ES2239761T3 - Complejo de enzima que desdobla lipidos. - Google Patents
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Abstract
EL OBJETO DE LA PRESENTE INVENCION EN UNA ENZIMA DE LA MEMBRANA NO DESCRITA HASTA AHORA, QUE SE PUEDE AISLAR A PARTIR DE FRACCIONES DE MEMBRANA CELULAR DE LEUCOCITOS DE LA SANGRE O MONOCITOS/MACROFAGOS. ADEMAS TRATA LA INVENCION DE LA UTILIZACION DE SUSTRATOS DE ESTA ENZIMA PARA LA OBTENCION DE MEDICAMENTOS, CONTENIENDO LOS MEDICAMENTOS ESTOS SUSTRATOS COMO PRINCIPIO ACTIVO FARMACEUTICO. LOS MEDICAMENTOS SE UTILIZAN PARA LA LIBERACION Y ENRIQUECIMIENTO DE SUSTANCIAS FARMACOLOGICAMENTE ACTIVAS EN LAS CORRESPONDIENTES CELULAS DIANA. SON TAMBIEN OBJETO DE LA INVENCION LOS SISTEMAS DE INVESTIGACION IN VITRO, QUE CONTIENEN ESTA ENZIMA, PARA DETECTAR OTROS SUSTRATOS DE ESTA ENZIMA.
Description
Complejo de enzima que desdobla lípidos.
El complejo de una enzima que desdobla lípidos
(del inglés Lipid Cleavage Enzym; LCE). Es objeto del presente
invento una enzima situada en membranas, que no ha sido descrita
hasta ahora, la cual se puede aislar, p.ej., a partir de fracciones
membranales celulares de leucocitos sanguíneos periféricos humanos,
o de macrófagos humanos, y que desdobla a conjugados de sustancias
farmacológicamente activas, que están unidas a una molécula de
vehículo a modo de un lípido, mediando liberación de la respectiva
sustancia farmacológicamente activa o de su monofosfato. Además, el
invento se refiere a la utilización de estos conjugados, que sirven
como substratos de este complejo de enzima, para la producción de
medicamentos, conteniendo los medicamentos estos conjugados como
sustancia activa farmacéutica. Los medicamentos son apropiados para
la liberación y el enriquecimiento planificados de sustancias
farmacológicamente activas en correspondientes células dianas. Son
objeto del invento, además, sistemas de investigación in
vitro que contienen este complejo de enzima, para el
descubrimiento de otros substratos adicionales de este complejo de
enzima. Por el concepto de un LCE se entienden tanto el complejo de
enzima, como la enzima aislada y las posibles isoenzimas.
La terapia de neoplasias malignas (p.ej.
carcinomas, sarcomas, hemoblastosis, neoplasias hematológicas), de
enfermedades inflamatorias o de enfermedades autoinmunitarias, así
como de enfermedades causadas por virus o retrovirus, tales como
por ejemplo el SIDA (en inglés AIDS = síndrome de inmunodeficiencia
adquirida), el ARC (de AIDS Related Complex = complejo relacionado
con el SIDA), la citomegalia, los herpes o las hepatitis, está
vinculada, junto a la insuficiente actividad de las sustancias
activas terapéuticas empleadas, con frecuencia con sus efectos
colaterales extremados. Este efecto se puede explicar por la
selectividad in vivo demasiado pequeña o por la amplitud
terapéutica limitada de las sustancias farmacológicamente activas
que se emplean. Las favorables propiedades in vitro
farmacológicas de las sustancias farmacológicamente activas no se
pueden extrapolar con frecuencia a las circunstancias in
vivo.
Desde hace varios años, se está intentando por lo
tanto, mediante modificación de la estructura química de sustancias
farmacológicamente activas, poner a disposición nuevas sustancias,
que tengan propiedades mejoradas en lo que se refiere a la amplitud
terapéutica. Además, con frecuencia se desarrollan nuevas formas
farmacéuticas de presentación y administración, con la meta de
transportar las sustancias activas de una manera planificada al
sitio de su efecto, junto al que deben desarrollar su acción
terapéutica. En tal contexto, se debe evitar en particular la
indeseada interacción con células sanas. En el caso de células
tumorales, que poseen correspondientes antígenos superficiales, se
produjeron por ejemplo anticuerpos, que reconocen a estos antígenos
superficiales especiales y por consiguiente los fijan de una manera
planificada a la célula cancerosa. Los anticuerpos están
modificados con toxinas apropiadas, de tal manera que, después de
haberse efectuado una fijación a la célula cancerosa, se pone en
libertad la toxina y la célula cancerosa se hace mortal.(= se
mortaliza) Otra alternativa distinta para el mejoramiento de la
amplitud terapéutica consiste, mediante una insignificante
modificación de la sustancia farmacológicamente activa, por ejemplo
mediante preparación de sales por adición con ácidos o con bases o
mediante preparación de sencillos ésteres [por ejemplo, ésteres de
ácidos grasos; J. Pharm. Sci. 79, 531 (1990)], en modificar las
propiedades físicas de la sustancia activa que constituye su
fundamento, de tal manera que se mejore la solubilidad o
compatibilidad de la sustancia activa. Estos compuestos
insignificantemente modificados desde el punto de vista químico se
designan con frecuencia también como los denominados
"profármacos" [del inglés prodrugs], puesto que ellos,
al entrar en contacto con líquidos corporales o en el hígado
(metabolismo en la primera pasada, del inglés first pass -
metabolism), son convertidos casi inmediatamente en el agente
terapéuticamente activo propiamente dicho.
El problema técnico en que se basó el presente
invento, consistió en encontrar una nueva diana (del inglés
target) que se presente del modo más específico que sea
posible sobre o en las células, que constituyen un objetivo diana
para la administración de sustancias farmacológicamente activas. La
diana debería entrar en interacción con correspondientes sustancias
activas farmacéuticas, de tal manera que las sustancias activas
puedan ser transportadas del modo más específico que sea posible
hasta estas células dianas, y reconocidas, fijadas y recibidas por
éstas. La sustancia activa farmacéutica debería estar constituida
en tal caso en lo esencial por dos constituyentes, siendo el primer
constituyente responsable del reconocimiento y de la interacción con
la diana (parte específica para un ligando) y representando el
segundo constituyente la sustancia activa propiamente dicha (parte
específica para una sustancia activa), que desarrolla su efecto tan
sólo cuando se han efectuado la fijación específica a la molécula
diana y la separación intracelular del agente activo propiamente
dicho o de su monofosfato. De esta manera, se debe evitar la
liberación indeseada de la sustancia farmacológicamente activa en
los líquidos corporales, de manera tal que las células sanas no sean
influidas negativamente por el agente farmacológicamente activo y
se eviten ampliamente efectos colaterales indeseados. La sustancia
activa farmacéutica, utilizada con esta finalidad para la
producción del medicamento, por una parte, debería servir en este
caso como ligando para la diana y, por otra parte, debería contener
el agente farmacológicamente activo propiamente dicho, pudiendo
estar constituido éste en particular también sobre la base de
estructuras activas farmacéuticas ya conocidas, cuya amplitud
terapéutica debe ser mejorada significativamente de esta manera.
Sorprendentemente, se encontró por fin que como
diana es apropiado un LCE, estando localizado el LCE
predominantemente en células malignas, activadas o infectadas con
virus, en particular en leucocitos sanguíneos periféricos humanos,
macrófagos, células de riñones, cápsulas suprarrenales u ovarios,
células del sistema linfático o de los órganos linfoides o células
del cerebro. Este complejo de enzima y sus compuestos análogos son
designados en lo sucesivo también abreviadamente como LCE. El LCE no
muestra, de manera sorprendente, ninguna distribución estadística
uniforme distribuida a lo largo de todos los órganos, sino que se
puede observar predominantemente en membranas de determinadas
células, que entran en cuestión como objetivo diana para la
administración de sustancias farmacológicamente activas. En células
del corazón, de la médula ósea y del hígado se pudo comprobar una
actividad enzimática, que comparativamente es sólo muy pequeña. Las
fracciones de materiales homogeneizados o de membranas de las
células, los órganos y los tejidos, que se utilizan para el
aislamiento del LCE, muestran diferentes actividades o afinidades
específicas del LCE, realizándose en células activadas que está
aumentada en gran manera la actividad específica o la afinidad en
comparación con células no activadas. Esto se puede demostrar para
leucocitos sanguíneos periféricos, linfocitos y granulocitos
humanos, así como para células mononucleares humanas y no humanas o
bien murinas, tales como p.ej. monocitos / macrófagos.
Un LCE se distingue sorprendentemente por el
hecho de que él, como substrato, desdobla a compuestos similares a
lípidos entre el entramado fundamental de lípido y la estructura de
puente de una sustancia fisiológicamente activa, unida a este
puente. Tales substratos se pueden transcribir por la fórmula
general I
(I)L – B –
D
representando L un radical de
lípido, B un puente y D una sustancia farmacológicamente activa o
bien representando B-D un fosfonato de una sustancia
activa. Sorprendentemente, las sustancias activas farmacéuticas de
la fórmula I, en comparación con las sustancias D ó
B-D libres o bien no modificadas, farmacológicamente
activas, poseen una mayor amplitud terapéutica. Ellas mejoran,
además de esto, con frecuencia su período de tiempo de permanencia
en el cuerpo, la biodisponibilidad o la capacidad para atravesar
membranas, que es conocida como factor crítico (p.ej. la barrera
hematoencefálica, membranas celulares, etc.) que poseen las
sustancias farmacológicamente activas. Los substratos de la fórmula
I sirven por consiguiente como un sistema de vehículo (en inglés
carrier) para la sustancia farmacológicamente activa. Los
conjugados de la fórmula I pueden ser designados, en lo que se
refiere a su función, como un sistema intracelular de almacenamiento
de fármacos, de dirección a dianas de fármacos o de suministro de
fármacos (en inglés Drug-Storage-,
Drug-Targeting- and
Drug-Delivery-System). Ellos dan
lugar a que la sustancia farmacológicamente activa o su forma de
profármaco sea puesta en libertad intracelularmente después de una
aplicación por vía oral, teniendo lugar esta liberación
ventajosamente, no de una manera inespecífica en la totalidad de las
células, los órganos o los tejidos del cuerpo, sino de una manera
deliberada en las células que contienen un LCE en la membrana
celular o también en parte intracelularmente. Es especialmente
sorprendente, sin embargo, el hecho de que el desdoblamiento no se
efectúa ya durante el transporte del substrato a través de los
líquidos corporales, tales como p.ej. la sangre, el suero o el
líquido linfático o a través del hígado, sino tan sólo junto a o en
las correspondientes células dianas. De esta manera se evita la
indeseada segregación del producto de desdoblamiento a través de
los riñones, o el desdoblamiento del substrato en el hígado, por lo
que la parte con mucho mayoritaria de la sustancia activa se
transporta hasta junto a las respectivas células dianas. Tales
células son, como ya anteriormente se ha mencionado, en particular
células activadas patofisiológica o fisiológicamente, que entran en
cuestión como objetivo diana para la administración de sustancias
farmacológicamente activas, tales como leucocitos sanguíneos,
linfocitos, macrófagos y otras poblaciones celulares del sistema
linfático inmunológico. En particular se trata en este caso de
células activadas (p.ej. macrófagos, granulocitos, linfocitos,
leucocitos, trombocitos, monocitos, etc.), que desempeñan un
cometido patológico, fisiológico, patofisiológico o sintomático en
el respectivo acontecer de una
enfermedad.
En el caso de un LCE se trata de un complejo de
enzima que hasta ahora no se ha descrito todavía. Éste se distingue
en particular por el hecho de que él desdobla, como substrato, al
compuesto éster
(3-dodecilmercapto-2-decil-oxi)-propílico
de ácido
(3'-desoxi-3'-azido-timidina)-5'-fosfórico
(seguidamente designado de manera abreviada como
AZT-DMDOPE) para dar el
3'-desoxi-3'-azido-timidina-monofostato
y el
(3-dodecilmercapto-2-decil-oxi)-propanol
(DMDOP). Otro substrato preferido del LCE es el compuesto éster
(3-dodecilmercapto-2-decil-oxi)-propílico
de ácido
(3'-desoxi-3'-fluoro-timidina)-5'-fosfórico
(FLT-DMDOPE), que es desdoblado para dar el
3'-desoxi-3'-fluoro-timidina-5'-monofostato
y el DMDOP. Alternativamente, se desdobla también el éster
(3-dodecilmercapto-2-decil-oxi)-propílico
de ácido
(5-fluoro-uridina)-5'-fosfórico
(5-FU-DMDOPE) para dar el
(5-fluoro-uridina)-5'-monofostato
(5-FU-MP) y el DMDOP.
Las formulaciones preparadas, que contienen un
LCE, están exentas de la fosfolipasa C.
Esto se pudo mostrar tanto mediante una diferente
dependencia con respecto de cationes de la actividad del LCE, tal
como mediante agentes inhibidores específicos de la fosfolipasa C,
que no inhiben al LCE.
Con el fin de determinar el grado de conversión
del AZT-DMDOPE mediante materiales homogeneizados
celulares, fracciones membranales o bien citosólicas,
preferiblemente de diferentes tipos de células humanas, se
estableció un sistema de ensayo de enzima (Ejemplo 6).
El principio del ensayo se basa en un
desdoblamiento de la sustancia madre mediante el LCE para dar
AZT-MP y la correspondiente parte de
tioéter-lípido. Se emplearon para esto el
[^{14}C]-AZT-DMDOPE y el
AZT-DMDOPE no marcado radiactivamente. El metabolito
de tioéter-lípido DMDOP se extrajo a partir de las
tandas (Ejemplo 7) y se midió en el analizador por escintilación en
líquido la cantidad de sustancia marcada radiactivamente. Puesto
que se empleó una cantidad definida de
[^{14}C]-AZT-DMDOPE en el ensayo
de una enzima, se pudo determinar el grado de conversión del
desdoblamiento enzimático.
La enzima se aísla preferiblemente a partir de
leucocitos sanguíneos periféricos humanos, que previamente habían
sido activados por PHA u otros estimulantes (p.ej. citocinas, etc.)
o a partir de células renales murinas. A partir de investigaciones
provisionales, resulta un peso molecular de aproximadamente 120.000
- 160.000, determinado de acuerdo con el método de
SDS-PAGE. Las células, que contienen esta enzima,
se pueden identificar de una manera sencilla mediante el recurso de
que ellas, en condiciones apropiadas de ensayo, se mezclan con una
solución de AZT-DMDOPE o de
FLT-DMDOPE, y los productos de desdoblamiento
AZT-monofosfato o bien
FLT-monofosfato o el DMDOP, se detectan por ejemplo
por métodos de cromatografía en capa fina, o en el caso de muestras
marcadas radiactivamente, por procedimientos de escintigrafía
(véanse los Ejemplos 4 - 7). Al contrario que las fosfolipasas C ó
D bioquímicamente afines, el LCE no es inhibido por los conocidos
agentes inhibidores de la fosfolipasa C ó D o no es activado por
agentes activadores de la fosfolipasa C ó D. Al contrario que la
fosfolipasa C, la enzima es activada por la sustancia D 609
(xantogenato de triciclodecan-9-ilo;
C_{11}H_{15}OS_{2}K), mientras que la D 609 inhibe a la
fosfolipasa C.
La AZT intracelular no muestra en su forma no
fosforilada ningún efecto inhibidor sobre la transcriptasa inversa
(RT, del inglés Reverse Transkriptase) vírica (Nakashima y
colaboradores, 1986, Antimicrob. Agents Chemother. 30,
933-937; Mitsuya y colaboradores, 1985, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 82, 7.096-7.100). Mediante
las enzimas intracelulares, timidina-cinasa,
timidilato-cinasa y
pirimidina-nucleósido-difosfato-cinasa
(Yarchoan y colaboradores, 1989, N. Engl. J. Med. 321,
726-738; Toyoshima y colaboradores, 1991, Anal.
Biochem. 196, 302-307), el compuesto análogo
estructural a la timidina es transformado por fosforilación
sucesiva, pasando por el AZT-MP y el
AZT-DP, en el AZT-TP
terapéuticamente eficaz, que inhibe a la RT. El
AZT-DMDOPE, como conjugado de
tioéter-lípido y AZT, se podría transformar por
desdoblamiento enzimático intracelular en AZT o directamente en la
forma AZT-MP ya fosforilada. En el Ejemplo 8 se
determinan las concentraciones intracelulares de AZT fosforilada y
no fosforilada después de una incubación con concentraciones
equipotentes de AZT-DMDOPE y AZT.
El complejo de enzima y sus compuestos análogos
no muestran además en diferentes especies (p.ej. seres humanos,
ratones, ratas, perros, monos) ninguna distribución estadística
uniforme en órganos, sino que se pueden hallar solamente en las
membranas de determinadas(os) células, órganos o tejidos, que
sirven como células dianas para conjugados desdoblables de la
fórmula I. Los substratos naturales de estas enzimas son hasta
ahora todavía desconocidos. En fracciones citosólicas, la actividad
de un LCE se encuentra siempre por debajo del límite de detección,
o precisamente junto a él. Una actividad muy pequeña se puede
comprobar p.ej. también en células de médula ósea, lo cual permite
sacar la conclusión de una toxicidad para la médula ósea, muy
pequeña o que incluso falta totalmente, de las sustancias activas
farmacéuticas de la fórmula I que se emplean como substrato del
LCE.
La actividad de un LCE muestra una dependencia
lineal con respecto de proteínas y del tiempo, una dependencia
específica con respecto de cationes de metales (inhibición por
Ca^{2+}, Zn^{2+} y Mn^{2+}) y una cinética clásica de
Michaelis-Menten (dependencia con respecto del
substrato) (Ejemplo 9). Junto a la actividad más alta del complejo
de enzima en células activadas, se muestra en estas condiciones
también una afinidad más alta del LCE con respecto al
substrato.
substrato.
El LCE aislado, o grandemente enriquecido a
partir de fracciones membranales, se puede emplear también para el
escrutinio en cuanto a nuevos substratos potencialmente
desdoblables o también en cuanto a substratos que se presenten en la
naturaleza. Los substratos así encontrados se pueden investigar
entonces más ampliamente en lo que se refiere a sus características
estructurales esenciales, que son necesarias para el reconocimiento
del substrato y la fijación a un LCE. Tales propiedades
estructurales identificadas se pueden utilizar entonces a fin de
producir substratos modificados químicamente, que contienen estas
características esenciales, así como, además de ello, grupos
funcionales apropiados, que sean adecuados para el acoplamiento con
sustancias farmacológicamente activas.
También es posible por consiguiente un escrutinio
en cuanto a agentes inhibidores o activadores de la enzima que
desdobla lípidos.
Para un diagnóstico, se puede emplear la enzima
aislada o grandemente enriquecida, cuando, por ejemplo, unas
actividades aumentadas o reducidas de la enzima que desdobla
lípidos conducen a modificaciones patológicas in vitro o
in vivo, o cuando a estas modificaciones patológicas les
acompañan correspondientes enfermedades o síntomas de
enfermedades.
Asimismo, el LCE se puede emplear para la
preparación de agentes de diagnóstico, que se utilizan para
comprobar el desdoblamiento de estos substratos al realizar la
administración de las sustancias activas farmacéuticas a pacientes,
lo cual conduce a una adaptación específica e individual de las
modalidades de terapia en los casos de estos pacientes (vigilancia
de fármacos, en inglés drug monitoring).
El LCE se distingue en particular por el hecho de
que puede desdoblar a compuestos del tipo general I
(I)L – B – D
\uparrow
\hskip0.5cmDesdoblamiento por LCE
en el que L representa una parte de
lípido, B caracteriza a un puente y D representa una sustancia
farmacológicamente activa, o bien B-D significa un
fosfonato de sustancia activa. El desdoblamiento muy específico se
efectúa entre la parte de lípido y el radical fosfato. No se
observa ningún desdoblamiento inespecífico de los compuestos de la
fórmula I en otros grupos funcionales de la
molécula.
El puente B es transcrito por la fórmula III,
(III)– O –
[PZ(OH)A]_{n}
-
en la que n puede ser = 1, 2 ó 3,
pero de modo preferido es igual a 1 ó 2, y en particular es igual a
1, Z es igual a O ó S y A es o bien O, S o una línea de valencia, de
modo preferido
O.
El concepto de "sustancia farmacológicamente
activa" (denominación D o bien B-D en el caso de
fosfonatos en la fórmula I) representa en esta solicitud a una
sustancia activa en el sentido legal de medicamentos. Esta sustancia
activa puede ser una sustancia activa de un agente farmacéutico ya
introducido, admitido por las autoridades de medicamentos, o una
sustancia activa que se encuentra en la fase de admisión legal de
medicamentos. La definición de "sustancia farmacológicamente
activa" abarca también los derivados de sustancias activas, que
pueden ser modificados químicamente por introducción de uno o
varios grupos funcionales (por ejemplo, los grupos que hacen
posible un acoplamiento de D con la parte L de lípido y vehículo,
tal como p.ej. grupos hidroxi o amino). La definición abarca además
las formas de profármacos que se forman a partir de la sustancia
activa D, que son asimismo activas fisiológicamente. En particular,
entran en cuestión las sustancias farmacológicamente activas D, cuyo
desarrollo clínico se había suspendido o no se había comenzado a
causa de efectos colaterales indeseados, o que disponen de un
espectro de dosis y efecto muy estrecho, por lo que la
administración de la cantidad terapéuticamente necesaria era
dominable solamente con altos riesgos o prácticamente no era
dominable en absoluto.
Sorprendentemente, se encontró que la amplitud
terapéutica de una sustancia farmacológicamente activa D o bien
B-D se mejora de una manera significativa en el
caso de fosfonatos de sustancias activas, cuando la sustancia es
acoplada a una molécula de vehículo a modo de lípido. El conjugado
así preparado sirve como nueva sustancia activa para la preparación
de formas de presentación y administración farmacéuticas. En
conjunto, resulta a partir del acoplamiento un efecto reforzado de
la sustancia farmacéuticamente activa D o bien B-D
in vivo, puesto que mediante el resultante sistema de
transporte y suministro de fármacos se efectúa una localización de
la sustancia farmacológicamente activa en células dianas, y con
ello se aumenta a la sustancia farmacológicamente activa en lo que
se refiere a su eficiencia. Esto significa que, por una parte, se
puede reducir la cantidad de la sustancia farmacológicamente activa
que se ha de administrar, o que, por otra parte, mediando
mantenimiento de la misma cantidad efectiva se consigue un efecto
farmacológico reforzado.
La estructura química que constituye el
fundamento de las sustancias farmacológicamente activas D o bien
B-D se puede modificar además de tal manera que las
sustancias sean modificadas en lo que se refiere a sus propiedades
físicas o químicas y presenten por ejemplo una lipofilia más alta o
más baja, pero que en lo que se refiere a su efecto terapéutico
posean esencialmente las mismas propiedades que la sustancia D o
bien B-D sin modificar. En particular, es ventajoso
el hecho de que la sustancia D sea modificada químicamente, por
introducción de grupos funcionales, de tal manera que pueda ser
acoplada, a través de un apropiado puente, a la parte de lípido L.
Esto se realiza, por ejemplo, mediante introducción de grupos
hidroxi, que son acoplados al lípido a través del grupo fosfato
B.
La sustancia farmacológicamente activa D o bien
B-D constituye una sustancia química o constituida
sobre una base biológica (anticuerpo, péptido, proteína, hormona,
toxina, etc.; INDEX NOMINUM, International Drug Directory, Medpharm)
así como sus derivados químicamente modificados por introducción de
un grupo funcional (p.ej. de un grupo hidroxi). Es una premisa que
la sustancia farmacológicamente activa, o su forma de profármaco,
ha de experimentar, a través del desdoblamiento del liponucleótido
por la enzima que desdobla lípidos, una "activación" por esta
enzima propia del cuerpo. Se prefieren en tal caso sustancias
farmacológicamente activas que, después de un desdoblamiento por el
LCE, como monofosfato de sustancia farmacológicamente activa,
actúan in vivo como un producto intermedio, y son aumentados
en cuanto a su grado de fosforilación, tal como p.ej. de un
nucleósido-monofosfato, para dar el correspondiente
nucleósido-trifosfato, o son desdoblados para dar la
sustancia farmacológicamente activa libre (véase el Ejemplo 8).
Entran en el sentido del invento, en particular,
todas las sustancias farmacológicamente activas, que son eficaces
in vitro, pero son tóxicas in vivo en el intervalo
terapéutico, es decir todas las sustancias con una pequeña amplitud
terapéutica, que disponen de un grupo químicamente funcional para la
unión del enlace covalente con el fosfato. Además, se pueden
utilizar también las sustancias que en su forma farmacológicamente
activa no contienen al comienzo ningún grupo funcional, pero éste
se puede introducir, sin embargo, por una modificación química, sin
que se establezca una pérdida del efecto de la sustancia.
De modo preferido, para la conjugación con un
radical de lípido L, se utilizan las sustancias farmacológicamente
activas, que normalmente alcanzan su forma activa después de una
fosforilación (tal como p.ej. en el caso de nucleósidos) o bien
fosfonatos de sustancias activas. A partir del conjugado se pone en
libertad entonces el fosfato de una sustancia farmacológicamente
activa mediante una hidrólisis enzimática del conjugado. La puesta
en libertad de la sustancia fosforilada presenta importancia en
particular debido al hecho de que este proceso puede tener lugar
también en las células, que no disponen de las enzimas (cinasas)
que normalmente son necesarias para el aumento del grado de
fosforilación de la sustancia farmacológicamente activa pura. La
sustancia farmacológicamente activa, conjugada y puesta en libertad
intracelularmente o en la membrana celular a través del LCE, puede
tener por ejemplo un efecto citostático, citotóxico, antitumoral,
anti-vírico, anti-retrovírico,
supresor de inmunidad o estimulador de inmunidad.
Como sustancias farmacológicamente activas D o
bien B-D entran en cuestión todas las sustancias que
tienen un corto período de tiempo de semivida, en particular
también compuestos con diferentes períodos de tiempo de semivida en
órganos, tejidos o células, con una mala biodisponibilidad, es
decir con una mala resorción, un alto desdoblamiento en el hígado o
una rápida eliminación, con una mala penetración a través de las
membranas (p.ej. de la membrana celular, la barrera
hematoencefálica, etc.); con una toxicidad para la médula ósea o
con otras toxicidades limitativas para órganos (p.ej. cardio-,
hepato-, nefro- y neuro-toxicidad, etc.), cuya
concentración eficaz in vivo es demasiado pequeña. Además,
son apropiadas las sustancias que entran en interacción
deliberadamente con el núcleo celular de las células dianas e
intervienen en el acontecer molecular en el plano de los ADN o ARN,
tales como p.ej. oligonucleótidos antisentido, fragmentos de ADN, y
que se pueden utilizar para la terapia génica.
Los compuestos de la fórmula I y su preparación
se describen en los documentos de solicitudes de patentes
internacionales WO 92/03462, WO 93/16092, WO 92/16091, WO 94/03465,
en el documento PCT/EP94/02123, en los documentos de patentes
alemanas DE 4402492, DE 4418690, así como, por ejemplo, en los
documentos WO 91/119726; EP 0.350.287; y en los documentos de
patentes de los EE.UU. US 5.223.263; US 5.194.654; US 4.921.951; US
4.622.392; US 4.291.024; y US 4.283.394. En el caso de nucleósidos
eficaces anti-víricamente, se describen en los
documentos EP 0.350.287 y US 5.223.263 derivados de lípidos
(diacilglicerol-nucleósidos) y su utilización en
forma de liposomas. De modo preferido en la forma de liposomas,
debe ser posible una recepción de la sustancia a través de células
del sistema reticuloendotelial (RES, de RetikuloEndothelialen
Systems), p.ej. macrófagos y monocitos.
Mediante correspondientes ensayos comparativos se
pudo mostrar que los efectos terapéuticos de los conjugados con
diacilglicerol, conocidos a partir del documento EP 0.595.133, son
inferiores in vivo a los conjugados con tioéter- o
éter-lípidos del documento WO 92/03462. Esto ha de
ser atribuido a una hidrólisis inespecífica de los ésteres de
ácidos grasos, que tiene lugar no solamente en el sitio de la
acción. Los radicales de tioéteres y éteres no hidrolizables
muestran ventajas decisivas en comparación con éstos, puesto que tan
sólo mediante la enzima especial (LCE) se pone(n) en libertad
en las membranas del tejido celular, o bien intracelularmente, una
sustancia con efecto biológico o correspondientes productos
intermedios.
Los conjugados de la fórmula I
(L-B-D) muestran decisivas ventajas
en comparación con la sustancia farmacológicamente activa no
conjugada D o bien B-D: El vehículo
(L-B o bien L) específico, unido covalentemente a la
sustancia farmacológicamente activa, mejora la biodisponibilidad de
sustancias farmacológicamente activas, mal resorbidas, la
compatibilidad de moléculas activas potencialmente tóxicas, el
período de tiempo de permanencia de medicamentos rápidamente
eliminados o metabolizados y la penetración a través de membranas de
compuestos mal capaces de pasar a través de membranas (p.ej. de
sangre a cerebro (hematoencefálica), células, etc.). El
desdoblamiento enzimático in vivo para dar un vehículo y una
sustancia farmacológicamente activa D (o un derivado de la
sustancia), o bien para dar un vehículo y un fosfato de la
sustancia (D-monofosfato) o fosfonato
B-D farmacológicamente activo, no se efectúa por
regla general en el suero, sino tan sólo intracelularmente. Además,
la parte de vehículo con su estructura a modo de lecitina, que es
esencial para el efecto reivindicado, mejora la penetración o la
capacidad de atravesar las membranas que presenta la sustancia
farmacológicamente activa, y muestra en muchos casos un efecto de
depósito. Además de esto, la compatibilidad gastrointestinal de los
conjugados de lípidos L-B-D es
muchas veces mejor que el de las sustancias farmacológicamente
activas D puras. También en el caso de la resorción, el conjugado
de lípido muestra una mejor penetración a través de estructuras de
membranas y por consiguiente una mejor superación de las barreras
para la resorción. Lo correspondiente es válido para la penetración
p.ej. a través de la barrera hematoencefálica por una difusión
facilitada o un transporte activo eventualmente.
Los períodos de tiempo de semivida, tanto en el
cuerpo global, en las células así como también en los órganos, de
la sustancia farmacológicamente activa se prolongan
considerablemente por conjugación a causa del más largo período de
tiempo de permanencia del conjugado en el organismo. A causa de la
falta de actividad del LCE para el desdoblamiento en el suero y en
algunos órganos, no se puede observar casi ninguna toxicidad para
la médula ósea y para dichos órganos, o solamente se puede observar
una mucho menor toxicidad. En particular, es ventajoso el hecho de
que los conjugados de la fórmula I se enriquecen específicamente en
diferentes órganos, tejidos o células
dianas.
dianas.
Los compuestos de la fórmula I se pueden utilizar
como sustancias activas para la producción de medicamentos, que se
emplean para todas las enfermedades, en las que se necesitan, o son
útiles, unos altos niveles de las sustancias farmacológicamente
activas en células, órganos o tejidos. Una premisa esencial para
este sistema de transporte, que se ha de designar como
"Drug-Storage-Delivery-Targeting"
[dirección hacia diana, almacenamiento y suministro de fármacos],
consiste en que las células que han de responder en el sentido de la
terapia pretendida tienen la enzima que desdobla lípidos en las
membranas celulares internas o externas, de manera tal que, en una
primera etapa, la sustancia activa se fija al LCE y a continuación
se transporta a través de la membrana celular al interior de la
célula, efectuándose el desdoblamiento de la sustancia activa para
dar la sustancia fisiológicamente activa o bien esencialmente al
mismo tiempo que el transporte a través de la membrana celular o
también más tarde, en parte dentro de la célula. El desdoblamiento
intracelular se presenta en particular en aquellos casos en los que
el LCE está localizado también dentro de la célula. En el sentido
del invento, el desdoblamiento de la sustancia activa, vinculado
con la liberación intracelular de la sustancia farmacológicamente
activa, se puede efectuar también de tal manera que o bien se forme
en tal caso directamente la sustancia fisiológica o
farmacológicamente activa, o que resulte un compuesto precursor
(forma de profármaco) correspondiente a esta sustancia. Células
dianas apropiadas son, por ejemplo, leucocitos sanguíneos (PBLs),
monocitos, células renales o macrófagos y células del sistema
linfático inmunológico.
Como posibles sales de los compuestos de la
fórmula general I entran en cuestión, sobre todo, sales de metales
alcalinos, de metales alcalino-térreos y de amonio
del grupo fosfato. Como sales de metales alcalinos se prefieren las
sales de litio, sodio y potasio. Como sales de metales
alcalino-térreos entran en cuestión en particular
las sales de magnesio y calcio. Por sales de amonio se entienden
conforme al invento las sales que contienen el ion de amonio, que
puede estar sustituido hasta cuatro veces con radicales alquilo de
1-4 átomos de carbono y/o con radicales aralquilo,
preferiblemente radicales bencilo. Los sustituyentes pueden en este
caso ser iguales o diferentes.
Los compuestos de la fórmula general I pueden
contener grupos de carácter básico, en particular grupos amino, que
pueden ser transformados con apropiados ácidos inorgánicos u
orgánicos en sales por adición de ácidos. Como ácidos entran en
consideración para esto, por ejemplo: ácido clorhídrico, ácido
bromhídrico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico, ácido fumárico,
ácido succínico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido láctico,
ácido maleico o ácido metanosul-
fónico.
fónico.
Junto a los compuestos de la fórmula general I,
esta solicitud se refiere también a sus tautómeros y sus sales
fisiológicamente compatibles con ácidos o bases de carácter
inorgánico u orgánico, así como a procedimientos para su preparación
y a medicamentos que contienen estos compuestos.
Puesto que los compuestos de la fórmula general I
contienen átomos de carbono asimétricos, son también objeto del
presente invento todas las formas ópticamente activas y las mezclas
racémicas de estos compuestos.
Son objeto de esta solicitud también nuevos
liponucleótidos. La preparación de estos conjugados se muestra
ejemplarmente en los Ejemplos 14-16. El LCE desdobla
también a conjugados de
2-cloro-2'-desoxi-adenosina
(conjugados de cladribina) de la fórmula V, a conjugados de
9-(\beta-D-arabinofuranosil)-2-fluoro-adenina
(conjugados de fludarabina) de la fórmula VI, y a conjugados de
3-(2-desoxi-\beta-D-eritro-pentofuranosil)-3,6,7,8-tetrahidro-imidazo[4,5-
d][1,3]diazepin-8-ol
(conjugados de pentostatina) de la fórmula VII. Los mencionados
compuestos se pueden aplicar terapéuticamente mejor que los
correspondientes nucleósidos a solas, puesto que muestran una muy
buena actividad y una gran amplitud terapéutica y tienen las mismas
ventajas que los derivados de la fórmula I antes mencionados:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
10 mg del éster
(3'-dodecil-mercapto-2-decil-oxi)propílico
de ácido
(3'-desoxi-3'-azido-timidina)-5'-fosfórico
(AZT-DMDOPE) se suspenden en 0,5 ml de una solución
0,1 M del tampón Tris, y después de haber añadido la enzima (0,5 mg
en el caso de una fosfodiesterasa y 0,1 mg en el caso de una
fosfolipasa / nucleasa), se incuban durante 15 horas a 37ºC. A
continuación, la solución se investiga por cromatografía en capa
fina (DC, del alemán Dünnschicht Chromatographie). Después de haber
añadido 5 gotas de una solución saturada de NaHCO_{3}, se incubó
a 37ºC durante 6 horas más, y a continuación la solución se
investigó por cromatografía en capa fina.
Mediante cromatografía en capa fina con
diferentes agentes de elución, la solución se investigó en lo que
se refiere a la formación de los posibles productos de
desdoblamiento (AZT, AZT-monofosfato, DMDOP y
monofosfato de lípido).
- a)
- Fosfolipasa C procedente de Bacillus cereus, 2000 U / 0,5 ml, Boehringer Mannheim GmbH
- b)
- Fosfolipasa C, tipo I, procedente de col, 150 - 300 U / mg, Sigma
- c)
- Fosfodiesterasa procedente de bazo de ternero, 2 U / mg, Boehringer Mannheim GmbH
- d)
- Fosfodiesterasa procedente de veneno de serpiente, Boehringer Mannheim GmbH
- e)
- Nucleasa procedente de Staphylococcus aureus, 15.000 U/mg, Boehringer Mannheim GmbH
- f)
- LCE (enzima que disocia lípidos)
A partir de la siguiente Tabla se desprende que
solamente en el caso de la fosfolipasa D se comprueba una débil
extinción de la fluorescencia a la altura del fosfato de lípido. En
ninguno de los casos a) - e), utilizados como enzimas de
referencia, se pudo comprobar la formación de la AZT ni del
AZT-monofosfato.
A partir del AZT-DMDOPE
inalterado no se pudo encontrar en estos ensayos ninguna mancha
adicional en el marco del límite de detección.
| Enzima | Extinción de la fluorescencia en DC |
| Fosfolipasa C | negativa |
| Fosfolipasa D | débil |
| Fosfodiesterasa de bazo de ternero | negativa |
| Fosfodiesterasa de veneno de serpiente | negativa |
| Nucleasa de Staphylococcus aureus | negativa |
| LCE | positiva |
Figura 1: Esta Figura muestra la actividad del
LCE que se había obtenido a partir de la fracción membranal de
leucocitos sanguíneos periféricos humanos, estimulados por PHA, en
función de la concentración de proteína. Resulta una conexión lineal
entre la concentración de proteína y la cantidad del producto de
desdoblamiento DMDOP que se ha formado.
Figura 2: Esta Figura muestra la cinética para
substratos (cinética de Michaelis-Menten) del LCE,
que se había obtenido a partir de la fracción membranal de
leucocitos sanguíneos periféricos humanos, estimulados por PHA.
Figura 3: Esta Figura muestra la cinética para
substratos (cinética de Michaelis-Menten) del LCE,
que se había obtenido a partir de la fracción membranal de
leucocitos sanguíneos periféricos humanos, estimulados por PHA
[\sqbullet] y a partir de leucocitos sanguíneos periféricos
humanos [\Box] en reposo (no estimulados).
Figura 4: Esta Figura muestra la dependencia de
la actividad enzimática específica del LCE, que se había obtenido a
partir de la fracción membranal de leucocitos sanguíneos periféricos
humanos, estimulados por PHA, con respecto de la concentración de
iones de calcio.
Figura 5: Esta Figura muestra la distribución
específica en órganos y tejidos del LCE de preparaciones de
membranas y células en un perro sin tratar.
Figura 6: Concentraciones intracelulares de AZT y
de AZT-nucleótidos en PBL humanos estimulados
después de una incubación durante 1, 3, 6 y 24 h con:
(A) 0,03 \mug de AZT / ml [\sqbullet] o bien
1 \mug de AZT-DMDOPE / ml [\Box]
(B) 0,3 \mug de AZT / ml [\sqbullet] o bien
10 \mug de AZT-DMDOPE / ml [\Box]
(Valores medios, n = 2 determinaciones)
Figura 7: Concentraciones intracelulares de AZT y
AZT-nucleótidos en PBL humanos no estimulados
después de una incubación durante 1, 3, 6 y 24 h con:
(A) 0,03 \mug de AZT / ml [\sqbullet] o bien
1 \mug de AZT-DMDOPE / ml [\Box]
(B) 0,3 \mug de AZT / ml [\sqbullet] o bien
10 \mug de AZT-DMDOPE / ml [\Box]
(Valores medios, n = 2 determinaciones)
Figura 8: Concentraciones intracelulares de AZT o
bien de AZT-nucleótidos en PBL humanos estimulados
después de una incubación durante 6 y 24 h con:
1 \mug de AZT-DMDOPE / ml de
(A) o bien 10 \mug de AZT-DMDOPE / ml de (B):
[\sqbullet] Tratamiento con una fosfatasa
alcalina
[\Box] Ningún tratamiento con una fosfatasa
alcalina
(Valores medios, n = 2 determinaciones)
Figura 9: Concentración intracelular de AZT y
AZT-nucleótidos en células P3X63Ag8.653 después de
una incubación durante 6, 24 y 48 h con:
(A) 0,03 \mug de AZT / ml [\sqbullet] o bien
1 \mug de AZT-DMDOPE / ml [\Box]
(B) 0,3 \mug de AZT / ml [\sqbullet] o bien
10 \mug de AZT-DMDOPE / ml [\Box]
(Valores medios, n = 2 determinaciones)
Figura 10: Concentraciones intracelulares de AZT
o bien de AZT-nucleótidos en células P3X63Ag8.653
después de una incubación durante 6 o 24 h con
1 \mug de BM 21.1290 Na / ml (A) o bien 10
\mug de AZT-DMDOPE / ml (B):
[\sqbullet] Tratamiento con una fosfatasa
alcalina
[\Box] Ningún tratamiento con una fosfatasa
alcalina
(Valores medios, n = 2 determinaciones)
Figura 11: Cinética de extinción intracelular de
AZT y AZT-nucleótidos en PBL humanos estimulados
después de una incubación durante 24 h con 0,3 \mug de AZT / ml
(A) o bien con 10 \mug de AZT-DMDOPE / ml (B).
Concentración intracelular de AZT y AZT-nucleótidos
a las 1, 3, 6, 24 y 48 h después de la eliminación de la solución
para incubación de AZT o respectivamente de
AZT-DMDOPE
(Valores medios, n = 2 determinaciones)
Figura 12: Desdoblamiento enzimático de
[^{14}C]-AZT-DMDOPE mediante
fracciones membranales (100 \mug de proteína / tanda) de PBL
humanos estimulados. El cromatograma por DC de la fase de
n-heptano después de una adsorción del substrato al
gel de sílice Kieselgel 60 H y separación en el sistema IBA (mezcla
de 2-propanolol, acetato de n-butilo
y agua bidestilada, 10:6:4, v/v/v) con Kieselgel 60 como fase
estacionaria.
Figura 13: Actividad específica [en pmol
mg^{-1} min^{-1}] del LCE en materiales homogeneizados
celulares, en el citosol y en fracciones membranales de PBL humanos
estimulados (valor medio \pm DT (desviación típica), n = 6
determinaciones)
Figura 14: Desdoblamiento de
AZT-DMDOPE mediante las fracciones membranales de
PBL humanos estimulados, en función de la concentración de proteína
(valor medio \pm DT, n = 3 determinaciones)
Figura 15: Desdoblamiento de
AZT-DMDOPE mediante la fracción membranal de
monocitos / macrófagos (monocitos estimulados) humanos en función de
la concentración de proteína (valor medio, n = 2
determinaciones)
Figura 16: Actividad específica del LCE a través
de fracciones membranales de PBL humanos estimulados y no
estimulados así como monocitos y monocitos / macrófagos (monocitos
estimulados) humanos (PBL humanos: valor medio \pm DT, n = 6
determinaciones) (monocitos humanos : valor medio \pm DT, n = 4
determinaciones)
Figura 17: Desdoblamiento de
AZT-DMDOPE mediante fracciones membranales de PBL
humanos estimulados en función del período de tiempo de incubación
(valor medio \pm DT, n = 3 determinaciones)
Figura 18: Cromatograma por DC de
[^{14}C]-AZT-DMDOPE (A) y de
[^{14}C]-AZT-DMDOPE después de un
desdoblamiento enzimático mediante materiales homogeneizados
celulares de 5 x 10^{7} células CEM-SS (B) después
de una incubación durante 6 h a 37ºC.
Extracción de los tioéter-lípidos
con una mezcla de dietil-éter y 2-propanol (9:1,
v/v) y separación en el sistema IBAE (mezcla de
2-propanol, acetato de n-butilo,
agua bidestilada y ácido acético glacial, 3:5:1:1, v/v/v/v) con
Kieselgel 60 como fase estacionaria.
| Inhibidor / activador | Punto de ataque de la | Fracción membranal | Influencia sobre la |
| inhibición / activación | de LCE | actividad de LCE | |
| SQ 22536 | Adenilato-ciclasa | Riñón (Balb/c) | ninguna |
| 7-Nitro-indazol | NO-sintasa | Riñón (Balb/c) | ninguna |
| RHC-80267 | DAG-lipasa | Riñón (Balb/c) | ninguna |
| Neomicina | PLC, (PLD) | Riñón (Balb/c) | ninguna |
| Wortmanina | PLD, (PLC) | Riñón (Balb/c) | ninguna |
| Ácido acetilsalicílico | PLC | Riñón (Balb/c) | ninguna |
| GTP-\beta-S | Activador de Gp | Riñón (Balb/c) | ninguna |
| D 609 | PLC | Riñón (Balb/c) | estimulación |
| CEM-SS | estimulación |
Las células cultivadas para la producción de
fracciones membranales y citosólicas se transfirieron a tubitos de
polipropileno (con una capacidad de 50 ml) y se sedimentaron
durante 10 min con 1.600 rpm en la Minifuge T a la temperatura
ambiente. Para la eliminación de los restos del medio de cultivo, el
sedimento celular se lavó tres veces con PBS (de Phosphate Buffered
Saline = solución salina tamponada con fosfato) fría y se recogió
en un tampón de disgregación con una densidad celular de 1 - 5 x
10^{8} células / ml. La suspensión de células se transfirió a
continuación a un aparato homogeneizador de vidrio enfriado por
hielo. Moviendo varias veces un émbolo de Teflón, las células se
disgregaron mecánicamente, siendo controlada la disgregación celular
por vía óptica en un microscopio de contraste de fases con
inversión. Las células disgregadas se centrifugaron a continuación,
para la eliminación de los núcleos celulares y de las células no
disgregadas, en la Minifuge T a 4ºC con 1.700 rpm durante 10 min. El
material sobrenadante se retiró cuidadosamente con una pipeta y se
diluyó con un tampón Tris 50 mM (de pH 7,5) al 10% (p/v = peso /
volumen) de sacarosa. El material homogeneizado celular, después
de su distribución en porciones, se almacenó a -70ºC y se usó para
el aislamiento de fracciones membranales y citosólicas. Para esto,
3,2 ml del material homogeneizado celular se transfirieron a
tubitos de policarbonato (con una capacidad de 3,2 ml) de paredes
gruesas, enfriados sobre hielo, y se centrifugaron durante 1 h a 4ºC
y 75.000 rpm con una ultracentrífuga de
Beckmann-Tabletop con el rotor
TLA-100.4. Los materiales sobrenadantes se retiraron
cuidadosamente con una pipeta Combitip y los sedimentos
membranales, bien visibles, se mezclaron en cada caso con 1 ml de un
tampón Tris 50 mM (de pH 7,5) / sacarosa al 10%. El sedimento
membranal se homogeneizó de una manera basta con ayuda de una
jeringa (de 5 ml de capacidad) con una cánula (de 0,9 x 40 mm). Los
materiales homogeneizados bastos se reunieron y se homogeneizaron
finamente mediando utilización de cánulas de menor diámetro (0,8 x
40 mm y 0,45 x 25 mm). Las fracciones membranales y citosólicas se
almacenaron a -70ºC después de una distribución en porciones.
\vskip1.000000\baselineskip
| Tampón de disgregación | 50 mM de Tris pH 7,5 |
| 70% (p/v) de sacarosa | |
| 50 \mug / ml de APMSF | |
| \begin{minipage}[t]{120mm} Para disolver la sacarosa, el tampón se tiene que calentar ligeramente mediando agitación \end{minipage} |
\vskip1.000000\baselineskip
Se aislaron PBL humanos por centrifugación en el
gradiente isotónico de densidades y se estimularon con
PHA-M durante 72 h. Para la eliminación de restos
del medio de cultivo, las células se lavaron tres veces con una PBS
fría y después de una determinación del número de células se
congelaron en N_{2} líquido y a continuación se almacenaron a
-70ºC. La lisis de las células se efectuó por descongelación y
congelación repetidas tres veces en un Tampón 1, ajustándose una
densidad celular de 2,5 x 10^{8} células / ml. En tubitos de
centrífuga Ti60 (con una capacidad de 30 ml) se dispuso previamente
una mezcla de 11 ml de Percoll y 2,13 ml de un Tampón 2, que
previamente se había ajustado a un pH de 9 con 70 \mul de NaOH 2
N. Para el aislamiento de la membrana plasmática, se aplicaron
sobre la mezcla 4 ml del material homogeneizado, y a continuación se
fraccionaron en el rotor Ti60 a 4ºC y 39.000 rpm durante 10 min,
estando desconectado el freno, en la ultracentrífuga de Beckmann L
5 50. A partir de la fase superior de los tubitos de centrífuga, se
sacaron fracciones de 1 ml y se diluyeron con 2 ml del Tampón 3.
Las soluciones se transfirieron a continuación a tubitos Ti50 (con
una capacidad de 10,4 ml) y, para la eliminación de restos del
medio de separación, se centrifugaron durante 45 min a 4ºC y 45.000
rpm en la ultracentrífuga de Beckmann L 5 50 con un rotor Ti50. Los
materiales sobrenadantes se retiraron con una pipeta, se
fraccionaron, se congelaron en N_{2} líquido y se almacenaron a
-70ºC. La caracterización de las fracciones se efectuó mediante
determinación del contenido de proteína y de la actividad enzimática
de la fosfatasa alcalina.
\vskip1.000000\baselineskip
| Tampón 1 | 100 mM | KCl |
| 5 mM | MgCl_{2} x 6 H_{2}O | |
| 1 mM | ATP | |
| 2 mM | fluoruro de (4-amidino-fenil)-metanosulfonilo (APMSF) | |
| 25 mM | Tris de pH 9,6 |
| Tampón 2 | 400 mM | KCl |
| 20 mM | MgCl_{2} x 6 H_{2}O | |
| 400 mM | Tris de pH 9,6 |
| Tampón 3 | 100 mM | KCl |
| 5 mM | MgCl_{2} x 6 H_{2}O | |
| 50 mM | Tris de pH 7,42 |
Como substrato se empleó en el ensayo de LCE una
mezcla de [^{14}C]-AZT-DMDOPE y
de AZT-DMDOPE no marcado radiactivamente.
Partiendo de una solución original de
[^{14}C]-AZT-DMDOPE, por dilución
con etanol se preparó una solución con una actividad específica de
83,27 kBq / ml. La solución etanólica se podía almacenar a 4ºC bajo
un gas inerte durante 2 meses.
En una tanda separada, se preparó el componente
no marcado radiactivamente de la mezcla de sustancias. Para esto,
se formuló en etanol una solución de AZT-DMDOPE con
una concentración de 1 \mumol / ml y se trató de manera
continuamente con ultrasonidos durante 1 min en un baño de hielo y
agua con la barra de ultrasonidos con una cesión de energía de
30%.
Para la preparación de la mezcla de substratos a
base del AZT-DMDOPE radiactivo y del no radiactivo,
se transfirieron a partir de estas soluciones etanólicas por cada
tanda 1,67 kBq de
[^{14}C]-AZT-DMDOPE marcado
radiactivamente y 0,7 - 5 nmol del compuesto no marcado a un tubito
de vidrio (con una capacidad de 10 ml). El disolvente se evaporó en
una corriente de N_{2}, y el AZT-DMDOPE se recogió
en un volumen apropiado de agua bidestilada y se trató
continuamente con ultrasonidos durante 1 min mediando enfriamiento
en un baño de hielo y agua con una cesión de energía de 30%.
Para la investigación del desdoblamiento
enzimático en función del tiempo y de la concentración de proteína,
se emplearon en el ensayo de LCE usualmente 5 nmol de
AZT-DMDOPE y 0,98 nmol de
[^{14}C]-AZT-DMDOPE (1,67 kBq) en
un volumen de 200 \mul de agua bidestilada. El esquema de pipeteo
se indica en la siguiente Tabla.
Para investigar el desdoblamiento enzimático en
función de la concentración de substratos se formuló en el ensayo
de LCE una solución original de substratos de 0,98 nmol de
[^{14}C]-AZT-DMDOPE y 0,7 nmol de
AZT-DMDOPE/80 \mul de agua bidestilada. Las
diferentes concentraciones de substratos en el ensayo de LCE se
ajustaron por continua duplicación o división por la mitad del
volumen de la solución de substratos. Las tandas se dispusieron
previamente en tubitos de vidrio (con una capacidad de 5 ml) y se
iniciaron por adición de la solución de substratos. La incubación se
llevó a cabo mediando ligero sacudimiento en un baño de agua a
37ºC.
Las tandas de reacción del ensayo de LCE se
sacaron del baño de agua después de un correspondiente período de
tiempo de incubación, y la reacción se detuvo por adición de 750
\mul de 2-propanol. Después de haberlas mezclado a
fondo, las tandas se mezclaron a continuación con 700 \mul de
n-heptano calentado a la temperatura ambiente. Las
tandas se mezclaron bien nuevamente durante 30 s (segundos) y, para
la aceleración de la separación entre fases, se centrifugaron a la
temperatura ambiente durante 15 min a 3.200 rpm en la Minifuge T. A
continuación, se sacaron 500 \mul de la fase superior
(n-heptano) y se transfirieron a nuevos tubitos de
vidrio (con una capacidad de 5 ml) con 10 mg de Kieselgel 60 H y
200 \mul de n-heptano. Las tandas se mezclaron a
fondo bien durante 30 s y, para la sedimentación del gel de sílice,
se centrifugaron durante 10 min en las condiciones antes
mencionadas. Del material sobrenadante se sacaron a continuación 500
\mul, y se mezclaron con 3 ml de un líquido de escintilación
(centelleo). La medición de la radiactividad se efectuó durante 4
min en un aparato analizador de la escintilación en líquido. Para
la determinación del valor absoluto de la radiactividad, se
mezclaron 200 \mul de la solución de substratos con 3 ml del
líquido de escintilación y se midieron en las mismas condiciones en
el aparato analizador de la escintilación en líquido.
Para la determinación de las concentraciones
intracelulares de AZT y/o de AZT-nucleótidos,
después de una incubación con AZT-DMDOPE o bien con
AZT, se aislaron los PBL humanos como "buffy coat" (que se
denominará en lo sucesivo como "revestimiento anteado".
Para esto, el "revestimiento anteado" de
donantes sanos se mezcló y se fraccionó por centrifugación en un
medio isotónico con una densidad de 1,077 g / ml. Puesto que las
células sanguíneas mononucleares (monocitos y linfocitos) tienen una
densidad menor que los eritrocitos y los granulocitos
polimorfonucleares, ellas forman un anillo junto al límite entre el
medio de separación y la muestra, y se pueden retirar con ayuda de
una pipeta. Los eritrocitos y los granulocitos polimorfonucleares
se sedimentan, a causa de su densidad más alta, a través del medio,
y por consiguiente se pueden separar de los PBL.
Para la estimulación de la proliferación celular
se empleó fitohemaglutinina A (mucoproteína)
(PHA-M), que es el extracto mitógeno de lectinas de
la judía roja (Phaseolus vulgaris). La fitohemaglutinina es
una familia de 5 isolectinas, que se presentan en forma de
tetrámeros. Las subunidades constan de un tipo L, reactivo con
linfocitos, y de un tipo E, reactivo con eritrocitos. El tipo L
tiene una alta afinidad para receptores superficiales de
linfocitos, y por consiguiente es responsable de las propiedades
mitógenas. La estimulación de los linfocitos se llevó a cabo en un
medio completo III de RPMI 1640 durante 72 h a 37ºC y con 5% de
CO_{2}. Después de haberse terminado la estimulación, con el fin
de aumentar el número de células, las células se cultivaron durante
24 h adicionales en un medio completo IV de RPMI 1640.
Para la determinación de las concentraciones
intracelulares de AZT y de AZT-nucleótidos, las
células se transfirieron a un medio completo II de RPMI 1640 con
una densidad de 1 x 10^{6} células / ml en frascos de cultivo de
tejidos (50 ml / 25 cm^{2}) y se incubaron durante 1 - 24 h en
presencia de 0,03 o bien 0,3 \mug de AZT / ml (carga 15) y de 1 o
bien 10 \mug de AZT-DMDOPE / ml.
Las concentraciones de AZT-DMDOPE
y de AZT se orientaban en este caso a los valores de IC50
(concentración inhibidora del 50%) para la actividad
anti-retrovírica, que se habían determinado para AZT
y AZT-DMDOPE en PBL humanos infectados con
HIV-1.
Los cultivos se incubaron a continuación durante
1, 3, 6 y 24 h a 37ºC y con 5% de CO_{2}. La AZT y sus
nucleótidos se extrajeron a continuación con metanol al 60%. Los
nucleótidos extraídos se desfosforilaron cuantitativamente con una
fosfatasa alcalina para dar la AZT, puesto que con ayuda de un
ensayo radioinmunológico se puede detectar solamente la AZT, pero
no los correspondientes nucleótidos.
Las concentraciones de AZT intracelular, que se
determinaron con ayuda del ensayo radioinmunológico, se componían
correspondientemente de las de AZT y de las de los
AZT-nucleótidos. No se llevó a cabo ninguna
cuantificación por separado de las concentraciones de
AZT-MP, AZT-DP y
AZT-TP. Unas observaciones experimentales en PBL
estimulados pudieron demostrar una concentración del
AZT-MP mayor en un factor de 40 en comparación con
las del AZT-DP y del AZT-TP (Arner y
colaboradores, 1992, J. Biol. Chem. 267,
10968-10975). Correspondientemente, se puede suponer
que la fracción de nucleótidos se compone casi exclusivamente de
AZT-MP.
En PBL humanos estimulados se alcanzaron, al
realizar la incubación con 0,03 o bien 0,3 \mug de AZT / ml, unas
concentraciones máximas de 2,90 y respectivamente 30,97 ng /
10^{6} células después de una incubación durante 6 y
respectivamente 3 h (Figura 6). Las concentraciones descendieron a
continuación a 2,32 y respectivamente 19,88 ng / 10^{6} células
con un período de tiempo de incubación creciente. Después de una
incubación con 1 o bien 10 \mug de AZT-DMDOPE / ml
se mostró un nivel intracelular constantemente creciente de AZT y
de sus nucleótidos a lo largo de todo el período de tiempo de
incubación. Después de una incubación durante 24 h con
AZT-DMDOPE y con AZT, los niveles intracelulares
eran idénticos. En unos ensayos adicionales se pudo mostrar que,
después de un período de tiempo de incubación de 18 - 48 h, las
concentraciones de AZT y de AZT-nucleótidos después
de una incubación con AZT-DMDOPE son incluso mayores
que después de una incubación con la concentración equipotente de
AZT.
En el caso de PBL humanos no estimulados, se
invirtieron las circunstancias (Figura 7). Así, las concentraciones
intracelulares de AZT y de AZT-nucleótidos, después
de una incubación con AZT-DMDOPE a lo largo del
mismo período de tiempo de incubación, eran mayores que después de
una incubación con la concentración equipotente de AZT. Después de
una incubación con 1 o bien 10 \mug de AZT-DMDOPE
/ ml se alcanzaron unas concentraciones intracelulares máximas de
AZT y AZT-nucleótidos de 0,62 y respectivamente 4,74
ng / 10^{6} células, mientras que después de una incubación con
0,03 o bien 0,3 \mug de AZT / ml se pudieron detectar unas
concentraciones de 0,10 y respectivamente 0,47 mg / 10^{6}
células.
Para la cuantificación por separado de la AZT y
de los AZT-nucleótidos después de una incubación
con BM 21.1290 Na, se determinaron todas las concentraciones
intracelulares de AZT y de AZT-nucleótidos con y sin
tratamiento con una fosfatasa alcalina. Estos experimentos se
llevaron a cabo con PBL humanos estimulados.
Para esto, se incubaron suspensiones celulares
con una densidad de 10^{6} células / ml con 1 o bien 10 \mug de
AZT-DMDOPE / ml durante 6 o bien 24 h a 37ºC y con
5% de CO_{2}. Las concentraciones intracelulares máximas de AZT
libre después de una incubación con 1 o bien 10 \mug de
AZT-DMDOPE / ml se detectaron después de 6 o bien 24
h con 0,03 o bien 0,15 ng / 10^{6} células (Figura 8). Si,
después de un tratamiento con una fosfatasa alcalina, se
determinaron adicionalmente los AZT-nucleótidos
intracelulares fosforilados, entonces se encontraron después de 24
h concentraciones máximas de 3,85 o bien 6,41 ng / 10^{6}
células.
La determinación de las concentraciones
intracelulares de AZT y de AZT-nucleótidos en
células deficientes en timidina-cinasa debería
suministrar reconocimientos adicionales acerca del desdoblamiento
intracelular de la sustancia de ensayo AZT-DMDOPE.
La AZT intracelular, a causa de un defecto en cuanto a
timidina-cinasa (TK), no se puede transformar en
estas células en el AZT-MP y por consiguiente
tampoco en el AZT-TP terapéuticamente eficaz. La
determinación de las concentraciones intracelulares de AZT y de
AZT-nucleótidos, después de una incubación con
AZT-DMDOPE, podría dar por consiguiente una
indicación adicional acerca del desdoblamiento de la sustancia de
ensayo.
Para esto, en cubetas de cultivo de tejidos (de
60 x 15 mm) se incubaron 1 x 10^{7} células en un medio completo
I de RPMI 1640 con 0,03 o bien 0,3 \mug de AZT / ml y con 1 o
bien 10 \mug de AZT-DMDOPE / ml durante 6, 24 y 48
h. Después de una extracción de AZT y de los
AZT-nucleótidos y de un tratamiento con una
fosfatasa alcalina, se determinó la concentración de AZT con ayuda
del ensayo radioinmunológico.
A partir del registro gráfico de los resultados
de los ensayos se puede deducir que las concentraciones
intracelulares de AZT y de AZT-nucleótidos con
AZT-DMDOPE eran manifiestamente mayores que después
de una incubación con concentraciones equipotentes de AZT. Así,
después de una incubación durante 6 h con 1 o bien 10 \mug de
AZT-DMDOPE / ml se alcanzaron unas concentraciones
máximas de AZT y de AZT-nucleótidos de 0,55 y
respectivamente 4,40 ng / 10^{6} células (Figura 9).
Las concentraciones intracelulares máximas de AZT
y de AZT-nucleótidos, después de una incubación con
0,03 o bien 0,3 \mug de AZT / ml, se determinaron después de 48 h
con unos valores de 0,03 y respectivamente 0,3 ng / 10^{6}
células.
Para la cuantificación de las proporciones de AZT
fosforilada, las concentraciones intracelulares de AZT y de
AZT-nucleótidos se compararon antes y después de un
tratamiento de los extractos celulares con una fosfatasa alcalina.
Los niveles de sustancia de AZT fosforilada después de una
incubación con 1 o bien 10 \mug de AZT-DMDOPE /
ml proporcionaron en este caso unos valores de 0,48 y
respectivamente 2,42 ng / 10^{6} células (Figura 10). Si se
determinó solamente la AZT, después de 24 h se alcanzaron unas
concentraciones máximas de 0,05 y respectivamente 1,10 ng / ml. Las
diferencias en las concentraciones intracelulares de
AZT-nucleótidos después de una incubación con AZT y
AZT-DMDOPE se pueden explicar por un desdoblamiento
intracelular de la sustancia de ensayo AZT-DMDOPE
para formar AZT-MP.
Se incubaron PBL humanos estimulados durante 24 h
con 0,3 \mug de AZT / ml o bien con 10 \mug de
AZT-DMDOPE / ml. A continuación, se transfirieron 1
x 10^{7} células a frascos de cultivo de tejidos (50 ml / 25
cm^{2}) con un medio completo I de RPMI 1640. Después de 1, 3, 6,
24 y 48 h, la AZT y los AZT-nucleótidos se
extrajeron desde la matriz celular. Después de un tratamiento con
una fosfatasa alcalina, se determinó la concentración de AZT con
ayuda del ensayo radioinmunológico.
A partir de la representación gráfica de los
resultados de los ensayos, se puede deducir que, después de una
incubación de las células con AZT, disminuyen rápidamente las
concentraciones intracelulares de AZT y de
AZT-nucleótidos y que, después de 6 h, éstas
alcanzan un valor constante de 0,40 ng / 10^{6} células. En el
caso de una incubación con una concentración equipotente de
AZT-DMDOPE, por el contrario, la AZT o bien los
AZT-nucleótidos disminuyen con menos intensidad y
después de 3 h alcanzan, en el caso de una concentración
esencialmente más alta, un valor constante durante 48 h de 1,80 ng
/ 10^{6} células (Figura 11). Puesto que la AZT no fosforilada se
había eliminado desde la célula lavando múltiples veces con PBS,
las concentraciones intracelulares han de ser atribuidas
principalmente a los AZT-nucleótidos fosforilados.
Una incubación con AZT-DMDOPE pone por consiguiente
a disposición de la célula, en comparación con una concentración
equipotente de AZT, una concentración más alta en un factor de 4,5
de AZT fosforilada. Estas grandes diferencias en las concentraciones
celulares de AZT-nucleótidos después de una
incubación con AZT-DMDOPE y AZT se pueden explicar
por un desdoblamiento intracelular directa del conjugado de
tioéter-lípido AZT-DMDOPE para dar
AZT-MP y la correspondiente parte de
tioéter-lípido DMDOP.
Las investigaciones acerca del desdoblamiento
enzimático del AZT-DMDOPE mediante materiales
homogeneizados celulares de PBL humanos y de células
CEM-SS pudieron mostrar que el
AZT-DMDOPE es metabolizado para dar DMDOP y
AZT-MP. La caracterización del LCE era la meta de
las siguientes investigaciones. Así, se investiga el desdoblamiento
enzimático del AZT-DMDOPE en función de la
concentración de proteína, del período de tiempo de incubación y de
los cationes de metales bivalentes. En función de diferentes
concentraciones del substrato se determinan en investigaciones
cinéticas de enzimas los parámetros aparentes de
Michaelis-Menten K_{M} y v_{max}.
Para estas investigaciones, se ha establecido un
ensayo de enzima, en el que se emplearon como substratos
AZT-DMDOPE y
[^{14}C]-AZT-DMDOPE (Ejemplo 6).
En el caso de mediciones dependientes de la proteína y del tiempo,
se utilizaron 5 nmol de AZT-DMDOPE y 0,98 nmol
(1,67 kBq) de [^{14}C]-AZT-DMDOPE
/ tanda. En el caso de conversiones dependientes de los substratos
se empleó una solución original de 0,98 nmol de
[^{14}C]-AZT-DMDOPE y de 0,7 nmol
de AZT-DMDOPE / 80 \mul. Las diferentes
concentraciones de los substratos se ajustaron a continuación por
continua duplicación o división por la mitad del volumen en
presencia de una solución de substratos.
Como fuente de la enzima se pueden emplear p.ej.
materiales homogeneizados celulares, fracciones citosólicas y
membranales, con conocidas concentraciones de proteína, de
diferentes células humanas.
La cuantificación del desdoblamiento enzimático
del AZT-DMDOPE se llevó a cabo mediante una
extracción en dos etapas del metabolito DMDOP con
n-heptano y una subsiguiente adsorción de restos
del substrato AZT-DMDOPE a Kieselgel 60 H. En este
caso, las tandas de reacción se mezclaron con
2-propanol y n-heptano,
enriqueciéndose en la fase de n-heptano el DMDOP
menos polar en comparación con el substrato. La fase de
n-heptano se mezcló luego con Kieselgel 60 H, siendo
adsorbidos los restos del substrato AZT-DMDOPE. La
fase de n-heptano se separó a continuación del gel
de sílice por centrifugación, se transfirió a 3 ml de Aqua luma y la
cantidad contenida en ella de DMDOP marcado radiactivamente se
determinó en el aparato analizador de escintilación en líquido
durante un período de tiempo de 5 min. A partir de estos resultados
se pudieron calcular la conversión porcentual del substrato
AZT-DMDOPE en DMDOP y la actividad específica del
LCE. Como actividad específica se designó en este caso la cantidad
de DMDOP que se había formado por 1 mg de proteína de las
preparaciones celulares empleadas, por minuto.
Para la comprobación de la extracción selectiva
del DMDOP a partir de la mezcla de reacción, se llevaron a cabo
experimentos de optimización con fracciones membranales de PBL
humanos estimulados. La concentración de proteína era en este caso
de 100 \mug / tanda. Paralelamente, se trataron tandas sin
proteína. Después de la extracción, la fase de
n-heptano se evaporó en una corriente de N_{2}, y
los residuos se recogieron en una mezcla de metanol y éster etílico
de ácido acético (1:1, v/v).
El análisis por cromatografía en capa fina se
efectuó en el sistema IBA. El valor de la reacción dejó reconocer
en este caso solamente el pico de la sustancia madre
[^{14}C]-AZT-DMDOPE. En la tanda
de reacción se detectó un pico de sustancia en el extremo del
frente de agente eluyente, que, basándose en el valor de R_{f}, se
pudo identificar inequívocamente como el metabolito
[^{14}C]-DMDOP (Figura 12). El pico, que se
desplaza inmediatamente delante del pico de la sustancia DMDPO, no
puede ser asociado con ninguno de los compuestos conocidos.
Presumiblemente, se trata en este caso de un compuesto, que se ha
formado por oxidación del azufre en la parte de
tioéter-lípido del DMDOP. Mediante una extracción
con n-heptano se pudo llevar a cabo por consiguiente
un aislamiento del producto de desdoblamiento enzimático, DMDOP, a
partir del ensayo de enzima. Una cuantificación sencilla y rápida
del metabolito DMDOP puesto en libertad a partir del
AZT-DMDOPE estaba por consiguiente garantizada.
En una primera serie de ensayos se investigó el
desdoblamiento enzimático del AZT-DMDOPE mediante
materiales homogeneizados celulares así como mediante fracciones
citosólicas y membranales de PBL humanos estimulados.
Después de haberse determinado la concentración
de proteína en materiales homogeneizados celulares, y en fracciones
citosólicas y membranales con ayuda del ensayo con ácido
bicinconínico (BCS), se emplearon 0,025 - 0,20 mg de proteína /
tanda. Las tandas de reacción se incubaron a 37ºC durante 2 h, a
continuación se aisló el producto DMDOP por extracción con
n-heptano a partir de las tandas, y se determinó la
actividad específica del LCE (Figura 13).
La actividad desdobladora del
AZT-DMDOPE era en los materiales homogeneizados
celulares y en las fracciones citosólicas, con unos valores de 6,48
\pm 0,38 (n = 6) y de 1,65 \pm 0,40 pmol mg^{-1} min^{-1} (n
= 6), menor en un factor de 1,59 y respectivamente 6,3 que la
actividad específica en las fracciones membranales, con 14,23 \pm
0,70 (n = 6) pmol mg^{-1} min^{-1}. En el caso del aislamiento
de las fracciones membranales se llega manifiestamente a un
enriquecimiento del LCE. Basándose en estos resultados, se
emplearon fracciones membranales en los experimentos realizados a
continuación para la determinación de los parámetros enzimáticos del
LCE.
La fracción membranal, que se había obtenido
mediante la disgregación mecánica de las células y una subsiguiente
ultracentrifugación del material homogeneizado celular, constituye
una mezcla de fragmentos de las membranas plasmática y nuclear así
como de las membranas de los orgánulos celulares.
Una diferenciación de los diferentes fragmentos
membranales fue posible por ultracentrifugación de un material
homogeneizado celular en el gradiente de densidades de Percoll y
por una caracterización realizada a continuación mediante el
marcador de membranas plasmáticas, fosfatasa alcalina.
Para el aislamiento de las membranas plasmáticas,
se disgregaron 2 ml de una suspensión celular de PBL humanos
estimulados, con una densidad celular de 2,5 x 10^{8} células /
ml, por congelación y descongelación repetidas tres veces, y se
fraccionaron por centrifugación en el gradiente de densidades de
Percoll. Del material centrifugado se sacaron 10 fracciones (de 1
ml), se eliminaron los restos del medio de separación, y en las
fracciones individuales se midió a 305 nm la actividad de la
fosfatasa alcalina con fosfato de p-nitrofenilo
como substrato.
La más alta actividad de fosfatasa alcalina se
pudo determinar en la Fracción 8. La absorción de las fracciones
remanentes era esencialmente menor. Esto apunta a un
enriquecimiento de las membranas plasmáticas en la Fracción 8. En
cada fracción se determinó la actividad específica de LCE después
de haber determinado la concentración de proteína. Para esto se
ajustó una concentración de proteína de 0,05 mg / tanda y las
tandas de reacción se incubaron durante 2 h a 37ºC. La más alta
actividad específica del LCE, de 4,40 pmol mg^{-1} min^{-1} se
pudo determinar en este caso en la Fracción 8.
En todas las otras fracciones se midieron unas
menores actividades específicas de 1,10 - 1,90 pmol mg^{-1}
min^{-l} (Figura 4:32). La más alta actividad específica del LCE
se determinó por consiguiente en la fracción, que tiene la más alta
actividad de fosfatasa alcalina. Este hallazgo muestra por
consiguiente la presencia del LCE en la fracción que tiene la
proporción más elevada en cuanto a fragmentos de la membrana
plasmática.
En investigaciones más amplias se tuvo que
determinar la conversión de AZT-DMDOPE en función
de concentraciones crecientes de proteína de las preparaciones
celulares.
En este caso, se utilizaron fracciones
membranales de PBL humanos estimulados y no estimulados así como de
monocitos sanguíneos humanos. La conversión del
AZT-DMDOPE en DMDOP por medio de las fracciones
membranales de PBL humanos estimulados, presentaba un comportamiento
lineal en el caso de emplearse 0,025 - 0,2 mg de proteína / tanda
(Figura 14). La actividad específica del LCE fue de 14,23 \pm 0,7
pmol mg^{-1} min^{-1} (n = 6) (Figura 16). En el caso de la
conversión del AZT-DMDOPE mediante proteínas de la
fracción membranal de PBL humanos no estimulados, se mostró una
dependencia lineal solamente en el intervalo de concentraciones
hasta de 0,05 mg de proteína / tanda. En el caso de unas
concentraciones más altas de proteínas, ya no se presentaba ninguna
linealidad. La actividad específica del LCE, que se calculó a
partir de las conversiones en el intervalo lineal, fue de 1,45 \pm
0,32 pmol mg^{-1} min^{-1} (n = 6).
Para la determinación de la actividad específica
del LCE en monocitos sanguíneos humanos, éstos se aislaron en el
gradiente hipertónico de densidades. Los monocitos tienen, con un
valor de 1,068 g / ml en promedio, una densidad algo menor que los
linfocitos, con 1,070 g / ml. Esta diferencia en la densidad es no
obstante muy pequeña, por lo que no es posible una separación de
estas células sanguíneas en el gradiente isotónico.
En condiciones hipertónicas, los linfocitos
pierden agua con mayor rapidez que los monocitos, dando como
resultado un aumento de su densidad. En un medio hipertónico de
separación, es por consiguiente posible aislar monocitos a partir de
una sangre entera o de un plasma rico en leucocitos. Un aislamiento
de monocitos sanguíneos humanos es posible asimismo en forma de un
"revestimiento anteado". En este caso, las células
mononucleares se separaron en condiciones isotónicas en el gradiente
de densidades y los monocitos se separaron a continuación en
frascos de cultivo de tejidos (de 175 cm^{2}/ 800 ml) mediante
su adherencia.
Con ayuda del análisis por citofluorometría de
flujo pasante, de acuerdo con una determinación del tamaño y de la
granularidad así como de acuerdo con una tinción específica de
anticuerpos, se pudo comprobar una estimulación de estas células
por adherencia. A causa de esta estimulación, los monocitos, que se
habían aislado por adherencia al fondo de los frascos de cultivo
de tejidos, se designaron a continuación como monocitos /
macrófagos (monocitos estimulados).
En el caso de conversiones enzimáticas del
AZT-DMDOPE por medio de la fracción membranal de
monocitos humanos, que en el transcurso de su aislamiento se habían
estimulado por adherencia, se pudo comprobar una dependencia lineal
hasta llegar a una concentración de 0,1 mg de proteína / tanda
(Figura 15). La actividad específica fue de 8,8 \pm 0,26 pmol
mg^{-1} min^{-1} (n = 4) (Figura 16). Sí los monocitos habían
sido aislados directamente en el gradiente hipertónico de
densidades, entonces al realizar el desdoblamiento enzimático se
muestra un comportamiento lineal solamente hasta llegar a una
concentración de proteína de 0,025 mg de proteína / tanda. En el
caso de concentraciones más altas de proteína, la conversión del
substrato permaneció casi constante. La actividad específica se
calculó de manera análoga a las conversiones con fracciones
membranales de PBL humanos no estimulados a partir del intervalo
lineal, y fue de 3,2 \pm 0,60 pmol mg^{-1} min^{-1} (n =
4).
Resumiendo, se puede establecer que, en el caso
de la conversión del AZT-DMDOPE por enzimas de las
fracciones membranales de PBL y monocitos humanos estimulados, se
observaron unas actividades específicas del LCE más altas que en el
caso de la conversión del AZT-DMDOPE mediante
fracciones membranales de células no estimuladas (Figura 16).
El desdoblamiento enzimático de la sustancia de
ensayo AZT-DMDOPE en función del período de tiempo
de incubación, se llevó a cabo con fracciones membranales de PBL
humanos estimulados como fuente de enzima. Las tandas de reacción se
incubaron a 37ºC durante 0,5, 1, 2, 3 y 6 h, y a continuación se
determinó la cantidad del metabolito DMDOPE. De acuerdo con un
registro gráfico de los resultados de los ensayos se pudo mostrar
que la conversión del AZT-DMDOPE en DMDOP presenta
una linealidad durante todo el período de tiempo de la incubación
de 0,5 - 6 h (Figura 17).
La dependencia del desdoblamiento enzimático del
AZT-DMDOPE por el LCE con respecto de cationes de
metales bivalentes se investigó con fracciones membranales de PBL
humanos estimulados como fuente de enzima.
Los cationes de metales bivalentes se emplearon
en una concentración de 2 mM en el ensayo de LCE. La concentración
de proteína se estableció con un valor de 0,068 mg / tanda.
Paralelamente se trató una tanda con EGTA. El
EGTA es un específico agente formador de complejos para Ca^{2+},
que es esencial para la actividad de la fosfolipasa C. Después de
un período de tiempo de incubación de 2 h a 37ºC, se midió la
conversión de la sustancia madre y se determinó la actividad
específica del LCE (Tabla siguiente).
La más alta actividad específica se calculó en el
caso de utilizarse EGTA y MgCl_{2} con unos valores de 10,41
\pm 1,37 (n = 3) y respectivamente 10,34 \pm 2,08 pmol
mg^{-1} min^{-1} (n = 3).
Dentro de la exactitud de las mediciones, no se
pudo comprobar por lo tanto ninguna inhibición por MgCl_{2}. Si
en el ensayo de enzima de empleó el CaCl_{2}, entonces se pudo
determinar una actividad específica de 6,19 \pm 0,26 pmol
mg^{-1} min^{-1} (n = 3). Esto significa, en comparación con la
tanda realizada con EGTA, una inhibición de la actividad del LCE de
41,0 \pm 0,25% (n = 3). En el caso de ZnCl_{2} no se podía
detectar nada de DMDOP dentro de la exactitud de las mediciones. El
ZnCl_{2} y el MnCl_{2} condujeron a una inhibición total de la
conversión de AZT-DMDOPE en DMDOP y
AZT-MP.
Con el fin de determinar los parámetros aparentes
de Michaelis-Menten para el LCE, se investigó el
desdoblamiento enzimático del AZT-DMDOPE en función
de concentraciones crecientes del substrato.
Para esto, se emplearon fracciones membranales de
PBL humanos estimulados y no estimulados, así como de monocitos y
monocitos / macrófagos (monocitos estimulados) humanos. Las tandas
de reacción contenían una cantidad constante de proteína de 0,068
mg / tanda y se incubaron a 37ºC durante 2 h. A continuación, se
determinó la cantidad del metabolito DMDOP.
Para la determinación de los parámetros
farmacocinéticos de la sustancia de ensayo
AZT-DMDOPE se llevaron a cabo ensayos in vivo
en ratones Balb/c hembras (Charles River Wiga, Sulzfeld;
Bormholtgard, Ry (Dinamarca); Ifa Credo, L'Abresle (Francia)). Los
animales suministrados se investigaron, antes del comienzo de los
ensayos, en cuanto a la existencia de anticuerpos de virus (virus
de hepatitis de ratón, Reo-virus,
Paro-virus). En los ensayos se emplearon solamente
los animales cuyo título de anticuerpos era negativo.
La cría de los animales se efectuó en establos
para animales totalmente climatizados con una temperatura ambiente
de 22 - 24ºC, una humedad relativa del aire de 50 - 70% y un ritmo
de día-noche de 12 horas. Mediante cajas de flujo
laminar se garantizó un intercambio de aire de 15 - 20 veces por
hora en un establo para animales. A los animales se les administró
una dieta normalizada (Ssniff, Soest) y agua ad libitum a través de
un abrevadero de bote-
lla.
lla.
\newpage
Para la conservación criogénica se ajustaron
células en un medio de RPMI 1640 a una densidad celular de 5 x
10^{6} células / ml y se sedimentaron durante 10 min a 1.600 rpm
en la Minifuge T. A continuación, el sedimento celular se recogió en
un volumen igual del medio de conservación criogénica. Después de
una suspensión renovada del sedimento celular, se transfirió en
cada caso 1 ml de la suspensión celular a tubitos de tratamiento
criogénico (con una capacidad de 1,8 ml) y se congelaron a -70ºC
durante 24 h. Para el almacenamiento definitivo, los tubitos de
tratamiento criogénico se transfirieron a un recipiente térmico con
N_{2} líquido.
| Medio de conservación criogénica | 60% (v/v) del medio de RPMI 1640 |
| \hskip1cm 0,05 mM de 2-mercaptometanol | |
| \hskip1cm 100 U / ml de penicilina | |
| \hskip1cm 100 g / ml de estreptomicina | |
| 30% (v/v) de suero de ternero fetal | |
| 10% (v/v) de DMSO |
La cultivación del linaje celular en suspensión
CEM-SS se efectuó en un medio completo I de RPMI
1640. Para esto, se transfirieron 1 x 10^{7} células a un frasco
de cultivo de tejidos (83 cm^{2}/ 260 ml) con 50 ml del medio. A
continuación, el cultivo se incubó durante 3 días a 37ºC y con 5%
de CO_{2}. Para la pasada de las células, las células se sacaron
del frasco de cultivo de tejido con una pipeta estéril y se
sedimentaron a 1.600 rpm durante 10 min en la Minifuge T. Después
de haber vuelto a suspender las células en el medio de cultivo y de
haber determinado el número de las células mediante tinción con
eosina en la cámara de recuento de Neubauer, se emplearon 1 x
10^{7} células para la pasada en 50 ml de medio de reciente
preparación.
La cultivación de células P3X63Ag8.653 se efectuó
en forma de una monocapa en un medio completo I de RPMI 1640. Para
esto 5 x 10^{6} células se transfirieron a un frasco de
cultivación de tejidos (83 cm^{2}/ 260 ml) con 40 ml del medio. El
cultivo celular se incubó durante 5 días a 37ºC y con 5% de
CO_{2} hasta que el fondo del frasco de cultivo de tejidos
estuviera cubierto con una monocapa celular confluyente. Para la
pasada de las células, las células adherentes se desprendieron
mecánicamente desde el fondo del frasco con un rascador de células
y a continuación se sedimentaron por centrifugación durante 10 min
a 1.600 rpm en la Minifuge T. Después de haber suspendido
renovadamente las células en un medio de cultivo, se determinó el
número de células mediante tinción con eosina en la cámara de
recuento de Neubauer y se emplearon 5 x 10^{6} células para la
pasada en 40 ml de medio de reciente preparación.
Para la determinación del número de células en
cultivos en suspensión y de monocapas se ajustó en PBS una
concentración celular de 0,1 - 1 x 10^{6} células / ml y una
porción de esta suspensión celular se mezcló con 20 \mul de
eosina. A continuación, la suspensión celular se mezcló a fondo
cuidadosamente con una pipeta, se incubó durante 2 min a la
temperatura ambiente y se transfirió a una cámara de recuento de
Neubauer.
La determinación del número de células se
efectuó, inmediatamente después del período de tiempo de
incubación, en el microscopio de contraste de fases con inversión,
recontándose las células situadas dentro de los cuatro grandes
cuadrados. Las células vitales no fueron teñidas en este caso, al
contrario que las células no vitales. Las células débilmente
teñidas fueron consideradas como no vitales.
El número de células vitales / ml se estableció a
partir del número de células no teñidas de los cuatro cuadrados
grandes, multiplicado por el factor de cámara 10^{4} y por el
factor de dilución de la suspensión celular en la solución de
eosina.
La medición del número de células en el contador
Coulter Counter se basa en un flujo pasante de las células entre
dos electrodos de platino. Si una célula pasa por el orificio de
los dos electrodos, entonces la resistencia eléctrica de la
corriente que fluye a través de los electrodos se modifica
proporcionalmente al tamaño de la célula. Esto genera un impulso de
tensión eléctrica, que es registrado y por consiguiente permite una
cuantificación de las células.
Para la determinación del número de células se
transfirieron 25 \mul de la suspensión de células a 3 ml de
Iso-Osmol, que es un líquido de vehículo para el
contador Coulter Counter, y se inyectaron en el equipo.
En este modo de efectuar el recuento de células,
se determina el número total de células de la suspensión celular.
No es posible una diferenciación entre células vitales y no
vitales.
Las células adherentes pudieron ser desprendidas
desde el fondo del respectivo recipiente de cultivo por vía
enzimática mediante tratamiento con una mezcla de tripsina y EDTA.
Para esto, el material sobrenadante de cultivo se decantó
cuidadosamente y las células se lavaron dos veces con un medio de
cultivo previamente calentado (a 37ºC). Para el desprendimiento de
las células desde el fondo del recipiente de cultivo, éste se
incubó a la temperatura ambiente durante 5 min con una solución de
tripsina y EDTA (1 x). El volumen de la solución de tripsina y EDTA
se escogió en este caso de tal modo que el fondo del respectivo
recipiente de cultivo estaba cubierto en 2 - 3 mm con la solución
enzimática. Después de haberse terminado el período de tiempo de
incubación, las células se desprendieron desde el fondo por
cuidadoso sacudimiento del frasco, se retiraron del recipiente de
cultivo y se mezclaron con un volumen igual de un medio completo I
de RPMI 1640. A continuación, las células se sedimentaron durante 10
min a 1.600 rpm en la Minifuge T. El material sobrenadante se
desechó, el sedimento celular se volvió a suspender en PBS frío y
se centrifugó de nuevo en las mismas condiciones. Las células
fueron luego vueltas a suspender en el medio de cultivo o en el
tampón, de modo correspondiente a su utilización ulterior.
Para el aislamiento de PBL humanos, el
"revestimiento anteado" de donantes sanos se mezcló y se
diluyó con un medio completo II de RPMI 1640 en la relación en
volumen de 1:2. En tubitos de polipropileno (con una capacidad de 50
ml) se dispusieron previamente 20 ml de un medio frío para la
separación de linfocitos y se cubrieron cuidadosamente con 15 ml
del "revestimiento anteado" diluido. El fraccionamiento se
efectuó por centrifugación a la temperatura ambiente durante 30 min
y a 1.600 rpm (aceleración 4 / freno 4) en la Minifuge T. La banda
bien visible entre la muestra y el medio de separación se recogió
con ayuda de una pipeta Combitip. Para la eliminación del medio de
separación, las fracciones reunidas se sedimentaron a la temperatura
ambiente durante 10 min y a 1.600 rpm. El material sobrenadante se
decantó y las células se lavaron, de un modo correspondiente a su
utilización, tres veces con un medio completo II de RPMI 1640 o con
PBS fría.
Después de haber aislado los PBL humanos mediante
centrifugación en el gradiente isotónico de densidades, era posible
establecer cultivos de linfocitos periféricos. Normalmente, las
células sanguíneas mueren en el cultivo con relativa rapidez. No
obstante, los linfocitos pueden ser mantenidos en cultivo a lo largo
de varias generaciones. Con el fin de conseguir una proliferación
de estas células, éstas se estimularon con el mitógeno
PHA-M, el extracto de lectinas de la judía roja
(Phaseolus vulgaris).
Para la estimulación, las células aisladas se
ajustaron a una densidad celular de 1 x 10^{6} células / ml en
frascos de cultivo de tejidos (175 cm^{2}/ 800 ml) en un medio
completo II de RPMI 1640, y se incubaron durante 72 h a 37ºC y con
5% de CO_{2}. Con el fin de evitar una densidad celular demasiado
grande, después de 24 h la suspensión celular se diluyó con el
medio de cultivación en la relación en volumen de 1:1. Después de
haberse terminado el período de tiempo de estimulación, el mitógeno
PHA-M se eliminó mediante lavado en tres veces con
el medio completo II de RPMI 1640. Para la expansión de las
células, los linfocitos estimulados se ajustaron a una densidad
celular de 5 - 7 x 10^{6} células / ml en un medio completo IV de
RPMI 1640 y se cultivaron durante 24 h.
Sangre venosa recientemente recogida de donantes
sanos se mezcló con una solución estéril al 10% (p/v) de EDTA en la
relación en volumen de 49:1 con el fin de impedir la coagulación.
Con el fin de conseguir un rápido mezclamiento de estos componentes,
se extrajeron del donante pequeños volúmenes de 8 - 9 ml de sangre
en tubitos de poliestireno (con una capacidad de 14 ml). Para la
preparación de un plasma rico en leucocitos, se mezclaron
EDTA-sangre y dextrano 75 en la relación en volumen
10:1. Los dos componentes se mezclaron bien a fondo, y los
eritrocitos se sedimentaron a la temperatura ambiente durante un
período de tiempo de 60 min. A continuación, se retiraron
cuidadosamente con una pipeta el plasma rico en leucocitos y el
material sobrenadante casi transparente, y se utilizaron para el
aislamiento de monocitos.
En una solución hipertónica era posible aislar
monocitos no estimulados a partir de la sangre entera o de un
plasma rico en leucocitos. Para esto, en tubitos de poliestireno
(14 ml) se dispusieron previamente 3 ml del medio hipertónico de
separación NycoPrep 1.068 y se cubrieron cuidadosamente con 6 ml de
un plasma rico en leucocitos. Los tubitos se cerraron y se
centrifugaron en la Minifuge T a la temperatura ambiente durante 15
min y a 600 x g (aceleración 4 / freno 4). Después de la
centrifugación, la fase plasmática transparente se retiró hasta 5
mm por encima de la ancha banda difusa y se desechó. La fase
plasmática remanente y la mitad de la ancha banda difusa se
retiraron y las células se sedimentaron en las mismas condiciones
por centrifugación en la Minifuge T durante 7 min. El sedimento
celular se volvió a suspender a continuación dos veces en 6 ml de
una solución de lavado, con el fin de eliminar los restos del medio
de separación, y se lavó.
| Nycoprep 1.068 | 13% (p/v) | Nycodenz |
| 0,58% (p/v) | NaCl | |
| 5 (mM) | Tricine/NaOH pH 7,4 | |
| Densidad | 1.068 \pm 0,001 g / ml (a 20ºC) | |
| Osmolaridad | 335 \pm 5 mOsm | |
| Solución de lavado | 0,9% (p/v) | NaCl |
| 0,13% (p/v) | EDTA | |
| 1% (p/v) | BSA (Fracción V) |
A partir del "revestimiento anteado" se
aislaron células mononucleares por centrifugación en el gradiente
isotónico de densidades, y se lavaron tres veces con un medio de
RPMI 1640 exento de suero. Para el aislamiento de los monocitos, las
células se ajustaron a una densidad celular de 5 x 10^{6} células
/ ml en frascos de cultivo de tejidos (175 cm^{2}/ 800 ml) con 20
ml de un medio completo II de RPMI 1640, y se incubaron durante 45
min a 37ºC y con 5% de CO_{2}. Las células no adherentes se
eliminaron mediante decantación del medio, después de la
terminación de la incubación. La capa celular situada junto al
fondo del frasco de cultivo de tejidos se lavó a continuación dos
veces con un medio de RPMI 1640 atemperado (a 37ºC) exento de
suero, con el fin de eliminar restos de células en suspensión. La
capa celular se mezcló con 30 ml de un medio completo V de RPMI
1640 y se incubó en las mismas condiciones durante 24 h adicionales.
El desprendimiento de los monocitos adherentes se efectuó mediante
un tratamiento con una mezcla de tripsina y EDTA.
Para el análisis por citofluorometría de flujo
pasante, las células que se habían de caracterizar se ajustaron en
FACS-PBS a una densidad celular de 1 x 10^{7}
células / ml. Las soluciones originales de anticuerpos se diluyeron
con FACS-PBS en la relación en volumen de 1:50.
Para la tinción directa y secuencial de anticuerpos, se dispusieron
previamente 50 \mul de la suspensión celular (1 x 10^{7} células
/ ml) en las cavidades de una placa de microtitulación con
fondo
cónico.
cónico.
A continuación, la suspensión celular se mezcló
con un volumen igual del anticuerpo, que en el caso de una tinción
directa de anticuerpos está acoplado con un colorante fluorescente.
Las tandas se incubaron durante 30 min a 4ºC y a continuación se
centrifugaron en la Minifuge T a 1.400 rpm y a la temperatura
ambiente durante 2 min, para efectuar la sedimentación de las
células.
Los materiales sobrenadantes se eliminaron, y el
sedimento celular se volvió a suspender en 200 \mul de
FACS-PBS con el fin de eliminar los restos del
anticuerpo no fijado, y se centrifugó de nuevo, tal como se ha
descrito. El material sobrenadante se eliminó y el sedimento
celular se volvió a suspender en 100 \mul de
FACS-PBS en el caso de una tinción directa de
anticuerpos.
En el caso de una tinción secuencial de
anticuerpos, después de haberse terminado la centrifugación, el
sedimento celular se recogió en 100 \mul de una solución del
anticuerpo Ig-R-PE de rata
anti-ratón (3 \mug / ml) marcado con ficoeritrina
y se incubó a 4ºC durante 30 min. Los restos del anticuerpo no
fijado se eliminaron, tal como se ha descrito, por lavado con 200
\mul de FACS-PBS y el sedimento celular se volvió
a suspender en 100 \mul de FACS-PBS para el
análisis por citofluorometría de flujo pasante de las células.
La determinación del número de células vitales y
no vitales mediante análisis por citofluorometría de flujo pasante,
es posible después de una tinción de las células con el colorante
fluorescente yoduro de propidio. Este colorante es recogido
solamente por células no vitales. Para esto, la suspensión celular
se ajustó en PBS a una concentración de 0,5 - 1 x 10^{6} células
/ ml. A partir de esta suspensión celular se retiraron 180 \mul
y se mezclaron con 20 \mul de una solución de yoduro de propidio
(5 \mug / ml). Después de un período de tiempo de incubación de 5
min, se inyectaron 100 \mul de la solución en el aparato
analizador de células. Mediante un análisis estadístico en el
programa de lisis II del analizador de células, se pudo determinar
la distribución porcentual de las células vitales y no vitales.
Para la determinación cuantitativa de la AZT, se
utilizó un estuche comercial de ensayo
^{125}I-AZT RIA. El tampón y las soluciones se
formularon de acuerdo con los datos del fabricante y se emplearon
en el estuche de ensayo. Las tandas de reacción se añadieron con
pipeta de acuerdo con el esquema reseñado más adelante (en la
Tabla), se mezclaron cuidadosamente y se incubaron a la temperatura
ambiente durante 2 h. A continuación, para la precipitación del
complejo de ^{125}I-AZT y del anticuerpo de AZT
(procedente de conejos) se añadieron a esto 500 \mul del
anticuerpo de cabra anti-conejo. Las tandas se
mezclaron y se incubaron nuevamente a la temperatura ambiente
durante 30 min.
Para la sedimentación del complejo de
precipitación, las tandas se centrifugaron a continuación a 1.000 x
g durante 20 min. Después de haber decantado el material
sobrenadante, se midió la radiactividad del sedimento durante 60 s
en el aparato analizador por escintilación en líquido. Para la
determinación del valor absoluto, se determinó en iguales
condiciones la radiactividad de 100 \mul de
^{125}I-AZT después una incubación durante 2 h a
la temperatura ambiente. Las concentraciones de AZT en la matriz
biológica se determinaron con ayuda de una curva de calibración,
que se había establecido con patrones con concentraciones definidas
de sustancias del estuche de ensayo.
Los resultados de los estudios farmacocinéticos
in vitro con AZT-DMDOPE o bien AZT en PBL
humanos estimulados y no estimulados así como células P3X63Ag8.653
deficientes en timidina cinasa, apuntan a un desdoblamiento
enzimático intracelular del AZT-DMDOPE mediando
liberación directa de AZT-MP y de la correspondiente
parte de tioéter-lípido DMDOP. Este desdoblamiento
enzimático intracelular debería ser demostrado en experimentos
ulteriores en el plano subcelular mediante una detección directa de
los correspondientes metabolitos. Para una caracterización
inequívoca del desdoblamiento, era necesaria por consiguiente la
identificación de los metabolitos hasta ahora conocidos, que pueden
resultar a partir de la sustancia madre AZT-DMDOPE.
A éstos pertenecen las sustancias DMDOP, AZT y
AZT-MP así como las sustancias que resultan por
oxidación del azufre en la parte de tioéter-lípido a
partir de la sustancia madre AZT-DMDOPE.
La identificación de los metabolitos potenciales
de AZT-DMDOPE era posible con ayuda de la DC. Para
esto, las sustancias puras no marcadas radiactivamente se
analizaron con ayuda de diferentes sistemas de separación y a
continuación se llevó a cabo una determinación de los valores de
R_{f}.
Para esto, las sustancias se disolvieron en una
mezcla del éster etílico de ácido acético y metanol (1:1, v/v) con
una concentración de 4 mg / ml. Con ayuda de un microcapilar se
aplicaron 5 \mul de estas soluciones sobre la fase estacionaria y
se analizaron.
Los tioéter-lípidos tales como
AZT-DMDOPE, DMDOP, así como los que resultan por
oxidación del azufre, se pudieron marcar con ayuda de un reactivo
que contenía yodo, el cual tiñe a la parte de
tioéter-lípido de estos compuestos. La AZT y el
AZT-MP se pudieron hacer visibles, por causa de su
absorción en la región ultravioleta a 254 nm, exclusivamente sobre
placas para DC con un indicador de la fluorescencia. El
AZT-DMDOPE, la sustancia con la parte de
tioéter-lípido y con un grupo cromóforo, eran
accesibles a ambos modos de realizar la
detección.
detección.
Para el análisis por cromatografía en capa fina
de las sustancias, se establecieron tres sistemas de separación,
que se diferencian en lo que se refiere a sus fases estacionarias y
móviles.
En el primer sistema de separación, el sistema
IBA, con Kieselgel 60 como fase estacionaria, se pudo identificar
la sustancia madre AZT-DMDOPE junto al DMDOP. Como
fase móvil se empleó una mezcla de 2-propanol,
acetato de n-butilo y agua bidestilada (10:6:4,
v/v/v).
Un perfeccionamiento ulterior de este sistema de
separación se consiguió mediante la utilización de una mezcla de
2-propanol, acetato de n-butilo,
agua bidestilada y ácido acético glacial (3:5:1:1, v/v/v/v) como
fase móvil (sistema IBAE). Las sustancias
AZT-DMDOPE y DMDOP pudieron ser separadas en este
caso sobre placas para DC de Kieselgel 60, tal como se describe en
el sistema de separación IBA. Adicionalmente, la AZT y el
AZT-MP se pudieron separar en luz UV (ultravioleta)
a 254 nm y con utilización de una fase estacionaria a partir de
Kieselgel 60 con un indicador de la fluorescencia. A causa de la
parte de AZT, era posible asimismo una detección de la sustancia
madre AZT-DMDOPE así como de sus productos de
oxidación.
Después de una visualización de las sustancias
sobre la paca de DC, se determinaron los valores de R_{f}.
Con el fin de diferenciar la sustancia
AZT-DMDOPE con respecto del DMDOP, estaba a
disposición otro sistema de separación adicional. En este caso, se
utilizaron como fase móvil una mezcla de n-heptano y
éster etílico de ácido acético (4:1, v/v) y como fase estacionaria
Kieselgel 60. La detección se llevó a cabo con el reactivo que
contenía yodo, ya descrito, por tinción de la parte de
tioéter-lípido de las sustancias.
En comparación con los sistemas IBA e IBAE, para
la sustancia DMDOPE se pudo determinar con este sistema de
separación un valor de R_{f} manifiestamente más bajo. La razón
de esto es una fase móvil, menos polar en comparación con los
sistemas IBA e IBAE, que consta de n-heptano y
éster etílico de ácido acético. El límite de detección de las
sustancias, después de un análisis por cromatografía en capa fina y
de una detección con un reactivo que contenía yodo, se determinó
con un valor de 0,1 \mug / ml en todos los sistemas de
separación.
Resumiendo, se puede retener que con ayuda de los
sistemas de separación para cromatografía en capa fina que se han
descrito, se pueden caracterizar inequívocamente, a través de sus
valores de R_{f}, todas las sustancias que de acuerdo con el
actual estado de los conocimientos entran en cuestión como
metabolitos potenciales de AZT-DMDOPE.
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
El desdoblamiento de AZT-DMDOPE
se investigó con ayuda de un ensayo enzimático con
[^{14}C]-AZT-DMDOPE y
AZT-DMDOPE como substratos.
Como fuente de enzima se utilizaron en primer
lugar materiales homogeneizados celulares de células
CEM-SS y de PBL humanos.
Las últimos se homogeneizaron tanto después de
una estimulación con PHA-M como también en el
estado no estimulado directamente después de su aislamiento, y se
emplearon en el ensayo de enzimas.
Para la preparación del material homogeneizado
celular se disgregaron mecánicamente en un aparato homogeneizador de
vidrio suspensiones celulares con una densidad de 5 x 10^{7}
células / ml de Tris 50 mM (pH 7,4). La disgregación de las células
se controló ópticamente en este caso en un microscopio de contraste
de fases con
inversión.
inversión.
Primeramente, 1 ml de este material homogeneizado
celular se empleó en el ensayo enzimático, sin previa determinación
de la concentración de proteína. Como substrato se emplearon 0,98
nmol de [^{14}C]-AZT-DMDOPE (1,67
kBq).
Con el fin de garantizar una saturación del
substrato, se añadieron a esto 50 nmol adicionales del compuesto no
marcado radiactivamente. El
[^{14}C]-AZT-DMDOPE lleva la
marcación radiactiva en la parte de tioéter-lípido y
permite por consiguiente una inequívoca identificación del
metabolito potencial
[^{14}C]-AZT-DMDOPE.
Las tandas se incubaron a 37ºC durante 1, 3, 6 y
24 h en un baño de agua. Como comparación, se trató al mismo tiempo
una tanda sin adición de un material homogeneizado celular. A
continuación, los productos de desdoblamiento se extrajeron con una
mezcla de dietil-éter y 2-propanol (9:1, v/v) y se
analizaron por cromatografía en capa fina en los sistemas IBA e
IBAE (Figura 18). Después de una separación de las sustancias, con
el fin de realizar la detección de las sustancias marcadas
radiactivamente, se midió la placa para DC durante 15 min en el
aparato analizador por DC y radiología. Una identificación
inequívoca de los metabolitos era posible finalmente mediante
determinación de los valores de R_{f}.
\vskip1.000000\baselineskip
El análisis por cromatografía en capa fina de los
productos de desdoblamiento enzimático de
AZT-DMDOPE mediante materiales homogeneizados
celulares de PBL humanos estimulados y no estimulados, se llevó a
cabo mediante utilización del sistema de separación IBA. En los
experimentos realizados a continuación con un material homogeneizado
celular de CEM-SS se llevó a cabo el análisis de los
productos de desdoblamiento en el sistema de separación IBAE. Puesto
que de ambos sistemas de separación se determinaron los valores de
R_{f} de las sustancias puras, era posible una comparación
directa de los resultados con el fin de identificar las sustancias
después de un desdoblamiento enzimático de
AZT-DMDOPE.
Después de un desdoblamiento enzimático de
[^{14}C]-AZT-DMDOPE mediante
materiales homogeneizados celulares de PBL humanos estimulados o
bien no estimulados, se detectaron tres sustancias desconocidas en
el cromatograma de DC. Con unos valores de R_{f} de 0,65 \pm
9,5 x 10^{-2} (n = 4) y 0,65 \pm 1,7 x 10^{-2} (n = 4) para
PBL humanos estimulados y no estimulados, el pico de sustancia 2 se
pudo asociar inequívocamente a la sustancia madre
[^{14}C]-AZT-DMDOPE. Los valores
de R_{f} del pico de sustancia 4 con 0,94 \pm 0,00 (n = 4) y
0,92 \pm 1,2 x 10^{-2} (n = 4) eran idénticos a los valores de
DMDOPE que se determinaron mediante un análisis por DC de las
sustancias puras. El pico de sustancia 3, con un valor de R_{f}
de 0,86 \pm 5,8 x 10^{-3} (n = 4) no pudo ser asociado con
ninguna de las sustancias conocidas. Los resultados se confirmaron
mediante un análisis del desdoblamiento enzimático de
[^{14}C]-AZT-DMDOPE mediante
materiales homogeneizados de células CEM-SS. Los
picos de sustancias 2 y 4 con unos valores de R_{f} de 0,56 \pm
2,5 x 10^{-2} (n = 4) y 0,96 \pm 0,00 (n = 4) se pudieron
identificar inequívocamente como de AZT-DMDOPE o
bien de DMDOP, mientras que el pico de sustancia 1 con un valor de
R_{f} de 0,41 \pm 2,5 x 10^{-2} (n = 4) pudo ser asociado con
un producto de oxidación. Para el pico de sustancia 3 tampoco se
pudo realizar ninguna asociación en el sistema IBAE después de una
comparación de los valores de R_{f} (Figura 18). Además, se pudo
mostrar que, después de una incubación de
[^{14}C]-AZT-DMDOPE sin adición de
un material homogeneizado celular, se podía detectar solamente la
sustancia madre (Figura 18).
A partir del análisis por cromatografía en capa
fina de las tandas de reacción se pudo realizar por consiguiente la
demostración de que la sustancia DMDOP se pone en libertad a partir
de la sustancia madre.
34,8 g (0,07 mol) del éster
(3-dodecilmercapto-2-decil-oxi)-propílico
de ácido fosfórico se disolvieron en 130 ml de piridina absoluta,
se mezclaron bajo nitrógeno con 15 g de cloruro de ácido
metanosulfónico y se agitaron a la temperatura ambiente durante 3
horas. Luego se incorporaron cuidadosamente 20 g de fludarabina y la
solución se agitó a la temperatura ambiente durante 48 horas
adicionales. La fludarabina se preparó de una manera análoga a como
en J. Heterocyclic Chem. 16, 157 (1979).
Después de una hidrólisis de la mezcla de
reacción por adición de 30 ml de una solución
1 M de bicarbonato de
trietil-amonio y de haber agitado durante una hora,
la piridina se eliminó en vacío, el residuo se repartió entre 200
ml de t-butil-metil-éter (MTB) y
150 ml de agua, la fase orgánica se separó y se concentró por
evaporación en un evaporador rotatorio.
El residuo se purificó por cromatografía en
presencia de RP-18 con una mezcla 8/2 de metanol y
un tampón de acetato 0,02 M de pH 4 como eluyente. Las fracciones
que contenían el producto se concentraron por evaporación excepto la
porción de agua, se extrajeron con MTB y la fase de MTB se ajustó a
un pH 7 frente a Friscolyt con una solución de metilato de
sodio.
Después de haber separado el disolvente por
evaporación, el residuo se suspendió en acetona, el precipitado
amorfo se filtró con succión y se secó.
Rendimiento: 23,7 g (43%). Material amorfo,
R_{f} = 0,45 (agente eluyente para DC: mezcla de isopropanol,
acetato de butilo, agua y amoníaco 50/30/15/5).
El conjugado de cladribina se preparó con un
rendimiento de 35% de una manera análoga a la del Ejemplo 14
mediando utilización de 4,2 g del éster
(3-dodecilmercapto-2-decil-oxi)-propílico
de ácido fosfórico, 3 g de ácido metanosulfónico, 100 ml de
piridina y 2 g de cladribina. R_{f} = 0,41 (agente eluyente como
en el Ejemplo 14). La cladribina se preparó de una manera análoga a
como en J. Am. Chem. Soc. 106, 6379 (1984).
El conjugado de pentostatina se preparó con un
rendimiento de 27% de una manera análoga a la del Ejemplo 14
mediando utilización de 4,2 g del éster
(3-dodecilmercapto-2-decil-oxi)-propílico
de ácido fosfórico, 3 g de ácido metanosulfónico, 100 ml de
piridina y 2,1 g de pentostatina. R_{f} = 0,52 (agente eluyente
como en el Ejemplo 14). La pentostatina se preparó de una manera
análoga a como en J. Org. Chem. 47, 3457 (1982) o bien en J. Am.
Chem. Soc. 101, 6127 (1979).
Claims (14)
1. Complejo de la enzima que desdobla lípidos
(LCE) exento de actividad de fosfolipasa C, caracterizado
porque desdobla al conjugado AZT-DMDOPE [(éster
(3-dodecilmercapto-2-decil-oxi)-propílico
de ácido
(3'-desoxi-3'-azido-timidina)-5'-fosfórico]
en AZT-MP
[3'-desoxi-3'-azido-timidina-monofosfato]
y DMDOP
[(3'-dodecilmercapto-2-decil-oxi)propanol],
o desdobla al conjugado FLT-DMDOPE [éster
(3-dodecilmercapto-2-decil-oxi)-propílico
de ácido
(3'-desoxi-3'-fluoro-timidina)-5'-fosfórico]
en AZT-MP
[3'-desoxi-3'-fluoro-timidina)-5'-monofosfato]
y DMDOP, o desdobla al conjugado
5-FU-DMDOPE [éster
(3-dodecilmercapto-2-decil-oxi)
de ácido
5'-fluoro-uridina-5'-fosfórico
en
5-FU-MP
[5-fluoro-uridina monofosfato] y
DMDOP, estando caracterizado el LCE por las siguientes
características
- -
- está situado en membranas y es aislable a partir de leucocitos sanguíneos periféricos humanos,
- -
- tiene un peso molecular de 120.000 - 160.000, determinado de acuerdo con el método de SDS-PAGE,
- -
- es activable mediante la sustancia D609 (xantogenato de triciclodecan-9-ilo)
- -
- es inhibible mediante Ca^{2+}, Zn^{2+} y Mn^{2+}.
2. LCE de acuerdo con la reivindicación 1,
caracterizado porque es obtenible a partir de leucocitos,
monocitos, células tumorales, células renales, linfocitos, células
del sistema inmunológico / linfático, o macrófagos.
3. LCE de acuerdo con una de las reivindicaciones
1 ó 2, realizándose que el LCE, en el caso de conjugados del tipo
L-B-D, en los cuales L significa un
radical similar a lípido, B significa un puente de fosfato o un
puente de tiofosfato y D significa una sustancia farmacológicamente
activa o B-D significa un fosfonato de sustancia
activa, induce un desdoblamiento del enlace covalente situado entre
la parte de lípido L y el radical -B-D.
4. LCE de acuerdo con una de las reivindicaciones
1, 2 ó 3, caracterizado porque la actividad del LCE, en el
caso del desdoblamiento del conjugado en células inmunitarias,
leucocitos humanos, monocitos, células tumorales, linfocitos,
células renales, células del sistema inmunológico y linfático, o
macrófagos, activados(as), es mayor por lo menos en el
factor 2 en comparación con células no activadas.
5. Sistemas subcelulares aislados para la
realización de procedimientos de investigación in vitro,
estando los sistemas subcelulares caracterizados porque
están enriquecidos con el LCE de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1 ó 2.
6. Procedimiento para el hallazgo o la
identificación de compuestos que actúan como substrato o ligando
del LCE de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 ó 2,
caracterizado porque se abarcan las siguientes etapas por
separado o en común,
- a)
- se pone a disposición el LCE,
- b)
- el LCE se incuba con el compuesto,
- c)
- los productos de desdoblamiento se detectan con un sistema apropiado.
7. Procedimiento para el hallazgo o la
identificación de compuestos que actúan como activadores o
inhibidores del LCE de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2,
caracterizado porque se abarcan las siguientes etapas por
separado o en común,
- a)
- se pone a disposición el LCE,
- b)
- el LCE se incuba con la sustancia,
- c)
- se añade un substrato o ligando,
- d)
- se detecta una modificación de la actividad enzimática con un sistema apropiado.
8. Utilización del LCE de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1 ó 2 para el hallazgo o la identificación de
substratos, ligandos, inhibidores o activadores del LCE.
9. Utilización de sistemas subcelulares de
acuerdo con la reivindicación 5 para el hallazgo o la
identificación de substratos, ligandos, inhibidores o activadores
del LCE.
10. Agente de diagnóstico que contiene un LCE de
acuerdo con una de las reivindicaciones 1, 2, 3 ó 4 para la
realización de procedimientos de determinación de substratos,
ligandos, activadores o inhibidores del LCE que desdobla
lípidos.
11. Agente para el hallazgo de sustancias que
actúan como substratos o ligados del LCE, que contienen una
cantidad suficiente del LCE aislado o enriquecido en preparados
celulares de acuerdo con una de las reivindicaciones 1, 2, 3 ó 4,
así como apropiados agentes de estabilización.
12. Utilización de un conjugado covalente de un
derivado de lípido y una sustancia farmacológicamente activa de la
fórmula L-B-D para la preparación de
un medicamento destinado a la liberación deliberada del radical
-B-D en apropiadas células dianas, seleccionado
entre el conjunto formado por las siguientes sustancias:
- éster (3-dodecilmercapto-2-decil-oxipropílico) de ácido 2-fluoro-9-(b-D-arabinofuranosil)-adenina-5'-fosfórico,
- éster (3-dodecilmercapto-2-decil-oxipropílico) de ácido 2-cloro-2-desoxi-adenosina-5'-fosfórico,
- éster (3-dodecilmercapto-2-decil-oxipropílico) de ácido 3-(2-desoxi-b-D-eritro-pentofuranosil)-3,6,7,8-tetrahidro-imidazo-[4,5-d][1,3]- diazepin-8-ol-5'-fosfórico.
13. Conjugados de lípidos de la fórmula I del
tipo L-B-D, seleccionados entre el
conjunto de las siguientes sustancias:
- éster (3-dodecilmercapto-2-decil-oxipropílico) de ácido 2-fluoro-9-(b-D-arabinofuranosil)-adenina-5'-fosfórico,
- éster (3-dodecilmercapto-2-decil-oxipropílico) de ácido 2-cloro-2-desoxi-adenosina-5'-fosfórico,
- éster (3-dodecilmercapto-2-decil-oxipropílico) de ácido 3-(2-desoxi-b-D-eritro-pentofuranosil)-3,6,7,8-tetrahidro-imidazo-[4,5-d][1,3]- diazepin-8-ol-5'-fosfórico.
14. Medicamentos que contienen un conjugado de
lípido del tipo L-B-D seleccionado
entre el conjunto formado por las siguientes sustancias:
- éster (3-dodecilmercapto-2-decil-oxipropílico) de ácido 2-fluoro-9-(b-D-arabinofuranosil)-adenina-5'-fosfórico,
- éster (3-dodecilmercapto-2-decil-oxipropílico) de ácido 2-cloro-2-desoxi-adenosina-5'-fosfórico,
- éster (3-dodecilmercapto-2-decil-oxipropílico) de ácido 3-(2-desoxi-b-D-eritro-pentofuranosil)-3,6,7,8-tetrahidro-imidazo-[4,5-d][1,3]-diazepin-8-ol-5'-fosfórico.
como sustancia activa, así como
otras sustancias coadyuvantes o de vehículo
farmacéuticas.
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