DE19518278A1 - Lipidspaltendes Enzym - Google Patents
Lipidspaltendes EnzymInfo
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Description
Das lipidspaltende Enzym und seine Analoga, Gegenstand der vorliegenden Erfindung,
sind bisher nicht beschriebene, membranständiges Enzyme, die z. B. aus Zellmembran
fraktionen von humanen peripheren Blutleukozyten oder humanen Makrophagen isoliert
werden können, und die Konjugate von pharmakologisch aktiven Substanzen, die an ein
lipidartiges Trägermolekül gebunden sind, unter Freisetzung der pharmakologisch aktiven
Substanz spalten. Außerdem betrifft die Erfindung die Verwendung dieser Konjugate, die
als Substrate dieses Enzyms dienen, zur Herstellung von Arzneimitteln, wobei die
Arzneimittel diese Konjugate als pharmazeutischen Wirkstoff enthalten. Die Arzneimittel
eignen sich zur gezielten Freisetzung und Anreicherung von pharmakologisch aktiven
Substanzen in entsprechenden Zielzellen. Gegenstand der Erfindung sind ferner In-vitro-
Untersuchungssysteme, die dieses Enzym enthalten, zur Auffindung von weiteren
Substraten dieses Enzyms, sowie Untersuchungssysteme zur Auffindung von LCE
Analoga.
Die Therapie bösartiger Neoplasien (Karzinome, Sarkome, hämatologische Neoplasien),
entzündlicher Erkrankungen oder Autoimmunerkrankungen sowie von durch Viren oder
Retroviren hervorgerufenen Erkrankungen, wie beispielsweise von AIDS, ARC (AIDS
related complex), Cytomegalie, Herpes oder Hepatitis, ist neben der unzureichenden Wirk
samkeit der eingesetzten therapeutischen Wirkstoffe häufig mit deren extremen Neben
wirkungen verbunden. Dieser Effekt ist mit der zu geringen In-vivo-Selektivität bzw. der
eingeschränkten therapeutischen Breite der eingesetzten pharmakologisch aktiven
Substanzen zu erklären. Die günstigen pharmakologischen In-vitro-Eigenschaften der
pharmakologisch aktiven Substanzen sind oft nicht auf die In-vivo-Verhältnisse über
tragbar.
Seit Jahren versucht man deshalb durch Modifzierung der chemischen Struktur von phar
makologisch aktiven Substanzen neue Substanzen zur Verfügung zu stellen, die verbes
serte Eigenschaften hinsichtlich der therapeutischen Breite aufweisen. Ferner werden oft
neue pharmazeutische Darreichungsformen mit dem Ziel entwickelt, die aktiven Substan
zen gezielt an ihren Wirkungsort zu transportieren, an dem sie ihre therapeutische
Wirkung entfalten sollen. Dabei soll insbesondere die unerwünschte Wechselwirkung mit
gesunden Zellen vermieden werden. Im Falle von Tumorzellen, die entsprechende Ober
flächenantigene besitzen, wurden beispielsweise Antikörper hergestellt, die diese speziellen
Oberflächenantigene erkennen und somit gezielt an die Krebszelle binden. Die Antikörper
sind mit geeigneten Toxinen derart modifiziert, daß nach erfolgter Bindung an die
Krebszelle das Toxin freigesetzt und die Krebszelle mortalisiert wird. Eine andere
Alternative zur Verbesserung der therpeutischen Breite besteht darin, durch geringfügige
Modifizierung der pharmakologisch aktiven Substanz, beispielsweise durch Herstellung
von Säure- oder Basenadditionssalzen oder durch Herstellung von einfachen Estern
[beispielsweise Fettsäureester; J. Pharm. Sci. 79, 531 (1990)], die physikalischen
Eigenschaften der zugrundeliegenden aktiven Substanz derart zu verändern, daß die
Löslichkeit oder Verträglichkeit der aktiven Substanz verbessert wird. Diese geringfügig
chemisch modifizierten Verbindungen werden oft auch als sogenannte "Prodrugs"
bezeichnet, da sie beim Kontakt mit Körperflüssigkeiten oder in der Leber (first pass-
Metabolismus) nahezu unmittelbar in das eigentliche therapeutisch aktive Agens um
gewandelt werden.
Das der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende technische Problem bestand darin, ein
neues Target aufzufinden, das möglichst spezifisch auf oder in Zellen vorkommt, die ein
Zielobjekt für die Verabreichung von pharmakologisch aktiven Substanzen darstellen. Das
Target sollte mit entsprechenden pharmazeutischen Wirkstoffen in Wechselwirkung treten,
so daß die Wirkstoffe möglichst spezifisch zu diesen Zielzellen transportiert, von diesen
erkannt, gebunden und aufgenommen werden können. Der pharmazeutische Wirkstoff
sollte dabei im wesentlichen aus zwei Bestandteilen aufgebaut sein, wobei der erste
Bestandteil für die Erkennung und Wechselwirkung mit dem Target verantwortlich ist
(ligandspezifischer Teil) und der zweite Bestandteil die eigentliche aktive Substanz
(wirkstoffspezifischer Teil) darstellt, der erst dann seine Wirkung entfaltet, wenn die spezi
fische Bindung an das Targetmolekül und die intrazelluläre Abspaltung des eigentlich
aktiven Agens erfolgt ist. Dadurch soll die unerwünschte Freisetzung der pharmakologisch
aktiven Substanz in den Körperflüssigkeiten vermieden werden, so daß gesunde Zellen
nicht durch das pharmakologisch aktive Agens negativ beeinflußt und unerwünschte
Nebenwirkungen weitgehend vermieden werden. Der für diesen Zweck für die Herstellung
der Arzneiform verwendete pharmazeutische Wirkstoff sollte hierbei einerseits als Ligand
für das Target dienen und andererseits das eigentliche aktive pharmakologische Agens ent
halten, wobei dieses insbesondere auch auf Basis von bereits bekannten pharmazeutischen
Wirkstrukturen beruhen kann, deren therapeutische Breite auf diese Weise signifikant ver
bessert werden soll.
Überraschenderweise wurde nun gefunden, daß sich als Target ein lipidspaltendes Enzym
eignet, wobei dieses Enzym vorwiegend auf oder in malignen, aktivierten oder virus
infizierten Zellen, insbesondere auf humanen peripheren Blutleukozyten, Makrophagen,
murinen Nieren-, Nebennieren- oder Ovarialzellen, Zellen des lymphatischen Systems oder
der lymphoiden Organe oder Zellen des Gehirns lokalisiert ist. Dieses Enzym und seine
Analoga werden im folgenden auch kurz als Lipid-Cleavage-Enzyme (LCE) bezeichnet.
LCE zeigt überraschenderweise keine über alle Organe verteilte gleichmäßige statistische
Verteilung, sondern ist vorwiegend in Membranen von bestimmten Zellen zu beobachten,
die als Zielobjekt für die Verabreichung von pharmakologisch aktiven Substanzen in Frage
kommen. In Herz- Knochenmark- und Leberzellen konnte eine vergleichsweise nur sehr
geringe Enzymaktivität festgestellt werden. Die Homogenat- bzw. Membranfraktionen der
zur Isolierung des LCE verwendeten Zellen, Organe oder Gewebe zeigen verschiedene
spezifische Aktivitäten oder Affinitäten des Lipid-Cleavage-Enzyms, wobei in aktivierten
Zellen die spezifische Aktivität und die Affinität stark erhöht ist im Vergleich zu nicht
aktivierten Zellen. Dies läßt sich für humane periphere Blutleukozyten-, Lymphozyten und
Granulozyten sowie für humane und nicht-humane bzw. murine mononukleäre Zellen, wie
z. B. Monozyten/Makrophagen belegen.
Dieses Enzym zeichnet sich überraschenderweise dadurch aus, daß es als Substrat lipid
ähnliche Verbindungen zwischen dem Lipidgrundgerüst und der Phosphatbrücke einer
kovalent an diese Brücke gebundenen, physiologisch aktiven Substanz spaltet. Derartige
Substrate können durch die allgemeine Formel I
L-B-D (I)
umschrieben werden, wobei L für einen Lipidrest, B eine Phosphatbrücke und D für eine
pharmakologisch aktive Substanz steht. Überraschenderweise besitzen die pharmazeuti
schen Wirkstoffe der Formel I im Vergleich zu den pharmakologisch aktiven freien bzw.
unmodifizierten Substanzen D eine größere therapeutische Breite. Sie verbessern darüber
hinaus oft deren Verweilzeit im Körper, die Bioverfügbarkeit oder die oft als kritischer
Faktor bekannte Membrangängigkeit (z. B. Blut-Hirn-Schranke, Zellmembran, etc.) der
pharmakologisch aktiven Substanzen. Substrate der Formel I dienen somit als Träger
system (Carrier) für die pharmakologisch aktive Substanz. Die Konjugate der Formel I
können hinsichtlich ihrer Funktion als intrazelluläres Drug-Storage, Drug-Targeting- und
Drug-Delivery-System bezeichnet werden. Sie bewirken, daß die pharmakologisch aktive
Substanz oder deren Prodrugform nach oraler Applikation intrazellulär freigesetzt wird,
wobei diese Freisetzung in vorteilhafter Weise nicht unspezifisch in allen Zellen, Organen
oder Geweben des Körpers stattfindet, sondern gezielt in solchen Zellen, die das LCE in
der Zellmembran oder auch teilweise intrazellulär enthalten. Besonders überraschend ist
jedoch, daß die Spaltung nicht bereits schon während des Transportes des Substrates
durch die Körperflüssigkeiten, wie z. B. Blut, Serum oder Lymphflüssigkeit oder durch die
Leber, erfolgt, sondern erst an oder in den entsprechenden Zielzellen. Auf diese Weise
wird das unerwünschte Ausscheiden des Substrates durch die Niere oder Spaltung des
Substrates in der Leber vermieden, so daß der weitaus größte Teil des Wirkstoffes an die
jeweiligen Zielzellen transportiert wird. Derartige Zellen sind, wie oben bereits erwähnt,
insbesondere pathophysiologisch oder physiologisch aktivierte Zellen, die als Zielobjekt
für die Verabreichung von pharmakologisch aktiven Substanzen in Frage kommen, wie
beispielsweise Blutleukozyten, Lymphozyten, Makrophagen und andere Zellpopulationen
des immunologisch lymphatischen Systems. Insbesondere handelt es sich hierbei um
aktivierte Zellen (z. B. Makrophagen, Granulozyten, Lymphozyten, Leukozyten,
Thrombozyten, Monozyten etc.), die beim jeweiligen Krankheitsgeschehen eine
pathologische, physiologische oder symptomatische Rolle spielen.
Bei dem als Lipid-Cleavage-Enzym (LCE) bezeichneten Enzym handelt es sich um ein bis
her noch nicht beschriebenes Enzym. Es zeichnet sich insbesondere dadurch aus, daß es als
Substrat die Verbindung (3′-Desoxy-3′-azidothymidin)-5′-phosphorsäure-(3-dodecyl
mercapto-2-decyloxy)-propylester (nachfolgend kurz als AZT-DMDOPE bezeichnet) zu
3′-Desoxy-3′-azidothymidin-monophosphat und (3-dodecylmercapto-2-decyloxy)-pro
panol (DMDOP) spaltet. Ein weiteres bevorzugtes Substrat dieses Enzyms ist die Verbin
dung (3′-Desoxy-3′-fluorthymidin)-5′-phosphorsäure-(3-dodecylmercapto-2-d-ecyloxy)-
propylester (FLT-DMDOPE), das zu 3′-Desoxy-3′-fluorthymidin-5′-monophosphat und
DMDOP gespalten wird.
Zur Bestimmung des Umsatzes von AZT-DMDOPE durch Zellhomogenate, Membran- bzw.
Zytosolfraktionen, vorzugsweise von verschiedenen humanen Zelltypen, wurde ein Enzym-
Assay etabliert (Beispiel 6).
Das Testprinzip beruht auf einer Spaltung der Muttersubstanz durch das LCE in AZT-MP
und den korrespondierenden Thioetherlipidteil. [¹⁴C]-AZT-DMDOPE und nichtradioaktiv
markiertes AZT-DMDOPE wurden hierfür eingesetzt. Der Thioetherlipidmetabolit
DMDOP wurde aus den Ansätzen extrahiert (Beispiel 7) und die Menge an radioaktiv
markierter Substanz im Flüssigkeits-Szintillations-Analysator gemessen. Da eine definierte
Menge an [¹⁴C]-AZT-DMDOPE im Enzym-Assay eingesetzt wurde konnte der Umsatz
der enzymatischen Spaltung bestimmt werden.
Das Enzym wird vorzugsweise aus humanen peripheren Blutleukozyten, die zuvor durch
PHA oder andere Stimulantien (z. B. Cytokine, etc.) aktiviert wurden, oder aus murinen
Nierenzellen isoliert. Es besitzt ein Molekulargewicht von etwa 120.000-160.000,
bestimmt nach der SDS-PAGE-Methode. Zellen, die dieses Enzym enthalten, können auf
einfache Weise dadurch identifiziert werden, indem sie unter geeigneten Testbedingungen
mit einer Lösung von AZT-DMDOPE oder FLT-DMDOPE versetzt werden und die
Spaltprodukte AZT-monophosphat bzw. FLT-monophosphat oder DMDOP
nachgewiesen werden, beispielsweise durch dünnschichtchromatographische Methoden
oder im Fall von radioaktiv markierten Proben durch szintillatographische Verfahren (siehe
Beispiele 4-7). Im Gegensatz zu den biochemisch verwandten Phospholipasen C oder -D
wird das LCE nicht durch bekannte Inhibitoren von Phospholipase C oder -D gehemmt
oder durch Aktivatoren von Phospholipase C oder -D aktiviert. Im Gegensatz zu
Phospholipase C wird das Enzym durch die Substanz D 609 (Tricyclodecan-9-yl
xanthogenat; C₁₁H₁₅OS₂K) aktiviert, während D 609 die Phospholipase C inhibiert.
Intrazelluläres AZT zeigt in seiner nichtphosphorylierten Form keine inhibitorische Wirkung
auf die virale reverse Transkriptase (RT) (Nakashima et al., 1986, Antimicrob. Agents
Chemother. 30 933-937; Mitsuya et al., 1985, Proc. Natl. Acad.Sci. USA 82, 7096-7100).
Durch die intrazellulären Enzyme Thymidin-Kinase, Thymidilat-Kinase und Pyrimidin-
Nukleosid-Diphosphat-Kinase (Yarchoan et al., 1989, N. Engl. J. Med. 321, 726-738;
Toyoshima et al., 1991, Anal. Biochem. 196, 302-307) wird das Strukturanalogon von
Thymidin durch sukzessive Phosphorylierung über AZT-MP und AZT-DP in das
therapeutisch wirksame, RT inhibierende AZT-TP überführt. AZT-DMDOPE, als
Thioetherlipid-AZT-Konjugat, könnte durch intrazelluläre enzymatische Spaltung in AZT
oder direkt in die bereits phosphorylierte Form AZT-MP überführt werden. In Beispiel 8
werden die intrazellulären Konzentrationen an phosphoryliertem und nichtphosphoryliertem
AZT nach Inkubation mit äquipotenten Konzentrationen an AZT-DMDOPE und AZT
bestimmt werden.
Das Enzym und seine Analoga zeigen ferner in verschiedenen Spezies (z. B. Mensch,
Maus, Ratte, Hund, Affe) keine gleichmäßige statistische Organverteilung, sondern sind
nur in den Membranen von bestimmten Zellen, Organen oder Geweben vorzufinden, die
als Targetzellen für spaltbare Konjugate der Formel I dienen. Die natürlichen Substrate
dieser Enzyme sind bislang noch unbekannt. In zytosolischen Fraktionen liegt die LCE-
Aktivität immer unter oder gerade an der Nachweisgrenze. Sehr geringe Aktivität ist z. B.
auch in Knochenmarkzellen festzustellen, was auf eine sehr geringe oder sogar gänzlich
fehlende Knochenmarktoxizität der als Substrate des LCEs eingesetzten pharmazeutischen
Wirkstoffe der Formel I schließen läßt.
Die Lipid-Cleavage-Enzym-Aktivität zeigt eine lineare Protein- und Zeitabhängigkeit, eine
spezifische Abhängigkeit von Metallkationen (Inhibierung durch Zn2+ und Mn2+) und eine
klassische Michaelis-Menten-Kinetik (Substratabhängigkeit) (Beispiel 9). Neben der
höheren Aktivität des Enzyms in aktivierten Zellen zeigt sich unter diesen Bedingungen
auch eine höhere Affinität des LCE zum Substrat.
Das isolierte oder aus Membranfraktionen stark angereicherte Lipid-Cleavage-Enzym läßt
sich auch zum Screening auf neue, potentiell spaltbare Substrate oder auch natürlicher
weise vorkommende Substrate einsetzen. Die so gefundenen Substrate können dann
weitergehend untersucht werden hinsichtlich ihrer essentiellen Strukturmerkmale, die für
die Erkennung des Substrates und die Bindung an das Enzym erforderlich sind. Derartige
identifizierte Struktureigenschaften können dann verwendet werden, um chemisch modifi
zierte Substrate herzustellen, die diese essentiellen Merkmale enthalten, sowie darüber hin
aus geeignete funktionelle Gruppen, die sich zur Kopplung mit pharmakologisch aktiven
Substanzen eignen.
Auch ein Screening auf Inhibitoren oder Aktivatoren des Lipid-Cleavage-Enzym ist somit
möglich.
Diagnostisch kann das isolierte oder stark angereicherte Enzym eingesetzt werden, wenn
beispielsweise gesteigerte oder reduzierte Lipid-Cleavage-Enzym-Aktivitäten zu patholo
gischen Veränderungen in vitro oder in vivo führen, oder mit diesen pathologischen Ver
änderungen entsprechende Erkrankungen oder Krankheitssymptome einhergehen.
Ebenso kann das LCE zur Herstellung von diagnostischen Mitteln eingesetzt werden, die
dazu verwendet werden, um bei der Verabreichung der pharmazeutischen Wirkstoffe an
Patienten die Spaltung dieser Substrate zu prüfen, was zur spezifischen und individuellen
Anpassung der Therapiemodalitäten bei diesen Patienten führt (Drugmonitoring).
Rekombinantes LCE kann nach wohletablierten Verfahren hergestellt werden, indem von
LCE oder LCE-Fragmenten die Aminosäuresequenz bestimmt wird und mit entsprechend
konstruierten Oligonukleotid "probes" eine menschliche oder andere Säugetier-Genbank
abgesucht wird. Das gefundene Gen wird dann durch einen entsprechenden Vektor in
einem prokaryotischen und enkaryotischen Zellsystem exprimiert. Das rekombinante LCE
kann dann nach in Proteinchemie bekannten Verfahren aufgereinigt werden (siehe z. B.
Maniatis, Molecular Cloning).
Das LCE zeichnet sich insbesonders dadurch aus, daß es Verbindungen des allgemeinen
Typs I
spalten kann, in dem L einen Lipidteil darstellt, B eine Phosphatbrücke kennzeichnet und
D für eine pharmakologische aktive Substanz steht. Die sehr spezifische Spaltung erfolgt
zwischen Lipidteil und Phosphatrest. Eine unspezifische Spaltung der Verbindungen der
Formel I an anderen funktionellen Gruppen im Molekül wird nicht beobachtet.
Bevorzugt stellt der Lipidteil L des Konjugats der Formel I dabei folgenden Rest der
Formel II dar,
in dem
R¹ eine geradkettige oder verzweigte, gesättigte oder ungesättigte Alkylkette mit 1-30 Kohlenstoffatomen, die gegebenenfalls ein- oder mehrfach durch Halogen, C₁-C₆- Alkoxy-, C₁-C₆-Alkylmercapto-, C₁-C₆-Alkoxycarbonyl-, C₁-C₆-Alkylsulfinyl- oder C₁-C₆-Alkylsulfonylgruppen substituiert sein kann,
R² Wasserstoff, eine geradkettige oder verzweigte, gesättigte oder ungesättigte Alkyl kette mit 1-20 Kohlenstoffatomen, die gegebenenfalls ein- oder mehrfach durch Halogen, C₁-C₆-Alkoxy-, C₁-C₆-Alkylmercapto-, C₁-C₆-Alkoxycarbonyl- oder C₁-C₆-Alkylsulfonylgruppen substituiert sein kann,
X einen Valenzstrich, Sauerstoff, Schwefel, Oxycarbonyl, Carbonyloxy, Carbonyl lamido, Amidocarbonyl, die Sulfinyl- oder die Sulfonylgruppe darstellt,
Y ein Valenzstrich, Oxycarbonyl, Carbonyloxy, Carbonylamido, Amidocarbonyl, ein Sauerstoff- oder Schwefelatom ist, und
m eine ganze Zahl zwischen 1 und 5 darstellt.
R¹ eine geradkettige oder verzweigte, gesättigte oder ungesättigte Alkylkette mit 1-30 Kohlenstoffatomen, die gegebenenfalls ein- oder mehrfach durch Halogen, C₁-C₆- Alkoxy-, C₁-C₆-Alkylmercapto-, C₁-C₆-Alkoxycarbonyl-, C₁-C₆-Alkylsulfinyl- oder C₁-C₆-Alkylsulfonylgruppen substituiert sein kann,
R² Wasserstoff, eine geradkettige oder verzweigte, gesättigte oder ungesättigte Alkyl kette mit 1-20 Kohlenstoffatomen, die gegebenenfalls ein- oder mehrfach durch Halogen, C₁-C₆-Alkoxy-, C₁-C₆-Alkylmercapto-, C₁-C₆-Alkoxycarbonyl- oder C₁-C₆-Alkylsulfonylgruppen substituiert sein kann,
X einen Valenzstrich, Sauerstoff, Schwefel, Oxycarbonyl, Carbonyloxy, Carbonyl lamido, Amidocarbonyl, die Sulfinyl- oder die Sulfonylgruppe darstellt,
Y ein Valenzstrich, Oxycarbonyl, Carbonyloxy, Carbonylamido, Amidocarbonyl, ein Sauerstoff- oder Schwefelatom ist, und
m eine ganze Zahl zwischen 1 und 5 darstellt.
In der allgemeinen Formel II bedeutet R¹ vorzugsweise eine geradkettige oder verzweigte
C₈-C₁₅-Alkylgruppe, die noch durch eine C₁-C₆-Alkoxy- oder eine C₁-C₆-Alkyl
mercaptogruppe substituiert sein kann. R¹ stellt insbesondere eine Nonyl-, Decyl-, Unde
cyl-, Dodecyl-, Tridecyl- oder Tetradecylgruppe dar. Als C₁-C₆-Alkoxy-substituenten von
R¹ kommen vorzugsweise die Methoxy-, Ethoxy-, Butoxy- und die Hexyloxygruppen in
Frage. Ist R¹ durch einen C₁-C₆-Alkylmercaptorest substituiert, versteht man darunter
insbesondere den Methylmercapto-, Ethylmercapto-, Propylmercapto-, Butylmercapto-
und den Hexylmercaptorest.
R² bedeutet vorzugsweise eine geradkettige oder verzweigte C₈-C₁₅-Alkylgruppe, die
noch durch eine C₁-C₆-Alkoxygruppe oder eine C₁-C₆-Alkylmercaptogruppe substituiert
sein kann. R² stellt insbesondere eine Octyl-, Nonyl-, Decyl-, Undecyl-, Dodecyl-, Tride
cyl- oder Tetradecylgruppe dar. Als C₁-C₆-Alkoxysubstituenten von R² kommen vor
zugsweise die Methoxy-, Ethoxy-, Propoxy-, Butoxy- und die Hexyloxygruppe in Frage.
Ist R² durch einen C₁-C₆-Alkylmercaptorest substituiert, versteht man darunter insbeson
dere den Methylmercapto-, Ethylmercapto-, Butylmercapto- und Hexylmercaptorest.
X ist bevorzugt gleich Schwefel, Sulfinyl oder Sulfonyl und Y gleich Sauerstoff. Die
Heteroatome X und Y im Lipidteil L können in Ausnahmefällen durch die aus Lecithin
bekannten Carbonsäureester ersetzt werden, da sonst häufig schon im Serum oder in der
Leber (first pass-effect) eine hydrolytische Spaltung zu den entsprechenden Lysolecithin-
Derivaten oder Glycerolestern mit entsprechend schnellerer Elimination der pharmako
logisch aktiven Substanz erfolgen wurde. Die Thioether- bzw. Etherlipide (X, Y = O, S)
dieser Anmeldung zeigen diese Spaltung im Serum verschiedener Spezies, inklusive des
Menschen, nicht.
Bevorzugt sind auch Verbindungen, in denen X und Y einen Valenzstrich darstellen, R²
gleich Wasserstoff ist und R¹ eine C₁-C₃₀-Alkylkette darstellt, die gegebenenfalls durch
C₁-C₆-Alkoxy, oder C₁-C₆-Alkylmercapto substituiert sein kann.
m ist bevorzugt gleich 1 oder 2 und besonders bevorzugt gleich 1.
Die Phosphatbrücke B wird durch die Formel III umschrieben,
-O-[(PO)(OH)O]n- (III)
in der n = 1, 2 oder 3 sein kann, aber bevorzugt gleich 1 oder 2 ist und insbesondere 1 ist.
Der Lipidteil L und die Phosphatbrücke B haben die oben angegebene Bedeutung, wobei
L bevorzugt einen Rest der Formel II darstellt und B bevorzugt eine Phosphatbrücke der
Formel III ist. Besonders bevorzugt ist eine Phosphatbrücke der Formel III mit n = 1 und
ein Lipidteil der Formel II, in dem R¹ und R² einen Alkylrest mit 8-15 C-Atomen dar
stellen, X gleich Schwefel und Y gleich Sauerstoff ist.
Der Begriff "pharmakologisch aktive Substanz" (Bezeichnung D in Formel I) steht in die
ser Anmeldung für einen Wirkstoff im arzneimittelrechtlichen Sinne. Dieser Wirkstoff kann
ein Wirkstoff eines bereits eingeführten, von Arzneimittelbehörden zugelassenen Pharma
zeutikums oder ein sich in der arzneimittelrechtlichen Zulassung befindlicher Wirkstoff
sein. Die Definition "pharmakologisch aktive Substanz" umfaßt auch solche Derivate von
Wirkstoffen, die durch Einführung einer oder mehrerer funktioneller Gruppen
(beispielsweise solche Gruppen, die eine Kupplung von D mit dem Lipid-Carrier-Teil L
ermöglichen, wie z. B. Hydroxy- oder Aminogruppen) chemisch modifiziert werden kön
nen. Die Definition umfaßt ferner die aus dem Wirkstoff D sich bildenden Prodrugformen,
die ebenfalls physiologisch aktiv sind. Insbesondere kommen solche pharmakologisch ak
tive Substanzen D in Frage, deren klinische Entwicklung aufgrund unerwünschter Neben
wirkungen eingestellt oder nicht begonnen wurde, bzw. die über ein sehr enges Dosis-
Wirkungs-Spektrum verfügen, so daß die Verabreichung der therapeutisch erforderlichen
Menge nur mit hohen Risiken oder praktisch überhaupt nicht beherrschbar war.
Überraschenderweise wurde gefunden, daß die therapeutische Breite einer pharmako
logisch aktiven Substanz D signifikant verbessert wird, wenn die Substanz in an ein lipid
artiges Trägermolekül gekoppelt wird. Das so hergestellte Konjugat dient als neuer Wirk
stoff für die Herstellung von pharmazeutischen Darreichungsformen. Insgesamt resultiert
aus der Kopplung eine verstärkte Wirkung der pharmazeutisch aktiven Substanz D in
vivo, da durch das entstehende Drug-Delivery-Transport-System eine Lokalisierung der
pharmakologisch aktiven Substanz in Zielzellen erfolgt und dadurch die pharmakologisch
aktive Substanz hinsichtlich ihrer Effizienz gesteigert wird. Dies bedeutet, daß einerseits
die Menge der zu verabreichenden pharmakologisch aktiven Substanz reduziert werden
kann, oder andererseits unter Beibehaltung der gleichen effektiven Menge eine verstärkte
pharmakologische Wirkung erzielt wird.
Die den pharmakologisch aktiven Substanzen D zugrundeliegende chemische Struktur
kann ferner derart modifiziert werden, daß die Substanzen hinsichtlich ihrer physikalischen
oder chemischen Eigenschaften verändert sind und beispielsweise eine höhere oder
geringere Lipophilie aufweisen, jedoch hinsichtlich ihrer therapeutischen Wirkung im
wesentlichen die gleichen Eigenschaften besitzen wie die unmodifizierte Substanz D.
Insbesondere ist es vorteilhaft, wenn die Substanz D durch Einführung von funktionellen
Gruppen chemisch derart modifiziert wird, daß sie über eine geeignete Brücke an den
Lipidteil L gekoppelt werden kann. Dies geschieht beispielsweise durch Einführung von
Hydroxygruppen, die über die Phosphatgruppe B an das Lipid gekoppelt werden.
Die pharmakologisch aktive Substanz D stellt eine chemische oder auf biologischer Basis
(Antikörper, Peptid, Protein, Hormon, Toxin etc.; INDEX NOMINUM, International
Drug Directory, Medpharm) aufgebaute Substanz mit biologischer Wirkung dar, sowie
deren durch Einführung einer funktionellen Gruppe (z. B. einer Hydroxygruppe) chemisch
modifizierten Derivate. Eine Voraussetzung ist, daß die pharmakologisch aktive Substanz
oder ihre Prodrugform über die Spaltung des Liponukleotids durch das Lipid-Cleavage-
Enzym eine "Aktivierung" durch dieses körpereigene Enzym erfahren. Bevorzugt sind
dabei pharmakologisch aktive Substanzen, die nach Spaltung durch das LCE als
pharmakologisch aktives Substanzmonophosphat in vivo als Zwischenprodukt fungieren
und durch zelluläre Enzyme weiter aufphosphoryliert werden, wie z. B. Nukleosid-
Monophosphat zum Nukleosid-Triphosphat, oder zur freien pharmakologisch aktiven
Substanz gespalten werden (siehe Beispiel 8).
Im Sinne der Erfindung kommen insbesondere alle in vitro wirksamen, jedoch in vivo im
therapeutischen Bereich toxischen pharmakologisch aktive Substanzen in Frage, d. h. alle
Substanzen mit kleiner therapeutischer Breite, die über eine chemisch funktionelle Gruppe
zur Knüpfung der kovalenten Bindung zum Phosphat verfügen. Außerdem können auch
solche Substanzen verwendet werden, die in ihrer pharmakologisch aktiven Form zunächst
keine funktionelle Gruppe enthalten, diese sich jedoch durch chemische Modifikation ein
führen läßt, ohne daß ein Verlust der Wirkung der Substanz eintritt.
Bevorzugt werden solche pharmakologisch aktive Substanzen zur Konjugation mit einem
Lipidrest L verwendet, die normalerweise nach Phosphorylierung ihre aktive Form errei
chen (wie z. B. im Fall von Nukleosiden). Aus dem Konjugat wird dann das pharmako
logisch aktive Substanzphosphat durch enzymatische Hydrolyse des Konjugats freigesetzt.
Die Freisetzung der phosphorylierten Substanz ist insbesondere deshalb von Bedeutung,
da dieser Prozeß auch in solchen Zellen stattfinden kann, die nicht über die normalerweise
zur Aufphosphorylierung der reinen pharmakologisch aktiven Substanz nötigen Enzyme
(Kinasen) verfügen. Die konjugierte und via LCE intrazellulär oder in der Zellmembran
freigesetzte pharmakologisch aktive Substanz kann beispielsweise eine zytostatische, zyto
toxische, antitumorale, antivirale, antiretrovirale, immunsupprimierende oder immun
stimulierende Wirkung aufweisen.
Als pharmakologisch aktive Substanzen D kommen solche Verbindungen in Frage, die
gegebenenfalls durch Einführung einer funktionellen Gruppe, die die Wirkung nicht
signifikant beeinflußt, in ein kopplungsfähiges Derivat überführt werden, das dann z. B. das
Tumorwachstum verlangsamt, eine in die DNA und/oder RNA interkalierende Substanz
ist, die Topoisomerase I und II hemmt, ein Tubulinhemmer ist, ein Alkylanz ist, eine die
Ribosomen inaktivierende Verbindung ist, ein Tyrosinphosphokinase-Inhibitor ist, ein
Differenzierungsinduktor ist, ein Hormon, Hormonagonist oder Hormonantagonist ist,
eine Substanz ist, welche die pleiotrope Resistenz gegenüber Zytostatika verändert, ein
Calmodulin-Inhibitor ist, ein Proteinkinase C-Inhibitor ist, ein P-Glycoprotein-Inhibitor ist,
ein Modulator der mitochondrial gebundenen Hexokinase ist, ein Inhibitor der γ-Glutamyl
cysteinsynthetase oder der Glutathion-S-Transferase ist, ein Inhibitor der Superoxid
dismutase ist, ein Inhibitor der Reversen Transkriptase von HIV-1 und -2 ist.
Die pharmakologisch aktive Substanz D kann eine antiinflammatorische, antirheumatische,
antiphlogistische, analgetische oder antipyretische Wirkung aufweisen. Sie kann ferner ein
Antiarrhythmikum, Calciumantagonist, Antihistaminikum, ein Hemmer der Phospho
diesterase oder ein Sympathomimetikum bzw. Parasympathomimetikum sein.
Als pharmakologisch aktive Substanzen D kommen alle Substanzen in Frage mit kurzer
Halbwertszeit, insbesondere auch Verbindungen mit unterschiedlicher Organ-, Gewebe-,
oder Zellhalbwertszeiten; mit schlechter Bioverfügbarkeit, d. h. mit schlechter Resorption,
hoher Leberspaltung oder schneller Elimination; mit schlechter Membranpenetration (z. B.
Zellmembran, Blut-Hirnschranke); mit Knochenmarktoxizität oder anderen limitierenden
Organtoxizitäten (z. B. Cardio-, Leber-, Nephro-, Neurotoxizität etc.), deren Wirk
konzentration in vivo zu gering ist. Außerdem sind solche Substanzen geeignet, die gezielt
mit dem Zellkern der Zielzellen in Wechselwirkung treten und auf der Ebene der DNA
oder RNA in das molekulare Geschehen eingreifen, wie z. B. Antisense-Oligonukleotide,
DNA-Fragmente, und die für die Gentherapie verwendet werden können.
Pharmakologisch aktive Substanzen D in der Formel I sind beispielsweise: AZT
(Azidothymidin), FLT (Fluorthymidin), 5-FU (5-Fluoruridin), 6-MPR, Fludarabin,
Cladribin, Pentostatin, ara-C, ara-A, ara-G, ara-H, Acyclovir, Ganciclovir, Doxorubicin,
4′-epi-Doxorubicin, 4′-Desoxy-doxorubicin, Etoposid, Daunomycin, Idarubicin, Epiru
bicin, Mitoxantron, Vincristin, Vinblastin, Taxol, Colchicin, Melphalan, 3′-Desoxy-2-
fiuoradenosin, FdA, 5-Ethinyluracil-9-β-D-arabinofuranosid, 5 -Propinyluracil-9-β-D-
arabinofuranosid, d4T, ddU, ddI, ddA, d2T, 2′-Desoxy-2′,2′-difiuorcytidin, 5-Trifiuor
methyl-2′-desoxyuridin, 5-Chlor-2′,3′-didesoxy-3′-fiuoruridin, 3′-Desoxy-3′-fluor-myo
inositol, Neplanocin A, Ribavirin, Myoinositol, Fialuridin, 3TC, Lamivudin, Doxifiuridin,
Tegafur, Hypericin, Pseudohypericin, Usevir, Famciclovir, Penciclovir, Carvedilol,
Actinomycin A, Bleomycin, Daunorubicin, Floxuridin, Mithramycin, Mitomycin C, Mitox
anthron, Streptozotocin, Vindesin, Netilmycin, Amikacin, Gentamycin, Streptomycin,
Kanamycin A, Tobramycin, Neomycin B, Plicamycin, Papamycin, Amphotericin B,
Vancomycin, Foscarnet, Idoxuridin, Trifluridin, Vidarabin sowie Morphine, Prosta
glandine, Leukotriene oder Cyclosporine. Ferner kommen in Frage: Terfenadin, Dexa
methason; Terbutalin; Prednisolon; Fenoterol; Orciprenalin; Salbutamol; Isoprenalin;
Muscarin; Bupranolol; Oxyphenbutazon; Östrogen; Salicylsäure; Propranolol; Ascorbin
säure; Spongiadiol, Diclofenac; Isospongiadiol; Flufenaminsäure; Digoxin; 4-Methyl
aminophenazon; Allopurinol; Theophyllin; Epoprostenol; Nifedipin; Chinin; Reserpin;
Methotrexat; Chlorambucil; Spergualin; Ibuprofen; Indomethacin; Sulfasalazin; Penicil
lanamin; Chloroquin.
Bevorzugte pharmakologisch aktive Substanzen sind auch beispielsweise Peptide, Proteine
und Oligonucleotide, wie z. B. Corticotropin, Calcitonin, Desmopressin, Gonadotropin,
Goserelin, Insulin, Zypressin, beta-Melanotropin, alpha-Melantropin, Muramyldipeptid,
Oxytocin, Vaopressin, FK-506, Octreotid oder Enalkiren.
Die oben erwähnten pharmakologisch aktiven Substanzen und die daraus herzustellenden
Konjugate stellen nur Beispiele dar und schränken den erfindungsgemäßen Gedanken nicht
ein.
Verbindungen der Formel I und deren Herstellung sind in den Anmeldungen WO
92/03462, WO 93/16092, WO 93/16091, WO 94/03465, PCT/EP94/02123, DE 44 02 492,
DE 44 18 690, sowie beispielsweise in WO 91/19726; EP 0 350 287; US 5,223,263; US
5,194,654; US 4,921,951; US 4,622,392; US 4,291,024; US 4,283,394 beschrieben. Im
Falle von antiviral wirksamen Nucleosiden werden in EP 0 350 287 und US 5,223,263
Lipid-Derivate (Diacylglycerol-Nucleoside) und deren Verwendung in liposomaler Form
beschrieben. Bevorzugt in Form von Liposomen soll eine Aufnahme der Substanz durch
Makrophagen und Monozyten möglich sein.
Durch entsprechende Vergleichsversuche konnte gezeigt werden, daß die therapeutischen
Effekte der aus EP 0 595 133 bekannten Diacylglycerol-Konjugate in vivo den Thioether-
oder Etherlipid-Konjugaten aus WO92/03462 unterlegen sind. Dies ist auf eine unspezifi
sche, nicht nur am Wirkort stattfindende Hydrolyse der Fettsäureester zurückzuführen.
Die nicht-hydrolysierbaren Thioether- und Etherreste zeigen demgegenüber entscheidende
Vorteile, da erst durch das spezielle Enzym (LCE) in den Membranen des Zielgewebes
bzw. intrazellulär eine Substanz mit biologischer Wirkung oder entsprechende Zwischen
produkte freigesetzt werden.
Die Konjugate der Formel I (L-B-D) zeigen entscheidende Vorteile im Vergleich zur nicht
konjugierten pharmakologisch aktiven Substanz D: Der spezifische, kovalent an die
pharmakologisch aktive Substanz gebundene Carrier (L-B-) verbessert die Bioverfügbar
keit von schlecht resorbierten pharmakologisch aktiven Substanzen, die Verträglichkeit
von potentiell toxischen Wirkmolekülen, die Verweilzeit von schnell eliminierten oder
metabolisierten Arzneimitteln und die Membranpenetration von schlecht membrangän
gigen Verbindungen (z. B. Blut-Hirn, Zellen etc.). Die enzymatische Spaltung in vivo in
Carrier und pharmakologisch aktive Substanz D (bzw. Substanz-Derivat) bzw. in
Carrier und pharmakologisch aktives Substanzphosphat (D-Monophosphat) erfolgt in der
Regel nicht im Serum sondern erst intrazellulär. Außerdem verbessert der Carrierteil mit
seiner lecithinartigen Struktur, die für den beanspruchten Effekt essentiell ist, die Pene
tration oder Membrangängigkeit der pharmakologisch aktiven Substanz und zeigt in vielen
Fällen einen Depoteffekt. Darüberhinaus ist die gastrointestinale Verträglichkeit der Lipid
konjugate L-B-D vielfach besser als die der reinen pharmakologisch aktiven Substanzen D.
Auch bei der Resorption zeigt das Lipid-Konjugat eine bessere Penetration durch Mem
branstrukturen und somit eine bessere Überwindung der Resorptionsbarrieren. Entspre
chendes gilt für die Penetration z. B. der Blut-Hirn-Schranke durch erleichterte Diffusion
oder eventuell aktiven Transport. Besonders bevorzugt sind Konjugate der Formel I mit
der Einschränkung des Lipidteils durch die Formel II, die durch enzymatische Hydrolyse
mit dem Lipid-Cleavage-Enzym eine Substanz mit biologischer Wirkung abspalten, die in
vivo zu weniger Nebenwirkungen führt als nach Verabreichung der pharmakologisch ak
tiven Substanz allein.
Durch eine bessere Bindung des Konjugats an Plasma- und Gewebeproteine wird ferner
die Verteilung in vivo verbessert. Durch normale Biotransformation wird das Konjugat
primär vom Thioether (X=S) zum Sulfoxid (X=SO) oxidiert, was aber aufgrund der equi
potenten Wirkung des Sulfoxids im Vergleich zum Thioether keinen Nachteil darstellt.
Durch eine langsame Freisetzung der pharmakologisch aktiven Substanz aus dem
Konjugat wird ein niedriger, aber über einen längeren Zeitraum konstanter aktiver
Substanzspiegel gewährleistet und somit die Wirkung verbessert oder toxische
Nebeneffekte vermieden. Die freigesetzte pharmakologisch aktive Substanz in Form des
Monophosphats penetriert wegen seiner großen Hydrophilie nicht mehr aus der Zelle
heraus.
Sowohl die Gesamtkörper-, Zell- als auch die Organ-Halbwertszeiten der
pharmakologisch aktiven Substanz werden durch Konjugation aufgrund der längeren
Verweilzeit des Konjugats im Organismus erheblich verlängert. Aufgrund der fehlenden
LCE-Aktivität zur Spaltung im Serum und in verschiedenen Organen ist nahezu keine
bzw. nur eine sehr geringere Knochenmark- und Organtoxizität zu beobachten.
Insbesondere ist vorteilhaft, daß die Konjugate der Formel I in verschiedenen Zielorganen,
Geweben oder Zellen spezifisch angereichert werden.
Die Verbindungen der Formel I können als Wirkstoffe zur Herstellung von Arzneimitteln
verwendet werden, die für alle Erkrankungen eingesetzt werden, bei denen hohe pharma
kologisch aktive Substanzspiegel in Zellen, Organen oder Geweben erforderlich oder hilf
reich sind. Eine wesentliche Voraussetzung für dieses als "Drug-Storage-Delivery-
Targeting" zu bezeichnende Transportsystem ist, daß die im Sinne der beabsichtigten
Therapie anzusprechenden Zellen das Lipid-Cleavage-Enzym in der Zellmembran auf
weisen, so daß in einem ersten Schritt der Wirkstoff an das LCE bindet und anschließend
über die Zellmembran hinweg in das Innere der Zelle transportiert wird, wobei die
Spaltung des Wirkstoffes zu der physiologisch aktiven Substanz entweder im wesentlichen
gleichzeitig mit dem Transport über die Zellmembran oder auch später teilweise innerhalb
der Zelle erfolgt. Die intrazelluläre Spaltung kommt insbesondere in solchen Fällen vor,
bei denen das LCE auch innerhalb der Zelle lokalisiert ist. Im Sinne der Erfindung kann die
Spaltung des Wirkstoffes verbunden mit der intrazellulärer Freisetzung der pharmako
logisch aktiven Substanz auch derart erfolgen, daß entweder die physiologisch oder phar
makologisch aktive Substanz dabei direkt entsteht oder eine dieser Substanz
entsprechende Vorstufe (Prodrugform). Geeignete Zielzellen sind beispielsweise
Blutleukozyten (PBLs), Monozyten, Nierenzellen oder Makrophagen und Zellen des
immunologisch lymphatischen Systems.
Insbesondere wirken die Verbindungen der Formel I immunmodulierend, para-
/sympatholytisch, /-mimetisch, zentral und/oder peripher muskelrelaxierend; antihyperton,
antihypoton, antiobstruktiv, analgetisch, antiphlogistisch, antiemetisch, antiinflamma
torisch, antiallergisch, antiasthmatisch, antipyretisch, antiulzerativ, antacid, antianginös,
antiarrhythmisch, antipsychotisch, antidepressiv, antiepileptisch, antikonvulsiv, antiparkin
sonoid, antihistaminerg, antimuscarinerg, antiserotoninerg, antigabaerg, antiadrenerg,
anticholinerg, glykosidisch, chronotrop, bathmotrop, dromotrop, inotrop, diuretisch, anti
diuretisch, urikosurisch, urikostatisch, anti-hypolipidämisch, antifibrinogen, antidiabetisch,
blutzuckersenkend, antiöstrogen, antiandrogen, antigestagen, antiosteoporotisch,
thyreostatisch, Knochenwachstum-stimulierend, narkotisch, anästhetisch, antihypnotisch,
antiinfektiös, antibiotisch, antituberkulostatisch oder hämatopoetisch oder stellen ein
Vitamin dar.
Steigern läßt sich die überlegene Wirkung einer der erfindungsgemäßen Verbindungen
durch Kombination mit geeigneten Arzneimitteln oder Kombination von zwei verschiede
nen Konjugaten der vorliegenden Anmeldung.
Beispielsweise läßt sich die Wirkung eines zytostatischen oder zytotoxischen Konjugats
dieser Anmeldung durch Kombination mit einer anderen zytostatischen oder zytotoxischen
Verbindung steigern, bevorzugt dann, wenn Komponenten mit unterschiedlichem Wirk
mechanismus verwendet werden oder Kombination eines zytostatischen oder zyto
toxischen Konjugats mit einem antiviralen Konjugat (Synergismus, z. B. bei AIDS).
Besonders geeignet sind erfindungsgemäße Konjugat-Kombinationen, bei denen eine
Komponente zytostatisches oder zytotoxisches Potential hat und die andere Komponente
z. B. die Multi-Drug-Resistenz durchbricht oder eine Komponente die Reverse Trans
kriptase von HIV und die andere Komponente z. B. die Protease inhibiert oder die beiden
Liponucleotide der Kombination keine Kreuzresistenz zeigen. Die Verbindungen der For
mel I und ihre pharmazeutische Zubereitungen können auch zur Herstellung von Arznei
mitteln verwendet werden, die sich in Kombination mit anderen Arzneimitteln zur Behand
lung und Prophylaxe von verschiedenen Erkrankungen eignen.
Als mögliche Salze der Verbindungen der allgemeinen Formel I kommen vor allem Alkali-,
Erdalkali- und Ammoniumsalze der Phosphatgruppe in Frage. Als Alkalisalze sind
Lithium-, Natrium- und Kaliumsalze bevorzugt. Als Erdalkalisalze kommen insbesondere
Magnesium- und Calciumsalze in Frage. Unter Ammoniumsalzen werden erfindungsgemäß
Salze verstanden, die das Ammoniumion enthalten, das bis zu vierfach durch Alkylreste
mit 1-4 Kohlenstoffatomen und/oder Aralkylreste, bevorzugt Benzylreste, substituiert sein
kann. Die Substituenten können hierbei gleich oder verschieden sein.
Die Verbindungen der allgemeinen Formel I können basische Gruppen, insbesondere
Amino-Gruppen enthalten, die mit geeigneten anorganischen oder organischen Säuren in
Säureadditionssalze überführt werden können. Als Säuren kommen hierfür beispielsweise
in Betracht: Salzsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Fumar
säure, Bernsteinsäure, Weinsäure, Zitronensäure, Milchsäure, Maleinsäure oder Methan
sulfonsäure.
Neben den Verbindungen der allgemeinen Formel I sowie der Spezifizierungen gemäß
Formel II und III beansprucht diese Anmeldung auch deren Tautomere und deren physio
logisch verträgliche Salze anorganischer und organischer Säuren bzw. Basen, sowie Ver
fahren zu ihrer Herstellung und diese Verbindungen enthaltende Arzneimittel.
Da die Verbindungen der allgemeinen Formel I asymmetrische Kohlenstoffatome enthal
ten, sind auch sämtliche optisch aktiven Formen und racemische Gemische dieser Verbin
dungen Gegenstand der vorliegenden Erfindung.
Gegenstand dieser Anmeldung sind auch neue Liponucleotide. Das LCE spaltet auch 2-
Chlor-2′-desoxy-adenosin-Konjugat (Cladribin-Konjugat) der Formel V, 9-(β-D-Arabino
furanosyl)-2-fluoradenin-Konjugat (Fludarabin-Konjugat) der Formel VI und 3-(2-
Desoxy-β-D-erythro-pentofuranosyl)-3,6,7,8-tetrahydroimidazo [4,5-d] [1,3] diazepin-
8-ol (Pentostatin-Konjugat) der Formel VII. Die genannten Verbindungen lassen sich
therapeutisch besser anwenden als die entsprechenden Nucleoside allein, da sie eine sehr
gute Wirksamkeit und eine große therapeutische Breite zeigen und die gleichen Vorteile
haben, wie die oben genannten Derivate der Formel I:
Im Sinne der vorliegenden Erfindung werden als Verbindungen der Formel I insbesondere
folgende Wirkstoffe zur Herstellung von Arzneimitteln verwendet:
- 1. (3′-Desoxy-3′-azidothymidin)-5′-phosphorsäure-(3-dodecyl-mercapto-2--decyloxy) propylester
- 2. (3′-Desoxy-3′-azidothymidin)-5′-phosphorsäure-(3-undecyl-mercapto-2--undecyloxy) propylester
- 3. (3′-Desoxy-3′-fluorthymidin)-5′-phosphorsäure-(3-dodecyl-mercapto-2--decyloxy) propylester
- 4. (3′-Desoxy-3′-fluorthymidin)-5′-phosphorsäure-(3 -undecyl-mercapto-2-undecyloxy) propylester
- 5. (2′,3′-Didesoxycytidin)-5′-phosphorsäure-(3-dodecyl-mercapto-2-decyl-oxy) propylester
- 6. (2′,3′-Didesoxyinosin)-5′-phosphorsäure-(3-dodecyl-mercapto-2-decylo-xy) propylester
- 7. (3′-Desoxythymidin)-5′-phosphorsäure-(3-dodecyl- mercapto-2-decyloxy)propylester
- 8. (5-Fluoruridin)-5′-phosphorsäure-(3 -dodecyl-mercapto-2-decyloxy)propylester
- 9. (6-Mercaptopurin-9-β-D-ribofuranosid)-5′-phosphorsäure-(3 -dodecylmercapto-2- decyloxy)propylester
- 10. (5-Trifluormethyluridin)-5′-phosphorsäure-(3 -dodecyl-mercapto-2-decyloxy) propylester
- 11. (1-β-D-Arabinofuranosyl-5-ethinyluradl)-5′-phosphorsäure-3 -dodecylmercapto-2- decyloxy)propylester
- 12. (2′-Desoxy-5-propinyluridin)-5′-phosphorsäure-(3 -dodecyl-mercapto-2-decyloxy) propylester
- 13. 2′-(9-{[(1-Hydroxymethyl)ethoxy]methyl}guanin)phosphorsäure-(3 -dodecyl- mercapto-2-decyloxy)propylester
- 14. 2′-[9-(Ethoxymethyl)guanin])phosphorsäure-(3-dodecylmercapto-2-decyl- oxy)propylester
10 mg (3′-Desoxy-3′-azidothymidin)-5′-phosphorsäure-(3-dodecyl-mercapto-2--decyl
oxy)-propylester (AZT-DMDOPE) werden in 0,5 ml 0,1 M Tris-Pufferlösung
suspendiert und nach Zugabe des Enzyms (0,5 mg bei Phosphodiesterase und 0,1 mg
bei Phospholipase/Nuclease) 15 Stunden bei 37°C inkubiert. Anschließend wird die
Lösung dünnschichtchromatographisch untersucht. Nach Zugabe von 5 Tropfen ge
sättigter NaHCO₃-Lösung wurde weitere 6 Stunden bei 37°C inkubiert und an
schließend die Lösung dünnschichtchromatographisch untersucht.
Durch Dünnschichtchromatographie mit verschiedenen Elutionsmitteln wurde die
Lösung hinsichtlich der Bildung der möglichen Spaltprodukte (AZT, AZT-mono
phosphat, DMDOP und Lipidmonophosphat) untersucht.
Folgende Enzyme wurden in dem oben genannten Test eingesetzt:
- a) Phospholipase C aus Bacillus cereus, 2000 U/0,5 ml, Boehringer Mannheim GmbH
- b) Phospholipase D, Typ I, aus Kohl, 150-300 U/mg, Sigma
- c) Phosphodiesterase aus Kalbsmilz, 2 U/mg, Boehringer Mannheim GmbH
- d) Phosphodiesterase aus Schlangengift, Boehringer Mannheim GmbH
- e) Nuclease aus Staphylococcus aureus, 15 000 U/mg, Boehringer Mannheim GmbH
- f) LCE (Lipid-Cleavage-Enzyme).
Aus der folgenden Tabelle geht hervor, daß nur im Falle der Phospholipase D eine
schwache Fluoreszenzauslöschung auf der Höhe des Lipidphosphats festgestellt wird.
In keinem der als Referenzenzyme verwendeten Fälle a)-e) konnte die Bildung von
AZT oder AZP-monophosphat nachgewiesen werden. Aus dem unveränderten AZT-
DMDOPE konnte bei diesen Versuchen kein zusätzlicher Fleck im Rahmen der
Nachweisgrenze gefunden werden.
Abb. 1: Diese Abbildung zeigt die Aktivität des LCE, das aus der
Membranfraktion von humanen, PHA-stimulierten peripheren
Blutleukozyten erhalten wurde, in Abhängigkeit von der
Proteinkonzentration. Es resultiert ein linearer Zusammenhang zwischen
der Proteinkonzentration und der Menge des gebildeten Spaltproduktes
DMDOP.
Abb. 2.: Diese Abbildung zeigt die Substratklnetik (Michaelis-Menten-Kinetik) des
LCE, das aus der Membranfraktion von humanen, PHA-stimulierten
peripheren Blutleukozyten erhalten wurde.
Abb. 3: Diese Abbildung zeigt die Substratkinetik (Michaelis-Menten-Kinetik) des
LCE, das aus der Membranfraktion von humanen, PHA-stimulierten
peripheren Blutleukozyten [∎] und aus ruhenden (nicht stimulierten)
peripheren Blutleukozyten [] erhalten wurde.
Abb. 4: Diese Abbildung zeigt die Abhängigkeit der spezifischen Enzymaktivität
des LCE, das aus der Membranfraktion von humanen, PHA-stimulierten
peripheren Blutleukozyten erhalten wurde, von der
Calciumionenkonzentration.
Abb. 5: Diese Abbildung zeigt die organ- bzw. gewebsspezifische Verteilung des
LCE von Zellmembranpräparationen am unbehandelten Hund.
Abb. 6: Intrazelluläre Konzentrationen an AZT und AZT-Nukleotiden in stimulierten
humanen PBL nach 1, 3, 6 und 24 h Inkubation mit:
- (A) 00.3 µg AZT/ml (∎) bzw. 1 µg AZT-DMDOPE/ml ()
- (B) 0.3 µg AZT/ml (∎) bzw. 10 µg AZT-DMDOPE/ml () (Mittelwerte, n = 2 Bestimmungen)
Abb.7: Intrazelluläre Konzentrationen an AZT und AZT-Nukleotiden in
nichtstimulierten humanen PBL nach 1, 3, 6 und 24 h Inkubation mit:
- (A) 00.3 µg AZT/ml (∎) bzw. 1 µg AZT-DMDOPE/ml ()
- (B) 0.3 µg AZT/ml (∎) bzw. 10 µg AZT-DMDOPE/ml () (Mittelwerte, n = 2 Bestimmungen)
Abb. 8: Intrazelluläre Konzentrationen an AZT bzw. AZT-Nukleotiden in
stimulierten humanen PBL nach 6 und 24 h Inkubation mit
1 µg AZT-DMDOPE /ml (A) bzw. 10 µg AZT-DMDOPE /ml (B):
∎ Behandlung mit alkalischer Phosphatase
keine Behandlung mit alkalischer Phosphatase
(Mittelwerte, n = 2 Bestimmungen)
Abb. 9: Intrazelluläre Konzentration an AZT und AZT-Nukleotiden in
P3X63Ag8.653-Zellen nach 6, 24 und 48 h Inkubation mit:
- (A) 00.3 µg AZT/ml (∎) bzw. 1 µg AZT-DMDOPE /ml ()
- (B) 0.3 µg AZT/ml (∎) bzw. 10 µg AZT-DMDOPE /ml () (Mittelwerte, n = 2 Bestimmungen)
Abb. 10: Intrazelluläre Konzentrationen an AZT bzw. AZT-Nukleotiden in
P3X63Ag8.653-Zellen nach 6 bzw. 24 h Inkubation mit 1 µg
BM 21.1290 Na/ml (A) bzw. 10 µg AZT-DMDOPE/ml (B):
∎ Behandlung mit alkalischer Phosphatase
keine Behandlung mit alkalischer Phosphatase (Mittelwerte, n = 2 Bestimmungen)
∎ Behandlung mit alkalischer Phosphatase
keine Behandlung mit alkalischer Phosphatase (Mittelwerte, n = 2 Bestimmungen)
Abb. 11: Intrazelluläre Abklingkinetik von AZT und AZT-Nukleotiden in stimulierten
humanen PBL nach 24 h Inkubation mit 0.3 µg AZT/ml /A) bzw. 10 µg AZT-
DMDOPE/ml (B). Intrazelluläre Konzentration an AZT und AZT-Nukleotiden
1, 3, 6, 24 und 48 h nach Entfernung der AZT- bzw. AZT-DMDOPE-Inkuba
tionslösung (Mittelwerte, n = 2 Bestimmungen)
Abb. 12: Enymatische Spaltung von [¹⁴C]-AZT-DMDOPE durch Membranfraktionen
(100 µg Protein/Ansatz) stimulierter humaner PBL. DC-Chromatogramm der n-
Heptan-Phase nach Adsorption des Substrates an Kieselgel 60 H und Trennung
im IBA-System (2-Propanolol : n-Butylacetat: Aqua bidest., 10 : 6 : 4, v/v/v) mit
Kieselgel 60 als stationärer Phase
Abb. 13: Spezifische Aktivität [pmol mg-1 min-1] des LCE in Zellhomogenaten, Zytosol
und Membranfraktionen stimulierter humaner PBL (Mittelwert ± SD, n = 6
Bestimmungen).
Abb. 14: Spaltung von AZT-DMDOPE durch die Membranfraktionen stimulierter
humaner PBL in Abhängigkeit von der Proteinkonzentration (Mittelwert ± SD,
n = 3 Bestimmungen).
Abb. 15: Spaltung von AZT-DMDOPE durch die Membranfraktion humaner
Monozyten/Makrophagen (stimulierte Monozyten) in Abhängig
keit von der Proteinkonzentration (Mittelwert, n = 2 Bestimmungen)
Abb. 16: Spezifische Aktivität des LCE durch Membranfraktionen stimulierter und
nichtstimulierter humaner PBL sowie humaner Monozyten und Mono
zyten/Makrophagen (stimulierte Monozyten) (humane PBL: Mittelwert
± SD, n = 6 Bestimmungen) (humane Monozyten: Mittelwert ± SD, n = 4
Bestimmungen).
Abb. 17: Spaltung von AZT-DMDOPE durch Membranfraktionen stimulierter humaner
PBL in Abhängigkeit von der Inkubationszeit (Mittelwert ± SD, n = 3
Bestimmungen).
Abb. 18: DC-Chromatogramm von [¹⁴C]-AZT-DMOPE (A) und von [¹⁴C]-AZT-
DMDOPE nach enzymatischer Spaltung durch Zellhomogenate von 5 × 10⁷
CEM-SS-Zellen (B) nach einer Inkubation von 6 h bei 37°C. Extraktion der
Thioetherlipide mit Diethylether : 2-Propanol (9 : 1, v/v) und Trennung im IBAE-
System (2-Propanol : n-Butylacetat : Aqua bidest : Eisessig, 3 : 5 : 1 : 1, v/v/v/v) mit
Kieselgel 60 als stationärer Phase.
Die zur Herstellung von Membran- und Zytosolfraktionen kultivierten Zellen wurden
in Polypropylenröhrchen (50 ml) überführt und in der Minifuge T bei Raumtemperatur
mit 1600 rpm für 10 min sedimentiert. Zur Entfernung von Resten des Kulturmediums
wurde das Zellsediment dreimal mit kaltem PBS gewaschen und in Aufschlußpuffer
mit einer Zelldichte von 1-5 × 10⁸ Zellen/ml aufgenommen. Die Zellsuspension
wurde anschließend in einen auf Eis gekühlten Glashomogenisator überführt. Durch
mehrmaliges Bewegen eines Teflonkolbens wurden die Zellen mechanisch
aufgeschlossen, wobei der Zellaufschluß im Umkehr-Phasenkontrast-Mikroskop
optisch kontrolliert wurde. Die aufgeschlossenen Zellen wurden anschließend zur
Entfernung der Zellkerne und der nicht aufgeschlossenen Zellen in der Minifuge T bei
4°C mit 1700 rpm für 10 min zentrifugiert. Der Überstand wurde vorsichtig mit einer
Pipette abgehoben und mit 50 mM Tris-Puffer (pH 7.5) auf 10% (w/v) Saccharose
verdünnt. Das Zellhomogenat wurde nach Portionierung bei -70°C gelagert oder zur
Isolierung von Membran- und Zytosolfraktionen herangezogen. Hierfür wurden 3.2 ml
des Zellhomogenates in auf Eis gekühlte, dickwandige Polycarbonatröhrchen (3.2 ml)
überführt und in der Beckmann-Tabletop-Ultrazentrifuge mit TLA-100.4 Rotor für 1 h
bei 4°C und 75 000 rpm zentrifugiert. Die Überstände wurden vorsichtig mit einer
Combitip-Pipette abgehoben und die gut sichtbaren Membransedimente mit jeweils
1 ml 50 mM Tris-Puffer (pH 7.5)/10% Saccharose versetzt. Das Membransediment
wurde mit Hilfe einer Spritze (5 ml) mit Kanüle (0.9 × 40 mm) grob homogenisiert.
Die Grobhomogenate wurden vereinigt und unter Verwendung von Kanülen kleineren
Durchmessers (0.8 × 40 mm und 0.45 × 25 mm) fein homogenisiert. Die Membran-
und Zytosolfraktionen wurden nach Portionierung bei -70°C gelagert.
Zum Lösen der Saccharose muß der Puffer unter Rühren leicht
erwärmt werden.
Humane PBL wurden durch Zentrifugation im isotonischen Dichtegradienten isoliert
und mit PHA-M 72 h stimuliert. Zur Entfernung von Resten des
Kultivierungsmediums wurden die Zellen dreimal mit kaltem PBS gewaschen und nach
Bestimmung der Zellzahl in flüssigem N₂ eingefroren und anschließend bei -70°C
gelagert. Die Lyse der Zellen erfolgte durch dreimaliges Auftauen und Einfrieren in
Puffer 1, wobei eine Zelldichte von 2.5 × 10⁸ Zellen/ml eingestellt wurde. In Ti60-
Zentrifugenröhrchen (30 ml) wurde eine Mischung aus 11 ml Percoll und 2. 13 ml
Puffer 2 vorgelegt, welche zuvor mit 70 µl 2 N NaOH auf pH 9 eingestellt wurde. Zur
Isolierung der Plasmamembran wurden 4 ml des Homogenates auf die Mischung
aufgetragen und anschließend im Ti60-Rotor bei 4°C und 39 000 rpm für 10 min mit
ausgeschalteter Bremse in der Beckmann-Ultrazentrifuge L 5 50 fraktioniert. Aus der
oberen Phase der Zentrifugenröhrchen wurden 1 ml Fraktionen entnommen und mit
2 ml Puffer 3 verdünnt. Die Lösungen wurden anschließend in Ti50-Röhrchen
(10.4 ml) überführt und zur Entfernung von Resten des Trennmediums in der
Beckmann-Ultrazentrifuge L 5 50 mit Ti50-Rotor bei 4°C und 45 000 rpm für 45 min
zentrifugiert. Die Überstände wurden mit einer Pipette abgehoben, fraktioniert, in
flüssigem N₂ eingefroren und bei -70°C gelagert. Die Charakterisierung der
Fraktionen erfolgte durch Bestimmung des Proteingehaltes und der Enzymaktivität der
alkalischen Phosphatase.
Als Substrat wurde im LCE-Assay ein Gemisch aus [¹⁴C]-AZT-DMDOPE und
nichtradioaktiv markiertem AZT-DMDOPE eingesetzt.
Ausgehend von einer [¹⁴C]-AZT-DMDOPE Stammlosung wurde durch Verdünnung mit
Ethanol eine Lösung mit einer spezifischen Aktivität von 83.27 kBq/ml hergestellt. Die
ethanolische Lösung konnte bei 4°C unter Inertgas für 2 Monate gelagert werden.
In einem getrennten Ansatz wurde die nichtradioaktiv markierte Komponente des
Substanzgemisches hergestellt. Hierfür wurde in Ethanol eine Lösung von AZT-DMDOPE
mit einer Konzentration von 1 µmol/ml angesetzt und für 1 min im Eis/Wasserbad mit dem
Ultraschallstab bei 30% Energieabgabe kontinuierlich beschallt.
Zur Herstellung des Substratgemisches aus radioaktivem und nichtradioaktivem AZT-
DMDOPE wurden aus diesen ethanolischen Lösungen pro Ansatz 1.67 kBq an radioaktiv
markiertem [¹⁴C]-AZT-DMDOPE und 0.7-5 nmol der nichtmarkierten Verbindung in ein
Glasröhrchen (10 ml) überführt. Das Lösungsmittel wurde im N₂-Strom evaporiert und
AZT-DMDOPE in einem geeigneten Volumen an Aqua bidest. aufgenommen und für 1 min
unter Kühlung im Eis/Wasserbad bei 30% Energieabgabe kontinuierlich beschallt.
Zur Untersuchung der enzymatischen Spaltung in Abhängigkeit von der Zeit und der
Proteinkonzentration wurden üblicherweise 5 nmol AZT-DMDOPE und 0.98 nmol [¹⁴C]-
AZT-DMDOPE (1.67 kBq) in einem Volumen von 200 µl Aqua bidest. im LCE-Assay
eingesetzt. Das Pipettierschema ist in der folgenden Tabelle angegeben.
Zur Untersuchung der enzymatischen Spaltung in Abhängigkeit von der
Substratkonzentration wurde eine Substratstammlösung von 0.98 nmol [¹⁴C]-AZT-
DMDOPE und 0.7 nmol AZT-DMDOPE/80 µl Aqua bidest. im LCE-Assay angesetzt. Die
verschiedenen Substratkonzentrationen im LCE-Assay wurden durch kontinuierliche
Verdopplung bzw. Halbierung des Volumens an Substratlösung eingestellt. Die Ansätze
wurden in Glasröhrchen (5 ml) vorgelegt und durch Zugabe der Substratlösung gestartet.
Die Inkubation wurde bei 37°C im Wasserbad unter leichtem Schütteln durchgeführt.
Die Reaktionsansätze des LCE-Assays wurden nach entsprechender Inkubationszeit dem
Wasserbad entnommen, und die Reaktion durch Zugabe von 750 µl 2-Propanol gestoppt.
Nach gründlicher Durchmischung wurden die Ansätze anschließend mit 700 µl auf
Raumtemperatur erwärmtem n-Heptan versetzt. Die Ansätze wurden erneut für 30 sec gut
gemischt und zur Beschleunigung der Phasentrennung in der Minifuge T bei 3200 rpm für
15 min bei Raumtemperatur zentrifugiert. Anschließend wurden 500 µl der oberen Phase (n-
Heptan) entnommen und in neue Glasröhrchen (5 ml) mit 10 mg Kieselgel 60 H und 200 µl
n-Heptan überführt. Die Ansätze wurden für 30 sec gut durchmischt und zur Sedimentation
des Kieselgels für 10 min unter oben genannten Bedingungen zentrifugiert. Vom Überstand
wurden anschließend 500 µl entnommen und mit 3 ml Szintillationsflüssigkeit versetzt. Die
Messung der Radioaktivität erfolgte für 4 min im Flüssigkeits-Szintillations-Analysator. Zur
Bestimmung des Absolutwertes an Radioaktivität wurden 200 µl der Substratlösung mit 3
ml Szintillationsflüssigkeit versetzt und unter gleichen Bedingungen im Flüssigkeits-
Szintillations-Analysator gemessen.
Zur Bestimmung der intrazellulären Konzentrationen an AZT und/oder AZT-
Nukleotiden nach Inkubation mit AZT-DMDOPE bzw. AZT wurden humane PBL aus
"Bufty coat" isoliert.
Hierfür wurde "Bufty-coat" von gesunden Spendern gemischt und durch Zentrifugation
in einem isotonischen Medium mit einer Dichte von 1.077 g/ml fraktioniert. Da
mononukleare Blutzellen (Monozyten und Lymphozyten) eine geringere Dichte als
Erythrozyten und polymorphkernige Granulozyten haben, bilden sie einen Ring an der
Grenze zwischen Trennmedium und Probe und können mit Hilfe einer Pipette
abgenommen werden. Erythrozyten und polymorphkernige Granulozyten sedimentieren
aufgrund ihrer höheren Dichte durch das Medium und lassen sich somit von PBL
separieren.
Zur Stimulation der Zellproliferation wurde Phytohämagiutinin A (Mukoprotein) (PHA-
M), der mitogene Lektinextrakt aus der roten Feuerbohne (Phaseolus vulgaris), einge
setzt. Phytohämagglutinin ist eine Familie von 5 Isolektinen, die als Tetramere vorlie
gen. Die Untereinheiten bestehen aus einem lymphozytenreaktiven Typ-L und einem
erythrozytenreaktiven Typ-E. Typ-L hat eine hohe Affinität zu Lymphozytenoberflä
chenrezeptoren und ist somit verantwortlich für die mitogenen Eigenschaften. Die Sti
mulation der Lymphozyten wurde in KPMI 1640 Komplettmedium III für 72 h bei
37°C und 5% CO₂ durchgeführt. Nach Beendigung der Stimulation wurden zur Erhö
hung der Zellzahl die Zellen für weitere 24 h in RPMI 1640 Komplettmedium IV kulti
viert.
Zur Bestimmung der intrazellulären Konzentrationen an AZT und AZT-Nukleotiden
wurden die Zellen in RPMI 1640 Komplettmedium II mit einer Dichte von
1 × 10⁶ Zellen/ml in Gewebekulturflaschen (50 ml/25 cm²) überführt, und in
Anwesenheit von 0.03 bzw. 0.3 µg AZT/ml (Charge 15) und 1 bzw. 10 µg AZT-
DMDOPE/ml für 1-24 h inkubiert.
Die Konzentrationen an AZT-DMDOPE und AZT orientierten sich hierbei an den
IC50-Werten für die antiretrovirale Wirksamkeit, die für AZT und AZT-DMDOPE in
HIV-1-infizierten humanen PBL ermittelt wurden.
Die Kulturen wurden anschließend für 1, 3, 6 und 24 h bei 37°C und 5% CO₂
inkubiert. AZT und seine Nukleotide wurden anschließend mit 60% Methanol
extrahiert. Die extrahierten Nukleotide wurden mit alkalischer Phosphatase quantitativ
zu AZT dephosphoryliert, da nur AZT, nicht jedoch die entsprechenden Nukleotide mit
Hilfe eines Radioimmuno-Assays detektiert werden kann.
Die Konzentrationen an intrazellulärem AZT, die mit Hilfe des Radioimmuno-Assays
bestimmt wurden, setzten sich dementsprechend aus der des AZT und den der AZT-
Nukleotide zusammen. Eine separate Quantifizierung der Konzentrationen an AZT-MP,
AZT-DP und AZT-TP wurde nicht durchgeführt. Experimentelle Beobachtungen an
stimulierten PBL konnten eine im Vergleich zu AZT-DP und AZT-TP um Faktor 40
höhere Konzentration an AZT-MP belegen (Arn´r et al., 1992, J. Biol. Chem. 267,
10968-10975). Entsprechend kann angenommen werden, daß sich die Nukleotidfraktion
fast ausschließlich aus AZT-MP zusammensetzt.
In stimulierten humanen PBL wurden bei Inkubation mit 0.03 bzw. 0.3 µg AZT/ml
maximale Konzentrationen von 2.90 bzw. 30.97 ng/10⁶ Zellen nach einer Inkubation
von 6 bzw. 3 h erreicht (Abb. 6). Die Konzentrationen fielen anschließend bei
zunehmender Inkubationszeit auf 2.32 bzw. 19.88 ng/10⁶ Zellen ab. Nach Inkubation
mit 1 bzw. 10 µg AZT-DMDOPE/ml zeigte sich ein über die gesamte Inkubationszeit
stetig steigender intrazellulärer Spiegel an AZT und seiner Nukleotiden. Nach 24 h
Inkubation mit AZT-DMDOPE und AZT waren die intrazellulären Spiegel identisch. In
weiteren Experimenten konnte gezeigt werden, daß nach einer Inkubationszeit von
18-48 h die intrazellulären Konzentrationen an AZT und AZT-Nukleotiden nach
Inkubation mit AZT-DMDOPE sogar größer sind als nach Inkubation mit der
äquipotenten Konzentration an AZT.
Bei nichtstimulierten humanen PBL kehrten sich die Verhältnisse um (Abb. 7). So
waren die intrazellulären Konzentrationen an AZT und AZT-Nukleotiden nach
Inkubation mit AZT-DMDOPE über die gesamte Inkubationszeit größer als nach
Inkubation mit der äquipotenten Konzentration an AZT. Nach Inkubation mit 1 bzw.
10 µg AZT-DMDOPE/ml wurden maximale intrazelluläre Konzentrationen an AZT und
AZT-Nukleotiden von 0.62 bzw. 4.74 ng/10⁶ Zellen erreicht, während nach Inkubation
mit 0.03 bzw. 0.3 µg AZT/ml Konzentrationen von 0.10 bzw. 0.47 ng/10⁶ Zellen
detektiert werden konnten.
Zur separaten Quantifizierung von AZT und den AZT-Nukleotiden nach Inkubation mit
BM 21. 1290 Na wurden alle intrazellulären Konzentrationen an AZT und AZT-
Nukleotiden mit und ohne Behandlung mit alkalischer Phosphatase bestimmt. Diese
Experimente wurden an stimulierten humanen PBL durchgeführt.
Hierfür wurden Zellsuspensionen mit einer Dichte von 10⁶ Zellen/ml mit 1 bzw. 10 µg
AZT-DMDOPE/ml für 6 bzw. 24 h bei 37°C und 5% CO₂ inkubiert. Die maximalen
intrazellulären Konzentrationen an freiem AZT nach Inkubation mit 1 bzw. 10 µg AZT-
DMDOPE/ml wurden nach 6 bzw. 24 h mit 0.03 bzw. 0.15 ng/10⁶ Zellen detektiert
(Abb. 8). Wurden nach Behandlung mit alkalischer Phosphatase zusätzlich die
phosphorylierten intrazellulären AZT-Nukleotide erfaßt. So wurden nach 24 h maximale
Konzentrationen von 3.85 bzw. 6.41 ng/10⁶ Zellen gefunden.
Die Bestimmung der intrazellulären Konzentrationen an AZT und AZT-Nukleotiden in
Thymidikinasedefizienten Zellen sollte weitere Erkenntnisse über die intrazelluläre
Spaltung der Testsubstanz AZT-DMDOPE liefern. Intrazelluläres AZT kann in diesen
Zellen aufgrund eines Mangels an Thymidin-Kinase (TK) nicht in ATZ-MP und somit in
das therapeutisch wirksame AZT-TP überführt werden. Die Bestimmung der
intrazellulären Konzentrationen an AZT und AZT-Nukleotiden nach Inkubation mit
AZT-DMDOPE könnte somit einen weiteren Hinweis auf die Spaltung der
Teststubstanz geben.
Hierfür wurden in Gewebekulturschalen (60 × 15 mm) 1 × 10⁷ Zellen in RPMI 1640
Komplettmedium I mit 0.03 bzw. 0.3 µg AZT/ml und 1 bzw. 10 µg AZT-DMDOPE/ml
über 6, 24 und 48 h inkubiert. Nach Extraktion von AZT und der AZT-Nukleotide und
einer Behandlung mit alkalischer Phosphatase wurde die Konzentration an AZT mit
Hilfe des Radioimmuno-Assays bestimmt.
Der graphischen Auftragung der Versuchsergebnisse ist zu entnehmen, daß die
intrazellulären Konzentrationen an AZT und AZT-Nukleotiden mit AZT-DMDOPE
deutlich höher waren als nach Inkubation mit äquipotenten Konzentrationen an AZT.
So wurden nach 6 h Inkubation mit 1 bzw. 10 µg AZT-DMDOPE/ml maximale
Konzentrationen an AZT und AZT-Nukleotiden von 0.55 bzw. 4.40 ng/10⁶ Zellen
erreicht (Abb. 9).
Die maximalen intrazellulären Konzentrationen an AZT und AZT-Nukleotiden nach
Inkubation mit 0.03 bzw. 0.3 µg AZT/ml wurden nach 48 h mit 0.03 bzw.
0.31 ng/10⁶ Zellen bestimmt.
Zur Quantifizierung der Anteile an phosphoryliertem AZT wurden die intrazellulären
Konzentrationen an AZT und AZT-Nukleotide vor und nach einer Behandlung der
zellulären Extrakte mit alkalischer Phosphatase verglichen. Die Substanzspiegel an
phosphoryliertem AZT nach Inkubation mit 1 bzw. 10 µg AZT-DMDOPE/ml ergaben
hierbei Werte von 0.48 bzw. 2.42 ng/10⁶ Zellen (Abb. 10). Wurde nur AZT erfaßt, so
wurden nach 24 h maximale Konzentrationen von 0.05 bzw. 1. 10 ng/ml erreicht. Die
Unterschiede in den intrazellulären Konzentrationen an AZT-Nukleotiden nach
Inkubation mit AZT und AZT-DMDOPE können durch eine intrazelluäre Spaltung der
Testsubstanz AZT-DMDOPE zu AZT-MP erklärt werden.
Stimulierte humane PBL wurden für 24 h mit 0.3 µg AZT/ml bzw. 10 µg AZT-
DMDOPE/ml inkubiert. Anschließend wurden 1 × 10⁷ Zellen in Gewebekulturflaschen
(50 ml/25 cm²) mit RPMI 1640 Komplettmedium I überführt. Nach 1, 3, 6, 24 und 48 h
wurde AZT und die AZT-Nukleotide aus der zellulären Matrix extrahiert. Nach einer
Behandlung mit alkalischer Phosphatase wurde mit Hilfe des Radioimmuno-Assays die
Konzentration an AZT bestimmt.
Der graphischen Darstellung der Versuchsergebnisse ist zu entnehmen, daß nach
Inkubation der Zellen mit AZT die intrazellulären Konzentrationen an AZT und AZT-
Nukleotiden rasch abfallen und nach 6 h einen konstanten Wert von 0.40 ng/10⁶ Zellen
erreichen. Bei Inkubation mit einer äquipotenten Konzentration an AZT-DMDOPE
hingegen nehmen die AZT bzw. AZT-Nukleotide weniger stark ab und erreichen nach
3 h bei einer wesentlich höheren Konzentration einen über 48 h konstanten Wert von
1.80 ng/10⁶ Zellen (Abb. 11). Da nichtphosphoryliertes AZT durch mehrmaliges
Waschen mit PBS aus der Zelle entfernt wurde sind die intrazellulären Konzentrationen
hauptsächlich auf phosphorylierte AZT-Nukleotide zurückzuführen. Eine Inkubation
mit AZT-DMDOPE stellt somit, im Vergleich zu einer aquipotenten Konzentration an
AZT, der Zelle eine um Faktor 4.5 höhere Konzentration an phosphoryliertem AZT zur
Verfügung. Diese großen Unterschiede in den zellulären Konzentrationen an AZT-
Nukleotiden nach Inkubation mit AZT-DMDOPE und AZT können durch eine direkte
intrazelluläre Spaltung des Thioetherlipid-AZT-Konjugates AZT-DMDOPE zu AZT-
MP und dem korrespondierenden Thioetherlipidteil DMDOP erklärt werden.
Untersuchungen zur enzymatischen Spaltung von AZT-DMDOPE durch Zellhomogenate
humaner PBL und CEM-SS-Zellen konnten zeigen, daß AZT-DMDOPE zu DMDOP und
AZT-MP metabolisiert wird. Die Charakterisierung des LCE war Ziel der folgenden
Untersuchungen. So wird die enzymatische Spaltung von AZT-DMDOPE in Abhängigkeit
von der Proteinkonzentration, der Inkubationszeit und zweiwertiger Metallkationen
untersucht. In Abhängigkeit verschiedener Substratkonzentrationen wird in
enzymkinetischen Untersuchungen die apparenten Michaelis-Menten-Parameter KM und
vmax bestimmt.
Für diese Untersuchungen ist ein Enzym-Assay etabliert, in dem AZT-DMDOPE und
[¹⁴C]-AZT-DMDOPE als Substrat eingesetzt wurde (Beispiel 6). Bei protein- und
zeitabhängigen Messungen wurden 5 nmol AZT-DMDOPE und 0.98 nmol (1.67 kBq) [¹⁴C]-
AZT-DMDOPE /Ansatz verwendet. Bei substratabhängigen Umsetzungen wurde eine
Staminlösung von 0.98 nmol [¹⁴C]-AZT-DMDOPE und 0.7 nmol AZT-DMDOPE /80 µl
eingesetzt. Die verschiedenen Substratkonzentrationen wurden anschließend durch
kontinuierliche Verdopplung bzw. Halbierung des Volumens an Substratlösung eingestellt.
Als Enzymquelle können z. B. Zellhomogenate, Zytosol- und Membranfraktionen bekannter
Proteinkonzentrationen von verschiedenen humanen Zellen eingesetzt werden.
Die Quantifizierung der enzymatischen Spaltung von AZT-DMDOPE wurde durch eine
zweistufige Extraktion des Metaboliten DMDOP mit n-Heptan und anschließender
Adsorption von Resten des Substrates AZT-DMDOPE an Kieselgel 60 H durchgeführt.
Hierbei wurden die Reaktionsansätze mit 2-Propanol und n-Heptan versetzt, wobei sich
das im Vergleich zum Substrat unpolare DMDOP in der n-Heptan-Phase anreichert. Die
n-Heptan-Phase wurde dann mit Kieselgel 60 H versetzt, wobei Reste des Substrates
AZT-DMDOPE adsorbiert werden. Die n-Heptan-Phase wurde anschließend durch
Zentrifugation vom Kieselgel separiert, in 3 ml Aqua luma überführt und die in ihr
enthaltene Menge an radioaktiv markiertem DMDOP im Flüssigkeits-Szintillations-
Analysator über einen Zeitraum von 5 min bestimmt. Aus diesen Ergebnissen konnte die
prozentuale Umsetzung des Substrates AZT-DMDOPE zu DMDOP und die spezifische
Aktivität des LCE errechnet werden. Als spezifische Aktivität wurde hierbei die Menge
an DMDOP bezeichnet die pro 1 mg Protein der eingesetzten Zellpräparationen pro
Minute gebildet wurde.
Zur Überprüfung der selektiven Extraktion von DMDOP aus dem Reaktionsgemisch
wurden Optimierungsexperimente mit Membranfraktionen stimulierter humaner PBL
durchgeführt. Die Proteinkonzentration war hierbei 100 µg/Ansatz. Parallel wurden
Ansätze ohne Protein mitgeführt. Nach der Extraktion wurde die n-Heptan-Phase im
N₂-Strom evaporiert, und die Rückstände in einem Gemisch aus Methanol und
Essigsäureethylester (1 : 1, v/v) aufgenommen.
Die dünnschichtchromatographische Analyse erfolgte im IBA-System. Der
Reaktionswert ließ hierbei nur den Peak der Muttersubstanz [¹⁴C]-AZT-DMDOPE
erkennen. Im Reaktionsansatz wurde ein Substanzpeak am Ende der Laufmittelfront
detektiert, der aufgrund des Rf-Wertes eindeutig als der Metabolit [¹⁴C]-DMDOP
identifiziert werden konnte (Abb. 12). Der Peak, der unmittelbar vor dem DMDOP-
Substanzpeak läuft, kann keiner der bekannten Verbindungen zugeordnet werden.
Vermutlich handelt es sich hierbei um eine Verbindung, die durch Oxidation des
Schwefels im Thioetherlipidteil von DMDOP entstanden ist. Durch eine Extraktion mit
n-Heptan konnte somit eine Isolation des enzymatischen Spaltproduktes DMDOP aus
dem Enzym-Assay durchgeführt werden. Eine einfache und schnelle Quantifizierung des
aus AZT-DMDOPE freigesetzten Metaboliten DMDOP war somit gewährleistet.
In einer ersten Versuchsreihe wurde die enzymatische Spaltung von AZT-DMDOPE
durch Zellhomogenate sowie durch Zytosol- und Membranfraktionen stimulierter
humaner PBL untersucht.
Nach Bestimmung der Proteinkonzentration in Zellhomogenaten, Zytosol- und
Membranfraktionen mit Hilfe des Bicinchoninsäure(BCS)-Tests wurden 0.025-0.20 mg
Protein/Ansatz eingesetzt. Die Reaktionsansätze wurden 2 h bei 37°C
inkubiert, anschließend das Produkt DMDOP durch Extraktion mit n-Heptan aus den
Ansätzen isoliert und die spezifische Aktivität des LCE bestimmt (Abb. 13).
Die AZT-DMDOPE-spaltende Aktivität war im Zellhomogenaten und in den
Zytosolfraktionen mit 6.48 ± 0.38 (n = 6) und 1.65 ± 0.40 pmol mg-1 min-1 (n = 6) um
Faktor 1.59 bzw. 6.3 kleiner als die spezifische Aktivität in den Membranfraktionen mit
14.23 ± 0.70 (n = 6) pmol mg-1 min-1. Bei Isolierung der Membranfraktionen kommt
es offensichtlich zu einer Anreicherung des LCE. Basierend auf diesen Ergebnissen
wurden in den sich anschließenden Experimenten zur Bestimmung der enzymatischen
Parameter des LCE Membranfraktionen eingesetzt.
Die Membranfraktion, die durch den mechanischen Aufschluß der Zellen und
anschließender Ultrazentrifugation des Zellhomogenates gewonnen wurde, stellt ein
Gemisch aus Fragmenten der Plasma- und Kernmembran sowie der Membranen der
Zellorganellen dar.
Eine Differenzierung der verschiedenen Membranfragmente war durch
Ultrazentrifugation eines Zellhomogenates im Percoll-Dichtegradienten und einer sich
anschließenden. Charakterisierung durch den Plasmamembranmarker alkalische
Phosphatase möglich.
Zur Isolierung der Plasmamembranen wurden 2 ml einer Zellsuspension stimulierter
humaner PBL mit einer Zelldichte von 2.5 × 10⁸ Zellen/ml durch dreimaliges Einfrieren
und Auftauen aufgeschlossen und durch Zentrifugation im Percoll-Dichtegradienten
fraktioniert. Dem Zentrifugat wurden 10 Fraktionen (1 ml) entnommen, Reste des
Trennmediums entfernt und in den einzelnen Fraktionen die Aktivität der alkalische
Phosphatase mit p-Nitrophenylphosphat als Substrat bei 305 nm gemessen.
Die höchste Aktivität an alkalischer Phosphatase war in Fraktion 8 zu bestimmen. Die
Absorption der verbleibenden Fraktionen war wesentlich geringer. Dies weist auf eine
Anreicherung der Plasmamembranen in Fraktion 8 hin. In jeder Fraktion wurde nach
Bestimmung der Proteinkonzentration die spezifische LCE-Aktivität ermittelt. Hierfür
wurde eine Proteinkonzentration von 0.05 mg/Ansatz eingestellt und die
Reaktionsansätze bei 37°C für 2 h inkubiert. Die höchste spezifische LCE-Aktivität von
4.40 pmol mg-1 min-1 konnte hierbei in Fraktion 8 bestimmt werden.
In allen weiteren Fraktionen wurden geringere spezifische Aktivitäten von 1.10-1.90
pmol mg-1 min-1 gemessen (Abb. 4.32). Die höchste spezifische Aktivität des LCE
wurde somit in der Fraktion bestimmt, die gleichzeitig die höchste Aktivität an
alkalischer Phosphatase aufweist. Dieser Befund zeigt somit das Vorkommen des LCE
in der Fraktion mit dem höchsten Anteil an Fragmenten der Plasmamembran an.
In weiterführenden Untersuchungen sollte die Umsetzung von AZT-DMDOPE in
Abhängigkeit steigender Proteinkonzentrationen der Zellpräparationen bestimmt
werden.
Hierbei wurden Membranfraktionen stimulierter und nichtstimulierter humaner PBL
sowie humaner Blutmonozyten verwendet. Die Umsetzung von AZT-DMDOPE zu
DMDOP durch die Membranfraktionen stimulierter humaner PBL wies beim Einsatz
von 0.025-0.2 mg Protein/Ansatz lineares Verhalten auf (Abb. 14). Die spezifische
LCE-Aktivität betrug 14.23 ± 0.7 pmol mg-1 min-1 (n = 6) (Abb. 16). Bei der
Umsetzung von AZT-DMDOPE durch Proteine der Membranfraktion nichtstimulierter
humaner PBL zeigte sich eine lineare Abhängigkeit nur im Konzentrationsbereich bis zu
0.05 mg Protein/Ansatz. Bei höheren Proteinkonzentrationen war keine Linearität mehr
gegeben. Die spezifische LCE-Aktivität, die aus den Umsetzungen im linearen Bereich
berechnet wurde, betrug 1.45 ± 0.32 pmol mg-1 min-1 (n = 6).
Zur Bestimmung der spezifischen LCE-Aktivität in humanen Blutmonozyten wurden
diese im hypertonischen Dichtegradienten isoliert. Monozyten haben mit 1.068 g/ml im
Durchschnitt eine etwas geringere Dichte als Lymphozyten mit 1.070 g/ml. Dieser
Unterschied in der Dichte ist allerdings sehr gering, so daß eine Trennung dieser
Blutzellen in einem isotonischen Gradienten nicht möglich ist.
Unter hypertonischen Bedingungen verlieren Lymphozyten schneller Wasser als
Monozyten, resultierend in einer Zunahme ihrer Dichte. In einem hypertonischen
Trennmedium ist es deshalb möglich, Monozyten aus Vollblut oder leukozytenreichem
Plasma zu isolieren. Eine Isolierung humaner Blutmonozyten ist ebenfalls aus "Buffy
coat" möglich. Hierbei wurden mononukleare Zellen unter isotonischen Bedingungen im
Dichtegradienten getrennt und Monozyten anschließend in Gewebekulturflaschen
(175 cm²/800 ml) durch ihre Adhärenz separiert.
Mit Hilfe der durchflußzytofluometrischen Analyse konnte nach Bestimmung von
Größe und Granularität sowie nach spezifischer Antikörperfärbung eine Stimulation
dieser Zellen durch Adhärenz nachgewiesen werden. Aufgrund dieser Stimulation
wurden die Monozyten, die durch Adhärenz am Boden der Gewebekulturflaschen
isoliert wurden, im folgenden als Monozyten/Makrophagen (stimulierte Monozyten)
bezeichnet.
Bei enzymatischen Umsetzungen von AZT-DMDOPE durch die Membranfraktion
humaner Monozyten, die im Verlauf ihrer Isolierung durch Adhärenz stimuliert wurden,
konnte eine lineare Abhängigkeit bis zu einer Konzentration von 0. 1 mg Protein/Ansatz
festgestellt werden (Abb. 15). Die spezifische Aktivität betrug 8.8 ± 0.26 pmol mg-1
min-1 (n = 4) (Abb. 16). Wurden die Monozyten direkt im hypertonischen
Dichtegradienten isoliert, so zeigt sich bei der enzymatischen Spaltung lineares
Verhalten nur bis zu einer Proteinkonzentration von 0.025 mg Protein/Ansatz. Bei
höheren Proteinkonzentrationen blieb der Substratumsatz nahezu konstant. Die
spezifische Aktivität wurde analog zu Umsetzungen mit Membranfraktionen
nichtstimulierter humaner PBL aus dem linearen Bereich berechnet und betrug
3.2+0.60 pmol mg-1 min-1 (n=4).
Zusammenfassend läßt sich feststellen, daß bei der Umsetzung von AZT-DMDOPE
durch Enzyme der Membranfraktionen stimulierter humaner PBL und Monozyten
höhere spezifische LCE-Aktivitäten beobachtet wurden als bei Umsetzung von AZT-
DMDOPE durch Membranfraktionen nichtstimulierter Zellen (Abb. 16).
Die enzymatische Spaltung der Versuchssubstanz AZT-DMDOPE in Abhängigkeit von
der Inkubationszeit wurde mit Membranfraktionen stimulierter humaner PBL als
Enzymquelle durchgeführt. Die Reaktionsansätze wurden 0.5, 1, 2, 3, und 6 h bei 37°C
inkubiert und anschließend die Menge des Metaboliten DMDOP bestimmt. Nach
graphischer Auftragung der Versuchsergebnisse konnte gezeigt werden, daß die
Umsetzung von AZT-DMDOPE zu DMDOP über den gesamten Zeitraum der
Inkubation von 0.5-6 h Linearität zu erkennen ist (Abb. 17).
Die Abhängigkeit der enzymatischen Spaltung von AZT-DMDOPE durch das LCE von
zweiwertigen Metallkationen wurde mit Membranfraktionen stimulierter humaner PBL
als Enzymquelle untersucht.
Die zweiwertigen Metallkationen wurden in einer Konzentration von 2 mM im LCE-
Assay eingesetzt. Die Proteinkonzentration wurde mit 0.068 mg/Ansatz festgelegt.
Parallel wurde ein Ansatz mit EGTA mitgeführt. EGTA ist ein spezifischer
Komplexbildner für Ca2+ das essentiell für die Aktivität der Phospholipase C ist. Nach
einer Inkubationszeit von 2 h bei 37°C wurde der Umsatz der Muttersubstanz
gemessen und die spezifische Aktivität des LCE bestimmt (folgende Tabelle).
Die höchste spezifische Aktivität wurde bei Verwendung von EGTA und MgCl₂ mit
10.41 ± 1.37 (n = 3) bzw. 10.34 ± 2.08 pmol mg-1 min-1 (n = 3) erreicht. Wurde im
Enzym-Assay die CaCl₂ eingesetzt, so konnte eine spezifische Aktivität von 6. 19 ±
0.26 pmol mg-1 min-1 (n = 3) bestimmt werden. Dies bedeutet im Vergleich zum
Ansatz mit EGTA eine Hemmung der LCE-Aktivität von 41.0 ± 0.25% (n = 3). ZnCl₂
und MnCl₂ führten zu einer totalen Hemmung der Umsetzung von AZT-DMDOPE zu
DMDOP und AZT-MP.
Zur Bestimmung der apparenten Michaelis-Menten-Parameter für das LCE wurde die
enzymatische Spaltung von AZT-DMDOPE in Abhängigkeit steigender
Substratkonzentrationen untersucht.
Hierfür wurden Membranfraktionen stimulierter und nichtstimulierter humaner PBL
sowie humaner Monozyten und Monozyten/Makrophagen (stimulierte Monozyten)
eingesetzt. Die Reaktionsansätze enthielten eine konstante Proteinmenge von
0.068 mg/Ansatz und wurden bei 37°C für 2 h inkubiert. Anschließend wurde die
Menge des Metaboliten DMDOP bestimmt.
Zur Bestimmung der pharmakokinetischen Parameter der Versuchssubstanz AZT-DMDOPE
wurden In-vivo-Experimente an weiblichen Balb/c-Mäusen (Charles River Wiga, Sulzfeld;
Bormholtgard, Ry (Dänemark); Iffa Credo, L′Abresle (Frankreich)) durchgeführt. Die
Tierlieferungen wurden vor Versuchsbeginn auf Virusantikörper (Mäuse Heptatisvirus, Reo-
Virus, Paro-Virus) untersucht. In den Versuchen wurden nur Tiere eingesetzt, deren
Antikörpertiter negativ war.
Die Tierhaltung erfolgte in vollklimatisierten Tierställen mit einer Raumtemperatur von 22-
24°C, einer relativen Luftfeuchtigkeit von 50-70% und einem Tag-Nacht-Rhythmus von
12 Stunden. Durch Laminarflowboxen wurde im Tierstall 15-20 mal pro Stunde ein
Luftaustausch gewährleistet. Den Tieren wurde eine Standarddiät (Ssniff, Soest) und über
eine Flaschentränke Wasser ad libitum verabreicht.
Zur Kryokonservierung wurden Zellen in RPMI 1640 Medium auf eine Zelldichte
von 5 × 10⁶ Zellen/ml eingestellt und 10 min bei 1600 rpm in der Minifuge T
sedimentiert. Anschließend wurde das Zellsediment in einem gleichen Volumen an
Kryokonservierungsmedium aufgenommen. Nach Resuspension des Zellsediments
wurde jeweils 1 ml der Zellsuspension in Kryoröhrchen (1.8 ml) überführt und für 24
h bei -70°C eingefroren. Zur endgültigen Lagerung wurden die Kryoröhrchen in
einen Thermobehälter mit flüssigen N₂ überführt.
Die Kultivierung der Suspensionszellinie CEM-SS erfolgte in RPMI 1640
Komplettmedium I. Hierfür wurden 1 × 10⁷ Zellen in eine Gewebekulturflasche (83
cm²/260 ml) mit 50 ml Medium überführt. Anschließend wurde die Kultur für 3 Tage
bei 37°C und 5% CO₂ inkubiert. Für die Zellpassage wurden die Zellen mit einer
sterilen Pipette der Gewebekulturflasche entnommen und in der Minifuge T für 10
min bei 1600 rpm sedimentiert. Nach Resuspension der Zellen in
Kultivierungsmedium und Bestimmung der Zellzahl durch Eosinfärbung in der
Neubauer-Zählkammer wurden 1 × 10⁷ Zellen zur Passage in 50 ml frisches Medium
eingesetzt.
Die Kultivierung von P3X63Ag8.653-Zellen erfolgte als Monolayer in RPMI
1640 Komplettmedium I. Hierfür wurden 5 × 10⁶ Zellen in eine Gewebe
kulturflasche (83 cm²/260 ml) mit 40 ml Medium überführt. Die Zellkultur wurde für
5 Tage bei 37°C und 5% CO₂ inkubiert bis der Boden der Gewebekulturflasche mit
einem konfluenten Zellmonolayer bedeckt war. Für die Zellpassage wurden die
adhärenten Zellen mit einem Zellschaber mechanisch vom Flaschenboden gelöst und
anschließend durch Zentrifugation für 10 min bei 1600 rpm in der Minifuge T
sedimentiert. Nach Resuspension der Zellen in Kultivierungsmedium wurde die
Zellzahl durch Eosinfärbung in der Neubauer-Zählkammer bestimmt und 5 × 10⁶
Zellen zur Passage in 40 ml frisches Medium eingesetzt.
Zur Bestimmung der Zellzahl in Suspensions- und Monolayerkulturen wurde in PBS
eine Zellkonzentration von 0.1-1 × 10⁶ Zellen/ml eingestellt und eine Portion dieser
Zellsuspension mit 20 µl Eosin versetzt. Anschließend wurde die Zellsuspension
vorsichtig mit einer Pipette durchmischt, für 2 min bei Raumtemperatur inkubiert und
in eine Neubauer-Zählkammer überführt. Die Bestimmung der Zellzahl erfolgte
unmittelbar nach der Inkubationszeit im Umkehr-Phasenkontrast-Mikroskop, wobei
die Zellen innerhalb der vier großen Quadrate gezählt wurden. Vitale Zellen wurden
hierbei im Gegensatz zu avitalen Zellen nicht angefärbt. Schwach angefärbte Zellen
wurden als avital betrachtet.
Die Zahl vitaler Zellen/ml ergab sich aus der Anzahl nichtgefärbter Zellen der vier
Großquadrate multipliziert mit dem Kammerfaktor 10⁴ und dem
Verdünnungsfaktor der Zellsuspension in der Eosinlösung.
Die Messung der Zellzahl im Coulter-Counter beruht auf einem Durchfluß der Zellen
zwischen zwei Platinelektroden. Passiert eine Zelle die Öffnung der beiden
Elektroden, so ändert sich der Widerstand des durch die Elektroden fließenden
Stroms proportional zur Größe der Zelle. Dies erzeugt einen Spannungsimpuls, der
aufgezeichnet wird und somit eine Quantifizierung der Zellen erlaubt.
Zur Bestimmung der Zellzahl wurden 25 µl der Zellsuspension in 3 ml Iso-Osmol,
einer Trägerflüssigkeit für den Coulter-Counter, überführt und in die Apparatur
injiziert.
Bei dieser Art der Zellzählung wird die Gesamtzellzahl der Zellsuspension bestimmt.
Eine Unterscheidung vitaler und avitaler Zellen ist nicht möglich.
1755 00070 552 001000280000000200012000285912164400040 0002019518278 00004 21636<
Adhärente Zellen konnten auf enzymatischem Weg durch Behandlung mit
Trypsin/EDTA vom Boden des jeweiligen Kulturgefäßes gelöst werden. Hierfür
wurde der Kulturüberstand vorsichtig dekantiert und die Zellen zweimal mit
vorgewärmten (37°C) Kultivierungsmedium gewaschen. Zur Ablösung der Zellen
vom Boden des Kulturgefäßes wurden diese für 5 min mit einer Trypsin/EDTA-
Lösung (1 ×) bei Raumtemperatur inkubiert. Das Volumen an Trypsin/EDTA-
Lösung wurde hierbei so gewählt, daß der Boden des jeweiligen Kulturgefäßes 2-3
mm mit der enzymatischen Lösung bedeckt war. Nach Beendigung der
Inkubationszeit wurden die Zellen durch vorsichtiges Schütteln der Flasche vom
Boden gelöst, aus dem Kulturgefäß entfernt und mit einem gleichen Volumen an
RPMI 1640 Komplettmedium I versetzt. Anschließend wurden die Zellen für 10 min
bei 1600 rpm in der Minifuge T sedimentiert. Der Überstand wurde verworfen, das
Zellsediment in kaltem PBS resuspendiert und unter gleichen Bedingungen erneut
zentrifugiert. Die Zellen wurden dann entsprechend ihrer weiteren Verwendung in
Kultivierungsmedium oder Puffer resuspendiert.
Zur Isolierung von humanen PBL wurde "Buffy coat" von gesunden Spendern
gemischt und mit RPMI 1640 Komplettmedium II im Volumenverhältnis 1 : 2
verdünnt. In Polypropylenröhrchen (50 ml) wurden 20 ml kaltes
Lymphozytentrennmedium vorgelegt und vorsichtig mit 15 ml des verdünnten "Buffy
coats" überschichtet. Die Fraktionierung erfolgte durch Zentrifugation bei
Raumtemperatur für 30 min und 1600 rpm (Beschleunigung 4/Bremse 4) in der
Minifuge T. Die zwischen Probe und Trennmedium gut sichtbare Bande wurde mit
Hilfe einer Combitip-Pipette gewonnen. Zur Entfernung des Trennmediums wurden
die gesammelten Fraktionen bei Raumtemperatur für 10 min und 1600 rpm
sedimentiert. Der Überstand wurde dekantiert und die Zellen entsprechend ihrer
Verwendung dreimal mit RPMI 1640 Komplettmedium II oder kaltem PBS
gewaschen.
Nach Isolierung von humanen PBL mittels Zentrifugation im isotonischen
Dichtegradienten war es möglich, periphere Lymphozytenkulturen anzulegen.
Normalerweise sterben Blutzellen in Kultur relativ schnell ab. Lymphozyten können
allerdings über mehrere Generationen in Kultur gehalten werden. Um eine
Proliferation dieser Zellen zu erreichen, wurden sie mit dem Mitogen PHA-M, dem
Lektinextrakt der roten Feuerbohne (Phaseolus vulgaris), stimuliert.
Zur Stimulation wurden die isolierten Zellen in Gewebekulturflaschen (175 cm²/800
ml) in RPMI 1640 Komplettmedium II auf eine Zelldichte von 1 × 10⁶ Zellen/ml
eingestellt und für 72 h bei 37°C und 5% CO₂ inkubiert. Um eine zu große
Zelldichte zu vermeiden, wurde nach 24 h die Zellsuspension mit
Kultivierungsmedium im Volumenverhältnis 1 : 1 verdünnt. Nach Beendigung der
Stimulationszeit wurde das Mitogen PHA-M durch dreimaliges Waschen mit RPMI
1640 Komplettmedium II entfernt. Zur Zellexpansion wurden die stimulierten
Lymphozyten in RPMI 1640 Komplettmedium IV auf eine Zelldichte von 5-7 × 10⁶
Zellen/ml eingestellt und für 24 h kultiviert.
Venöses Frischblut von gesunden Spendern wurde zur Verhinderung der Gerinnung
im Volumenverhältnis 49 : 1 mit steriler 10% (w/v) EDTA-Lösung versetzt. Um eine
schnelle Vermischung dieser Komponenten zu erreichen, wurden dem Spender kleine
Volumina von 8-9 ml Blut in Polystyrolröhrchen (14 ml) entnommen. Zur
Herstellung von leukozytenreichem Plasma wurde EDTA-Blut und Dextran 75 im
Volumenverhältnis 10 : 1 gemischt. Die beiden Komponenten wurden gut
durchmischt, und die Erythrozyten bei Raumtemperatur über einen Zeitraum von 60
min sedimentiert. Anschließend wurde der fast klare Überstand, das leukozytenreiche
Plasma, mit einer Pipette vorsichtig entnommen und zur Isolierung von Monozyten
verwendet.
In einer hypertonischen Lösung war es möglich, nichtstimulierte Monozyten aus
Vollblut oder leukozytenreichem Plasma zu isolieren. Hierfür wurden in
Polystyrolröhrchen (14 ml) 3 ml des hypertonischen Trennmediums NycoPrep 1.068
vorgelegt und vorsichtig mit 6 ml leukozytenreichem Plasma überschichtet. Die
Röhrchen wurden verschlossen und in der Minifuge T bei Raumtemperatur für 15
min und 600 × g (Beschleunigung 4/Bremse 4) zentrifugiert. Nach der Zentrifugation
wurde die klare Plasmaphase bis 5 mm über der breiten, diffusen Bande entfernt und
verworfen. Die verbleibende Plasmaphase und die Hälfte der breiten, diffusen Bande
wurde entnommen und die Zellen durch Zentrifugation in der Minifuge T für 7 min
unter gleichen Bedingungen sedimentiert. Das Zellsediment wurde anschließend zur
Entfernung von Resten des Trennmediums zweimal in 6 ml Waschlösung
resuspendiert und gewaschen.
Aus "Buffy coat" wurden mononukleare Zellen durch Zentrifugation im isotonischen
Dichtegradienten isoliert und dreimal mit serumfreiem RPMI 1640 Medium
gewaschen. Zur Isolierung der Monozyten wurden die Zellen in
Gewebekulturflaschen (175 cm²/800 ml) mit 20 ml RPMI 1640 Komplettmedium II
auf eine Zelldichte von 5 × 10⁶ Zellen/ml eingestellt und für 45 min bei 37°C und 5
% CO₂ inkubiert. Nichtadhärente Zellen wurden nach Beendigung der Inkubation
durch Dekantieren des Mediums entfernt. Die Zellschicht am Boden der
Gewebekulturflasche wurde anschließend zur Entfernung von Resten an
Suspensionszellen zweimal mit temperiertem (37°C), serumfreiem RPMI 1640
Medium gewaschen. Die Zellschicht wurde mit 30 ml RPMI 1640 Komplettmedium
V versetzt und für weitere 24 h unter gleichen Bedingungen inkubiert. Die Ablösung
der adhärenten Monozyten erfolgte durch eine Behandlung mit Trypsin/EDTA.
Für die durchflußzytofluometrische Analyse wurden die zu charakterisierenden
Zellen in FACS-PBS auf eine Zelldichte von 1 × 10⁷ Zellen/ml eingestellt. Die
Antikörperstammlösungen wurden mit FACS-PBS im Volumenverhältnis 1 : 50
verdünnt. Für die direkte und sequentielle Antikörperfärbung wurden 50 µl der
Zellsuspension (1 × 10⁷ Zellen/ml) in die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte mit
konischem Boden vorgelegt.
Anschließend wurde die Zellsuspension mit einem gleichen Volumen des Antikörpers
versetzt, der im Falle einer direkten Antikörperfärbung mit einem fluoreszierenden
Farbstoff gekoppelt ist. Die Ansätze wurden für 30 min bei 4°C inkubiert und
anschließend zur Sedimentation der Zellen bei 1400 rpm und Raumtemperatur für 2
min in der Minifuge T zentrifugiert.
Die Überstände wurden entfernt, und das Zellsediment zur Entfernung von Resten
des nichtgebundenen Antikörpers in 200 µl FACS-PBS resuspendiert und erneut,
wie beschrieben, zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt und das Zellsediment
im Falle einer direkten Antikörperfärbung in 100 µl FACS-PBS resuspendiert.
Bei einer sequentiellen Antikörperfärbung wurde nach Beendigung der
Zentrifugation das Zellsediment in 100 µl einer Lösung des mit Phycoerythrin
markierten Antikörpers Ziege-Anti-Maus Ig-R-PE (3 µg/ml) aufgenommen und für
30 min bei 4°C inkubiert. Reste des nichtgebundenen Antikörpers wurden, wie
beschrieben durch Waschen mit 200 µl FACS-PBS entfernt und das Zellsediment
zur durchflußzytofluometrischen Zellanalyse in 100 µl FACS-PBS resuspendiert.
Die Bestimmung der Anzahl vitaler und avitaler Zellen durch
durchflußzytofluometrische Analyse ist nach Färbung der Zellen mit dem
fluoreszierenden Farbstoff Propidiumjodid möglich. Dieser Farbstoff wird nur von
avitalen Zellen aufgenommen. Hierfür wurde die Zellsuspension in PBS auf eine
Konzentration von 0.5-1 × 10⁶ Zellen/ml eingestellt. Aus dieser Zellsuspension
wurden 180 µl entnommen und mit 20 µl einer Propidiumjodidlösung (5 µg/ml)
versetzt. Nach einer Inkubationszeit von 5 min wurden 100 µl der Lösung in den
Zellanalysator injiziert. Durch eine statistische Analyse im Lysis II-Programm des
Zellanalysators konnte die prozentuale Verteilung der vitalen und avitalen Zellen
bestimmt werden.
Zur quantitativen Bestimmung von AZT wurde ein kommerzieller ¹²⁵J-AZT RIA
Test-Kit verwendet. Puffer und Lösungen wurden gemäß den Angaben des
Herstellers angesetzt und im Test-Kit eingesetzt. Die Reaktionsansätze wurden nach
untenstehendem Schema (Tab.) pipettiert, vorsichtig gemischt und für 2 h bei
Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurden zur Präzipitation des Komplexes
aus ¹²⁵J-AZT und des AZT-Antikörpers (aus Kaninchen) 500 µl des Ziege-Anti-
Kaninchen-Antikörpers hinzugefügt. Die Ansätze wurden gemischt und erneut bei
Raumtemperatur für 30 min inkubiert.
Zur Sedimentation des Präzipitationskomplexes wurden die Ansätze anschließend bei
1000 × g für 20 min zentrifugiert. Nach Dekantieren des Überstandes wurde die
Radioaktivität des Sedimentes für 60 sec im Flüssigkeits-Szintillations-Analysator
gemessen. Zur Ermittlung des Absolutwertes wurde die Radioaktivität von 100 µl
¹²⁵J-AZT nach einer Inkubation von 2 h bei Raumtemperatur unter gleichen
Bedingungen bestimmt. Die Konzentrationen an AZT in der biologischen Matrix wurde
mit Hilfe einer Eichkurve ermittelt, die mit Standards definierter
Substanzkonzentrationen des Test-Kits erstellt wurde.
Die Ergebnisse der In-vitro-Pharmakokinetikstudien mit AZT-DMDOPE bzw. AZT in
stimulierten und nichtstimulierten humanen PBL sowie thymidinkinasedefizienten
P3X63Ag8.653-Zellen deuten auf eine intrazelluläre enzymatische Spaltung von AZT-
DMDOPE unter direkter Freisetzung von AZT-MP und des korrespondierenden
Thioetherlipidteiles DMDOP hin. Diese intrazelluläre enzymatische Spaltung sollte in
weiteren Experimenten auf subzellulärer Ebene durch einen direkten Nachweis der
entsprechenden Metabolite belegt werden. Für eine eindeutige Charakterisierung der
Spaltung war somit die Identifizierung der bisher bekannten Metabolite notwendig, die aus
der Muttersubstanz AZT-DMDOPE entstehen können. Hierzu gehören die Substanzen
DMDOP, AZT und AZT-MP, sowie die Substanzen, die durch Oxidation des Schwefels im
Thioetherlipidteil aus der Muttersubstanz AZT-DMDOPE entstehen.
Die Identifizierung der potentiellen Metabolite von AZT-DMDOPE war mit Hilfe
der DC möglich. Hierfür wurden die nicht radioaktiv markierten Reinsubstanzen mit
Hilfe verschiedener Trennsysteme analysiert und anschließend eine Bestimmung der
Rf-Werte durchgeführt.
Die Substanzen wurden hierfür in einem Gemisch aus Essigsäureethylester und
Methanol (1 : 1, v/v) mit einer Konzentration von 4 mg/ml gelöst. Mit Hilfe einer
Mikrokapillare wurden 5 µl dieser Lösungen auf die stationäre Phase aufgetragen
und analysiert.
Thioetherlipide wie AZT-DMDOPE, DMDOP, sowie solche, die durch Oxidation
des Schwefels entstehen, konnten mit Hilfe eines jodhaltigen Reagenz markiert
werden, das den Thioetherlipidteil dieser Verbindungen anfärbt. AZT und AZT-MP
konnten aufgrund ihrer Absorption im ultravioletten Bereich bei 254 nm
ausschließlich auf DC-Platten mit Fluoreszenzindikator sichtbar gemacht werden.
AZT-DMDOPE , die Substanz mit Thioetherlipidteil und chromophorer Gruppe,
waren beiden Arten der Detektion zugänglich.
Für die dünnschichtchromatographische Analyse der Substanzen wurden drei
Trennsysteme etabliert, die sich hinsichtlich ihrer stationären und mobilen Phasen
unterscheiden.
Im ersten Trennsystem, dem IBA-System, mit Kieselgel 60 als stationärer Phase,
konnte die Muttersubstanz AZT-DMDOPE neben DMDOP identifiziert werden. Als
mobile Phase wurde ein Gemisch aus 2-Propanol : n-Butylacetat : Aqua bidest. (10 : 6 : 4,
v/v/v) eingesetzt.
Eine Weiterentwicklung dieses Trennsystems wurde durch die Verwendung von 2-
Propanol : n-Butylacetat : Aqua bidest. : Eisessig (3 : 5 : 1 : 1, v/v/v/v) als mobile Phase
(IBAE-System) erreicht. Die Substanzen AZT-DMDOPE und DMDOP konnten
hierbei, wie im IBA-Trennsystem beschrieben, auf Kieselgel 60 DC-Platten getrennt
werden. Zusätzlich konnten AZT und AZT-MP im UV-Licht bei 254 nm und
Verwendung einer stationären Phase aus Kieselgel 60 mit Fluoreszenzindikator
getrennt werden. Aufgrund des AZT-Teils war ebenfalls eine Detektion der
Muttersubstanz AZT-DMDOPE sowie deren Oxidationsprodukte möglich.
Nach Visualisierung der Substanzen auf der DC-Platte wurden die Rf-Werte
bestimmt.
Zur Unterscheidung der Substanz AZT-DMDOPE von DMDOP stand ein weiteres
Trennsystem zur Verfügung. Hierbei wurde als mobile Phase ein Gemisch aus n-
Heptan und Essigsäureethylester (4 : 1, v/v) und als stationäre Phase Kieselgel 60
verwendet. Die Detektion wurde mit dem bereits beschriebenen jodhaltigen Reagenz
durch Anfärben des Thioetherlipidteils der Substanzen durchgeführt.
Im Vergleich zum IBA- und IBAE-System konnte für die Substanz DMDOP mit
diesem Trennsystem ein deutlich niedriger Rf-Wert bestimmt werden. Grund hierfür
ist eine im Vergleich zum IBA- und IBAE-System unpolare mobile Phase, bestehend
aus n-Heptan und Essigsäureethylester. Die Nachweisgrenze der Substanzen nach
dünnschichtchromatographischer Analyse und Detektion mit einem jodhaltigen
Reagenz wurde in allen Trennsystemen mit 0. 1 kg/ml bestimmt.
Zusammenfassend kann festgehalten werden, daß mit Hilfe der beschriebenen
dünnschichtchromatographischen Trennsysteme alle Substanzen, die nach
derzeitigem Kenntnisstand als potentielle Metabolite von AZT-DMDOPE in Frage
kommen, sich über ihre Rf-Werte eindeutig charakterisieren lassen.
Die Spaltung von AZT-DMDOPE wurde mit Hilfe eines Enzym-Assays mit [¹⁴C]-
AZT-DMDOPE und AZT-DMDOPE als Substrat untersucht.
Als Enzymquelle wurden zunächst Zellhomogenate von CEM-SS-Zellen und
humanen PBL verwendet.
Letztere wurden sowohl nach Stimulation mit PHA-M als auch in nichtstimuliertem
Zustand direkt nach ihrer Isolierung homogenisiert und im Enzym-Assay eingesetzt.
Zur Herstellung der Zellhomogenate wurden Zellsuspensionen mit einer Dichte von
5×10⁷ Zellen/ml 50 mM Tris (pH 7.4) im Glashomogenisator mechanisch
aufgeschlossen. Der Zellaufschluß wurde hierbei im Umkehr- Phasenkontrast-
Mikroskop optisch kontrolliert.
Zunächst wurde 1 ml dieses Zellhomogenates in dem Enzym-Assay ohne vorherige
Bestimmung der Proteinkonzentration eingesetzt. Als Substrat wurden 0.98 nmol
[¹⁴C]-AZT-DMDOPE (1.67 kBq) eingesetzt.
Zur Gewährleistung einer Substratsättigung wurden weitere 50 nmol der
nichtradioaktiv markierten Verbindung hinzugefügt. [¹⁴C]-AZT-DMDOPE trägt die
radioaktive Markierung im Thioetherlipidteil und erlaubt somit eine eindeutige
Identifikation der potentiellen Metabolits [¹⁴-C]DMDOP.
Die Ansätze wurden für 1, 3, 6 und 24 h im Wasserbad bei 37°C inkubiert. Als
Vergleich wurde ein Ansatz ohne Zugabe von Zellhomogenat mitgeführt.
Anschließend wurden die Spaltprodukte mit Diethylether : 2-Propanol (9 : 1, v/v)
extrahiert und dünnschichtchromatographisch im IBA- und IBAE-System analysiert
(Abb. 18). Nach Trennung der Substanzen wurde zur Detektion der radioaktiv
markierten Substanzen die DC-Platte 15 min im Radio-DC-Analysator gemessen.
Eine eindeutige Identifizierung der Metaboliten war schließlich durch Bestimmung
der Rf-Werte möglich.
Die dünnschichtchromatographische Analyse der enzymatischen Spaltprodukte von
AZT-DMDOPE durch Zellhomogenate stimulierter und nichtstimulierter humaner
PBL wurde durch Anwendung des IBA-Trennsystems durchgeführt. In den sich
anschließenden Experimenten mit CEM-SS-Zellhomogenat wurde die Analyse der
Spaltprodukte im IBAE-Trennsystem durchgeführt. Da von beiden Trennsystemen
die Rf-Werte der Reinsubstanzen ermittelt wurden, war ein direkter Vergleich der
Ergebnisse zur Identifikation der Substanzen nach enzymatischer Spaltung von AZT-
DMDOPE möglich.
Nach enzymatischer Spaltung von [¹⁴C]-AZT-DMDOPE durch Zellhomogenate
stimulierter bzw. nichtstimulierter humaner PBL wurden drei unbekannte Substanzen
im DC-Chromatogramm detektiert. Mit Rf-Werten von 0.65 ± 9.5 × 10-2 (n = 4) und
0.65 ± 1.7 × 10-2 (n = 4) für stimulierte und nichtstimulierte humane PBL konnte
Substanzpeak 2 eindeutig der Muttersubstanz [¹⁴C]-AZT-DMDOPE zugeordnet
werden. Die Rf-Werte von Substanzpeak 4 mit 0.94 ± 0.00 (n = 4) und 0.92 ± 1.2 ×
10-2 (n = 4) waren identisch mit den Werten von DMDOP, die durch DC-Analyse der
Reinsubstanzen bestimmt wurden. Substanzpeak 3 mit einem Rf-Wert von 0.86 ± 5.8
× 10-3 (n = 4) konnte keiner der bekannten Substanzen zugeordnet werden. Die
Ergebnisse wurden durch Analyse der enzymatischen Spaltung von [¹⁴C]-AZT-
DMDOPE durch CEM-SS-Zellhomogenate bestätigt. Substanzpeak 2 und 4 mit Rf-
Werten von 0.56 ± 2.5 × 10-2 (n = 4) und 0.96 ± 0.00 (n = 4) konnten eindeutig als
AZT-DMDOPE bzw. DMDOP identifiziert werden, während Substanzpeak 1 mit
einem Rf-Wert von 0.41 ± 2.5 × 10-2 (n = 4) einem Oxidationsprodukt zugeordnet
werden konnte. Für Substanzpeak 3 konnte auch im IBAE-System nach Vergleich
der Rf-Werte keine Zuordnung getroffen werden (Abb. 18). Weiterhin konnte
gezeigt werden, daß nach Inkubation von [¹⁴C]-AZT-DMDOPE ohne Zugabe von
Zellhomogenat nur die Muttersubstanz zu detektieren war (Abb. 18).
Aus der dünnschichtchromatographischen Analyse der Reaktionsansätze konnte
somit der Beweis geführt werden, daß die Substanz DMDOP aus der Muttersubstanz
freigesetzt wird.
Claims (43)
1. Lipid-Cleavage-Enzyme (LCE), dadurch gekennzeichnet, daß es das Konjugat AZT-
DMDOPE [(3′-Desoxy-3′-azidothymidin)-5′-phosphorsäure-(3-dodecylmercapto-2--
decyloxy)-propylester] in AZT-MP [3′-Desoxy-3′-azidothymidinmonophosphat] und
DMDOP [(3 Dodecylmercapto-2-decyloxy)-propanol] spaltet.
2. LCE nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es das Konjugat FLT-DMDOPE
[(3′-Desoxy-3′-fluor-thymidin)-5′-phosphorsäure-(3-dodecylmercapto-2--decyloxy)-
propylester] in FLT-MP [3′-Desoxy-3′-fluorthymidin)-5′-monophosphat und DMDOP
spaltet.
3. LCE nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß es aus
Blutleukozyten, Monozyten oder Makrophagen erhältlich ist.
4. Isolierte subzelluläre Systeme zur Durchführung von In-vitro-Untersuchungsverfah
ren, dadurch gekennzeichnet, daß die subzellulären Systeme mit dem Enzym nach
einem der Ansprüche 1-3 angereichert sind.
5. Verwendung des Enzyms nach einem der Ansprüche 1-3 zum Auffinden oder zur
Identifizierung von Substraten oder Liganden des LCE in einem geeigneten In-vitro-
Untersuchungssystem.
6. Verwendung von subzellulären Systemen nach Anspruch 4 zum Auffinden oder zur
Identifizierung von Substraten oder Liganden des LCE in einem geeigneten In-vitro-
Untersuchungssystem.
7. Verfahren zum Auffinden von Verbindungen, die als Substrat oder Ligand des LCE′s
nach einem der Ansprüche 1-3 fungieren, dadurch gekennzeichnet, daß in einem
geeigneten Untersuchungssystem die Spaltprodukte nachgewiesen werden.
8. Verfahren zum Auffinden von LCE-Analoga, in dem nach Anspruch 7 beschriebenen
Verfahren aufgefundene Verbindungen in einem Screening-System verwendet werden.
9. LCE-Analoga, erhältlich nach einem Verfahren nach Anspruch 8.
10. LCE oder LCE-Analoga nach einem der Ansprüche 1-3 oder 9, wobei das Enzym
bei Konjugaten vom Typ L-B-D, in denen L ein lipidähnlicher Rest, B eine
Phosphatbrücke und D eine pharmakologisch aktive Substanz bedeutet, eine Spaltung
der kovalenten Bindung zwischen dem Lipidteil L und dem Rest -B-D induziert.
11. LCE oder LCE-Analoga nach einem der Ansprüche 1-3 oder 9-10, wobei das
Enzym ein nach der SDS-PAGE-Methode bestimmtes Molekulargewicht von
120.000-160.000 Dalton besitzt.
12. LCE oder LCE-Analoga nach einem der Ansprüche 1-3 oder 9-11, dadurch
gekennzeichnet, daß die Aktivität des Enzyms bei der Spaltung des Konjugates in
aktivierten Immunzellen, humanen Blutleukozyten, Monozyten oder Makrophagen
mindestens um den Faktor 2 höher ist im Vergleich zu nicht aktivierten Zellen.
13. LCE oder LCE-Analoga nach einem der Ansprüche 1-3 oder 9-12, dadurch
gekennzeichnet, daß die Aktivität des Enzyms durch Zn2+ und Mn2+ inhibiert wird.
14. Verwendung eines kovalenten Konjugates eines Phospholipid-Derivates und einer
pharmakologisch aktiven Substanz zur Herstellung eines Arzneimittels zur gezielten
Freisetzung der phosphorylierten aktiven Substanz in geeigneten Zielzellen, wobei der
Lipidteil des kovalenten Konjugates ein Targeting des Konjugates zu den Zielzellen
und einen aktiven Transport des Konjugates oder des Restes -B-D durch die
Zellmembran dieser Zielzellen hindurch bewirkt, die Spaltung des Konjugates durch
ein membranständiges Enzym nach einem der Ansprüche 1-3 oder 9-13 erfolgt, so
daß eine spezifische Anreicherung der aktiven Substanz in intrazellulären
Kompartimenten dieser Zielzellen resultiert.
15. Verwendung nach Anspruch 14, wobei die Spaltung des kovalenten Konjugates im
wesentlichen an der Membran oder in den betreffenden Zielzellen erfolgt.
16. Verwendung nach Anspruch 14, wobei das Arzneimittel die Nebenwirkungen im
Vergleich zur Verabreichung der freien, nicht an ein Lipid gebundenen aktiven Sub
stanz vermindert.
17. Verwendung nach Anspruch 14 oder 15, wobei das Konjugat nicht in Körperflüssig
keiten oder in der Leber gespalten wird und dadurch im wesentlichen keine freie
aktive Substanz in den Körperflüssigkeiten nachweisbar ist.
18. Verwendung nach Anspruch 14 oder 15, wobei die Zielzellen humane Blutleukozyten,
Monozyten, Makrophagen, immunologische Zellen, Tumorzellen oder Zellen des
lymphatischen Systems sind.
19. Verwendung nach einem der Ansprüche 14-18, wobei das Arzneimittel geeignet ist,
die intrazelluläre Konzentration der aktiven Substanz in den Zielzellen um mindestens
10% im Vergleich zur Verabreichung der freien, nicht an ein Lipid gebundenen akti
ven Substanz zu erhöhen.
20. Verwendung nach Anspruch 19, wobei die Konzentration der aktiven Substanz in
den Zielzellen um mindestens 50% erhöht wird.
21. Verwendung nach einem der Ansprüche 14-20, wobei das Arzneimittel in einer
Dosierungseinheit verabreicht wird, die einen niedrigeren äquivalenten Gehalt der
aktiven Substanz im Vergleich zu der die freie Substanz enthaltenden Darreichungs
form aufweist.
22. Verwendung nach Anspruch 21, wobei der äquivalente Gehalt der aktiven Substanz
weniger als 50% im Vergleich zu der die freie aktive Substanz enthaltenden
Darreichungsform beträgt.
23. Verwendung nach einem der Ansprüche 14-21 zur Herstellung von Arzneimitteln
zur Verminderung der Organtoxizität von pharmakologisch aktiven Substanzen.
24. Verwendung nach einem der Ansprüche 14-22 zur Herstellung von Arzneimitteln
zur Verminderung der Knochenmarktoxizität von pharmakologisch aktiven Sub
stanzen.
25. Verwendung nach einem der Ansprüche 14-22 zur Herstellung von Arzneimitteln
zur Verminderung der Cardiotoxizität, Nephrotoxizität oder Neurotoxizität von
pharmakologisch aktiven Substanzen.
26. Verwendung nach einem der Ansprüche 14-22 zur Herstellung von Arzneimitteln
zum gezielten Transport von pharmakologisch aktiven Substanzen über die Blut-
Hirn-Schranke.
27. Verwendung nach Anspruch 26, wobei die pharmakologisch aktive Substanz in Zellen
des Gehirns angereichert wird.
28. Verwendung nach einem der Ansprüche 14-27, wobei das Konjugat ein Wirkstoff
der Formel L-B-D ist und L den Lipidteil, B eine Phosphatbrücke und D eine pharma
kologisch aktive Substanz darstellt.
29. Verwendung eines kovalenten Konjugates L-B-D nach Anspruch 28, wobei L einen
Rest der Formel II
darstellt, wobei
R¹ eine geradkettige oder verzweigte, gesättigte oder ungesättigte Alkylkette mit 1- 30 Kohlenstoffatomen, die gegebenenfalls ein- oder mehrfach durch Halogen, C₁- C₆-Alkoxy-, C₁-C₆-Alkylmercapto-, C₁-C₆-Alkoxycarbonyl-, C₁-C₆-Alkyl sulfinyl- oder C₁-C₆-Alkylsulfonylgruppen substituiert sein kann,
R² Wasserstoff, eine geradkettige oder verzweigte, gesättigte oder ungesättigte Alkylkette mit 1-20 Kohlenstoffatomen, die gegebenenfalls ein- oder mehrfach durch Halogen, C₁-C₆-Alkoxy-, C₁-C₆-Alkylmercapto-, C₁-C₆-Alkoxycar bonyl- oder C₁-C₆-Alkylsulfonylgruppen substituiert sein kann,
X einen Valenzstrich, Sauerstoffs Schwefel, Oxycarbonyl, Carbonyloxy, die Sulfinyl- oder die Sulfonylgruppe darstellt,
Y ein Valenzstrich, Oxycarbonyl, Carbonyloxy, ein Sauerstoff- oder Schwefelatom ist, und
m eine Zahl zwischen 1 und 5 darstellt.
R¹ eine geradkettige oder verzweigte, gesättigte oder ungesättigte Alkylkette mit 1- 30 Kohlenstoffatomen, die gegebenenfalls ein- oder mehrfach durch Halogen, C₁- C₆-Alkoxy-, C₁-C₆-Alkylmercapto-, C₁-C₆-Alkoxycarbonyl-, C₁-C₆-Alkyl sulfinyl- oder C₁-C₆-Alkylsulfonylgruppen substituiert sein kann,
R² Wasserstoff, eine geradkettige oder verzweigte, gesättigte oder ungesättigte Alkylkette mit 1-20 Kohlenstoffatomen, die gegebenenfalls ein- oder mehrfach durch Halogen, C₁-C₆-Alkoxy-, C₁-C₆-Alkylmercapto-, C₁-C₆-Alkoxycar bonyl- oder C₁-C₆-Alkylsulfonylgruppen substituiert sein kann,
X einen Valenzstrich, Sauerstoffs Schwefel, Oxycarbonyl, Carbonyloxy, die Sulfinyl- oder die Sulfonylgruppe darstellt,
Y ein Valenzstrich, Oxycarbonyl, Carbonyloxy, ein Sauerstoff- oder Schwefelatom ist, und
m eine Zahl zwischen 1 und 5 darstellt.
30. Verwendung eines kovalenten Konjugates L-B-D nach Anspruch 29, wobei R¹ eine
geradkettige oder verzweigte C₈-C₁₅-Alkylgruppe, die durch eine C₁-C₆-Alkoxy-
oder eine C₁-C₆-Alkylmercaptogruppe substituiert sein kann, bedeutet, und insbeson
dere eine Nonyl-, Decyl-, Undecyl-, Dodecyl-, Tridecyl- oder Tetradecylgruppe dar
stellt.
31. Verwendung eines kovalenten Konjugates L-B-D nach einem der Ansprüche 29 oder
28, wobei R² eine geradkettige oder verzweigte C₈-C₁₅-Alkylgruppe, die durch eine
C₁-C₆-Alkoxygruppe oder eine C₁-C₆-Alkylmercaptogruppe substituiert sein kann,
bedeutet, und insbesondere eine Octyl-, Nonyl-, Decyl-, Undecyl-, Dodecyl-,
Tridecyl- oder Tetradecylgruppe darstellt.
32. Verwendung eines kovalenten Konjugates L-B-D nach einem der Ansprüche 28-31,
wobei X ein Schwefelatom, eine Sulfinyl- oder Sulfonylgruppe bedeutet.
33. Verwendung eines kovalenten Konjugates L-B-D nach einem der Ansprüche 28-32,
wobei Y ein Sauerstoffatom bedeutet.
34. Verwendung eines kovalenten Konjugates L-B-D nach einem der Ansprüche 28-33,
wobei m die Zahlen 1 oder 2 bedeuten.
35. Verwendung eines kovalenten Konjugates L-B-D nach Anspruch 28, wobei X und Y
einen Valenzstrich darstellen, R² gleich Wasserstoff ist und R¹ eine C₁-C₃₀-Alkyl
kette darstellt, die gegebenenfalls durch C₁-C₆-Alkoxy, oder C₁-C₆-Alkylmercapto
substituiert sein kann.
36. Verwendung eines kovalenten Konjugates L-B-D nach einem der Ansprüche 28-35,
wobei B eine Phosphatbrücke der Formel III
-O-[(PO)(OH)O]n- (III),darstellt, in der n die Zahlen 1, 2 oder 3 bedeutet.
37. Verwendung eines kovalenten Konjugates L-B-D nach einem der Ansprüche 28-36,
wobei D eine pharmakologisch aktive Substanz darstellt, ausgewählt aus der Gruppe
der antiviralen, antiretroviralen, cytotoxischen, cytostatischen, antitumoralen, immun
supprimierenden oder immunstimulierenden Substanzen.
38. Verfahren zur Herstellung von Arzneimitteln zur gezielten Freisetzung von pharmako
logisch aktiven Substanzen in Zielzellen, wobei diese Zielzellen das Lipid-Cleavage-
Enzym oder LCE-Analoga nach einem der Ansprüche 1-3 oder 9-13 enthalten,
umfassend die Schritte
- a) Auswählen einer pharmakologisch aktiven Substanz,
- b) Herstellen eines kovalenten Konjugats aus der pharmakologisch aktiven Substanz und einem lipidartigen Trägermolekül,
- c) und Herstellen einer pharmazeutischen Darreichungsform, die als Wirkstoff das nach b) hergestellte Konjugat, sowie weitere pharmazeutische Hilfs- oder Träger stoffe enthält.
39. Lipidkonjugate der Formel I vom Typ L-B-D (I), ausgewählt aus der Gruppe der
folgenden Substanzen:
2-Fluor-2′-desoxy-9-(β-D-arabinofuranosyl)adenin-5′-phosphorsäure-
(3-dodecylmercapto-2-decyloxypropyl)ester,
2-Chlor-2′-desoxyadenosin-5′-phosphorsäure-(3-dodecylmercapto-
2-decyloxypropyl)ester,
3-(2-Desoxy-β-D-erythropentofuranosyl)-3,6,7,8-tetrahydro-imidazo-
[4,5-d][1,3]-diazepin-8-ol-5′-phosphorsäure-(3-dodecylmercapto-2-
decyloxypropyl)ester.
40. Diagnostisches Mittel enthaltend LCE oder LCE-Analoga nach einem der Ansprüche
1-3 oder 9-13 zur Durchführung von Bestimmungsverfahren für Substrate des
lipidspaltenden Enzyms.
41. Mittel zum Auffinden von Substanzen, die als Substrate oder Liganden des Enzyms
fungieren, enthaltend eine ausreichende Menge des isolierten oder in Zellpräparaten
angereicherten LCE oder LCE-Analoga nach einem der Ansprüche 1-3 oder 9-13,
sowie geeignete Stabilisierungsmittel.
42. Diagnostisches Mittel enthaltend ein Liponukleotid nach Anspruch 28 zur Bestim
mung von pathologischen Veränderungen aufgrund gestiegener oder reduzierter
Enzym-Aktivität, die mit entsprechenden Erkrankungen oder Krankheitssymptomen
einhergehen.
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