HUT76294A - Use of purine derivatives for preparing co-dependent guanilyl-cyclase modificating pharmaceutical compns. - Google Patents

Description

A jelen szabadalom tárgya általánosságban a sejtbeli és idegsejtbeli aktivitás, valamint sejtbeli és idegsejtbeli rendellenességek kezelése. Közelebbről, a jelen szabadalom célja olyan módszerek, azokkal összefüggő anyagkeverékek és gyógyhatású készítmények leírása, amelyek szénmonoxid-függő guanilil-cikláz módosító purin-származékok adagolásával módosítják emlősök sejtbeli és idegsejtbeli aktivitását, amely • · • · • · · · · · ··· · • · · · · · · • · · · · · · · · ···· purin-származékok szelektív és szabályozható módon kiváltják bizonyos természetes, genetikailag kódolt molekulák, mint például neurotróp tényezők in vivő (az élő szervezetben történő) genetikai előállítását. A jelen találmány szerinti módszerek, az azokkal összefüggő anyagkeverékek és gyógyhatású készítmények segítségével számos sejtbeli és idegrendszerbeli folyamat befolyásolható, továbbá megoldható a fiziológiás, neurodegeneratív (idegrendszeri elfajulással kapcsolatos) és idegrendszeri rendellenességek széles körének gyógyító vagy megelőző kezelése.

Az emlősök központi idegrendszerének kifejlődése a nehéz problémák megoldását követelő, egyre bonyolultabb környezet kihívásaira adott természetes válasz volt. Az ílymódon kialakult felépítmény kifinomult biokémiai rendszer, amit kémiai-lag módosított szabályozó folyamatok bonyolult rendszere működtet.

Ezek a biokémiai folyamatok nagymértékben specifi-kus kémiai reakciók bonyolult sorozatán keresztül irányítják a központi idegrendszer minden szerkezeti és működési részle-tét, és ezáltal az egész szervezetet. Normális esetben a kü-lönböző szabályozó rendszerek bonyolult együttműködésének végeredménye az agy által irányított, nagymértékben hatékony, sokcélú központi idegrendszer. Sajnos, ha a központi ideg-rendszer biokémiai folyamatainak rendszere bármilyen okból, akár az életkor, akár betegség, vagy bármilyen más ok miatt sérül, a normál szabályozó folyamatok nem biztos, hogy haté-konyan képesek pótolni a veszteséget. Ilyen esetekben kívána-tos volna, hogy az idegi mechanizmusokat módosítani vagy • · kiegészíteni lehessen a rendellenességek megelőzése vagy ellensúlyozása céljából. Ez a jelen találmány fő célkitűzése.

Közelebbről, az emlősök agya közelítőleg tízmilliárd idegsejtből vagy neuronból áll, melyeket még nagyobb számú, neuroglia vagy asztrocita sejtek-nek nevezett kötőszöveti sejtek vesznek körül. A neuronok, mint a test egyéb sejtjei, egy központi magból, citoplazmából, és a környező sejtmembránból állnak. A többi sejtektől eltérően azonban a neuronoknak egyedi, szálszerű kiterjesztései is vannak, ami lehetővé teszi, hogy az egyes idegsejtek a szó szoros értelmében több ezer más idegsejttel együtt hálózatba szerveződve kialakítsák az idegrendszert. Az ebben a bonyo-lult hálózatban végbemenő kommunikáció képezi a szervezet valamennyi elmebeli folyamatának az alapját.

A bejövő jeleket valamennyi idegsejtben dendriteknek nevezett idegi kinövések fogadják, melyekből minden idegsejtben több ezer is lehet. Az idegi információ az idegsejt mentén hasonlóképpen, axonok segítségével terjed, amik akár 10,000 különböző idegvégződésbe is elágazhatnak. Ezeket az idegsejtbeli axonokat és dendriteket együttesen neuritoknak szokták nevezni, melyek segítségével minden egyes idegsejt más idegsejtekkel többszörös kapcsolatokat tud létesíteni. Ennek eredményeképpen a lehetséges idegi kapcsolódások száma az egészséges agyban billiós nagyságrendű, ami igen nagy szellemi kapacitást eredményez. Ha ellenben az ideg-rendszerbeli kapcsolatok akár az idegsejtek elhalása, akár az életkorral járó öregedés, betegség, oxidatív sztressz, vagy közvetlen • · · · · · · • * · ··· ··· · • · · · · · · ··· · · · ·· · ··· fizikai ártalom következtében megszakadnak, a szervezet mentális kapacitása komoly károsodást szenvedhet.

Az egyes axonoknak más idegsejtek dendritjeivel vagy sejttestével való kapcsolódása szinapszisoknak (idegvégződéseknek) nevezett kapcsolódási pontokon keresztül megy végbe. A szinapszisokon keresztül bonyolódik az egyes idegsejtek egymás közötti információ-cseréje, a kémiai messzendzsereknek (információ-hordozó molekuláknak) a szinaptikus kapcsolódásokon keresztül történő áramlása által. Ezeknek a kémiai messzendzsereknek, vagy neurotranszmittereknek a többsége kis fehérje, kateholamin vagy aminosav. Az ideg-sejtek között áramló információ összetettsége alapján jelen-leg úgy gondoljuk, hogy 50 és 100 között van a különböző neurotranszmitterek száma, amik az emlősök agyában hordozzák a jeleket.

Egészen a legutóbbi időben felfedezték, hogy a nitrogénmonoxid (NO) és a szénmonoxid (CO) neurotranszmitterek lehetnek. Úgy tűnik, hogy ezek a gáznemű molekulák a sejt növekedését és kölcsönhatásait befolyásoló számos idegrendszeri szabályozó folyamatban vesznek részt. A szénmonoxidot az agyban, és a test más részein is a hém oxigenáz II (HO) enzim termeli. Jelenleg úgy gondoljuk, hogy a CO molekula, akár a

HO-enzim termeli, akár más forrásból származik, amint az idegsejtben diffúzió útján terjed, a guanilát-cikláz vagy guanilil-cikláz néven ismert enzim módosításával kiváltja a ciklikus guanozin monofoszfát (cGMP) néven ismert másodlagos transzmitter molekula mennyiségének növe-kedését. ílymódon a CO jelző molekulaként működik a guanilil- -cikláz szabályozó • · · * ·· körfolyamatban. A cGMP szinteknek az így létrejövő növekedése több neurotróp tényezőt, valamint más idegi tényezőket is módosít, ami kiválthat, elősegíthet vagy módosíthat egy sor sejtbeli folyamatot, mint például a sejt-növekedés, a védelem, és a sejtek közötti kommunikáció.

A neurotróp tényezők (az idegszövetek táplálkozásában szerepet játszó anyagok) olyan molekulák, melyeknek sokféle hatása van, elősegítik az idegsejtek kifejlődését és differenciálódását, a sejtek egységének fennmaradását, és szükségesek a szervezet életciklusa folyamán az idegsejtek túléléséhez és fejlődéséhez. A neurotróp tényezők általános-ságban két nagy csoportba sorolhatók: a neurotrofinokra és a pleiotrofinokra. A pleiotrofinok abban különböznek a neurotrofinoktól, hogy esetükben nincs a sejtekből kiválasztódott molekulákra jellemző jelsorozat, továbbá sokféle sejtet, köztük idegsejteket is befolyásolhatnak. A neurotróp tényezők-nek két hatása különösen lényeges: (i) az idegsejtek elha-lásának megakadályozása, és (ii) az idegsejt nyúlványok (keletkező axonok vagy dendritek) képződésének elősegítése. Ráadásul, a CO-kiváltotta neurotróp tényezők valószínűleg csökkentik az idegsejtek membránpotenciálját, és ezáltal az idegsejtek könnyebben tudnak jelet fogadni és továbbítani.

Újabban számos kutató azt a nézetet vallja, hogy az emlékezet összefügg a szinaptikus aktivitás módosulásával, amikoris az agyi idegsejtek meghatározott csoportján belül a szinaptikus kapcsolatok ismételt aktiválás hatására megerősödnek, vagy könnyebbé válnak. Ennek eredményeképpen ezeket a módosult kapcsolatokat sokkal könnyebb aktiválni. A kapcso• · · · · • · · · · ··· • · · · · • · · · · · latok megkönnyítésének ezen típusa az elképzelések szerint az egész agyban előfordul, de különösen gyakori a hippokampuszban, az agynak az emlékezet szempontjából legjelentősebb területén. A hippokampuszbeli idegpályák ingerlése több nappal az eredeti inger után is fokozott szinaptikus át-vitelt eredményezhet ezeken az idegpályákon. Ezt a folyamatot hosszútávú potencírozásnak (angol neve után, rövidítve LTP) nevezzük.

Közelebbről, a hosszútávú potencírozás a tevékenységtől függő szinaptikus elektromos aktivitásnak olyan formája, ami számos idegpálya mentén megfigyelhető. Ebben az állapotban, amit általánosan elfogadnak, mint a sejtemlékezés egyik formáját, az idegsejtek ingerekre érzékenyebbek. Ennek megfelelően, széles körben elfogadott nézet szerint az LTP kiváló modell a szinaptikus képlékenység azon típusa sejttani és molekuláris alapjainak megértéséhez, ami gerincesekben, és így az emberben is felelős a tanulásért és az emlékező-képességért.

Jelenlegi ismereteink szerint az LTP kiváltásáért felelős messzendzser (küldönc) anyagokként leginkább a NO és a CO jöhet szóba, mivel az ezen vegyületeket gátló anyagok késleltetik a potencírozás kiváltását. Az a lehetőség, hogy ezekkel, vagy más jelátvivő anyagokkal módosíthatjuk az idegrendszeri aktivitást, és könnyíthetjük az LTP kialakulását, elvileg lehetővé teszi a tanulási sebesség és a megismerési képesség fokozását, ami ellensúlyozhatja a csökkent szellemi képességeket. A jelen találmány előtt nem volt olyan ismert módszer vagy anyag, ami in vivő, sejt-szinten megbízhatóan módosítani lett volna képes a sejtbeli és ideg• · · « * · ··«·· · ·· * * · ··· ··· · • · · · · · · η .............

rendszerbeli szabályozó folyamatokat, mint például az idegsejtek hosszútávú potencírozásának megkönnyítését.

A hosszútávú potencírozás által biztosított megnövelt szellemi teljesítménnyel szemben a szellemi képességeket változó mértékben gátolhatja, ha az idegsejtek hálózatában az azt alkotó idegsejtek elhalása vagy nem megfelelő működése következtében megszakad a kapcsolat. Bár a szellemi képes-ségek csökkenése közvetlenül az idegsejtek közötti hálózatos kapcsolatok megszakadásával függ össze, fontos emlékeztetni arra, hogy a megszakadás az egyes sejtek szintjén következik be. Ezen a szinten az idegi összeköttetések megszakadásával kapcsolatos káros hatásokat sokféle tényező közül bármelyik előidézheti, mint például az idegrendszer elfajulásával kapcsolatos betegségek és rendellenességek, szívroham, agy-vérzés, öregedés, baleset, vagy káros vegyi anyagok, illetve környezeti ártalmak hatása.

Az ismert idegrendszeri megbetegedések közül, amelyek károsan befolyásolják az idegsejtek működését, megemlíthető az Alzheimer-kór és az azzal összefüggő rendellenességek, a Parkinson-kór, motoros idegrendszeri károsodások, mint pél-dául az Amyotróf Laterális Szklerózis (izomsorvadással járó gerincvelő keményedés), az agyvérzés, a szklerózis multiplex, és a Huntington-kór. Hasonló problémákat okozhat az idegrendszeri kapcsolatoknak a normális öregedési folyamattal összefüggő, vagy agyvérzés, szívroham, vagy egyéb vér-keringési zavar következtében beálló elfajulása. Közvetlen fizikai sérülés vagy környezeti tényezők, úgymint kémiai anyagok, nehézfémek és hasonló tényezők szintén kiválthatják az • ·«β « « « • · · * ··4 ··· idegsejtek vagy egyéb sejtek elégtelen vagy nem megfelelő működését, vagy elhalását.

Jelenlegi ismereteink szerint számos sejt- és idegsejt elfajulással kapcsolatos megbetegedés, úgymint az Amyo-tróf Laterális Szklerózis, a Parkinson-kór, az Alzheimer-kór, a rák és az öregedés egyik kritikus tényezője az oxidativ szabad gyökök felhalmozódása által kiváltott sejt-károsodás. A legtöbb sejtben a szabad gyökös oxidációval szemben sok-féle védekező mechanizmus létezik. Például, a glutation magas szintje védhet a szabad gyökös oxidációval szemben. Az idegsejtekben hiány van ezekből az antioxidáns (az oxidációs hatásokkal szemben védő) anyagokból.

Akármi is okozza az idegrendszeri rendellenességet vagy kóros működést, az a tény, hogy a károsodott idegsejtek általában nem képesek arra, hogy természetes körülmények között lényegileg megújuljanak vagy regenerálódjanak, ahhoz a javaslathoz vezetett, hogy az idegrendszeri működés helyreállításához neurotróp tényezőket adagoljanak, amelyek serkentik az idegi növekedést és működést. Hasonlóképpen, ha a neuritogenezist (a neuritok, vagyis az idegnyúlványok képződését), vagy a neuritok növekedését serkentjük, ez hozzájárulhat ahhoz, hogy a túlélő idegsejtek kapcsolatokat építsenek ki, és ezáltal helyreálljon az idegrendszeri működés.

A jelenleg rendelkezésre álló módszerek és vegyületek nem hatásosak, vagy a gyakorlatban nem megoldott, hogy egy idegrendszeri rendellenességben szenvedő betegnek közvetlenül adagoljunk neurotróp tényezőt. Ez részben maguknak a neuro-tróp tényezőknek a bonyolult molekuláris kölcsönhatásaival, valamint • »· ·*·· ·· ·· * * · - ί · * * ·**···· » * » · · <· 9 · •»r ·» ··· ··*» az idegsejtek növekedése és a neuritok képződése egymással összefüggő szabályozásával kapcsolatos. A neurotróp tényezők kémiai folyamatok hosszú sorozaténak eredményei, amely folyamatokat transzmitterek (információ átvivő moleku-lák) és receptorok (kötőhelyek) bonyolult sorozata szabályoz kifinomult módon, molekuláris szinten. Az idegsejteket, ennek megfelelően, különféle neurotróp tényezők összhangja befolyá-solja, amely tényezők mindegyike különböző időpontokban az idegsejt fejlődésének különböző fázisaihoz járul hozzá. A neurotróp tényezők valójában a kémiai folyamatok legvégén jelennek meg, és mint ilyenek, a szabályozási körfolyamatok legbonyolultabb összetevői. A korábbi gyakorlatban tulaj-donképpen naivitás volt feltételezni, hogy egyes neurotróp tényezőknek (a sejt szempontjából) véletlenszerű, lényegesen javítani képes hígítás nélküli adagolása sejt aktivi-tását vagy regenerálódását. Ellenkezőleg, ha a szabályozási folyamatokat korábbi fázisukban módosítjuk, akkor válhat lehetővé, hogy a megfelelő növekedési tényezők keletkezzenek a megfelelő viszonylagos mennyiségben, és azok a megfelelő időpontban kerüljenek bele az összetett sejtbéli környezetbe.

Egyéb gyakorlati megfontolások is az ellen a korábbi gyakorlat ellen szólnak, hogy a neurotróp tényezőket közvetlenül alkalmazzuk az idegsejtek hálózata regenerálódásának serkentésére. A neurotróp tényezők (ideértve a neurotrofinokat és a pleiotrofinokat is) ugyanis nagyméretű fehérjék, és mint ilyenek, nem adagolhatok a gyógyászatban megszokott, hagyományos módszerekkel. Például, ezeket a proteineket nem lehet orálisan (szájon át) beadni a betegnek vagy a kezelt

állatnak, mivel annak emésztőrendszere lebontaná azt, mielőtt eljutna a célzott idegsejtekhez. Sőt, ezek a fehérjék, nagy méretük miatt, nem tudnak áthatolni a vér-agy gáton és így nem tudnak eljutni az idegrendszer legfontosabb helyére. Ezt a nehézséget durván kiküszöböli, ha a neurotróp tényezőket közvetlenül befecskendezik az agyba vagy a gerincvelő folyadékába, azonban ennek a megoldásnak is megvannak a maga technikai problémái, amiket mostanáig nem sikerült megnyugtatóan megoldani. Például, az ismert neurotróp tényezőknek az agyba való közvetlen infúziója a gyakorlatban nem megvalósítható, mivel a hatásos koncentráció eléréséhez több évig tartó adagolásra lenne szükség. Ráadásul, az agyba való közvetlen befecskendezés igen rövid idő elteltével az idegszövetek veszélyes duzzadását és gyulladását okozza. Ilymódon, elméletileg bármennyire is kívánatos volna a neurotróp tényezők közvetlen adagolása, ez jelenleg nem megvalósítható.

A jelen találmánynak, ennek megfelelően, általános célkitűzése olyan módszereket és azokkal kapcsolatban olyan anyagkeverékeket és gyógyhatású anyagokat szolgáltatni, amelyek segítségével számos kedvező hatás elérése céljából eredményesen módosíthatók az emlősök sejtjei, idegsejtjei, a sejtek, vagy az idegsejtek tevékenysége. Ilyen kedvező hatás lehet az oxidatív sztressz és a szabad gyökök okozta károsodás elleni védelem, valamint további, általánosabb fiziológiás hatások, mint például az emlősök vérnyomásának csökkentése.

Ilymódon, a jelen találmány további célkitűzése olyan módszereket és azokkal kapcsolatban olyan anyagkeverékeket és gyógyhatású anyagokat szolgáltatni, amelyek alkalmasak az • · · ···· ·· · · «···· · ·· • · ···· ··· · emlősökben idegrendszeri megbetegedések és sejt-rendellenességek kezelésére.

Még további célkitűzése a jelen találmánynak olyan módszereket és azokkal kapcsolatban olyan anyagkeverékeket és gyógyhatású anyagokat szolgáltatni, melyek segítségével az emlősök idegsejtjének memránpotenciálja hosszú távon változtatható.

A jelen találmánynak célja továbbá olyan módszereket és azokkal kapcsolatban olyan anyagkeverékeket és gyógyhatású anyagokat szolgáltatni, melyek segítségével a sejteken belül kiváltható genetikailag kódolt molekulák és neurotróp té-nyezők ín vivő fiziológiás előállítása és adagolása.

További célja a jelen találmánynak olyan módszereket és azokkal kapcsolatban olyan anyagkeverékeket és gyógyhatású anyagokat szolgáltatni, melyek segítségével fiziológiás környezetben növelhető a neurotróp tényezőknek az idegrendszer regenerálódására gyakorolt hatása.

A felsorolt, és más célkitűzéseket a jelen találmány olyan módszereivel és azokkal kapcsolatban olyan anyagkeverékekkel és gyógyhatású anyagokkal érjük el, amelyek, széles összefüggésben, biztosítják természetesen előforduló, genetikailag kódolt molekuláknak, mint például neurotróp tényezőknek az in vivő genetikai kifejeződését és azt követő termelődését, továbbá, amelyek legalább egy szénmonoxid-függő guanilil-cikláz módosító purin-származéknak az emlős sejtekbe vagy idegsejtekbe való beadásával biztosítják a sejtbeli és idegsejtbeli tevékenység módosítását.

Amint azt a szakemberek jól tudják, a genetikai • · • · • · · kifejeződésnek, valamint a sejtbeli és idegsejtbeli aktivitás példák szerinti módosításának az in vivő aktiválása, vagy gátlás alóli felszabadítása, amit a jelen találmány szerinti módszerek és azokkal kapcsolatos anyagkeverékek és gyógyhatású anyagok váltanak ki, számos különféle módon, vagy azok kombinációjával fejezhetők ki. Például, ha egy emlős sejtjét vagy idegsejtjét a jelen találmány szerinti módszerrel kezeljük, ennek eredményeképpen a sejt közvetlenül hozzájuthat az in vivő kifejezett molekulá(k)hoz, különféle természetes, genetikailag kódolt vegyületek, mint például fehérjék és neurotróp tényezők fokozott sejtbeli termelésével, vagy pedig ezen vegyületek aktivitásának serkentésével, ami azután hatással van a természetes sejtbeli vagy idegsejtbeli metabolizmusra, a sejtek működésére, fejlődésére, túlélésére. Ezek az utólagos hatások állhatnak abból, hogy megvédik a sejtet a szabad gyökös oxidációtól és a sejt lebomlásától, stabilizálják a sejt kötőhelyeit más tényezőkkel szemben, vagy hatásukra fokozódhat a szénmonoxid és más antioxidáns anyagok sejtbelí termelése, vagy akár a vérnyomás is csökkenhet, szénmonoxid kiváltotta sejtmechanizmusok hatására. A jelen találmány szerinti módszerek és gyógyhatású anyagok ezenkívül közvetlenül is serkenthetik a sejtek vagy az idegsejtek növekedését, fejlődését és túlélését, a korábbi módszerek által okozott káros mellékhatások nélkül. Továbbá, a jelen találmány használható a sejtek membránpotenciálja csökkentésére vagy megváltoztatására, ami által nő a sejtek rugalmassága, és hosszú távú potencírozás jön létre.

··· · · ··· · ····

A jelen találmány gyakorlati megvalósítására alkalmas, szénmonoxid-függő, guanilil-cikláz módosító purinszármazékokra példa lehet a guanozin, az inozin pranobex, és a [ 4-[ 3-(1,6-dihidro-6-oxo-9-purin-9-il)-1-oxopropil] -amino] -benzoesav.

(AIT-082). A korábban ismert vegyületektől eltérően, ezek a vegyületek közvetlenül beadhatók a betegnek, akár orálisan, akár injekció formájában, vagy más hagyományos módon. Ezek a példabeli vegyületek nem mérgezőek, és a vér-agy gátat is át tudják lépni.

Egy további, különleges szempont, hogy a jelen találmány szerinti módszerek és anyagkeverékek alkalmazhatók idegrendszeri megbetegedések és más sejtrendellenességek, mint például a betegség, oxidatív sztressz, öregkor, baleset vagy káros vegyi anyagok által kiváltott rendellenességek gyógyító vagy megelőző kezelésére. Az egyes idegsejtek és sejtek túlélésének, növekedésének és fejlődésének elősegítésével a jelen találmány megkönnyíti az idegsejtek hálózatának regenerálódását és fejlődését, és enyhíti a sejtek és idegsejtek kóros működésének következményeit.

A szakemberek számára természetes, hogy a jelen találmány szerinti, szénmonoxid-függő guanilil cikláz módosító purinszármazékok hatásos koncentrációit tartalmazó gyógyászati anyagkeverékek és gyógyhatású anyagok készíthetők gyógyászatilag elfogadható töltőanyagok és hordozók felhasználásával. Ezek a gyógyászati készítmények orálisan, transzdermálisan (a bőr alá), helyileg, vagy injekció formájában adagolhatok. Sőt, mivel a jelen találmány szerinti módszerekben használt aktív hatóanyagok át tudják lépni a vér-agy gátat, nem *· 9 9 i, · * 9 * · 9 9 · 9·· ··· • · · kell azokat közvetlenül az agyba vagy a központi idegrendszerbe adagolni injekció vagy infúzió alakjában.

A jelen találmány szerinti módszerek és anyagkeverékek, egy másik szempont szerint, alkalmasak arra, hogy emlősök idegsejtjei membránpotenciáljának hosszú távú változásait váltsák ki. Ezek a hosszú távú potenciálváltozások a membrán nagyobbfokú képlékenységéhez vezetnek, és ennek megfelelően fokozódik a sejt-emlékezet. A fokozott sejt-emlékezet viszont növelheti a kezelt szervezet szellemi kapacitását, aminek következtében gyorsabban fog tanulni, és a megtanultakra hosszabb ideig fog emlékezni.

A jelen találmány további célkitűzései, jellemzői és előnyei a szakemberek számára nyilvánvalóak lesznek a találmánynak a következőkben részletezett, kedvező megvalósítási példáiból, a csatolt ábrákon benutatott kísérleti adatokkal kapcsolatban, amiket az alábbiakban röviden leírunk.

Az 1. ábra az AIT-082 purin-származéknak a jelen találmány szerinti, egérnek való adagolása után a vegyület egér-plazmában mért koncentrációjának grafikus ábrázolása;

A 2. ábra az atropin, egy kolinerg antagonista hatásának grafikus ábrázolása, az AIT-082 vegyület egereken mért memóriafokozó hatására;

A 3. ábra in vitro (lombikban) tenyésztett idegsejtek idegi növekedési tényező kiváltotta neurotogenetikus (a neuritképződéssel kapcsolatos) hatásának grafikus szemléltetése, az AIT-082 purin-származék különböző koncentrációi mellett;

A 4A, 4B és 4C ábra szelektív inhibitorok (gátló hatású molekulák) és az AIT-082 purin-származék az idegi növekedési ·· ··»» »» ·· ··**»· « * » * » · ··· ··» « ♦ * · 9 · * · «·» *· ··4 9 99 9 9 tényező kiváltotta neurotogenetikus válaszreakcióra gyakorolt hatásának grafikus összehasonlitása; a 4A ábra mutatja a methemoglobin, egy szénmonoxid megkötő molekula jelenlétében tenyésztett sejtek neurotogenetikus válaszreakcióját; a 4B ábrán ugyanaz a válaszreakció látható metilénkék, egy guanilil-cikáz inhibitor jelenlétében; a 4C ábra pedig cink protoporfirin IX, egy szénmonoxid-megkötő molekula jelenlétében tenyésztett sejtek válaszreakcióját mutatja;

Az 5A és 5B ábra különböző koncentrációjú AIT-082 purinszármazék, és különböző koncentrációjú nitrogénmonoxid-gátlók jelenlétében tenyésztett sejtek idegi növekedési tényező kiváltotta neurotogenetikus hatásának grafikus szemléltetése;

A 6. ábra az AIT-082 purinszármazékkal együtt, illetve az AIT-082 vegyület nélkül tenyésztett idegsejtek gyűrűs GMP termelésének grafikus összehasonlítása;

A 7. ábra az AIT-082 purinszármazék tanulásra gyakorolt hatásának dózis - hatás görbéje, amit svájci Webster-egereken mértünk a win-shift memória-teszt segítségével;

A 8. ábra az AIT-082 purin-származék hatásának elhúzódását hasonlítja össze grafikusan, 60 mg/kg, illetve 30 mg/kg nagyságú adagolás esetén;

A 9. ábrán grafikusan összehasonlítjuk öregkori emlékezetromlásban szenvedő svájci Webster-egerek tanulási képességét az AIT-082 purin-származékkal, illetve a fizosztigmin nevű gyógyszerrel való kezelés esetén;

A 10. ábrán grafikusan összehasonlítjuk öregkori emlékezetromlásban szenvedő C57BL/6 egerek tanulási képességét • ··· · • · • ··· az AIT-082 purin-származékkal, illetve a fizosztigmin nevű gyógyszerrel való kezelés esetén;

A 11. ábrán grafikusan összehasonlítjuk egerek öregkori emlékezetromlásának megelőzését az AIT-082 purin-származékkal való kezeléssel, illetve anélkül;

A 12A és 12B ábrán grafikusan összehasonlítjuk rágcsálók agykéreg-asztrocitái által termelt idegi növekedési tényező mennyiségét purin-származékok adagolásának hatására, az ELISA kísérleti elrendezéssel mérve; a 12A ábrán láthatók a különböző koncentrációjú guanozin-trifoszfát jelenlétében tenyésztett idegsejtekben mért idegi növekedési tényező koncentrációk, a 12B ábra pedig ugyanezen mért értékeket szemlélteti különböző koncentrációjú guanozin jelenléte esetén;

A 13A és 13B ábrán grafikusan összehasonlítjuk a rágcsáló agykéreg-asztrocita sejtjei által termelt különféle mRNA neurotróp tényezők mennyiségét különböző időpontokban, guanozin jelenlétében, illetve anélkül; a 13A ábra szemlélteti az idegi növekedési tényező (NGF) mRNA szintjét, a 13B ábra pedig a fibroblaszt növekedési tényező (FGF) mRNA szintjét;

A 14A, 14B és 14C ábrákon grafikusan összehasonlítjuk a különböző koncentrációjú purin-származék hatására létrejövő neurotogenetikus válaszreakciót idegi növekedési tényező jelenlétében, illetve anélkül; a 14A ábra szemlélteti a különböző koncentrációjú purin-származékok által kiváltott neurotogenetikus válaszreakciót az idegi növekedési tényező jelenlétében, a 14B ábra szemlélteti a neurotogenetikus válaszreakciót az idegi növekedési tényező nélkül, a 14C ábra pedig ugyanazt a válaszreakciót szemlélteti egyes purin17 származékok, valamint purin-származékok kombinációja esetén, idegi növekedési tényező jelenlétében és anélkül;

A 15A, 15B és 15C ábrákon grafikusan összehasonlítjuk különféle purin-származékok különböző koncentrációjának jelenlétében tenyésztett idegsejtek idegi növekedési tényező által kiváltott neurotogenetikus válaszreakcióját; a 15A ábra szemlélteti a neurotogenetikus válaszreakciót különböző koncentrációjú inozin jelenlétében; a 15B ábra szemlélteti ugyanazt a válaszreakciót különböző koncentrációjú hipoxantin jelenlétében; a 15C ábra pedig az idegsejtek neurotogenetikus válaszreakcióját szemlélteti különböző koncentrációjú xantin jelenlétében;

A 16. ábrán grafikusan szemléltetjük a különböző koncentrációjú AIT-034 purinszármazék jelenlétében tenyésztett idegsejtekben mért, idegi növekedési tényező által kiváltott neurotogenetikus válaszreakciót;

A 17. ábrán grafikusan összehasonlítjuk a különböző koncentrációjú guanozin-trifoszfát és adenozin-trifoszfát jelenlétében, idegi növekedési tényezővel vagy anélkül tenyésztett idegsejtekben mért neurotogenetikus válaszreakciót;

A 18. ábrán grafikusan összehasonlítjuk a különböző koncentrációjú guanozin és az adenozin monofoszfátjai, difoszfátjai és trifoszfátjai különböző koncentrációi mellett, idegi növekedési tényező által kiváltott neuroto-genetikus válaszreakciót;

A 19. ábrán grafikusan összehasonlítjuk a különböző koncentrációjú guanozin jelenlétében tenyésztett idegsejtekben keletkező gyűrűs guanozin-monofoszfát mennyiségét;

A 20A, 20B és 20C ábrán grafikusan összehasonlítjuk a guanozinnal és anélkül, három inhibitor (gátló hatású anyag) különböző koncentrációjának jelenlétében tenyésztett idegsejtek idegi növekedési tényező által kiváltott neurotogenetikus válaszreakcióit; a 20A ábrán látható a metilénkék, egy guanilil-cikláz gátló anyag jelenlétében tenyésztett sejtek neurotogenetikus válaszreakciója, a 20B ábra szemlélteti különböző koncentrációjú LY83583, szintén egy guanilil-cikláz gátló anyag, jelenlétében tenyésztett sejtek neuroto-genetikus válaszreakcióját, a 20C ábrán pedig különböző koncentrációjú atriális natriuretikus tényező (szívpitvari nátriumürítési hormon), a guanilil ciklázzal kölcsönhatásban levő hormon jelenlétében tenyésztett sejtek neurotogenetikus válaszreakciója látható;

A 21. ábra grafikusan szemlélteti a nátrium nitrát, egy szervetlen nitrogén-monoxid donor molekula, jelenlétében tenyésztett sejtek idegi növekedési tényező által kiváltott neurotogenetikus válászreakcióját;

A 22A és 22B ábrán grafikusan összehasonlítjuk nitrogénmonoxid donor molekulák, valamint nitrogén-monoxid és szénmonoxid megkötő molekulák jelenlétében tenyésztett sejtek idegi növekedési tényező által kiváltott neurotogenetikus válaszreakcióját, a 22A ábra mutatja nitrogén-monoxid donor-molekulák és hemoglobin különböző kombinációja jelenlétében tenyésztett idegsejtek neurotogenetikus válaszreakcióját, a 22B ábrán pedig nitrogén-monoxid donor-molekulák és methemo-globin különböző kombinációja jelenlétében tenyésztett ideg-sejtek neurotogenetikus válaszreakcióját láthatjuk;

• · • · • · ♦ ··· · ···«

A 23. ábrán grafikusan összehasonlítjuk guanozinnal együtt, illetve guanozin nélkül, különböző koncentrációjú hemoglobin jelenlétében tenyésztett sejtek idegi növekedési tényező által kiváltott neurotogenetikus válaszreakcióját;

A 24. ábrán grafikusan összehasonlítjuk guanozinnal együtt, illetve guanozin nélkül, különböző koncentrációjú Lnítro-argínin metil-észter (L-NAME) jelenlétében tenyésztett sejtek idegi növekedési tényező által kiváltott neurotogenetikus válaszreakcióját;

A 25. ábrán grafikusan összehasonlítjuk guanozinnal együtt, illetve guanozin nélkül, különböző koncentrációjú cink protoporfirin IX (ZnPP), egy CO-szintézis gátló molekula jelenlétében tenyésztett sejtek idegi növekedési tényező által kiváltott neurotogenetikus válaszreakcióját;

A 26. ábra a 25. ábra grafikus összehasonlításának negatív kontrollja, ezen az ábrán grafikusan összehasonlítjuk guanozinnal együtt, illetve guanozin nélkül, különböző koncentrációjú réz protoporfirin IX (CuPP) jelenlétében tenyésztett sejtek idegi növekedési tényező által kiváltott neurotogenetikus válaszreakcióját;

A 27. ábrán grafikusan szemléltetjük különböző koncentrációjú inozin pranobex, egy purin-származék molekula jelenlétében tenyésztett idegsejtek idegi növekedési tényező által kiváltott neurotogenetikus válaszreakcióját;

A jelen találmány tárgya, nagy vonalakban, olyan módszerek, azokkal kapcsolatos anyagkeverékek és gyógyhatású készítmények, melyek egyedülálló módon alkalmasak emlősök sejtjei és idegsejtjei aktivitásának befolyásolására. Közelebb-ről, • · · a jelen találmány célja, hogy hatásos purin-származékok felhasználásával módosítsa a sejteken vagy idegsejteken belül a szénmonoxid-függő guanilil-cikláz szabályozó rendszert, és ílymódon számos előnyös hatást érjen el, mint ami például a természetes neurotróp tényezők ín vivő genetikai előállítása, aminek következtében ezek a természetes neurotróp tényezők közvetlenül adagolhatok emlősöknek; valamint antioxidáns vegyületek és szénmonoxid termelése a szervezeten belül, és ennek eredményeképpen az emlősök vérnyomásának csökkentési lehetősége. A jelen találmány módszerei és anyagkeverékei segítségével elérhető ezenkívül a káros sejtlebomlás megelőzése, és kezelhetők olyan kóros állapotok, amelyek szabad gyökök által kiváltott oxidatív sztressz következtében fellépő sejtkárosodásra vezethetők vissza.

A jelen találmány elképzeléseit szemléltető megvalósítási példákban meghatározott purin-származékok felhasználásával, kódolt molekulák genetikai kifejezése útján serkentjük a neuritogenezist, fokozzuk az idegsejtek növekedését, és módosítjuk az idegsejtek membránpotenciáiját, hogy ílymódon emlősökben fokozott tanulási képességet érjünk el. Az alábbiakban példaként végrehajtott és tárgyalt vizsgálatokban és kezelésekben a jelen találmány módszerei szerint hatásos anyagkeverékeket képviselő, kiválasztott purin-származékok különböző mennyiségű adagjait, és különféle adagolási módjait alkalmaztuk. Természetesen, a szakmában járatosak számára nyilvánvaló, hogy az alábbiakban részletesen tárgyalt, meghatározott anyagkeverékek, adagolások vagy beadási módok nem jelentik a jelen találmány oltalmi körének szűkítését.

• · • · · ···· ·· ····· · ·· • · ···· · · · · • * · · · · · • · · ·· ··· · ····

A jelen találmány elvei alapján, a hatásos kezelési koncentráció elérése céljából a felhasznált anyagkeverékek adagolhatok különböző mennyiségű gyógyhatású készítményként, vagy diétás étrend részeként, a kezelendő élőlény különleges igényei szerint.

Az, hogy mi számít a kiválasztott anyagkeverék hatásos mennyiségének, olyan tényezőktől függ, mint a kiválasztott purin-származék aktivitása, a kezelt élőlény fiziológiai jellemzői, a kezelt élőlény idegrendszeri károsodásának vagy rendellenességének mértéke, valamint az adagolás módja. A példákban szereplő, az idegrendszer aktivitásának módosításában hatásosnak bizonyult kezelési töménységek lpmól töménységtől 500 mmól, vagy még nagyobb töménységig terjednek. Általánosságban megállapítható, hogy a kezdeti adagolást az adott emlős szervezet számára optimális adag megállapítása céljábók módosítani kell. Az anyagkeverékek számos különböző módon adagolhatok, úgymint orálisan (szájon át) , helyileg, bőrön keresztül, intraperitoniális vagy intravénás injekció formájában, közvetlenül a váráramba. Természetesen, szükség esetén a purin-származékok hatásos mennyisége a gerincfolyadékba adott injekció formájában, vagy infúzióval közvetlenül az agyba is adagolható.

A jelen találmány módszerei végrehajthatók olymódon, hogy a purin-származékokat gyógyhatású anyagként önmagukban, vagy pedig más anyaggal kombinálva, mint gyógyászati készítményt adagoljuk az emlős szervezetnek. Továbbá, a purin-származékok kombinálhatok gyógyászatilag elfogadott töltőanyagokkal és hordozó anyagokai, mint például semleges, szilárd hígító anyagok, vizes oldatok vagy nem mérgező szerves oldószerek. Ezek a gyógyászati készítmények szükség esetén tartalmazhatnak tartósítószereket, stabilizáló szereket, és hasonló anyagokat.

A jelen találmány szerinti módszerek és gyógyhatású anyagok biztosítják a sejtbeli és idegbeli tevékenységek különböző típusainak szabályozott, hosszútávú módosítását, ahol a módosítás jelentheti a természetben előforduló, genetikailag kódolt molekulák, mint például hém oxigenáz, és neurotróp növekedési tényezők (többek között neurotropinok, pleiotropinok és citokinek) in vivő termelését, az ilyen, in vivő képződött molekulák közvetlen adagolását, amiáltal fokozható e molekulák és a neurotróp tényezők hatása, jelentheti továbbá a sejtnövekedés, sejttevékenység, védelem, és fejlődés serkentését. Továbbá, a jelen találmány használható a neuritogenezis elősegítésére, oldalági idegi kapcsolatok képzésére, a gyűrűs purin nukleotidok termelésének növelésére, a szinapszisképződés (idegi kapcsolatok képzése) elősegítésére, és az idegek membránpotenciáljának megváltoztatására. Ezek a hatások különösen kedvezőek lehetnek az idegi elfajulás kezelésében, és a tanulási kapacitás növelésében. Hasonlóképpen, ha előidézzük természetes endogén (a szervezetben keletkező) antioxidáns vegyületek in vivő termelését, ez különösen kedvező hatású lehet oxidatív károsodással kapcsolatos kóros állapotok, mint például a rák, az öregedés, és számos idegrendszeri rendellenesség gyógyító és megelőző kezelésében.

Az ilyen kóros állapotokkal kapcsolatos kísérleti készítmények és módszerek hatékonyságának kezdeti meghatározása, • 9 * nyilvánvaló gyakorlati és erkölcsi okok miatt, embereken nem végezhető. Ennek megfelelően, bármely gyógyhatású anyag vagy terápiás eljárás kifejlesztésének kezdeti szakaszában bevált az az eljárás, hogy - biztonsági okokból és költségkímélés miatt megfelelő állati modelleket alkalmaznak. A laboratóriumi állati modellek gyakorlati sikere azon alapszik, hogy az emlősök sejttani vagy idegrendszeri felépítése hasonló. Ilymódon, az egyik faj, például, a rágcsálók egyik tagjának sejtbeli vagy idegrendszeri válaszreakciója gyakorta megfelel egy másik, például az emberi faj egy képviselője ugyanazon reakciójának. Csak miután az állatkísérleteket kellően kidolgozták, kerülhet sor embereken végzett klinikai kísérletek végrehajtására, melyekkel tovább bizonyítják a terápiás hatóanyag embereken való alkalmazásának biztonságát és hatékonyságát.

Ami az idegrendszeri elfajulással kapcsolatos kóros állapotokat és rendellenességeket, és azok klinikai hatásait illeti, az egér-modell igen hasonló ezen tünetegyüttesek emberi kórisméjéhez. A szakemberek számára ezért elfogadott gyakorlat, hogy az egér modell eredményeit emberre és más emlősökre is kiterjesztik. Az egér, csakúgy, mint az ember, hajlamos arra, hogy akár baleseti sérülés, akár oxidatív károsodás, öregedés, betegség vagy veszélyes vegyszerek következtében fellépő idegrendszeri elfajulásból eredően tanulási rendellenességeket mutasson. És ami éppolyan lényeges, a tapasztalatok szerint a neurotróp tényezők alapjában véve ugyanolyan módon hatnak az egér modellben, mint az emberi szervezetben, figyelemreméltó módon hasonló idegi válaszreakciókkal. Ennek megfelelően, a jelen találmányban • · · ···«

- kizárólag a szemléltetés céljából, és a találmány oltalmi körének szűkítése nélkül - egéren, mint emlős szervezeten elvégzett kísérleti példákat mutatunk be. Szakemberek számára nyilvánvaló, hogy a jelen találmány szerinti módszereket más emlős szervezetekre, többek között az emberi szervezetre is lehet alkalmazni.

Az itt közölt kísérletek tapasztalatai szerint több purinszármazék a jelen találmány elveivel összhangban fejti ki hatását. Közelebbről, adataink szerint a guanozin hatékonyan serkenti a neurotróp tényezők termelését, és fokozza a neuritogenezist. Hasonlóképpen, egy másik példabeli purin-származék, a -[ 3-(1,6-dihidro-6-oxo-9-purin-9-il)-1-oxo-propil] -amino benzoesav (AIT-082) serkenti természetes, genetikailag kódolt gének aktiválását vagy derepresszióját, és ennek következtében a szervezetben előforduló, genetikailag kódolt molekulák, mint például neurotróp tényezők termelődnek. E vegyület kiváltja még a hém oxigenáz szervezetbeli termelését, ami viszont szénmonoxid és epefesték antioxidáns vegyületek szervezetbeli termelését indítja el. Az AIT-082 vegyület ezenkívül fokozza a neuritogenezist, növeli a neurotróp tényezők hatását, és megváltoztatja az idegsejtek membránpotenciálját, és ezáltal megkönnyítik a sejtek hosszútávú potencírozását.

Az AIT-082 vegyületet az 1992 február 25-én, a jelen szabadalmi bejelentés egyik társfeltalálójának nevére bejelentett 5,091,432 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentésben írták le, erre a szabadalmi bejelentésre a

továbbiakban hivatkozunk.

Egy további anyagkeverék, ami a tapasztalatok szerint alkalmazható a jelen találmány szerint, az inozin pranobex, vagy izoprinozin. Az inozin pranobex, ami inozin és DIP-PacBa 1:3 mól-arányú keveréke, a tapasztalat szerint in vitro fokozza a neuritogenezist és a neurotróp tényezők hatását. A jelen találmánynak a fentiekben említett különböző megvalósítási példái szemléltetik annak az elvnek az alkalmazhatóságát, amely elv szerint különféle purin-származékok segítségével módosíthatók a sejtbeli és idegi tevékenységek, a szénmo-noxidfüggő guanilil-cikláz rendszer módosításán keresztül.

A jelen találmány példaként szereplő, kedvező megvalósításában a sejteket vagy idegeket az AIT-082 vegyülettel, vagyis 4-[ 3-(1,6-dihidro-6-oxo-9-purin-9-il)-1-oxo-propil] -amino benzoesavval kezeljük. Amint azt a koráb-biakban említettük, az AIT-082 vegyület a hipoxantin purinvázas vegyület különleges származéka, ami para-amino-benzoesav csoportot tartalmaz. Orális beadás után gyorsan felszívódik, és - miután átlépte a vér-agy gátat - változatlan formában kerül az agyba. 30 perccel az orális adagolás után 3,3 ng/mg agyszövet koncentrációban mutatható ki. Az AIT-082 vegyület kiváltja természetesen előforduló, genetikailag kódolt molekulák, például a hém oxigenáz és neurotróp tényezők in vivő genetikai kifejezését. Ennek eredményeképpen a jelen találmány szerint ki lehet váltani ezeknek a vegyületeknek a közvetlen eljuttatását a kezelt sejtekhez, és lehetséges az ezekkel összefüggő metabolikus folyamatok, és a megfelelő fiziológiás hatások serkentése. E vegyület, ha egymagában adagoljuk a sejttenyészetekhez, serkenti az ideg-nyúlványok kinövését az • · • · · · • · · · · · · • · · ··· ··· · • · · · · · · • · · · · ··· · ··· idegsejtekből, továbbá fokozza a neurotróp tényezők, mint például az idegi növekedési tényező (nerve growth factor, rövidítése NGF) neurit-képződésre gyakorolt hatását. Ami ennél is fontosabb, az AIT-082 fokozza a memória működését idős, csökkent memóriájú egerekben, akár intraperitoniális (az emésztőrendszert megkerülő), akár orális adagolás esetén.

Az AIT-082 neurotogenetikus hatását a hemoglobin, a metilénkék, és a ZnPP gátolja, melyek valamennyien CO-megkötő molekulák, de nem gátolja a CuPP, vagy más, a nitrogén-monoxid szintézisét gátló molekulák. Ismert neurotransz-mitterekkel és neuromodulátor receptorokkal végzett in vitro szűrővizsgálatok nem mutattak aktivitást. A ZnPP úgy is ismert, mint a hém oxigenáz I enzimet gátló molekula, ami lehetővé teszi ezen, példaként szereplő guanilil-cikláz módosító purin-származék hatóhelyének azonosítását. A hém oxigenáz ismert hősokk fehérje (sztressz-fehérje). A hősokk-fehérjék bizonyítottan szabályozzák a sejtekben található fehérjék konformációját, sejtek közötti szállítását, és lebontását. Résztvesznek a sejtek reprodukciós képességének a sztressz alatti fennmaradása biztosításában is. Egyes szakemberek szerint lehetséges, hogy

Alzheimer-kórban szenvedő betegek agyában a rendellenesen hajtogatott fehérjék fokozott kiválásának és a sejtek pusztulásának az egyik kiváltó tényezője a hősokk-fehérjék csökkent koncentrációja, vagy csökkent aktivitása. ílymódon, az AIT-082 vegyületnek az a tulajdonsága, hogy az élő szervezetben kiváltja a hém oxigenáz termelését, bizonyítja a jelen találmány hatását számos sejtbeli védekező folyamatra, és jelzi a jelen találmány alkalmazhatóságát szívroham és agyvérzés • · • · ···· ··· · • · · · ♦ · · • · · · · ··· · ···· kezelésére, az egyéb kóros tünetegyüttesek kezelésén túl.

Az itt következő példák, az oltalmi kör szűkítése nélkül, méginkább megvilágítják a szakemberek számára a jelen találmány lényegét. E kísérleti példák hivatottak szemléltetni purin-származékoknak a jelen találmány elveivel összhangban lévő azonosítását, jellemzését és felhasználását.

1. PÉLDA

AZ AIT-082 VEGYÜLET KONCENTRÁCIÓJA EGÉR PLAZMÁBAN

Felnőtt C57BL/6 egereknek az AIT-082 vegyület 30 mg/kg-os dózisát adtuk be intraperitoniálisan, sóoldatban. Az állatokat az AIT-082 beadása utáni 30., 45., 60. és 90. percben dekapitáltuk. A vért heparinizált csövekben gyűjtöttük, összekeverés után 15 percig 2000 fordulat/perc sebességgel centrifugáltuk. A plazma felülúszót elválasztva, a meghatározás előtt -70 °C hőmérsékleten tároltuk. A plazma és az agyszövet AIT-082 tartalmának analitikai meghatározására nagynyomású folyadékkromatográfiás rendszert fejlesztettünk ki. A kidolgozott meghatározási módszer számos, rokon szerkezetű purin-származék molekula jelenlétében szelektív az AIT-082 vegyületre nézve. A módszer érzékenysége 0,1 mikrogramm AIT-082 vegyület 1 ml plazmában, és 0,1 mikrogramm AIT-082 vegyület egy milligramm agyszövetben (nedves súly).

Ezen meghatározások eredményeit az A. táblázat tartalmazza, grafikus megjelenítésük pedig az 1. ábrán látható, ahol az AIT-082 vegyület plazmabeli koncentrációit tüntettük fel a 30 mg/kg AIT-082 vegyület C57BL/6 egereknek való intraperitoniális beadása utáni 30., 45. 60. és 90. percben. Az AIT-082

vegyület plazmabeli komcentrációja az adatok alapján becsülve kb. a 45. percben éri el a maximális értéket, és a vegyület plazmából való kiürülésének felezési ideje kb. 12 perc, a sebességi állandó k_eg = 3,45 h^-1 értékével.

A. táblázat

Az AIT-082 vegyület koncentrációja a plazmában Idő (perc)_Koncentráció (jj.g/ml + hiba)

15	42 ±	6
30	108 ±	13
45	437 ±	131
60	86 ±	24
90	20 ±	12
	2. PÉLDA

AZ AIT-082 VEGYÜLET ÁTJUT A VÉR-AGY GÁTON Két, az AIT-082 vegyület 30 mg/kg dózisával kezelt állat agyszövetét vizsgáltuk, a beadás után 30 perccel. Az agyakat gyorsan eltávolítottuk, és jéggel hűtöttük. Az agyi szöve-teket boncolással szétválasztottuk kéregállományra és egyéb szövetekre. Az agyszövetet (kb. 250-300 mg nettó súly) 5,0 ml sóoldatban, Brinkman Polytron szövetmalommal homogenizáltuk, és a meghatározás előtt -70°C hőmérsékleten tároltuk. Az agy homogenizátumokat Gelman Acrodísc szűrőkön való ultra-szűréssel fehérje-mentesltettük; először 1,2 mikronos, majd 0,2 mikronos szűrőn. Az így kapott mintából a fentebb leírt vizsgálat elvégzéséhez 30 μΐ-t fecskendeztünk a nagynyomású folyadékkromatográfba. A kalibrációs görbét úgy készítettük,

···· ·· hogy kezeletlen állatokból származó agyhomogenátumokhoz az AIT082 vegyület ismert mennyiségét adtuk. Az agyszövet vizsgálati eredményei szerint mindkét állatból származó agy-kéreg mintákban és a többi agyszövet mintáiban egyaránt kimutatható az AIT-082 vegyület. Az eredményeket közvetlenül mutatja az itt következő B. táblázat.

B. táblázat

Az AIT-082 vegyület koncentrációja az agyi szövetekben

Minta	Az agyi	Az agyi	Az AIT-082
vegyület	terület	minta	koncentrációja
száma		súlya (mg)	(ng/mg agyszövet)
S3	agykéreg	181	2,8
S3	többi rész	153	3,3
S4	agykéreg	146	3,4
S4	többi rész	217	2,3

Ez a kísérleti bizonyíték az AIT-082 vegyület jelenlétére az agyszövetben, a kezelés után 30 perccel, alapvető fontosságú, mivel azt mutatja, hogy az AIT-082 vegyület bomlás nélkül átjut a vér-agy gáton.

3. PÉLDA

AZ AIT-0882 VEGYÜLET KÖLCSÖNHATÁSBA LÉP A KOLINERG RENDSZERREL Tekintettel arra, hogy Alzheimer-kórban szenvedő betegek hippokampuszában a kolinerg idegsejtek komoly hiánya figyelhető meg, jelentős érdeklődés mutatkozik olyan vegyületeknek a

···· »· ·· memóriára gyakorolt hatása iránt, amelyek megváltoztatják a kolinerg rendszer működését. Azt a feltételezést, hogy az emlékezet mechanizmusa összefügg a kolinerg rendszerrel, megerősítik agyi sérülésekkel kapcsolatos vizsgálatok, vagy az agyvérzés modellje. Tapasztalatok szerint a hippokampusz CAl területének sérülései különösen lerontják az emlékezet működését. Az agyvérzés modelljében valamelyik agyi verőér (30 percig tartó) elzáródása veszteségeket okoz különösen a hippokampusz CAl területén levő sejtekben, valamint az emlékezet működésében. Ezekkel a modellekkel kapcsolatban azt tapasztalták, hogy például időskorú patkányoknál a fizosztigmin, egy kolinészteráz enzim gátló anyag, javítja az emlékezetet. Kimutatták, hogy a THA (takrin) , ami szintén fokozza a kolinerg működést, javítja az emlékezetet időskorú majmoknál. Az a megfigyelés, hogy az AIT-082 vegyület általánosságban ugyanolyan módon javítja az emlékezetet, mint a fizosztigmin és a THA, felveti azt a kérdést, hogy az AIT-082 vegyület befolyásolhatja a kolinerg rendszert.

Az AIT-082 vegyület emlékezet javító mechanizmusának felderítése céljából megkíséreltük, hogy gátoljuk a hatását olymódon, hogy egereknek egyidejűleg a rövid távon ható kolinerg antagonista atropint adagoltuk, majd egyszerű tanulási próbáknak vetettük alá azokat. Irodalmi adatok szerint az atropin képes gátolni a fizosztigmin és a THA hatását. Egereknek 4 napon keresztül 30 mg/kg AIT-082 vegyületet adtunk be, 2 órával a tanulási próbák előtt. Atropint (0,5 mg/kg dózis) 1/2 órával a tanulási próbák előtt, vagy 1,5 órával az AIT-082 vegyület beadása előtt adagoltunk, kizárólag a 3. napon. Valamennyi ··· · ·· ·· • » · · · • ··· ·»· · • « · · · ··· · ···· injekciót intraperitoniálisan adtuk be. Miután egy ellenőrző kísérletben az egerek megtanulták, hol van elhelyezve a jutalom egy labirintus T-elágazásában, a megismételt kísérletben meghatároztuk, mennyire emlékeznek a jutalom elhelyezésére. A helyes válaszok százalékos arányát szemlélteti grafikusan a 2.

ábra.

A 2. ábra azt bizonyítja, hogy az atropin a 3. napon gátolta az AIT-082 vegyület emlékezet javító hatását, továbbá ez a hatás átmeneti, mivel a 4. napon, amikor atropint nem adtunk be, az AIT-082 emlékezet javító hatása ismét megjelent.

4. PÉLDA

AZ AIT-082 VEGYÜLET HATÁSA AZ ACETILKOLIN RECEPTOROKRA

Az AIT-082 vegyület és az acetilkolin receptorok kölcsönhatását QNB (3-kinuklidinil benzilát) egér szövetekben kötődését zavaró hatása meghatározásával állapítottuk meg,

Fields módszerét használva [ J. Bioi. Chem. 253(9), 3251-3258,

1978] . Ebben a kísérletben az AIT-082 vegyület nem mutatott hatást.

E vizsgálat során az egereket 30 mg/kg AIT-082 dózissal való kezelésük után 2 órával dekapitáltuk, és a szöveteket az acetilkolin receptorokat tartalmazó memrán kinyerése céljából feldolgoztuk. Amikor ezekkel a szövetekkel in vitro végeztük el a meghatározásokat, az AIT-082 vegyületnek semmilyen hatása nem volt a QNB affinitására (Kd), ha az AIT-082 adagolásának körülményei ugyanazok voltak, mint az emlékezetre gyakorolt hatásának vizsgálatakor. Változott a receptorok száma (B max) az agykéregben és a corpus striatumokban, a kéregben kevesebb, « · » · · • · · · · a corpus striatumokban több acetilkolin kötőhely volt. Ezek az adatok összhangban vannak azzal a feltevéssel, hogy az AIT-082 vegyület az állatoknak való beadása következtében az agykéregben mennyisége.

növekszik a receptorokra jutó molekulák A növekvő ligandum-koncentráció jellegzetes eredménye a receptorok számának csökkenése irányába ható szabályozás.

5. PÉLDA

AZ AIT-082 VEGYÜLET HATÁSA A RECEPTOR - LIGANDUM KÖTŐDÉSRE

IN VITRO

Értékeltük az AIT-082 vegyület gátló hatását ligandumok kötődésére, 38 elválasztott receptoron. A szűrővizsgálatba bevont receptorok és ligandumaik a következők:

Adenozin

Aminosavak:

Excitáns (serkentő) aminosavak (glicin, kainát, MK-801, NMDA, PCP, kviszkalát és szigma);

Gátló aminosavak (benzodiazepin, GABA-A, GABA-B és glicin)

Biogén aminok (dopamin-1, dopamin-2, szerotonin-1, szerotonin-2)

A kálcium-csatorna fehérjéi (nifedipin, omegakonotoxin klorid, kálium);

Fehérje tényezők (ANF, EGF, NGF)

Fehérjék: (angiotenzin, arg-vazopresszin-Vl és V2, bombezin, központi és perifériás CCK, neurotenzin,

NPY, szomatosztatin, substance K, substance P, VIP) ·· · · « · · · • · · ··· ··« _# • * · * · · · ·*· ·· ··· , ····

Második messzendzser rendszerek:

Adenil cikláz

Fehérje kinéz (fórból észter és inozitol trifoszfát)

A kísérleteket szerződés alapján a Nova Labs (Baltimore,

MD) cég végezte. Az AIT-082 vegyület az elvégzett in vitro kísérletek egyikében sem mutatott aktivitást.

Ennek megfelelően, bár az AIT-082 vegyület a kolinerg idegrendszer által hat (atropin gátolja a hatását), olyan a hatásmechanizmusa, ami nem tartalmazza az acetilkolin receptorokkal való közvetlen kölcsönhatást. Fontos megjegyezni, hogy az AIT-082 vegyület in vitro nem kötődik az adenozin receptorhoz.

Értékeltük az AIT-082 vegyület hatását egy sor pszichofarmakológiai teszten, amiket azzal a céllal állítottunk össze, hogy a vegyület központi idegrendszerre gyakorolt hatását minél teljesebb mértékben felderíthessük. Az alkalmazott tesztek között volt:

(a) motoros koordináció, gyorsuló Rota-Rod taposómalommal, (b) felderítő és home cage (lakókalitka) lokomotoros aktivitás, a Stoelting-féle aktivitás monitorral, (c) anxiolitikus (feszültség csökkentő) aktivitás, felemelt Plus labirintussal, és (d) fájdalomérzékelés.

Az AIT-082 vegyület hatását összehasonlítottuk szabványos összehasonlító gyógyszerekével.

MM «» • » *·· «·ν.

6. PÉLDA

AZ AIT-082 VEGYÜLET FOKOZZA A MOTOROS KOORDINÁCIÓT EGEREKBEN A motoros koordinációt egereknek készült gyorsuló Rota-Rod (forgó rudas) taposómalommal mértük (Ugo Basile Co. ) . A sóoldattal vagy a gyógyszerrel kezelt egereket a kezelés utáni különböző időpontokban a Rota-Rod készülékre helyeztük, ami 5 perc alatt gyorsul maximális sebességre. Az alábbiakban bemutatott C. táblázatban tüntettük fel azt az időtartamot másodpercekben,amennyi idő elteltével a kísérleti alany leesett a próbapadról. Mindegyik állattal háromszor végeztük el a kísérletet, és az időtartamok középértékét jegyeztük fel.

··»· ., ,, • · · · ♦·· ··» · • · · · ··· · <-··«

C. táblázat

Az AIT-082 vegyület hatása a Roto-Rod készüléken mért teljesítményre

082 adagolás	Idő
(mg/kg)	(mp)
Kontroll	123+64
0,005	162+93
0,005	207*±73
0,5	184* ±76
30,5	187*±68
60,0	229*+80

*p<0,05, t-próba a kontroll csoporttal szemben

Az AIT-082 vegyülettel kezelt kísérleti alanyok motoros koordinációja javult, mivel hosszabb ideig tudtak fennmaradni a rotorod készüléken, mint az összehasonlító (sóoldattal kezelt) csoport tagjai, vagy a kis adaggal (0,005 mg/kg) kezelt alanyok.

7. PÉLDA

AZ AIT-082 VEGYÜLET NEM GÁTOLJA A FELDERÍTŐ AKTIVITÁST

A felderítési viselkedés mérésére a kísérleti alanyokat sóoldattal vagy AIT-082 vegyülettel kezeltük, egy új konstrukciójú, nagyméretű (25 hosszú, 48 cm széles, 16 cm magas) ketrecbe helyeztük őket, és 30 percen keresztül egyperces időközönként mértük mozgásaikat. A nagyméretű ketrec (San Diego Instruments, San Diego, California) függőleges irányú érzékelőkkel volt ellátva, és a hátrafelé irányuló mozgásokat is rögzítettük. A felderítő jellegű aktivitásra ······ • · · · · • ···· · · · · • · · · · · « ·· ··· · · · · · nézve semmilyen hatást nem figyeltünk meg, ami azt jelzi, hogy a kísérleti alanyok képességei nem csökkentek.

8. PÉLDA

AZ AIT-082 VEGYÜLET NEM GÁTOLJA A LOKOMOTOROS AKTIVITÁST A home cage lokomotoros aktivitás mérésére a lakóketrecet egy aktivitás monitor (Stoelting Instruments) lemezére helyeztük. A home cage lokomotoros aktivitási mozgásokat 15 percen keresztül, egyperces időközönként rögzítettük. A kísérleti alanyokat sóoldattal vagy AIT-082 vegyülettel kezeltük, és visszahelyeztük ketreceikbe. Az injekció beadása után tíz perccel a lakóketreceket elhelyeztük az aktivitás monitor lemezére. A lakóketrec lokomotoros aktivitással kapcsolatos mozgásokat 30 percen keresztül jegyeztük fel, egyperces időközönként. Az első öt percben figyeltük és feljegyeztük a környezet felderítésével kapcsolatos mozgásokat is.

Az eredményeket az alábbi, D. táblázatban mutatjuk be.

• · · · • · ···· ··· · • · · · · · ·

............

D. táblázat

Az AIT-082 vegyület hatása a lokomotoros aktivitásra

AIT-082 adag _Mozgások (középértékíeltérés)

(mg/kg)	Gyógyszer előtt	Gyógyszer után	Különbség
Kontroll	1633Í434	1385Í492	248Í492
0,005	1884Í230	1375Í563	509Í429
0,05	1718Í606	1508Í456	209Í430
0, 5	1610Í349	1320Í689	290Í435
30, 0	1440+264	1098Í189	342Í267
60, 0	1690+223	634*+223	1056+154
*p<0,05, t	-próba a kontroll	csoporttal szemben
Amint	az a D. táblázat	adataiból látszik, a	magas dózisnál
(60 mg/kg)	könnyebben hozzászokhattak környeze	-tűkhöz, és az
AIT-082 vegyülettel való	kezelés után kevesebb mozgást
mutattak.	Egyéb hatást nem	figyeltünk meg.
		9. PÉLDA

AZ AIT-082 VEGYÜLET LÉNYEGESEN NEM FOKOZZA AZ AGGÓDÁST Plus labirintust készítettünk fekete plexiüvegből, ami egymással szemben lévő két nyitott ágból (30 cm hosszú, 5 cm széles) , és egymással szemben lévő két zárt ágból állt (30 cm hosszú, 5 cm széles, 15 cm magas) . A zárt ágak falai tiszta plexiüvegből készültek, és a négy ágat egy 5x5 cm-es központi terület kapcsolta össze. Az egész Plus labirintust a padló szintje fölött 38 cm-re lévő lapra helyeztük. A próba abból állt, hogy a kísérleti alanyokat az egyik nyitott ág egyik végére helyeztük. Feljegyeztük azt az időt, ami alatt az állat ·· ···· ·· • · · « • ···· ··· • · · · · • · · · · · elhagyta a kiindulási helyzetet (a nyitott ág első tíz cm-ét). Feljegyeztük ezenkívül azt az időt, ami alatt az állat félútig jutott el a zárt ágak egyikében. Amikor a kísérleti alany eljutott a zárt ág felezőpontjába, megkezdődött a három percig tartó kísérleti szakasz. A három perces kísérleti szakasz alatt feljegyeztük, hogy az állat hányszor lépett be a nyitott ágakba. A belépést úgy határoztuk meg, hogy legalább két mancsát a nyitott ág lemezére helyezte. Az AIT-082 vegyület enyhe aggódáskeltő hatását figyeltük meg 30 mg/kg-os dózisban, de ez a hatás sem a nagyobb dózisnál (60 mg/kg), sem a kisebb dózisoknál (0,005 - 0,5 mg/kg) nem volt megfigyelhető.

10. PÉLDA

AZ AIT-082 VEGYÜLET NEM HAT A FÁJDALOMÉRZÉKELÉSRE Az egereket 55°C hőmérsékletű elektromos főzőlapra (Omnitech) helyeztük, és mértük azt a késlekedés! időt, amiután az állat megnyalta hátsó mancsát. Ha 45 másodpercig nem reagált, a kísérletet befejeztük. Ezen a teszten az AIT-082 vegyület hatástalan volt.

11. PÉLDA

AZ AIT-082 VEGYÜLET NEM MÉRGEZŐ Az AIT-082 vegyület patkányon és egéren végzett előzetes akut toxicitási (heveny mérgező hatásra való) vizsgálata bizonyította, hogy orális vagy intraperitoniálís adagolás mellett az LD5Q értéke nagyobb, mint 3000 mg/kg. Az AIT-082 vegyület értékelése a Panlab Általános Farmakológíai Szűrővizsgálati Programja (Panlabs, 11804 North Creek Parkway • · · · « · ···· ··· · • · · · · · · ··· ·· ··· · · · · ·

South, Bothwell, Washington 98011) szerint történt, és a cég 79 különböző tesztrendszerének szabványos eloszlásai szerint mérve a vegyület semmilyen toxicitást nem mutatott.

Az AIT-082 vegyület kémiai szerkezetének természete alapján nem várható, hogy a vegyület mérgező metabolitokká alakuljon.

Öszefoglalva, az AIT-082 vegyület pszichofarmakológiai vizsgálata során, az egyetlen dózisban észlelt enyhe aggodalomkeltő hatástól eltekintve nem figyeltünk meg káros hatásokat. Egy dózis-tartományban (0,05 - 60 mg/kg) fokozza a motoros koordinációt (roto-rod teszt), és egyetlen dózisnál (60 mg/kg) esetleg tanulást vagy megszokást fokozó hatása van.

Ennek a példabeli vegyületnek a pszichofarmakológiai jellemzését követően további vizsgálatokat végeztünk a jelen találmány neurogén hatásainak bizonyítására.

12. PÉLDA

AZ AIT-082 VEGYÜLET ELŐSEGÍTI A NEURITEK KÉPZŐDÉSÉT PC12

SEJTEKBEN

A jelen találmány szerinti vegyületek jellemzésére végrehajtott munka nagy részében PC12 sejteket használtunk. Ezek a sejtek a patkány pheochromocitomából származnak, és ha NGF jelenlétében tenyésztjük, neuriteket fejlesztenek, megszűnik a sejtosztódás, és a szimpatikus neurinok számos jellemzőjét mutatják. Ha az idegi növekedési tényező hiányában tenyésztjük, kevés PC12 sejtnek van egy sejtátmérőnél nagyobb neuritja. Ha 48 órán keresztül telítési koncentrációjú NGF-t adunk a tenyészethez, ez a sejteknek kb. 20-35%-ában serkenti a • · · · • · · neurit képződést. Tekintettel arra, hogy ezek az idegsejtszerű sejtek homogén populációját képezik, ami nem szennyezett asztrocita típusú sejtekkel, ezeken a sejteken tanulmányozni lehet a purin-vázas vegyületek közvetlen hatását a neuritképződésre.

A jelen találmány példái szerinti vegyületeknek az idegi tevékenységre gyakorolt hatásának bemutatása céljából előállítottuk az AIT-082 vegyület dózis-hatás görbéjét, mérve a PC12 sejtekben a neuritképződés serkentését. A 1,5% lószérumot és 1,5% szarvasmarha embrió szérumot tartalmazó RPMI 1640-ben tenyésztett sejteket átoltottuk poliornitinnal bevont, 24üreges tenyésztőlemezekre (22,5xl0⁴ sejt/üreg). Az egyes tenyészetekhez közvetlenül az oltás után AIT-082 vegyületet és NGF-t adtunk. 48 óra múlva eltávolítottuk a közeget, és a sejteket azonnal rögzítettük 10% formaiinban és PBS-ben, 10 percig. A sejteket és a neuriteket a rögzítéstől számított 2 napon belül megszámláltuk.

A neurit meghatározása szerint olyan sejtkinövés, amely a sejttől legalább egy sejtátmérőnyi hosszúságban nyúlik ki, és csúcsán növekedési kúp található. Minden egyes kezelésnél a mikroszkóp két reprezentatív területén végeztük a számlálást, azonos kezelést kapott 6 testvér-tenyészetben. A neurittal rendelkező sejtek arányát az üregenként! összes megszámlált sejt száma, (közelítőleg 100 sejt) és az üregekbeli, neurittal rendelkező sejtek száma felhasználásával határoztuk meg. Ezután minden egyes kezelésre meghatároztuk a középértékeket (± sztenderd mérési hiba). Az összehasonlítás megkönnyítése céljából a neuritképződést azon neurittal rendelkező sejtek • · · százalékos arányára vonatkoztatva fejeztük ki, melyek kizárólag NGF jelenlétében keletkeznek (NGF=100%). A vegyületek NGF jelenlétében, illetve anélkül kifejtett hatásait a Tukey-féle szignifikancia tesz felhasználásával, szórás-analízissel hasonlítottuk össze.

Az eredményeket a 3. ábrán mutatjuk be, ahol a görbe az AIT-082 vegyület különböző koncentrációit jelenti, 2,5 S NGF telítési koncentrációja mellett (40 ng/ml). A középső, vízszintes vonal képviseli a kizárólag 40 ng/ml koncentrációjú NGF jelenlétében tenyésztett sejtek összehasonlító értékeit. A felső és alsó vízszintes vonal az NGF-vel végzett meghatározások megbízhatósági határait jelölik, amit szabványos statisztikai módszerekkel határoztunk meg.

Amint a 3. ábrán látható, PC12 sejtekben az AIT-082 vegyület már kis koncentrációkban is (lpmól) serkenti a neuritképződést, és fokozza a NGF által kiváltott neurit-képződést.

Az adatok elemzése alapján megállapítható, hogy az AIT-082 vegyület a PC12 sejtekbeli neurit-képződés serkentésében ugyanolyan hatásos, mint a NGF, és a NGF legkedvezőbb hatását

30%-kal fokozza. Amint azt az alábbiakban, az összehasonlítás céljából, részletesebben tárgyalni fogjuk, az inozin és a hipoxantin hatása PC12 sejtek NGF-kiváltotta neurit-képződésére - bár alacsonyabb, 30-300 nm koncentrációban - gyenge. A guanozin az AIT-082 vegyülethez hasonló, jelentős hatással bír, de nagyobb, 30-300pmól koncentrációban.

13. PÉLDA

GÁTLÓ ANYAGOK HATÁSA AZ AIT-082 VEGYÜLET ÁLTAL KIVÁLTOTT

NEURIT-KÉPZŐDÉSRE

Az öregedéssel összefüggő emlékezet-romlást kapcsolatba hozzák az NGF-függő, alapvető előagyi idegek számának csökkenésével. Ez az állapot javítható NGF intracerebroventikuláris (az agyüregbe adott) infúzió alakjában való adagolásával. Vizsgáltuk az AIT-082 vegyületnek a neurit-képződésre gyakorolt hatását magában, valamint NGF-vel együtt adagolva, a 12. Példa szerinti kísérleti elrendezésben. Az AIT082 hatásmechanizmusának felderítése céljából elvégeztünk egy kísérletsorozatot, amelyben gátló hatású anyagok segítségével blokkoltunk, vagy módosítottunk meghatározott biokémiai folyamatokat. A kísérletsorozatban szereplő valamennyi sejttenyészet optimális dózisban tartalmazott NGF-t (40 ng/ml), úgyhogy az AIT-082 vegyületet nem tartalmazó sorozat képviselte a gátló anyagok hatását az NGF aktivitására. Bizonyos kísérletekben, ahol külön jelezzük, az AIT-082 vegyületet a jelenlegi ismereteink szerinti optimális, 10 pg/ml-es dózisban adagoltuk. Három szelektív gátló anyagot használtunk.

Ezeknek a vizsgálatoknak az eredménye az alábbi, E. táblázatban látható, és a 4A, 4B és 4C ábra grafikusan szemlélteti azon sejtek részarányát, amelyek a jelzett körülmények között, 48 órás tenyésztés után neuritokat tartalmaztak. Az alapvonalnak megfelelő érték azon sejtekre vonatkozik, amelyeket NGF vagy AIT-082 vegyület nélkül tenyésztettünk.

E. táblázat

Az AIT-082 vegyület, és szelektív inhibitorok hatása a neurítképződésre önmagukban, és NGF-el együtt adagolva • · ···· · · ·« • · · · · · • · ··· ··· · • · · · · · ·* ··· · ····

Inhibitor	Koncent-	csak	csak	AIT-082 +
	ráció	AIT-0821	NGF	NGF
Semmi		0,2±0,02	0,2±0,02	0,26±0,01
methemoglobin	0		0,2±0,02	0,26±0,01
	1 μπιόΐ		0,2±0,02	0,17±0,02
metilénkék	0		0,2±0,02	0,26+0,01
	5 μιηόΐ		0,24+0,02	0,10±0,01
Zn protoporfirín 0		0,20±0,02	0,26+0,01
IX	5 μπιόΐ		0,22±0,02	0,13±0,01

¹Neuritot tartalmazó sejtek részaránya

A methemoglobin (MHb) megköti és eltávolítja a nitrogén-monoxidot (NO) és a szénmonoxidot (CO) a tenyészetek közegéből. Az MHb nem hat az NGF aktivitására, de gátolja az AIT-082 vegyület hatását, ami azt jelenti, hogy vagy a nitrogén-monoxid, vagy a szénmonoxid szerepel az AIT-082 vegyület hatásmechanizmusában.

A metilénkék (MB) gátolja az oldható guanilil ciklázt, a gyűrűs GMP-ot (guanozin-monofoszfát, cGMP) termelő enzimet. A cGMP, amint azt a korábbiakban tárgyaltuk, olyan, a sejteken belül megtalálható anyag, amely résztvesz az idegi impulzus továbbításának második messzendzser rendszerében. A metilénkkék nem hat az NGF aktivitására, de gátolja az AIT-082 vegyület hatását, ami arra utal, hogy az AIT-082 vegyület hatásmechanizmusában szerepel a guanilil-cikláz.

A cink protoporf irin IX (ZnPP) a hém oxigenáz II (HO) inhibitora, ami viszont CO termelő. A ZnPP-nek nincs hatása az

NGF aktivitására, viszont gátolja az AIT-082 vegyület hatását. Ez a megfigyelés az AIT-082 vegyület egyik lehetséges ható helyére utal, ami a HO képződésében szerepel. Jelenti továbbá azt is, hogy az AIT-082 vegyület hatásmechanizmusa során szénmonoxid keletkezik. Ezek az eredmények a jelen találmány számos fontos vonatkozását és jellemző vonását jelzik.

Amint azt korábban említettük, a HO hősokk (sztressz) fehérje. Ezek a fehérjék jelenlegi ismereteink szerint szerepelnek abban a védekező mechanizmusban, ami sztressz alatt szükséges a sejtek életképességének fenntartásához (lásd például Georgopoulos, C. és W. J. Welch, Role of the major heat shock proteins as molecular chaperons, A legfontosabb hősokk fehérjék szerepe, mint molekuláris kísérők, Annu. Rév. Cell Bioi., 9, 601-634, 1993). Azontúl, hogy szabályozzák a sejteken belüli fehérjék megjelenését, sejten belüli szállítását és lebomlását, a HO erőteljesen érintett azoknak a lehetséges antioxidáns vegyületeknek a termelésében, amelyek a hémnek éppen a HO enzimaktivitása által kiváltott - bomlásakor keletkeznek.

Emlősök szöveteiben a biliverdin és a bilirubin, e védő antioxidáns epesavak egyetlen forrása a HO által lebontott hém. Jelentős bizonyítékokkal rendelkezünk arra nézve, hogy ezek az epesavak fontos szerepet játszanak a sejteken belüli antioxidáns védekező mechanizmusban [Stocker, P., és mások,

Bilirubin is an antioxidant of possible physiological imporance, A bilirubin antioxidáns tulajdonságának lehetéges élettani jelentősége. Science, 235, 1043-1047 (1987)] . Ezenfelül, a HO megtalálható az agyban, és ismert, hogy kon45

centrációja hősokkot követően nagymértékben nő [ Ewing, J. F.,

S. N. Haber, and M. D. Maines, Normál and heat-induced patterns of expression of heme oxygenase-1 (HSP32) in rat brain: hyperthermia causes rapid induction of mRNA and protein, A hém oxigenáz kifejezésének normális, és hő által kiváltott formája a patkány agyában: a túlmelegedés az mRNA és a fehérje gyors képződését okozza. J. Neurochem., 58, 1140-1149 (1992)] .

Ezzel a modellel összhangban, számos neurotrofin úgy fejti ki idegi védő hatását, hogy serkenti a szabad gyökök által okozott oxidativ sztressz és károsodás elleni belső védelmet.

[Williams, L. R., Oxidative stress, agerelated neurodegeneration, and the potential fór neurotrophic therapy, Az oxidativ sztressz, az öregedéssel összefüggő idegi elfajulás, és a neurotróf kezelés lehetősége, in Cerebrovasc. Brain Metab. Rév. 1995, Raven Press, Ltd.: New York, NY. p. 55-73. Mattson, Μ. Ρ., B. Cheng, and V. L. Smith-Swintosky, Mechanisms of neurotrophic factor protection against calcium and free radical-mediated excitotoxic injury: implications fór treating neurodegenerative disorders, A kálcium és szabad gyökök által kiváltót márgezéses sérülés elleni neurotróp tényezővel való védekezés mechanizmusai: lehetséges hatásai az idegi elfajulásai járó rendellenességek kezelésében. Exp. Neurol.,

124, 89-95 (1993)] . Tekintettel arra, hogy számos, idegi elfajulással kapcsolatos rendellenesség kóroktanában a sejtméreg szabad gyökök szerepét gyanítják, ésszerű az a következtetés, hogy jelen találmány lehetővé teszi a HO termelésének vagy aktivitásának serkentését, hogy ilymódon védő hatású antioxidáns anyagok keletkezzenek, amelyek megelőzik a

sejtek oxidatív szabad gyökök által kiváltott pusztulását, ezen mérgező, oxidáló hatású anyagok semlegesítésével vagy blokkolásával.

Jelenleg a szakemberek között elterjedt az a szemlélet, hogy az ALS, a Parkinson-kór és az Alzheimer-kór lehetséges kóroka a sejtek azon képességének csökkenése, hogy védekezzenek a szabad gyökök felhalmozódott sejtkárosító hatása ellen. Szakemberek kísérleteztek a gyakorlatban az ALS betegség neurotrofinokkal való kezelésével [DiStefano, P. S., Neurotrophic factors in the treatment of motor neuron disease and trauma, Neurotróp tényezők a motoros idegsejt betegség és sérülés kezelésében. Exp. Neurol., 124, 56-59 (1993). Thoenen, H., R. A. Hughes, and M. Sendtner, Trophic support of motorneurons: Physiological, patophysiological, and therapeutic implications, A motoros idegsejtek szövet-táplálkozása: élettani, kórélettani és terápiás vonatkozások. Exp. neurol., 124, 47-55 (1993)] . Tekintettel arra, hogy a jelen találmány lehetővé teszi ezen védő hatású vegyületeknek a szervezeten belüli előállítását, hatékony kezelést jelent az említett, és egyéb kóros sejtbeli állapotok esetén. Ez a védő hatás különösen fontos az idegsejtek kezelésében, mivel a legtöbb sejttől eltérően, amelyek sokféle védekező mechanizmussal rendelkeznek, mint például a magas glutation koncentráció, az idegsejtek nem rendelkeznek az antioxidáns anyagoknak ezzel a forrásával.

A jelen találmánynak az a jellemzője, hogy serkenti a HO aktivitását vagy termelődését, emlősökben legalább egy további fiziológiás előnnyel jár. Amikor a HO hatására a hém lebomlik • · · ·· *· · · · · • · · · • ···· · ·· • · ♦ · · • · · · · · bilirubin és biliverdin epesavakra, szénmonoxid is keletkezik, ílymódon a HO termelés és aktivitás a jelen találmány által lehetővé tett serkentése egyúttal azt a lehetőséget is jelenti, hogy elősegíthető a szénmonoxid sejteken belüli, in vivő termelése. A szénmonoxid az oldható guanilát cikláz enzim ismert aktiválója, és cGMP-függő mechanizmussal csökkenti a ér simaizom görcsét [ Graser, T., Y.P. Verderni-kov, and D. S. Li, Study of the mechanism of carbon monoxide induced endotheliumindependent relaxation in porcine coronary artery and vein, A sertés szívkoszorúér artériában és vénában bekövetkező, endotéliumtól (az ereket bélelő sejtréteg) független, szénmonoxid által kiváltott elernyedése mechanizmusának vizsgálata. Biomed. Biochim. Acta, 49, 293-296 (1990). Morita,

T., és mások, Smooth muscle cell-derived carbon monoxide is a regulator of vascular cGMP, A simaizom sejtjeiből származó szénmonoxid szabályozza a cGMP érrend-szerbeli mennyiségét. Proc. Natl. Acad. ci. USA, 1995. 92, 1475-1479 (1995)] . Újabban más kutatók bizonyították, hogy ha a HO gátlásával megszüntetik a szénmonoxid vérnyomáscsökkentő hatását, ennek eredményeképpen nő az emlősök vérnyomása [ Johnson, R. A. és mások, A heme oxygenase product, presum-ably carbon monoxide, mediates a vasodepressor function in rats, A hém oxigenáz enzim egyik terméke, valószínűleg a szénmonoxid értágító szerepe patkányokban. Hypertension, 25, 166-169 (1995)] . Ennek megfelelően ésszerű az a következtetés, hogy a jelen találmány által nyújtott lehetőség az in vivő szénmonoxid termelés fokozására, azonkívül, hogy fokozott antioxidáns védelmet • · ·te· · · · ·· • · te « · · • ···· · te · · • te te · · te ·· te te te · te te « te biztosít, csökkenteni fogja az emlősök vérnyomását. A szakirodalomban egyedülálló a jelen találmány által nyújtott azon lehetőség, hogy közvetlenül kiváltható a felsorolt, drámai fiziológiás hatásokat okozó, a természetben előforduló sejtbeli vegyületek ín vivő termelése.

14. PÉLDA

NITROGÉNMONOXID GÁTLÓ ANYAGOK HATÁSA AZ AIT-082 VEGYÜLETRE A nitrogén-monoxid a nitrogén-monoxid-szintetáz enzim (NOS) hatására képződik. Két vegyületről kimutatták, hogy szelektív módon gátolják a NOS működését: ezek az N-nitro-Larginin metil-észter (L-NAME), és az N-nitro-arginin (NOLA). E vegyületek különböző koncentrációit adagoltuk az AIT-0082 vegyülettel egyidejűleg, és a 12. Példa kísérleti elrendezése szerint mértük a neurit-képződést. Az L-ΝΆΜΕ adagolás eredményeit az F. táblázat, míg a NOLA adagolás eredményeit a

G. táblázat mutatja. Az alábbi két táblázat adatait grafikusan szemléltetjük az 5A és 5B ábrán.

Ν *» ··«· »· • · · · · • · ···· ♦ »· · • · · · * · · •·· «· ··· · *···

F. táblázat

L-NAME hatása a neurit-képződésre

az L-NAME	koncentrációja (ymól)
AIT-082	nulla	1-1 o	1,0	10, 0
0	0,246±0,017	0,246±0,027	0,257±0,013	0,251±0,013
10 μιηό 1	0,254±0,008	0,220±0,010	0,302±0,027	0,254±0,018
lOOumól	0,309±0,027	0,257+0,016	0,232+0,019	0,289±0,006

G. táblázat

A NOLA hatása a neurit-képződésre

		a NOLA	koncentrációj a	(μιηόΐ)
AIT-082	nulla	0,1	1,0	10,0
0	0,246±0,017	0,259±0,027	0,311±0,016	0,305±0,017
10 μιηόΐ	0,254±0,008	0,277±0,016	0,312±0,027	0,298±0,019
ΙΟΟμτηόΙ	0,309+0,027	0,279+0, 027	0,295+0,028	0,310+0,023

Amint az F. és a G. táblázat adataiból látható, egyik szóbanforgó NOS inhibitor sem gátolja az AIT-082 hatását a neurit-képződésre. Ezek az eredmények azt jelzik, hogy az AIT-082 vegyület hatásmechanizmusában a nitrogén-monoxid nem játszik szerepet.

• ·· ···· »· ♦· ····· · ·· « ' »««4 ··♦ « • « · · i » * ··· ·· ·«· · ♦·*

15. PÉLDA

AZ AIT-082 VEGYÜLET HATÁSA A PC-12 SEJTEKBELI cGMP

KONCENTRÁCIÓRA

A szénmonoxid-függő guanilil-cikláz módosítás bizonyítása céljából mértük az AIT-082 vegyület adagolása után a gyűrűs guanozin monofoszfát (cGMP) koncentrációját PC12 sejtekben. A PC-12 sejteket előzetesen 3 napon keresztül kondicionáltuk 40 ng/ml koncentrációjú NGF-vel, alacsony szérum-tartalmú közegben (1,5% lószérum + 5% borjú magzat szérum). A sejteket 40 ng/ml NGF-t tartalmazó, alacsony szérum-tartalmú közegben mérőlemezekre oltottuk, és 1 órán keresztül inkubáltuk (állandó hőmérsékleten tartottuk). A közeget alacsony arginin-tartalmú (80μιηό1) , szérum-mentes, és - ahol jeleztük - NGF-t és papaverint (ΙΟΟμιηόΙ) tartalmazó közegre cseréltük. A tesztvegyületeket a megjelölt időpontban adtuk a tenyészetekhez, és a reakciót 10,000 dpm ²H-cGMP-t tartalmazó, 5%-os TCA-val állítottuk le. A cGMP mennységét Maurice [Mól. Pharmacol. 37,

671-681 (1990)] rádioimmun meghatározásával mértük. A TCA-t aktív szénpor (5 g) hozzáadásával tisztítottuk, az elegyet Whatman #1 szűrőpapíron szűrtük. ílymódon eltávolíthatók a TCA azon szennyezései, amelyek egyébként zavarják a cGMP rádioimmun meghatározását (RIA).

A cGMP-ot a rádioimmun meghatározás előtt meg kellett tisztítani a cAMP-tól és más szennyezésektől, mivel ezek az idegen anyagok zavarhatják a meghatározást. Röviden, a TCA oldatot Dowex oszlopokra vittük (50W-8X, 200-400 szemcseméret) , és leoldottuk. Ezután minden egyes Dowex oszlop alá alumínium-oxid oszlopot helyeztünk. A cGMP-ot leoldottuk a ···· ·· · <» -, · ··«· w* • · · • ··· ··*>

* · · «<· ·· ··*

Dowex oszlopokról a semleges alumínium-oxid oszlopokba olymódon, hogy minden egyes Dowex oszlophoz 4 ml 0,05 mólos HCI oldatot adtunk. Ezután a semleges alumínium-oxid oszlopokat egymást követően 2 ml HCI oldattal, 4 ml vízzel, végül 0,2 mólos (6,2 pH-jú) nátrium-acetát oldattal öblítettük. A RIA méréshez a cGMP-ot 1 ml nátrium-acetáttal oldottuk le, 50-65% kinyeréssel. A cGMP meghatározását Dupont RIA készlettel végeztük. Az eredményeket grafikusan a 6. ábra mutatja be.

Amint az a 6. ábrán látható, az AIT-082 vegyület hozzáadása fokozza PC12 sejtekben a cGMP termelését, ami azt jelzi, hogy az AIT-082 vegyület a szénmonoxid-függő guanilil-cikláz enzim aktivitásának módosítása útján hat.

16. PÉLDA

AZ AIT-082 VEGYÜLET HATÁSA A mRNA NEUROTROFIN GENETIKAI

KIFEJEZÉSÉRE

Annak bizonyítására, hogy az AIT-082 vegyület kiváltja neurotrofinok, e természetes, genetikailag kódolt molekulák genetikai kifejeződését és ezáltal a sejtekbeli termelődését, továbbá fokozzák ezen molekulák aktivitását, a következő kísérletet végeztük el. Az mRNA neurotrofin képződését AIT-082, NGF, vagy mindkettő jelenlétében tenyésztett asztrociták northern biot elemzésével határoztuk meg. A sejtek begyűjtését és az RNA kivonását a kezelés után 24 órával végeztük.

Közelebbről, NIH Swiss egerek (Harlan) agykérgéből származó asztrocitákat választottunk el. Az eljárás röviden: 024 órás újszülött egereket lefejeztünk. Az agyakat steril körülmények között eltávolítottuk, és 20% hőkezeléssel inak• · · • · · tivált lószérumot (Hyclon) tartalmazó, módosított Dulbecco-féle közegbe (DMEM, teljes közeg) helyeztük. Ezután minden egyes agyi féltekéből kimetszettük a neopalliumot, amit 1 mm-es kockákra szeleteltünk.

Ezután az asztrocitákat mechanikus hasítással elválasztottuk. A kockákat maximális sebességgel 1 percig szuszpendáltuk. Ezután a sejt-szuszpenziót először 75 mm-es, majd 10 mm-es Nitex-rétegen (oszlopon) bocsátottuk keresztül. A keletkező sejt-szuszpenziót teljes közeggel annyira hígítottuk, hogy a teljes közeg minden 10 ml-e egy teljes agyat tartalmazzon. A hígított sejt-szuszpenziót 10 ml-enként lOOmmes Falcon szövet-tenyésztő lemezekre (Fisher) vittük. 3 nap múlva a közeget 10 ml frissen készült teljes közegre cseréltük, ezt követően a közeget hetente kétszer cseréltük, 10% hővel inaktivált lószérumot tartalmazó (növesztő közeg) közegre. Két hét tenyésztés után az asztrociták összefüggő, egy sejtből álló réteget képeztek.

Az RNA kivonása céljából az asztrocitákat tripszinnel emésztettük, ezután az asztrocitákat átoltottuk 100 mm-es, PORN-al bevont lemezekre, lemezenként 10® sejt sűrűséggel (10 ml növesztési közeg) . 2 óra múlva a megfelelő lemezekhez 10 mmólnyi PBS-t (foszfáttal pufferei sóoldatot), Guo-t vagy GNTPt adtunk. Az összes RNA-t a kezelés után 4 vagy 24 órával, kezelésenként 1,5x10? sejtből, TRIzol reagenssel gyűjtöttük össze, a szállító cég eljárása szerint (GIBCO BRL/Life Technologies, Inc.). A siót biot eljáráshoz az összes RNA-t Hybond-N szűrőkhöz kötöttük (Amrsham/United States Biochemicals), a Nukleinsavak és fehérjék átvitele és • · ···» immobilizálása S&S szilárd hordozókra (S&S módszer leírások:

Schleicher & Schuell, New Hampshire, USA). Minden egyes mintánál elvégeztük a northern biot vizsgálatot is, 10-20 mg összes RNA felhasználásával. Ezeket a mintákat formaldahidet tartalmazó 1% agaróz-gélen elektroforézisnek vetettük alá, és az S&S kísérleti elrendezés szerint Hybond-N szűrőkre vittük.

A foltokat p32-_rai jelzett cDNA (NGF, NT-3 és BDNF szondák) vagy oligonukleotid szonda (FGF-2) segítségével hívtuk elő, piperazin-N, N'-bisz-[ 2-etánszulf onsav] (PIPES) pufferben (50 mmól PIPES, pH 6,8; 50 mmól NaH2PC>4; 0,1 mólos NaCl; 5% nátrium dodecil-szulfonát és 1 mmól EDTA) egy éjszakán át, 50°C hőmérsékleten. Ezután minden egyes foltot kétszer mostunk (2X SSC, 0,1% SDS) mosópufferrel szoba-hőmérsékleten 20 percen át, majd kétszer (0,lX SSC, 0,1% SDS) mosópuf ferrel 52°C hőmérsékleten, 20-20 percen keresztül. Az IX SSC jelentése: 0,15 mól NaCl és 15 mmól nátrium citrát, pH = 7,0. A nedves membránokat Sárán védőburokkal takartuk, az autoradiográfiás mérést Hyperfilm-MP (Amersham/USB) filmmel, és intenzitás fokozó szűrőket tartalmazó kazettában hajtottuk végre. Minden egyes mintából különböző koncentrációkat (0,25 - 4 mg összes RNA) cseppentettünk fel és hívtunk elő, úgyhogy a mennyiségi meghatározás elvégzése előtt biztosítani lehetett, hogy a film feketedés - koncentráció válaszgörbéje lineáris legyen. A mennyiségi meghatározást MCID Image Ana-lysis (St.Catherine's, Ontario, Canada) végezte.

Szondákként az egér NGF gén pGEM.NGF(+) plazmádban kifejezett cDNA kiónját, az emberi NT-3 cDNA kiónját, és Bluescript-ben kifejezett BDNF-et izoláltunk. A cDNA szondákat • · · izolálás után -^^p-^Qpp-tai (ICN Biomedicals Canada, Ltd.) jelöltük, a Boehringer Mannheim Biochemica cég Random Prímed DNA Labeling Kit-je (Véletlenszerű jelzésen alapuló DNS Jelző Készlete) felhasználásával, az abban található leírás szerint.

Az FGF-2 szondájaként előállítottak egy 40-tagú, ellentétesen irányított oligonukleotidet (MOBIX, McMas-ter Universíty). Ez az egér FGF-2 mRNA-beli kódsorozata 5'- végének kiegészítő sorrendje. Ezt az oligonukleotidet az 5'-végén jelöltük, polinukleotid kináz, One-Phor-All puffer, a Pharmacia Biotech Inc. által szolgáltatott kísérleti elrendezés, valamint ATPgP³^ felhasználásával.

A négy különböző neurotróp tényező termelésével kapcsolatban elvégzett vizsgálat eredményei az alábbi, H.

táblázatban láthatók.

H. táblázat

Asztrocitákból származó neurotrofín mRNA-k northern biot

analízise
Neurotrofin mRNA	Kontroll	NGF 40 ng/ml	AIT-082 (lOOmmól)	AIT-082 (lOOmmól) + NGF (40 ng/ml)
NGF	-	+	++	+
FGF-2	+	-	++	+
BDNF	+	+	+	+
NT-3	-	-	++	+

Azokat a kísérleti körülményeket, amelyekben kimutatható mennyiségű neurotrofin mRNA keletkezett, + -al jelöltük. A ++ jelölés azt jelzi, hogy a kimutatható mennyiségnek • · · legalább a kétszerese van jelen. A negatív foltokat -al j elöltük.

Az eredmények azt mutatják, hogy az AIT-082 vegyület több neurotróp tényező, köztük az NGF mRNA-jának kifejeződését előidézi. Ami még fontosabb, ezeknek az adatoknak az alapján határozottan megállapítható, hogy az AIT-082 vegyület a jelen találmány elvei szerint kezelt emlősben szelektív és szabályozható módon kiváltja legalább egy természetes, genetikailag kódolt molekula in vívó genetikai kifejeződését. Amikor a példabeli purin-származékot adagoltuk, ez szelektív módon kiváltotta a négy azonosított neurotróp tényező közül három, az NGF, az FGF-2 és az NT-3 kód-mRNA-jának kifejeződését, de nem váltotta ki a BDNF mRNA-ja génkódjának aktiválását, vagy gátlás alóli felszabadítását. Ez a szelektív szabályozási lehetőség, azzal a könnyű beadhatósággal együtt, amit a jelen találmány szerinti vegyületek és módszerek biztosítanak, a korábban ismert nehézségek hatékony leküzdését teszi lehetővé. Ahelyett, hogy a hatóanyag molekulákat közvetlenül, bonyolult és potenciálisan veszélyes eljárásokkal juttatnánk el a sejtekhez, a jelen találmány szerint az emlős szervezet hagyományos, nem károsító hatóanyag adagolási módszerekkel kezelhető, amelyek előidézik a kezelt sejtekben a kívánt vegyületeket kódoló genetikai anyag kifejeződését, aminek eredménye a közvetlen, in vivő adagolás és a hatás helyére való eljuttatás. Bár a jelen találmány potenciálisan hasznos gén módosítási vagy más molekuláris biológiai eljárásokban is, a genetikai módosításra nincs szükség.

♦ · »·· ·

Korábban kimutatták, hogy Alzheimer-kórban szenvedő betegek hippokampuszában a gének kifejeződésének megváltozott a programja, aminek következtében a neurotróp tényezők mRNA koncentrációja kóros mértékű. Számos állatkísérlet és klinikai kísérlet során bebizonyosodott, hogy az idegi elfajulással kapcsolatos betegségek kezelésére egyes neurotrofinok adagolása nem hatásos. Ennek megfelelően, a jelen találmány szerinti vegyületeknek az a tulajdonsága, hogy a sejteken belül serkentik többféle neurotrofin-mRNA termelését, lényegesen növeli azt a lehetőséget, hogy sokféle idegi elfajulással kapcsolatos betegség kezelésében alkalmazhatók legyenek, mivel módszert biztosítanak arra, hogy a betegnek ezeket a természetes, genetikailag kódolt molekulákat hatásosan adagoljuk, az in vivő genetikai kifejeződésük kiváltásával.

A megelőző példák azt mutatják, hogy az AIT-082 vegyület önmagában in vitro serkenti PC12 sejtekben a neurit-képződést, és fokozza az idegi növekedési tényező (NGF) hatását. Továbbá, az AIT-082 vegyület neurit-képző hatását csökkenti a methemoglobín (ami megköti és eltávolítja a nitrogén-monoxidot és a szénmonoxidot), a metilénkék (ami gátolja a guanilil cikláz enzimet), és a cink protoporfirin IX (a hém oxigenáz enzimet gátló anyag, ami szénmonoxidot termel). AZ L-NAME vagy a NOLA, a nitrogén-monoxid termelést gátló anyagok, az AIT-082 vegyület neurit-képződésre gyakorolt hatását nem befolyásolják. Ráadásul, az AIT-082 vegyület serkenti számos különbző neurotróp tényező termelődését, amit ezen tényezők megnövekedett mRNA koncentrációja bizonyít, az AIT-082 vegyület asztrocitákhoz való in vitro adagolását követően. Sőt, mivel az AIT-082 vegyület orálisan hatékony és - amint azt a 2. Példában bemutattuk, gyorsan átlépi a vér-agy gátat, jelentős terápiás potenciállal rendelkezik, mint NGF-utánzó hatóanyag az Alzheimer-kórban és más, idegrendszeri elfajulással és sejtrendellenességgel kapcsolatos betegségben.

Az előzőekben bemutatott eredményekre való tekintettel kísérleteket végeztünk, hogy bizonyítsuk az AIT-082 vegyület hatásosságát néhány, példának kiválasztott, idegrendszeri leépüléssel kapcsolatos betegség kezelésében. Az Alzheimerkórnak, csakúgy, mint számos egyéb idegi károsodásnak a központi tünete a memóriavesztés. Az Alzheimer-kórban, az amnéziában (emlékezet-vesztés), az öregedés során, és majmok hippokampuszának sérülése után különösképpen a munka- (vagy epizód-) memória károsodik. Az AIT-082 vegyületnek az ilyen típusú emlékezetcsökkenésre gyakorolt javító hatásával szemléltetjük a jelen találmány szerinti vegyületeknek az idegrendszeri elfajulással kapcsolatos betegségek kezelésében mutatott hatékonyságát.

17. PÉLDA

AZ EMLÉKEZET-NYOMOK ÖSSZEHASONLÍTÁSA KÜLÖNBÖZŐ EGÉR-FAJOKBAN

Kimutatták, hogy a win-shift T-labirintus minta különösen jól modellezi rágcsálók munkamemóriáját, ezért ez széles körben elfogadott módszer. A rágcsálók természetes viselkedése, hogy ha éhesek, étel után kutatnak, ezért arra a helyre nem térnek vissza, ahol elfogyasztották az összes ott talált táplálékot. Ezt a modellt nem abból a célból alkották, hogy számot adjon az emlékezet által tárolt hatalmas adat58 mennyiségről. Hipoxiával (csökkent oxigéntartalom) és ischemiával (helyi vértelenség), CAl hippokampusz sejteket szelektíven károsító eljárásokkal kapcsolatos adatok azt mutatják, hogy ezek a folyamatok veszteségeket okoznak a munkamemóríában, ugyanakkor a memória egyéb típusait nem érintik. Ez erősen arra utal, hogy a memóriának különböző típusai vannak, amik anatómiailag különböző helyekhez kötődnek, és valószínűleg különbözik a neurokémiájuk (az idegi működésben résztvevő vegyületek). Ennek megfelelően, bár a win-shift modell lehet, hogy nem ad számot a munkamemóriában szerepet játszó összes tényezőről, mégis az irodalomban elfogadott, hasznos eszköz olyan hatástani kísérletek tervezésében, amelyek a memória megváltoztatása lehetséges mechanizmusáról adnak felvilágosítást.

A National Institute of Aging-től beszerzett hímnemű Swiss Webster fajú egereknek egy hathónapos (fiatal felnőtt), és egy tizenegy hónapos (idős) egyedekből álló két csoportját, külön ketrecben tartottunk, 22 órás világos/sötét ciklusban, folyamatos vízellátás mellett. A táplálékfelvételt olyan mértékben korlátoztuk, hogy súlyuk a szabad táplálkozással elérhető súly 80%-ának megfelelő értéken stabilizálódjék. Az állatokat egy hétig kezeltük a leírt módon, súlyuk ellenőrzése mellett. A win-shift kísérletet az irodalomban leírt módon végeztük, olymódon, hogy a T-labirintusban a helyes válasz minden sikeres próbálkozás után cserélődött. A próbálkozások közötti időtartamot úgy változtattuk, hogy meghatározható legyen az a leghosszabb időtartam, ameddig az egyes egyedek emlékezni tudnak az előző próbálkozás helyes eredményére. Az 5• · · · • · · ös eredményt (10 próbálkozásból 5 sikeres, 50%-os találati arány) véletlenszerűnek tekintjük; vagyis, az állat ekkor nem emlékszik arra, hogy az előző próbálkozás alkalmával melyik dobozban volt a táplálék. A jutalomként kapott táplálékot tartalmazó doboz helyét minden egyes sikeres próbálkozás után változtatjuk. Minden egér naponta tízszer próbálkozik. Ha az állat térbeli tájékozódási szokást alakít ki (pl. csak a jobb oldalon próbálkozik), minden pró-bálkozásnál visszatér ugyanahhoz a dobozhoz, és helyes próbálkozásainak aránya lényegesen kevesebb lesz, mint 50%. A kiindulási doboz elhagyásáig eltelt lappangási időt a motiváció mértékeként, a futási időt (a kiindulás doboz elhagyása és a céldoboz elérése közötti időt) a teljesítmény mértékeként, a sikeres próbálkozások számát pedig az emlékezet mértékeként jegyezzük fel.

Az I. táblázat adatai szemléltetik a próbálkozások között eltelt idő növelésének hatását gyógyszeres kezelést nem kapott fiatal, felnőtt állatoknál.

• ·

I. táblázat

A próbálkozások között eltelt idő hatása a win-shift kísérletben

Próbálkozások közötti időtartam (mp)

	30	60	90	120	150
Swiss Webster egér	7,5*	7,5*	5,0
C57BL/6 egér	7,0*	7,4*	7,0*	7,8	5,6

(1) A találati arány a 10 próbálkozásból elért helyes válaszok középértéke. A fiziológiás sóoldatot 1 órával a kísérlet előtt adagoltuk.

*p<0,05. Az ANOVA szignifikancia-vizsgálatot követően az adatok statisztikai elemzésére Dunnett-próbát végeztünk, összehasonlítva a gyógyszerrel kezelt csoportokat a kontrollcsoportokkal. A százalékos adatokon arc sign átalakítást hajtottunk végre.

Az I. táblázat adataiból látható, hogy a Swiss Webster egerek emlékeznek a win-shift stratégiára, ha a próbálkozások közötti időtartam 30 vagy 60 másodperc. A fiziológiás sóoldat kezelést kapott egerek közül kevés teljesített a véletlennek megfelelő (50%) szintnél jobban a 90 másodperces késleltetési időtartamnál. Ezek az adatok azt jelzik, hogy az emlékezet-nyom ezekben az állatokban 60 és 90 másodperc között eltűnik. A gyógyszer értékelési vizsgálatokat a normális felnőtt Swiss Webster egerekkel minden esetben a próbálkozások közötti 90 másodperces késleltetéssel végeztük, hacsak másképpen nem jelezzük. A C57BL/6 egereknél az emlékezet-nyom 120 másodpercig tartott.

18. PÉLDA

AZ AIT-082 VEGYÜLET HATÁSA AZ EMLÉKEZET-NYOM IDŐTARTAMÁRA

Az AIT-082 vegyület hatását összehasonlítottuk a takrinéval (THA) és a fizosztigminéval (PHY), amelyek kísérleti antikolinészteráz hatóanyagok, és állatoknál emlékezetfokozó hatásuk van. A hatóanyagokat a lokomotoros aktivitásra gyakorolt hatásuk szerint is értékeltük. A win-shift emlékezet kísérletben az AIT-082 vegyületnek azt a képességét is értékeltük, hogy a gyógyszer beadása után 18 nappal tolerancia (tűrő-képesség) kialakulását váltja ki. Az AIT-082 vegyületnek ezenkívül vizsgáltuk a tanulási képességet befolyásoló hatását is, egy módosított T-labirintus feladatban.

Az ebben a példában alkalmazott gyógyszerek a 4-[ [3-(1,6-dihidro-6-oxo-9-purin-9-il)-1-oxopropil] amino] benzoesav (AIT-082), kálium só alakjában, a takrin hidroklorid (tetra-hidroamino-akridin, THA, Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri), és a fizosztigmin hemiszulfát sója (PHY, Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri). A gyógyszereket fiziológiás sóoldatban oldottuk fel, és naponta frissen készítettük el. Valamennyi injekciót 0,1 ml/10 gramm testsúly térfogatban készítettük.

Amikor a gyógyszeres hatásokat vizsgáltuk, az AIT-082 vegyület vagy a THA intraperitoniális (i.p.) injekcióit egy órával a vizsgálat előtt készítettük el. Rövidebb hatásideje miatt a PHY injekciót 30 perccel a vizsgálat előtt adtuk be. A kontroll csoport tagjainak fiziológiás sóoldatot (hordozó anyagot) injektálunk.

Az emlékezet-nyom tartósságának meghatározása céljából az egyedeknek hatóanyagot vagy fiziológiás sóoldatot adagoltunk, ’ * · β : · · ··. · * * · · Λ Σ * · és 30 perccel (PHY) vagy 1 órával (AIT-082 vagy THA) később egyetlen hivatkozási kísérletet végeztünk, amelyben mindkét céldobozban volt jutalom tej. A jelzett késleltetési idő után az egyedeket visszatettük a kiindulási dobozba, és megkezdődött az első próbálkozás, amelyben a jutalom tej csak az előző, sikeres próbálkozással ellentétes céldobozban volt. Az egyedeknek 10 próbálkozás! lehetőségük volt, és a jutalom helyét csak a sikeres próbálkozás után változtattuk.

Annak meghatározása céljából, hogy kialakul-e az AIT-082 vegyület biológiai hatásaival kapcsolatban tűrőképesség, a gyógyszert vagy a fiziológiás sóoldatot a szokásos win-shift kísérlet előtt 18 napig naponta adagoltuk.

Az egyedekkel végeztünk másfajta tanulási kísérletet is, ugyanabban a T-labirintusban, amelyben a fentiekben tárgyalt win-shift kísérlet történt. Csakúgy, mint a win-shift kísérletben, az egyedek előzetes állapot-stabilizálása után egyetlen hivatkozási kísérletben a jutalmat mindkét céldobozba beletettük. Az egyed csak a kiválasztott céldobozban lévő jutalom tejet fogyaszthatta el. A következő kísérletben a jutalom, és így a sikeres kísérlet ugyanazt a céldobozt jelentette, mint a hivatkozási kísérletben, és ezt nem változtattuk. Az egyedeknek meg kellett tanulniuk, hogy a helyes válaszhoz a céldoboz helyzetét nem változtatjuk. Naponta 10 próbálkozásuk lehetett, ami addig tartott, amíg két egymást követő napon a 10 próbálkozásból legalább 8 sikereset értek el. Feljegyeztük, hogy hány nap alatt érték el ezt a teljesítményszintet. Miután az egyedek elérték ezt a szintet, a helyes válasznak megfelelő céldoboz helyzetét felcseréltük. Ezután ··· ·· feljegyeztük hogy a csere után hány nappal érték el a megadott teljesítmény-szintet.

A T-labirintusban végzett tanulási feladat, és a winshift kísérlet eredményeit az alábbi, J. táblázatban mutatjuk be.

J. táblázat

Az AIT-082 vegyület, a THA és a PHY hatása 90 mp-es kísérletek közötti időtartam esetén, Swiss Webster egerekben

A teszt típusa^1 2)	Kontroll	THA	AIT-082	PHY
Adagolás (mg/kg)	sóoldat	1,25	0,5	30,0	0,12.
win-shift memóriahelyes válaszok	-teszt 4,6	7,1*	6,5*	8,2*	6,5

(helyes válasz/10 próba)

várakozási idő (mp)	2,68	8,22* 1,95	2,03
futási idő (mp)	1, 95	3,65* 2,20	1,95	2,65
Lokomotoros
aktivitás(2)	343	671* 323	378	N/T

Tanulás a T-labirintusban (a szint teljesítéséhez szükséges napok száma)

Tanulás	3,6	N/T (3) 3,0	3,3	N/T
Csere	4,2	N/T	3,78	3,5	N/T
Hozzászokás	4,9	N/T	N/T	7,6*	N/T

(helyes válasz/10 próba) (1) Csoportonként legalább 8 állatot vizsgáltunk.

(2) Az óránkénti spontán mozgások száma.

: : · ’·· :..

..... ···· · .· · (3) Nem vizsgáltuk.

* A p<0,05 szintet jelenti. Az ANOVA szignifikancia-vizsgálatot követően az adatok statisztikai elemzésére Dunnettpróbát végeztünk, összehasonlítva a gyógyszerrel kezelt csoportokat a kontroli-csoportokkal. A százalékos adatokon arc sign transzformációt végeztünk, és a várakozási idő adatokat reciprok idő, vagy sebesség adatokká alakítottuk át.

Amint az a J. táblázat adataiból látható, az AIT-082 vegyülettel való kezelés hatására növekedett a helyes válaszok száma (a memória), az összehasonlító, sóoldattal kezelt csoportokhoz képest. Míg a hatás ugyanabban a tartományban van, mint a THA és a PHY esetén, a THA és a PHY egyaránt növelte a várakozási időt (nőtt a kiindulási doboz elhagyásáig eltelt idő, ami csökkent motivációra utal), és a THA fokozta a spontán lokomotoros aktivitást. Az AIT-082 vegyület nem hatott a cserével kombinált tanulásra, és 18 napig tartó előzetes kezelés után nem alakult ki hozzászokás az AIT-082 vegyület memória-fokozó hatásával szemben. Csak az AIT-082 vegyület növelte a memória működését anélkül, hogy befolyásolta volna a tanulási képességet, a motivációt, a teljesítményt és a lokomotoros aktivitást. Hasonló adatokat figyeltünk meg az AIT-082 vegyület orális adagolása esetén is.

19. PÉLDA

AZ AIT-082 VEGYÜLET DÓZISÁNAK HATÁSA AZ EMLÉKEZET-NYOM

TARTÓSSÁGÁRA ** · ·· : : : ··· :.. · .· ··· ·. ... * · .· · • ···.

Vizsgáltuk az AIT-082 vegyület dózisa és hatása közötti összefüggést, valamint hatásának időtartamát, fiatal felnőtt Swiss Webster egereken. Az eredményeket, mint a véletlen eloszlást meghaladó helyes válaszok százalékos arányát közöljük, ahol a véletlen eloszlás 50% helyes válasznak felel meg. Amint a 7. ábrán látható, az AIT-082 vegyület hatásosan javítja a memóriát normál felnőtt Swiss Webster egerekben 0.5 és 60 mg/kg dózistartományban. Továbbá, amint a 8. ábra mutatja, a hatás megjelenése igen gyors (1 óra, az adat nem látható) , és egyetlen, 60 mg/kg dózis beadása után több, mint hét napig tart. Szakemberek sokra értékelhetik, hogy a gyógyszer hatásainak hosszú időtartama lényegesen csökkenti az adagolás gyakoriságát, ami előnyös a kezelt egyedek kezeléssel szembeni hozzáállása, valamint a kezelés költségei szempontjából.

20. PÉLDA

AZ AIT-082 VEGYÜLET HATÁSA AZ EMLÉKEZET-NYOM TARTÓSSÁGÁRA, C57BL/6 EGEREKBEN

Korábbi kísérletekben bebizonyosodott, hogy a normál felnőtt Swiss Webster egereknél a win-shift kísérletben az emlékezet-nyom tartóssága 60 másodperc, ami az AIT-082 vegyület adagolásával növelhető. A jelen találmány szerinti módszerek és anyagkeverékek alkalmazhatóságának és hatásosságának további bemutatása céljából egy másik egérfajtának is beadtuk az AIT-082 vegyületet, amelynél az emlékezet-nyom tartóssága különbözik, az előző kísérlet elrendezése szerint. Az eredmények az alábbi, K. táblázatban találhatók.

K. táblázat

Az emlékezet-nyom tartóssága C57BL/6 egerekben

A próbák kö- |_A kezelt csoportok_ zötti időtar- |Kontroll | AIT-082 | Fizosztigmin

tam	(mp)	(sóoldal)	(30	mg/kg)	(0,125	mg/kg)
		|jó/ösz- he-	jó/ös	z- he-	Ijó/ösz	- he-
		J_szes# lyes^J_szes#	lyes^	Iszes#	lyes^
	30	| 3/5 70±ll**			1
	60	| 3/5 70±16**			1
	90	| 4/5 70±6**			1
	120	| 4/5 78±16**			1
	150	| 1/5 56±10			1
	180	| 2/7 58±12	4/6	70±15**	1 3/6	65±16*
	210	1 1	4/6	78±15**	1 1/6	53±9
	240	1 1	0/6	50±6	1
	270	1 1	0/6	50±6	1
# =	A véletlenszerű eloszlást	meghaladó (60%	helyes)	egyedek
	száma/a	vizsgált egyedek	száma	r

^v - a helyes próbálkozások középértéke ± sztenderd hiba ** = p<0,01 (statisztikai t-próba) * = p<0,05 (statisztikai t-próba)

A win-shift táplálék keresési kísérletben a C57BL/6 egerek emlékezet-nyomának jellemző időtartama 120 másodperc. Amint a K. táblázat mutatja, 30 mg/kg-os dózisnál az AIT-082 vegyület több, mint 210 másodpercre növelte az emlékezet-nyom tartósságát. Bár a fizosztigmin szintén növelte az emlékezetnyom tartósságát ebben a kísérletben, 120-ról 180 másodpercre, hatása kisebb, mint az AIT-082 vegyületé.

21. PÉLDA

ÖREGEDÉSSEL JÁRÓ MEMÓRIA RENDELLENESSÉGEK KEZELÉSE AZ AIT-082

VEGYÜLETTEL

Az eddig tárgyalt eredmények fényében vizsgálatokat végeztünk annak bizonyítására, hogy az AIT-082 vegyület javítja az emlékezőképességet, egészséges, és idegrendszeri rendellenességgel bíró emlősökben egyaránt. Tizenkét hónapos hím Swiss Webster egerek teljesítményét vizsgáltuk a winshift táplálék keresési kísérletben. Az egyedeket különböző késleltetési időkkel vizsgáltuk, a kísérletek közötti időtartamot 10 másodpercről 30, 60, 90 és 120 másodpercre növelve. A kezeletlen egerek eredményei az alábbi, L.

táblázatban láthatók.

• ·«» ··· ···

L. táblázat

Öregedéssel kapcsolatos munka-memória csökkenés

Swiss Webster egereknél

Az emlékezet-nyom	Az egyedek	Az egyedek	Az emléke
hossza	száma	%-a	romlás foka
kevesebb mint 10 mp	6	25%	súlyos
10 mp	8	33	közepes
30 mp	10	42	enyhe
összes	24	100

Az L. táblázat eredményei bizonyítják, hogy az egyedek a munkamemória romlásának foka szerint osztályozhatók. A súlyosan károsodott egyedek 10 másodperc múlva már nem emlékeztek a helyes válaszra, míg az enyhe emlékezőképesség csökkenésben szenvedő egyedek 30 másodperces próbálkozások közötti időtartam esetén még emlékeztek a helyes válaszra, 60 másodpercnél pedig már nem. A közepes emlékezet romlásban szenvedő egyedek 10 másodperc próbák közötti időtartamnál még emlékeztek a helyes válaszra, de 30 másodperc esetén már nem. Ilymódon, a winshift kísérlet kimutatja a munkamemória öregedéssel kapcsolatos károsodását. A szakemberek számára ez a megfigyelés fontos lehet, hiszen azt a lehetőséget biztosítja, hogy hasonló életkorú, eltérő fokú memóriacsökkenéssel jellemezhető egyedeket használjunk potenciális hatóanyagok értékelésére.

Az alapvonal meghatározása után, mind a három csoportból hat egyedet kezeltünk az AIT-082 vegyülettel (30 mg/kg, egy órával a próba előtt) vagy fizosztigminnel (0,125 mg/kg, 30

perccel a próba előtt), majd elvégeztük a win-shift táplálékszerzési kísérletet. Az eredményeket az alábbi, M. táblázatban mutatjuk be, és grafikusan a 9. ábrán szemléltetjük.

M. táblázat

Az AIT-082 vegyület és PHY hatása az emlékezet-nyom tartósságára öregedési memória-csökkenést mutató Swiss Webster egereken

A csökkenés	Késleltetési	Kontroll	AIT-082	PHY
mértéke mg/kg	idő (mp)	(sóoldat)	30 mg/kg	0, 125
Enyhe	60	0/6	6/6*	5/6*
	90		4/6	3/6
	120		2/6	2/6
	150		1/6	2/6
	180		1/6	1/6
	210		0/6	0/6
Közepes	30	0/6	4/6*	1/6
	60		2/6	0/6
	90		0/6
Súlyos	<10	0/6	0/6	0/6

Az adatok jelentése: a lényegesen a véletlenszerű eloszlás fölött teljesítő egyedek száma/az összes egyedek száma;

* Jelentése: p<0,05 (t-próba)

Hat egyednek súlyos a memória-csökkenése: ezek nem tudtak emlékezni a feladatra 10 másodperc múlva. Egyikük sem mutatott memória visszaépülést, sem AIT-082 vegyülettel, sem PHY-val való kezelés után. Hat közepes, 10 másodperces emlékezet-nyom70

• · · · mai járó memória-csökkenést mutató egyed közül az AIT-082 vegyület 4 egyednél (az egyedek 67%-ánál) több, mint 30 másodpercre, 2 egyednél pedig (50%) több, mint 60 másodpercre növelte az emlékezet-nyom tartósságát. A hat, enyhe memóriacsökkenést mutató egyednél (30 másodperces emlékezet-nyommal) az AIT-082 vegyület az egyedek közül kettőnél 60 másodpercre, kettőnél 90 másodpercre, egynél 90, két egyednél pedig legalább 180 másodpercre növelte az emlékezet-nyom tartósságát, ílymódon, az AIT-082 vegyület aktívabb a fizosztigminnél a közepes memória-csökkenést mutató, és legalább olyan hatásos az enyhe memória-csökkenést mutató csoportnál.

22. PÉLDA

ÖREGEDÉSSEL KAPCSOLATOS MEMÓRIA-CSÖKKENÉS KEZELÉSE AZ AIT-082

VEGYÜLETTEL

Tizenkét hónapos hím C57BL/6 egerek teljesítményét vizsgáltuk a win-shift táplálékszerzési kísérletben. A kísérleteket a próbálkozások közötti időtartam változtatásával végeztük. Azokat az egyedeket, amelyek 10 másodperces késleltetési idő alatt sem tudták teljesíteni a követelményt (>60% helyes válasz), a súlyos memória-csökkenést mutató csoportba soroltuk. Azok az egyedek, amelyek 10 másodperc alatt sikeresen teljesítettek, de 30 másodperc alatt nem, a közepes memória-csökkenést mutató csoportba tartoznak, míg a 30 másodperc alatt teljesítő, de 60 másodpercnél nem teljesítő egyedek alkotják az enyhe csökkenést mutató csoportot. Az egyes csoportokhoz tartozó egyedeket, csakúgy, mint a 21. Példában, az AIT-082 vegyülettel vagy fizosztigminnél kezeltük, hogy • · · memória visszaépülést, sem AIT-082 vegyülettel, sem PHY-val való kezelés után. Hat közepes, 10 másodperces emlékezet-nyommal járó memória-csökkenést mutató egyed közül az AIT-082 vegyület 4 egyednél (az egyedek 67%-ánál) több, mint 30 másodpercre, 2 egyednél pedig (50%) több, mint 60 másodpercre növelte az emlékezet-nyom tartósságát. A hat, enyhe memóriacsökkenést mutató egyednél (30 másodperces emlékezet-nyommal) az AIT-082 vegyület az egyedek közül kettőnél 60 másodpercre, kettőnél 90 másodpercre, egynél 90, két egyednél pedig legalább 180 másodpercre növelte az emlékezet-nyom tartósságát. Ilymódon, az AIT-082 vegyület aktívabb a fizosztigminnél a közepes memória-csökkenést mutató, és legalább olyan hatásos az enyhe memória-csökkenést mutató csoportnál.

22. PÉLDA

ÖREGEDÉSSEL KAPCSOLATOS MEMÓRIA-CSÖKKENÉS KEZELÉSE AZ AIT-082 VEGYÜLETTEL

Tizenkét hónapos hím C57BL/6 egerek teljesítményét vizsgáltuk a win-shift táplálékszerzési kísérletben. A kísérleteket a próbálkozások közötti időtartam változtatásával végeztük. Azokat az egyedeket, amelyek 10 másodperces késleltetési idő alatt sem tudták teljesíteni a követelményt (>60% helyes válasz), a súlyos memória-csökkenést mutató csoportba soroltuk. Azok az egyedek, amelyek 10 másodperc alatt sikeresen teljesítettek, de 30 másodperc alatt nem, a közepes memória-csökkenést mutató csoportba tartoznak, míg a 30 másodperc alatt teljesítő, de 60 másodpercnél nem teljesítő egyedek alkotják az enyhe csökkenést mutató csoportot. Az egyes csoportokhoz tartozó egyedeket, csakúgy, mint a 21. Példában, az AIT-082 vegyülettel vagy fizosztigminnel kezeltük, hogy meghatározzuk e hatóanyagoknak a munkamemória nyom kiterjesztésére gyakorolt hatását. Az eredményeket az alábbi,

N. táblázatban közöljük, és grafikusan a 10. ábrán szemléltetjük.

N. táblázat

Az AIT-082 vegyület és PHY hatása az emlékezet-nyom tartósságára öregedési memória-csökkenést mutató C57BL/6 egereken

A csökkenés	Késleltetési	Kontroll	AIT-082	PHY
mértéke	idő (mp)	(sóoldat)	30 mg/kg	0,125 mg/kg
Enyhe	60	0/6	4/4*	7/8*
	90		2/4*	3/8
	120			2/8
	150			2/8
	180			2/8
	210			0/8
Közepes	10	6/6	6/6*	6/6
	30	0/6	4/6	1/6
	60		1/6	0/6
	90		0/6
Súlyos	<10	0/6	0/6	0/6
Az adatok	jelentése: a	lényegesen	a véletlenszerű eloszlás

fölött teljesítő egyedek száma/az összes egyedek száma; * Jelentése: p<0,05 (t-próba) • · • · · · · · · • · ···· ··· · • · · · · · · ··· ·· ··· · ···

Az enyhe csökkenést mutató csoportnál az AIT-082 vegyület 30-ról 90 másodpercre hosszabbította az emlékezet-nyom tartósságát, a közepes memória-csökkenést mutató csoportnál pedig 10 mp-ről 30 mp-re. Bár a PHY javította a memóriát az enyhe csoportban, a közepes csoportban hatástalan volt. Ezek szerint az AIT-082 vegyület helyreállítja a munkamemória csökkenését mind normál egereknél, mind öregedéssel kapcsolatos idegrendszeri rendellenességeket mutató egereknél, a Swiss Webster és a C57BL/6 faj esetében egyaránt. Köze-lebbről, az eredmények szerint az AIT-082 vegyület helyreállítja a munkamemóriát enyhe és közepes memória-csökkenést mutató egerekben. A korábbi, egyéb példák alap-ján ésszerű az a következtetés, hogy memória javító hatását a szénmonoxid-függő guanilil-cikláz rendszer módosítása útján fejti ki.

23. PÉLDA

ÖREGEDÉSSEL KAPCSOLATOS MEMÓRIA RENDELLENESSÉGEK MEGELŐZÉSE AZ AIT-082 VEGYÜLETTEL

Megfigyelték, hogy egereknél az öregedéssel kapcsolatos memória-csökkenés jellemzően 14 és 16 hónapos életkor között mutatkozik meg. Ezért egereket 14 hónapos korukban elkezdtünk az AIT-082 vegyülettel kezelni (30 mg/kg napi dózissal), az ivóvízben. Az állatok memóriáját havonta vizsgáltuk, a korábban leírt win-shift táplálékszerzési kísérlettel. A 11. ábrán bemutatott eredmények szerint az AIT-082 vegyület adagolása késleltette a memória-csökkenés kezdetét, és súlyosságát.

24. PÉLDA

ALKOHOL ÁLTAL KIVÁLTOTT, MEMÓRIA-CSÖKKENÉSSEL KAPCSOLATOS RENDELLENESSÉGEK MEGELŐZÉSE AZ AIT-082 VEGYÜLETTEL

A jelen találmány különböző típusú, az idegrendszer leépülésével kapcsolatos rendellenességek körében való széleskörű alkalmazhatóságának bemutatása céljából az AIT-082 vegyülettel késleltettük alkohol által kiváltott memóriacsökkenés kialakulását. Hat hónapos hím C57L/6 egereket vizsgáltunk a win-shift kísérletben etanollal, egy nem-fajlagos memória-gátló anyaggal, és az AIT-082 vegyülettel való kezeléssel kombinálva. Az egyedeket a próbálkozások megkezdése előtt 1 órával sóoldattal (kontroll) vagy az AIT-082 vegyülettel (30 mg/kg i.p.) kezeltük. Az etanolt 0,5 mg/kg i.p. dózisban adagoltuk, 10 perccel a kísérlet megkezdése előtt. Egy előzetes kísérlet eredményei láthatók az alábbi, 0.

táblázatban.

0. Táblázat

A munkamemória etanol által kiváltott csökkenése, és annak helyreállítása az AIT-082 vegyülettel

Kezelés

Kontroll Etanol Etanol+AIT-082

Sikeres próbák1-'2	8,08±0,29	6, 5+2 6*	7,89±0,54!
Várakozási idő^	1,24±0,17	1,18±0,10	1,77±0,27
Futási idő^	1,44±0,35	1,17±0,08	3,22±0,61*!
Az egyedek száma	13	13	9

¹ A sikeres próbálkozások száma 10 kísérletből;

² Középértékeket jelent ± sztenderd hiba;

* p<0,05 (t-próba) kontrollal összehasonlítva;

• p<0,05 (t-próba) etanollal összehasonlítva.

Az 0. táblázat eredményei szerint azonosítani lehet a gátló anyagnak egy olyan dózisát, ami a win-shift kísérletben mérhető memória-csökkenést okoz. Nem-fajlagos gátló anyagként az etanolt választottuk, aminek a hatásait AIT-082 vegyületnek az etanolos kezelés előtt való adagolásával fordítottuk vissza. Ennélfogva megvalósíthatónak látszik egyéb, fajlagosabb hatású gátló anyagok értékelése is, amelyek meghatározott receptor-helyeken fejtik ki a hatásukat.

Jelenlegi ismereteink szerint az AIT-082 vegyületen kívül más purin-származékok is szerepet játszanak az idegsejtek túlélésében, a szinapszisok képződésében, valamint a központi idegrendszerben bekövetkezett sérüléseket vagy sejtpusztulást követően a működés helyreállításában. Az AIT-082 vegyület és a guanozin közötti hasonlóságok például arra utalnak, hogy az AIT-082 és a guanozin hasonló mechanizmus szerint fejti ki hatását, valószínűleg mindkettő szénmonoxid-függő guanilil-cikláz enzim módosítóként hat. Ismert továbbá, hogy a sejtek károsodása után belőlük jelentős mennyiségű purin-nukleozid és -nukleotid távozik a sejtek közötti térbe. Helyi agysérülések területén a guanozin koncentrációja elérheti az 50 mmólt is, és ez az érték legalább hét napon át az ötszörösére növekedhet, ílymódon, a sérülést követően az asztrociták vagy a glia-sejtek • · · és a neuronok a guanozin magas sejt közötti koncentrációjának vannak kitéve.

A következő vizsgálatokat ennek megfelelően azzal a céllal végeztük, hogy bizonyítsuk más, példaként választott purinszármazékok, mint például a guanozin hatásosságát a szénmonoxid-függő guanilil-cikláz rendszer módosításában.

25. PÉLDA

AZ ASZTROCITÁK GUANOZIN ÉS GTP HATÁSÁRA NÖVEKEDÉSI TÉNYEZŐKET ÁLLÍTANAK ELŐ

A sejtek közötti térben lévő guanozin vagy guanozintrifoszfát (GTP) hatására az asztrociták erőteljesen szaporodnak. A GTP vagy a guanozin ezenkívül serkenti növekedési tényezők felszabadulását újszülött egerek agyából származó sejttenyészetekben. Asztrocitákat különböző koncentrációjú guanozin vagy GTP jelenlétében érleltünk. Ezután a kezelt sejtek tenyészetének közegében az ELISA teszttel mértük a neurotrofinok immunreaktivitását.

Röviden, 96-üreges Falcon lemezeket (Fisher) vontunk be 0,1 mólos nátrium-karbonát pufferban (pH=9,6) lévő 1 mg/ml koncentrációjú, juhból származó (affinitás oszlopon tisztított) mono-specifikus anti-NGF immunoglobulinnal. Miután 4°C hőmérsékleten egy éjszakán át érleltük, az antitestek fölöslegének eltávolítása céljából gátló anyag (PBS, 10%-os lúd-szérumban) oldatát adtuk hozzá. A lemezeket négyórás, szobahőmérsékleten végzett érlelés után háromszor mostuk 0,05%

Tween 20-at tartalmazó PBS oldattal. Ezután összeöntöttük az előkészített közeget és szokványos 2,5S nagynyomású

• · · · folyadékkromatográfiával tisztított NGF-t. A lemezeket a következő napon háromszor mostuk 0,05% Tween 20-at tartalmazó PBS oldattal. Ezután hozzáadtuk a másodlagos antitestet, b-galaktozidáz enzimhez kötött nyúlmono-specifikus anti-NGF IgG-t (Pierce SPDP módszer, 1:500 hígítás). A lemezeket 4°C hőmérsékleten egy éjszakán át érleltük. A lemezeket a következő napon háromszor mostuk 0,05% Tween 20-at tartalmazó PBS oldattal. Ezután mindegyik üregben lévő szubsztráthoz 0,2 mmólos 4-metilumbellíféri1-b-galaktozidot (MUG) adtunk, 0,1 mólos foszfát pufferban (1 mmól MgCl2r pH=7,2). A reakciót 4 órás, szobahőmérsékleten történő érlelés után 0,1 mólos, 10,3 pH-jú glicin hozzáadásával állítottuk le. Ezután a mintákat Microfluor ELISA leolvasóval mértük (gerjesztés 360 nm; emisszió 450 nm). Ennek a meghatározásnak az érzékenysége 10 pg/üreg NGF.

Az ELISA meghatározással közel egyforma affinitással kimutattuk az NGF és az NT-3 neurotrofinokat, a BNDF-et pedig

100-szor kisebb affinitással. Amint az a 12A és 12B ábrán látható, a guanozin és a GTP egyaránt növelte a tenyésztési közegben az NGF-szerű immunreaktivitást. A különböző koncentrációjú guanozin jelenlétében érlelt asztrociták sokkal erőteljesebb válaszreakciót szolgáltattak, mint az egyenértékű koncentrációjú GTP jelenlétében tartott sejtek.

• · · ···· ·· ·· • · · · · · ·

26. PÉLDA

AZ ASZTROCITÁK GUANOZIN HATÁSÁRA

NEUROTRÓF TÉNYEZŐKET ÁLLÍTANAK ELŐ

Az előző kísérlet eredményeinek megerősítése céljából FGF2 és NGF növekedési tényezők mRNA szintjeit mértük asztrocitákban, guanozin jelenlétében. Az mRNA szinteket ugyanazzal a kísérleti elrendezéssel mértük, mint amit korábban a

16. Példában használtunk. Amint azt a 13A és 13B ábra mutatja, guanozin a hozzáadása után 4, illetve 24 órával növelte az NGF és FGF-2 mRNA-jának szintjét. A neurotrofin-mRNA színjének növekedése lényeges agyi sérülést követően, vagy agyi sérülésből való felépülés során, amikor a guanozin koncentrációja a sejtek közötti térben eléggé magas. Mivel a sejtek az agysérülést követően több napig magas guanozin koncentrációjú közegben vannak, ez az adat azt jelenti, hogy valószínűleg részben a guanozinnak köszönhető a működés helyreállítása.

Amint azt korábban tárgyaltuk, egy olyan hatóanyagnak, amelyik át tud hatolni a vér-agy gáton, és növelni képes a neurotróf tényezők koncentrációját, amit itt az mRNA szintekkel mérünk, szükségszerűen jelentős pozitív hatása van az idegsejtek túlélésére és a kollaterális (oldalági) idegi pályák képződésére. Ez viszont számos különböző idegrendszeri betegségben, vagy az idegrendszer károsodása után elősegíti a működés helyreállítását.

• ·· ··· · ·« · · ····· · · · « · ···· ··« · • · · · · · · ··· ·· ··· · ····

27. PÉLDA

GUANOZIN JELENLÉTÉBEN AZ IDEGSEJTEKBEN NEURITOK KÉPZŐDNEK

A fokális (kis helyre koncentrált) agysérülést követően a glia-sejtekben vagy az asztrocitákban végbemenő változásokon túl fontos idegi változások is lezajlanak. A túlélő idegsejtekben neurit-képződés mehet végbe. Ennek megfelelően, a korábbi, AIT-082 vegyülettel végzett kísérletek alapján vizsgálatokat végeztünk annak bizonyítására, hogy a guanozin is képes a szénmonoxid-függő guanilil cikláz rendszer módo-sítása útján serkenteni a neurit-képződést. Amint azt korábban tárgyaltuk, mivel a PC12 sejtekben az idegsejt-típusú sejtek egyenletes eloszlásban vannak jelen, és nem keverednek asztroglia-típusú sejtekkel, ezekben a sejtekben könnyen megfigyelhetők a jelen találmány példáiban szereplő purinszármazékoknak a neurit-képződésre gyakorolt közvetlen hatásai. Ennek megfelelően, PC12 sejteket érleltünk guanozin és adenozin jelenlétében, NGF hozzáadásával vagy anélkül, és megfigyeltük azokat, a 12. Példa szerinti módszerrel. A purinszármazékok és NGF együttes hatása a 14A ábrán, míg az NGF nélkül észlelt hatások a 14B ábrán láthatók. A 14C ábrán közvetlenül összehasonlítjuk ezeknek a purin-származékoknak NGF jelenlétében és anélkül kifejtett hatásait.

Amint a 14A ábrán látható, 48 óra múltán a guanozin fokozta PC12 sejtekben az NGF által kiváltott neurit-képződést, az adenozin pedig nem. Ez a növelő hatás az NGF egyedüli adagolásához képest 30 és 300 mmólos guanozin koncentrációknál jelentős. Az adenozin egyik alkalmazott koncentrációban sem fokozta az NGF által kiváltott neurit-képződést. Ez azt jelenti, hogy a purin-származékok által kiváltott neuritképződés nem általános jelenség. Az 5'-N-etil-karbox-amidoadenozin (NECA), ami adenozin Ap és A2 receptor agonista, szintén fokozta a neurit-képződést, de nem olyan mértékben, mint a guanozin.

Amint az a 14B ábrán látható, önmagukban, NGF távollétében, az adenozin és a guanozin egyaránt kissé növelte a neuritokkal bíró sejtek arányát. A guanozin hatásai 30 és 300 mmólos koncentrációnál egyaránt nagyobbak, mint az adenozinéi ugyanannál a koncentrációnál. NECA jelenlétében kissé növekedett a neurit-képződés. Tekintettel arra, hogy NGF jelenlétében a vegyületek hatását sokkal jobban lehetett érté-kelni, és az kísérletről kísérletre kevésbé változott, mint a vegyületek önmagukban való adagolásakor, neurit-képződés fokozására vonatkozó adatok többségét NGF jelenlétében határoztuk meg.

A 14A és 14B ábrán bemutatott, a 14C ábrán kiemelten látható adatok szerint a guanozin kiváltja neuritok kinövését, de szinergista (hatást fokozó) módon is hat, amikor fokozza az NGF növekedésre gyakorolt hatását. Az adenozin, bár önmagában kissé növeli a neurit-képződést, nem fokozza az NGF hatását. Érdekes módon a guanozin hatását szinergista módon a NECA fokozta, az adenozin pedig nem, NGF jelenlétében és anélkül egyaránt, amint a 14C ábrán látható. Az a tény, hogy PC12 sejtekben adenozin nem növelte a neuritok NGF által kiváltott képződését, a guanozin pedig igen, arra utal, hogy ezen purinszármazékok kölcsönhatása a PC12 sejtekkel eltérő. Az adenozin az adenozin receptorokkal lépne kölcsönhatásba, mint például az • · ·· · *

A₂ purinoceptor. Ez aktiválná az adenilát cikláz enzimet, ami növeli a sejten belül a cAMP mennyiségét. A NECA láthatólag ilyen módon hat. A NECA azonban fokozta a guanozin hatását. Ez azt jelzi, hogy a guanozin és a NECA különböző jelzési utak segítségével fokozza a neurit-képződést.

• · · · • · · · · · · • · · · « ·· ··· · ··

28. PÉLDA

KÜLÖNBÖZŐ PURIN-SZÁRMAZÉKOK HATÁSÁRA

A NEURIT-KÉPZŐDÉS SEBESSÉGE KÜLÖNBÖZŐ A korábbi eredményekre való tekintettel további purinszármazékokat vizsgáltunk annak bizonyítására, hogy az idegi aktivitás módosítását a szénmonoxid-függő guanilil-cikláz módosítása útján biztosító vegyület hatása fajlagos. Közelebbről, az idegi tevékenységet módosító hatásuk bizonyítása céljából különféle purin-származékokat, úgymint az inozint, a

hipoxantint és a xantínt	vizsgáltuk	különböző	koncentrá-
ciókban, NGF jelenlétében,	a 12. Példa	kísérleti	elrendezése
szerint.
Amint az a 15A. ábrán	látható, az	inozin csupán kismér-

fékben fokozta a neurit-képződést a csupán NGF-vel kezelt sejtekhez képest. Ez a 0,3 - 300 mmól koncentrációtartományra érvényes. A 15A. ábrán az is látható, hogy az inozin hatása a neurit-képződésre sokkal kisebb, mint a guanoziné.

A 15B. és 15C. ábra szerint a hipoxantin és a xantin az inozinéhoz hasonló hatást gyakorolt az NGF által kiváltott neurit-képződésre. A 15C. ábra szerint a xantin 0,3 és 30 mmól koncentráció között (300 mmól koncentrációban toxikus hatása volt a sejtekre) csupán kismértékben növelte az NGF által ·· ·«» · ·· ·· • · · · · « · · · · · · · · kiváltott neurit-képződést. A 15B. ábra szerint a legnagyobb, noha mérsékelt, növelő hatást a hipoxantin mutatta 0,3 és 300 mmólos koncentrációban, bár a többi koncentrációnál nem volt jelentős növekedés. Annak ellenére, hogy a hipoxantin esetében megfigyelhető volt a neurit-képződés bizonyos növekedése, a növekedés viszonylagos mértéke közel sem volt akkora, mint a guanozin esetében. Ezek az eredmények azt jelentik, hogy az inozin, a xantin és a hipoxantin az idegrendszeri működés módosítását nem a szénmonoxid-függő guanilil-cikláz rendszer módosítása útján, hanem más jelző-rendszerek befolyásolásával éri el.

29. PÉLDA

AZ AIT-34 VEGYÜLET HATÁSA A NEURIT-KÉPZŐDÉSRE Az AIT-082 vegyülethez hasonló vegyületeknek a neuritképződésre gyakorolt hatásai kimutatása céljából PC12 sejteket tenyésztettünk az AIT-34 vegyület, másnéven 3-(1,6-dihidro-6-oxo-9H-purin-9-il)-N-[ 3-(2-oxopirrolidin-l-il)-propil] propánamid jelenlétében, és a 12. Példa szerint követtük a neuritképződést. Amint az a 16. ábrán látható, az AIT-34 vegyület különböző koncentrációkban - az AIT-082 vegyülettől eltérően

- nem növelte az NGF által kiváltott neurit-képződést.

30. PÉLDA

AZ ATP ÉS A GTP HATÁSA A NEURIT-KÉPZŐDÉSRE Annak további bizonyítására, hogy különböző funkciós csoportokat tartalmazó purin-származékok használhatók a jelen találmány elvei szerint, PC12 sejteket tenyésztettünk adeno83 • ·· ··«· ·* ·· • · · · · · · • · ···· ··« · • · · · · · · ··· ·· ·♦ · · · · * zin-trifoszát (ATP) és guanozin-trifoszfát (GTP) jelenlétében, és a neurit-képződést a 12. Példa szerint követtük.

Az adenozinnak és a guanozinnak a PC12 sejtekben neuritképződésre gyakorolt hatásaihoz nagyon hasonló módon, a megfelelő nukleotidok, az ATP és a GTP hatása a neurit-képződésre párhuzamosan alakul. Amint az a 17. ábrán látható, az ATP sem NGF-vel kezelt sejtekben, sem önmagában nem növelte a neurit-képződést. Ezzel szemben a GTP 30 és 300 mmól koncentrációban NGF jelenlétében fokozta a neurit-képződést, és önmagában is növelte a neurit-képződét.

Amint azonban a 18. ábrán látható, a GTP nem viselkedik guanozint szabályozott módon kibocsátó forrásként. Ha a GTP ektoenzimek (extracelluláris, a sejten kívüli enzimek) hatására guanozin difoszfátra (GDP), guanozin monofoszfátra (GMP), és végül guanozinra hidrolizálna, várható lenne, hogy PC12 sejtekben a GDP és a GMP szintén fokozza a neurit-képződést. Ezzel szemben sem a GDP, sem a GMP nem hatásos a neurit-képződésre, sem önmagukban, sem NGF-vel együtt. Az összehasonlítás kedvéért, az adenin alapú vegyületek valamennyien gátló hatásúak.

31. PÉLDA

PC12 SEJTEKBEN A GUANOZIN NÖVELI A cGMP MENNYISÉGÉT, A GTP PEDIG NEM

A korábbi példák alapján vizsgálatokat végeztünk a GTP és a guanozin neurit-képzésre gyakorolt hatása mechanizmusának felderítésére. Kimutatták, hogy a guanozin és a GTP az artéria simaizmában növeli a gyűrűs 3',5'-guanozin-monofoszfát (cGMP) • ·· ··»« ·· ·· ····· · · · * · · ··« ··· · • · · · · · · ··· ·· ··» · ···· mennyiségét. Mivel az ismeretes, hogy a cGMP-vel analóg vegyületek neuroblasztóma sejtekben serkentik a neuritképződést, elképzelhető volna, hogy a guanozin és a GTP egyaránt a cGMP-nak a sejten belüli mennyiségét növelve fejti ki hatását. Amint a 19. ábrán látható, a guanozin - a 15.

Példában részletesen leírt radioimmun módszerrel mérve - PC12 sejtekben növelte a cGMP sejten belüli mennyiségét. Ez a növelő hatás szénmonoxid-függő guanilil-cikláz módosító anyagtól várható. A GTP ezzel szemben - az eredmények szerint - nem növelte a cGMP mennyiségét, ami azt jelzi, hogy a GTP más mechanizmussal serkenti a neurit-képződést.

32. PÉLDA

A GUANILIL-CIKLÁZ ENZIMET NEM-FAJLAGOS MÓDON GÁTLÓ ANYAGOK CSÖKKENTIK A GUANOZIN NEURIT-KÉPZŐDÉSRE GYAKOROLT HATÁSÁT

Annak bizonyítására, hogy a guanozin módosítja a szénmonoxid-függő guanilil-cikláz rendszert, azt vizsgáltuk, hogy a sejten belüli fokozott mennyiségű cGMP jelenléte szükséges-e ahhoz, hogy a guanozin PC12 sejtekben NGF jelenlétében fokozza a neurit-képződést. Közelebbről, a guanilil-cikláz enzim három inhibitorának különböző koncentrációit adtuk guanozinnal kezelt PC12 sejtekhez. Ezután a 12. Példa módszerével meghatároztuk a neurit-képződést.

A metilénkék (MB) gátolja a cGMP szintéziséért felelős oldható guanilil-cikláz enzimet (sGC). Amint a 20A ábrán látható, ha PC12 sejttenyészetekhez 0,1-5 mmól MB-t adunk, ez lecsökkenti a guanozinnak az NGF-ét fokozó hatását. A ···· >· • · • « · « ·<· metílénkéknek ugyanakkor nincs hatása az NGF által kiváltott neurit-képződésre.

A LY 83583 vegyület mind az olhatatlan, mind az oldható guanilil-cikláz enzimet gátolja. A 20B ábra szerint a LY83583 vegyület gátolta a guanozin hatását a neurit-képződésre, az NGF hatását viszont nem változtatta. Nem ismeretes, hogya LY83583 vegyület milyen mechanizmussal gátolja a guanilil-cikláz enzimet, de az valószínűleg közvetett, és a glutation metabolizmusával kapcsolatos. Ily-módon a guanilil-cikláz enzim két, különböző hatásmechanizmusú, nem-fajlagos inhibitora csökkenti a guanozin neurit-képződésre gyakorolt hatását.

Ezek az adatok azt jelzik, hogy a guanozin és az NGF hatásmechanizmusa különbözik. Arra is utalnak, hogy a guanozin neurit-képzésre gyakorolt hatásának kifejtéséhez szükséges, bár valószínűleg nem elegendő a sejten belüli cGMP mennyiség növekedése.

Annak ellenőrzésére, hogy a cGMP mennyiségének növekedése elégséges-e a neurit-képződés előidézéséhez, sejttenyészetekhez - a guanozin adagolásához hasonlóan - atriális natriuretikus tényezőt (ANF) adtunk. Az ANF olyan hormon, amelynek egyetlen ismert jelátviteli útja az oldhatatlan guanilil-cikláz enzim aktiválásán keresztül vezet. Amint a 20C. ábrán látható, az ANF - a guanozinhoz hasonlóan - fokozta PC12 sejtekben az NGF által kiváltott neurit-képződést, ami azt jelzi, hogy a szénmonoxid-függőő guanilil-cikláz vagy más mechanizmus által kiváltott fokozott sejtbeli cGMP termelés hozzájárul a neuritképződés serkentéséhez.

33. PÉLDA

A NITROGÉN-MONOXID VAGY A SZÉNMONOXID SEGÍTI ELŐ A GUANOZIN NEURIT-KÉPZŐDÉST FOKOZÓ HATÁSÁT

Tekintettel arra, hogy - amint azt a 31. Példában megmutattuk - a guanozin növelte a sejten belüli cGMP mennyiségét, vizsgálatokat végeztünk annak megállapítására, hogy ezt a jelzést NO vagy CO termelése továbbítja-e. Ha a jelátviteli mechanizmusban a nitrogén-monoxid szerepel, akkor NO-donor molekulák, vagyis amelyekből NO szabadul fel, utánoznák a guanozin hatásait.

PC12 sejteket tenyésztettünk 48 órán keresztül nátrium nitroprusszid (SNP) vagy nátrium nitrit (SN) (mindkettőből NO szabadul fel) jelenlétében.

Önmagukban sem a SNP sem a SN nem váltotta ki PC12 sejtekben a neurit-képződést. A guanozinhoz hasonlóan azonban az SNP és a SN egyaránt szinergista módon fokozta az NGF által kiváltott neurit-képződést, amint az a 21. ábrán SN esetében látható. A 22A és 22B ábra - a hatás további megerősítéseként azt mutatja, hogy a NO donorok neurit-képződést elősegítő tulajdonságait mind a hemoglobin (Hb), mind a methemoglobin (MB) gátolja. Mindkettő olyan anyag, ami nagy affinitással köti meg a NO-t és a CO-t, és kizárja, hogy ezek a hatóanyagok jelátvivőként szerepelhessenek.

Ennek megfelelően, ha a NO és a CO közvetíti a guanozin neurit-képzésre gyakorolt hatását, akkor ez a hatás szükségszerűen csökkenthető, ha a sejttenyészetekhez hemoglobint adunk. A várt hatást nyilvánvalóan mutatja a 23. ábra, amelyen a Hb (0,1 - 1 mmól) gátolta guanozin neurit-képződésre gyako• ·» ··»· «· ·· ···«· « · * « · · ··· ··» · • · · · · « « ··« ·· ··· ···· rolt hatását, de nem gátolta ugyanazt NGF esetében. Ez arra utal, hogy a guanozin neurit-képzésre gyakorolt hatásához NO vagy CO előállítására van szükség, míg az NGF esetében nincs.

Vannak arra utaló tények, hogy inkább a CO, mint a NO az, ami kölcsönhatásba lép a guanozinnal az idegi tevékenység módosítása során. Például, ha a guanozin hatásait NO közvetítené, akkor guanozinnak a PC12 sejtekhez való hozzáadása a sejtekben lévő cNOS-t NO előállítására serkentené. A PC12 sejtekben azonban nem mutattak ki cNOS-t, és (guanozin és NGF mentes) kezeletlen PC12 sejtek nem mutatnak színreakciót a diaforáz enzimre, ami azonos helyen fut az NOS enzimmel. Tekintettel arra, hogy a cNOS kálcium/kalmodulin-érzékeny, aktivitásának növekednie kellene kálcium-ionhordozó anyag hozzáadására, ami a cGMP mennyiségének növekedését okozná. Amikor PC12 sejttenyészetekhez az A23187 ionhordozó anyagot adtuk, nem következett be a cGMP mennyiségének növekedése.

34. PÉLDA

A GUANOZINNAK A NEURIT-KÉPZŐDÉSRE GYAKOROLT HATÁSÁT A SZÉNMONOXID KÖZVETÍTI, NEM A NITROGÉN-MONOXID

Az előző példák eredményei alapján vizsgálatokat végeztünk annak bizonyítására, hogy a jelen találmány szerinti purin-származékok, közöttük a guanozin, az idegi tevékenységet a szénmonoxid-függő guanilil-cikláz rendszer módosítása útján befolyásolják.

A 6. Példához hasonlóan, amelyben inhibitorok felhasználásával kimutattuk, hogy a szénmonoxid közvetíti az AIT-082 vegyület hatását, ugyanazon módszerekkel bizonyítható, hogy a • ·* ···· *· ·* »· · « · · · » « Λ · ·«· ··· · • · · · · · ··· ·» ··♦ ···· vegyület hatását, ugyanazon módszerekkel bizonyítható, hogy a guanozin is kölcsönhatásba lép a szénmonoxid-függő rendszerrel. Közelebbről, amint a 24. ábrán látható, az L-nitro-arginin metil-észter (L-NAME), egy cNOS-gátló anyag nem befolyásolta a guanozin képességét, hogy növelje az NGF által kiváltott neurit-képződést. Ezek az adatok megerősítik, hogy a cNOS enzim nem szerepel abban a jelátviteli reakció-sorozatban, ami a guanozin PC12 sejtek neurit-képzésére gyakorolt hatását közvetíti .

Annak további bizonyítására, hogy nem annyira a NO, mint inkább a CO közvetíti a guanozin neurit-képződésre gyakorolt hatását, a növekedésben lévő sejtekhez cink protoporfirin IX-et (ZnPP) adtunk, ami gátolja a hém oxigenáz enzimet, és ezáltal gátolja a CO előállítását. Amint a 25. ábrán látható, a ZnPP megszüntette a guanozin neuritogenetikus hatását, de nem befolyásolta az NGF hatását. Ezzel szemben egy rokon protoporfirin származék, a réz protoporfirin IX (CuPP), nem gátolja a hém oxigenázt. A 26. ábra ennek megfelelően azt mutatja, hogy a réz protoporfirin IX nem csökkentette a guanozinnak azt a képességét, hogy PC12 sejtekben fokozza az NGF által kiváltott neurit-képződést. Ezek az adatok, csak-úgy, mint az AIT-082 vegyület esetében, arra utalnak, hogy a guanozin fokozza a CO-szintézist. A CO viszont aktiválja az sGC-t és növeli a GMP sejten belüli mennyiségét, és ezáltal elősegíti a neurit-képződést.

····· · ·· • · ···· ··· · • · · · · · · ··· ·· ··· · ····

35. PÉLDA

AZ IOZIN PRANOBEX FOKOZZA A NEURIT-KÉPZŐDÉST A jelen találmány alkalmazhatósági körének és működésének további bizonyítására neurit-képződési vizsgálatokat végeztünk inozin pranobex-szel. Az inozin pranobex közelebbről az inozin és DIP-PacBa 1:3 mólarányú keveréke. Ezen anyagot különböző koncentrációban adagoltuk NGF-vel kezelt PC12 sejtekhez, amelyeket azután a 12. Példa szerinti kísérleti elrendezésben követtünk.

Amint a 27. ábrán látható, a kezelt sejtekben az inozin pranobex lényegesen növelte a neurit-képződést. A 27. ábrán látható görbe inozin pranobex különböző koncentrációit jelenti NGF telítési koncentrációjával együtt adagolva, míg a vízszintes vonalak az NGF-vel kezelt kontroll szintet jelölik, a hozzátartozó megbízhatósági tartománnyal. Ebben a kísérletben a kezelt sejtek a legtöbb kiválasztott koncentrációnál a kontroll alapvonal fölött helyezkednek el.

A sejteknek, közelebbről az idegsejteknek a jelen találmány elveivel összhangban való módosítása a sejtekkel és az idegi elfajulással kapcsolatos betegségek széles körének a kezelésére használható, a sejtek vagy idegsejtek működése helyreállítása útján. Ilymódon a jelen találmány bármely okból bekövetkező sejt- vagy idegsejtelfájulás kezelésére alkalmazható, az ok lehet oxidatív sztressz, betegség, sérülés, öregedés, valamint káros fizikai vagy kémiai anyagok hatása. Hasonlóan, a jelen találmányban leírt módszerek és gyógyhatású anyagok alkalmazhatók - többek között - a következő idegrendszeri betegségek kezelésére: Alzheimer-kór és

• · · · azzal összefüggő elfajulás! rendellenességek, Parkinson-kór, és azzal összefüggő rendellenességek, mint például a striatonigrális idegpálya elfajulása, gerincagy/kisagyi sorvadás, motoros idegrendszeri zavarok, vagy a motoros rendszer betegségei, többek között az Amyotróf Laterális Szklerózis, a Werdnig-Hofmann-kór, a Wohlfart-Kugelberg-Welander tünetegyüttes és az öröklött Little-kór, az idegsejtek ischémiás károsodása (mint agyvérzés esetén), az anoxia vagy a hipoglicémia (mint például a vérkeringés hosszantartó pangása után) a Huntington-kór, agyi bénulás, szklerózis multiplex, pszichiátriai betegségek, mint érzelmi rendellenességek, skizofrénia, epilepszia és agyvérzés, bármilyen okból bekövetkezett perifériás idegrendszeri betegség, tanulási nehézségek és a memória rendellenességei. Kezelhetők még az idegsejtek, vagy azok folyamatainak károsodása, amit akár fizikai hatások, például sugárzás vagy elektromos áramok, akár vegyszerek, mint az alkohol, az alumínium, nehézfémek, ipari mérgek, természetes mérgek, illetve gyógyszerek vagy kábítószerek okoztak. A módszerek alkalmazhatók továbbá idegrendszeri károsodást okozó agyi vagy gerincoszlopi sérülések áldozatai kezelésére, vagy az öregedéssel összefüggő állapotok, mint például jóindulatú feledékenység, és az érzékelő, motoros, reflex vagy értelmi képességeknek az idegek vagy idegi kapcsolatok elfajulása miatt bekövetkező leromlása kezelésére. Ha az előzőekben felsorolt bármely sejt- vagy idegsejt rendellenességben szenvedő egyednek beadjuk a jelen találmány szerinti legalább egy szénmonoxid-függő guanilil-cikláz ····· · ·· • · ···* ··· · • · · · · · · • · · ·· ··· · ···· módosító purin-származék hatásos adagját, az olyan sejten belüli változásokat okoz, ami a működés helyreállítását eredményezi.

Közelebbről, a szénmonoxid/függő guanilil-cikláz rendszernek a jelen találmány elvei szerinti módosítása változásokat okoz az idegsejtek és a gliasejtek, közöttük az asztrociták idegi tevékenységében. Például, a jelen találmány felhasználásával az asztrociták működése olymódon módosítható, hogy azok különféle neurotróp tényezőket és citokineket állítsanak elő, közöttük fibroblaszt növekedési tényezőt (FGF), idegi növekedési tényezőt (NGF), az agyból származó neurotróp tényezőt (BDNF), és neurotrofin-3 tényezőt (NT-3). Ezek a tényezők befolyásolhatják a túlélő idegsejtek neurit-képződésének beindulását, valamint elősegíthetik új sejtek kifejlődését, ílymódon új szinapszisok képződhetnek, és ez bizonyos fokig a működés helyreállításához vezethet. Ezeknek a neurotróp tényezőknek az idegrendszert védő szerepük is van. ílymódon, ha képződésüket elősegítjük, az további idegi károsodásokat is kedvezően befolyásolhat.

A jelen találmány elveivel összhangban számos purin-származék alkalmazható. Az a képesség azonban, hogy az idegi tevékenységet a szénmonoxid-függő guanilil-cikláz rendszer módosítása útján befolyásolja, nem az összes purin-vázas vegyületnek vagy purin-származéknak az általános tulajdonsága. Például, a bemutatott adatok szerint az inozin, az adenozin, a hipoxantin és a xantin valamennyien viszonylag hatástalanok az idegi tevékenység módosításában. További purin-származékok, amelyek nem módosítják az idegi aktivitást: a 3-(6-amino-9H• · ····· · ·· • · ···· · ·· · ··· ·· ··« · ····

-purin-9-il)propionsav etil-észter (AIT-0026), a 3-(1,6-dihidro-6-oxo-9H-purin-9-il)-N-{ 3-(2-oxopirrolidin-l-il)propil} -propánamid (AIT-0034) és a propentofillin. Ezenkívül, bár egyéb purinvázas vegyületek és purin-származékok, mint például az 5'-N-etilkarboxamido-adenozin (NECA), a kísérletek szerint serkentik a neurit-képződést, azok nem a szénmonoxid-függő guanilil-cikláz mechanizmus módosítása útján fejtik ki hatásukat. Ennek megfelelően, a találmány oltalmi körét a purin-származékok azon köre határozza meg, amelyek a sejtek vagy az idegsejtek tevékenységét az itt leírt hatásmechanizmus útján kifejtik ki, a bemutatott adatok szerint. Szakmai szempontból termé-szetesen elfogadható, hogy a jelen találmány szerinti vegyületek funkcionálisan egyenértékű izomer vegyületekkel, analógokkal és homológokkal helyettesíthetők.

Szakmai szempontból az is elfogadható továbbá, hogy a jelen találmány más formában is megjeleníthető, annak alapelvei vagy középponti jellemzői meghagyásával. Vagyis a jelen találmány előzőekben adott leírása csupán annak példálózó megvalósításait jelenti, a jelen találmány oltalmi körébe beleértendők egyéb változatok is. A jelen találmány oltalmi köre ennek megfelelően nem korlátozódik az itt részletesen leírt megvalósítási példákra. A jelen találmány oltalmi körét és tartalmát tekintve inkább az ahhoz csatlakozó szabadalmi igénypontokra kell hivatkozni.

Claims (91)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Emlősök idegi tevékenységének módosítására szolgáló gyógyhatású készítmény, a mondott gyógyhatású készítmény tartalmazza legalább egy, a szénmonoxid-függő guanilil-cikláz rendszert módosító purin-származék hatásos mennyiségét.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti gyógyhatású készítmény, amelyben a mondott, szénmonoxid-függő guanilil-cikláz módosító purin-származék a guanozin, 4-[[3-(l,6-dihidro-6-oxo-9H-purin-9-il)-1-oxo-propil] amino] benzoesav, és inozin pranobex valamelyike.
3. 3. Az 1. igénypont szerinti gyógyhatású készítmény, amelyben a mondott, szénmonoxid-függő guanilil-cikláz módosító purin-származék mondott hatásos mennyisége legalább 1 pmólos kezelési koncentrációt jelent.
4. 4. A 2. igénypont szerinti gyógyhatású készítmény, amelyben a mondott, szénmonoxid-függő guanilil-cikláz módosító purin-származékot orálisan adagolják emlős egyednek.
5. 5. A 2. igénypont szerinti gyógyhatású készítmény, amelyben a mondott, szénmonoxid-függő guanilil-cikláz módosító purin-származékot injekció alakjában adagolják emlős egyednek.
6. 6. Az 1. igénypont szerinti gyógyhatású készítmény, amelynél az emlős szervezet idegi tevékenységének módosítása neurotrofinok termelését jelenti.
7. 7. Az 1. igénypont szerinti gyógyhatású készítmény, amelynél az emlős szervezet idegi tevékenységének módosítása pleiotrofinok termelését jelenti.

   • · · · • · · ···· ·· • · · · · · • * **·· ·«· • · · · · • · · ·· ··· ·
8. 8. Az 1. igénypont szerinti gyógyhatású készítmény, amelynél az emlős szervezet idegi tevékenységének módosítása az idegsejtek megnövekedett túlélési képességét jelenti.
9. 9. Az 1. igénypont szerinti gyógyhatású készítmény, amelynél az emlős szervezet idegi tevékenységének módosítása kollaterális idegpályák képződését jelenti.
10. 10. Az 1. igénypont szerinti gyógyhatású készítmény, amelynél az emlős szervezet idegi tevékenységének módosítása neurit-képződést jelent.
11. 11. Az 1. igénypont szerinti gyógyhatású készítmény, amelynél az emlős szervezet idegi tevékenységének módosítása szinapszisok képződését jelenti.
12. 12. Az 1. igénypont szerinti gyógyhatású készítmény, amelynél az emlős szervezet idegi tevékenységének módosítása gyűrűs purin-nukleotidok képződését jelenti.
13. 13. Az 1. igénypont szerinti gyógyhatású készítmény, amelynél az emlős szervezet idegi tevékenységének módosítása a neurotrofinok vagy a pleiotrofinok megnövekedett aktivitását jelenti.
14. 14. A 13. igénypont szerinti gyógyhatású készítmény, amelynél a neurotrofinok vagy pleiotrofinok aktivitásának mondott növekedését az alábbi neurotrof tényezők valamelyike, vagy azok kombinációja váltja ki: idegi növekedési tényező, fibroblaszt növekedési tényező, neurotrofin-3, agyból származó neurotróp tényező, neurotrofin-4/5 csillós neurotróp tényező,

    S100B.
15. 15. Emlősök idegrendszeri megbetegedéseinek kezelésére szolgáló gyógyhatású készítmény, amely tartalmazza legalább ·· ···· ·· ·· • · · · · · • · · ·» · · · · ·· ··· * ···· egy, a szénmonoxid-függő guanilil-cikláz rendszert módosító purin-származék hatásos mennyiségét.
16. 16. A 15. igénypont szerinti gyógyhatású készítmény, amelyben a mondott, szénmonoxid-függő guanilil-cikláz módosító purin-származék a guanozin, 4-[ [ 3-(1,6-dihidro-6-oxo-9H-purin-9-il)-1-oxo-propil] amino] benzoesav, és inozin pranobex valamelyike.
17. 17. A 15. igénypont szerinti gyógyhatású készítmény, amelyben a mondott, szénmonoxid-függő guanilil-cikláz módosító purin-származék mondott hatásos mennyisége legalább 1 gmólos kezelési koncentrációt jelent.
18. 18. A 16. igénypont szerinti gyógyhatású készítmény, amelyben a mondott, szénmonoxid-függő guanilil-cikláz módosító purin-származékot orálisan adagolják a mondott emlős egyednek.
19. 19. A 16. igénypont szerinti gyógyhatású készítmény, amelyben a mondott, szénmonoxid-függő guanilil-cikláz módosító purin-származékot injekció alakjában adagolják a mondott emlős egyednek.
20. 20. A 15. igénypont szerinti gyógyhatású készítmény, amelyben a mondott, emlős szervezetben előforduló idegrendszeri megbetegedés Alzheimer-kór, és azzal kapcsolatos elfajulási rendellenességek.
21. 21. A 15. igénypont szerinti gyógyhatású készítmény, amelyben a mondott, emlős szervezetben előforduló idegrendszeri megbetegedés öregkori jóindulatú feledékenység, és azzal kapcsolatos elfajulás! rendellenességek.
22. 22. A 15. igénypont szerinti gyógyhatású készítmény, amelyben a mondott, emlős szervezetben előforduló ideg96 ··· ·· · · · rendszeri megbetegedés idegsejteknek és idegi kapcsolatoknak az öregedéssel kapcsolatos elhalása, valamint az érzékelőő, mozgató, reflex- vagy értelmi képességek azokkal összefüggő leromlása.
23. 23. A 15. igénypont szerinti gyógyhatású készítmény, amelyben a mondott, emlős szervezetben előforduló idegrendszeri megbetegedés Parkinson-kór, és azzal kapcsolatos elfajulás! rendellenességek.
24. 24. A 15. igénypont szerinti gyógyhatású készítmény, amelyben az emlős szervezet mondott idegrendszeri megbetegedése gerincagyi/kisagyi sorvadás.
25. 25. A 15. igénypont szerinti gyógyhatású készítmény, amelyben az emlős szervezet mondott idegrendszeri megbetegedése motoros neuropátia.
26. 26. A 15. igénypont szerinti gyógyhatású készítmény, amelyben az emlős szervezet mondott idegrendszeri megbetegedése az idegsejtek vagy azok működésének fizikai szerek általi károsodása.
27. 27. A 15. igénypont szerinti gyógyhatású készítmény, amelyben az emlős szervezet mondott idegrendszeri megbetegedése az idegsejtek ischemia (helyi vértelens ég), anoxia (oxigénhiány) vagy hipoglicémia (alacsony vércukor-szint) általi károsodása.
28. 28. A 15. igénypont szerinti gyógyhatású készítmény, amelyben az emlős szervezet mondott idegrendszeri megbetegedése az idegsejtek vagy azok működésének vegyszerek általi károsodása.

    • · · · ····· · ·· • · ···· ··· · • · · · · · · • · · ·· ··· · ····
29. 29. A 15. igénypont szerinti gyógyhatású készítmény, amelyben az emlős szervezet mondott idegrendszeri megbetegedése az agy vagy a gerincoszlop sérülése.
30. 30. A 15. igénypont szerinti gyógyhatású készítmény, amelyben az emlős szervezet mondott idegrendszeri megbetegedése epilepszia vagy agyvérzés.
31. 31. A 15. igénypont szerinti gyógyhatású készítmény, amelyben az emlős szervezet mondott idegrendszeri megbetegedése perifériás idegrendszeri betegség.
32. 32. A 15. igénypont szerinti gyógyhatású készítmény, amelyben az emlős szervezet mondott idegrendszeri megbetegedése korlátozott tanulási képesség.
33. 33. A 15. igénypont szerinti gyógyhatású készítmény, amelyben az emlős szervezet mondott idegrendszeri megbetegedése agyi bénulás.
34. 34. A 15. igénypont szerinti gyógyhatású készítmény, amelyben az emlős szervezet mondott idegrendszeri megbetegedése pszichiátriai rendellenesség.
35. 35. A 15. igénypont szerinti gyógyhatású készítmény, amelyben az emlős szervezet mondott idegrendszeri megbetegedése memória rendellenesség.
36. 36. A 15. igénypont szerinti gyógyhatású készítmény, amelyben az emlős szervezet mondott idegrendszeri megbetegedése Huntington-kór.
37. 37. Emlős szervezet idegsejtje membrán-potenciáljában tartós változásokat kiváltó gyógyhatású készítmény, amelyik tartalmazza legalább egy, a szénmonoxid-függő guanilil-cikláz rendszert módosító purin-származék hatásos mennyiségét.

    • · ···· »· ·· • · · ·· ··» · • · · · · · · ··· ·· ··· · ····
38. 38. A 37. igénypont szerinti gyógyhatású készítmény, amelyben a mondott, szénmonoxid-függő guanilil-cikláz módosító purin-származék a guanozin, 4-[ [ 3-(1,6-dihidro-6-oxo-9H-purin-9-il)-1-oxo-propil] -amino] -benzoesav, és inozin pranobex valamelyike.
39. 39. A 37. igénypont szerinti gyógyhatású készítmény, amelyben a mondott, szénmonoxid-függő guanilil-cikláz módosító purin-származék mondott hatásos mennyisége legalább 1 pmólos kezelési koncentrációt jelent.
40. 40. Gyógyhatású készítmény, amelyik emlős szervezetben szelektív és ellenőrizhető módon kiváltja legalább egy természetes, genetikailag kódolt molekula in vivő genetikai kifejeződését, amely gyógyhatású készítmény tartalmazza legalább egy, a szénmonoxid-függő guanilil-cikláz rendszert módosító purin-származék hatásos mennyiségét.
41. 41. A 40. igénypont szerinti készítmény, amelyben a mondott, szénmonoxid-függő guanilil-cikláz módosító purin-származék a guanozin, 4-[ [ 3-(1,6-dihidro-6-oxo-9H-purin-9-il)-1-oxo-propil] -amino] -benzoesav, és inozin pranobex valamelyike .
42. 42. A 40. igénypont szerinti gyógyhatású készítmény, amelyben a mondott, szénmonoxid-függő guanilil-cikláz módosító purin-származék mondott hatásos mennyisége legalább 1 pmólos kezelési koncentrációt jelent.
43. 43. A 40. igénypont szerinti gyógyhatású készítmény, amelyben a mondott, szénmonoxid-függő guanilil-cikláz módosító purin-származékot orálisan adagolják a mondott emlős egyednek.

    ····
44. 44. A 16. igénypont szerinti gyógyhatású készítmény, amelyben a mondott, szénmonoxid-függő guanilil-cikláz módosító purin-származékot injekció alakjában adagolják a mondott emlős egyednek.
45. 45.

    amelyben molekula
46. 46.

    amelyben
47. 47 .

    amelyben
48. 48 .

    amelyben tényezők tényező, származó tényező,

    A 40. igénypont szerinti gyógyhatású készítmény, legalább az egyik természetes, genetikailag kódolt egy neurotróp tényező.

    A 45. igénypont szerinti gyógyhatású készítmény, a mondott neurotróp tényező neurotropin.

    A 45. igénypont szerinti gyógyhatású készítmény, a mondott neurotróp tényező pleiotropin.

    A 45. igénypont szerinti gyógyhatású készítmény, a mondott neurotróp tényező az alábbi neurotróf valamelyike, vagy azok kombinációja: idegi növekedési fibroblaszt növekedési tényező, neurotrofin-3, agyból neurotróp tényező, neurotrofin-4/5 csillós neurotróp

    S100B.
49. 49. Olyan gyógyhatású készítmény, amely emlős szervezetben legalább egy természetes, genetikailag kódolt molekula hatásos közvetlen beadását teszi lehetővé olymódon, hogy szelektíven kiváltja a mondott molekula in vivő genetikai kifejeződését a mondott emlős szervezetben, és a mondott gyógyhatású készítmény tartalmazza legalább egy, szénmonoxidfüggő guanilil-cikláz módosító purin-származék hatásos mennyiségének beadását.
50. 50. A 49. igénypont szerinti készítmény, amelyben a mondott, szénmonoxid-függő guanilil-cikláz módosító purinszármazék a guanozin, 4-[ [ 3-(1,6-dihidro-6-oxo-9H-purin-9-il)• · ·

    100

    -1-oxo-propil] amino] benzoesav, és inozin pranobex valamelyike.
51. 51. A 49. igénypont szerinti gyógyhatású készítmény, amelyben a mondott, szénmonoxid-függő guanilil-cikláz módosító purin-származék mondott hatásos mennyisége legalább 1 pmólos kezelési koncentrációt jelent.
52. 52. A 49. igénypont szerinti gyógyhatású készítmény, amelyben a mondott, szénmonoxid-függő guanilil-cikláz módosító purin-származékot orálisan adagolják a mondott emlős egyednek.
53. 53. A 40. igénypont szerinti gyógyhatású készítmény, amelyben a mondott, szénmonoxid-függő guanilil-cikláz módosító purin-származékot injekció alakjában adagolják a mondott emlős egyednek.
54. 54 .

    amelyben molekula
55. 55 .

    amelyben
56. 56.

    amelyben
57. 57 .

    amelyben tényezők tényező, származó tényező,

    A 40. igénypont szerinti gyógyhatású készítmény, legalább az egyik természetes, genetikailag kódolt egy neurotróp tényező.

    A 49. igénypont szerinti gyógyhatású készítmény, a mondott neurotróp tényező neurotropin.

    A 49. igénypont szerinti gyógyhatású készítmény, a mondott neurotróp tényező pleiotropin.

    A 49. igénypont szerinti gyógyhatású készítmény, a mondott neurotróp tényező az alábbi neurotróf valamelyike, vagy azok kombinációja: idegi növekedési fibroblaszt növekedési tényező, neurotrofin-3, agyból neurotróp tényező, neurotrofin-4/5 csillés neurotróp

    S100B.
58. 58. Gyógyhatású készítmény emlősökben előforduló, oxidatív sztressz által kiváltott sejtkárosodással járó kóros állapotok kezelésére legalább egy természetes, endogén anti• ·« · ··· • · · · · · • · · · · · · ·*· ·« ··· · ·«·· ιοί oxidáns in vivő előállításának előidézésével, és a mondott gyógyhatású készítmény tartalmazza legalább egy, szénmonoxidfüggő guanilil-cikláz módosító purin-származék hatásos mennyiségének beadását.
59. 59. Az 58. igénypont szerinti készítmény, amelyben a mondott, szénmonoxid-függő guanilil-cikláz módosító purin-származék a guanozin, 4-[ [ 3-(1,6-dihidro-6-oxo-9H-purin-9-il)-1-oxo-propil] amino] benzoesav, és inozin pranobex valamelyike.
60. 60. Az 58. igénypont szerinti gyógyhatású készítmény, amelyben a mondott, szénmonoxid-függő guanilil-cikláz módosító purin-származék mondott hatásos mennyisége legalább 1 pmólos kezelési koncentrációt jelent.
61. 61. Az 59. igénypont szerinti gyógyhatású készítmény, amelyben a mondott, szénmonoxid-függő guanilil-cikláz módosító purin-származékot orálisan adagolják a mondott emlős egyednek.
62. 62. Az 59. igénypont szerinti gyógyhatású készítmény, amelyben a mondott, szénmonoxid-függő guanilil-cikláz módosító purin-származékot injekció alakjában adagolják a mondott emlős egyednek.
63. 63. Az 58. igénypont szerinti gyógyhatású készítmény, amelyben a mondott, emlős szervezetben előforduló idegrendszeri megbetegedés Alzheimer-kór, és azzal kapcsolatos elfajulás! rendellenességek.
64. 64. Az 58. igénypont szerinti gyógyhatású készítmény, amelyben a mondott, emlős szervezetben előforduló idegrendszeri megbetegedés öregkori jóindulatú feledékenység, és azzal kapcsolatos elfajulási rendellenességek.

    ·* · « · ····· · ·« • · ·«·» · ·9 · • · · ' * · · ·«« · · ··· « ····

    102
65. 65. Az 58. igénypont szerinti gyógyhatású készítmény, amelyben a mondott, emlős szervezetben előforduló idegrendszeri megbetegedés idegsejteknek és idegi kapcsolatoknak az öregedéssel kapcsolatos elhalása, valamint az érzékelőő, mozgató, reflex- vagy értelmi képességek azokkal összefüggő leromlása.
66. 66. Az 58. igénypont szerinti gyógyhatású készítmény, amelyben a mondott, emlős szervezetben előforduló idegrendszeri megbetegedés Parkinson-kór, és azzal kapcsolatos rendellenességek .
67. 67. Az 58. igénypont szerinti gyógyhatású készítmény, amelyben az emlős szervezet mondott idegrendszeri megbetegedése gerincagyi/kisagyi sorvadás.
68. 68. Az 58. igénypont szerinti gyógyhatású készítmény, amelyben az emlős szervezet mondott idegrendszeri megbetegedése motoros neuropátia vagy Amyotróf Laterális Szklerózis.
69. 69. Az 58. igénypont szerinti gyógyhatású készítmény, amelyben az emlős szervezet mondott idegrendszeri megbetegedése az idegsejtek vagy azok működésének fizikai szerek általi károsodása.
70. 70. Az 58. igénypont szerinti gyógyhatású készítmény, amelyben az emlős szervezet mondott idegrendszeri megbetegedése az idegsejtek ischemia, anoxia vagy hipoglicémia általi károsodása.
71. 71. Az 58. igénypont szerinti gyógyhatású készítmény, amelyben az emlős szervezet mondott idegrendszeri megbetegedése az idegsejtek vagy azok működésének vegyszerek általi károsodása.

    »«· ··· • · • · · · · · · • a a ·* ··· * ····

    103
72. 72. Az 58. igénypont szerinti gyógyhatású készítmény amelyben az emlős szervezet mondott idegrendszeri megbetegedése a szív, az agy vagy a gerincoszlop sérülése.
73. 73. Az 58. igénypont szerinti gyógyhatású készítmény amelyben az emlős szervezet mondott idegrendszeri megbete gedése epilepszia vagy agyvérzés.
74. 74. Az 58. igénypont szerinti gyógyhatású készítmény amelyben az emlős szervezet mondott idegrendszeri megbete gedése perifériás neuropátia.
75. 75. Az 58. igénypont szerinti gyógyhatású készítmény amelyben az emlős szervezet mondott idegrendszeri megbete gedése korlátozott tanulási képesség.
76. 76. Az 58. igénypont szerinti gyógyhatású készítmény amelyben az emlős szervezet mondott idegrendszeri megbete gedése agyi bénulás.
77. 77. Az 58. igénypont szerinti gyógyhatású készítmény amelyben az emlős szervezet mondott idegrendszeri megbete gedése pszichiátriai rendellenesség.
78. 78. Az 58. igénypont szerinti gyógyhatású készítmény amelyben az emlős szervezet mondott idegrendszeri megbete gedése memória rendellenesség.
79. 79. Az 58. igénypont szerinti gyógyhatású készítmény amelyben az emlős szervezet mondott idegrendszeri megbete gedése Huntington-kór.
80. 80. Az 58. igénypont szerinti gyógyhatású készítmény amelyben a mondott endogén antioxidáns anyag epefesték.

    ···· ·· • · ·· · · « · · * » · · »·* «·ς, · • · · · « · · «·· ·· ··» » ··»·

    104
81. 81. A 80. igénypont szerinti gyógyhatású készítmény, amelyben a mondott epefesték biliverdin vagy bilirubin valamelyike .
82. 82. A 80. igénypont szerinti gyógyhatású készítmény, amelyben a mondott epefesték úgy képződik, hogy a hém oxigenáz enzim lebontja a hémet.
83. 83. Gyógyhatású készítmény emlős szervezetben hém oxigenáz enzim in vivő előállítására, és a mondott gyógyhatású készítmény tartalmazza legalább egy, szénmonoxid-függő guanilil-cikláz módosító purin-származék hatásos mennyiségének beadását.
84. 84. A 83. igénypont szerinti készítmény, amelyben a mondott, szénmonoxid-függő guanilil-cikláz módosító purinszármazék a guanozin, 4-[ [ 3-(1,6-dihidro-6-oxo-9H-purin-9-il)-1-oxo-propil] amino] benzoesav, és inozin pranobex valamelyike.
85. 85. A 83. igénypont szerinti gyógyhatású készítmény, amelyben a mondott, szénmonoxid-függő guanilil-cikláz módosító purin-származék mondott hatásos mennyisége legalább 1 pmólos kezelési koncentrációt jelent.
86. 86. A 84. igénypont szerinti gyógyhatású készítmény, amelyben a mondott, szénmonoxid-függő guanilil-cikláz módosító purin-származékot orálisan adagolják a mondott emlős egyednek.
87. 87. A 87. igénypont szerinti gyógyhatású készítmény, amelyben a mondott, szénmonoxid-függő guanilil-cikláz módosító purin-származékot injekció alakjában adagolják a mondott emlős egyednek.
88. 88. A 83. igénypont szerinti gyógyhatású készítmény a mondott emlős szervezetben a hémnek hém oxigenázzal való

    105 lebontását idézi elő, és ilymódon a szervezeten belül epe festék és szénmonoxid képződik.
89. 89. A 88. igénypont szerinti gyógyhatású készítmény amely a mondott emlős szervezetben a mondott, endogén szénmo noxiddal módosítja a guanilil-cikláz enzimet.
90. 90. A 88. igénypont szerinti gyógyhatású készítmény amely a mondott emlős szervezetben a mondott, endogén epe festékkel semlegesíti vagy megköti a szabad gyököket.
91. 91. A 88. igénypont szerinti gyógyhatású készítmény amely a mondott emlős szervezetben a mondott, endogé szénmonoxiddal csökkenti a vérnyomást.