CZ380296A3 - Léčivo pro dlouhodobou modifikaci savčí neurální aktivity, léčení neurologických chorob, indukci dlouhodobých změn membránového potenciálu neuronů a jiné účely - Google Patents

Description

Oblast techniky y

Vynález se obecně týká regulace buněčné a neurální aktivity a léčení buněčných a nervových poruch. Vynález je zejména zaměřen na způsoby, prostředky a léčiva pro modifikaci savčí buněčné a neurální aktivity podáváním purinových derivátů modulujících guanylyl cyklasu dependentní na oxidu uhelnatém. Tyto deriváty selektivně a regulovaně indukují in vivo genetickou expresi přírodních geneticky kódovaných molekul včetně neurotrofických faktorů. Způsobů, prostředků a léčiv podle tohoto vynálezu se může použít pro ovlivnění různých buněčných a neurologických aktivit a pro terapeutické nebo profylaktické léčení celé řady fyziologických, neurodegenerativních a neurologických poruch.

Dosavadní stav techniky

Vývoj centrálního nervového systému u savců byl přirozenou odpovědí na zvyšující se složitost prostředí, která si žádala řešení obtížných problémů. Výsledná struktura představuje důvtipnou biochemickou matrici, která je přesně řízena a atenuována důmyslným systémem chemicky modulovaných regulačních drah. Prostřednictvím komplexní série vysoce specifických chemických reakcí mají tyto dráhy přehled nad každým strukturním a operačním aspektem centrálního nervového systému a jeho prostřednictvím nad celým organismem a zajišťují jejich řízení. Za normálních okolností složitá interakce různých kontrolních systémů spolupracuje za účelem získání vysoce účinného všestran2

ného centrálního nervového systému řízeného mozkem. Když je však bohužel biochemická matrice centrálního nervového systému poškozena, buď věkem, chorobou nebo z jiných důvodů, mohou normální regulační dráhy ztratit schopnost účinně kompenzovat takovou ztrátu. V těchto případech by bylo vysoce žádoucí modifikovat nebo doplnit nervové mechanismy tak, aby se zabránilo výše uvedeným poruchám nebo aby byly tyto poruchy kompenzovány. Vynález je zaměřen právě tímto směrem.

Mozek savce se skládá z přibližně 10 miliard nervových buněk (neuronů), které jsou obklopeny ještě větším počtem podpůrných buněk, které jsou známy pod označením neuroglia neboli astrocytové buňky. Neurony, podobně jako jiné buňky v těle, se skládají z jádra, cytoplasmy a obklopující buněčné membrány. Na rozdíl od jiných buněk však neurony také obsahují jedinečné vláknité výčnělky, které každé jednotlivé nervové buňce umožňují spojení do sítě z doslovně tisíci jiných nervových buněk za vzniku nervové infrastrutury či sítě. Komunikace v rámci této složité sítě zajišťuje bázi pro všechny mentální procesy probíhající v organimu.

Každá nervová buňka přijímá vstupní signály prostřednictvím nervových výčnělků, označovaných názvem dentrity. Počet dendritů vztažený na jednu nervovou buňku může dosahovat několika tisíc. Podobně je nervová informace přenášena strukturami označovanými názvem axony”, které se mohou rozvětvovat až do desetitisíc různých nervových zakončení. Axony a dendrity nervové buňky se označují obecným názvem neurity. Každý jednotlivý neuron může být pomocí těchto neuritů spojen s velkým počtem jiných neuronů. V důsledku toho počet možných nervových spojení ve zdravém mozku dosahuje hodnoty řádu bilionu, takže výsledná mentální kapacita je obrovská. Když se naopak spojení v rámci nervové • · sítě přeruší v důsledku odumření nervových buněk nebo jejich degenerace chorobou, věkem, oxidačním stresem nebo přímým fyzickým napadením, mentální kapacita organismu se může výrazně snížit.

Ke spojení jednotlivých axonů s dendrity nebo těly buněk jiných neuronů dochází ve spojovacích místech označovaných názvem synapse. Právě v synapsích spolu jednotlivé neurony komunikují prostřednictvím toku chemických mediátorů přes synaptické spojení. Většina těchto chemických mediátorů či neurotransmiterů jsou malé peptidy, katecholaminy nebo aminokyseliny. Když axonové nervové spojení obdrží příslušný stimul, neurotransmitery difundují přes synapsi k sousednímu neuronu a přenášejí tak stimul vedlejšímu neuronu v nervové síti. Na základě složitosti informací přenášených mezi nervovými buňkami se v současné době předpokládá, že pro přenos signálů v savčím mozku se používá 50 až 100 různých neurotransmiterů.

Zcela nedávno bylo zjištěno, že oxid dusnatý (NO) a oxid uhelnatý (CO) mohou fungovat jako neurotransmitery.

Zdá se, že se tyto plynné molekuly podílejí na řadě neuronálních regulačních drah ovlivňujících růst a interakce buněk. V mozku, stejně tak jako v jiných částech těla, je oxid uhelnatý produkován enzymem hem oxygenasa II (HO).

At již je oxid uhelnatý produkován enzymem HO nebo pochází z jiných zdrojů, předpokládá se, že když difunduje do neuronu, indukuje zvýšenou tvorbu sekundární transmiterové molekuly známé pod názvem cyklický guanosinmonofosfát (cGMP) prostřednictvím modulace enzymu známého pod označením guanylát cyklasa nebo guanylyl cyklasa.

Oxid uhelnatý tedy působí jako signalizační molekula v regulační dráze guanylyl cyklasy. Zvýšená hladina cGMP, které se při tom dosahuje, zřejmě modifikuje několik • · · ·

neurotrofických faktorů a jiných neuronálních faktorů, jež mohou indukovat, vyvolávat nebo modifikovat řadu buněčných funkcí, včetně růstu, ochrany a mezibuněčné komunikace buněk.

Neurotrofické faktory jsou molekuly vykazující různé účinky stimulující jak vývoj, tak diferenciaci neuronů a zachování buněčné integrity a jsou nezbytné pro přežití a vývoj neuronů v životním cyklu organismu. Obecně lze neurotrofické faktory rozdělit do dvou velkých tříd: neurotrofiny a pleiotrofiny. Pleiotrofiny se od neurotrofinů odlišují tím, že postrádají molekulární signální sekvenci, která je charakteristická pro molekuly, jež jsou vylučovány z buněk a také ovlivňují mnoho typů buněk včetně neuronů. Obzvláště důležité jsou dva účinky neurotrofických faktorů:

i) prevence odumírání neuronů a ii) stimulace růstu neuritů (buď nascentních axonů nebo dendritů). Kromě toho se zdá, že neurotrofické faktory indukované oxidem uhelnatým mohou snižovat membránový potenciál nervových buněk, což usnadňuje neuronům přijímat a přenášet signály.

Mnozí ze současných vědců se domnívají, že pamět je spojena s modifikací synaptické aktivity, při níž se zesilují nebo vytvářejí synaptická spojení mezi specifickými skupinami neuronů v mozku po opakované aktivaci. Taková modifikovaná spojení se v důsledku toho mnohem snadněji aktivují. Tento typ modifikace pravděpodobně probíhá v celém mozku, ale zvláště výrazný může být v hippocampu, což je oblast mozku, která má rozhodující význam pro pamět. Stimulace neuronálních drah v hippocampu může zesilovat synaptický přenos těmito drahami řadu dnů po původní stimulaci. Tento postup se označují názvem dlouhodobá potenciace (long term potentiation - LTP).

Dlouhodobá potenciace představuje formu synaptické elektrické aktivity dependentní na aktivitě, k níž dochází v mnoha neuronálních drahách. V tomto stavu, který je obecně přijímán jako typ buněčné paměti, jsou nervové buňky responsivnější vzhledem ke stimulaci. Díky tomu se v široké míře předpokládá, že LTP zajišťuje výborný model pro porozumění buněčnému a molekulárnímu základu synaptické plasticity jež je podkladem učení a paměti u obratlovců včetně člověka.

Oxid dusnatý a oxid uhelnatý jsou v současné době čelnými kandidáty mediátorových látek umožňujících LTP, poněvadž inhibitory těchto sloučenin retardují indukci potenciace. Schopnost modifikovat nervovou aktivitu a usnadnit LTP za použití těchto a jiných signálních transducerů by mohla potenciálně zvýšit rychlost učení a kognitivní kapacitu a snad kompenzovat sníženou mentální bystrost. Před vyvinutím tohoto vynálezu nebyly známy žádné metody ani činidla, které by mohly pracovat na buněčné úrovni in vivo za účelem spolehlivé modifikace buněčných a nervových regulačních drah za účelem usnadnění LTP neuronů.

Na rozdíl od zvýšení mentální kapacity zajišťovaného dlouhodobou potenciací mohou být mentální funkce v různém rozsahu zhoršovány, když dojde k narušení neuronální sítě v důsledku odumření nebo dysfunkce nervových buněk, které tuto síť vytvářejí. Pokles mentálních schopností má sice přímý vztah k narušení neurální sítě, ale je důležité mít na paměti, že k tomuto narušení dochází na úrovni jednotlivých buněk. Na této úrovni mohou být škodlivé účinky spojené s narušením neuronů vyvolány kterýmkoliv z řady faktorů zahrnujících neurodegenerativní choroby a poruchy, srdeční záchvat, mrtvice, stárnutí, úrazy a expozice škodlivým chemickým vlivům nebo vlivům životního prostředí.

• ···· · ·· ·· · ·«···· · • · · · ··· ·· · • · · · · · · · · · · • · · · · · · ·· ····

Ze známých neurologických chorob, které nepříznivě ovlivňují funkci neuronů, je možno uvést Alzheimerovu chorobu a podobné poruchy, Parkinsonovu chorobu, motorické neuropatické choroby, jako je amyotrofická laterální sklerosa, cerebrální paralýza, roztroušená sklerosa a Huntingtonova choroba. Podobné problémy mohou být vyvolány ztrátou neuronálních receptorů. V důsledku toho jsou nervové buňky ovlivňovány souhrou různých neurotrofických faktorů, z nichž každý přispívá k různých aspektům vývoje neuronů v různé době. Neurotrofické faktory efektivně představují konec této kaskády a jsou tedy jednou z nejsložitějších složek regulační dráhy. Proto byl dosavadní přístup založený na předpokladu, že by neatenuované podávání jednotlivých neurotrofických faktorů v náhodnou dobu (z hlediska buněk) mohlo podstatně zlepšit aktivitu nebo regeneraci buněk, zcela naivní. Naproti tomu, modifikace regulační dráhy v časnějším stádiu kaskády by mohla umožnit produkci správných růstových faktorů ve správných relativních množstvích a jejich zavedení do složitého buněčného prostředí ve správnou dobu.

Také jiné praktické ohledy znemožňovaly podle dosavadního stavu techniky použití neurotrofických faktorů pro stimulaci regenerace sítě neuronů. Neurotrofické faktory (včetně neurotrofinů a pleiotrofinů) jsou velké proteiny a jako takové je nelze podávat normálními způsoby podávání léčiv. Tak například tyto proteiny nelze dodávat pacientovi orálně, poněvadž zažívací systém pacienta je stráví dříve než se dostanou na cílové místo v nervech. Kromě toho jsou tyto proteiny příliš rozměrné, než aby mohly překročit bariéru mezi krví a mozkem a dospět na nejdůležitější neurologické místo v těle. Alternativní způsob přímého injekčního podávání neurotrofických faktorů do mozku nebo mozkomíšního moku sice překonává tuto obtíž, ale je spojeno s inherentními technickými problémy, které až dosud nebylo ·· · ······ · • · · · · · · ·· · možno překonat. Tak například přímá infuze známých neurotrofinů do mozku se ukázala jako nepraktická, poněvadž by pro dosažení terapeuticky užitečných koncentrací vyžadovala několikaleté podávání. Přímé injekční podávání do mozku je také za velmi krátkou spojeno s nebezpečnými otoky a záněty nervové tkáně. Přestože je tedy přímé podávání neurotrofických faktorů pacientovi s teoretického hlediska žádoucí, v současné době je neproveditelné.

Úkolem tohoto vynálezu je proto zajistit metody, prostředky, jakož i léčiva pro účinnou modifikaci savčích buněk, neuronů, buněčné aktivity nebo neurální aktivity za účelem dosažení řady prospěšných výsledků. Tyto výsledky zahrnují ochranu proti oxidačnímu stresu a poškození volnými radikály a generalizovanější fyzické odpovědi, jako je snížení krevního tlaku savce.

Dalším úkolem tohoto vynálezu je tedy vyvinout metody, prostředky a léčiva pro léčení nervových chorob a buněčných poruch savců.

Ještě dalším úkolem tohoto vynálezu je vyvinout metody, prostředky a léčiva pro indukci dlouhodobých změn membránového potenciálu nervových buněk savce.

Dalším úkolem tohoto vynálezu je vyvinout metody, prostředky a léčiva pro indukci in vivo fyziologické produkce a podávání geneticky kódovaných molekul a neurotrof ických faktorů v buňkách.

Konečně je úkolem tohoto vynálezu také vyvinout metody, prostředky a léčiva pro zvyšování neurotogenních účinků neurotrofických faktorů ve fyziologickém prostředí.

·« · · • · · • · * ·· · · · · ······ · • · · · · · • · ·· · · · · • · · · ·

Podstata vynálezu

V nejobecnějším vyjádření jsou předmětem tohoto vynálezu způsoby, prostředky a léčiva zajištující selektivní indukci in vivo genetické exprese a výsledné produkce přirozených geneticky kódovaných molekul zahrnujících neurotrofické faktory, a modifikace buněčné a neurální aktivity prostřednictvím léčení savčích buněk a neuronů za použití alespoň jednoho purinového derivátu modulující guanylyl cyklasu dependentní na oxidu uhelnatém.

Jak je zřejmé odborníkům v tomto oboru, in vivo aktivace a dereprese genetické exprese a exemplární modifikace buněčné a neurální aktivity, které mohou být vyvolány za použití způsobů, prostředků a léčiv podle tohoto vynálezu, lze exprimovat v různých formách nebo kombinacích. Tak například léčení savčí buňky nebo neuronu za použití poznatků podle tohoto vynálezu může vést k tomu, že si buňka bude sama sobě podávat in vivo exprimovanou molekulu nebo molekuly prostřednictvím zvýšené buněčné produkce různých přirozených geneticky kódovaných sloučenin, jako jsou proteiny a neurotrofické faktory, nebo že bude stimulovat aktivitu těchto sloučenin a jejich následný účinek na přirozený metabolismus, funkci, vývoj a přežití buněk nebo neuronů. Tyto následné účinky mohou zahrnovat ochranu před oxidací volnými radikály a destrukcí buněk, stabilizaci buněčných receptorů proti jiným faktorům, endogenní produkci oxidu uhelnatého a sloučenin typu antioxidantů a dokonce i snížení krevního tlaku prostřednictvím buněčných mechanismů aktivovaných oxidem uhelnatým. Pomocí způsobů a léčiv podle tohoto vynálezu je také možno stimulovat růst, vývoj a přežití buněk či neuronů přímo, bez škodlivých účinků, jež jsou vlastní metodám podle dosavadního stavu techniky.

Tohoto vynálezu lze také dále použít pro snižování nebo • 9999

9 • ··· • · 9 • 9*

9 « 9 9 9 • 9 · · · ·

9 · 9 ··· 9 • · · · · • •9 ·» 99 ·

9999 změny membránového potenciálu buňky, zvyšování synaptické plasticity a indukci dlouhodobě potenciace.

Jako příklady purinových derivátů modulujících guanylyl cyklasu dependentní na oxidu uhelnatém, které jsou užitečné pro provádění tohoto vynálezu, je možno uvést guanosin, inosin pranobex a 4-[3-(l,6-dihydro-6-oxo-9purin-9-yl)-l-oxopropyl]aminobenzoovou kyselinu (AIT-082).

Na rozdíl od sloučenin známých z dosavadního stavu techniky je tyto sloučeniny možno podávat pacientovi přímo, bud orálně nebo injekčně nebo jinými vhodnými cestami. Tyto sloučeniny, uvedené jako příklad, jsou netoxické a také jsou schopny překročit bariéru mezi krví a mozkem.

Dalším specifičtějším aspektem tohoto vynálezu je použití způsobů a prostředků podle vynálezu pro léčení a profylaxi neurologických chorob a jiných buněčných chorob, včetně chorob vyvolaných jinými chorobami, oxidačním stresem, věkem, úrazem nebo expozicí škodlivým chemickým činidlům. Tím, že vynález podporuje přežívání, růst a vývoj jednotlivých neuronů a buněk, usnadňuje také regeneraci a vývoj nervové sítě a odstraňuje projevy buněčné a neurální dysfunkce.

Purinové deriváty modifikující guanylyl cyklasu dependentní na oxidu uhelnatém podle tohoto vynálezu je možno zpracovávat na farmaceutické prostředky a léčiva v souladu s běžnou farmaceutickou praxí známou odborníkům v tomto oboru. Přitom se může používat farmaceuticky vhodných excipientů a nosičů. Získané farmaceutické prostředky je možno podávat orálně, transdermálně, topikálně nebo injekčně. Jelikož jsou účinná činidla používaná podle vynálezu schopna překročit bariéru mezi krví a mozkem, není nutno je podávat přímými injekcemi nebo infuzemi do mozku nebo centrálního nervového systému.

• · ··· ·

Dalším aspektem tohoto vynálezu je použití metod a prostředků podle vynálezu pro indukci dlouhodobých změn membránového potenciálu savčího neuronu. Tyto dlouhodobé potenciační změny mohou vést ke zvýšené membránové plasticitě a odpovídajícímu zvýšení buněčné paměti. Zvýšená pamět buněk má dále za následek zvýšení mentální kapacity subjektu, které vede k rychlejšímu učení a zvýšené retenci látky.

Další předměty, znaky a výhody tohoto vynálezu budou zřejmé odborníkům v tomto oboru z následujícího podrobného popisu přednostních příkladných provedení. Při objasňování těchto příkladných provedení se používá odkazů na data znázorněná na připojených výkresech, které nyní budou v krátkosti charakterizovány.

Přehled obr, na výkresech

Na obr. 1 je uvedeno grafické znázornění závislosti koncentrace purinového derivátu AIT-082 podle vynálezu v myší plasmě na čase.

Na obr. 2 je graficky znázorněn účinek atropinu, cholinergického antagonisty, na posílení paměti u myší pomocí purinového derivátu AIT-082.

Na obr. 3 je graficky znázorněna neurotogenní odpověď zprostředkovaná faktorem růstu nervů v nervových buňkách pěstovaných in vitro za přítomnosti různých koncentrací purinového derivátu AIT-082.

Na obr. 4A, 4B a 4C je provedeno grafické porovnání účinků selektivních inhibitorů a purinového derivátu AIT-082 na neurotogenní odpověď zprostředkovanou faktorem růstu nervů; na obr. 4A je znázorněna neurotogenní odpověď buněk • · · ·

pěstovaných za přítomnosti methemoglobinu, látky zachycující oxid uhelnatý; na obr. 4B je znázorněna stejná odpověď buněk pěstovaných za přítomnosti methylenové modři, inhibitoru guanylyl cyklasy; na obr. 4C je znázorněna odpověď buněk pěstovaných za přítomnosti protoporfyrinu zinku IX, což je látka zachycující oxid uhelnatý.

Na obr. 5A a 5B je provedeno grafické porovnání neurotogenní odpovědi zprostředkované faktorem růstu nervů u buněk pěstovaných za přítomnosti purinového derivátu AIT-082 a různých koncentrací inhibitorů oxidu dusnatého.

Na obr. 6 je znázorněno grafické porovnání produkce cyklického GMP v neuronálních buňkách pěstovaných v kultuře, jednak za přítomnosti a jednak bez purinového derivátu AIT-082.

Na obr. 7 jsou graficky znázorněny účinky různých dávek purinového deriváty AIT-082 na učení při zkoušce na pamět win-shift memory test” u myší Swiss Webster.

Na obr. 8 je graficky znázorněno trvání účinku purinového derivátu AIT-082 po podání jednotlivých dávek 60 a 30 mg/kg.

Na obr. 9 je graficky znázorněna schopnost učení myší Swiss Webster vykazujících deficit paměti způsobený věkem při léčení purinovým derivátem AIT-082 a léčivem fysostigminem.

Na obr. 10 je graficky znázorněna schopnost učení myší C57BL/6 vykazujících deficit paměti způsobený věkem při léčení purinovým derivátem AIT-082 a léčivem fysostigminem.

·· ·

Na obr. 11 je graficky znázorněna profylaxe deficitu paměti vyvolaného věkem myší při léčení purinovým derivátem AIT-082 ve srovnání neléčenými myšmi.

Na obr. 12A a 12B je uvedeno grafické porovnání produkce faktoru růstu nervů myšími kortikálními astrocyty v odpovědi na přídavek purinových derivátů podle měření stanovením ELISA; obr. 12A ilustruje koncentrace růstového faktoru nervů naměřené u neuronů pěstovaných za přítomnosti různých koncentrací guanosintrifosfátu a obr. 12B ilustruje koncentrace růstového faktoru nervů naměřené u neuronů pěstovaných za přítomnosti různých koncentrací guanosinu.

Na obr. 13A a 13B je provedeno grafické porovnání produkce různých mRNA neurotrofického faktoru myšími kortikálními astrocytovými buňkami kultivovanými různou dobu za přítomnosti nebo nepřítomnosti guanosinu; obr. 13A ilustruje hladinu mRNA růstového faktoru nervů (NGF) a obr. 13B ilutruje hladinu mRNA růstového faktoru fibroblastů (FGF).

Na obr. 14A, 14B a 14C je provedeno grafické porovnání neurotogenních odpovědí na různé koncentrace purinových derivátů za přítomnosti a nepřítomnosti růstového faktoru nervů; obr. 14A ilustruje neurotogenní odpověď na různé purinové deriváty při různých koncentracích za přítomnosti růstového faktoru nervů, 14B ilustruje neurotogenní odpověď za nepřítomnosti růstového faktoru nervů a obr. 14C ilustruje neurotogenní odpověď na jednotlivé purinové deriváty a jejich kombinace za přítomnosti a nepřítomnosti růstového faktoru nervů.

Na obr. 15A, 15B a 15C je provedeno grafické porovnání neurotogenní odpovědi zprostředkované faktorem růstu nervů v neuronech pěstovaných za přítomnosti různých koncentrací různých derivátů purinu; obr. 15A ilustruje neuro• · · · · · togenní odpověď na různé koncentrace inosinu, obr. 15B ilustruje stejnou neurotogenní odpověď na různé koncentrace hypoxanthinu a obr. 15C ilustruje neurotogenní odpověď neuronových buněk exponovaných různým koncentracím xanthinu.

Na obr. 16 je graficky znázorněna neuritogenese zprostředkovaná růstovým faktorem nervů měřená u neuronových buněk pěstovaných za přítomnosti různých koncentrací purinového derivátu AIT-034.

Na obr. 17 je uvedeno grafické porovnání neurotogenní odpovědi neuronových buněk pěstovaných za přítomnosti různých koncentrací guanosintrifosfátu a adenosintrifosfátu a za přítomnosti nebo nepřítomnosti růstového faktoru nervů.

Na obr. 18 je uvedeno grafické porovnání neurotogenní odpovědi zprostředkované růstovým faktorem nervů na monofosfát, difosfát a trifosfát purinového derivátu, guanosinu a adenosinu.

Na obr. 19 je provedeno grafické porovnání produkce cyklického GMP v neuronálních buňkách pěstovaných za přítomnosti různých koncentrací purinového derivátu, guanosinu.

Na obr. 20A, 20B a 20C je uvedeno grafické porovnání neurotogenní odpovědi zprostředkované růstovým faktorem nervů u buněk pěstovaných za přítomnosti nebo bez purinového derivátu, guanosinu a za přítomnosti různých koncentrací tří různých inhibitorů; obr. 20A ilustruje neurotogenní odpověď buněk pěstovaných za přítomnosti methylenové modři, inhibitoru guanylyl cyklasy, obr. 20B ilustruje neurotogenní odpověď buněk pěstovaných za přítomnosti různých koncentrací LY83583, což je také inhibitor guanylyl cyklasy, obr. 20C ilustruje neurotogenní • · odpověď buněk pěstovaných za přítomnosti různých koncentrací atriálního natriuretického faktoru, což je hormon, který vykazuje interakci s guanylyl cyklasou.

Na obr. 21 je uvedeno grafické porovnání neurotogenní odpovědi zprostředkované růstovým faktorem nervů u neuronů pěstovaných za přítomnosti dusičnanu sodného, což je anorganický donor oxidu dusnatého.

Na obr. 22A a 22B je provedeno grafické porovnání neurotogenní odpovědi zprostředkované růstovým faktorem nervů u neuronů kultivovaných za přítomnosti donorů oxidu dusnatého a pohlcovačů oxidu dusnatého a oxidu uhelnatého; obr. 22A ukazuje neurotogenní odpověď buněk pěstovaných za přítomnosti různých kombinací donorů oxidu dusnatého a hemoglobinu a na obr. 22B je ukázána neurotogenní odpověď buněk pěstovaných za přítomnosti různých kombinací donorů oxidu dusnatého a methemoglobinu.

Na obr. 23 je provedeno grafické porovnání neurotogenní odpovědi zprostředkované růstovým faktorem nervů u buněk pěstovaných za přítomnosti různých koncentrací hemoglobinu a za přítomnosti nebo bez přítomnosti purinového derivátu, kterým je guanosin.

Na obr. 24 je provedeno grafické porovnání neurotogenní odpovědi zprostředkované růstovým faktorem nervů u buněk pěstovaných za přítomnosti různých koncentrací methylesteru L-nitroargininu (L-NAME) a za přítomnosti nebo bez přítomnosti purinového derivátu, kterým je guanosin.

Na obr. 25 je provedeno grafické porovnání neurotogenní odpovědi zprostředkované růstovým faktorem nervů u buněk pěstovaných za přítomnosti různých koncentrací protoporfyrinu zinku IX (ZnPP), což je inhibitor syntézy • · · · • · ·· · · · · ·· 9 oxidu uhelnatého a za přítomnosti nebo bez přítomnosti purinového derivátu, kterým je guanosin.

Obr. 26 ilustruje negativní kontrolní pokus pro pokus znázorněný na obr. 25 a je na něm uvedeno grafické porovnání neurotogenní odpovědi zprostředkované růstovým faktorem nervu u buněk pěstovaných za přítomnosti různých koncentrací protoporfyrinu mědi IX (CuPP) a za přítomnosti nebo bez přítomnosti purinového derivátu, kterým je guanosin.

Na obr. 27 je provedeno grafické porovnání neurotogenní odpovědi zprostředkované růstovým faktorem nervů u neuronálních buněk pěstovaných za přítomnosti různých koncentrací purinového derivátu, kterým je inosin pranobex.

Následuje podrobnější popis vynálezu.

V nejobecnějším vyjádření jsou předmětem tohoto vynálezu způsoby, prostředky a léčiva, které jsou určeny pro jedinečné ošetření savčích buněk a neuronů za účelem modifikace jejich buněčné nebo neurální aktivity. Vynález je konkrétněji zaměřen na použití účinných derivátů purinu pro modulaci regulačního systému guanylyl cyklasy dependentní na oxidu uhelnatém v buňkách nebo neuronech pro dosažení řady prospěšných výsledků, včetně indukce in vivo genetické exprese přírodních neurotrofických faktorů a výsledného přímého podávání takových přírodních geneticky kódovaných molekul savci, endogenní produkce sloučenin působících jako antioxidanty a oxidu uhelnatého, jehož důsledkem je snížení krevního tlaku savce. Za použití způsobů a prostředků podle tohoto vynálezu je také možno dosáhnout prevence degenerativní destrukce buněk a léčení chorobných stavů spojených s poškozením buněk oxidačním stresem působením volných radikálů.

• · · · · · • ·· ·

V příkladných provedeních, která ilustrují tento vynález, se používá konkrétních purinových derivátů pro indukci genetické exprese kódovaných molekul za účelem stimulace neuritogenese, povzbuzení růstu neuronů a modifikace membránového potenciálu neuronů pro zvýšení schopnosti učení u savců. Dále jsou uvedeny příkladné studie a ošetření za použití různých dávek a cest podávání zvolených příkladných purinových derivátů, jež jsou reprezentativními sloučeninami účinnými při způsobech podle tohoto vynálezu. Odborníkům v tomto oboru je zřejmé, že předložený vynález není specificky omezen na konkrétní látky, prostředky, dávky nebo způsoby aplikace, jež jsou podrobně uvedeny dále.

V závislosti na konkrétních potřebách individuálních subjektů je možno prostředky podle vynálezu podávat jako léčiva v různých dávkách a za použití různých režimů pro dosažení účinné terapeutické koncentrace. Účinné množství zvolené látky či prostředku se bude měnit v závislosti na takových faktorech, jako je účinnost zvoleného purinového derivátu, fyziologická charakteristika subjektu, rozsah a druh neurodegradace nebo poruchy u pacienta a způsob podávání. Jako příklady vhodných terapeutických koncentrací, které se ukázaly jako účinné pro modifikaci neurální aktivity, je možno uvést koncentrace v rozmezí od méně než ΙμΜ do koncentrace 500mM nebo vyšší. Obvykle se počáteční dávkování modifikuje pro stanovení optimálního dávkování pro léčení konkrétního savčího subjektu. Prostředky podle vynálezu je možno podávat různými způsoby, jako například orálně, topikálně, transdermálně nebo ve formě intraperitoneálních injekcí nebo intravenosních injekcí podávaných přímo do proudu krve. Účinná množství purinových derivátů je samozřejmě také možné podávat injekčně do mozkomíšního moku nebo infusí přímo do mozku.

·· ···· • ···· · »· ·· · ······ · • · · ♦ ··· · · · • ·· ·· ·· · · · ·

Způsoby podle vynálezu je možno provádět za použití purinových derivátů, které se podávají jako léčiva savčím subjektům bud samotné nebo v kombinaci v podobě farmaceutických prostředků. Purinové deriváty je možno kombinovat s farmaceuticky vhodnými excipienty a nosiči, jako jsou inertní pevná ředidla, vodné roztoky nebo netoxické organická rozpouštědla. Farmaceutické prostředky mohou podle potřeby také obsahovat konzervační činidla, stabilizátory a podobné látky.

Způsoby a léčiva podle tohoto vynálezu zajišťují řízenou dlouhodobou modifikaci různých typů buněčných nebo nervových aktivit, včetně in vivo produkce přírodních geneticky kódovaných molekul, jako je hem oxygenasa a neurotrofické růstové faktory (včetně neurotrofinů, pleiotrofinů a cytokinů), přímého podávání takových in vivo produkovaných molekul, zvyšování účinků těchto molekul a neurotrof ických faktorů a stimulace růstu, funkce, ochrany a vývoje buněk. Vynález lze dále použít pro povzbuzování neuritogenese za účelem tvorby kolaterálních nervových obvodů, pro povzbuzování produkce cyklických purinnukleotidů, pro zvyšování tvorby synapsí a pro modifikaci membránového potenciálu neuronu. Tyto účinky mohou být výjimečně prospěšné při léčení neurodegenerace a zvyšování schopnosti učení. Podobně také indukce in vivo produkce přírodních endogenních antioxidantů může být extrémně užitečná při léčení a prevenci chorobných stavů spojených s oxidačním poškozením, včetně rakoviny, stárnutí a různých neurologických poruch.

S ohledem na zřejmé praktické a morální důvody není možné provádět počáteční výzkum zaměřený na stanovení účinnosti experimentálních prostředků a metod na výše uvedené choroby a poruchy na lidech. V důsledku toho se s ohledem na bezpečnost a náklady v časném stádiu vývoje jakéhokoliv

• · · · · · léčiva a léčení standardně používá vhodných zvířecích modelů. Úspěch při použití laboratorních zvířecích modelů je možno předvídat na základě skutečnosti, že fyziologie buněk a neurofyziologie savců je podobná. Buněčná a neurotrofická odpověď u členů jednoho druhu, například hlodavce, často odpovídá stejné odpovědi u členů odlišného druhu, jako člověka. Teprve po vývoji vhodných zvířecích modelů mohou být provedeny klinické zkoušky u člověka za účelem dalšího potvrzení bezpečnosti a účinnosti terapeutického činidla při aplikaci člověku.

Pokud se týče neurodegenerativních chorob a poruch a jejich klinických účinků, myší model se v mnoha ohledech blízce podobá patologii těchto stavů u člověka. Odborníci v tomto oboru se proto dobře shodují, že je možno myší (murinní) model extrapolovat na člověka a jiné savce. Tak jako člověk, i myši jsou susceptibilní k poruchám učení v důsledku degradace neuronů, at již k ní dojde poškozením úrazem, oxidačním poškozením, věkem, chorobami nebo škodlivými chemickými činidly. Stejně významná je i skutečnost, že neurotrofické faktory zřejmě působí v podstatě stejným způsobem u myšího modelu, jako u člověka a reakce neuronů vykazují pozoruhodnou podobnost. V důsledku toho se pro účely vysvětlování vynálezu a nikoliv pro jeho omezení používá při dalším objasňování vynálezu především myšího modelu, jako příkladu savčího subjektu. Odborníkům v tomto oboru je zřejmé, že vynález lze stejně dobře' provádět i u jiných savčích subjektů, včetně člověka.

Jak je zřejmé z dále uvedených dat, bylo nalezeno několik purinových derivátů, které vykazují účinnost ve shodě s poznatky tohoto vynálezu. Data konkrétně ukazují, že guanosin působí dobře při stimulaci produkce neurotrofických faktorů a povzbuzování neuritogenese. Podobně i jiný příkladný purinový derivát, 4-[3-(l,6-dihydro-6-oxo-9·· · · purin-9-yl)-l-oxopropyl]aminobenzoová kyselina (AIT-082), stimuluje in vivo aktivaci dereprese přírodních genů a výslednou produkci přírodních geneticky kódovaných molekul, jako jsou neurotrofické faktory. Tato látka také indukuje endogenní produkci hem oxygenasy a posledně uvedená látka indukuje endogenní produkci oxidu uhelnatého a sloučenin působících jako antioxidanty žlučového barviva. AIT-082 také zvyšuje neuritogenesi, povzbuzuje účinky neurotrofických faktorů a mění membránový potenciál neuronů, čímž zajištuje dlouhodobou potenciaci buněk.

Sloučenina AIT-082 byla publikována v US patentu č.

091 432 uděleném 25. února 1992 spolupůvodci této přihlášky. Výše uvedený patent je zde citován náhradou za přenesení jeho celého obsahu do popisu tohoto vynálezu. Ještě jednou příkladnou látkou, u níž byla ukázána vhodnost pro použití pro účely tohoto vynálezu, je inosin pranobex nebo isoprinosin. Inosin pranobex, což je směs inosinu a DIP-PacBa v molárním poměru 1:3, zvyšuje neuritogenesi a účinky neurotrofických faktorů in vitro. Různá provedení tohoto vynálezu uvedená výše demonstrují použitelnost různých purinových derivátů pro modifikaci buněčné a neurální aktivity prostřednictvím modulace systému guanylyl cyklasy dependentní na oxidu uhelnatém.

Při přednostním provedení tohoto vynálezu (které je uvedeno pouze jako příklad) se buňky nebo neurony léčí látkou AIT-082, totiž 4-[3-(l,6-dihydro-6-oxo-9-purin-9-yl)l-oxopropyl]aminobenzoovou kyselinou. Jak bylo nedávno uvedeno, AIT-082 je jedinečným derivátem purinu hypoxanthinu, který obsahuje skupinu p-aminobenzoové kyseliny. Tento derivát se rychle absorbuje po orálním podání a po překročení bariéry mezi krví a mozkem vstupuje beze změny do mozku. Je možno ho detegovat v mozkové tkáni 30 minut po orálním podání v tak vysoké koncentraci, jako 3,3 ng/mg.

»· • · ···* ··«« • · · • ·

• · · • ·

AIT-082 indukuje in vivo genetickou expresi přírodních geneticky kódovaných molekul, jako jsou hem oxygenasa a neurotrofické faktory. V důsledku toho je podle vynálezu možno indukovat přímé samopodávání sloučenin ošetřovaným buňkám a stimulovat připojené metabolické dráhy a výsledné fyziologické efekty. Když se tato sloučenina přidá ke kulturám, stimuluje sama růst neuritů z neuronových buněk a také zvyšuje neurotogenní účinky neurotrofických faktorů, jako je faktor růstu nervů (NGF). Ještě důležitější je, že AIT-082 zvyšuje pracovní pamět starých myší s deficitem paměti při intraperitoneálním a orálním podání.

Neurotogenní aktivita AIT-082 je inhibována hemoglobinem, methylenovou modří a ZnPP, což jsou pohlcovače oxidu uhelnatého, ale nikoliv CuPP nebo jinými inhibitory oxid dusnatý synthasy. Zkoušky se screeningem na in vitro aktivitu vůči známým receptorům neurotransmiterů a neuromodulátorů byly negativní. ZnPP je také znám jako inhibitor hem oxygenasy I, která identifikuje místo působení tohoto příkladného purinového derivátu modulujícího guanylyl cyklasu. Hem oxygenasa je známý protein tepelného šoku (stresu).

U proteinů tepelného šoku byla demonstrována schopnost regulovat konformaci, intracelulární transport a degradaci intracelulárních proteinů. Tyto látky se také podílejí na uchovávání životaschopnosti buněk během stresu. Někteří odborníci se domnívají, že snížená hladina nebo funkce proteinů tepelného šoku (stresu) může být jedním z faktorů vedoucích ke zvýšenému ukládání proteinů s abnormálními záhyby a k odumírání buněk v mozku u pacientů postižených Alzheimerovou chorobou. Schopnost AIT-082 indukovat in vivo produkci hem oxyganasy poskytuje důkaz účinku tohoto vynálezu na různé protektivní buněčné dráhy a ukazuje, terapeutickou využitelnost vynálezu při léčení srdečního záchvatu a mrtvice kromě léčení jiných chorobných stavů.

··«· ··· • · • ·· ·· ···· ··«<·· · • · · · · 9 • · » · ··· · • · · 9 9 • 9 9 99 9 9 9

Vynález je blíže objasněn v následujících příkladech provedení. Tyto příklady ilustrují exemplární protokoly pro identifikaci, charakterizaci a použití purinových derivátů v souladu s poznatky tohoto vynálezu. Příklady mají výhradně ilustrativní charakter a rozsah vynálezu v žádném ohledu neomezují.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Hladina AIT-082 v myší plasmě

Při této zkoušce bylo použito následujícího protokolu: Dospělým myším C57BL/6 se intraperitoneálně podá AIT-082 v roztoku chloridu sodného v dávce 30 mg/kg. Zvířata se 30, 45, 60 a 90 minut po podání AIT-082 usmrtí dekapitací. Jejich krev se shromáždí v heparizrnovaných zkumavkách, míchá a podrobí 15minutovému odstředění při frekvenci otáčení 2000 min“¹. Plasmový supernatant se oddělí a až do analýzy skladuje při -70°C. Na základě vysokotlaké kapalinové chromatografie byl vyvinut systém pro analytické měření obsahu AIT-082 v plasmě a mozkové tkáni. Vyvinuté stanovení je selektivní vůči AIT-082 za přítomnosti řady blízce příbuzných purinových molekul. Citlivost metody je 0,1 μ9 AIT-082/ml plasmy a 0,1 μυ AIT-082/mg mozkové tkáně (vlhká hmotnost).

Výsledky těchto stanovení jsou uvedeny v tabulce A a graficky zpracovány na obr. 1, kde jsou uvedeny hodnoty hladiny AIT-082 30, 45 a 60 minut po podání v dávce 30 mg/kg

i.p. myším C57BL/6. Z těchto dat lze odhadnout, že hladina AIT-082 v krvi dosahuje maxima přibližně po 45 minutách a poločas eliminace této látky z plasmy činí přibližně 12 minut při rychlostní konstantě eliminace k_ej = 3,45 h“¹.

• · · ·· ··· ·

Tabulka A

Hladina AIT-082 v plasmě

Doba Hladina (min) ^g/ml ± SE)

15	42	±	6
30	108	+	13
45	437	+	131
60	86	+	24
90	20	+	12

Příklad 2

Přechod AIT-082 přes bariéru mezi krví a mozkem

Při této zkoušce bylo použito následujícího protokolu: Mozková tkáň ze dvou usmrcených zvířat, kterým byla podána látka AIT-082 v dávce 30 mg/kg se 30 minut po podání podrobí analýze. Mozek se rychle vyjme a ochladí na ledu. Mozková tkáň se rozřízne na kortex a zbytek mozku. Mozková tkáň (250 až 300 mg vlhké hmotnosti) se homogenizuje s 5,0 ml roztoku chloridu sodného za použití homogenizátoru tkání Brinkman Polytron a až do analýzy se homogenát udržuje při -70°C. Potom se mozkový homogenát zbaví proteinů ultrafiltrací přes filtry Gelman Acrodisc. Nejprve se použije filtru s póry o velikosti 1,2 μπι a potom o velikosti 0,2 μιη. 30μ1 vzorek se nastříkne na sloupec pro HPLC za účelem výše popsané analýzy. Sestrojí se kalibrační křivka za použití analýzy vzorků získaných přidáním známých-množství AIT-082 k mozkovým homogenátům neošetřených zvířat. Analýza mozkové tkáně ukazuje, že látka AIT-082 je obsažena jak ve • · vzorku kortexu, tak ve vzorku zbytku mozku u obou zvířat. Výsledky jsou shrnuty v tabulce B, která následuje.

Tabulka B

Hladina AIT-082 v mozkové tkáni

Vzorek č.	Oblast mozku	Hmotnost vzorku (mg)	Hladina AIT-082 ve tkáni (ng/mg)
S3	Kortex	181	2,8
S3	Zbytek	153	3,3
S4	Kortex	146	3,4
S4	Zbytek	217	2,3

Zjištění přítomnosti AIT-082 v mozkové tkáni po 30 minutách představuje důkaz, že AIT-082 překračuje bariéru mezi krví a mozkem bez degradace.

Příklad 3

Interakce AIT-082 s cholinergickým systémem

S ohledem na zjištění, že u pacientů postižených Alzheimerovou chorobou dochází k významné ztrátě cholinergických neuronů v hippocampu, je značný zájem zaměřen na účinek sloučenin, které mění aktivitu tohoto systému, na parnět. Podpora cholinergické hypotézy paměti přichází ze studií za použití lézí nebo mrtvičného modelu. Zdá se, že léze oblasti CA1 hippocampu specificky narušují pracovní parnět. U mrtvičného modelu má okluze vertebrálních a karotidových artérií (po dobu 30 minut) za následek specifickou ztrátu buněk v oblasti CA1 hippocampu a ztrátu • · · · · · pracovní paměti. U těchto modelů za použití starých krys bylo ukázáno, že fysostigmin, což je inhibitor cholin esterasy, vyvolal zlepšení paměti. THA, což je další léčivo zvyšující cholinergickou funkci, zlepšuje pamět u starých opic. Pozorování, že AIT-082 zlepšuje paměť stejným obecným způsobem jako fysostigmin a THA, vyvolává otázku, zda snad AIT-082 nemá nějaký účinek na cholinergický systém.

Pro objasnění mechanismů, kterými AIT-082 zlepšuje paměť byly učiněny pokusy blokovat účinky této látky současným podáním krátkodobě působícího cholinergického antagonisty, atropinu, myším, které byly poté podrobeny jednoduchým zkouškám učení. Atropin má údajně schopnost blokovat účinky fysostigminu a THA. Myším se injekčně podá látka AIT-082 (v dávce 30 mg/kg) 2 hodiny před zkoušením v den 1 až 4. Atropin (0,5 mg/kg) (28) se injekčně podá 0,5 hodiny před zkoušením nebo 1,5 hodiny po podání AIT-082 (pouze v den 3). Všechna podání se provádějí intraperitoneálními injekcemi. Po referenčním pokusu, při němž mohou myši zjistit, kde je v bludišti T umístěna odměna, se myši podrobí novému zkoušení, aby se zjistilo, zda si byly schopny zapamatovat umístění odměny. Procentický podíl správných odpovědí je graficky zpracován na obr. 2.

Data uvedená na obr. 2 ukazují, že atropin blokuje účinnost AIT-082 na zvýšení paměti v den 3 a že tento účinek je přechodný, poněvadž povzbuzující účinky AIT-082 se znovu objeví v den 4, kdy se žádný atropin nepodává. Toto pozorování naznačuje, že na působení AIT-082 se může podílet cholinergický mechanismus.

• · · · · ·

Příklad 4

Účinek AIT-082 na receptory acetylcholinu

Interakce AIT-082 s receptory acetylcholinu byla stanovena na základě interference s vazbou QNB (3-chinuklidinylbenzllát) v myší tkáni. Bylo použito metody popsané v Fields, J. Biol. Chem. 253 (9): 3251 až 3258, 1978. Při tomto stanovení nevykázala látka AIT-082 žádný účinek.

Použité stanovení lze v krátkosti popsat takto: Myším se podá látka AIT-082 v dávce 30 mg/kg a po 2 hodinách se usmrtí dekapitací. Tkáň se zpracuje, aby se získaly membrány obsahující receptory acetylcholinu. Při zkoušení tkání in vitro se nezjistí žádný účinek AIT-082 na afinitu (Kd) pro QNB, pokud se AIT-082 podává za stejných podmínek, jakých bylo použito pro zkoušení účinků této látky na paměť. Dochází ke změně počtu receptoru (B max) v kortexu a striatu, přičemž v kortexu je zaznamenáno snížení a ve striatu zvýšení počtu míst vázajících acetylcholin. Tato data jsou konsistentní s hypotézou, že při podání látky AIT-082 živočichům dochází ke zvýšenému přívodu do kortexu. Tento zvýšený přívod má obvykle za následek regulaci receptoru směrem dolů.

Příklad 4

Účinek AIT-082 na vazbu ligandu k receptoru in vitro

Derivát AIT-082 byl hodnocen na svou schopnost inhibovat vazbu ligandu k 38 izolovaným receptorům. Při screeningu bylo použito následujících receptorů a jejich ligandů:

Adenosin

Aminokyseliny:

excitační aminokyseliny (glycin, kainát, MK-801,

NMDA, PCP, chischalát a sigma);

inhibitory aminokyselin (benzodiazepin, GABA-A,

GABA-B a glycin)

Biogenní aminy (dopamin-1, dopamin-2, serotonin-1, serotonin-2)

Proteiny vápníkového kanálu (nifedipin, omegakonotoxin, chlorid, draslík)

Peptidové faktory (ANF, EGF, NGF)

Peptidy: (angiotensin, arg-vasopresin-Vl a V2, bombesin, centrální a periferní CCK, neurotensin, NPY, somatostatin, látka K, látka P, VIP)

Druhé mediátorové systémy: adenylcyklasa proteinkinasa (ester forbolu a inositoltrifosfát)

Zkoušení bylo provedeno smluvně v laboratořích

Nova Labs (Baltimore, MD, USA). V žádné z těchto zkoušek prováděných in vitro se látka AIT-082 neprojevila jako účinná.

Lze učinit tento závěr: Přestože AIT-082 působí prostřednictvím cholinergického nervového systému (atropin blokuje účinnost této látky), zdá se, že mechanismus působení AIT-082 nezahrnuje přímou interakci s receptory acetylcholinu. Je důležité si povšimnout, že in vitro se AIT-082 neváže k receptoru adenosinu.

Látka AIT-082 byla podrobena zkoušení v sérií psychofarmakologických testů, které byly uspořádány pro úplnější vyhodnocení rozsahu její účinnosti na centrální nervový systém. Bylo použito následujících zkoušek:

a) zkouška motorické koordinace za použití rychle se otáčejícího šlapacího mlýnku Rota-Rod,

b) lokomotorická aktivita (průzkumná a v domovské kleci) za použití monitoru aktivity Stoelting,

c) anxiolytická aktivita za použití vyvýšeného bludiště Plus,

d) nociocepce.

Při těchto zkouškách byla látka AIT-082 porovnávána se standardními referenčními léčivy.

Příklad 6

Zvýšení motorické koordinace u myší pomocí látky AIT-082

Motorická koordinace se měří za použití rychle se otáčejícího šlapacího mlýnku Rota-Rod pro myši (Ugo Bassile Co.). V různé době po ošetření roztokem chloridu sodného nebo léčivem se myší umístí do mlýnku Rota-Rod, jehož rychlost se během 5minutového období zvýší na maximum. Doba (v sekundách), za kterou zvíře odpadne, je zaznamenána v tabulce C, která následuje. Každé zvíře se podrobí zkoušení třikrát a zaznamenává se střední hodnota.

• · ·

- 28 Tabulka C

Účinek AIT-082 na výkon v mlýnku Roto-Rod

Dávka AIT-082 Doba (s) (mg/kg)

kontrolní	123 ±	64
0,005	162 ±	93
0,05	207*±	73
0,5	184*±	76
30,0	187*±	68
60,0	229*±	80

*p < 0,05, t-test proti kontrole

Zvířata, která obdržela látku AIT-082 vykazují zlepšenou motorickou koordinaci, což se projevuje tím, že zůstanou na mlýnku Roto-Rod delší dobu ve srovnání s kontrolními zvířaty (kterým byl podán roztok chloridu sodného) nebo se zvířaty, kterým byla podána látka AIT-082 v nízké dávce (0,005 mg/kg).

Příklad 7

AIT-082 neinhibuje průzkumnou aktivitu

Pro měření průzkumového chování se zvířatům podá roztok chloridu sodného nebo látka AIT-082 a potom se zvířata umístí do nové velké klece (šířka 25 cm, délka 48 cm a výška 16 cm) a po dobu 30 minut se zaznamená pohyb v jednominutových intervalech. Tato velká klec (San Diego Instruments, San Diego, Kalifornie, USA) je vybavena vertikálními detektory. Také se zaznamenávají vztyčovací ·· · ······ • · · · · · · · · pohyby. Nezjistí se žádný účinek na průzkumovou aktivitu, což ukazuje, že zvířata nejsou v tomto ohledu zneschopněna.

Příklad 8

AIT-082 neinhibuje lokomotorickou aktivitu

Pro měření lokomotorické aktivity v domovské kleci se domovská klec umístí na desku monitoru aktivity (Stoelting Instruments). Pohyby, které jsou měřítkem lokomotorické aktivity v domovské kleci, se zaznamenávají po dobu 15 minut v jednominutových intervalech. Zvířata obdrží roztok chloridu sodného nebo AIT-082 a jsou vrácena do svých domovských klecí. 10 minut po injekci se domovská klec přemístí na desku monitoru aktivity. Pohyby, které jsou měřítkem lokomotorické aktivity v domovské kleci, se zaznamenávají po dobu 30 minut v jednominutových intervalech. Během prvních 5 minut se také sleduje a zaznamenává očištovací aktivita. Výsledky jsou uvedeny v tabulce D, která následuje.

Tabulka D

Účinek AIT-082 na lokomotorickou aktivitu

Dávka AIT-082 Pohyby (střední hodnota ± směrodatná odchylka)

(mg/kg)	Před podáním léčiva	Po podání léčiva	Rozdíl
kontrolní	1633±434	1385+492	248+492
0.005	1884±230	1375+563	509+429
0.05	17181606	15081456	209+340
0.5	16101349	13201689	2901435
30.0	14401264	10981189	3421267
60.0	1690+223	-634*1223	1056*1154
*p < 0,05,	t-test proti kontrole

• · · · • · · ·

Jak je zřejmé z dat uvedených v tabulce D, při vysokých dávkách AIT-082 (60 mg/kg) se zdá, že zvířata jsou více zvyklá na své prostředí a vykazují méně pohybů. Jinak se nezaznamenají žádné účinky.

Příklad 9

AIT-082 nezvyšuje podstatně úzkost

Z černého plexiskla se zhotoví bludiště Plus, které se skládá ze dvou protilehlých otevřených větví (délka 30 cm, šířka 5 cm) a dvou protilehlých uzavřených větví (délka 30 cm, šířka 5 cm, výčka 15 cm). Stěny uzavřených větví jsou z čirého plexiskla a všechny čtyři větve se sbíhají v centrální oblast o rozměrech 5x5 cm. Celé bludiště Plus se umístí na základnu 38 cm nad podlahou. Při zkoušení se zvíře umístí do jednoho konce jedné z otevřených větví. Zaznamenává se doba, za kterou zvíře opustí svou výchozí polohu (prvních 10 cm otevřené větve). Také se zaznamenává doba, za kterou se zvíře dostane do poloviny jedné z uzavřených větví. Když se zvíře dostane do místa ležícího uprostřed uzavřené větve, zahájí se tříminutový pokus. V průběhu tohoto tříminutového pokusu se zaznamenává počet vstupů zvířete do otevřených větví. Vstup je definován jako umístění alespoň dvou pracek na desku v otevřené větvi.

Při této zkoušce byl zjištěn mírný anxiogenní účinek AIT-082 v dávce 30 mg/kg. Tento účinek však nebyl pozorován při vyšší dávce (60 mg/kg) nebo nižší dávce (0,005 až 0,5 mg/kg).

• · · ·· · · · · · • · · · · · • · · · ··· · • · · · ·

Příklad 10

AIT-082 neovlivňuje nociocepci

Myší se umístí desku (Omnitech) elektricky zahřívanou na 55°C a měří se doba latence, za kterou si zvíře začne olizovat zadní pracku. Není-li pozorována žádná odpověď do 45 sekund, pokus se ukončí. Při této zkoušce bylo zjištěno, že AIT-082 nevykazuje žádný účinek na nociocepci.

Příklad 11

Látka AIT-082 není toxická

Předběžné zkoušky akutní toxicity u krys a myší ukazaly, že látka AIT-082 vykazuje hodnotu LD₅₀ vyšší než 3000 mg/kg při podání orální nebo intraperitoneální cestou. Látka AIT-082 byla podrobena zkoušení za použití programu Panlabs's General Pharmacology Screening Program (Panlabs, 11804 North Creek Parkway South, Bothwell, Washington 98011, USA) a výsledky ukázaly absenci jakékoliv toxicity při měření za použití standardního profilu 79 různých zkušebních systémů.

S ohledem na chemickou strukturu látky AIT-082 se nepředpokládá, že by tato sloučenina mohla být metabolizována na jakékoliv toxické metabolity.

Výše uvedené zkoušky je možno shrnout takto: S výjimkou mírně anxiogenního účinku při jedné dávce bylo pozorováno jen velmi málo nepříznivých účinků látka AIT-082 při různých psychofarmakologických zkouškách. Bylo zaznamenáno zvýšení motorické koordinace (při zkoušce s mlýnkem Roto-Rod) v celém rozmezí dávkování (0,05 až 60 mg/kg) a • · • · · · snad i účinek na učení a habituaci v jedné dávce (60 mg/kg) při lokomotorickém testu.

Po psychofarmakologické charakterizaci této příkladné sloučeniny byly provedeny další studie za účelem demonstrace neurogenních účinků tohoto vynálezu.

Příklad 12

Látka AIT-082 povzbuzuje neuritogenesi v buňkách PC12

Velká část práce, která byla provedena při charakterizaci sloučenin podle vynálezu, zahrnovala použití buněk PC12. Tyto buňky pocházejí z krysího feochromocytomu a když se pěstují za přítomnosti NGF, vytvářejí se na nich neurity, buňky se přestávají dělit a nabývají mnoha charakteristik sympatických neuronů. Při kultivaci za nepřítomnosti růstového faktoru nervů (NGF) jen málo buněk PCI2 obsahuje neurity větší než je průměr buňky.' Přídavek NGF v koncentraci odpovídající nasycení na dobu 48 hodin stimuluje růst neuritů z těchto buněk u asi 20 až 35 % těchto buněk.

Jelikož tyto buňky vytvářejí homogenní populaci buněk podobajících se neuronům, aniž by byly kontaminovány buňkami typu astroglia, je možné studovat přímé účinky sloučenin na bázi purinu na růst neuritů v těchto buňkách.

Pro demonstraci neuronální modifikace příkladnými sloučeninami podle tohoto vynálezu se sestrojí křivka odpovědi na dávce AIT-082 měřením stimulace neuritogenese v buňkách PC12. Buňky kultivované v médiu RPMI 1640 s 1,5 % koňského séra a 1,5 % fetálního hovězího séra se navzorkují na 24jamkové kultivační misky potažené poly-ornithinem (2,5 x 10⁴ buněk/jamka). Ihned po přenesení do jamek se k různým kulturám přidá AIT-082 a NGF. Po 48 hodinách se médium odstraní a buňky se inhed fixují v 10% formalinu a PBS po • ···· ·· · • ··· • * · • · • * · ·· · · • · · • · · » • · · ·· · · · ·* ···· • · · • · · ··· · • · ·· · dobu 10 minut. Buňky a neurity se spočítají v průběhu dvou dnů od fixace.

Neurit byl definován jako výčnělek zasahující od buňky přinejmenším do vzdálenosti jednoho průměru těla buňky a obsahující na svém konci růstový kužel. Při každém ošetření se spočítají dvě reprezentativní mikroskopická políčka z každé ze 6 sesterských kultur, které byly ošetřeny stejným způsobem. Pro stanovení podílu buněk nesoucích neurity se zjistí celkový počet buněk na jamku (přibližně 100 buněk) a celkový počet buněk obsahujících neurity v každé jamce. U každého stanovení se poté vypočítá střední hodnota (± směrodatná odchylka). Porovnání se usnadní tím, že se růst neuritů vyjádří relativně vzhledem k podílu buněk nesoucích neurity za přítomnosti samotného NGF (NGF = 100 %). Účinky zkoušených sloučenin za současného použití NGF a bez něho se potom porovnají analýzou variance (ANOVA), po níž se provede Tukeyův test na statistickou významnost.

Výsledky jsou uvedeny na obr. 3. Křivka odpovídá různým hladinám látky AIT-082 spolu s 2.5 S NGF v koncentraci odpovídající nasycení (40 ng/ml). Centrální vodorovná čára představuje kontrolní hodnoty pro buňky kultivované za přítomnosti samotného NGF (40 ng/ml). Horní a spodní vodorovné čáry vymezují meze spolehlivosti za použití samotného NGF vypočítané za použití standardních statistických metod.

Jak je to zřejmé z obr. 3, AIT-082 stimuluje neuritogenesi a v nízkých koncentracích (ΙμΜ) zvyšuje neuritogenesi stimulovanou NGF v buňkách PC12. Analýza těchto dat ukazuje, že AIT-082 je za těchto podmínek stejně účinná látka jako NGF při povzbuzování neuritogenese v buňkách PC12. Optimální účinky NGF zvyšuje AIT-082 o 30 %. Pro srovnání, byly také provedeny zkoušky s inosinem a • · · · ·· · · hypoxanthinem. Tyto zkoušky ukazují (jak je podrobněji uvedeno dále), že inosin a hypoxanthin jsou slabě účinné při stimulaci neuritogenese a při povzbuzování neuritogenese stimulované NGF v buňkách PC12, ale jsou účinné v nižších koncentracích v rozmezí od 30 do 300nM. Guanosin poskytuje významný účinek, který se podobá účinku AIT-082, ale při vyšších koncentracích v rozmezí od 30 do 300μΜ.

Příklad 13

Účinek inhibitorů na neuritogenesi pomocí AIT-082

Ztráta paměti spojená s věkem se přisuzuje ztrátě bazálních neuronů dependentních na NGF v předním mozku. Stav je možno zlepšit infuzí i.c.v. NGF. Účinek samožné látky AIT-082 a její kombinace s NGF na neuritogenesi se studuje za použití protokolu popsaného v příkladu 12. Studium mechanismu, prostřednictvím kterého látka AIT-082 zprostředkovává své účinky, zahrnuje sérii experimentů, při nichž se pro blokování nebo modifikaci specifických biochemických procesů použije inhibitorů. Všechny kultury obsahují NGF v optimální dávce (40 ng/ml), takže série prováděná za nepřítomnosti AIT-082 představuje účinek inhibitorů na aktivitu NGF. Tam, kde je to uvedeno, přidává se látka AIT-082 v ΙΟμΜ koncentraci, což je podle současných poznatků optimální dávka této látky. Použije se tří selektivních inhibitorů.

Výsledky těchto studií jsou uvedeny dále v tabulce E a na obr. 4A, 4B a 4C. Na těchto obrázcích je graficky znázorněn podíl buněk nesoucích neurity po 48 hodinách kultivace za uvedených podmínek. Hodnoty základní linie odpovídají buňkám pěstovaným bez NGF nebo AIT-082.

• ·· · • ·· • · · · · ·

Tabulka Ε

Účinek AIT-082 za a bez přítomnosti NGF a selektivních inhibitorů na neuritogenesi

Inhibitor	Koncen- trace	AIT-082 samotná1	NGF samotný	AIT-082 + NGF
žádný	0	0,2+0,02	0,2 ±0,02	0,26±0,01
Methemoglobin	0		0,2 ±0,02	0,26±0,01
	ΙμΜ		0,2 ±0,02	0,17±0,02
Methylenová	0		0,2 ±0,02	0,26±0,01
modř	5μΜ		0,24±0,03	0,10±0,01
Zn Protopor-	0		0,20±0,02	0,26±0,01
fyrin IX	ΙμΜ		0,22±0,03	0,13±0,01

Ipodíl buněk nesoucích neurity

Methemoglobin (MHb) zachycuje a odstraňuje oxid dusnatý a oxid uhelnatý z kultivačního média. MHb nevykazuje žádný účinek na aktivitu NGF, ale inhibuje působení AIT-082, což vede k závěru, že buď oxid dusnatý nebo oxid uhelnatý se podílí na působení AIT-082.

Methylenová modř (MB) inhibuje rozpustnou guanylyl cyklasu, což je enzym produkující cyklický GMP (cGMP). Guanylyl cyklasa je intracelulární látka, která se podílí na činnosti, jak bylo popsáno výše, druhého mediátorového systému přenosu nervových impulzů. Methylenová modř nemá žádný účinek na aktivitu NGF, ale inhibuje působení AIT-082, což vede k závěru, že se guanylyl cyklasa podílí na mechanismu působení AIT-082.

• · ·· · 4 4 4

Protoporfyrin zinku IX (ZnPP) je inhibitor hem oxygenasy II (HO), kterýžto enzym produkuje oxid uhelnatý. ZnPP nemá žádný účinek na aktivitu NGF, ale inhibuje působení AIT-082. Tím identifikuje potenciální místo působení AIT-082, jako místo, které se podílí na produkci hem oxygenasy II. Zároveň tím také identifikuje výslednou produkci oxidu uhelnatého, jako součást mechanismu působení AIT-082. Tyto výsledky jsou indikativní pro řadu důležitých aspektů a znaků tohoto vynálezu.

Jak již bylo uvedeno výše, hem oxygenasa II představuje protein tepelného šoku (stresu). 0 těchto proteinech se předpokládá, že jsou součástí ochranných mechanismů, kterých je zapotřebí pro uchování životaschopnosti buněk za stresových podmínek (viz například Georgopoulos C. a W. J. Welch, Role of the Major Heat Schock Proteins as Molecular Chaperones, Annu. Rev. Cell Biol., 1993, 9: str. 601 až 634. Hem oxygenasa II nejen reguluje konformaci, intracelulární transport a degradaci intracelulárních proteinů, nýbrž se také silně podílí na produkci účinných antioxidačních sloučenin produkovaných degradací hernu enzymatickým účinkem hem oxygenasy II. Jediným zdrojem ochranných antioxidačních žlučových barviv biliverdinu a bilirubinu v savčí tkáni je hem degradovaný působením hem oxygenasy II. Existují významné důkazy, že tato žlučová barviva hrají důležitou fyziologickou úlohu v mechanismu obrany buněk působením antioxidantů (Stocker P. et al., Bilirubin is an antioxidant of possible physiological importance, Science, 1987, 235: str. 1043 až 1047). Kromě toho se hem oxygenasa II vyskytuje v mozku a je známo, že její hladina se významně zvyšuje po tepelném šoku (Ewing, J. F., S. N. Haber a M. D. Maines, Normál and heat-induced patterns of expression of heme oxygenase-1 (HSP32) in rat brain: hyperthermia causes rapid induction of mRNA and protein, J. Neurochem., 1992, 58: str. 1140 až 1149).

• · · · • *

V souladu s těmito poznatky zprostředkovává řada neurotrofinů své neuroprotektivní účinky stimulací endogenních obranných mechanismů proti oxidačnímu stresu a poškození volnými radikály (Williams, L. R., Oxidative stress, age-related neurodegeneration, and the potential for neurotrophic therapy v Cerebrovasc. Brain Metab. Rev.

1995, Raven Press, Ltd.: New York, NY, USA, str. 55 až 73, Mattson, Μ. P. , B. Cheng a V. L. Smith-Swintosky, Mechanisme of neurotrophic factor protection against calcium and free radical-mediated excitotoxic injury: implications for treating neurodegenerative disorders, Exp. Neurol., 1993,

124: str. 89 až 95). Jelikož jsou cytotoxické volné radikály podezřelé z toho, že se podílejí na etiologii řada neurodegenerativních chorob, je důvodné předpokládat, že pomocí tohoto vynálezu lze stimulovat produkci nebo aktivitu hem oxygenasy II za účelem produkce protektivních antioxidačních sloučenin zabraňujících degenerativní destrukci buněk oxidačními volnými radikály tím, že dochází k neutralizaci nebo sekvestraci těchto toxických oxidačních sloučenin.

Mnoho odborníků se v současné době domnívá, že ALS, Parkinsonova choroba a Alzheimerova choroba mohou vzniknout díky neschopnosti ochrany proti akumulovanému poškození buněk volnými radikály. Někteří lékaři zkoušeli léčit ALS podáváním neurotrofinů (DiStefeno, P. S., Neurotrophic factors in the treatment of motor neuron disease and trauma, Exp. Neurol., 1993, 124: str. 56 až 59, Thoenen, Η., R. A. Hughes a M. Sendtner, Trophic support of motorneurons: Physiological, pathophysiological, and therapeutic implications, Exp. Neurol., 1993, 124: str. 47 až 55).

Jelikož lze podle vynálezu zajistit endogenní produkci těchto ochranných sloučenin, představuje vynález účinné léčení těchto a jiných degenerativních chorob buněk. Tato ochranná schopnost je obzvláště důležitá při léčení neuronů, poněvadž na rozdíl od většiny jiných buněk, které mají řadu

• · ochranných mechanismů, jako je vysoká hladina glutathionu, neurony tento zdroj antioxidantu postrádají.

Schopnost tohoto vynálezu stimulovat aktivitu nebo produkci hem oxygenasy II zahrnuje přinejmenším jeden přídavný přímý fyziologický užitek u savců. Když se hem degraduje působením hem oxygenasy II na žlučová barviva bilirubin a biliverdin, také se produkuje oxid uhelnatý. Schopnost tohoto vynálezu stimulovat produkci a aktivitu hem oxygenasy II tedy také zajišůuje stimulaci in vivo buněčné produkce oxidu uhelnatého. Oxid uhelnatý je známým aktivátorem rozpustné guanylát cyklasy a činidlem vyvolávajícím relaxaci vaskulárního hladkého svalstva prostřednictvím cGMP-dependentního mechanismu (Graser, T., Y. P. Verdernikov a D. S. Li, Study of the mechanism of carbon monoxide induced endothelium-independent relaxation in porcine coronary artery and vein, Biomed. Biochim. Acta, 1990, 49: str. 293 až 296, Mořita T. et all, Smooth muscle cell-derived carbon monooxide is a regulátor of vascular cGMP, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 1995, 92: str. 1475 až 1479). Jiní vědci nedávno ukázali, že odstranění účinků oxidu uhelnatého na snižování krevního tlaku prostřednictvím inhibice hem oxygenasy II má za následek zvýšení krevního tlaku savců (Johnson, R. A. et al., A heme oxygenase product, presumably carbon monooxide, mediates a vasodepresor function in rats, Hypertension, 1995, 25: str. 166 až 169). V důsledku toho se zdá být rozumné předpokládat, že schopnost tohoto vynálezu stimulovat produkci oxidu uhelnatého in vivo povede kromě zvýšení ochrany pomocí antioxidantů také ke snížení krevního tlaku savce. Schopnost tohoto vynálezu přímo indukovat in vivo produkci přírodních buněčných sloučenin vyvolávajících tyto dramatické fyziologické účinky nemá v tomto oboru žádný precedens.

Příklad 14

Účinek inhibitorů oxidu dusnatého na AIT-082

Oxid dusnatý je produkován působením enzymu oxid dusnatý synthetasy (NOS). Byly identifikovány dvě chemikálie, které jsou schopny selektivně inhibovat NOS, totiž methylester N-nitro-L-argininu (L-NAME) a N-nitroL-arginin (NOLA). Při provádění zkoušky podle tohoto příkladu se tyto chemikálie podávají v různé koncentraci, bud samotné nebo spolu s AIT-082 a měří se neuritogenese v buňkách PC12 za použití protokolu popsaného v příkladu 12. Výsledky dosažené s L-NAME jsou uvedeny v tabulce F, zatímco výsledky naměření s NOLA jsou uvedeny v tabulce G. Hodnoty z obou tabulek, které následují, jsou graficky zpracovány na obr. 5A a 5B.

Tabulka F

Účinek L-NAME na neuritogenesi

	Koncentrace	L-NAME (μΜ)
AIT-082	0	0,1	1,0	10,0
0 ΙΟμΜ ΙΟΟμΜ	0,246±0,017 0,254±0,008 0,309±0,027	0,259+0,027 0,220±0,010 0,257±0,016	0,257±0,013 0,302+0,027 0,232±0,019	0,251±0,013 0,254±0,018 0,289±0,006

• · • ·

Tabulka G

Účinek NOLA na neuritogenesi

AIT-082	Koncentrace NOLA (μΜ)
0	0,1	1,0	10,0
0	0,246±0,017	0,259±0,009	0,311±0,016	0,305±0,017
ΙΟμΜ	0,254±0,008	0,277±0,016	0,312±0,029	0,298±0,019
ΙΟΟμΜ	0,309±0,027	0,279±0,027	0,295+0,028	0,310+0,023

Jak je zřejmé z tabulek F a G, žádný z výše uvedených inhibitorů NOS není účinný při blokování účinků AIT-082 na neuritogenesi. Tyto výsledky ukazují, že oxid dusnatý se nepodílí na mechanismu působení AIT-082.

Příklad 15

Účinek AIT-082 na hladinu cGMP v buňkách PC12

Pro demonstraci modifikace guanylyl cyklasy dependentní na oxidu uhelnatém byla měřena hladina cyklického guanosin monofosfátu (cGMP) v buňkách PC12 po podání AIT-082. Nejprve se buňky PC12 podrobí předběžnému třídennímu zpracování za použití NGF v koncentraci 40 ng/ml v médium s nízkým obsahem séra (1,5% koňské sérum + 5% fetální hovězí sérum). Buňkami se zaočkují zkušební misky s médiem obsahujícím nízkou koncentraci séra a NGF v koncentraci 40 ng/ml a 1 hodinu se inkubují. Médium se vymění za nízkoargininové médium (80μΜ) bez séra a NGF a tam, kde je to uvedeno, se přidá papaverin (ΙΟΟμΜ). Zkoušené sloučeniny se přidávají po uvedenou dobu a reakce se zastaví přídavkem 5% • · · ·· · • · ·· · • · · • · • · · · · • · · · · • · » · · · · β · · · ·· ·· ·

TCA s obsahem 10 000 rozpadů za minutu (dpm) ³H-cGMP. cGMP se Stanoví radioimunoesejem metodou popsanou v Maurice, Mol. Pharmacol. 37: 671 až 681, 1990. TCA se purifikuje přídavkem práškovitého aktivního uhlí (5 g) a směs se přefiltruje přes filtrační papír Whatman č. 1. Tím se z TCA odstraní nečistoty, které jinak interferují se stanovením cGMP pomocí radioimunoeseje (RIA).

Před prováděním radioimunoeseje je potřeba cGMP purifikací zbavit cAMP a jiných nečistot, poněvadž tyto látky by mohly interferovat se stanovením. Purifikační postup lze v krátkosti popsat takto: roztok TCA se nanese na sloupce Dowex (50W8X, zrnění 38 až 75 μπι) a provede se eluce. Pod každou kolonu s náplní Dowex se potom umístí kolona s neutrálním oxidem hlinitým. cGMP se eluuje ze sloupce Dowex na sloupec neutrálního oxidu hlinitého tím, že se na každý sloupec Dowex uvedou 4 ml 0,05M kyseliny chlorovodíkové. Kolony s neutrálním oxidem hlinitým se potom postupně propláchnou 2 ml kyseliny chlorovodíkové, 4 ml vody a nakonec 0,2M roztokem octanu sodného o pH 6,2. cGMP pro RIA se shromáždí elucí za použití 1 ml roztoku octanu sodného, přičemž dosažený výtěžek činí 50 až 65%. Stanovení cGMP se provede pomocí soupravy DuPont RIA kit. Výsledky jsou graficky zpracovány na obr. 6.

Jak ukazuje obr. 6, přídavek AIT-082 se projeví zvýšenou produkcí cGMP v buňkách PC12, což ukazuje, že AIT-082 působí prostřednictvím modifikace aktivity enzymu guanylyl cyklasy dependentního na oxidu uhelnatém.

Příklad 16

Účinek AIT-082 na genetickou expresí neurotrofinové mRNA • · · ·

Pro demonstraci skutečnosti, že AIT-082 indukuje in vivo genetickou expresi a výslednou buněčnou produkci neurotrofinů (což jsou přírodní geneticky kódované molekuly), a že zvyšuje jejich aktivitu, byl proveden následující experiment. Indukce neurotrofinové mRNA byla stanovena analýzou Northern Blot astrocytů kultitovaných za přítomnosti AIT-082, NGF nebo obou těchto látek. Buňky byly sklizeny a RNA byla extrahována 24 hodin po ošetření.

V krátkosti lze použitý postup charakterizovat takto: Astrocyty z cerebrálního kortexu myší NIH Swiss (Harlan) se izolují tak, že se neonatální myši (0 až 24 hodin po vrhu) dekapitují, za aspetických podmínek se vyjme mozek a umístí do modifikovaného Dulbeccova média (DMEM) s obsahem 20 % tepelně inaktivovatného koňského séra (Hyclone) - (úplné médium). Z každé cerebrální hemisféry se vyřízne neopallium a rozmělní na lmm kostky.

Astrocyty se izolují mechanickým rozvolněním.

Kostky se zpracovávají vířením po dobu 1 minuty při nastavení na nejvyšší rychlost. Buněčná suspenze se nechá projít nejprve přes 75mm Nitex a poté přes lOmm Nitex. Výsledná buněčná suspenze se zředí úplným médiem na konečnou koncentraci 1 mozek na 10 ml úplného média. Do každé misky pro kultivaci tkání Falcon o průměru 100 mm (Fisher) se umístí 10 ml této zředěné buněčné suspenze. Po 3 dnech se médium nahradí 10 ml čerstvého úplného média a následně se médium vyměňuje 2 x týdně, vždy pomocí DMEM s obsahem 10 % tepelně inaktivovaného koňského séra (růstovým médiem). Po 2 týdnech kultivace se astrocyty utvoří konfluentní monovrstvu.

Pro extrakci RNA se astrocyty trypsinizují. Potom se astrocyty přenesou na lOOmm misky potažené PORN při hustotě buněk 10⁶ buněk na misku (10 ml růstového média). Po

·· • · · · · · • · · • · · ··· · • · ·· · hodinách se ke vhodným miskám přidá PBS, Guo nebo GTP v koncentraci lOmM. Při každém typu ošetření se sklidí celková RNA z 1,5 x 10⁷ buněk v době 4 a 24 hodin po zpracování činidlem TRIzol. Pracuje se podle protokolu dodavatele (Gibco BRL/Life Technologies, lne.). V případě štěrbinových blotů (slot blots) je celková RNA vázána k filtrům HybondN (Amersham/United States Biochemicals), jak je to popsáno v Transfer and Immobilization of Nucleic acids and Proteine to S & S Solid Supports (S & S protokoly: Schleicher & Schuell, New Hampshire, USA). Také se provede analýza Northern blot za použití 10 až 20 mg celkové RNA z každého vzorku. Přitom se celková RNA podrobí elektroforéze v 1% agarosovém gelu s obsahem formaldehydu a poté blotuje na filtry Hybond-N podle protokolu S & S.

Bloty se podrobí zkoušení za použití P³²-značené cDNA (próby NGF, NT-3 a BDNF) nebo oligonukleotidové próby (FGF-2) hybridizací v pufru na bázi piperazin-N,N'-bis(2-ethansulfonové kyseliny) (PIPES) (50mM PIPES, pH 6,8;

50mM dihydrogenfosforečnan sodný, O,1M chlorid sodný, 5% SDS a lmM EDTA) přes noc při 50°C. Bloty se 2 x opláchnou promývacím pufrem (2X SSC, 0,1% SDS) při teplotě místnosti, vždy po dobu 20 minut a potom dvakrát promývacím pufrem (0,lX SSC, 0,1% SDS) při 52°C, vždy po dobu 20 minut. Pod označením IX SSC se rozumí 0,15M roztok chloridu sodného s citrátem sodným (15mM) o pH 7,0. Vlhké membrány se zabalí do obalu ze saranu a provede se autoradiografie za použití filmu Hyperfilm-MP (Amersham/USB) a kazety s intenzifikačními stínítky. Různé koncentrace (0,25 až 4 mg celkové RNA) zjištěné spektrofotometricky u každého vzorku se nablotují a zkoušejí tak, aby bylo možno provést kvantifikaci po zajištění lineární odpovědi filmu. Kvantifikace se provádí za použití obrazové analýzy NCID (St. Catherine's, Ontario, Kanada).

9 99 9

9 9

9 9 9

Pro získání prób se cDNA klon myšího genu NGF izoluje v plasmidu pGEM.NGF(+) a cDNA klony humánního NT-3 a BDNF se izolují v plasmidu Bluescript. Po izolaci se cDNA próby označí ³²p-dCTP (ICN Biomedicals, Kanada, Ltd.) za použití soupravy Random Primed DNA Labelling Kit (Boehringer Mannheim Biochemica) způsobem popsaným v tomto kitu.

Syntetizuje (MOBIX, McMaster University) se 40merový kódující oligonukleotid, jako próba pro FGF-2. Tento oligonukleotid je komplementární k 5' konci myší sekvence kódující FGF-2b v mRNA. Tento oligonukleotid se na 5' konci označí za použití polynukleotid kinasy, pufru One-Phor-All, podle protokolu dodávaného firmou Pharmacia Biotech, lne. a ATPgP³² (ICN Biomedicals Canada, Ltd.).

Výsledky této studie produkce čtyř různých neurotrof ických faktorů jsou ukázány dále v tabulce H.

Tabulka H

Analýza Northern Blot neurotrofinových mRNA z astrocytů

Neurotro- trofinová mRNA	Kontrola	NGF 40 ng/ml	AIT-082 lOOmM	AIT-082 (lOOmM) + NGF (40 ng/ml)
NGF	-	-	++	+
FGF-2	+	-	++	+
BDNF	+	+	+	+
NT-3	—	—	++	+

Podmínky, za nichž vzniklo detegovatelné množství každé z neurotrofinových mRNA jsou označeny znakem +. Znak ++ ukazuje, že byl přítomen alespoň dvojnásobek detegovatelného množství. Negativní bloty jsou označeny znakem ·· · · · · · • · · · · ·

Výše uvedené výsledky ukazují, že AIT-082 indukuje expresi mRNA několika neurotrofických faktorů, včetně NGF. Ještě důležitější je, že tato data jasně potvrzují, že AIT-082 selektivně a kontrolovatelně indukuje in vivo genetickou expresi alespoň jedné přírodní geneticky kódované molekuly v savci ošetřeném způsobem podle vynálezu. Podání tohoto příkladného purinového derivátu selektivně indukuje expresi mRNA kódující 3 ze 4 identifikovaných neurotrofických faktorů, totiž NGF, FGF-2 a NT-3, ale neindukuje aktivaci nebo derepresi genu kódujícího BDNF mRNA. Toto selektivní potlačení spojené s jednoduchou aplikací sloučenin a způsobů podle vynálezu představuje účinné překonání omezení, která jsou vlastní dosavadnímu stavu techniky. Místo toho, aby bylo nutno podávat tyto molekulární sloučeniny přímo do buněk za použití složitých a potenciálně nebezpečných technik, umožňuje tento vynález léčit savčího pacienta za použití tradičních neinvasivních cest dodávky léčiva, jež indukuje u ošetřených buněk expresi genetického materiálu kódujícího požadované sloučeniny, což má za následek přímou in vivo dodávku a podávání. Přestože je genetická modifikace potenciálně užitečná v souvislosti s modifikací genů nebo jinými technikami molekulární biologie, u tohoto vynálezu jí není zapotřebí.

Jak již bylo uvedeno výše, v hippocampu pacientů postižených Alzheimerovou chorobou dochází k pozměněnému programu exprese genu, který vede k aberantní hladině mRNA pro neurotrofické faktory. Řada studií na zvířatech a klinických studií ukázala, že podávání jednotlivých neurotrofinů je pro léčení neurodegenerativních chorob nevhodné. Schopnost sloučenin podle vynálezu stimulovat produkci několika neurotrofinových mRNA v buňkách podstatně zvyšuje jejich potenciál, jako prostředků léčení různých neurodegenerativních chorob tím, že zajištuje způsob efektivního přímého podávání těchto přírodních geneticky kódovaných molekul pacientovi prostřednictvím indukce jejich in vivo genetické exprese.

Výše uvedené příklady ukazují, že AIT-082 stimuluje neuritogenesi in vitro v buňkách PC12, když se této látky použije samotné, a zvyšuje účinek růstového faktoru nervů (NGF), když se jí použije v kombinaci s tímto růstovým faktorem. Tyto příklady také ukazují, že neurotogenní účinek látky AIT-082 se snižuje působením methemoglobinu (který zachycuje a odstraňuje oxid dusnatý a oxid uhelnatý), methylenové modří (která inhibuje guanylyl cyklasu) a protoporfyrinem zinku IX (což je inhibitor hem oxygenasy produkující oxid uhelnatý). Neurotogenní účinek látky AIT-082 není ovlivněn působením L-NAME nebo NOLA, což jsou inhibitory tvorby oxidu dusnatého. AIT-082 kromě toho také stimuluje produkci řady různých neurotrofických faktorů.

Důkazem tohoto tvrzení je zvýšená hladina mRNA těchto faktorů v astrocytech po podání AIT-082 in vitro. Jelikož je látka AIT-082 orálně účinná a rychle překonává bariéru mezi krví a mozkem (srovnej příklad 2), je potenciálně terapeuticky velmi významná jako NGF-mimetické činidlo při Alzheimerově chorobě a jiných neurodegenerativních a buněčných chorobách.

S ohledem na výše uvedené výsledky byly provedeny studie pro demonstraci účinnosti použití AIT-082 pro léčení příkladných neurodegenerativních chorob. Ztráta paměti je základním symptomem Altzheimerovy choroby a řady jiných nervových postižení. Při Alzheimerově chorobě, amnézii, stárnutí a po lézích hippocamtu u opic dochází specificky k poškození pracovní (epizodické) paměti, účinky AIT-082 při zlepšování stavů zahrnujících ztrátu paměti bylo použito pro demonstraci účinnosti sloučenin podle vynálezu při léčení neurodegenerativních chorob.

• · · · * ·

Příklad 17

Srovnávací pokusy s paměťovou stopou u různých kmenů myší

Zkouška win-shift v bludišti typu T je považována za paradigma, které specificky modeluje pracovní paměť hlodavců a je obecně akceptována odborníky v tomto oboru. Přirozené chování hlodavců zahrnuje konzumaci potravy, když jsou zvířata hladová. Když zvířata zkonzumují všechnu přítomnou potravu, přirozeně se nevracejí se na stejné místo. Tento model nebyl navržen pro zohlednění celého obrovského množství dat vztahujících se k paměti. Data získaná při studiích s hypoxií a ischemií, což jsou postupy, které selektivně poškozují buňky hippocampu CA1, ukazují, že vznikají deficity v pracovní paměti, zatímco jiné typy paměti nejsou ovlivněny. Tyto skutečnosti silně naznačují, že existuje několik typů paměti, které mají různá anatomická místa a velice pravděpodobně také rozdílné neurochemické přísuny. Model win-shift tedy sice nemusí zohledňovat všechny neurochemické přísuny, které se podílejí na pracovní paměti, ale přesto představuje užitečný prostředek, který je v tomto oboru akceptován pro modelování farmakologických experimentů za účelem zjištění mechanismů, jimiž by bylo možno modifikovat paměť.

Samci myší Swiss Webster o stáří 6 měsíců (mladí dospělci) a 11 měsíců (staří samci) získaní z Národního ústavu stárnutí (National Institute of Aging) se chovají jednotlivě v klecích za použití 22hodinového cyklu světlo/ tma, přičemž zvířatům je nepřetržitě umožněn přístup k vodě. Potrava se zvířatům omezuje tak, aby se jejich hmotnost stabilizovala na 80 % hodnoty odpovídající hmotnosti v případě, že potrava omezována není. Myši se po dobu 1 týdne každý den váží a podrobují zkouškám. Modelová zkouška win-shift se provádí způsobem popsaným v literatuře za ·· ···· ···· • ' • · · ·· • · · · · • · · · · • · · »·· · • · · · • A ·· · použití bludiště typu T. Při této zkoušce následuje po každém správném pokusu správná odpověď. Interval mezi pokusy se mění a umožňuje stanovit nejdelší období mezi pokusy, po které je zvíře schopno si zapamatovat správnou odpověď při předcházejícím pokusu. To umožňuje měřit délku trvání parnětové stopy. Skóre 5 (5 správných odpovědí při 10 pokusech, 50% správnost) je považováno za náhodný výsledek, tj . zvíře si nepamatuje, která klec byla zvolena jako klec s odměnou při předchozím pokusu. Cílová klec s odměnou se po každém správném pokusu zamění. Každý den se s každou myší provádí 10 pokusů. Jestliže se zvíře naučí vnímat prostorové uspořádání (pouze na pravé straně), vrací se při každém pokusu ke stejnému cíli a správný poměr odpovědí je podstatně nižší než 50%. Doba latence od opuštění výchozí klece se zaznamenává jako měřítko motivace, doba běhu (doba od opuštění výchozí klece do dosažení cílové klece) se zaznamenává jako měřítko výkonnosti a počet správných odpovědí se zaznamenává jako měřítko paměti.

Data uvedená v tabulce I ilustrují účinek prodlužujícího se intervalu mezi pokusy u mladých dospělých myší, které nebyly podrobeny žádnému ošetření.

Tabulka I

Účinek délky intervalu mezi pokusy na paradigma win-shift¹

	Interval mezi pokusy	(sekundy)
	30 60 90	120 150
Myši
Swiss Webster	7,5* 7,5* 5,0

<9 · · · · •« · • · · · · · * • # ♦ · · · • · · · ··· · • · · · · ··· · · ·· *

Tabulka I - pokračování

Interval mezi pokusy (sekundy)
	30 60	90	120 150
Myši C57BL/6	7,0* 7,4*	7,0*	7,8 5,6

¹ Skóre představuje střední hodnotu správných odpovědí při 10 pokusech. 1 hodinu před zkoušením se zvířatům podá roztok chloridu sodného.

p < 0,05. Analýza dat se provádí zkouškou signifikance ANOVA; provede se Dunnetova zkouška pro srovnání skupin ošetřených léčivem s kontrolními skupinami. Procentická data se podrobí transformaci Are Sign.

Z dat uvedených v tabulce I je zřejmé, že myši Swiss Webster jsou schopny si zapamatovat strategii winshift, pokud činí interval mezi zkouškami 30 nebo 60 sekund. Pět myší ošetřených roztokem chloridu sodného vykazuje skóre vyšší než náhodné (50 %) v případě, že se interval mezi pokusy prodlouží na 90 sekund. Tato data ukazují, že u těchto zvířat paměťová stopa mizí v rozmezí od 60 do 90 sekund. Všechny zkoušky s hodnocením léčiv u normálních dospělců myši Swiss Webster byly prováděny s 90s intervalem mezi pokusy, pokud není uvedeno jinak. U myší C57BL/6 je doba trvání paměťové stopy 120 sekund.

Příklad 18

Účinek látky AIT-082 na dobu trvání paměťové stopy

Účinnost AIT-082 se porovnává s účinnosti takrinu (THA) a fysostigminu (PHY), což jsou experimentální anti50 ··*· • ·« ·♦ ····

cholinesterasová činidla zvyšující paměť zvířat. Léčiva se také hodnotí pokud se týče jejich účinků na lokomotorickou aktivitu. Při pamětovém paradigmatu win-shift se u látky AIT-082 zjišťuje schopnost indukovat toleranci po 18 dnech podávání léčiva. Kromě toho se u této látky zkouší aktivita při modifikaci učebního procesu při modifikovaném diskriminačním úkolu v bludišti T.

Jako léčiv se v tomto příkladu použije 4-[3-(1,6dihydro-6-oxo-9-purin-9-yl)-1-oxopropyl]aminobenzoové kyseliny (AIT-082) v podobě draselné soli, hydrochloridu takrinu (tetrahydroaminoakridin (THA), Sigma Chemical Company, St. Louis, Missouri, USA) a fysostigminu v podobě hemisulfátu (PHY, Sigma Chemical Company, St. Louis, Missoury, USA). Léčiva se rozpustí v roztoku chloridu sodného a každý den se připravuje čerstvý roztok. Všechny injekce mají objem 0,1 ml/10 g tělesné hmotnosti. Při zkoušení účinnosti léčiv se 1 hodinu před začátkem zkoušení zvířatům intraperitoneální (i.p.) injekcí podá látka AIT-082 nebo THA. S ohledem na kratší dobu účinku se PHY injekčně podává 30 minut před zkoušením. Kontrolní zvířata obdrží podobnou injekci roztoku chloridu sodného (vehikula).

Pro stanovení doby trvání paměťové stopy se zvířatům podá léčivo nebo roztok chloridu sodného a po 30 minutách (v případě PHY) nebo po 1 hodině (v případě AIT-082 nebo THA) se provede jeden referenční pokus s mléčnou odměnou umístěnou v obou cílových klecích. Po uplynutí označeného intervalu mezi pokusy se zvířata vrátí do výchozí klece a provede se první zkušební pokus, při němž je mléčná odměna pouze v cílové kleci, která je umístěna naproti kleci, do níž zvíře vstoupilo při svém předchozím správném pokusu. Každé zvíře se podrobí 10 pokusům, při nichž se umístění odměny mění pouze v tom případě, že předchozí odpověď byla správná.

• · ··· ·» · • · ·» «· ť · · · · • · · · · · • · . · · ··· · • · o · · *· · ·· ·· o tolerance roztok

Pro stanovení, zda se u zvířat vyvinula vůči biologickým účinkům AIT-082, se léčivo nebo chloridu sodného, podává každý den po dobu 18 dnů před zkoušením za použití standardního paradigmatu win-shift.

Zvířata se také trénují ve stejném bludišti T, jakého bylo použito při modelové zkoušce win-shift popsané výše. Tak jako při výše popsané metodě win-shift se zvířata předběžně ošetří a potom se podrobí jednomu referenčnímu pokusu, při němž je odměna k dispozici v obou cílových klecích. Zvířeti se však umožní konzumace mléčné odměny pouze ve zvolené cílové kleci. Při příštím pokusu je odměna, a tedy správná odpověčf, umístěna ve stejné cílové kleci, která byla zvolena pro referenční pokus a nemění se. Cílem je naučit zvíře, že nedochází k přesunu cílové klece v případě, že odpověčf je správná. Zvířata mají 10 pokusů za den a v tréningu se pokračuje tak dlouho, dokud zvíře během 2 po sobě jdoucích dnů nedosáhne alespoň 8 z 10 správných odpovědí. Zaznamenává se počet dnů tréningu, kterých je zapotřebí pro dosažení tohoto kritéria výkonnosti. Když zvíře dosáhne tohoto kritéria, cílová klec odpovídající správné odpovědi se zamění (reverze). Poté se zaznamenává počet dnů, kterých je zapotřebí pro dosažení stejného kritéria po provedení této změny.

Výsledky zkoušky učení a paměťové zkoušky win-shift v bludišti T jsou souhrnně uvedeny v tabulce J, která následuje.

φφ φ φ

Tabulka

Účinek AIT-082,

THA a PHY při myší Swiss

9Os intervalu mezi pokusy u Webster

Druh zkoušky	Kontrola	THA	AIT-	082	PHY
Dávka (mg/kg)	roztok NaCl	1,25	0,5	30,0	0,125
Zkouška paměti win-shift Správné odpovědi (správné odpovědi/10 pokusů)	4,6	7,1*	6,5*	8,2*	6,5
Doba latence (s)	2,68	8,22*	1,95	2,03
Doba běhu (s)	1,95	3,65*	2,20	1,95	2,65
Lokomotorická aktivita1 2	343	671*	323	378	N/T
Učení v bludišti T (doba ve dnech do dosažení kritéria)	3,6	N/T3	3,0	3,3	N/T
Reverze	4,2	N/T	3,78	3,5	N/T
Tolerance (správné odpovědi/10 pokusů)	4,9	N/T	N/T	7,6*	N/T

¹ každá skupina obsahuje přinejmenším 8 zvířat počet spontánních pohybů za hodinu ³ nezkoušeno • · · ·

* p < 0,05. Analýza dat se provádí zkouškou signifikance ANOVA; provede se Dunnetova zkouška pro srovnání skupin ošetřených léčivem s kontrolními skupinami. Procentická data se podrobí transformaci Are Sign a latence se transformují na převrácenou hodnotu času nebo rychlosti.

Jak ukazují data uvedená v tabulce J, léčení

AIT-082 má za následek zvýšení počtu správných odpovědí (zlepšení paměti) ve srovnání s ošetřením roztokem chloridu sodného (kontrolní pokus). Tento účinek byl sice řádově stejný jako účinek THA a PHY, ale THA a PHY také zvyšují dobu latence (prodlužují dobu do opuštění výchozí klece, což je důkazem snížené motivace) a THA zvyšuje spontánní lokomotorickou aktivitu. Látka AIT-082 při těchto zkouškách nevykázala žádný účinek na učení nebo reverzi a po 18 dnech předběžného ošetřování se nevyvine žádná tolerance, pokud se týče povzbuzujícího účinku látky AIT-082 na paměů. Pouze látka AIT-082 vykázala povzbuzující účinky na fukci paměti bez ovlivnění učení, motivace, výkonnosti a lokomotorické aktivity. Podobná data byla pozorována i při orálním podávání látky AIT-082.

Příklad 19

Účinek dávkování látky AIT-082 na dobu trvání paměíové stopy

Odpověd na dávku a doba trvání účinku AIT-082 se studuje na mladých dospělých myších Swiss Webster. Výsledky jsou uvedeny jako procentický podíl správných odpovědí nad podíl náhodný, kde za náhodný podíl je považováno 50% správných odpovědí. Jak je zřejmé z obr. 7, látka AIT-082 je účinná při zlepšování paměti u normálních dospělých myší Swiss Webster v dávce ležící v rozmezí od 0,5 do 60 mg/kg, přičemž optimálního účinku se dosáhne při dávkování 20 až 30 mg/kg. Jak dále zřejmé z obr. 8, začátek účinku je rychlý (1 • · • · · *· · · · hodina, data nejsou uvedena) a účinek trvá déle než 7 dní po podání jediné dávky 60 mg/kg. Odborníci v tomto oboru ocení skutečnost, že prodloužená doba trvání účinků léčiva podstatně sníží frekvenci podávání, což přinese užitek v ochotě pacienta podrobit se léčebnému režimu a ceně.

Příklad 20

Účinek látky AIT-082 na dobu trvání paměťové stopy u myší C57BL/6

Předchozí práce ukázala, že dobu trvání paměťové stupy 60 sekund při paradigmatu win-shift u normálních dospělců myši Swiss Webster je možno zvýšit podáním AIT-082. Pro další demonstraci aplikovatelnosti prostředků a proveditelnosti způsobů podle tohoto vynálezu se za použití výše popsaného protokolu zkouší látka AIT-082 na alternativním kmenu myší, který vykazuje odlišnou dobu trvání paměťové stopy. Výsledky jsou uvedeny v tabulce K, která následuje.

Tabulka K

Doba trvání paměťové stopy u myší C57BL/6

Doba mezi pokusy (s)	Druh ošetření skupiny
Kontrola (roztok NaCl)	AIT-082 (30 mg/kg)	Fysostigmin (0,125 mg/kg)
	PZ#	Správnost*	PZ#	Správnost*	PZ#	Správnost*
30	3/5	70±ll**
60	3/5	70±16**
90	4/5	70± 6**

• · ····

Tabulka K - pokračování

Doba mezi pokusy (s)	Druh ošetření skupiny
Kontrola (roztok NaCl)	AIT-082 (30 mg/kg)	Fysostigmin (0,125 mg/kg)
	PZ#	Správnost*	PZ#	Správnost*	PZ#	Správnost*
120	4/5	•tg db 78±16
150	1/5	56+10**
180	2/7	58±12**	4/6	70±15**	3/6	65±16*
210			4/6	78±15**	1/6	53± 9
240			0/6	50± 6
270			0/6	50± 6

$ Počet zvířat, jejichž úspěšnost je vyšší než náhodná (60% správnost)/celkový počet zkušebních zvířat ⁺ Střední hodnota ± směrodatná odchylka ** p < 0,01 (t-test proti náhodě)

JL p < 0,05 (t-test proti náhodě)

Při paradigmatu win-shift je typická hodnota trvání paměťové stopy u myší C57BL/6 120 sekund. Jak je zřejmé z tabulky K, při podání látky AIT-082 v dávce 30 mg/kg i.p. se doba trvání paměťové stopy prodlouží na 210 sekund. Fysostigmin sice také prodlužuje dobu trvání paměťové stopy při této modelové zkoušce, není však tak účinný jako AIT-082, poněvadž se s ním dosahuje jen prodloužení ze 120 na 180 sekund.

• ·· · • · · • · ····

Příklad 21

Léčení poruch paměti vyvolaných věkem za použití látky AIT-082

S ohledem na výsledky získané při výše popsaných pokusech byly provedeny studie demonstrující, že AIT-082 zlepšuje pamět savců, a to jak u savců s nervovými poruchami, tak u zdravých jedinců. 12 měsíců staří myší samci Swiss Webster se podrobí screeningu na výkonnost při zkoušce win-shift. Zvířata se zkoušejí při různé délce intervalu mezi pokusy, počínaje 10 sekundami a dále při intervalu 30, 60, 90 a 120 sekund. Výsledky zjištěné u neošetřených myší jsou uvedeny v tabulce L, která následuje.

Tabulka L

Deficit pracovní paměti vyvolaný věkem u myší Swiss Webster

Doba trvání	Počet	Podíl zví-	Stupeň zhoršení
paměťové stopy	zvířat	řat (%)	paměti
méně než 10 s	6	25	značný
10 s	8	33	střední
30 s	10	42	mírný
celkem	24	100

Výsledky uvedené v tabulce L ukazují, že jednotlivá zvířata lze roztřídit podle stupně poškození pracovní paměti. Zvířata se značným zhoršením nejsou schopna si zapamatovat správnou odpověď ani 10 sekund, zatímco zvířata s • ·« · * · · mírným deficitem jsou schopna si zapamatovat správnou odpověď po dobu 30sekundového intervalu mezi pokusy, ale nikoliv po dobu 60 sekund. Zvířata se středním deficitem si pamatují správnou odpověď v intervalu 10 sekund mezi pokusy, ale nikoliv v 30sekundovém intervalu. Pomocí modelové zkoušky win-shift je tedy možno detegovat zhoršení pracovní paměti vyvolané věkem. Jak je zřejmé odborníkům v tomto oboru, toto pozorování je důležité, poněvadž při vyhodnocování potenciálních terapeutických účinků poskytuje možnost použít věkově vyrovnaných zvířat s různým stupněm poškození.

Po stanovení základní linie se šesti zvířatům v každé ze tří skupin podá látka AIT-082 (30 mg/kg, 1 hodinu před zkoušením) nebo fysostigmin (0,125 mg/kg, 30 minut před zkoušením) a provede se zkouška win-shift. Výsledky, které jsou uvedeny v tabulce M uvedené dále, jsou graficky zpracovány na obr. 9.

Tabulka M

Účinek AIT-082 a PHY na dobu trvání pamětové stopy u myší Swiss Webster s pamětovými deficity indukovanými věkem

Stupeň deficitu	Interval mezi pokusy (s)	Kontrola (roztok NaCl)	AIT-082 30 mg/kg	PHY 0,125 mg/kg
mírný	60	0/6	6/6*	5/6*
	90		4/6	3/6
	120		2/6	2/6
	150		1/6	2/6
	180		1/6	1/6
	210		0/6	0/6

• · · 9 · · *··· *·· • · ·· · • ·

Tabulka Μ - pokračování

Stupeň deficitu	Interval mezi pokusy (s)	Kontrola (roztok NaCl)	AIT-082 30 mg/kg	PHY 0,125 mg/kg
střední	30	0/6	4/6*	1/6
	60		2/6	0/6
	90		0/6
značný	<10	0/6	0/6	0/6

Data jsou vyjádřena jako počet zvířat, jejichž úspěšnost je významně vyšší než náhodná/celkový počet zkušebních zvířat * p < 0,05 (t-test)

Šest zvířat vykázalo značný paměťový deficit (bez paměťové stopy). Tato zvířata nebyla schopna si zapamatovat úkol při lOs intervalu. U žádného z těchto zvířat nedošlo k navrácení paměti při léčení AIT-082 i PHY. U šesti zvířat se středním paměťovým deficitem (doba trvání paměťové stopy 10 sekund) se působením AIT-082 prodloužilo trvání paměťové stopy na více než 30 sekund u 4 zvířat (67 % zvířat) a u dvou zvířat se trvání paměťové stopy prodloužilo na více než 60 sekund (50 %). U šesti zvířat postižených mírným paměťovým deficitem (doba trvání paměťové stopy 30 sekund) se při podání AIT-082 prodloužilo trvání paměťové stopy u dvou zvířat na 60 sekund, u dvou zvířat na 90 sekund, u jednoho zvířete na 120 sekund a u jednoho zvířete na 180 sekund. Podání PHY se projevilo prodloužením doby trvání paměťové stopy z 10 sekund na 30 sekund pouze u jednoho zvířete ze skupiny se středním paměťovým deficitem. U skupiny s mírným paměťovým deficitem se podání PHY projevilo prodoužením doby ·· ····

trvání paměťové stopy u dvou zvířat na 60 sekund, u jednoho zvířete na 90 sekund a u dvou zvířat na alespoň 180 sekund. Je tedy možno uzavřít, že látka AIT-082 je účinnější než fysostigmin u skupiny se středním paměťovým deficitem a přinejmenším stejně účinná u skupiny s mírným paměťovým deficitem.

Příklad 22

Léčení poruch spojených s paměťovým deficitem vyvolaným věkem za použití látky AIT-082

Samci myši C57BL/6 o stáří 12 měsíců se podrobí screeningu na výkonnost při testu win-shift. Zvířata se zkoušejí při různých intervalech mezi jednotlivými pokusy. Jedinci, kteří nebyli schopni splnit požadované kritérium (nad 60 % správných odpovědí) při lOs intervalu se klasifikují jako jedinci se značným paměťovým deficitem. Jedinci, kteří splní požadované kritérium při intervalu 10 sekund, ale nikoliv 30 sekund, jsou klasifikováni jako jedinci se středním paměťovým deficitem a jedinci, kteří splní požadované kritérium při intervalu 30 sekund, ale nikoliv 60 sekund, jsou klasifikováni jako jedinci s mírným paměťovým deficitem. Tak jak v příkladu 21 se zvířatům v každé skupině podává buď látka AIT-082 nebo PHY za účelem stanovení rozsahu prodloužení stopy v pracovní paměti. Výsledky jsou uvedeny v tabulce N, jež následuje, a graficky jsou zpracovány na obr. 10.

·♦·· · ·♦ ·· ···· • ·»··♦· · ··· 9 9 9 99 9 • » · · ·· 99 9 9

9 9 9 9 9

999 99999 99 9

Tabulka Ν

Účinek AIT-082 a PHY na dobu trvání paměťové stopy u myší C57BL/6 s paměťovými deficity indukovanými věkem

Stupeň deficitu	Interval mezi pokusy (s)	Kontrola (roztok NaCl)	AIT-082 30 mg/kg	PHY 0,125 mg/kg
mírný	60	0/6	4/4*	7/8*
	90		2/4*	3/8
	120			2/8
	150			2/8
	180			2/8
	210			0/8
střední	10	6/6	6/6*	6/6
	30	0/6	4/6	1/6
	60		1/6	0/6
	90		0/6
značný	<10	0/6	0/6	0/6

Data jsou vyjádřena jako počet zvířat, jejichž úspěšnost je významně vyšší než náhodná/celkový počet zkušebních zvířat * p < 0,05 (t-test)

U skupiny s mírným paměťovým deficitem se podání

AIT-082 projeví prodloužením doby trvání paměťové stopy ze na 90 sekund. Prodloužení u skupiny se středním paměťovým deficitem je z 10 na 30 sekund. Látka PHY sice prodlužuje dobu trvání paměťové stopy u skupiny s mírným paměťovým de61

9999 · «9 99 9999

9 99 9 9 9 9 9

9999 999 99 9

99 99 9* 9999 ficitem, ale u skupiny se středním paměťovým deficitem je neúčinná. Je tedy možno shrnout, že pomocí látky AIT-082 je možno dosáhnout reverze deficitů pracovní paměti jak u normálních myší, tak u myší s neuronálními poruchami (kmene Swiss Webster a C57BL/6) vyvolanými věkem. Výsledky konkrétně ukazují, že látka AIT-082 navrací pracovní paměť u myší s mírným a středním paměťovým deficitem. Na základě ostatních příkladů uvedených výše lze učinit odůvodněný závěr, že k této regeneraci pracovní paměti dochází modifikací guanylylcyklasového systému dependentního na oxidu uhelnatém.

Tabulka O

Deficit pracovní paměti vyvolaný ethanolem a jeho reverze za použití AIT-082

	Ošetření
Kontrola	Ethanol	Ethanol + AIT-082
Správné pokusy 1»2	8,08+0,29	6,5 ±26*	7,89±0,54+
Doba latence (s)2	l,24±0,17	1,18± 0,10	l,77±0z27
Doba běhu (s)2	l,44±0,35	1,17± 0,08	3,22±0,61*+
Počet subjektů	13	13	9

¹ Střední počet správných odpovědí z 10 pokusů ² Střední hodnota ± směrodatná odchylka * p < 0,05 (t-test) ve srovnání s kontrolou ⁺ p < 0,05 (t-test) ve srovnání s ethanolem

Výsledky v tabulce 0 ukazují, že pomocí modelu win-shift je možno identifikovat dávku blokovacího

9999

9 9 '

činidla, která může vyvolat paměťový deficit. Ethanol byl zvolen jako nespecifické blokační činidlo a reverze jeho účinků bylo dosaženo podáním látky AIT-082 před ošetřením ethanolem. Na základě tohoto výsledky lze usuzovat, že by bylo možno použít k vyhodnocování také jiných specifičnějších blokačních činidel vykazujících účinnost na specifická receptorová místa.

Předpokládá se, že kromě látky AIT-082 budou i jiné purinové deriváty hrát úlohu při přežití neuronů, synaptogenesi a regeneraci funkce po poškození nebo odumření buněk centrálního nervového systému. Tak například podobnosti mezi guanosinem a látkou AIT-082 ukazují, že obě látky působí srovnatelnými mechanismy. Zdá se totiž, že obě tyto látky působí jako modulátory guanylyl cyklasy dependentní na oxidu uhelnatém. Je dále také známo, že po poškození buňky uvolňují velká množství purinových nukleosidů a nukleotidů do mimobuněčného prostoru. Extracelulární koncentrace guanosinu v oblasti ohniska mozkového poškození může dosahovat hodnoty 50mM a je zvýšena až na pětinásobek přinejmenším po dobu 7 dnů. Po poškození jsou tedy astrocyty (glia) a neurony exponovány vysokým extracelulárním koncentracím guanosinu.

V důsledku toho byly provedeny následující studie za účelem demonstrace účinnosti použití jiných exemplárních purinových derivátů, jako je guanosin, pro modulaci guanylyl cyklasového systému dependentního na oxidu uhelnatém.

Příklad 25

Po expozici guanosinu a GTP produkují astrocyty trofické faktory

- 63 ·· ····

Zdá se, že astrocyty proliferují v odpovědi na extracelulární guanosin nebo guanosintrifosfát (GTP). GTP a guanosin může také stimulovat uvolňování tropických faktorů z kultur neokortikálních astrocytů pocházejících z mozku neonatálních myší. Astrocyty byly inkubovány s různou koncentrací guanosinu nebo GTP. Imunoreaktivita neurotrofinu v kultivačním médiu ošetřených buněk byla potom měřena zkouškou ELISA.

V krátkosti lze uvedený postup charakterizovat takto; 96-ti jamkové misky Falcon (Fisher) se potáhnou ovčím monospecifickým anti-NGF IgG (1 mg/ml) přečištěným na afinitním sloupci s obsahem O,1M pufru na bázi uhličitanu sodného o pH 9,6. Po noční inkubaci při 4°C se přidá blokovací roztok (PBS s 10% kozím sérem), aby se odstranil nadbytek protilátky. Po 4hodinové inkubaci při teplotě místnosti se misky 3 x opláchnou PBS s obsahem 0,05 % smáčedla Tween 20. Přidá se kondicionované médium a standardní 2.5 S NGF purifikovaný pomocí HPLC a poté se misky inkubují přes noc. Následující den se misky 3 x opláchnou médiem PBS s 0,5 % smáčedla Tween 20. Přidá se sekundární protilátka, totiž králičí monospecifický anti-NGF IgG konjugovaný s b-galaktosidasou (metoda Pierce-SPDP) (zředění 1 ; 500). Misky se inkubují přes noc při 4'C a následující den se 3 x opláchnou médiem PBS s 0,05 % smáčedla Tween 20. Ke každému substrátu v jamce se přidá 0,2mM 4-methylumbelliferyl-b-galaktosid (MUG) v 0,lM fosfátovém pufru (lmM chlorid hořečnatý, pH 7,2). Po 4hodinové inkubaci při teplotě místnosti se reakce zastaví přídavkem 0,lM glycinu o pH 10,3. Vyhodnocení vzorků se provede ve čtecím zařízení Microfluor ELISA (excitace 360 nm, emise 450 nm). Citlivost tohoto stanovení je 10 pg/NGF v jamce.

Stanovením ELISA se detegují neurotrofiny NGF a NT-3 při téměř stejné afinitě a BDNF se lOOx nižší ·· ···· • ···· · ·* ·· · »····· · • · · · · · · · ·· · • · · · · · · ·«·· • · · · · · · ··» ··· ··· ·· ·· · aktivitou. Jak je zřejmé z obr. 12A a 12B, jak guanosin, tak GTP zvyšuje množství imunoreaktivity typu NGF v kultivačním médiu. Astrocyty exponované různé hladině guanosinu poskytují mnohem silnější odpověď než astrocyty exponované stejné koncentraci GTP.

Příklad 26

Po expozici guanosinu produkují astrocyty neurotrofické faktory

Pró potvrzení výsledků předchozího stanovení se měří hladina mRNA trofických faktorů FGF-2 a NGF v astrocytech, které byly exponovány guanosinu. Hladina mRNA se měří za použití protokolu popsaného výše v příkladu 16. Jak je zřejmé z obr. 13A a 13B, přídavek guanosinu má za následek zvýšení NGF mRNA (po 4 hodinách) a FGF-2 mRNA (po 24 hodinách), přičemž výše uvedené doby se počítají od přídavku k astrocytům. Pozorované zvýšení neurotrofinové mRNA je důležité po poškození mozku nebo při zotavování z poškození mozku, kdy jsou extracelulární koncentrace guanosinu značně vysoké. Jelikož jsou buňky po dobu několika dnů po poškození mozku vystaveny působení vysokých koncentrací guanosinu, zdá se, že guanosin může být zodpovědný za určité aspekty procesu regenerace.

Jak již bylo uvedeno výše, činidlo, jež by bylo schopno překročit bariéru mezi krví a mozkem a zvýšit koncentrace neurotrofických faktorů (zde měřených jako hladina mRNA), by mělo mít významný pozitivní účinek na přežití neuronů a na tvorbu kolaterálních nervových obvodů. Tyto jevy by zase měly vést ke zlepšení regenerace funkce při mnoha různých neurologických poruchách nebo po poškození nervového systému.

• ·

- 65 • · · • · · ··· · • · • · ·

Příklad 27

Neurony podléhají neuritogenesi po expozici guanosinu

Po fokálním poškození mozku dochází nejen ke změnám u glií či astrocytů, ale také dochází k důležitým změnám neuronů. Neuritické výčnělky přežívajících neuronů mohou podléhat neuritogenesi. Na základě dřívějších výsledků dosažených za použití látky AIT-082 byly proto provedeny studie pro demonstraci, že guanosin může také modifikovat guanylyl cyklasu dependentní na oxidu uhelnatém pro stimulaci neuritogenese. Jak již bylo uvedeno výše, jelikož buňky PCI2 vytvářejí homogenní populaci buněk podobajících se neuronům, aniž by byly kontaminovány buňkami typu astroglia, je snadno možno pozorovat přímé účinky příkladných purinových derivátů podle vynálezu na růst neuritů z těchto buněk.

Proto se buňky PC12 exponují guanosinu a adenosinu buď s nebo bez NGF a monitorují se způsobem popsaným v příkladu 12. Účinky expozice purinovým derivátům s NGF jsou uvedeny na obr. 14A, zatímco účinky expozice purinovým derivátům bez NGF jsou znázorněny na obr. 14B. Přímé srovnání účinků těchto purinových derivátů s nebo bez přítomnosti NGF je pro každou zkoušenou sloučeninu uvedeno na obr. 14C.

Jak je zřejmé z obr. 14A, guanosin, ale nikoliv adenosin, povzbuzuje po 48 hodinách růst neuritů indukovaný NGF v buňkách PC12. Toto povzbuzení je významné vzhledem k indukci samotným NGF při koncentracích guanosinu 30 a 300mM. Adenosin v žádné koncentraci nezvyšuje růst neuritů indukovaný NGF. Tyto výsledky ukazují, že růst neuritů indukovaný puriny není pouze generálizovaný jev. 5’-N-Ethylkarboxamidoadenosin (NECA), agonista adenosinového A^ a A₂ receptoru, také zvyšuje neuritogenesi, ale nikoliv ve stejném rozsahu jako guanosin.

• · • · » ·

Pokud se adenosinu a guanosinu použije samotného, tj. za nepřítomnosti NGF, obě tyto látky mírně zvyšují podíl buněk s neurity, jak je to zřejmé z obr. 14B. účinky guanosinu jsou jak při koncentraci 30, tak při koncentraci 300mM vyšší než účinky adenosinu při stejné koncentraci. Za přítomnosti NECA dochází jen k malé stimulaci růstu neuritů. Jelikož byly účinky těchto sloučenin za přítomnosti NGF mnohem snadněji interpretovatelné a podléhaly méně variacím mezi jednotlivými experimenty (než tomu bylo v případě použití těchto sloučenin samotných), většina dat vztahujících se k povzbuzení růstu neuritů byla pořízena za přítomnosti NGF.

Srovnávací data znázorněná na obr. 14A a 14B a zdůrazněná na obr. 14C ukazují, že guanosin vyvolává určité prodloužení neuritů, ale může také reagovat synergicky při zvyšování trofických účinků NGF. Samotný adenosin sice mírně povzbuzuje růst neuritů, ale nezvyšuje účinky NGF. Zajímavé je, že NECA, ale nikoliv adenosin, může synergicky zvyšovat účinky guanosinu, a to jak za přítomnosti, tak za nepřítomnosti NGF (viz obr. 14C). Skutečnost, že adenosin nezvyšuje růst neuritů dependentní na NGF v buňkách PC12, jako to činí guanosin, naznačuje, že tyto látky působí v buňkách PC12 odlišným způsobem. Adenosin zřejmě reaguje s receptory adenosinu, jako je A₂ purinoceptor. Tím zřejmě dochází k aktivaci adenylátcyklasy, která zvyšuje intracelulární cAMP.

NECA zřejmě působí tímto způsobem. Účinky NECA však vykazují synergii s účinky guanosinu. To ukazuje, že guanosin a NECA využívají různých signalizačních drah pro zvýšení růstu neuritů.

Příklad 28

Různé purinové deriváty poskytují různou rychlost neuritogenese »· «·«· • · ··· ·· · • ··· • · · • · • ·· ·· · · · · · • · · · · · • · · · ··· · • · « · · ··· ·· ·

S ohledem na výsledky získané při výše uvedených studiích byly jiné příkladné purinové deriváty zkoušeny za účelem demonstrace jejich specifičnosti při modulaci guanylyl cyklasy dependentni na oxidu uhelnatém vedoucí k modifikaci neurální aktivity. Konkrétně byly zkoušeny různé koncentrace purinových derivátů inosinu, hypoxanthinu a xanthinu za přítomnosti NGF. Pro demonstraci jejich schopmosti modifikovat neurální aktivitu bylo použito protokolu popsaného v příkladu 12.

Jak je zřejmé z obr. 15A, inosin pouze mírně zvyšuje růst neuritů ve srovnání s růstem, k němuž dochází v buňkách ošetřených samotným NGF. Toto tvrzení je pravdivé, pokud se týče koncentrace inosinu v rozmezí od 0,3 do 300mM. Z obr. 15A je také zřejmé, že působení inosinu na zvyšování růstu neuritů je mnohem méně účinné ve srovnání s působením guanosinu.

Z obr. 15B a 15C je také zřejmé, že i hypoxanthin a xanthin poskytuje podobné výsledky jako inosin při NGF-indukované neuritogenesi. Z obrázku 15C je zřejmé, že xanthin v koncentraci 0,3 až 30mM (koncentrace 300mM je toxická vůči buňkám) pouze mírně zvyšuje NGF-indukovaný růst neuritů.

Obr. 15B ukazuje, že hypoxanthin poskytuje nejvyšší, přestože stále ještě jen malé, zvýšení při koncentraci 0,3 a 300mM, přestože jiné koncentrace žádné významné zvýšení neposkytují. Přestože bylo pozorováno určité zvýšení růstu neuritů za použití hypoxanthinu, relativní rozsah tohoto zvýšení není tak velký jako je tomu v příkladě guanosinu. Tyto výsledky ukazují, že inosin, xanthin a hypoxanthin nemoduluje systém guanylyl cyklasy závislé na oxidu uhelnatém, a tedy nemodifikuje neurální aktivitu, nýbrž ovlivňuje jiné signalizační mechanismy.

• · · · · · • ···· e ·· «« · · · · · · · · • ··· · ·· · · · • · · · · ······ z-O ····· · * — oo ~ ··· ··· ··· ·· *· ·

Příklad 29

Účinky AIT-34 na neuritogenesi

Pro demonstraci účinků sloučenin, které se podobají látce AIT-082, na neuritogenesi, se buňky PC12 během růstu exponují látce AIT-34, totiž 3-(l,6-dihydro-6-oXo-9H-purin9-yl) -N-[ 3- (2-oxopyrrolidin-l-yl)propyl]propanamidu. Monitorování pokusu se provádí způsobem popsaným v příkladu 12.

Jak je zřejmé z obr. 16, různé koncentrace AIT-034 nezvyšují NGF-indukovanou neuritogenesi, která je pozorována u látky AIT-082.

Příklad 30

Účinky ATP a GTP na neuritogenesi

Pro další demonstraci, že je možno použít purinových derivátů obsahujících různé funkční skupiny v souladu s poznatky podle tohoto vynálezu, byly buňky PC12 exponovány adenosintrifosfátu (ATP) a guanosintrifosfátu (GTP), načež byla sledována neuritogenese za použití protokolu podle příkladu 12.

Zjistilo se, že odpovídající nukleotidy ATP a GTP mají paralelní, velmi podobné účinky na růst neuritů jako adenosin a guanosin. Jak je zřejmé z obr. 17, ATP nezvyšuje neuritogenesi ani u buněk, které jsou ošetřeny NGF, ani sám o sobě. V ostrém kontrastu s tímto výsledkem GTP povzbuzuje neuritogenesi při koncentraci 30 a 300mM za přítomnosti NGF a rovněž vyvolává růst neuritů sám o sobě.

Jak však je zřejmé z obr. 18, zdá se, že GTP nepůsobí jako zdroj, z něhož je guanosin řízeným způsobem uvolňován. Kdyby byl GTP působením ektoenzymů hydrolyzován na • · ·

guanosindifosfát (GDP), guanosinmonofosfát (GMP) a nakonec na guanosin, bylo by možno předvídat, že GDP a GMP budou také povzbuzovat růst neuritů u buněk PC12. Tak tomu však není, poněvadž ani GDP ani GMP není účinný sám o sobě nebo v kombinaci s NGF při povzbuzování růstu neuritů. Pro srovnání lze uvést, že všechny sloučeniny na bázi adeninu vykazují inhibiční účinek.

Příklad 31

Guanosin, ale nikoliv GTP, zvyšuje cGMP u buněk PC12

Na základě výsledků získaných v předcházejících příkladech byla provedena studie, jejímž účelem je demonstrovat neurotogenní mechanismy GTP a guanosinu. Bylo ukázáno, že guanosin a GTP zvyšují hladinu intracelulárního cyklického 3 ' ,5 ’-guanosinmonofosfátu (cGMP) v hladkém stalstvu artérií. Jelikož bylo oznámeno, že analogy cGMP stimulují růst neuritů z neuroblastomálních buněk, jevilo se jako možné, že jak guanosin, tak GTP by mohly vyvíjet své účinky prostřednictvím zvyšování hladiny intracelulárního cGMP. Jak je zřejmé z obr. 19, guanosin zvyšuje intracelulární hladinu cGMP v buňkách PC12, což se zjistilo radioimunoesejem za použití protokolu podrobně popsaného v příkladu 12. Takový nárůst by bylo možno očekávat u guanylyl cyklasového modulátoru dependentního na oxidu uhelnatém. V kontrastu s tím se však zjistilo, že GTP nezvyšuje hladinu cGMP, což ukazuje, že k jakékoliv GTP-stimulované neuritogenesi dochází odlišným mechanismem.

Příklad 32

Použití neselektivních inhibitorů guanylyl cyklasy snižuje neuritogenesi indukovanou guanosinem • · ·

- 70 Pro demonstraci, že guanosin modifikuje guanylylcyklasový systém dependentní na oxidu uhelnatém, byly provedeny studie, jejichž účelem bylo ukázat, že pro zvýšení neurotogenních účinků NGF na buňky PC12 je zapotřebí, aby byla zvýšena hladina intracelulárního cGMP. Použitý postup lze v krátkosti popsat takto: Různé koncentrace tří inhibitorů guanylyl cyklasy se přidají z buňkám PC12 s guanosinem a sleduje se neuritogenese za použití protokolu popsaného v příkladu 12.

Methylenová modř (MB) inhibuje rozpustnou guanylyl cyklasu (sGC), totiž enzym, který syntetizuje cGMP. Jak je zřejmé z obr. 20A, přídavek methylenové modři (0,1 až 5mM) ke kulturám buněk PC12 ruší synergické účinky guanosinu s NGF. Naproti tomu methylenová modř nemá žádný účinek na růst neuritů stimulovaný NGF.

Látka LY83583 inhibuje jak částicovou, tak rozpustnou guanylyl cyklasu. Obr. 20B ukazuje, že odpověď spočívající v růstu neuritů, která je vyvolána guanosinem, je inhibována látkou LY83583, ale odpověď vyvolaná NGF ovlivněna není. Mechanismus, kterým LY83583 inhibuje guanylyl cyklasu, není dosud znám, ale pravděpodobně je nepřímý a podílí se na něm metabolismus glutathionu. Dva neselektivní inhibitory guanylyl cyklasy, z nichž každý má odlišný mechanismus účinku, proto atenuují neurotogenní účinek guanosinu.

Tato data ukazují, že guanosin a NGF působí odlišnými mechanismy. Ukazují také, že zvýšení intracelulární hladiny cGMP je nutnou, ale možná nikoliv postačující podmínkou pro to, aby guanosin mohl uplatnit své neurotogenní účinky.

Za účelem zjištění, zda zvýšení hladiny cGMP je postačující podmínkou pro vyvolání růstu neuritů, byla provedena následující zkouška. K buněčným kulturám se podobným způsobem, jakého bylo použito v případě guanosinu, přidá atriální natriuretický faktor (ANF). ANF je hormon, jehož jediná signální transdukční dráha probíhá prostřednictvím aktivace částicové guanylyl cyklasy. Jak je zřejmé z obr. 20C, ANF, podobně jako guanosin, zvyšuje růst neuritů stimulovaný NGF z buněk PCI2, což ukazuje, že zvýšená produkce intracelulárního cGMP, která je indukována guanylyl cyklasou dependentní na oxidu uhelnatém nebo jinými mechanismy přispívá ke stimulaci růstu neuritů.

Příklad 33

Oxid dusnatý nebo oxid uhelnatý povzbuzuje neuritogenesi indukovanou guanosinem

Jelikož guanosin zvyšuje intracelulární cGMP (jak je zřejmé z příkladu 31), byly provedeny studie za účelem demonstrace, zda může být jeho signál přenášen prostřednictvím produkce oxidu dusnatého nebo oxidu uhelnatého. Pokud by se oxid dusnatý na tomto mechanismu nepodílel, potom by přídavky jeho donorů, z nichž je oxid dusnatý uvolňován, měly napodobovat účinky guanosinu.

Buňky PC12 se 48 hodin kultivují za přítomnosti nitroprussidu sodného (SNP) nebo dusitanu sodného (SN), což jsou obě látky, z nichž se uvolňuje oxid dusnatý. Když se SNP nebo SN použije samotného, nedojde k vyvolání růstu neuritů u buněk PC12. Podobně jako guanosin však SNP a SN zvyšuje synergickým způsobem růst neuritů zprostředkovaný NGF; v případě přidání SN jsou výsledky uvedeny na obr. 21. Tento efekt dále potvrzují výsledky uvedené na obr. 22A a 22B, které ukazují, že neurotogenní vlastnosti donorů oxidu dusnatého jsou inhibovány hemoglobinem (Hb) a methemoglobinem (Mb). Obě tyto látky pohlcují oxid dusnatý a oxid uhel-

natý s vysokou afinitou a zabraňují těmto činidlům, aby jich bylo možno využít jako přenašečů signálu.

Pokud oxid dusnatý nebo oxid uhelnatý zprostředkovává neurotogenní účinky guanosinu, potom by tedy tyto účinky měly být sníženy přídavkem hemoglobinu ke kulturám. Očekávaný účinek je jasně zřejmý z obr. 23, kde hemoglobin v koncentraci 0,1 až lmM inhibuje neurotogenní účinky guanosinu, ale nikoliv NGF. To ukazuje, že syntéza oxidu dusnatého nebo oxidu uhelnatého vyžaduje neurotogenní účinek guanosinu, ale nikoliv neurotogenní účinek NGF.

Několik skutečností ukazuje, že na guanosin při modifikaci neurální aktivity působí spíše oxid uhelnatý, a nikoliv oxid dusnatý. Tak například kdyby byly účinky guanosinu zprostředkovány oxidem dusnatým, potom by měl přídavek guanosinu k buňkám PC12 stimulovat cNOS v buňkách PC12 za účelem produkce oxidu dusnatého. Přítomnost cNOS však nebyla v buňkách PCI2 oznámena a neošetřené (naivní vzhledem ke guanosinu a NGF) buňky PC12 se nebarví diaforasou, což je enzym, který je rozmístěn spolu s NOS. Jelikož cNOS je kalcium/kalmodulin-sensitivní, její aktivita by se měla zvýšit po přidání vápníkového ionoforu, a to by tedy mělo vést ke zvýšení hladiny cGMP. Přídavek ionoforu A23187 ke kulturám buněk PC12 však nevyvolává zvýšení cGMP.

Příklad 34

Oxid uhelnatý, ale nikoliv oxid dusnatý zprostředkovává účinky guanosinu na neuritogenesi

Na základě výsledků získaných v předcházejících příkladech byly provedeny studie, jejichž úkolem bylo demonstrovat, že deriváty purinu podle tohoto vynálezu, včetně • · · · guanosinu, modulují guanylyl cyklasový systém dependentní na oxidu uhelnatém s následnou modifikací neurálních aktivit.

Tak jako bylo zjištěno při zkoušce za použití inhibitorů, popsané v příkladu 6, že oxid uhelnatý zprostředkovává účinky AIT-082, zjistilo se, že i guanosin a systém dependentní na oxidu uhelnatém na sebe vzájemně působí. Jak ukazuje obr. 24, inhibitor cNOS, kterým je L-nitroargininmethylester (L-NAME), neovlivňuje schopnost guanosinu povzbuzovat růst neuritů zprostředkovaný NGF. Tato data potvrzují, že se cNOS nepodílí na přenosové dráze signálu, která zprostředkovává neurotogenní účinky guanosinu na buňky PC12.

Pro další potvrzení, že je to oxid uhelnatý a nikoliv oxid dusnatý, který zprostředkovává neurotogenní účinky guanosinu, se k buňkám během růstu přidá protoporfyrin zinku IX (ZnPP), který inhibuje hem oxygenasu a tedy inhibuje syntézu oxidu uhelnatého. Jak je zřejmé z obr. 25, ZnPP ruší neurotogenní účinky guanosinu, ale neovlivňuje neurotogenní účinky NGF. Naproti tomu, podobný derivát protoporfyrinu, protoporfyrin mědi IX (CuPP) neinhibuje hem oxygenasu. Obr. 26 tedy ukazuje, že protoporfyrin mědi IX nesnižuje schopnost guanosinu povzbuzovat NGF-dependentní růst neuritů z buněk PC12. Tak jako tomu bylo u AIT-082, ukazují tato data, že guanosin zvyšuje syntézu oxidu uhelnatého. Oxid uhelnatý následně aktivuje rozpustnou guanylyl cyklasu (sGC) a zvyšuje intracelulární hladinu GMP, a tím povzbuzuje neuritogenesi.

Příklad 35

Inosin pranobex povzbuzuje neuritogenesi • ·

Pro získání další ilustrace rozsahu a použitelnosti tohoto vynálezu byly provedeny neurotogenní studie s inosinem pranobex. Inosin pranobex je tvořen směsí inosinu a DIP-PacBa v molárním poměru 1:3. Při této zkoušce byly různé koncentrace této sloučeniny přidány k buňkám PCI2 s NGF, které byly následně monitorovány za použití protokolu podle příkladu 12.

Jak ukazuje obr. 27, inosin pranobex podstatně zvyšuje rozsah růstu neuritů ošetřených buněk. Křivka znázorněná na obr. 27 ukazuje různou hladinu inosinu pranobexu v kombinaci s nasycenou koncentrací NGF, zatímco horizontální čáry představují kontrolní hodnoty pro NGF s příslušným rozmezím spolehlivosti. Ošetřené buňky při většině zvolených koncentrací vykazují hodnoty, které se nalézají nad základní kontrolní linií.

Modifikace buněčné, a konkrétněji, neurální aktivity podle tohoto vynálezu se může použít pro léčení širokého rozmezí buněčných a neurodegenerativních chorob spočívající v regeneraci buněčné nebo neurální funkce.

Vynálezu lze tedy použít pro léčení degenerace buněk a zvláště neurodegenerace vyvolané jakoukoliv příčinou, jako například oxidačním stresem, chorobou, úrazem, věkem a expozicí škodlivým fyzikálním nebo chemickým činidlům. Podobně lze způsobů a léčiv podle tohoto vynálezu použít pro léčení neurologických chorob. Jako neomezující příklady těchto chorob je možno uvést Alzheimerovu chorobu a podobné degenerativní poruchy, Parkinsonovu chorobu a podobné poruchy, jako je striatonigrální degenerace, spinocerebelární atrofie, motorická neuropathie či choroby pohybového systému, včetně amyotrofické laterální sklerózy, Werdnig-Hoffmannovy choroby, Wohlfart-KugelbergWelanderova syndromu a dědičné spastické diplegie, poškození • · · · • ·· ·· ···· *· · · · · · • · · · · · neuronů ischemií (například mrtvicemi), anoxií nebo hypoglykémií (například po prodloužené zástavě krevního oběhu), Huntingtonovu chorobu, cerebrální paralýzu, roztroušenou sklerosu, psychické poruchy, včetně afektivních poruch, schizofrenii, epilepsii a záchvaty, periferní neuropathie vyvolané jakoukoliv příčinou, neschopnost učení a poruchy paměti.

Výše uvedeným způsobem lze také léčit poškození neuronů nebo jejich výčnělků fyzikálními činidly, jako je záření nebo elektrický proud, nebo chemickými činidly zahrnujícími alkohol, hliník, těžké kovy, průmyslové toxiny, přírodní toxiny a legální nebo ilegální drogy.

Tohoto způsobu je také možno použít pro léčení obětí úrazu mozku nebo míchy, jež mají za následek poškození neuronů nebo pro léčení stavů vyvolaných věkem, jako je benigní zapomětlivost nebo zhoršení senzorických motorických reflexních nebo kognitivních schopností v důsledku ztráty neuronů nebo spojů mezi nimi. Pouhé podání účinné dávky alespoň jednoho purinového derivátu podle tohoto vynálezu, modulujícího guanylyl cyklasu dependentní na oxidu uhelnatém, pacientovi postiženému kteroukoliv z výše uvedených buněčných nebo neurálních poruch indukuje intracelulární změny vedoucí k regeneraci funkce.

Modifikace guanylyl cyklasového systému dependentního na oxidu uhelnatém v souladu s poznatky tohoto vynálezu vyvolává konkrétně změny neurální aktivity v neuronech a gliálních buňkách včetně astrocytů. Tak například je za použití tohoto vynálezu možno modifikovat neurální aktivitu astrocytů za účelem syntézy různých neurotrofických faktorů a cytokinů, včetně růstového faktoru fibroblastů (FGF), růstového faktoru nervů (NGF) neurotrofického faktoru odvozeného z mozku (BDNF) a neurotrofinu-3 • · · · «· * ·· ··· · (NT-3). Tyto faktory mohou ovlivnit klíčení neuritických výčnělků z přečivších neuronů, jakož i povzbuzování vývoje nových buněk. Potom se mohou vytvořit nové synapse, a může dojít k určité regeneraci funkce. Tyto neurotrofické faktory také hrají neuroprotektivní úlohu. Indukce jejich produkce může tedy vést ke zlepšení dalších neurálních poškození.

Podle vynálezu je možno použít četných derivátů purinu. Schopnost modifikovat neurální aktivitu prostřednictvím modulace guanylyl cyklasového systému dependentního na oxidu uhelnatém však není obecnou vlastností všech purinů nebo purinových derivátů. Tak například, jak ukazují výše uvedená data, inosin, adenosin, hypoxanthin a xanthin jsou všechny relativně neúčinné při modifikaci neurální aktivity. Jiné purinové deriváty, které nevykazují schopnost modifikovat neurální aktivitu, zahrnují ethylester 3-(6-amino-9Hpurin-9-yl)propionové kyseliny (AIT-0026), 3-(1,6-dihydro6-oxo-9H-purin-9-yl)-N-[3-(2-oxopyrrolidin-l-yl)propyl]propanamid (AIT-0034) a propentofyllin. Kromě toho, bylo sice ukázáno, že jiné puriny a purinové deriváty, jako je 5'-N-ethylkarboxamidoadenosin (NECA) sice stimulují růst neuritů, ale nečiní tak prostřednictvím modulace guanylylcyklasového mechanismu dependentního na oxidu uhelnatém. Rozsah tohoto vynálezu je tedy definován funkční reaktivitou purinových derivátů, které modifikují buněčnou nebo neurální aktivitu způsobem uvedeným v tomto popisu, tak jak je dokumentován zde uvedenými daty. Odborníkům v tomto oboru je zřejmé, že sloučeniny podle vynálezu je možno nahradit jejich funkčně ekvivalentními isomery, analogy a homology.

Odborníkům v tomto oboru je dále také zřejmé, že vynález je možno provádět jinými specifickými formami, aniž by to znamenalo odklon od ducha vynálezu a jeho ústředních atributů. V předcházejícím popisu je tedy vynález objasněn pouze na svých příkladných provedeních a rozumí se, že do · ····

9 9 9 9 ·

9 9

99 rozsahu tohoto vynálezu spadají i všechny jeho zřejmé variace. Rozsah vynálezu se tedy neomezuje na výše popsaná konkrétní provedení, nýbrž je vymezen spíše následujícími patentovými nároky.

Claims (90)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Léčivo pro dlouhodobou modifikaci savčí neurální aktivity, vyznačující se tím, že obsahuje účinné množství alespoň jednoho purinového derivátu modulujícího guanylyl cyklasu dependentní na oxidu uhelnatém.
2. 2. Léčivo podle nároku 1, vyznačující se t í m , že purinový derivát modulující guanylyl cyklasu dependentní na oxidu uhelnatém je zvolen ze souboru zahrnujícího guanosin, 4-[3-(l,6-dihydro-6-oxo-9H-purin-9-yl)-loxopropyl]aminobenzoovou kyselinu a inosin pranobex.
3. 3. Léčivo podle nároku 1, vyznačující se t í m , že účinné množství alespoň jednoho purinového derivátu modulujícího guanylyl cyklasu dependentní na oxidu uhelnatém produkuje léčebnou koncentraci přinejmenším ΙμΜ.
4. 4. Léčivo podle nároku 2, vyznačující se tím, že je uspořádáno pro orální podávání alespoň jednoho purinového derivátu modulujícího guanylyl cyklasu dependentní na oxidu uhelnatém savčímu subjektu.
5. 5. Léčivo podle nároku 2, vyznačující se tím, že je uspořádáno pro injekční podávání alespoň jednoho purinového derivátu modulujícího guanylyl cyklasu dependentní na oxidu uhelnatém savčímu subjektu.
6. 6. Léčivo podle nároku 1, vyznačující se t í m , že modifikací savčí neurální aktivity je produkce neurotrofinů.
7. 7. Léčivo podle nároku 1, vyznačující se t í m , že modifikací savčí neurální aktivity je produkce pleiotrofinů.

   44 4444
8. 8. Léčivo podle nároku 1, vyznačující se t i m , že modifikací savčí neurální aktivity je zvýšené přežití neuronů.
9. 9. Léčivo podle nároku 1, vyznačující se t i m , že modifikací savčí neurální aktivity je tvorba kolaterálních nervových obvodů.
10. 10. Léčivo podle nároku 1, vyznačující se t i m , že modifikací savčí neurální aktivity je neuritogenese.

    se tím ba synapsí.

    Léčivo podle nároku 1, vyznačující , že modifikací savčí neurální aktivity je tvors e dukce
11. 12. Léčivo podle nároku 1, vyznačující tím, že modifikací savčí neurální aktivity je procyklických purinnukleotidů.
12. 13. Léčivo podle nároku 1, vyznačující se t i m , že modifikací savčí neurální aktivity je zvýšená aktivita neurotrofinu nebo pleiotrofinu.
13. 14. Léčivo podle nároku 13, vyznačující se t i m , že zvýšená aktivita neurotrofinu nebo pleiotrof inu je produkována neurotrofickým faktorem zvoleným ze souboru zahrnujícího růstový faktor nervů, růstový faktor fibroblastů, neurotrofin-3, neurotrofický faktor odvozený z mozku, neurotrofin-4/5 ciliární neurotrofický faktor, S100B a jejich kombinace.
14. 15. Léčivo pro léčení savčích neurologických chorob, vyznačující se tím, že ·· ···· obsahuje účinné množství alespoň jednoho purinového derivátu modulujícího guanylyl cyklasu dependentní na oxidu uhelnatém.
15. 16. Léčivo podle nároku 15, vyznačující se t í m , že purinový derivát modulující guanylyl cyklasu dependentní na oxidu uhelnatém je zvolen ze souboru zahrnujícího guanosin, 4-[3-(l,6-dihydro-6-oxo-9H-purin-9-yl)-loxopropyl]aminobenzoovou kyselinu a inosin pranobex.
16. 17. Léčivo podle nároku 15, vyznačující se t í m , že účinné množství alespoň jednoho purinového derivátu modulujícího guanylyl cyklasu dependentní na oxidu uhelnatém produkuje léčebnou koncentraci přinejmenším ΙμΜ.
17. 18. Léčivo podle nároku 16, vyznačující se tím, že je uspořádáno pro orální podávání alespoň jednoho purinového derivátu modulujícího guanylyl cyklasu dependentní na oxidu uhelnatém savčímu subjektu.
18. 19. Léčivo podle nároku 16, vyznačující se tím, že je uspořádáno pro injekční podávání alespoň jednoho purinového derivátu modulujícího guanylyl cyklasu dependentní na oxidu uhelnatém savčímu subjektu.
19. 20. Léčivo podle nároku 15, vyznačující se t í m , že savčí neurologickou chorobou je Alzheimerova choroba a příbuzné neurodegenerativní poruchy.
20. 21. Léčivo podle nároku 15, vyznačující se t í m , že savčí neurologickou chorobou je benigní zapomětlivost a podobné poruchy.
21. 22. Léčivo podle nároku 15, vyznačující se t í m , že savčí neurologickou chorobou je ztráta neuronů nebo jejich vzájemného spojení a tím zhoršení • · 9 · · 9 sensorické, motorické, reflexní nebo kognitivní schopnosti, které jsou spojeny s věkem.
22. 23. Léčivo podle nároku 15, vyzná se t i m , že savčí neurologickou chorobou je va choroba a podobné poruchy.
23. 24. Léčivo podle nároku 15, vyzná se t i m , že savčí neurologickou chorobou je berální atrofie.

    č u j ící Parkinsonoč u j ící spinocere
24. 25. Léčivo podle nároku 15, vyznačující se t i m , že savčí neurologickou chorobou je motorická neuronopathie.
25. 26. Léčivo podle nároku 15, vyznačující se t i m , že savčí neurologickou chorobou je poškození neuronů nebo jejich výčnělků fyzikálními činidly.
26. 27. Léčivo podle nároku 15, vyznačující se t i m , že savčí neurologickou chorobou je poškození neuronů ischemií, anoxií nebo hypoglykémií.
27. 28. Léčivo podle nároku 15, vyznačující se t i m , že savčí neurologickou chorobou je poškození neuronů chemickými činidly.
28. 29. Léčivo podle nároku 15, vyznačující se t i m , že savčí neurologickou chorobou je úraz mozku nebo míchy.

    s e nebo
29. 30. Léčivo podle nároku 15, vyzná tím, že savčí neurologickou chorobou je záchvaty.

    č u j ící epilepsie • · · · ·· e···
30. 31. Léčivo podle nároku 15, vyznačující se t í m , že savčí neurologickou chorobou je periferní neuropathie.
31. 32. Léčivo podle nároku 15, vyznačující se t í m , že savčí neurologickou chorobou je neschopnost učení.
32. 33. Léčivo podle nároku 15, vyznačující se t í m , že savčí neurologickou chorobou je cerebrální paralýza.
33. 34. Léčivo podle nároku 15, vyznačující se t í m , že savčí neurologickou chorobou je psychická porucha.
34. 35. Léčivo podle nároku 15, vyznačující se t í m , že savčí neurologickou chorobou je porucha paměti.
35. 36. Léčivo podle nároku 15, vyznačující se t í m , že savčí neurologickou chorobou je Huntingtonova choroba.
36. 37. Léčivo pro indukci dlouhodobých změn membránového potenciálu savčích neuronů, vyznačuj ící se t í m , že obsahuje účinné množství alespoň jednoho purinového derivátu modulujícího guanylyl cyklasu dependentní na oxidu uhelnatém.
37. 38. Léčivo podle nároku 37, vyznačující se t í m , že purinový derivát modulující guanylyl cyklasu dependentní na oxidu uhelnatém je zvolen ze souboru zahrnujícího guanosin, 4-[3-(l,6-dihydro-6-oxo-9H-purin-9-yl)-loxopropyl]aminobenzoovou kyselinu a inosin pranobex.

    • ··<·· ·« · • ··· • · · • ·· ·» · ··« ······ « • · · · · · ·· · * ··9 · • · · · · «·· *· *· ·
38. 39. Léčivo podle nároku 37, vyznačující se t í ra , že účinné množství alespoň jednoho purinového derivátu modulujícího guanylyl cyklasu dependentní na oxidu uhelnatém produkuje léčebnou koncentraci přinejmenším ΙμΜ.
39. 40. Léčivo pro selektivní a kontrolovatelnou indukci in vivo genetické exprese alespoň jedné přírodní geneticky kódované molekuly v savci, vyznačuj ící se t í m , že obsahuje účinné množství alespoň jednoho purinového derivátu modulujícího guanylyl cyklasu dependentní na oxidu uhelnatém.
40. 41. Léčivo podle nároku 40, vyznačující se t í m , že purinový derivát modulující guanylyl cyklasu dependentní na oxidu uhelnatém je zvolen ze souboru zahrnujícího guanosin, 4-[3-(1,6-dihydro-6-oxo-9H-purin-9-yl)-loxopropyl]aminobenzoovou kyselinu a inosin pranobex.
41. 42. Léčivo podle nároku 40, vyznačující se t í m , že účinné množství alespoň jednoho purinového derivátu modulujícího guanylyl cyklasu dependentní na oxidu uhelnatém produkuje léčebnou koncentraci přinejmenším ΙμΜ.
42. 43. Léčivo podle nároku 40, vyznačující se tím, že je uspořádáno pro orální podávání alespoň jednoho purinového derivátu modulujícího guanylyl cyklasu dependentní na oxidu uhelnatém savčímu subjektu.
43. 44. Léčivo podle nároku 40, vyznačující se tím, že je uspořádáno pro injekční podávání alespoň jednoho purinového derivátu modulujícího guanylyl cyklasu dependentní na oxidu uhelnatém savčímu subjektu.

    • 9 • · · · · · ·· 9 9 • 9
44. 45. Léčivo podle nároku 40, vyznačující se t í m , že alespoň jednou přírodní geneticky kódovanou molekulou je neurotrofický faktor.
45. 46. Léčivo podle nároku 45, vyznačující tím, že neurotrofickým faktorem je neurotrofin.
46. 47. Léčivo podle nároku 45, vyznačuj ící tím, že neurotrofickým faktorem je pleiotrofin.
47. 48. Léčivo podle nároku 45, vyznačující se t í m , že neurotrofický faktor je zvolen ze souboru zahrnujícího růstový faktor nervů, růstový faktor fibroblastů, neurotrofin-3, neurotrofický faktor odvozený z mozku, neurotrofin-4/5 ciliární neurotrofický faktor,

    S100B a jejich kombinace.
48. 49. Léčivo pro účinné přímé podávání alespoň jedné přírodní geneticky kódované molekuly savci selektivní indukcí in vivo genetické exprese této molekuly v savci, vyznačující se tím, že obsahuje účinné množství alespoň jednoho purinového derivátu modulujícího guanylyl cyklasu dependentní na oxidu uhelnatém.
49. 50. Léčivo podle nároku 49, vyznačující se t í m , že purinový derivát modulující guanylyl cyklasu dependentní na oxidu uhelnatém je zvolen ze souboru zahrnujícího guanosin, 4-[3-(l,6-dihydro-6-oxo-9H-purin-9-yl)-loxopropyl]aminobenzoovou kyselinu a inosin pranobex.
50. 51. Léčivo podle nároku 49, vyznačující se t í m , že účinné množství alespoň jednoho purinového derivátu modulujícího guanylyl cyklasu dependentní na oxidu uhelnatém produkuje léčebnou koncentraci přinejmenším ΙμΜ.

    44 4 ·

    4444 a 4 4 4 4 4

    4 44 444 4
51. 52. Léčivo podle nároku 49, vyznačující se tím, že je uspořádáno pro orální podávání alespoň jednoho purinového derivátu modulujícího guanylyl cyklasu dependentní na oxidu uhelnatém savčímu subjektu.
52. 53. Léčivo podle nároku 49, vyznačující se tím, že je uspořádáno pro injekční podávání alespoň jednoho purinového derivátu modulujícího guanylyl cyklasu dependentní na oxidu uhelnatém savčímu subjektu.
53. 54. Léčivo podle nároku 49, vyznačující se t í m , že alespoň jednou přírodní geneticky kódovanou molekulou je neurotrofický faktor.
54. 55. Léčivo podle nároku 54, vyznačující tím, že neurotrofickým faktorem je neurotrofin.
55. 56. Léčivo podle nároku 54, vyznačující tím, že neurotrofickým faktorem je pleiotrofin.
56. 57. Léčivo podle nároku 54, vyznačující se t í m , že neurotrofický faktor je zvolen ze souboru zahrnujícího růstový faktor nervů, růstový faktor fibroblastů, neurotrofin-3, neurotrofický faktor odvozený z mozku, neurotrofin-4/5 ciliární neurotrofický faktor,

    S100B a jejich kombinace.
57. 58. Léčivo pro léčení savčích chorobných stavů spojených s poškozením buněk oxidačním stresem indukcí in vivo produkce alespoň jednoho přírodního endogenního antioxidantů, vyznačující se tím, že obsahuje účinné množství alespoň jednoho purinového derivátu modulujícího guanylyl cyklasu dependentní na oxidu uhelnatém.

    • · · · · · ···· • · ·
58. 59. Léčivo podle nároku 58, vyznačující se t i m , že purinový derivát modulující guanylyl cyklasu dependentní na oxidu uhelnatém je zvolen ze souboru zahrnujícího guanosin, 4-[3-(l,6-dihydro-6-oxo-9H-purin-9-yl)-loxopropyl]aminobenzoovou kyselinu a inosin pranobex.
59. 60. Léčivo podle nároku 58, vyznačující se t i m , že účinné množství alespoň jednoho purinového derivátu modulujícího guanylyl cyklasu dependentní na oxidu uhelnatém produkuje léčebnou koncentraci přinejmenším ΙμΜ.
60. 61. Léčivo podle nároku 59, vyznačující se tím, že je uspořádáno pro orální podávání alespoň jednoho purinového derivátu modulujícího guanylyl cyklasu dependentní na oxidu uhelnatém savčímu subjektu.
61. 62. Léčivo podle nároku 59, vyznačující se t i m , že je uspořádáno pro injekční podávání alespoň jednoho purinového derivátu modulujícího guanylyl cyklasu dependentní na oxidu uhelnatém savčímu subjektu.
62. 63. Léčivo podle nároku 58, vyznačující se t i m , že savčím chorobným stavem je Alzheimerova choroba a příbuzné degenerativní poruchy.
63. 64. Léčivo podle nároku 58, vyznačující se t i m , že savčím chorobným stavem je benigní zapomětlivost a podobné poruchy vyvolané věkem.
64. 65. Léčivo podle nároku 58, vyznačující se t i m , že savčím chorobným stavem je ztráta neuronů nebo jejich vzájemného spojení a tím zhoršení sensorické, motorické, reflexní nebo kognitivní schopnosti, které jsou spojeny s věkem.

    • ·

    - 87
65. 66. Léčivo podle nároku 58, vyznačuj se t i m , že savčím chorobným stavem je Parkinsonova choroba a podobné poruchy.
66. 67. Léčivo podle nároku 59, vyznačuj se t i m , že savčím chorobným stavem je spinocereberální atrofie.
67. 68. Léčivo podle nároku 58, vyznačuj se t i m , že savčím chorobným stavem je motorická neuronopathie nebo amyotrofická laterální sklerosa.
68. 69. Léčivo podle nároku 58, vyznačuj se t i m , že savčím chorobným stavem je poškození neuronů nebo jejich výčnělků fyzikálními činidly.
69. 70. Léčivo podle nároku 58, vyznačuj se t i m , že savčím chorobným stavem je poškození neuronů ischemií, anoxií nebo hypoglykémií.
70. 71. Léčivo podle nároku 58, vyznačuj se t i m , že savčím chorobným stavem je poškození neuronů chemickými činidly.
71. 72. Léčivo podle nároku 58, vyznačuj se t i m , že savčím chorobným stavem je úraz srdce, nebo míchy.
72. 73. Léčivo podle nároku 58, vyznačuj se t i m , že savčím chorobným stavem je epilepsie nebo záchvaty.
73. 74. Léčivo podle nároku 58, vyznačuj se t i m , že savčím chorobným stavem je periferní neuropathie.

    ící ící ící ící ící ící

    1 C 1 mozku ící ící

    - 88
74. 75. Léčivo podle nároku 58, vyznačuj ící se t í m , že savčím chorobným stavem je neschopnost učení.
75. 76. Léčivo podle nároku 58, vyznačující se t i m , že savčím chorobným stavem je cerebrální paralýza.
76. 77. Léčivo podle nároku 58, vyznačující se t i m , že savčím chorobným stavem je psychická porucha.
77. 78. Léčivo podle nároku 58, vyznačující se t i m , že savčím chorobným stavem je porucha paměti.
78. 79. Léčivo podle nároku 58, vyznačuj ící se t i m , že savčím chorobným stavem je Huntingtonova choroba.

    s e vo.
79. 80. Léčivo podle nároku 58, vyznačující tím, že endogenním antioxidantem je žlučové barvi
80. 81. Léčivo podle nároku 80, vyznačující se t i m , že žlučové barvivo je zvoleno ze souboru zahrnujícího biliverdin a bilirubin.
81. 82. Léčivo podle nároku 80, vyznačující se t i m , že žlučové barvivo je produkováno degradací hernu hem oxygenasou.
82. 83. Léčivo pro indukci in vivo produkce hem oxygenasy u savců, vyznačující se tím, že obsahuje účinné množství alespoň jednoho purinového derivátu modulujícího guanylyl cyklasu dependentni na oxidu uhelnatém.
83. 84. Léčivo podle nároku 83, vyznačující se t i m , že purinový derivát modulující guanylyl cyklasu dependentni na oxidu uhelnatém je zvolen ze souboru zahrnujícího guanosin, 4-[ 3-(1,6-dihydro-6-oxo-9H-purin-9-yl)-loxopropyl)aminobenzoovou kyselinu a inosin pranobex.
84. 85. Léčivo podle nároku 83, vyznačující se t i m , že účinné množství alespoň jednoho purinového derivátu modulujícího guanylyl cyklasu dependentni na oxidu uhelnatém produkuje léčebnou koncentraci přinejmenším ΙμΜ.
85. 86. Léčivo podle nároku 84, vyznačující se tím, že je uspořádáno pro orální podávání alespoň jednoho purinového derivátu modulujícího guanylyl cyklasu dependentni na oxidu uhelnatém savčímu subjektu.
86. 87. Léčivo podle nároku 84, vyznačující se tím, že je uspořádáno pro injekční podávání alespoň jednoho purinového derivátu modulujícího guanylyl cyklasu dependentni na oxidu uhelnatém savčímu subjektu.
87. 88. Léčivo podle nároku 83, vyznačuj ící se t i m , že indukuje degradaci hernu v savci hem oxygenasou za účelem endogenní produkce žlučového barviva a oxidu uhelnatého.
88. 89. Léčivo podle nároku 83, vyznačující se tím, že je moduluje guanylyl cyklasu v savci endogenně produkovaným oxidem uhelnatým.
89. 90. Léčivo podle nároku 88, vyznačující se t i m , že neutralizuje nebo sekvestruje volné radikály v savci endogenně produkovaným žlučovým barvivém.
90. 91. Léčivo podle nároku 88, vyznačující se t i m , že indukuje snížení krevního tlaku savce endogenně produkovaným oxidem uhelnatým.

    01-2783-96-Če ·· ·· ···· • · · · · • · · · · • · · ··· · • · · · ·· ·· · pH £

    bfi a

    >o £

    CD cd r—I

    Ph <M

    O

    I

    H

    C

    0) o

    cd

    P

    Podíl správných odpovědí (%)

    Obr. 4A

    Kontrol. M_etíb ΑΓΓ-08Ζ ΑΓΓ-08Ζ+Metíb

    Obr. 4B

    Kontrola A/T-Ú88+Μβ

    Podíl buněk s neurity

    Obr. 4C ·· « · · · ·· • · · · · • · · · · • · · · · · · • · · « ·· ·· ·

    Podíl buněk s neurity Podíl buněk s neurity

    Obr. 5A

    E3 0/<M L-NfíM£

    O,J/tM L-NflME L-MM£

    S JO/tML-MM£

    NOLfí JO/iMfí/Γ JóO/tMfl/T samotný

    Obr. 5B

    B ΟβΜ NOLfí % 0//tM NOLfí

    NOLfí JOμΜ NOLfí • ···· «· · · • ··· • · · • · ·· ·· «»·· • « · · · • · · · · • · · ··· · • · · · ·· ·· · • »9 · ·· ····

    99 · • ··· • · »

    9 ·

    9 9 · 9

    9 · · · • 9 9 ·♦· · 9 '9 9 9

    99 99 9

    Obr. 9

    Obr. 10 o\o •r4 '© •l—i řd

    Xi

    O '1-1

    O ►i—» pj \5 &

    Efl joo3000 4020

    KT \

    \ \

    I kontrola

    ΟΙΓ-082

    PPY ks \/ cd

    V<

    >

    £

    Bá

    Stupen deficitu

    JO značný /

    / /

    /// /

    fí\ //30 CO 30 mírný

    Interval mezi pokusy (s)

    WWW

    JO 30 CO 30 střední • · ·· · · ·· • · ♦ · · e · · · · « · · ·· · · • · · · • ·· ·· ·

    Obr. 11 cd

    50000

    9999 • · ·

    Obr. 12A

    99 9999 • 9 • ·

    9 9 9 9

    9 9

    9 9 9

    Aí ε

    cd bc

    Pn

    C5

    K cd

    S •r-l τ>

    cd

    I

    Λ 'cd

    40000 30000 zoooo 30000 ω •r-l

    N

    Koncentrace přidaného GTP (^uM) v jamce

    Zjevná hladina NGF (pg·/jamka)

    Obr. 12B v jamce

    Obr·. * 4«3 A

    Relativní optická densita na 1/Ug RNA Relativní optická densita na lug RNA

    Obr. 13B

    0,086 kontrolní CL/O kontrolní

    84 h • ···· 9· · • * · · ··· «·

    Obr

    14A

    Podíl buněk s neurity (%) Podíl buněk s neurity (%) (buňky ošetřené NGF = 100 %) (buňky ošetřené NGF - 100 %)

    30 300 30 300 JO

    Obr. 14B

    4 444· 4 »4 4· 4444 • 44 4444 .44 4

    4444 · 4 4 4· 4 • · · 44 44 4444

    4 · · · · 4 · ··· ··· ··♦ 4· «4 ·

    Obr. 14C

    Podíl růstu neuritů (%) Podíl buněk s neurity (%) (vztažený na NGF kontrolu) (NGF = 100 %)

    Obr. 15 A /W//V (/<M) • · · · • · ··· ·

    Podíl růstu neuritů (%) Podíl rustu neuritu (%) (vztažený na NGF kontrolu) (vztažený na NGF kontrolu) /ZWZ/7/V/W faM) ·· · · · ·

    Obr. 17

    Podíl buněk s neurity (%) • ·♦·· · ·· ·· ···· • · · · · « · · 9 ·

    9 999 9 9 9 9 9 9 • · · · · 99 9999

    9 9 9 9 9 9 9

    99 9 999 99 9 99 9 9 ·

    Obr. 19

    6UAN05/N ···· ·· ···· ······ · • ♦ · · · · • · · · ···· • · · · · ·· · ·· ♦· ·

    Podíl růstu neuritů (%) Podíl růstu neuritů (%) (vztaženo na NGF kontrolu) (vztaženo na NGF kontrolu)

    Obr. 20A

    Obr. 20B ·· ···· • · ·

    Obr**^*OC

    I ·

    I · ··· o\o o +-> °tí tí +-» o

    S fa tí o ^M o a

    Ό >N O aj >

    ZOO

    J7J

    JJO

    JZJ

    J00

    7J

    JO

    ZJ

    Kontrola

    ANf JO nM fíŇJ J00 nM

    Podíl růstu neuritů (%) (vztaženo na NGF kontrolu)

    Koncentrace

    206_m M) • ·· · • · · • · · ·· · « · · • · · ··· · • · ♦ · · ·· ··· · ·· · • · ··

    Otrr ·

    • · ·· *

    Podíl růstu neuritů (%) Podíl růstu neuritů (%) (vztaženo na NGF kontrolu) (vztaženo na NGF kontrolu)

    Podíl růstu neuritů (%) Podíl růstu neuritů (%) (vztaženo na NGF kontrolu) (vztaženo na NGF kontrolu)