HUT76322A

HUT76322A - Flavin derivatives as anti-viral agents

Info

Publication number: HUT76322A
Application number: HU9601006A
Authority: HU
Inventors: Odur Ayuko Washington
Original assignee: Radopath Ltd
Priority date: 1993-10-19
Filing date: 1994-10-19
Publication date: 1997-08-28
Also published as: CN1140992A; MD960168A; HU9601006D0; NO961547D0; EE9600057A; PE5596A1; GB9421099D0; IL111338A0; EP0739208A1; AP620A; SK50696A3; CA2174552A1; CO4520283A1; BR9407862A; GB9321558D0; ZA948191B; CZ113796A3; BG100599A; JO1866B1; HRP940688A2

Description

A jelen találmány tárgyát antivirális ágensek, valamint ezek alkalmazása képezi humán és állat betegek kezelésében, a virális fertőzés, főleg HÍV által okozott káros hatások enyhítésében vagy kezelésében. A találmány szerinti vegyületek részletes vizsgálatát végeztük el, hogy értékeljük hatékonyságukat számos különböző HIV-1 törzstől származó fertőzés esetében. A vegyületeknek hasonló az aktivitásuk mind akutan, mind krónikusan fertőzött sejtekben. Ez egy kettős tulajdonság, amely csak ritkán található meg más vegyületekben, amelyeket jelenleg a HÍV fertőzés terápiájában használnak, jóllehet a sejtek de nova (akut) fertőzéseit olyan vegyületekkel lehet kezelni, amelyek a HÍV replikációs ciklusának elején hatnak, ezzel blokkolják a vDNS integrációját a gazdaszervezet kromoszómájába. Ez az integráció, amely jelzi, hogy a fertőzés a krónikus állapotba lépett. Azok a vegyületek, amelyek a HÍV poszt-integrációjában hatnak, ennélfogva a krónikusan fertőzött sejtek inhibitorai. A Zidovudin (AZT) például csak a HÍV de nova fertőzésénél aktív, és nincs jelentős hatása krónikusan fertőzött sejtekkel szemben. A HÍV (amely egy pozitív szálú vírus) génexpressziójának inhibitorai ennélfogva aktívak a Hívvel krónikusan fertőzött sejtekben.

A HÍV egy pozitív szálú RNS vírus, amely érinti az embereket. A vírus a sejtmembránokhoz virion adszorpcióval tapad a CD4 sejtfelszíni receptorokhoz. A • · virion azután penetratíven áthatol a sejtmembránon és belép a sejt citoplazmájába. A vírusburkolat lebomlása azután a citoplazmában játszódik le, aholis a virális burok és a genom fehérjeburka az RNS-t a citoplazmába bocsátja ki. A reverz transzkripció azután egy kétszálú DNS átiratot állít elő a gazdasejt genetikai anyagáról. Ez behatol a gazdasejt sejtmagjába és integrálódik a gazdasejt kromoszómális DNS-ébe. Az ezt követő transzkripció során egy vRNS másolat készül, amely a citoplazmában transzlálódik, ezáltal új virális fehérjék képződnek. Az utóbbiak azután a vRNS-sel egymáshoz illeszkednek a belső sejtfelszínen, így új vírusrészecskék keletkeznek, amelyek kiszabadulnak a gazdasejtből.

A HÍV normális körülmények között egy kezdeti tünetmentes fázissal indul. Ez a kezdeti tünetmentes fázis sok évig tarthat, mielőtt a HÍV betegség jelei feltűnnek.

A sejtpusztulás okairól számos elmélet született.

Ezek közül az egyik az apoptózis. Ez a programmozott sejthalál morfológiailag megkülönböztethető formája, amely számos fiziológiai és patológiai folyamatban játszik szerepet, beleértve a sejtes folyamatokat, amelyek a megfelelő intracelluláris oxidáns-antioxidáns folyamatokat akarják fenntartani. A sejtpusztulás a Tsejtekben szorosan kapcsolódik ehhez a kiegyensúlyozó folyamathoz. A HIV-vel való fertőzésről azt gondolják, hogy fokozatosan megzavarja az egyensúlyt, a sejtpusztulás irányába eltolva azt. Egy másik kritikai faktor annak • · · · • · · · · « • · · · · • · · · · a · • · · · · « ·· ·· * meghatározásában, hogy a sejtek normális módon nőnek és osztódnak-e, az intracelluláris ATP koncentráció. Az ATP alacsony intracelluláris koncentrációja az iszkémiás pusztuláshoz kapcsolódik. A T-limfociták különösen érzékenyek az intracelluláris ATP szint lecsökkenésére. A HÍV fertőzés megzavarhatja a celluláris oxidativ foszforilezést, amely a sejtekben az ATP szintért felelős sejtfolyamat. A bármilyen ok által kiváltott sejtpusztulás végül a sejtek olyan hiányához vezet, amely AIDS-t okoz .

A vírusellenes kutatás területén jelenleg folytatott kutatómunka legnagyobb része specifikus, vírus által kódolt enzimek megcélzására irányul. Az ennek a kutatásnak a során felfedezett vegyületeknek elvileg alacsony toxicitással kell rendelkezniük a celluláris folyamatokra. A HÍV fertőzés kezelésének klinikai vizsgálatai során a vegyületek hosszú ideig való alkalmazása nem adta a kezdetben várt előnyöket, ezért új megközelítésekre van szükség.

A riboflavin egy ismert vegyület, amely a következő neveken is ismert nég:

E101;

laktoflavin;

riboflavin;

riboflavinum;

B₂ vitamin;

G vitamin;

• · · · ♦*·.·· ·· ♦ · · Β » • · · · • · · · • · · · ·» « _β »

7,8-dimetil-10-(1' -D-ribitil)-izoalloxazin; és

3,10-dihidro-8,8-dimetil-10-(D-ribo-2,3,4,5tetrahidroxipentil-benzopteridin-2,4,-dión.

A riboflavin kereskedelmi forgalomban van riboflavin formájában, de beszerezhető nátrium-foszfát vagy tetrabutirát sója formájában is, tipikus esetben az előző esetben dihidrát só formájában. Beszerezhető egyéb vitaminokkal képzett különböző keverékek formájában is, amelyek mind, többek között a B vitamin hiányának kezelésére szolgálnak. Az ilyen keverékekben a riboflavin dózisa 0,5 és 10 mg között változik, a naponta maximálisan javasolt dózis 30 mg.

A riboflavin használatával kapcsolatban nem írtak le káros hatásokat. A riboflavin nagy dózisai azonban a vizelet fényes sárga elszíneződését okozzák, amelyek megzavarhatnak egyes laboratóriumi vizsgálatokat.

Az emberek riboflavin szükséglete gyakran az energiabevitelhez kötődik, de úgy tűnik, hogy sokkal szorosabban kapcsolódik a nyugalmi metabolikus szükségletekhez. Naponta körülbelül 1,3-1,8 mg riboflavin bevétele ajánlott, azaz azt mondhatjuk, hogy a riboflavin javasolt alap beviteli értéke 550 pg per 4200 kJ (1000 kcal) táplálék [Report of a Joint FAO/WHO Expert Group, Tech. Rep. Ser. Wld lll^th Org. No. 362 (1967)] .

A riboflavin elfogadott maximális napi bevitele maximum 500 pg per testsúlykilogramm [ Thirteenth Report • · · · of FAO/WHO Expert Committee on Food Additives, Tech. Rep. Ser. WHO. No. 445 (1971)] .

A riboflavin, amely egy vízoldható vitamin, lényeges a táplálékból származó energia felhasználásához. Az aktív, foszforilezett formák, azaz a flavin-mononukleotid a flavin-adenin-mononukleotid és a flavin-adenin-dinukleotid koenzimekként vesznek részt az oxidatív/reduktív metabolikus reakciókban.

Számos egyéb flavin és flavinszármazék ismert, amelyek főleg ízesítő anyagok.

Meglepő módon azt találtuk, hogy a riboflavin, valamint egyéb flavinok és flavinszármazékok beadása, a korábban használtnál vagy javasoltnál jóval magasabb dózisban, nagyon hatékony lehet a vírusfertőzések, különösen a HÍV fertőzés kezelésében és gyógyításában. A vegyület szerkezete azt sugallja, hogy a sejtekben lejátszódó oxidatív foszforilezésben vesz részt. Az lehetséges, hogy a találmány szerinti vegyületek főleg azokat a célpontokat támadják mint a HÍV, és így ellenállnak a fertőzésnek, vagy megakadályozzák a manifesztálódását, beleértve a vírus prokreatív kapacitását.

Ennek megfelelően a jelen találmány tárgyát képezi egy flavinnak, főleg riboflavinnak, vagy annak származékának alkalmazása gyógyszer előállítására, vírusfertőzés kezelése céljából.

Továbbá, mivel idáig bizonyos flavinokról és származékaikról nem ismert, hogy gyógyszerek lennének, • · · · ·· • · · · • · * · · még abban az általános értelemben sem mint a riboflavin (amelyről ismert, hogy egy enzim kofaktor vitamin) , a találmány tárgya szélesebb értelemben ilyen flavinok vagy származékaik előállítása antivirális ágensekként való alkalmazás céljából.

A találmány szerinti alkalmazás szerint a riboflavint vagy egyéb flavint használhatjuk önmagában, vagy származéka formájában, és a flavin származék lehet bármely olyan származék, amely biztonságosan alkalmazható emberekben és állatokban. A riboflavin esetében a riboflavin származék előnyösen egy riboflavin só, és még előnyösebb, ha a riboflavin só riboflavin nátrium-foszfát vagy riboflavin tetrabutirát. A legelőnyösebb, ha a flavin vagy származéka nagyon tiszta, és a hatástalan adalékanyagokat elkerüljük.

Általánosabb értelemben a jelen találmány szerint használt flavin vagy flavinszármazékot a I általános képlet szerinti vegyületként határozhatjuk meg, amelyben

X jelentése a II képletű vegyület (riboflavin)

III képletű vegyület (schizoflavin SFJ

IV képletű vegyület (schizoflavin SF₂)

V képletű vegyület (riboflavin-5' foszfát nátriumsó dihidrát)

VI képletű vegyület (flavin-adenindinukleotid) vagy

CH₃ (lumiflavin)

Emellett a I általános képletű vegyületben X jelentése lehet alkilcsoport vagy hidrogénatom, vagy egy aromás vagy egyéb ciklusos szénhidrogén csoport.

Tehát a jelen találmány szerinti alkalmazást az alábbi flavinokkal és flavinszármazékokkal hajthatjuk végre:

(A) a VII képletű lumikrom;

(Β) A VIII képletű roseoflavin;

(C) B-hidroxiflavin, alloxazinok és egyéb származékaik (IX általános képlet), amelyben

R jelentése ribitil·-, alkilcsoport vagy hidrogénatom;

X jelentése OH-csoport, brómatom, klóratom, SH-csoport, OAlk- vagy SAlk-csoport.

A fentiekre az alábbiakban adunk meg példákat:

X általános képlet,amelyben R jelentése alkilribitilcsoport vagy rib-P (8-hidroxi-FMN) , vagy R= Rib-P-AMP (8-hidroxi-FAD) ;

XI képletű vegyület;

XII képletű vegyület;

XIII képletű vegyület;

XIV általános képletű vegyület, amelyben R jelentése ugyanaz, mint amit az előzőkben meghatároztunk.

(D) 8<x-N (3) -hisztidilflavinok

XV általános képlet, amelyben R jelentése a riboflavin származék ribitil oldallánca.

(Ε) 8αΝ(1)-hisztidilflavinok:

XVI általános képlet, amelyben R jelentése a riboflavin származék ribitil oldallánca.

(F) 8a-ciszteinilflavin-tioéterek (G) 6-S-ciszteinilflavin-tioéterek (H) Lumiflavinok:

XVII általános képlet, amelyben R₁=R₄=H, R₂=R₃=CH3 a lumiflavin esetében.

(I) 5-deazaflavinok:

Ezeket a XVIII általános képlettel lehet leírni, amelyekben a helyettesítő csoportokat az alábbiak szerint lehet meghatározni:

R¹	R²	R³
H	ch₃	H
H	c₂h₅	H
H	n-C₃H₇	H
H	n-C₄H₉	H
ch₃	ch₃	H
ch₃	c₂h₅	H
ch₃	n-C₃H₇	H
ch₃	n-C₄H₉	H
H	ch₃	7,8-(CH₃)
H	D-ribitil	7,8-(CH₃)
H	c₂h₅	7-CH₃
ch₃	c₂h₅	7-CH₃
ch₃	D-ribitil	7,8-(CH₃)

és ezek származékai, azaz:

XIX képlet.

(J) A riboflavin, FMN és FAD 5-karba-5-deaza és 1karba-l-deaza származékai.

Ezekre jellemző példák a riboflavin analógok (XX képlet) , 5-karba-5-deazariboflavin analógok (XXI képlet) és az 1-karba-l-deazariboflavin analógok (XII képlet).

(K) Flavin 1, N⁶-etanoadenin dinukleotid, XXIII képlet.

(L) Schizoflavinok és származékaik:

7,8-dimetil-izoalloxazin riboflavin (II képlet)

7, 8-dimetil-izoalloxazin SF₂ (IV képlet)

7,8-dimetil-izoalloxazin SFx (III képlet).

A fentiek a schizoflavinok kémiai szerkezetét mutatják, valamint riboflavinból való képződésüket. Az SF₂-t és az SFi-et 7,8-dimetil-10-(2,3,4-trihidroxi-4formilbutil)-izoalloxazinként és 7,8-dimetil-10-(2,3,4trihidroxi-4-karboxibutil)-izoalloxazinként lehet meghatározni .

Egyéb flavinokat a következőkben sorolunk fel:

3-karboximetilriboflavin

3-karboximetil-FMN

7- amino-10-(1' -D-ribitil)-izoalloxazin

8- amino-7,10-dimetilizoalloxazin

8a(S-merkaptopropionsav)-riboflavin

8a(S-merkaptopropionsav)-FMN

8a(N-aminohexil)-FMN

9-azobenzoil-FMN • · · · «

10- (ω-karboxialk.il) -7,8-dimetilizoalloxazin .

A találmány szerinti alkalmazás során a flavint, azaz a riboflavint vagy származékát előnyösen magas dózisszinten alkalmazzuk, lényegesen magasabb szinten annál, mint amit jelenleg használnak. Tehát a jelen találmány szerint a klinikai vizsgálatok során a riboflavint vagy egyéb flavint naponta legalább 1-100 mg/testsúlykilogramm vagy még magasabb szinten alkalmazzuk. Emellett, a találmány szerinti alkalmazás során a gyógyszert orálisan beadható formában alkalmazzuk, (lehetőleg kapszula formában kiszerelve).

Egy másik kiviteli mód szerint a találmány tárgya gyógyászati vagy állatgyógyászati készítmény vírusfertőzések kezelésére, egységdózis formájában, amely készítmény egy flavinból, azaz például riboflavinból vagy származékaiból (az ismertetett vagy meghatározott módon) legalább 35 mg-os azaz például 50 mg-os vagy még magasabb (azaz például 50-300 mg, úgymint 50-200 vagy 50-100 mg) egységdózist tartalmaz, egy gyógyászatilag vagy állatgyógyászatilag elfogadható higítószerrel, töltőanyaggal vagy hordozóval együtt.

A találmány szerinti készítmény előnyösen egy 351000 mg-os egységdózist tartalmaz. Még előnyösebb, ha az egységdózis 250-500 mg.

Emellett, a találmány szerinti készítmény előnyösen orális vagy injekciózható formában van. Ebben az

összefüggésben az előnyös készítmény egy steril vízzel készített oldat.

A találmány tárgya továbbá eljárás egy vírusfertőzések kezelésére alkalmas gyógyszer előállítására, amely eljárás során egy flavint, azaz például riboflavint vagy származékát, azaz tetrabutirát sót formulálunk vírusellenes felhasználás céljára.

Amint az nyilvánvaló, az előző meghatározás szerinti eljárást egy vagy több, itt említett további tulajdonság felhasználásával hajthatunk végre.

A találmány tárgya továbbá egy vírusellenes hatóanyagként flavint, azaz például riboflavint vagy származékát tartalmazó termék, egyéb vegyületekkel együtt, amelyeknek vírusellenes aktivitásuk van, kombinált készítmény formájában, vírusellenes terápiában egyszerre, külön vagy egymás utáni alkalmazás céljára.

Ismét megjegyezzük, hogy egy, a fenti meghatározásnak megfelelő termék lehet olyan, amelyre egy vagy több jellemző a találmány itt meghatározott specifikus tulajdonságaiból.

A találmány tárgya továbbá eljárás vírusfertőzés kezelésére, amely eljárás szerint egy flavint, azaz például riboflavint vagy származékát hatásos mennyiségben adunk be orálisan vagy parenterálisan.

Egy, a találmány szerinti eljárásban a beadott mennyiség 1-100 (azaz például legalább 10) mg/testsúlykilogramm.

• · · ·

Továbbá, az eljárás különösen jól használható, ha a \ vírus a humán immundeficiencia vírus, azaz a HÍV.

Még egyszer megismételjük, hogy a találmány szerinti eljárásra egy vagy több is jellemző lehet a találmány itt meghatározott specifikus tulajdonságaiból.

A legelőnyösebb, ha a találmány szerinti eljárást az alábbi vegyületek közül eggyel vagy többel végezzük el, azaz például riboflavin, riboflavin-nátriumfoszfát, flavin-adenin-mononukleotid, lumiflavin, lumikrom, vagy főleg riboflavin-tetrabutirát, amelynek szerkezetét a XXIV képlet írja le.

In vitro vizsgálatok

Az alábbi in vitro vizsgálatokat arra használjuk, hogy vizsgáljuk a találmány szerinti vegyületek HÍV elleni vírusellenes aktivitását.

1. Akut fertőzési vizsgálatok

1.1 Standard akut vizsgálat

A humán immundeficienciencia vírus magas titerű törzstenyészetét (HTLV-111B) H9 sejtekben szaporítjuk, 10% borjúmagzat szérummal kiegészített RPMI 1640 táptalajban mint növesztő táptalajban szaporítva. A sejttörmeléket kis sebességű centrifugálással eltávolítjuk, majd a felülúszót -70 °C-on tároljuk, ameddig szükséges.

Egy tipikus vizsgálatban a C8166 T-limfoblasztoid sejteket 10TCID_5O HIV-l-gyel inkubáljuk 37 °C-on 90 percig, • · · · • · · majd háromszor mossuk foszfáttal puffereit sóoldattal (PBS) . 2xl0⁵ sejtet tartalmazó alikvot részeket szuszpendálunk 1,5 ml szaporító táptalajban 6 ml-es tenyésztő csövekben, majd a vizsgált vegyületeket azonnal hozzáadjuk logaritmusos hígításokban, 0,2-200 gmol/l koncentrációban. A vizsgált vegyületet 70% etanolban oldjuk, az alkohol végkoncentrációja a tenyészetben <1%. A tenyészeteket 72 óra hosszat inkubáljuk 37 °C-on 5% CO₂t tartalmazó atmoszférában. Mindegyik tenyészetből 200 μΙ-es felülúszót veszünk ki, majd a HÍV p24 mag antigén mennyiségét 450 nm-en mért optikai sűrűség mérésével határozzuk meg [ Kinchington és munkatársai (1989); Roberts és munkatársai (1990)], egy kereskedelmi forgalomban levő ELISA alkalmazásával, amely egyformán ismeri fel az összes mag antigént (Coulter Electronics Ltd. Luton, Anglia). Az IC₅₀ értékek meghatározásához standard görbéket veszünk fel a <1% alkoholt tartalmazó kezeletlen tenyészetekből. Belső kontrollként AZT-t és ddC-t használunk. A vizsgálatokat két párhuzamosban végezzük.

1.2 Kimerített táptalaj vizsgálat

A standard vizsgáló rendszerben a sejttenyészeteket összegyűjtjük, elosztjuk, majd friss táptalajjal tápláljuk körülbelül 18-24 óra hosszat, a vizsgálat megkezdése előtt. A friss táptalaj hozzáadása arra serkenti a sejteket, hogy a növekedés logaritmikus fázisába lépjenek. Ahhoz, hogy vizsgáljuk a kimerített • · • · · · táptalaj körülmények között egybefolyó növekedési állapotot elérő sejtek hatását, a sejttenyészeteket tápláljuk és felosztjuk 72, 48 és 24 órával azelőtt, hogy a standard akut vizsgálatban használjuk.

1.3 A fénnyel való érintkezés hatása

A vizsgált vegyület frissen oldott mintáját két alikvot részre osztjuk. Ezeket vagy napfényre tesszük, vagy sötétbe, két óra hosszat, mielőtt a standard akut vizsgálatokat elvégezzük velük.

1.4 Előinkubálási vizsgálatok

A célsejteket előinkubáljuk a vizsgált vegyülettel, logaritmusos hígításban, 200-0,2 pmol/l koncentrációban,

18/24 órával a HIV-l-gyel végzett fertőzés előtt. Mindegyik minta-koncentrációt azután egyenként kezeljük, ugyanúgy, mint a standard akut vizsgálatban.

2. Krónikusan fertőzött sejtek vizsgálata

2.1 Standard krónikus vizsgálat

HIV-Irf-fel (H9rf) krónikusan fertőzött H9 sejteket háromszor mossuk táptalajjal, hogy eltávolítsuk az extracelluláris vírust, majd a vizsgált vegyülettel inkubáljuk (200-0,2 μιηοΐ/ΐ) három napig. A p24 antigént azután 450 nm-en végzett optikai sűrűség mérésével határozzuk meg, amint azt az akut fertőzés standard vizsgálatánál ismertettük. Az IC₅₀ értékek meghatározásásához standard • * görbéket készítünk 1% alkoholt tartalmazó kezeletlen tenyészetekből. Belső kontrollként RO 31-8959-et (Roche Proteináz inhibitor) használunk. A vizsgálatokat két párhuzamosban végezzük.

2.2 Kimerített táptalaj vizsgálat

A standard vizsgálatban a sejttenyészeteket összegyűjtjük, elosztjuk, majd friss táptalajjal tápláljuk, a vizsgálat előtt körülbelül 18-24 órával. A friss táptalaj hozzáadása arra serkenti a sejteket, hogy a növekedés logaritmusos fázisába lépjenek. Ahhoz, hogy vizsgáljuk a kimerített táptalaj körülmények között egybefolyó növekedési állapotot elérő sejtek hatását, a sejttenyészeteket tápláljuk és felosztjuk 72, 48 és 24 órával azelőtt, hogy a standard akut vizsgálatban használjuk.

2.3 A fénnyel való érintkezés hatása

3. Toxicitási vizsgálat

A vegyület toxicitásának vizsgálatához 2xl0⁵fertőzetlen sejtet tenyésztünk a vizsgált vegyületekkel, ugyanabban a logaritmusos hígításban, 72 óra hosszat (1.1 és 2.1). A sejteket azután mossuk a táptalajjal és 200 pl növesztő táptalajban oldjuk, amely ¹⁴C fehérjehidrolizátumot tartalmaz. A sejteket 5-20 óra elteltével gyűjtjük össze, majd mérjük a ¹⁴C beépülését. A kezeletlen sejteket használjuk kontrollként.

A vizsgálatokat az alábbi, 1. táblázatban felsorolt vegyületekre alkalmazzuk:

1. Táblázat

Kód

FI

F2

F3

F4

F5

F6

F7

Vegyület riboflavin5' foszfát riboflavin

Flavin-adenin dinukleotid lumiflavin lumikrom riboflavin tetranikotinát riboflavin tetrabutirát

Az induló vizsgálatokat a 2. táblázatban említett különböző vegyületekkel kapcsolatban végezzük el, az előzetes eredmény elérése céljából. A 2. táblázatban található IC₅₀ értékeket tovább vizsgáljuk; nem felelnek meg a mai napig újra elvégzett vizsgálatok eredményeinek. A vizsgálatok eredményei a grafikonokon láthatók, amelyekből az alábbi ábrák készültek, valamint a 2. és

10. táblázatban, az alábbiak szerint:

1. ábra: Antigén optikai sűrűség formájában az F2,

F4 (első antigén vizsgálat) és F5 vegyületekre 450 nm-en, a koncentráció függvényében ábrázolva. Az OD=0,371-nél levő pontozott vonal az IC₅₀ értéket jelöli (aktív).

2. ábra: Antigén optikai sűrűség formájában az FI, és F5 vegyületekre 450 nm-en, a koncentráció függvényében ábrázolva. Az OD=0,371nél levő pontozott vonal az IC₅₀ értéket jelöli (aktív).

3. ábra: Toxicitás ¹⁴C felvétel alapján (dpm), a koncentráció függvényében ábrázolva az F2, F3, F4 (első toxicitási vizsgálat) és F5 vegyületekre. A 6035 dpm-nél látható pontozott vonal a CC₅₀ értéket jelöli (nemtoxikus) .

4. ábra: Toxicitás ¹⁴C felvétel alapján (dpm), a koncentráció függvényében ábrázolva az FI vegyületre. A 6035 dpm-nél látható pontozott vonal a CC₅₀ értéket jelöli (nemtoxikus) .

5. ábra: Antigén optikai sűrűség (OD) formájában az

F4 vegyületre (második antigén vizsgálat) 450 nm-en, a koncentráció (gmol/l) függvényében ábrázolva. Az OD=0,371-nél levő pontozott vonal az IC₅₀ értéket jelöli (aktív).

6. ábra: Toxicitás ¹⁴C felvétel alapján (dpm), a koncentráció függvényében ábrázolva az F4 vegyületre (második toxicitási vizsgálat). A 6035 dpm-nél látható pontozott vonal a CC₅₀ értéket jelöli (nem-toxikus).

7. ábra: Antigén optikai sűrűség formájában az F6, és F7 vegyületekre 450 nm-en, a koncentráció (pmol/l) függvényében ábrázolva. Az

OD=0,371-nél levő pontozott vonal az IC₅₀értéket jelöli (aktív).

8. ábra: Toxicitás ¹⁴C felvétel alapján (dpm), a koncentráció függvényében ábrázolva az F6 és F7 vegyületekre. A 6035 dpm-nél látható pontozott vonal a CC₅₀ értéket jelöli (nemtoxikus) .

9. ábra: Antigén kontroll (ddC)

Amint az a táblázatokból látható, a vizsgált vegyületek sejtekkel szembeni aktivitását a HIV-vel mind akutan, mind krónikusan fertőzött sejtekre megvizsgáltuk. Az antivirális (IC₅₀) és toxicitási adatokat is bemutatjuk az alábbiakban. Egy másik kísérletsorozatban a vegyületeket sejttenyészetekben vizsgáltuk, amelyekhez friss táptalajt adtunk a fertőzés előtt 72, 48 és 24 órával.

• · · · • ·

Ezt a kísérletet azért hajtottuk végre, hogy megvizsgáljuk a vegyületek hatásait az aktívan osztódó és nyugalmi állapotban levő sejtekre. Ezek az adatok azt mutatják, hogy a sejtek érzékenyebbek lehetnek a vizsgált vegyületekre, amikor nyugalmi állapotban vannak. A fénynek a stabilitásra gyakorolt hatását, az előinkubálásnak a célsejtekre gyakorolt hatását és egy afrikai HIV-1 izolátum elleni aktivitást is vizsgáltuk. A kétórás fénnyel való érintkezésnek nem volt hatása a vegyület aktivitására. A megcélzott sejtekkel való előinkubálás fokozta az aktivitását, és jelentős aktivitást mutatott az afrikai HIV-1 izolátummal szemben.

2. Táblázat (1-4. ábra) - Akut fertőzési standard vizsgálat (1.1)

Vegyület sorszám/	ic₅₀		CC50			Sí
vizsgálat sorszám	(1. és 2.	ábra)	(3. .	ás 4	. ábra)
Fl/1	1-től 20	'-ig	>200			—
Fl/2	<0,4		>400			>1000
Fl/3	0,1 (2.	ábra)	>800	(4.	ábra)	>8000
F2	3 (1.	ábra)	>200	(3.	ábra)	>60
F3	0,8 (2.	ábra)	>200	(3.	ábra)	>200
F4	1 (1.	ábra)	150	(3.	ábra)	150
F5	3 (1.	ábra)	>200	(3.	ábra)	>60

3. Táblázat (7. és 8. ábra) - Akut fertőzési standard vizsgálat (1.1)

Vegyület sorszám/ IC₅₀ CC₅₀ Sí

vizsgálat	sorszám
F7/1		27 (7.	ábra) 130 (8. ábra)	5
F7/2		57	>200	>4
F7/3		10	70	7
F7/4		25	140	6
		4 .	Táblázat
Krónikus fertőzési	standard vizsgálat (2.1)
Vegyület vizsgálat	sorszám/ sorszám	IC₅₀	CC50	Sí
F7/1		0,2	7	35
F7/2		>20	>20	-
F7/3		10	>200	>20
F7/4		4	75	19
F7/5		26	>200	>7
		5 .	Táblázat
Akut	fertőzés	kimerített táptalaj vizsgálat (1	• 2)
Vegyület	72	óra	48 óra 24 óra
sorszám	IC₅₀	cc₅₀	IC50 CC50 IC₅₀	cc₅₀
F7	10	160	21 100 110	160
		6.	Táblázat
Akut	fertőzés	kimerített táptalaj vizsgálat (2	• 2)
Vegyület	72	óra	48 óra 24 óra

sorszám • « ·· ···· • · · · · · ···« ·· ·· «

F7 40 75 90 250 60 101

7. Táblázat

Akut fertőzés fényhatás vizsgálat (1.3)

Vegyület sorsz._Nappali fény_Sötétség í 0-5Ω_CCsn_ÍC50_EDso

F7 60 >200 60 >200

8. Táblázat

Akut fertőzés előinkubálási vizsgálat (1.4) Célsejtek előinkubálása a vizsgált vegyülettel, 24 órával a fertőzés előtt

Vegyület sorszám_IC₅₀_CC ₅₀_Sí

F7 5 120 24

9. Táblázat (5-8. ábra) - Akut fertőzési standard vizsgálat (1.1)

Vegyület sorszám_IC ₅₀_CC₅₀_Sí

F4 13 (5. ábra) 150 (6. ábra) 12

F6 30-60(7.ábra) >200 (8. ábra) min. 3-6

10. Táblázat

Akut fertőzés standard vizsgálat (1.1)

C8166 sejtekre (HTLV-vel transzformált és immortalizált

T-limfoblasztoid sejtek) alkalmazott vizsgálat egy afrikai HÍV izolátummal (HIV-1 CBL4)

Vegyület sorszám IC₅₀_CC₅₀_Sí • · • · · ·

F7 4 150 37,5

11. Táblázat (10-12. ábra) -Akut fertőzés standard vizsgálat (1.1)

Vegyület sorszám_IC₅₀_CC₅₀_Sí

F7 32 200 6,3 ddC (kontroll) 0,2

Az F7 vegyülettel megfigyelt variációk a végpontokban valószínűleg a megcélzott limfoblasztoid sejtek tulajdonságaiból következnek. Még szinkronizált tenyészetekben is lehetnek csekély eltérések a sejtek alpopulációinak metabolikus állapotában. Ez a páros antivirális és toxicitási értékek végpontjaiban vizsgálatról vizsgálatra való eltolódásban tükröződik (3. táblázat). Az 5.

és 6. táblázatban összefoglalt eredmények azt mutatják, hogy az aktív vagy nyugalmi állapotban levő sejttenyészeteknek eltérő lehet a vizsgált vegyületekkel szemben tanúsított érzékenysége.

Betegek kezelése

Harmincöt beteget kezeltünk. Közülük harmincnál volt követő orvosi látogatás.

i) A betegek általános állapota

A követő látogatásra eljött harminc beteg közül húsz közölte, hogy általános állapota javult. Ezeknek a többsége a rossz közérzet, étvágy és súlynövekedés • · ·· ···· szempontjából közöltek javulást. Két beteg a bőrkiütések javulását közölte, a bőr léziók regressziójával, míg az egyik azt közölte, hogy nem voltak új bőrléziók a terápia során. Egy beteg javulást közölt az impotenciájában (ami a terápia megkezdése előtt három hónapig állt fenn), míg két másik beteg hosszantartó nátha megszűnését közölte.

ii) Beteglátogatások

Néhány beteg klinikán volt nem tervezett beteglátogatásra:

1. Egy betegnek megújuló tályogjai voltak, valamint szeptikus artrítisze is, amely még a terápia során is megmaradt.

2. Két betegnek megújuló alsó légúti fertőzései voltak, közülük az egyikben nyílt broncho-pneumonia fejlődött ki a terápia második hetében.

3. Két betegnek láza volt lokalizáló jelzések nélkül, a malária paraziták vizsgálata céljából végzett ismételt vérkeneteknegatívak voltak, nem volt jelentős növekedés a vértenyészetekben. Ezek közül a betegek közül az egyik jól reagált amoxicillinre és most lázmentes.

4. Az egyik betegnek gasztroenterítisze volt a kezelés harmadik hetében.

5. Két betegnek volt orális és vulvo-vaginális kandidiázisa, és a vulvo-vaginális kandidiázis újból előjött, mihelyt egy Nisztatin pesszárium és tabletta kezelés véget ért.

I

6. Két betegnek volt ismétlődő herpesz szimplex genitálisza.

iii) Toxicitás

A legtöbb toxicitási jelenség a kezelés első két hetében jelentkezett, és átmeneti volt.

Két betegnek volt viszketegsége, amely átlagban négy napig tartott a kezelés első hetében, és minden külön kezelés nélkül elmúlt.

Négy betegnek volt közepes hasmenése a kezelés első két hetében. Ez átlagban négy napig tartott. Ezt a tünetet nem lehetett mihez hozzárendelni, nem lehetett tudni, hogy mellékhatás-e vagy a HÍV fertőzés természetes megnyilvánulása. Azonban előfordulásának következetessége a kezelés első két hetében valamint átmeneti természete valószínűvé teszi, hogy mellékhatásról van szó.

Egy beteg közölt álmosságot és egy másik közölte, hogy a vizelete megsötétedett. Az MSU normális volt.

Két betegnek volt hasi problémája.

iv) Laboratóriumi eredmények

Három betegnek ideiglenesen emelkedett a máj enzimszintje a kezelés második-harmadik hetében, anélkül, hogy májbetegségnek klinikai tünetei lennének. Az enzimszintek azonban mindig visszatértek a normális szintre.

A fenti klinikai kísérleti eredmények egy klinikai vizsgálat előzetes eredményei, amely jelenleg is több hétig folyik az orálisan, kapszula formában beadott F7 vegyülettel (a kapszulákat a 4. példában ismertetjük). A dózisok az alábbiak voltak:

1. dózisszint: 1 mg/testsúlykilogramm naponta orálisan kettéosztott dózisban

2. dózisszint: 2 mg/testsúlykilogramm naponta orálisan kettéosztott dózisban

3. dózisszint: 10 mg/testsúlykilogramm naponta orálisan kettéosztott dózisban

4. dózisszint: 15 mg/testsúlykilogramm naponta orálisan kettéosztott dózisban

5. dózisszint: 20 mg/testsúlykilogramm naponta orálisan kettéosztott dózisban

6. dózisszint: 30 mg/testsúlykilogramm naponta orálisan ketté- vagy három részre osztott dózisban

7. dózisszint: 40 mg/testsúlykilogramm naponta orálisan ketté- vagy három részre osztott dózisban

8. dózisszint: 50 mg/testsúlykilogramm naponta orálisan ketté- vagy három részre osztott dózisban

9. dózisszint: 100 mg/testsúlykilogramm naponta orálisan ketté- vagy három részre osztott dózisban.

Az alábbi specifikus példákban a találmány szerint formulázott készítményeket mutatjuk be.

1. Példa

Egy készítményt az alábbiak szerint állíthatunk elő: riboflavin-5-foszfát 10 mg steril víz 2 ml így kapunk egy 10 mg riboflavint tartalmazó egységdózist napi egyszeri beadás céljára, vírusfertőzés esetében.

2. Példa

Egy készítményt az alábbiak szerint állíthatunk elő: riboflavin-5-foszfát 30 mg steril víz 2 ml így kapunk egy 30 mg riboflavint tartalmazó egységdózist napi egyszeri beadás céljára, vírusfertőzés esetében.

3. Példa

Az 1. és 2. példában szereplőhöz hasonló készítményeket az alábbi dózisokkal állíthatunk elő:

	10 25 50	mg mg mg	per per per	ml, ml és ml,
2	vagy	5	ml steril	vízben,	az	alábbi	aktív

adalékanyagokkal:

ribof lavin-5' -foszfát riboflavin flavin-adenin-dinukleotid lumiflavin lumikrom, vagy ezek keveréke.

• · ·· ···· • · · · · · ···· · · ·· ·

4. Példa

A következő

Méret:

kapszulákat formuláztuk:

25	mg
50	mg
100	mg
200	mg
400	mg

Típus :

Összetétel:

Kétrészes kemény zselatin

F7 vegyület mikrokristályos cellulózzal keverve Ph. Eur 166.4/156.7/118.6/108.7/50 mg így kapunk 191.4/206.7/218.6/308.7/450 mg-os kapszulasúlyokat.

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Egy flavin vegyület vagy két vagy több flavin vegyület keverékének alkalmazása egy HÍV fertőzés által okozott betegség megelőzésére vagy gyógyítására alkalmas gyógyszer előállítására, azzal jellemezve, hogy a flavin vegyület ribof lavin-5' -foszfát, flavin-adenin-dinukleotid, lumiflavin, lumikrom, riboflavin-tetranikotinát vagy riboflavin-tetrabutirát.
2. Egy flavin vegyület vagy két vagy több flavin vegyület keverékének alkalmazása vírusfertőzés által okozott betegség megelőzésére vagy gyógyítására alkalmas gyógyszer előállítására.
3. A 2. igénypont szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy a riboflavin származék egy riboflavin só.
4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy a riboflavin só riboflavinnátrium-foszfát vagy riboflavin-tetrabutirát.
5. A 2. igénypont szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy a flavin vagy flavin származék egy az alábbi általános képletű vegyületek közül:

XXV általános képlet, amelyben R jelentése hidrogénatom vagy alkilcsoport, R_x és R₄ jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom, alkilcsoport, hidroxicsoport, halogénatom, alkoxicsoport, alkiltio-csoport, kénatom • * • # ·» vagy egy opcionálisan helyettesített aromás vagy nemaromás nitrogén heterociklus, X jelentése pedig:

i) hidrogénatom, ribitil-, alkil-csoport vagy egy aromás vagy nem-aromás karbociklus;

ii) -CH₂- (CHOH)_n-Y általános képletű csoport, amelyben n jelentése egész szám (3 vagy 4), Y jelentése CH₂OH-COOH vagy -COH, vagy a XXVI képletű csoport;

amelyben R jelentése hidrogénatom vagy alkilcsoport és amelyben W_x és W₂ jelentése egymástól függetlenül alkilcsoport, hidroxicsoport, halogénatom, alkoxi-, alkiltio-, tiocsoport, vagy opcionálisan helyettesített aromás vagy nem-aromás nitrogén heterociklus;

XVII általános képletű vegyület, amelyben X jelentése (i) hidrogénatom, ribitilcsoport, alkilcsoport, hidrogénatom, aromás vagy nem-aromás karbociklus;

(ii) -CH₂-(CHOH)_n-Y általános képletű csoport, amelyben n jelentése egész szám (3 vagy 4), Y jelentése -CH₂OH-COOH vagy -COH, vagy a XXVI képletű csoport;

amelyben R jelentése hidrogénatom vagy alkilcsoport és amelyben W-l és W₂ jelentése egymástól függetlenül alkilcsoport, hidroxicsoport, halogénatom, alkoxi-, alkiltio-, tiocsoport, vagy opcionálisan helyettesített aromás vagy nem-aromás nitrogén heterociklus;

XVIII általános képletű vegyület, amelyben R_xjelentése hidrogénatom vagy alkilcsoport, R₂ jelentése • · • · • · · * • · • · «f • * alkilcsoport vagy ribitilcsoport, R₃ jelentése hidrogénatom vagy a külső karbociklusos gyűrű alkilcsoporttal való egyszeres vagy kétszeres helyettesítése.
6. A 2. igénypont szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy a flavin vagy flavinszármazék lumikrom, roseflavin, egy hidroxiflavin, egy alloxazin vagy származéka, egy 8a-N(3)-hisztidilflavin; egy 8a-N(I)hisztidilflavin; egy 8a-ciszteinil-tioéter; egy 6a-Sciszteinil-tioéter; lumiflavin; 5-deazaflavin; a riboflavin 5-karba-5-deaza- vagy 1-karba-l-deaza analógja, FMN vagy FAD; flavin-1,N⁶-etanoadenin-dinukleotid; 9-metilflavin; 9-fenilflavin; 9-benzilflavin; 9-ciklohexilflavin; 6,9-dimetilflavin; 6,7,9-trimetilflavin; 9oxietilflavin; 9-dioxipropilflavin; 6,8,9-trimetilflavin;

lakroflavin; flavin-9-karbonsav; 6,7-dimetilflavin-9karbonsav vagy schizoflavin.
7. Gyógyászati készítmény vírusfertőzés által okozott betegség kezelésére vagy megelőzésére, amely flavint vagy flavinszármazékot tartalmaz.
8. A 13. igénypont szerinti készítmény, amelyben a flavin vagy flavinszármazék a 3-6 igénypontok bármelyike szerinti vegyület.
9. A 7. vagy 8. igénypont szerinti készítmény, amely egy legalább 35 mg flavint vagy flavinszármazékot tartalmazó egységdózis, amely tartalmaz még egy gyógyászatilag vagy állatgyógyászatilag elfogadható higítószert, töltőanyagot vagy hordozót.

• · · · · ···
10. Eljárás vírusfertőzés által okozott betegség megelőzésére vagy kezelésére, azzal jellemezve, hogy az eljárás során egy ilyen betegségben szenvedő betegnek egy flavinból vagy flavin származékból hatásos mennyiséget adunk be, vagy megelőzés céljából topikálisan alkalmazzuk hatásos mennyiségben egy ilyen fertőzés kockázatának kitett betegnél, a hatásos mennyiség 100 mg/testsúlykiiogramm/nap.

ifi. Szentpéteri ^dám

H-l

XX

Ο _β 6 ι b 6 KÖZZÉTÉTELI PÉLDÁN Τ (l/l

OH OH OH — CH_Z-C—C— C— CH₂OH ( J| )

Η Η H

OH OH OH — CH_a-C—C—C—COOH ( Hl )

Η Η H

OH OH OH — CH₂-C—C—C —COH ( IV )

H H H

OH OH OH H₂

Ilii —ch₂~c—c—c—ΟΙ I I

Η Η H

ONct

OH \ .

ifj. Szentpéteri Adám > szabadalmi ügyiével az\s.B,<3- XsHzetktizi ii In

H-l062^ídap^b-Afttifás^sii 113. Telefon: 34-24-950; Fax: 34-24-323 ι Ο Ο β 'J

LZL I t ΐ LLf HcLUmí

Η/2

OH OH (ΗΟ—C— η\ ifj. Szentpéterí Ádám szabadalmi ügyvivő azS.B.G. Sí K. Nemzetközi Szabadalmi Iroda tagja\ H-lOőajBuqapeaúAndjlás^y Ψ Π3. Telefon^+H^50LEM: 3*>Z4-323 • · • · » · * ((/ό

J F’EL

Γ:

J.J (χ) (χι) (χιι) (χιιι) (χιν) ifj. Szentpéteri Ádám szabadalmi ügyvivő az S»B.G. & K. NemzeűcSzi

Szabadalmi Iroda tagja i

H-1062 Budaptó Abirásáy ült 113.

Telefonr3444á5QtW?L·3^4-323 • · · · ·

Η₃Ν—CH-COO (χιχ)

CH₂OCOCH₃ ifj. Szentpéterí Ádám szabadalmi ügyvivő u S.B.G. Λ K. NentíMközi

H-10te ^dabést^tÁssy út 113. TeleföíLM^<15í5^!aíij424-323 • · · · ··· · (XX)

R | II I I

C—Η

C—ΟΗ

C—ΟΗ

C—ΟΗ

C—Ο—Ρ —

Η °^Η ( XXIII) (χχιι)

HC—ΝΗ / \

HC. .(> /Ν_χ ^XC

I CH iQ. Szentpéteri fÁdám &zabad«ilnu ügyvivő az S.r '

Sz

H-1062 bU03f?eát^}üráfcy út 113 Telefon: 34-2+^1^^2^3^

Ο Ο 6 3 6

CH,— I 0 butira^ H — 1 -c—o botiról H — -c—o butira t H — -C—0 butir át H — -c—H

(χχιν) (χχν) (χχνι) ifj. Szentpéteri Ádám szabadalmi ügyviidz^