JPH10504814A - 一酸化炭素依存性グアニリルシクラーゼ修飾因子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 哺乳類における、一般的な細胞および神経の活性の調節向けに、ならびに１またはそれ以上の天然由来の遺伝的にコード化された分子の生体内での遺伝子発現を選択的および制御的に誘導するための方法および関連する組成物および医薬をここに開示する。より特別には、本発明は特定の天然由来の分子、例えばタンパク質または神経栄養因子をコード化する遺伝子を選択的に活性化させまたは抑制解除し、そして一酸化炭素依存性グアニリルシクラーゼ修飾プリン誘導体の投与によりこれらの天然由来の化合物の内因性生成物を誘導する。本発明の方法は種々の細胞および神経学的機能および活性に影響を与えることならびに広範な種々の神経変性性、神経学的、細胞性および生理学的疾病を治療的または予防的に処置することが可能である。

Description

【発明の詳細な説明】 一酸化炭素依存性グアニリルシクラーゼ修飾因子 本発明は一般に細胞および神経の活性の制御および細胞および神経性障害の治 療に関する。より特別には、本発明は、生体内での神経栄養因子を含む天然由来 の遺伝的にコード化された分子の遺伝子発現を選択的におよび制御可能に誘導す る、一酸化炭素依存性グアニリルシクラーゼ修飾(modulating)プリン誘導体の投 与によって哺乳類の細胞および神経活性の改質のための方法および関連する組成 物および医薬に関する。この本発明の方法および関連する組成物および医薬は種 々の細胞および神経の活性に影響を与えることならびに広範な種々の生理学的、 神経変性性(neurodegenerative)または神経学的傷害を治療的または予防的に処 置することが可能である。 発明の背景 哺乳類の中枢神経系の進化は困難な問題への解決策を要するますます複雑な環 境に対する生来的反応であった。その結果生じた構造体は化学的に修飾された調 節経路の精巧な系によって正確に制御されそして減衰(attenuation)される複雑 な生化学的マトリックスである。非常に特別な化学反応の精巧な系列によって、 これらの経路は中枢神経系の構造および操作面ごとに統制し指令しそ してそれによって生体自身に指令する。ふつう、種々の調節系のこの複雑な相互 作用は協力して、脳により管理される非常に有能な多目的な中枢神経系を形成す る。不幸にも加齢、病気または他の理由のいずれかにより、中枢神経系の生化学 的マトリックスが損傷した場合、正常な調節経路は喪失に対して有効に補償する ことができない。このような場合このような障害に対する予防または補償するた めの神経機構の変成（modify）または捕捉は非常に望ましい。このことが本発明 の焦点である。 さらに特別には、哺乳類の脳は神経膠または星状細胞として知られる非常に多 くの支持体細胞によって囲まれている約１００億の神経細胞、即ち”ニューロン ”から構成されている。ニューロンは、体の他の細胞と同様、核、細胞質および 周りを囲む細胞膜からなる。しかし、他の細胞とは異って、ニューロンは個々の 神経細胞ごとに文字通り数千の他の神経細胞とネットワーク化して神経基盤（ne ural infrastrucuture）、即ちネットワークを構築できる独特な、繊維様の伸長 部分をも持つ。この複雑なネットワーク内の伝達は生体により請け負われる全て の精神過程の基礎を提供する。 各々の神経細胞において入ってくる信号は、１神経細胞に付き、数千個を含む ことのできる、”樹状突起”として知られているニューロンの伸長部分で受ける 。同様にニューロンの情報は神経細胞に沿って、１０，０００もの数の異なる神 経末端中に枝分かれできる”軸索”に 伝えられる。これらの神経細胞軸索および樹状突起は一緒にして一般に”神経突 起(neurites)”と呼ばれ、これを介して個々のニューロンの各々は他のニューロ ンとの多くの連結（connection）を形成できる。結果として、巨大な精神知能を 発生させる、健康な脳の可能なニューロンの連結の数は一兆である。反対に、神 経細胞の死、あるいは加齢、病気、酸化的ストレスまたは直接的な物理的損傷に よる変性のため、ニューロンのネットワーク中の連結が壊れた場合、生体の知能 はひどく傷つく。 他のニューロンの樹状突起または細胞体との個々の軸索の連結は”シナプス” として知られる接合部または部位で行われる。個々のニューロンが互いに化学的 メッセンジャーの流れを介して向かい側のシナプスの接合部に伝達することはシ ナプスで行われる。これらの化学的メッセンジャーの多く、即ち”神経伝達物質 ”は少量のペプチド、カテコールアミン、またはアミノ酸である。適当な刺激を ニューロン軸索連結にて受けると、神経伝達物質はシナプスを渡って隣接したニ ューロンに拡散し、それによって次のニューロンにニューロンのネットワークに 沿って刺激を伝達する。神経細胞間に移動する情報の複雑さに基づいて、哺乳類 の脳では５０ないし１００個の別の神経伝達物質が信号を伝達することに使用さ れると、最近では信じられている。 極めて最近、酸化窒素（ＮＯ）および一酸化炭素（ＣＯ）が、神経伝達物質と して機能できることが発見され た。これらの気体分子は細胞成長および相互作用に影響する多くの神経調節経路 に関係するようである。脳において、並びに体の他の部分においては、ＣＯは酵 素”ヘムオキシゲナーゼ II”（ＨＯ）によって生成される。ＨＯ酵素、または 他の源のいずれかから製造されるにしろ、ＣＯがニューロン中に拡散すると、” グアニレート シクラーゼ”または”グアニリル”シクラーゼとして知られる酵 素を修飾することにより”サイクリックグアノシンモノホスフェート”（ｃＧＭ Ｐ）として知られる第二の伝達物質分子の発生が誘導されると信じられている。 従って、ＣＯはグアニリルシクラーゼ調節経路において信号分子（signaling mo lecule）として作用する。結果として生じるｃＧＭＰレベルにおける増加は細胞 成長、保護および細胞間連結を含む種々の細胞機能を誘導、促進または変成でき る数種の神経栄養因子並びに他のニューロン因子(neuronal factor)を変成する ようである。神経栄養因子ニューロンの発達および分化の両方を刺激する種々の 作用を及ぼす分子であり、生体のライフサイクルを通してニューロンの生存およ び発達に必要である。一般的に神経栄養因子は２つの広範な種類：ニューロトロ フィンおよびプレイオトロフィン(pleiotrophin)に分別される。プレイオトロフ ィンはそれらが細胞から分泌された分子の分子信号配列特性を欠き、そしてそれ らがニューロンを含む細胞の多くの型にも影響を与える点でニューロトロフィン と異なる。２つの神経細胞栄 養因子の作用は、特に重要である：（ｉ）ニューロンの死の予防および（ii）神 経突起（neurites）（発生期の軸索または樹状突起）の発芽後成長への刺激であ る。加えて、ＣＯ−誘導性神経栄養因子は神経細胞の膜電位を減少させて、ニュ ーロンが信号を受容および到達し易くする。 多くの今日の研究者は、記憶が、脳ニューロンの特定のグループ間のシナプス 連結が反復活性後に強められまたは促進されることとなる、シナプス活性の変成 (modification)に関係すると信じている。結果として、これらの変成された連結 は非常により容易に活性化される。この促進のタイプは、脳のすべてにわたって 生じるが、記憶のために重要な脳領域である、海馬において特に顕著である。海 馬内のニューロン経路の刺激は最初の刺激に続く多くの日々の間のこれらの経路 によってシナプス伝達の増大を生じさせることができる。この過程は長期増強現 象(long term potentiation(LTP))として知られている。 さらに特別には、長期増強現象は多くのニューロン経路によって示される活性 −依存性シナプス電気活性を形成する。この状態では、神経細胞が刺激に対して より反応性をもつ細胞の記憶の型として、一般に認められている。従って、LTP が、ヒトを含む脊椎動物の学習および記憶に基づくタイプのシナプスの適応性の 基礎となる細胞および分子を理解するための優れたモデルを提供する と広く信じられている。 ＮＯおよびＣＯはこれらの化合物の阻害剤が増強現象の導入を遅らせるため、 目下、LTPを促進するメッセンジャー物質のための主な候補とされる。神経活性 を変成しおよびこれらもしくは他の信号トランスデューサを使用するLTPの容易 性を増強する能力は、学習速度および認識力を潜在的に増強でき、あるいは減衰 した精神的明瞭性を補償する。本発明以前では、ニューロンのLTPを促進するた めに、細胞および神経調節経路を信頼的に変成する生体内での細胞レベルにおい て操作できる方法または薬剤は知られていない。 長期増強現象により供される精神知能に比べて、精神機能は構成要素である神 経細胞の死または機能障害によってニューロンネットワークが崩壊する場合に変 化する程度を妨げ得る。精神能力の減退がニューロンネットワークの崩壊に直接 関係すると同時にこの崩壊は個々の細胞レベルで起こることを思いだすことも重 要である。このレベルではニューロンの崩壊に関係する有害な作用は神経変性性 の病気および障害、心臓発作、発作、老化および外傷および有害な化学的または 環境的因子への暴露を含む多くの因子のいずれかによって引き起こされる。 ニューロンの機能に不利に影響する公知の神経性疾病(neurological diseases )の中には、アルツハイマー病および関連する障害、パーキンソン病、運動神経 ニューロパシー病（moter neuropatghic deiseases）例えば筋 萎縮性側索硬化症、脳性麻痺、多発性硬化症、ならびにハンティングトン病があ る。同様な問題は、正常な老化のため、または発作、心臓発作または他の循環性 合併症からのニューロンへの損傷によるニューロンの連結性の損失により引き起 こされ得る。直接の物理的外傷または化学物質、重金属等を含む環境的因子はま たニューロンのまたは細胞の窮迫性、機能障害または死を生じさせる。 酸化的フリーラジカルによる蓄積された細胞損傷は筋萎縮性側索硬化症、パー キンソン病、アルツハイマー病、癌および老化を含む多様な細胞および神経変性 性の病気における重大な要因の一つであると信じられている。多くの細胞は細胞 障害フリーラジカルに対して守る多様な保護機構を持つ。例えば、グルタチオン の高レベルはフルーラジカル酸化に対して保護できる。ニューロンはこの抗酸化 剤源を欠いている。 神経障害または機能障害のいずれの原因であっても、一般に損傷した神経細胞 の、自然状態下で実質的な再成長または再発生を受けることができないというこ とにより、神経成長および機能を刺激することによってニューロン機能を回復さ せるために神経細胞に神経栄養因子と投与する提案を与える。同様に、神経栄養 因子を投与することによる、神経突起発生(neuritogenesis)または、神経突起の 成長を刺激することは、側副枝連結およびそれによる神経機能の回復を形成する 、生存しているニュ ーロンの能力に寄与できる。 現在、従来の技術および化合物は神経障害にかかる患者へ神経栄養因子を直接 投与するには効果的または実際的ではない。部分的には、これは神経栄養因子自 体の複雑な分子相互作用のため、および神経細胞成長および神経突起発生の相乗 的調節のためである。神経栄養因子は伝達物質および受容体の複雑な系列によっ て分子レベルにおいて絶妙に調節される長い化学的カスケードの結果である。従 って、ニューロンの細胞は各々が異なる時間における異なるニューロンの発達の 面に寄与している異なる神経栄養因子の協力によって影響を受ける。神経栄養因 子は、このカスケードの一番の終わりに有効に存在し、従って調節経路の最も複 雑な構成要素の一つである。（細胞の立場から）無作為な時間における単一の神 経栄養因子の減少されない投与が実質的に細胞の活性または再生を改善できるこ とと従来技術の開業医が当然思うことはそれ自体、単純である。これに対し、カ スケードにおけるより早い時期の調節経路の変成は正確な相対量で生成されそし て適当な複雑な細胞環境に導入される適切な成長因子を与える。 他の実際的な検討はまた、従来技術の、ニューロンネットワークの再生を刺激 するための神経栄養因子の使用の排除である。神経栄養因子（ニューロトロフィ ンおよびプレイオトロフィンを含む）は大きいタンパク質でありそしてそれ自体 医薬投与の正常の経路を修正しない。 例えば、これらのタンパク質が標的の神経部位に到達する前に患者の消化系が、 それらを消化するため、これらのタンパク質は患者または被検体に経口的に与え ることはできない。さらに、それらの比較的大きい大きさにより、そのタンパク 質は血液脳関門を渡って体中の最も重要な神経部位に入ることができない。他方 、自然のままで脳または脳脊髄液に神経栄養因子の直接の注射することはこの困 難性を乗り越えるが、しかしそれ自体扱いにくいことがさらにわかる技術的問題 を伴う。例えば、脳への公知のニューロトロフィンの直接注入は治療濃度を提供 するまで数年間をこえる投与が要求されるため実行不可能であることが証明され ている。さらに脳内への直接注射は非常に短い期間後に神経細胞の膨張および炎 症の危険に関係する。従って、同様に理論的には望ましいが、患者への神経栄養 因子の直接投与は、多分現時点においては、実行不可能である。 従って、本発明の一般的な目的は、種々な有利な結果を達成するための哺乳類 の細胞、ニューロン、細胞活性または神経活性を有効に変成するための方法およ び関連する組成物および医薬を提供することである。これらの結果はフリーラジ カルによる酸化的ストレスおよび損傷に対する保護およびさらに哺乳類の血圧の 減少のような一般的生理学的反応も含む。 従って、本発明の他の目的は、哺乳類の神経性疾病および細胞の障害を治療す るための方法および関連する組 成物および医薬を提供することである。 本発明のまた他の目的は、哺乳類ニューロンの膜電位における長期変化を誘導 するための方法および関連する組成物および医薬を提供することである。 本発明のさらに他の目的は、生体内において、細胞内の遺伝的にコード化され た分子および神経栄養因子の生理学的生成および投与(administration)を誘導す るための方法および関連する組成物および医薬を提供することである。 本発明の別の目的は、生理学的環境での神経栄養因子の神経発生作用(neuroto genic effect)を高めるための方法および関連する組成物および医薬を提供する ことである。 発明の要約 これらおよび他の目的は本発明の方法および関連する組成物および医薬によっ て達成され、それは、広い面において、神経栄養因子を含む天然由来の遺伝的に コード化された分子の生体内での遺伝的発現および得られた生成物の、選択的な 誘導ならびに、一酸化炭素依存性グアニリルシクラーゼ調節プリン誘導体の少な くとも１種による哺乳類の細胞およびニューロンの処置による細胞およびニュー ロンの活性の変成を提供する。 当業者によって認識されるであろうが、本発明の方法および関連する組成物お よび医薬によってもたらされる、生体内における遺伝的発現の活性または抑制解 除およ び細胞および神経活性の代表的な変成(modification)は、多様な形態またはその 組合せを発現できる。例えば、本発明の技術による哺乳類の細胞およびニューロ ンの処理は、種々の天然由来の遺伝学的にコード化された、タンパク質および神 経栄養因子のような化合物の細胞での生成を高めることによって、生体内で発現 された分子の、細胞の直接的自己投与(cell's direct self-administration)を 生じさせ；あるいはそれらに続いておこるこれらの化合物ならびに天然由来の細 胞またはニューロンの代謝、機能、発達、および生存(survival)における、作用 の活性の刺激を生じさせる。 これらの続いておこる作用はフリーラジカル酸化および細胞破壊からの保護、 他の要因に対する細胞受容体の安定化、一酸化炭素および抗酸化性化合物の内因 性の生成および一酸化炭素活性化細胞代謝による血圧の低下を含む。本発明の方 法および医薬は細胞またはニューロンの成長、発達および生存を、従来技術の要 素となる方法論の有害な作用なく、直接的に刺激できる。 さらに、本発明は細胞の膜電位を低くしまたは変化させて、その適応性を増加 させおよび長期増強現象を誘導するのに使用できる。 本発明の実施するために有用な代表的な一酸化炭素依存性グアニリルシクラー ゼ修飾プリン誘導体は、グアノシン、イノシンプラノベクスおよび４−［［３− （１，６−ジヒドロ−６−オキソ−９Ｈ−プリン−９−イル） −１−オキソ−プロピル］アミノ］安息香酸(AIT-082)である。従来技術の化合 物とは異なって、これらの化合物は経口的にまたは注射によりあるいは他の慣用 の経路の何れかによって患者に直接投与できる。これらの代表的な化合物は非毒 性であり、さらに血液脳関門を通過する。 さらに、より特別な面では本発明の方法および組成物は、病気、酸化的ストレ ス、加齢、外傷または有害な化学因子への暴露によってもたらされるものを含む 、神経性疾病ならびに他の細胞障害の治療または予防的保護のために使用できる 。個々のニューロンおよび細胞の生存、成長および発達を促進するために、本発 明はニューロンネットワークの再生および発達を促進しおよび細胞および神経機 能障害の徴候を軽減する。 当業者はもちろん、製薬的組成物および医薬が、製薬的に許容される賦形剤お よび担体とともに本発明の一酸化炭素依存性グアニリルシクラーゼ修飾プリン誘 導体の有効な濃度を含んで製剤化できることを認めるであろう。これらの製薬的 組成物は経口的、経皮的、局所的または注射により投与できる。さらに本発明の 方法に使用される有効物質は血液脳関門を通過することができるため、それらは 脳または中枢神経系に直接注射または注入しなくてもよい。 いまだ他の面は、本発明の方法および組成物は哺乳類のニューロンの膜電位の 長期変化を誘導するのに使用で きる。これらの長期電位変化は相当する細胞記憶の増大化とともに膜の柔軟性を もたらす。次に、この増大した細胞記憶は被検体の精神知能を高めてより早い学 習および物質の増大した保持がもたらすことができる。 本発明の他の目的、特徴および利点は、最初に簡単に説明する関係する図面に 記載されたデータと関連してなされる下記の本発明の好ましい代表的具体例の詳 細な記載の検討により当業者により明らかとなるであろう。 図面の簡単な説明 第１図は本発明に従うプリン誘導体AIT-82の投与後のネズミ（murine）の血漿 中濃度のグラフによる表示である。 第２図はプリン誘導体AIT-082によるマウスの記憶増強における、コリン作用 系拮抗剤である、アトロピンのグラフによる表示である。 第３図はプリン誘導体AIT-082の種々の濃度によって成体外で成長したニュー ロン細胞における神経成長因子が介在する神経発生反応(neurotogenic response )のグラフによる表示である。 第４Ａ、４Ｂおよび４Ｃ図は神経成長因子が介在する神経発生反応における、 選択的阻害剤およびプリン誘導体AIT-082の影響のグラフによる比較である；第 ４Ａ図は一酸化炭素捕捉剤であるメトヘモグロビンの存在下で成長した細胞の神 経発生反応を示し、第４Ｂ図はグアニリルシクラーゼ阻害剤であるメチレンブル ーの存在下で 成長した細胞の同様の反応を示し、第４Ａ図は一酸化炭素捕捉剤である亜鉛プロ トポルフィリンの存在下での成長した細胞の上記反応を示す。 第５Ａ図および第５Ｂ図はプリン誘導体AIT-082および種々の濃度の一酸化窒 素阻害剤の存在下で成長した細胞に対する神経成長因子が介在する神経発生反応 のグラフによる比較である。 第６図はプリン誘導体AIT-082を含むおよび含まない培養で成長したニューロ ン細胞における環状GMP生成のグラフによる比較である。 第７図はウィン−シフト記憶検査を使用して、スイスウエブスターマウスにお いて測定された学習におけるプリン誘導体AIT-082の異なる投薬量の影響のグラ フによる表示である。 第８図は60mg／kgおよび３０mg／kgの単一の投薬に関し、時間について測定さ れたプリン誘導体AIT-082の作用の持続期間のグラフによる比較である。 第９図はプリン誘導体AIT-082および薬物フィゾスチグミンにより処理された 、老化により誘発される記憶欠損のスイスウエブスターマウスの学習能力のグラ フによる比較である。 第１０図はプリン誘導体AIT-082および薬物フィゾスチグミンにより処理され た、老化により誘発される記憶欠損のC57BL/6マウスの学習能力のグラフによる 比較である。 第１１図はプリン誘導体AIT-082のより処理されたおよび処理されないマウス の、老化により誘発される記憶欠損予防のグラフによる比較である。 第１２Ａおよび１２Ｂ図はエリザ検定法を使用して測定された、プリン誘導体 の添加に対する反応におけるネズミ皮質星状細胞による神経成長因子の生成につ いてのグラフによる比較である；第１２Ａ図はグアノシン三リン酸の異なる濃度 の存在下で成長したニューロンに対して測定された神経成長因子の濃度を示し、 そして第１２Ｂ図ではグアノシンの種々の濃度の存在下で成長した細胞に対する 神経成長因子の濃度を示す。 第１３Ａおよび第１３Ｂ図は異なる時間、グアノシンの存在下および不在下に おいて成長したネズミ皮質星状細胞による種々の神経栄養因子mRNAの生成につい てのグラフによる比較である；第１３Ａ図は神経成長因子（NGF）のmRNAレベル を示し、そして第１３Ｂ図は繊維芽細胞成長因子(FGF)のmRNAを示す。 第１４Ａ、１４Ｂおよび第１４Ｃ図は神経成長因子の存在下または不在下での プリン誘導体の異なる濃度に対する神経発生反応のグラフによる比較である；第 １４Ａ図は神経成長因子の存在下の異なる濃度での種々のプリン誘導体に対する 神経発生反応を示し、第１４Ｂ図は神経成長因子の不在下での神経発生反応を示 し、第１４Ｃ図は神経成長因子の存在下および不在下における、個々のプリン誘 導体およびプリン誘導体の組合せに対する神 経発生反応を示す。 第１５Ａ、１５Ｂおよび第１５Ｃ図は異なるプリン誘導体の種々の濃度の存在 下で成長しニューロンにおける神経成長因子が介在する神経発生反応についての グラフによる比較である；第１５Ａ図はイノシンの種々の濃度に対する神経発生 反応を示し、第１５Ｂ図はヒポキサンチンの種々の濃度に対する同様の神経発生 反応を示し、第１５Ｃ図はキサンチンの種々の濃度の下に置かれたニューロン細 胞の神経発生反応を示す。 第１６図はプリン誘導体AIT-082の種々の濃度において成長したニューロン細 胞に対して測定された神経成長因子が介在した神経突起発生についてのグラフに よる表示である。 第１７図は神経成長因子を伴うまたは伴わないグアノシン三リン酸およびアデ ノシン三リン酸の種々の濃度において成長したニューロン細胞の神経発生反応に ついてのグラフによる比較である。 第１８図はグアノシンおよびアデノシンの一リン酸、二リン酸および三リン酸 プリン誘導体に対する神経成長因子が介在する神経発生反応についてのグラフに よる比較である。 第１９図はプリン誘導体グアノシンの異なる濃度の存在下で成長したニューロ ン細胞中に生成された環状ＧＭＰについてのグラフによる比較である。 第２０Ａ、２０Ｂおよび２０Ｃ図は３つの異なる阻害 剤の種々の濃度の存在下におけるプリン誘導体グアノシンとともにまたはなしに 成長した細胞の神経成長因子に介在された神経発生反応についてのグラフによる 比較である；第２０Ａ図はグアニリルシクラーゼの阻害剤であるメチレンブルー の存在下で成長した細胞の神経発生反応を示し、第２０Ｂ図はグアニリルシクラ ーゼの阻害剤であるLY83583の存在下で成長した細胞の神経発生反応を示し、第 ２０Ｃ図はグアニリルシクラーゼと相互作用のあるホルモンである心房性ナトリ ウム利尿因子の種々の濃度の存在下で成長した細胞の神経発生反応を示す。 第２１図は無機一酸化窒素受容体である、亜硝酸ナトリウムの存在下で成長し たニューロンに対する神経成長因子が介在する神経発生反応についてのグラフに よる表示である。 第２２Ａおよび２２Ｂ図は一酸化窒素供与体ならびに一酸化窒素および一酸化 炭素の捕捉剤の存在下で成長したニューロンの神経成長因子が介在する神経発生 反応についてのグラフによる比較である；第２２Ａ図は：一酸化窒素供与体およ びヘモグロビンの種々の組合せの存在下で成長した細胞の神経発生反応を示しそ して第２２Ｂ図は一酸化窒素供与体およびメトヘモグロビンの種々の組合せの存 在下で成長した細胞の神経発生反応を示す。 第２３図はプリン誘導体グアノシンと共にまたはなし でヘモグロビンの種々の濃度で成長した細胞の神経成長因子に媒介された神経発 生反応についてのグラフによる比較である。 第２４図はプリン誘導体グアノシンと共にまたはなしでＬ−ニトロアルギニン メチルエステル（L-NAMB）の種々の濃度で成長した細胞の神経成長因子に媒介さ れた神経発生反応についてのグラフによる比較である。 第２５図はグアノシンと共にまたはなしで、CO合成の阻害剤である亜鉛プロト ポルフィリンIX（ZnPP）の種々の濃度で成長した細胞の神経成長因子に媒介され た神経発生反応についてのグラフによる比較である。 第２６図は第２５図に示されたグラフによる比較に対する負の調節であり、プ リン誘導体グアノシンと共にまたはなしで、銅プロトプルフィリンIX（CuPP）の 種々の濃度で成長した細胞に対する神経成長因子に媒介された神経発生反応につ いてのグラフによる比較である。 第２７図はプリン誘導体イノシンプロノベクスの種々の濃度で成長したニュー ロン細胞の神経成長因子に媒介された神経発生反応についてのグラフによる表示 である。 詳細な説明 広い面において、本発明は、哺乳類細胞およびニューロンの独特な処置をして 細胞または神経活性を変成するのに使用するための方法および関連する組成物お よび医薬を示す。さらに具体的には、細胞内またはニューロン内の一酸化炭素依 存性グアニリルシクラーゼ調節系を修飾して、天然由来の神経栄養因子およびの 生体内における遺伝的発現の誘導ならびにその結果として生じるこのような天然 由来の遺伝的にコード化された分子の哺乳類への直接投与、抗酸化性化合物およ び一酸化炭素の内因的な生成、ならびにその結果として哺乳類の血圧を低下させ る能力を含め、多様な有利な結果を生ずるために有効なプリン誘導体の使用を示 す。変性性の細胞崩壊を防ぎ、そしてフリーラジカルによる酸化的ストレスによ る細胞損失に基づく病態（disease conditions）を治療することもまた、本発明 の方法および組成物によって達成できる。 本発明の技術により示すところの代表的具体的記載は、特に、プリン誘導体が 、哺乳類における、コード化された分子の遺伝的発現を誘導すること、神経突起 発生を刺激すること、ニューロン成長を高めること、ニューロンの膜電位を変化 させて哺乳類の増強された学習能力を生じさせることに使用される。具体例とし ての検討および処理は、本発明の方法に有効な組成物を代表する選択された具体 的なプリン誘導体の種々の投薬量および投与 の経路を使用して、以下に討論されるように行われた。当業者はもちろん本発明 は以下に詳説する特定の組成物、投与の投薬量または経路に、特に限定されない ことを認めるであろう。 関係する個々の被検体の特別は必要性に依存して、使用される組成物は、本発 明の技術に基づいて有効に処置されうる濃度で提供するように、種々の投薬量お よび摂生における医薬として投与できる。選択された組成物の有効量を構成する ものは選択されたプリン誘導体の活性、被検体の生理学的特性、被検体のニュー ロンの崩壊または障害の程度および性質および投与方法を含む、このような要因 に基づいて変化される。神経活性範囲を変成するのに有効であることが証明され た具体的な処理濃度は、１μM未満ないし500mMもしくはそれより多い濃度の範囲 にある。一般に、初期の投薬量は特定の哺乳類被検体の処理に最適な投薬量を決 定するために加減される。組成物は経口的、局所的、経皮的、腹腔内注射または 直接血流中への静脈注射を含む多くの異なる経路を使用して投与される。もちろ ん、プリン誘導体の有効量はまた、所望ならば、脳脊髄液中への注射または脳内 への直接注入により投与してもよい。 本発明の方法は、医薬として哺乳類被検体に、単独でまたは製剤のように組合 せで投与されるプリン誘導体を使用して行うことができる。さらに、プリン誘導 体は製薬的に許容される賦形剤ならびに、不活性固体希釈剤、 水溶液または非毒性有機溶媒のような担体材料と配合できる。所望ならば、これ らの製剤はまた、保存剤および安定剤等を含んでいてもよい。 本発明による方法および組成物は天然由来の遺伝的にコード化された分子、例 えばヘムオキシゲナーゼおよび神経栄養因子（ニューロトロフィン、プレイオト ロフィン、サイトカインを含む）の生体内での生成、生体内で生成された分子を 直接投与してこれらの分子および神経栄養因子の作用を増大させること、ならび に細胞成長、機能、保護および発達を刺激することを含む、種々のタイプの細胞 または神経活性の長期変成を調節することを提供する。さらに本発明は神経突起 発生を促進し、副側枝神経回路を形成させ、環状プリンヌクレオチドの生成を増 大させ、シナプス形成を増強し、ニューロンの膜電位を変化させるために使用で きる。これらの作用は神経変性の治療および学習能力の増大に極めて有利であり 得る。同様に、天然由来の内因性抗酸化性化合物の生体内での生成は、癌、老化 、および種々の神経障害を含む酸化的損失に関する病態を処理および予防するの に極めて有益であり得る。 明らかな実施上のおよび道徳上の理由のため、このような苦痛に関する実験的 組成物および方法の効能を測定するための、ヒトにおける初期の研究は不可能で ある。従って、いずれかの薬剤または治療法の早期における開発では、安全性お よび費用の理由のため適当な動物モデ ルを使用することは標準的手段である。研究用の動物モデルを使用することの成 功は、哺乳類の細胞または神経生理が類似していると理解されていることに基づ く。従って、一つの種、例えばげっ歯動物の一員における細胞または神経栄養的 反応は、異なる種、例えばヒト、の一員における同様の反応にしばしば一致する 。適当な動物モデルが充分に開発された後にのみ、ヒトの治療薬の安全性および 効能をさらに証明するためにヒトにおける臨床試験が行われることになる。 神経変性性の病気(neurodegenerative disease))および障害およびそれら臨床 学的作用に関して、マウスモデルは多くの点でこれらの条件におけるヒトの病理 学にきわめて類似している。従って、マウスまたは”ネズミ科の”モデルからヒ トおよび他の哺乳類を推測することが妥当であることは当業者によって充分理解 されることである。ヒトにおけると同様にマウスは外傷的傷害、酸化的損傷、加 齢、病気または有害な化学因子のいずれかのためにニューロンの崩壊の結果によ る学習障害を受けやすい。同様に意義深いことには、神経栄養因子は、ヒトにお いて作用すると同様にそれらはネズミ科のモデルにおいて、顕著に類似のニュー ロンの反応により、実質的に同様に作用すると思われる。従って、説明の目的の ためにのみ、そして限定を目的とするのではなく、本発明は第一に哺乳類被検体 としてここではマウスの具体例を示す。当業者は本発明がヒトを含む他の哺乳類 検体で同 様に実施できることを認めるであろう。 ここにおいてデータにより示されると同様に、本発明の技術に従って数種のプ リン誘導体が効果的に適用されることが見いだされている。特にデータはグアノ シンが神経栄養因子の生成を刺激しそして神経突起発生を増強することにおいて 充分適用されたことを表すことを示す。同様に、他の代表的プリン誘導体は、４ −［［３−（１，６−ジヒドロ−６−オキソ−９Ｈ−プリン−９−イル）−１− オキソ−プロピル］アミノ］安息香酸（AIT-082）が生体内での、天然由来の遺 伝子の活性化または抑制解除および結果としての天然由来の遺伝的にコードされ た分子、例えば神経栄養因子の生成を刺激することを示している。それはまた、 順次一酸化炭素および胆汁色素抗酸化性化合物の内因的な生成を誘導する、ヘム オキシダーゼの内因的な生成を誘導する。AIT-082はまた、神経突起発生を増大 させ、神経栄養因子の作用を高め、そしてニューロンの膜電位を変更させそれに よって細胞の長期増強現象を促進する。 AIT-082は本特許出願の共同発明者の1992年２月25日に発行された米国特許第5 ,091,432号に開示されており、参考文献によって本明細書に組入れられる。また 他の本発明における使用に適当であると示される具体的組成物はイノシンプラノ ベクスまたはイソプリノシンである。イノシンおよびDIP-PacBa ３：１モル比に おける混合物であるイノシンプラノベクスは生体外(in vitro)での 神経突起発生および神経栄養因子の作用を増大させることが見いだされた。上記 に示された本発明の別の実例は、一酸化炭素依存性グアニリルシクラーゼ系を調 節することによって細胞および神経活性を変成する種々のプリン誘導体を使用す ることの適用可能性を示す。 本発明の具体的な好ましい実例は、AIT-082または４−［［３−（１，６−ジ ヒドロ−６−オキソ−９−プリン−９−イル）−１−オキソ−プロピル］アミノ ］安息香酸による細胞またはニューロンの処理を包含する。既に討議したように 、AIT-082はパラアミノ安息香酸部分を含むプリンヒポキサンチンのユニークな 誘導体である。経口投与の後それは速やかに吸収され、そして血液脳関門を通過 した後、不変のまま脳に入る。それは経口投与３０分後、3.3ng／mg脳組織、と 同程度の高さのレベルで検出される。 AIT-082はヘムオキシナーゼおよび神経栄養因子を含む天然由来の遺伝的にコ ード化された分子の生体内での遺伝的発現を誘導する。結果として、本発明は処 理した細胞にこれらの化合物の直接的自己投与を誘導しおよび関連する代謝経路 結果として得られる生理学的作用を刺激することができる。それはまた、培養に 単独で加えた場合に神経細胞からの神経突起の発芽後成長ならびに、例えば神経 成長因子(nerve growth factor;NGF)のような神経栄養因子の神経発生作用を増 大させるように刺激する。さらに重要なことは、AIT-082は腹腔内および経口 投与の何れかの後に、老齢の記憶欠損マウスにおける作業記憶を増大させる。AI T-082の神経発生活性は全てＣＯの捕捉剤であるヘモグロビンによって、メチレ ンブルーによって、およびZnPPによって阻害されるが、Cuppないし他の一酸化窒 素シンターゼ阻害剤によっては阻害されない。公知の神経伝達物質およびニュー ロモジュレーター受容体における生体内での活性に対する選別試験は陰性であっ た。ZnPPはここに例示するグアニリルシクラーゼ修飾プリン誘導体の作用部位を 確認するヘムオキシゲナーゼIの阻害剤であることもまた知られている。ヘムオ キシゲナーゼは公知の熱ショック（ストレス）タンパク質である。熱ショックタ ンパク質は立体配座、細胞内輸送、および細胞内タンパク質の分解を調節するこ とが実証されている。それらはまたストレスの間の細胞生存可能性にも関係する 。ある当業者は熱ショック（ストレス）タンパク質の減少されたレベルまたは機 能性がアルツハイマー病の患者の脳における増加した異常に折り畳まれたタンパ ク質および細胞死の沈積物を導く要因の１つであろうと信じている。従って、ヘ ムオキシゲナーゼの生体内での生成を誘導するAIT-082の能力は他の病態を治療 することに加えて、心臓発作および発作の治療に対する本発明の治療の適用可能 性を示す、多様な保護的な細胞経路における本発明の強い効果の証拠になる。本 発明のさらなる理解は本発明の技術に従うプリン誘導体の確認、特徴づけ、およ び使用のための具体的手順を 説明する以下の非限定的な実施例から、当業者に示されるであろう。 実施例１ マウス中のAIT-082の血漿レベル 成体C57BL/6マウスに生理食塩水（saline）中のAIT-082 ３０mg／kgをi.p.（ 腹腔内注射）により投与した。この動物をAIT-82投与後30,45,60および90分にお いて断頭に供した。血液をヘパリンを加えた試験管に集め、混合し、2000rpmで1 5分間遠心分離した。血漿上澄液を取り出しそして分析するまで−70℃で貯蔵し た。血漿および脳組織中のAIT-082の分析測定のための高圧液体クロマトグラフ ィー法が開発された。開発された検定法は多くの密接に関係するプリン分子存在 下でAIT-082に対し選択的であった。この方法の感度は血漿１ml当たりAIT-082 0.1μgおよび脳組織１mg（湿重量）当たりAIT-082 0.1μgであった。 C57BL/6マウスへの30mg／kgのi.p.による投与30,45および60分後におけるAIT- 082の血漿レベルを示すこれらの測定結果を表Ａに示し第１図に図示する。デー タから、AIT-082の血液レベルが約４５分後にそのピークに達しそしてｋ_e1＝3.4 5 hr^-1をもつ約１２分の血漿排泄半減期であると評価された。 実施例２ AIT-082は血液脳関門を通過する AIT-082の30mg／kgのi.p.による投与を受けておりおよび薬剤投与後３０分で 断頭に供された２体の動物からの脳組織を分析した。脳は速やかに取り出しそし て氷で冷却した。脳組織を脳の皮質と残りの部分に解体した。脳組織（約250-30 0mg湿重量）をBrinkman Polytron tissue grinderを使用して生理食塩水5.0mlで ホモジネートし、分析するまで−70℃で貯蔵する。脳ホモジネートをGelman Acr odisc filterを通して；最初に1.2ミクロンフィルターに通し、次に0.2ミクロン フルターに通して；超遠心分離して除タンパクする。試料30μｌを上記と同様の 分析のためのＨＰＬＣに注入した。未処理の動物からの脳ホモジネートに対する AIT-082の既知の量を添加することによって標準曲線を作成した。脳組織の分析 は、AIT-082が両方の動物からの皮質試料と残りの脳 部分の試料の両方に検出されることを示した。結果を下記表Ｂに直接示す。 この、30分後の脳組織におけるAIT-082の存在の実証は、AIT-082が分解するこ となく血液脳関門を通過することを示す点で重要である。 実施例３ AIT-082はコリン作用系と相互作用する アルツハイマー病の患者の海馬ではコリン性ニューロンのかなりの損失がある ことが見いだされていることからこの系の活性を変える化合物における記憶に関 する影響にかなりの関心がある。記憶のコリン作用仮説に対する支持は病変また は発作モデルを使用する研究からでてきたものである。海馬のCA1領域の病変は 作業記憶(working memory)を破壊するようである。発作モデルでは、椎骨および 頸動脈の咬合（occlusion）（３０分）が海馬 のCA1領域の特定の細胞損失と作業記憶の損失を引き起こす。加齢のラットのこ れらのモデルでは、コリンエステラーゼ阻害剤である、フィゾスチグミンが記憶 を改善することが示されている。コリン作用機能を増加させる他の薬剤である、 THAは加齢のサルの記憶を改善することが示されている。AIT-082がフィゾスチグ ミンおよびTHAと同じ一般的手法で記憶を改善するという観察は、AIT-082がコリ ン作用系においていくらかの影響を持つかどうかの疑問を生じさせる。AIT-082 が記憶を改善する機構を明瞭にするために、試験はマウスに、短期間作用するコ リン作用拮抗剤、アトロピンを共に投与することによってAIT-082の作用を遮断 させおよびそれらに簡単な学習検査をさせた。アトロピンはフィゾスチグミンお よびTHAの作用を遮断する能力をもつと報告されている。マウスに１日目から４ 日目において検査２時間前にAIT-082（30mg／kg）を注射した。アトロピン（0.5 mg／kg）（28）は３日目のみ検査1/2時間前またはAIT-082投与1.5時間後に注射 した。全ての注射は腹腔内注射であった。Ｔ−迷路における報酬が置かれた場所 に向かわせる指示走行(reference run)をさせた後、マウスが報酬の場所を思い 出すことができるかどうかを測定するためそれらを再検査する。正しい反応の百 分率を第２図に図示する。 第２図は３日目においてアトロピンが、記憶を増強するAIT-082の活性を遮断 したこと、ならびにアトロピン を投与されない４日目において再現されたAIT-082の増強効果により前記影響が 一時的であったことを示す。この観察は、コリン系作用機構がAIT-082の作用に 関係することを意味する。 実施例４ アセチルコリン受容体におけるAIT-082の影響 AIT-082のアセチルコリン受容体との相互作用は、Method of Fields[J.Biol． Chem．253(9):3251-3258,1978]を使用して、マウス組織においてQNB(3-キヌクリ ジニル ベンジレート)の結合を妨害することによって測定された。この分析で はAIT-082の影響は見られなかった。 この検討では、供する２時間前に30mg／kgにおいてAIT-082で処理し、断頭し そしてアセチルコリン受容体を含む膜を得るためそして組織を加工した。これら の組織を、生体外で検定する場合、記憶における効果に対する検査に利用される と同じ条件下でAIT-082が投与されるとき、QNBに対する親和性(Kd)においてAIT- 082の影響はなかった。アセチルコリン結合部位について皮質は減少を示しおよ び線条は増加を示して皮質および線条における受容体の数(B max)において変化 があった。これらのデータはAIT-082が動物に投与された結果として皮質への増 加した入力あるという仮説と一致する。一般的には増加された入力は受容体の下 方への調節を生ずる。 実施例５ 生体外での受容体リガント結合におけるAIT-082の影響。 AIT-082はリガンドが38個の単離された受容体に結合するのを阻害するその能 力に対し評価された。この選別された受容体およびそれらのリガンドは： アデノシン アミノ酸： 興奮性アミノ酸(Bxcitatory Amino Acids)（グリシン、カイネート、MK-801、 NMDA、PCP、キスカレートおよびシグマ） 抑制性アミノ酸(Inhibitory Amino Acids)（ベンゾジアゼピン、GABA-A、GABA -Bおよびグリシン） 生合成アミン（ドーパミン−１、ドーパミン−２、セロトニン−１、セロトニン −２） カルシウムチャンネルタンパク質（ネフェジピン、オメガコノトキシン、塩化物 、カリウム） ペプチドファクター（ANF、BGF、NGF） ペプチド：(アンジオテンシン、アルギニン−バソプレッシン−V1およびV2、ボ ンベシン、CCK中枢および末梢、ニューロテンシン、NPY、ソマトスタチン、サブ スタンスK、サブスタンスP、VIP) 二次メッセンジャー系： アデニルシクラーゼ プロテインキナーゼ（ホルボールエステルおよびイノシトールトリホスフェー ト） 試験はNova Labs(メリーランド州，ボルチモア)との連絡の下で行った。AIT-0 82は行われた生体外分析のいずれにおいても活性を持たなかった。 従って、AIT-082はコリン作用神経系を介して作用する（アトロピンはその活 性を遮断する）が、AIT-082はアセチルコリン受容体との相互作用に直接関係し ない機構を介して作用するようである。生体外では、AIT-082はアデノシン受容 体と結合しないことを注目することは重要である。 AIT-082はその中枢神経系活性の範囲をより充分に評価するために確立された 一連の精神医学的試験において評価された。 この試験の中で利用されたものは （ａ）加速するローターロッド踏み車(Rota-Rod treadmill)による運動協調(m otor coordination)： （ｂ）ストーエルティング行動モニター（Stoelting activity monitor）によ る探査(exploratory)、およびホームケージ運動行動(Home cage locomotor acti vity) （ｃ）高架プラス迷路(elevated Plus maze)による抗不安的行動(axiolytic a ctivity)、 （ｄ）侵害受容性(nocioception) AIT-082を標準参照薬と比較する。 実施例６ AIT-082はマウスの運動協調を増大させる。 加速するローターロッド踏み車を使用してマウス（Ugo Basile Co.）について 運動協調を測定した。生理食塩水または薬剤による処理後のそれぞれ異なる時間 で５分間にわたり最大速度にに加速しる、ローターロッドにマウスを置いた。被 検体が離反した秒による時間を下記の表Ｃに直接記録した。おのおのの動物を３ 回試験しそして平均時間を記録する。 AIT-082投与を受けた被検体は対照（生理食塩水）または低い投薬量(0.005mg ／kg)と比較する場合、より長期間ロート−ロッド(roto-rod)に残っていること によって改善された運動協調を示す。 実施例７ AIT-082は探査行動を抑制しない 探査行動を測定するため、生理食塩水またはAIT-082投与を受けた被検体を新 しい大きいケージ（25×48×16cm，幅×長さ×高さ）に置き、運動を１分間隔で 30分間測定する。大きいケージ(San Diego Instruments，San Diego，Californi a)は垂直検出器を備えそしてリアリング動作(rearing movement)もまた記録した 。探査行動に関し影響は認められず被検体が不適格でないことを示した。 実施例８ AIT-082は運動行動を阻害しない ホームケージ運動における行動を測定するため、ホームケージを行動モニター (activity monitor;Stoelting Incstruments)のプラットホームに置く。ホーム ケージ運動における行動の動きを１分間隔で15分間測定する。被検体は生理食塩 水またはAIT-082投与を受けおよびそれらのホームケージに戻す。注射10分後、 ホームケージを行動モニターのプラットホームにおく。ホームケージ運動におけ る行動の動きを１分間隔で30分間記録する。最初の５分間、グルーミング活動を もモニターに見られそして記録された。結果を直接以下の表Ｄに示す。 表Ｄにおけるデータにより示されるように、高い投薬量（60mg／kg）において 、被検体はAIT-082による処理後、それらの環境によりよく慣れそしてより少な い動きを示した。他のものは、影響は認められなかった。 実施例９ AIT-082は実質的に不安を増大させない プラス迷路は２つの対面するる開口アーム（30×5cm，長さ×幅）および２つの 対面する閉口アーム（30×5×15，長さ×幅×高さ）からなる黒いプレキシガラ スから構築された。閉口アームの壁は透明なプレキシガラスであり、４つのアー ムは中央領域５×５cmによって連結された。プラス迷路全体を床から38cmの土台 に固定した。検査は被検体を開口アームの一方の一端に置くことによ りなる。被検体が出発点から離れるのにかかる時間（開口部の最初の１０cm）を 記録した。被検体が閉口アームの一つの中の中間に入るのに要する時間もまた記 録した。被検体が閉口アームの中間地点に到達した時、３分検査セッションを開 始した。３分試験セッションの間、開口アームに入った被検体回数を記録した。 エントリーは開口アームのプラットフォーム上に少なくとも２本の脚が置かれた ことと定義した。30mg／kgにおけるAIT-082の若干の不安発生（anxiogenic）作 用があるが、より高い投薬量(60mg／kg)またはより低い投薬量(0.005ないし0.5m g／kg)においては観察されなかった。 実施例１０ AIT-082投薬量は侵害受容性に影響しない マウスを55℃の電気ホットプレート（Omnitech）上におき被検体がその後脚を なめるまでの潜在時間を測定した。45秒までに反応が無い場合は試験を中止した 。この試験では、侵害受容性においてAIT-082の影響はなかった。 実施例１１ AIT-082は毒性でない AIT-082のラットおよびマウスにおける予備急性毒性試験では、経口または腹 腔内経路によって投与される場合、LD₅₀が3000mg／kgを超えることが証明されて いる。AIT-082はPanlabs's General Parmacology Screening Program(Panalabs ，11804 North Creek Parkway South， Bothwell,Washington 98011)に基づいて評価されそして結果は79の異なる試験方 法のそれらの標準プロフィールにおいて測定された場合に、いかなる毒性も存し ないかとを示した。 AIT-082の化学的構造の性質により、この化合物はいかなる毒性代謝生産物に 代謝しないであろうことが予想される。結論として、ある投与量における僅かな 不安発生作用の他は、種々の精神薬理学試験におけるAIT-082の有害な作用は少 しもなかった。投薬量の範囲にわたる(0.05-60mg／kg)運動協調（回転ロッド試 験）の増加および、運動検査におけるある投薬量(60mg／kg)においてことによる と学習または慣れ作用があった。 以下の具体的な化合物の精神薬理学的確認に続く、さらなる検討は本発明の神 経発生作用(neurogenic effect)を実証するために行われる。 実施例１２ AIT-082はPC12細胞における神経突起発生(neuritogensis)を促進する PC12細胞の使用に関し本発明の化合物の確認について多くの検討を行った。こ れらの細胞はラットクロム親和細胞腫から誘導され、NGFの存在下で成長した場 合、神経突起を伸長し、細胞分裂を終止しおよび交感神経ニューロンの多くの特 徴を呈する。神経成長因子(NGF)の不在下で培養された場合には、PC12細胞は１ つの細胞直径より大きい神経突起を殆どもたなかった。48時間のNGF の飽和濃度の添加は細胞の約20-35％において神経突起発芽後成長（neurite out -growth）を刺激した。これらが大グリア型細胞を混入することのなく、ニュー ロン様の細胞の均質な母集団を構成するため、これらの細胞の神経突起発芽後成 長におけるプリンベースの化合物の直接作用を研究することが可能である。 本発明の具体的化合物によるニューロンの変成(modification)を示すために、 PC12細胞における神経突起発生の刺激を測定してAIT-082の投薬量反応曲線(a do se responce curve)を作成した。1.5％ウマ血清および胎児ウシ血清1.5％を含む RPMI 1640中で培養された細胞をポリ−オルニチン被覆24−ウェル培養プレート( 1ウェルにつき2.5×10⁴細胞)上にリプレートする(replate)。プレーティングし たら直ちにAIT-082およびNGFを種々の培養に加えた。48時間後、培地を取り出し 、直ちに細胞を10％ホルマリンおよびPBS中で10分間固定した。細胞および神経 突起を固定の２日間内で計数した。 神経突起は長さにおいて細胞、少なくとも１細胞体の直径から伸長しおよびそ の先端における成長錐体(growth cone)を示す過程として定義された。おのおの 処理に関し、同じ処理を受けている６つの姉妹培養体のそれぞれから２つの代表 的顕微鏡視野を計数した。ウェルごとに計数された細胞の総数（約１００細胞） およびおのおののウェル内に神経突起を含む細胞の総数を使用して神経突起発芽 細胞(neurite-bearing cells)の分数(fract ion)を決定した。平均値（±SBM）をそれぞれの処理について決定した。比較を 容易にするために神経突起発芽後成長はNGFのみ(NGF＝100％)存在下での神経突 起を発芽する細胞の割合に比例させて示される。NGFが伴うおよび伴わない化合 物の効果を有意性に対するTukeyのテストが続く分散分析法(AVOVA)によって比較 した。 結果を、曲線が飽和濃度(40ng/ml)2.5 S NGFを加えた異なるのレベルのAIT-08 2を表す第３図に示す。中央の水平直線は40ng/mlのNGF単独の存在下で培養され た細胞についての対照値を表す。その上方およびより下方の水平直線は標準的な 統計学的方法を使用して決定したNGF単独の信頼限界の表示である。 第３図に示すように、AIT-082は低濃度において(1μM)PC12細胞中の神経突起 発生を刺激しおよびNGF−刺激性神経突起発生を増強する。データの分析はAIT-0 82がPC12細胞中の神経突起発生の促進においてNGFと同程度有効であり、そしてN GFの最適効果を30％増強したことを示す。比較の目的のため、および以下により 詳細に討論されるようにイノシンおよびヒポキサンチンはPC12細胞中の神経突起 発生を刺激することおよびNGF−刺激性神経突起発生の増強にやや有効であるが 、30-300nMにおけるより低濃度で有効である。グアノシンはAIT-082と同様に著 しい作用を与えるがより高い濃度30-300μMにおいてである。 実施例１３ AIT-082ニューリット発生における阻害剤の影響 加齢に関連する(age-related)記憶喪失はNGF依存性基底前脳ニューロンの喪失 に関係している。それはNGFのi.c.v注入によって改善され得る。単独およびNGF を伴う神経突起発生におけるAIT-082の影響は実施例１２の手順を使用して検討 した。AIT-082のそれらの作用を発揮させる機構を検討するため、阻害剤が特定 の生化学的過程を遮断または修飾するのに利用される一連の実験を行った。培養 の全ては最適な投薬量（40ng/ml）でNGFを含み、従ってAIT-082添加のないシリ ーズはNGF活性における阻害剤の作用を示した。AIT-082が10μMで添加されたこ とが示すのは、目下最適な投薬量と理解されるようである。３つの選択的阻害剤 が使用された。これらの検討の結果は下記の表Ｅに示しならびに第４Ａ図、４Ｂ 図および４Ｃ図は、示された条件下で４８時間培養後に神経突起を生成する細胞 の割合を図示する。ベースライン値はNGFまたはAIT-082なしで成長した細胞であ る。 メトヘモグロビン（MHb）は培養培地から一酸化窒素(NO)および一酸化炭素(CO )を捕捉して取り除く。MHbはNGF活性に影響しないがAIT-082の作用を阻害し、そ れはNOまたはCOのいずれかがAIT-082の作用に関係することを意味している。 メチレンブルー(MB)は前に討論したように神経インパ ルストランスミッションの二次メッセンジャー系に関係する細胞間物質である環 状GMP(cGMP)を生成する酵素である溶解性グアニリルシクラーゼを阻害する。MB はNGF活性に影響を持たないが、AIT-082を阻害したが、それはグアニリルシクラ ーゼがAIT-082の作用の機構に関連することを意味する。 亜鉛プロトポルフィリンIX(ZnPP)は順にCOを生成するヘムオキシゲナーゼII(H O)の阻害剤である。ZnPPはNGF活性に影響しないがAIT-082の作用を阻害する。こ のことはAIT-082の作用の可能な部位(potential site)がHOの生成に関係するこ とを明らかにする。結果としてCOの生成がAIT-082の作用の機構の部分であるこ とも明らかにする。これらの結果は本発明の多くの重要な見地および特徴を示唆 するものである。 前に討論したように、HOは熱ショック（ストレス）タンパク質である。これら のタンパク質はストレスの間の細胞生存力を維持するために必要な保護的機構の 一部であると信じられている。（例えば、Georgopoulos,C．and W.J．Welch，Ro le of the major heat shock proteins as molecular chaperones．Annu．Rev． Cell Biol.，1993．9:p601-634参照）。立体配座、細胞間輸送および細胞間タン パク質の分解を調節することに加えて、HOは、HOの酵素活性によるヘムの分解に より生成される強い抗酸化性化合物の生成に非常に関係している。哺乳類組織で は保護的抗酸化剤の胆汁色素であるビリベルジンお よびビリルビンのただ一つの源はHOにより分解されたヘムである。これらの胆汁 色素が細胞抗酸化剤防御機構において重要な生理学的役割をする実質的証拠があ る(Stocker,P.,et al.,Bilirubin is an antioxidant of possible phisiologic al importance．Science，1987．235:p.1043-1047)。さらに、HOは脳に見出され 、そしてそのレベルは熱ショック後非常に増大するこが知られている（Bwing，J .F.，S.N．Haber，and M.D．Maines,Normal and heat-induced patterns of exp resson of heme osygenase-1(HSP32)in rat brain: hyperthermia causes rapid induction of mRNA and protein．J.Neurochem.,1992．58:p．1140-1149）。 この理解と一致して、多くのニューロトロフィンはフリーラジカルによる酸化 的ストレスおよび損傷に対する内因性の防御を刺激することによるそれらの神経 保護作用(neuro-protective effect)を発揮する(Williams，L.R.,Oxidative str ess，age-related neurodegeneration，and the potential for neurotrophic t herapy，in Cerebrovasc．Brain Metab．Ref．1995，Raven Press，Ltd.:New Yo rk，NY．p 55-73．Mattson，M.P.,B．Cheng，and V.L．Smith-Swintosky，Mecha nisms of neurotrophic factor protection against calcium and free radical -mediated excitotoxic injury: implication for treating neurodegenerative disorders．Exp．Neurol.，1993．124: p.89-95)。細胞毒性フリーラジカルは 多 様な神経変性病の病因であると思われることから、本発明がこれら毒性酸化化合 物の中和化または封鎖化(sequestration)を介する酸化的フリーラジカルによる 変性性の細胞破壊を防止するよう機能する保護的抗酸化性化合物を生成する、HO の生成または活性を刺激できると結論づけることは筋のとおったことである。 目下、多くの当業者によって、ALS、パーキンソン病およびアルツハイマー病 はフリーラジカルにより蓄積された細胞の損傷に対して保護することのできない 結果であろうと信じられている。当業開業医のあるものはニューロトロフィンの 投与によるALSの治療を実験している(DiStefano,P.S.,Neurotrophic factors in the troeatment of motor nueuron disease and trauma．Exp．Neurol.，1993 ．124: p56-59. Thoenen，H.，R.A．Hughes，and M．Sendtner，Trophic Suppor t of motorneurons：Physiological，pathopysiologiscal，and therapeutic im plications．Exp.Neurol.,1993．124: p47-55)。 本発明がこれらの保護的化合物を内因的に生成できるため、本発明はこれらの 病気または他の変性性の細胞の状態に対する有効な治療法を提供する。高レベル のグルタチオンのような種々の保護的機構をもつ殆どの細胞とは異なり、ニュー ロンはこの抗酸化性源を欠くためこの保護的能力はニューロンの治療に特に重要 である。 HOの活性または生成を刺激する本発明の能力は哺乳類において少なくとも１つ のさらなる直接的生理学的利点 を持つ。ヘムがHOによって分解されて胆汁色素、ビリルビンおよびビリベルジン になったとき、COがまた生成される。従って、HOの活性または生成を刺激する本 発明の能力はまた、本発明に、生体内における細胞のCOの生成を刺激する能力を 提供する。COは可溶性グアニレートシクラーゼの活性剤として知られ、そしてcG MP−依存性機構を介して管平滑筋(vascular smooth muscle)を弛緩させる(Grase r，T.，Y.P．Verdernikov，and D.S．Li，Study of the mechanism of carbon m onoxide induced endothelium-indipendent relaxation in procine coronary a rtery and vein．Biomed．Biochem．Acta，1990．49: p.293-296．Morita，T.， et al.，Smooth muscle cell-derivied carbon monoxide is a regulator of va scular cCMP．Proc．Natl．Acad．Sci．USA，1995．92: p.1475-1479)。最近、 他の当業者によって、HOの阻害によるCOの血圧低下作用の詳細な論議が哺乳類の 血圧において増加していることが示されている(Jonson，R.A.，et al.，A hem o xgenaze product，presumably carbon monooxide，mediates a vasodepressor f unction in rats．Hypertension,1995．25:166-169)。従って、生態内でCOの生 成を刺激する本発明の能力が、増強された抗酸化的保護を与えることに加えて哺 乳類の血圧を減少させると結論づけることは正当である。これらの劇的な生理学 的効果を生じる天然由来の細胞性化合物の生体内での生成を直接誘導する本発明 の能力は技術的に先例がない ものである。 実施例１４ AIT-082における一酸化窒素の影響 一酸化窒素は酵素一酸化窒素シンセターゼ(NOS)の作用によって生成される。N OSを選択的に阻害することが示されている２つの化合物は、Ｎ−ニトリロ−Ｌ− アルギニンメチルエステル（L-NAMB）およびＮ−ニトロ−Ｌ−アルギニン（NOLA ）である。これらの化合物の異なるレベルをAIT-082と同時に投与し、PC12にお ける神経突起発生を実施例12の手順を使用して測定する。L-NAMBに対する結果を 表Ｆに示し、同時にNOLAに対する結果を表Ｇに示す。両方の表は以下の第５Ａ図 および５Ｂ図に示されるデータのグラフ図示に関して直接示される。 表ＦおよびＧのデータにより示されたように、これらのNOSの阻害剤のいずれ もがニューリット発生におけるAIT-082の効果を遮断する活性がない。これらの 結果は、NOがAIT-082の作用の機構に関係しないことを示して いる。 実施例１５ PC12細胞中のcGMPレベルにおけるAIT-082の効果 CO依存性グアニリルシクラーゼ修飾を示すために、PC12細胞中の環状グアノシ ンモノホスフェート(cGMP)レベルをAIT-082の添加後に測定する。最初に、PC12 細胞を低血清培地(1.5％ウマ血清＋5％胎児ウシ血清)で3日間40ng/mlのNGFで培 養する。40ng/ml NGF含む低血清培地の分析プレート上に細胞を接種しそして１ 時間インキュベートする。培地を血清を含まないおよびNGF、指示されたパパベ リン(100μM)を含む低アルギニン培地(80μM)に変える。試験化合物を指示され た時間に加えそして反応を³H-cGMP 10,000dpmを含む５％TCAを添加することによ って停止させる。cGMPはMauriceのラジオイムノアッセイ[Mol．Pharmacol．37:6 71-681,1990]によって検定する。TCAを粉末木炭(5g)を加えそしてWhatman #1ろ 紙によって混合物をろ過することにより精製する。cGMPのラジオイミムノアッセ イ(RIA)を妨害するのでこの処理はTCAの混入物を除去する。cAMPおよび他の混入 物は分析を妨害するためラジオイムノアッセイの前にcAMPおよび他の混入物から cGMPを精製することが必要がある。簡単にいえば、TCA溶液をDowexカラム(50W-8 X,200-400メッシュ)にかけ、溶出させる。中性アルミナカラムを次にそれぞれの Dowexカラムの下に配置する。0.05M HCl 4mlをそれぞれのDowexカ ラムに添加することによりcGMPをDowexカラムから中性アルミナカラムの中へ溶 出させる。中性アルミナカラムを次にHCl 2ml、水4mlおよび最後に0.2M酢酸ナト リウム(pH 6.2)で連続的に洗浄する。50-65％の回収率で酢酸ナトリウム1ml中に 溶出されたRIAのためのcGMPを集める。cGMPをDupont RIA キットを使用して分 析する。結果を第６図に図示する。 第６図に示されるようにAIT-082の添加はcGMP細胞におけるcGMPの生成を増加 させ、それはPC12細胞が一酸化炭素依存性酵素グアニリルシクラーゼの活性を修 飾することによって作用することを示す。 実施例１６ ニューロトロフィンmRNAの遺伝的発現におけるAIT-082の効果 AIT-082が生体内での遺伝的発現、そして結果としてのニューロトロフィン、 天然由来の遺伝的にコード化された分子の、細胞的生成、ならびにそれらの拡大 された活性を誘導したことを示すために、以下の実験を行った。ニューロトロフ ィンmRNAの誘導はAIT-082、NGF、または両方とともに培養された星状細胞のノー ザンブロット分析によって決定する。細胞を収集しRNAを処理後24において抽出 する。 より特別にはNIHスイスマウス(Harlan)のからの星状細胞が単離される。簡単 にいえば、新しく生まれた子(0-24時間)を断頭する。それらの脳を無菌状態に移 しそ して20％熱不活性化ウマ血清(Hyclone)を含む改良されたDulbecco's培地(DMEM) −("完全培地")に置く。新皮質をそれぞれ大脳半球から切出しそして1mmの立法 形に切り刻む。 星状細胞を機械的分離により単離する。立法形を最大速度で１分間激しく攪拌 する(vortex)。細胞懸濁物を最初に75mmのNitexつづいて10mmのNitexに通過させ る。得られた細胞懸濁物を完全培地で、完全培地10mlにつき１つの脳の最終濃度 になるよう完全培地で希釈する。希釈した細胞懸濁物10mlをそれぞれ100mm Falc on組織培養プレート(Fisher)に加える。３日後培地を新しい完全培地10mlに置き 換え次いで週2回10％熱不活性ウマ血清を含むDMBM("生育培地")と置換する。培 養２週間後星状細胞が融合生の単一層を形成する。 RNA抽出のため、星状細胞をトリプシン化(trypsinized)した。星状細胞を100m mのPORN被覆プレート上に1プレート（生育培地10ml）につき10⁶個の細胞の細胞 密度でリプレートした。2時間後10mMでPBS,GuoまたはGTPを適当なプレートに加 えた。それぞれの処理について1.5×10⁷個の細胞から、TRIzol試薬および供給元 提示の手順(GIBCO BRL/Life Tecnologies，Inc.)を使用して処理の４および24時 間後、総RNAを収集した。スロットブロットのために、Trasnfer and Immobiliza tion of Nucleic Acids and Protein to S & S Solid Supports (S and S Protoc ols: Schleicher & Schuell,New Hamps hier,USA)に記載されると同様に総RNAをHybond-Nフィルター(Amersham/United S tates Bicocemicals)に結合させた。ノーザンブロットはまたそれぞれの試料か らの総RNA 10-20mgを使用して行われた。これらをホルムアルデヒドを含む1％ア ガロースゲルで電気泳動させ、SアンドSプロトコルに従ってHybond-Nフィルター 上にブロットした。 ブロットを、P³²−ラベル化cDNA(NGF,NT-3およびBDNFプローブ)またはオリゴ ヌクレオチドープローブ(FGF-2)を用いてピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス−［2−エ タンスルホン酸］(PIPBS)緩衝液(50mM PIPBS,pH 6.8;50mM NaH₂PO₄;0.1M NaCl;5 %SDSおよび1mM EDTA)中、50℃で一晩中、ハイブリッド形成させることによって プローブした。つぎにブロットをそれぞれ室温で20分間(2X SSC，0.1％SDS)洗浄 用緩衝液で２回洗浄し、そして52℃で20分間(0.1X SSC，0.1％SDS)洗浄用緩衝液 で2回洗浄した。1X SSCは0.15M NaClおよび15mMクエン酸ナトリウム、pH7.0であ った。湿った膜をサランラップで包みそしてHyperfilm-MP(Amersham//USB)およ びカセットを使用して増強スクリーンとともにオートラジオグラフィーを行った 。分光光度計により測定されたおのおのの試料の種々の濃度（総RNAの0.25ない し4mg）を直線的フィルム反応(linear film response)を確実にした後、定量が なされるようにブロットおよびブローブした。定量はMICD Image Analysis(St． Catherine's，Ontario,C anada)。 プローブを提供するため、プラスミドpGEM.NGF(+)中のマウスNGF遺伝子のcDNA クローンおよびブルースクリプト(Bluescript)中のヒトNT-3およびBDNFのcDNAク ローンを単離した。単離後、Random Primed DNA Labeling Kit(Boehringer Mann heim Biochemica)をそのキットに記載された方法で使用してcDNAプローブを³²P- dCTP(ICN Biomedicals Canada,Ltd.)でラベル化する。 40-merアンチセンスオリゴヌクレオチドをFGF-2のためのプローブとして合成 した(MOBIX，McMaster University)。これはmRNAの配列をコーディングするマウ スFGF-2の5'末端に対して相補する。このオリゴをポリヌクレオチドキナーゼ、O ne-Phor-All緩衝液、およびPharmacia Biotech Inc.により供給された手順およ びATPgP³²(ICN Biomedicals Canada，Ltd.)を使用して5'末端ラベル化する。 ４つの異なる神経栄養因子の生成のための検討の結果を下記表Ｈに示す。 結果は、NGFを含む、幾つかの神経栄養因子に対しAIT-082がmRNAの発現を誘導 したことを示す。さらに重要なことには、これらのデータは、本発明の教示する ところによって処理される哺乳類における天然由来の遺伝的にコード化された分 子の生体内での遺伝的発現をAIT-082が選択的および調節的に誘導したことを明 らかに確立している。この具体的なプリン誘導体を投与することは４つの確認さ れた神経栄養因子のうち３つ、NGF、FGF- 2およびNT-3をコード化するmRNAの発現を選択的に誘導するが、BDNF mRNAについ てコード化する遺伝子の活性化または抑制解除を誘導しなかった。本発明の化合 物および方法により提供される投与の容易性と相まってこの選択的調節は従来技 術の制限を効果的に克服している。複雑な危険の可能性のある技術を介してこれ らの分子化合物を細胞に直接投与することよりもむしろ本発明は、遺伝的物質を コード化する所望の化合物を発現するよう細胞を誘導してそれらの直接的な生体 での配達および投与を生じさせる、伝統的な、被侵襲性の薬剤配達経路を利用し て哺乳類の患者を治療することができる。変更された遺伝子または他の分子生物 学的技術と連結する潜在的な有益性にもかかわらず、本発明について、遺伝学的 変更は必要でない。 アルツハイマー病患者からの海馬内では、神経栄養因子についてのmRNAの異常 なレベルを引き起こす遺伝子発現の変化したプログラムが存在することが従来示 されている。多くの動物および臨床研究は単なるニューロトロフィンの投与が神 経変性性の病気を処理するのに不十分であることを示している。従って、細胞内 の多数のニューロトロフィンmRNAの生成を刺激する本発明の化合物の能力はこれ らの天然由来の遺伝的にコード化された分子の患者への、それらの生体内での遺 伝的発現の誘導による有効な直接投与のための方法を提供することによる、種々 の神経変性性の病気のための治療のようなそれらの 潜在能力を実質的に増大させる。 前記の実施例はAIT-082が生体外でPC12細胞のみの中でニューリット発生を刺 激し、そして神経栄養因子（NGF）の作用を増強することを示している。さらにA IT-082の神経発生作用(neurotogenic effect)はメトヘモグロビン（一酸化窒素 および一酸化炭素を捕捉し排除する）、メチレンブルー（グアニリルシクラーゼ を阻害する）および亜鉛プロトポルフィリン IX（一酸化炭素を生成するヘムオ キシゲナーゼの阻害剤）によって減少される。AIT-082の神経発生作用はNO生成 の阻害剤であるL-NAMEまたはNOLAによっては影響されない。さらに、AIT-082は の生体外でのAIT-082投与後の星状細胞の神経栄養因子の増加したmRNAレベルに よって明らかにされたように多くの種々の神経栄養因子の生成を刺激する。さら に、AIT-082が経口的に活性でありおよび実施例２によって示したように速やか に血液脳関門を通過するため、アルツハイマー病におけるならびに他の神経変性 および細胞性病気におけるNGF疑似薬剤(NGF-mimetic agent)としての重要な治療 可能性をもつ。 前記結果の見地から、具体的な神経変性の病気を治療するためにAIT-082を使 用する有効性を示すための検討が行われた。記憶の喪失は多くの他の神経性苦痛 と同様アルツハイマー病の主な症状を示す。特別な作業（時々おこる(episodic) 記憶はアルツハイマー病、記憶喪失、老化ならびに猿の海馬の傷害後には害され る。この記憶 の喪失を改善することにおけるAIT-082の効果は、神経変性性の病気の治療に関 する本発明の化合物の効能を示すために使用された。 実施例１７ 異なるマウス系統における記憶痕跡の比較 ウイン−シフトＴ−迷路（win-shift T-maze）パラダイムはゲッ歯動物の作業記 憶(working memory)の特別なモデルについて示しておりおよび広範囲に受け入れ られている方法である。げっ歯動物の自然の行動は空腹であるとき食餌を捜しま わり、そのため何らかの食餌を食べ尽くした後はそれがいた同じ位置に戻らない 。このモデルは記憶の広大なデータの全てについて説明する事を意図しない。低 酸素症および虚血の研究からのデータ、CA1海馬細胞を選択的に損傷する手段は 作業記憶の不足を生じさせるが、記憶の他のタイプは影響されない。このことは 、異なる解剖上の部位および殆どあるとされている異なる神経化学的入力をもつ 数種のタイプの記憶あることを強く指示する。従って、ウイン−シフトモデルは 全ての作業記憶に関する神経化学的入力を説明できないが、このモデルは、それ によって記憶を修飾し得る機構の情報を提示すために意図される薬理学的実験に おいて有益な技術が許容し得る道具として提供される。 National Institute on Agingから入手した６カ月齢（若い成体）および11カ 月齢（老齢）の雄のスイスウエブスターマウス(Swiss Webster mice)を水への継 続的な供給を伴う22時間の明／暗周期で個々のケージ内に維持した。マウスが自 由な給餌の場合の体重の８０％に安定化するように食餌は制限した。マウスを計 量しそして１ 週間の間毎日扱った。ウイン−シフトモデルは文献に記載されたように作られ、 それぞれの正しい試験の後、正しい反応（correct responce）を変更させるＴ− 迷路試験からなる。試験と試験との間の間隔はいろいろ変化させそして被検体が 以前における正しい反応を記憶できる試験と試験との間の最も長い期間の測定を 与える。これにより記憶痕跡の持続期間の測定ができる。得点５（１０回の試験 につき５回正しい反応，５０％正しさ(correct)を偶然（chance）とみなし、即 ち前の試験の正の報酬に対して選択したボックスを該動物は記憶していない。報 酬の目標ボックスはおのおのの正しい試験の後変える。１匹のマウスにつき１０ 回の試験を毎日行う。動物が空間的な学習のセット（右側のみ）を確立するとき は、それらを試験毎に同じ目標に戻し、５０％の正しさよりも著しく低い正しい 反応割合をもつ。開始ボックスを離れる潜在時間を動機付けの測定として記録し 、走行時間（開始ボックスから離れて目標ボックスに到達する時間）を実施時間 の測定として記録し、そして正しい反応の回数を記憶の測定として記録する。表 Ｉに記載したデータはいかなる薬剤の処理もない若い成体において試験間隔(試 験と試験との間隔:inter-trial interval)を増加させる効果を示す。 表Ｉのデータからは、試験と試験の間の延長した間隔が30または60秒の場合に 、スイスウエブスターマウスがウイン−シフト計略を記憶することができると理 解できる。生理食塩水で処理したマウスは90秒の試験と試験の間の延長した間隔 に関し偶然（50％）より上に得点することはほとんどない。これらのデータは これらの動物の”記憶痕跡”が60および90秒の間に消えることをしめす。正常の 成体スイスウエブスターネズミにおける全ての薬剤評価試験は他に示さない限り 、90秒の試験間隔で行われた。C57BL/6マウスにおいては、記憶痕跡の持続期間 は120秒であった。 実施例１８ 記憶痕跡の持続期間におけるAIT-082の効果 AIT-082の活性をタクリン(THA)およびフィゾスチグミン(PHY)、動物の記憶を 増強する実験用アセチルコリンエステラーゼ剤と比較する。薬剤をまた運動行動 に対するそれらの効果に関し評価する。ウイン−シフト記憶パラダイムでは、AI T-082は薬剤投与の18日後、耐性(tolerance)を誘導するその能力において評価す る。加えて、AIT-082は改変されたＴ−迷路識別作業における学習を変成するそ れらの活性に対して検査される。 この実施例で使用する薬剤は４−［［３−（１，６−ジヒドロ−６−オキソ− ９−プリン−イル］アミノ］安息香酸（AIT-082）、代表的なカリウム塩として 、塩酸タクリン（テトラヒドロアミノアクリジン，THA，Sigma Chemical Co.,St Louis，Missouri）およびフィゾスチグミン、ヘミスルフェート塩(PHY,Sigma C hemcal Co.，St Louis，Missouri)である。薬剤を生理食塩水に溶解しそして毎 日新しく調整する。すべての注射は体重当たり0.1ml/10gの容積においてなされ る。検査薬剤を作用させる場合、AIT-082またはTHAの腹腔内(i.p.)注射が検査の 開始１時間前になされる。そのより短い作用期間のため、PHYは検査30分前に注 射される。対照の被検体は同様な生理食塩水（媒体）の注射を受ける。 記憶痕跡の持続期間の決定のため、被検体は薬剤または生理食塩水を投与され 、そして30分(PHY)または1時 間(AIT-082またはTHA)後、両方の目標ボックスの中にミルクの報酬を用いて一回 の参照実験(reference run)を受ける。試験間隔の延長を示した後、被検体を開 始ボックスに戻しそして前回正しい試験において入っていたボックスと反対側の 目標ボックスのみのミルク報酬を使用して最初の検査試験を与える。被検体は正 しい反応の後、単に報酬を変更したのみ10回の試験を受ける。 AIT-082の生物学的作用に関する耐性が発達したかどうかを測定するために、 標準ウイン−シフトパラグラムの検査の前、18日間薬剤または生理食塩水を毎日 投与する。 被検体はまた上記で討議したウイン−シフトモデルを使用するために同様のＴ −迷路内で訓練をうける。ウイン−シフト法におけると同様に、被検体を定め、 次に報酬が両方の目標ボックス中で得られる、単一の照会走行を与える。被検体 は目標ボックスを選択したことにおいてのみミルクの報酬を食べ尽し得る。次の 実験では、報酬およびこのような正しい反応が参照実験に対して選択された同じ 目標ボックスにあり、そして変更しなかった。被検体は正しい反応に対する目標 ボックスを位置換えしない学習を要求された。被検体は１日に付10回の試験を受 け、連続する2日間において10から少なくとも8の正しい反応をもつまで続けられ る。これらの実施の基準(criteria of performance)に到達する迄の日数を記録 する。被検体が基準に到達した後、目標ボックスを逆転 する。逆転における基準に達するまでの日数を記録する。 Ｔ−迷路学習作業およびウイン−シフト記憶検査の結果を直接下記の表Ｊに示す 。 表Ｊにおけるデータによって示されるように、AIT-082による処理は生理食塩水 対照と比較して正しい反応（記憶）の数の増加を生じた。一方効果は同じ範囲に あるが 、THAおよびPHY、THAとPHYの両方を用いる場合はまた潜在時間（開始ボックスを 離れるまでの延長した時間であり動機付けの減少を明らかにする。）を増加させ 、そしてTHAは自発的な移動活動を増加させた。AIT-082は学習または逆転に影響 せず、そして前処理の18日後AIT-082の記憶の増強効果に対する耐性を発達させ なかった。AIT-082のみが、学習、動機づけ、行動および移動活性に影響するこ となく記憶機能を増強させた。同様のデータはAIT-082の経口投与によっても観 察された。 実施例１９ 記憶痕跡持続期間におけるAIT-082投与量の効果 AIT-082の作用の投薬反応および期間を若い成体スイスウエブスターマウスに おいて検討した。結果を偶然をこえる正しい反応の％として示す；偶然は５０％ の正しさである。第７図に示すようにAIT-082は正常の成体のスイスウエブスタ ーマウスにおいて、20ないし30mg／kgにおける最適作用とともに0.5ないし60mg ／kgの投薬範囲において記憶を改善することに活性がある。さらに第８図に示す ように、作用の徴候が迅速で（１時間，データ示さず）そして60mg／kgの一回投 薬後７日より多く持続する。当業者は薬剤の効果の延長した期間が患者への承諾 および費用の点で利点を与える実質的に投薬回数をより低くするであろうことを 高く評価するであろう。 実施例２０ C57BL/6マウスにおける記憶痕跡持続期間におけるAI T-082の効果 前出の研究はAIT-082の投与によって増強され得るウィン−シフトパラダイム において正常な成体スイスウエブスターマウスが60秒の記憶痕跡の持続期間を有 し得うることを確立した。さらに本発明の方法および組成物の適用可能性および 操作性を実証するために、既に記載した手順を使用して、異なる記憶痕跡の持続 期間をもつ別の系統のマウスにAIT-082を投与する。結果を以下の表Ｋに直接示 す。 概して、ウイン−シフト食餌パラダイムにおいて、C5 7BL/6マウスは120秒の記憶痕跡持続期間をもつ。表Ｋに示されるように、30mg／ kg腹腔内注射において、AIT-082は210秒をこえる記憶痕跡の期間を延長した。フ ィゾスチグミンはまた、このモデルにおいて記憶痕跡の持続期間を120ないし180 秒延ばすが、AIT-082ほどは活性がなかった。 実施例２１ AIT-082を使用する老化誘発性記憶障害（age-induced Working Memory Disorder )の処理 既に記載した結果を考慮して、AIT-082がニューロンの障害をもつ哺乳類なら びに健康な被検体の記憶を改善することを示すための検討を行う。20月齢の雄の スイスウエブスターマウスをウイン−シフト食餌検査の実施のために選別する。 10秒で開始し、そして試験と試験との間の時間間隔を30、60、90および120秒に 増加させる、種々の時間延長して、被検体を検査する。未処理のマウスに対する 結果を以下の表Ｌに直接示す。 表Ｌにおける結果は個々の被検体が作業記憶欠陥(working memory impairment )の程度により類別できることを示す。重度の欠陥をもつ被検体は10秒で正しい 反応を記憶できず、一方軽度の欠損(deficit)をもつ検体は30秒の試験間隔では 正しい反応を記憶できるが60秒ではできなかった。中度の欠損をもつ被検体では 10秒の試験間隔における正しい反応を記憶できるが30秒ではできなかった。従っ てウィン−シフトモデルは作業記憶における老化誘発性の障害を検出できる。可 能な治療薬の評価のために障害の程度を変えるとともに年齢を合わせた被検体を 使用する能力を提供するため、この観察は重要である。 ベースラインの決定に続いて、３つの群のそれぞれに おいて６つの被検体をウイン−シフト食餌検査を使用してAIT-082（30mg／kg、 検査１時間前）またはフィゾスチグミン（0.125mg／kg、検査30分前）で処理し た。結果を以下の表Ｍに直接示しそして第９図にグラフにより示す。 ６被検体は記憶痕跡をもたない重度の欠損をもち、それらは10秒で作業を記憶 できなかった。これらの被検体はAIT-082またはPHY処理のいずれによっても記憶 の回復を示さなかった。10秒の記憶痕跡の持続期間をもつ中度の記憶欠損をとも なう６被検体では、AIT-082が４被検体（67％）について記憶痕跡の持続期間を3 0秒より大 きく増加させ、２被検体について（50％）記憶痕跡を60秒より大きく増加させる 。30秒の記憶痕跡の持続期間をもつ軽度の記憶欠損をともなう６被検体では、AI T-082が２被検体について記憶痕跡の持続期間を60秒に、２被検体について90秒 に、１被検体についてそれぞれ120および180秒に増加させる。PHYは中度の欠損 群において単に１被検体について10秒ないし30秒に記憶痕跡の持続期間を増加さ せる。軽度の欠損の群ではPHYは２被検体について60秒に、１被検体について90 秒に、２被検体について少なくとも180秒に記憶痕跡の持続期間を増加させる。 従って、AIT-082は中度の欠損群においてフィゾスチグミンより活性があり、そ して軽度の欠損群おいては少なくとも活性はある。 実施例２２ AIT-082を使用する老化障害欠損障害の処理 21月齢の雄C57BL/6マウスをウイン−シフト食餌検査を行うため選別する。被 検体は種々の試験間の時間間隔で検査する。10秒延長において基準(>60％ 正し さ)に達しない被検体を重度の欠損をもつと類別する。10秒の基準を達するが30 秒に達しない被検体を中度の欠損をもつと類別する。30秒の基準を達するが60秒 に達しない被検体を軽度の欠損をもつと類別する。実施例２１と同様に、それぞ れの群の被検体はAIT-082またはPHYのいずれかにより処理され、作業記憶痕跡が 延長された程度を測定する。結果を直接以下の表Ｎに示しおよび第１０図 にグラフにより示す。 AIT-082は、軽度の欠損群において30ないし90秒、中度の欠損において10ない し30秒の記憶痕跡の持続期間を延長する。PHYは軽度の群において記憶を延長す るが、中度の群においては有効でなかった。従って、AIT-082は、スイスウエブ スターとC57BL/6系統の両方について、正常マウスおよび老化誘発性ニューロン 障害をもつマウスの両方における作業記憶欠損を回復した。特に、この結果はAI T-082が軽度および中度の記憶欠損をもつマウスにおいて作業記憶を回復するこ とを示す。前に提示した他の実施例に基づいて、それは、一酸化炭素依存性 グアニリルシクラーゼ系を修飾することにより、この回復を達成すると結論づけ ることは正当性がある。 実施例２３ AIT-082を使用する老化欠損記憶障害の予防 老化誘発性記憶欠損はそれ自体14ないし16月齢のマウスに現れる。従って、我 々は14月のマウスをそれらの飲料水にAIT-082（30mg／kg／日）を入れて処理を 開始した。動物はウイン−シフト食餌検査を使用する月１回それらの記憶に対し て測定する。結果を第１１図に示し、AIT-082の投与が記憶欠損の徴候および悪 化を遅らせることを示す。 実施例２４ AIT-082を使用するアルコール誘発性欠損記憶障害の予防 神経変性性障害の異なるタイプに関する本発明の広範囲の適用性を示すために 、AIT-082をアルコール誘発性記憶欠損の発生を遅らせるために使用した。６月 齢雄C57BL/6マウスを非特異性の記憶抑制剤であるエタノール、およびAIT-082の 処理を組み合わせて評価する。検査１時間前に被検体を塩類溶液（対照）または AIT-082（30mg/kg i.p.）で処理する。検査の10分前にエタノールを0.5mg/kg i. p．の投薬量で投与する。パイロット調査の結果を下記の表Ｏに直接表示する。 表Ｏにおける結果は、ウイン−シフトモデルにおいて測定されたように記憶欠 損を生じさせうることのできる遮断薬の投薬を確認できることを示す。エタノー ルは非特異性の遮断剤として選択されそしてその作用はエタノールによる処理の 前にAIT-082の投与によって逆転する。したがって、他のより多くの特異的な受 容体部位において活性をもつ特定の遮断剤を評価可能であるようである。 AIT-082に加えて他のプリン誘導体はニューロンの生 存、シナプス発生および中枢神経系の損傷または細胞の死に続く機能の回復の役 割をすると信じられている。例えば、グアノシンおよびAIT-082間の類似性はAIT -082およびグアノシンが同等な機構によって作用することを示す。即ち両者は一 酸化炭素依存性グアニリルシクラーゼモジュレーターとして作用すると思われる 。さらに、細胞が損傷した後、それらはプリンヌクレオチドおよびヌクレオチド の両方の多くの量を細胞外空間に漏出させることが知られている。焦点の脳の損 傷の領域における細胞外グアノシンの濃度は50mMに達し得、そして少なくとも７ 日において５倍までに高められる。従って損傷後、星状細胞またはグリアおよび ニューロンはグアノシンの高い細胞外濃度下におかれる。 従って以下の検討は他の代表的プリン誘導体、例えばグアノシンを一酸化炭素 依存性グアニリルシクラーゼ系を修飾することを示すために使用する効果を示す ために行われる。 実施例２５ グアノシンおよびGTP下におかれた星状細胞は栄養因子を生成する 星状細胞は細胞外のグアノシンまたはグアノシン三リン酸(GTP)に対する反応 において増殖するようである。GTPまたはグアノシンはまた新生児マウス脳から の新皮質の星状細胞の培養から栄養因子を放出するのを刺激で きる。星状細胞はそれぞれGTPのグアノシンの種々の濃度とともにインキュベー トする。処理した細胞からの培地中のニューロトロフィン免疫反応性をELISA法 によって測定する。 手短にいえば、96個のウェルファルコンプレート(Falcon plates；(Fisher)を 0.1M炭酸ナトリウム緩衝液,pH9.6に含まれるヒツジ単一特異性抗−NGF IgG（ア フィニティーカラム精製）1mg／mlによって被覆する。4℃における一晩中のイン キュベーションの後、過剰な抗体を除去するため遮断溶液(10％ヤギ血清を含むP BS)を加える。室温において４時間保温した後、0.05％Tween20を含むPBSで３回 洗浄する。調整した培地および標準2.5 S HPLC精製NGFを加えそして一晩中イン キュベートする。次の日PBS-0.05％Tween20で３回洗浄する。二次抗体、ｂ−ガ ラクトシダーゼに結合したウサギ単一特異性抗NGF IgG(1:500希釈)を加える。プ レートは一晩中４℃でインキュベートする。次の日PBS-0.05% Tween20でプレー トを３回洗浄する各々のウエル基質に0.1Mリン酸緩衝液(1mM MgCl₂ pH7.2)中の0 .2mM 4-メチルウンベリフェリル−ｂ−ガラクトシド(MUG)を加える。室温で４時 間のインキュベーションの後0.1Mグリシン，pH10.3を添加することにより反応を 停止させる。試料を次にMicroflour ELISA readerで（励起360nm; 発光450nm） を使用して読み取る。この検定法の感度は10pg/ウエルNGFである。 このエリザ検定法は殆ど等しい親和性をもつニューロトロフィンNGFおよびNT- 3、ならびに100倍より少ない親和性をもつBNDFを検出する。第１２Ａ図および第 １２Ｂ図に示すように、グアノシンおよびGTPの両方はNGFと同様の培養培地中の 免疫反応性の量を増加させる。種々のレベルのグアノシン下に置かれた星状細胞 はGTPの等しい濃度下に置かれたものよりも非常に強い反応を引き起こした。 実施例２６ 星状細胞はグアノシン作用下で神経栄養因子を生成する 前記検定の結果を確認するために、グアノシン下におかれた星状細胞において 栄養因子FGF-2おびNGFのmRNAレベルを測定する。mRNAレベルは既に示した実施例 １６に使用したと同じ手順を使用して測定する。第１３Ａ図および第１３Ｂ図に 示すように、グアノシンの添加はそのそれが星状細胞へ添加された後４時間およ び24時間においてNGFおよびFGF-2 mRNAをそれぞれ増加させる。グアノシンの細 胞外の濃度がかなり高い場合、観察されたニューロトロフィンmRNAの増加は脳の 傷害または脳の傷害からの回復の次に重要である。脳の傷害の後に細胞が数日間 グアノシンの高濃度下に置かれるとき、このデータはグアノシンが機能の回復の あるものに対して反応し得ることを示す。 既に討議したように、血液脳関門を透過できおよびこ こではmRNAのレベルにより測定された神経栄養因子の濃度を増加できる物質はニ ューロンの生存および皮質神経回路の形成に実質的に正の作用をもつようである 。このことは順次多くの異なる神経性疾病または神経系の損傷後における機能回 復を増強するようである。 実施例２７ グアノシン作用下におけるニューロンは神経突起発生をおこす グリアまたは星状細胞の変化に加えて、重要なニューロンの変化はまた焦点の 脳傷害に続いて起こる。従ってAIT-082を使用する、以前の結果に基づいて、グ アノシンが一酸化炭素グアニリルシクラーゼを修飾して神経突起発生を刺激する ことを示すために検討を実施する。既に討論したように、PC12細胞は大グリア型 細胞を含むことなくニューロン様細胞の均質な母集団を構築するため、これらの 細胞の神経突起発芽後成長における本発明の具体的なプリン誘導体の直接作用が 容易に見いだされる。従って、PC12細胞はNGFとともにおよびそれなしでグアノ シンおよびアデノシン作用下に置かれそして実施例１２と同様にモニターされる 。NGFとともにプリン誘導体作用下におくことの効果は第１４Ａ図に、NGFなしで のプリン誘導体作用下におくことの効果は第１４Ｂ図に示される。これらのプリ ン誘導体のNGFの存在下または不在下の効果の直接の比較は第１４Ｃ図に記載さ れる。 第１４Ａ図に示すように、アデノシンではなく、グアノシンはPC12細胞におけ るNGFによって誘導される神経突起発芽後成長は48時間後増強した。この増強は3 0ないし300mMのグアノシン濃度においてNGFのみの増強を有意に越える。アデノ シンはいずれの濃度においてもNGFに誘導された神経突起発芽後成長を増強しな かった。これは、プリンによって誘導される神経突起発芽後成長はまさに一般化 された現象ではないことを示す。アデノシンＡ₁およびＡ₂受容体拮抗剤である５ ’−Ｎ−エチルカルボキサミドアデノシン（NECA）もまた神経突起発生を増強す るが、グアノシンと同じ程度ではない。第１４図に示すように、それら自体にお いて、NGFの不在下、アデノシンおよびグアノシンの両方は神経突起をもつ細胞 の比率を僅かに増加させた。30および300mMの両方におけるグアノシンの効果は 同じ濃度におけるアデノシンよりも大きかった。（NECA）の存在下においては神 経突起は殆ど刺激されない。NGFの存在下における化合物の効果は非常に容易に 獲得でき、そして化合物のみを用いるよりも実験から実験までより少なく変化し 得るため、神経突起発芽後成長の増強のためのデータのほとんどはNGFの存在下 で決定する。 第１４Ａ図および第１４Ｂ図に示されならびに第１４Ｃ図に強調されるは比較 データは、グアノシンが幾分の神経突起伸長を引き起こすが、またNGFの栄養効 果を増強する相乗的に反応できることことを示す。アデノシン はそれ自体で神経突起発芽後成長を僅かに増強するが、それはNGFの作用を増強 しなかった。興味深いことには、しかし、アデノシンでなく、NECAは、第１４Ｃ 図に示されるようにNGFの存在および不在下の両方においてグアノシンの作用を 相乗的に増強できた。アデノシンがPC12細胞のNGF−依存性神経突起発芽後成長 を増加させないが、グアノシンが増加させる事実は、それらはPC12細胞と別個に 影響し合うことを提案する。アデノシンはＡ₂プリノセプタのようなアデノシン 受容体と相互作用した。これは細胞間のｃＡＭＰを増加させるアデニレートシク ラーゼを活性化する。NECAはこのように作用するようである。しかしNECAの効果 はグアノシンの効果と共に相乗的になった。このことはグアノシンおよびNACAが 神経突起発芽後成長を増強するのに異なる信号経路を使用することを示す。 実施例２８ 種々のプリン誘導体が神経突起発生の異なる割合を示すこと 前記結果の点で、一酸化炭素依存性グアニリルシクラーゼを修飾するこれらの 化合物の特異性を示すため他の具体的付誘導体を試験する。 具体的にはプリン誘導体イノシン、ヒポキサンチンおよびキサンチンの種々の 濃度を実施例１２の手順を使用して、NGFの存在下で試験して神経活性を変成す るそれらの能力を示す。 第１５Ａ図に示されるように、イノシンは、NGF単独で処理される細胞中に生 成される神経突起発芽後成長を僅かに増強するのみである。このことは0.3ない し300mMにイノシンの濃度に対して正しい。第１５図Ａはまた神経突起発芽後成 長の増強におけるイノシンの効果はグアノシンの効果よりも非常に少ない有効性 であったことを示す。 第１５Ｂ図および第１５Ｃ図はまたヒポキサンチンおよびキサンチンがそれぞ れNGF−誘導性神経突起発生におけるイノシンの結果と同様の結果を生じたこと を示す。第１５Ｃ図では、0.3ないし30mMの濃度（300mMは細胞に対して毒性であ る。）において、単にNGF誘導性神経突起発芽後成長を僅かに増強するのみであ った。第１５Ｂ図はヒポキサンチンが、最も大きいしかしまだ控えめな、0.3お よび300mMの濃度において増強を示すが、他の濃度では顕著な増強はみられない ことを示した。ヒポキサンチンにおいて神経突起発芽後成長のいくらかの増強が 観察されるが、増強の相対量はグアノシンの効果ほど殆ど大きくなかった。イノ シン、キサンチンおよびヒポキサンチンは神経の活性を変成する、一酸化炭素依 存性グアニリルシクラーゼ系を修飾せず、むしろ他の信号メカニズムに影響を与 えることを示す。 実施例２９ 神経突起発生におけるAIT-082の効果 神経突起発生におけるAIT-082と同様の化合物の効 果を示すために、PC12細胞を、成長の間、別の、３−（１，６−ジヒドロ−６− オキソ−９Ｈ−プリン−９−イル）−Ｎ−［３−（２−オキソピロリジン−１− イル）プロピル］プロパミドとして知られるAIT-34の下におき、実施例１２に従 ってモニターする。第１６図に示されるように、AIT-34の種々の濃度はAIT-082 によって観察されるようにNGF−誘導神経突起発生を増強しない。 実施例３０ 神経突起発生におけるATPおよびGTPの効果 異なる官能基をもつプリン誘導体を本発明の技術に従って使用できることをさ らに示すために、PC12細胞をアデノシン三リン酸(ATP)およびグアノシン三リン 酸(GTP)の下におきそして実施例１２の手順を使用して神経突起発生に対してモ ニターする。 PC12細胞の神経突起発芽後成長におけるアデノシンおよびグアノシンの作用と 非常に類似して、相当するヌクレオチドATPおよびGTPは神経突起発芽後成長にお いて並行に作用する。第１７図に示されたようにATPはNGFで処理された細胞また はそれのみの何れにおいても増強された神経突起発芽後成長を示さない。 しかし、第１８図に示したように、GTPは制御されてグアノシンがそこから離 れる源として作用しているようには思われない。GTPがエクト酵素によってグア ノシン二リン酸(GDP)、グアノシン一リン酸(GMP)そして最終的にグアノシンに加 水分解される場合はPC12細胞からGD PおよびGMPもまた神経突起発芽後成長を増強することが予想される。しかし未だ 、神経突起発芽後成長を引き出すことについてGDPおよびGMPも単独もしくはNGF を伴ういずれの場合であっても有効でない。比較のつもりとして、アデノシンベ ースの化合物はすべて阻害的な作用をもつ。 実施例３１ GTPではないが、グアノシンはPC12細胞におけるcGMPを増加させる 前述の実施例に基づいて、GTPおよびグアノシンそれぞれの神経発生機構を示 すために検討が行われた。動脈平滑筋においてグアノシンおよびGTPは細胞環の 環状３’，５’−グアノシン一リン酸（cGMP）を増加させることが示されている 。cGMPは同様に神経芽腫細胞において神経突起発芽後成長を刺激することが報告 されているためグアノシンおよびGTPの両方は、細胞間cGMPを増加させることに よるそれらの効果を発揮するかもしれない。第１９図に示したように、グアノシ ンは実施例１５に説明した手順を使用するラジオイムノアッセイによって測定さ れるPC12細胞における細胞間cGMPを増加させた。 このように増加は一酸化炭素依存性グアニリルシクラーゼモジュレータを期待 させる。これに対し、GTPはcGMPのレベルを増加せず、いずれかのGTPにより刺激 された神経突起発生が他の機構によって引き起こされていることを示そた。 実施例３２ グアニリルシクラーゼの非選択性阻害剤の使用はグアノシン神経突起発生を減 少させること グアノシンが一酸化炭素依存性グアニリルシクラーゼ系を変成させることを示 すため、細胞間cGMPの増加されたレベルが、グアノシンがNGFのPC12細胞におけ る神経発生作用を増強するのに必要であるを示すために検討を行う。特に、グア ニリルシクラーゼの３つの阻害剤の異なる濃度をグアノシンとともにPC12細胞に 添加する。神経突起発生を実施例１２の手順を使用して測定した。 メチレンブルー（MB）は可溶性グアニリルシクラーゼ(sGC)を、この酵素がcGM Pを合成するのを阻害する。第２０Ａ図に示したようにPC12細胞培養にMB(0.1-5m M)の添加はNGFとのグアノシンの相乗的作用を打ち消した。逆にMBはNGF刺激性神 経突起発芽後成長に影響しなかった。 LY83583は微粒子物およびsGCの両方を阻害する。第２０Ｂ図は、グアノシンに よって発揮される神経突起発芽後成長反応がLY83583によて阻害されたが、NGFに よって発揮される反応では影響がなかったことを示す。LY83583がグアニリルシ クラーゼを阻害する機構はまだ決まっていないが、間接的にはグルタチオン代謝 に関係するようである。従って、それぞれ異なる作用機構によるグアニリルシク ラーゼの２つの非選択性の阻害剤は、グアノシンの神経発生作用を弱める。 これらのデータは、グアノシンおよびNGFは異なる機構により作用することを 示す。それらはまた、可能性は充分でないが、グアノシンがその神経発生作用を 発揮するには細胞間cGMPの増加が必要であったことを示す。 さらにcGMPの増加が神経突起発生に充分であるかどうかを試験するために、グ アノシンに対して使用されたと同様な手法で心房性ナトリウム利尿因子(ANF)を 細胞培養に添加する。ANFはそのただ一つの公知信号変換経路(signal transduct ion pathway))が微粒子グアニリルシクラーゼの活性化を介するホルモンである 。第２０Ｃ図に示したようにANFはグアノシンと同様にPC12細胞からのNGFにより 刺激される神経突起発芽後成長を増強して、一酸化炭素依存性グアニリルシクラ ーゼによりまたは神経突起発芽後成長を刺激するのを補助する他の機構により誘 導した、増加した、細胞間のcGMP生成を示す。 実施例３３ 一酸化窒素または一酸化炭素はグアノシン神経突起発生を促進する 実施例３１に示したように、グアノシンは細胞間cGMPを増加させたため、その 信号がNOまたはCOの生成により導入されうるかどうかを示すための検討が行われ た。NOが関連した場合には、NOを遊離する一酸化窒素の供与体はグアノシンの作 用を模するであろう。 PC12細胞を両者ともNOを遊離するナトリウムニトロプルシド(sodium nitropru sside)(SNP)または亜硝酸ナト リウム(SN)の存在下で48時間成長させる。単独では、SNPもSNもPC12細胞からの 神経突起発芽後成長を引き出さない。しかしながら、グアノシンと同様に、SNP およびSNの両者は第２１図に示されるSNの添加に対し相乗的手法でNGFの介在す る（NGF-mediated）神経突起発芽後成長を増大させる。さらに効果を確認する、 第２２Ａ図および第２２Ｂ図はNO供与体の神経発生の特性がヘモグロビン(Hb)お よびメトヘモグロビン(MB)の両方によって抑制されたことを示す。両者は高い親 和性でNOおよびCOを捕捉する物質であり、これらの物質を、信号伝達物質として 使用されることからあらかじめ排除する。 従って、NOまたはCOがグアノシンの神経発生作用を媒介するならば、培養にヘ モグロビンを添加することによってそれらの効果は減少する。予想された効果は Hb(0.1-1mM)がグアノシンの神経発生作用を阻害したが、NGFの作用は抑制しなか ったことを明らかに示す。このことはグアノシンの神経発生作用が、NGFの作用 は違うが、NOまたはCOの合成を必要とするとを示す。 幾つかの事実が、神経の活性を変成するグアノシンと相互作用するのはNOより もCOであることを示唆する。例えば、グアノシンの作用がNOによって媒介されて いるならば、PC12細胞へのグアノシンの添加はPC12細胞のcNOSを刺激してNOを生 成するはずである。しかしcNOSはPC12細胞および未処理の（グアノシンおよびNG Fをうけない）PC12細胞はNOSと一緒に局在する酵素ジアフォラーゼ に対して着色されない。cNOSはカルシウム／カルモジュリンに感受性があり、そ の活性はカルシウムイオノホアを加えた後増加し、次にcGMPレベルを増加させる 。PC12細胞の培養へのこのイオノホアA23187の添加はcGMPの増加を起こさせるこ とができなかった。 実施例３４ 一酸化窒素ではなく、一酸化炭素が神経突起発生におけるグアノシンの効果を 媒介する。 上記実施例の結果に基づいて、グアノシンを含む本発明のプリン誘導体は一酸 化炭素依存性グアニリルシクラーゼ系を修飾して神経活性を変成することを示す ために検討がなされた。 阻害剤の使用によって一酸化炭素がAIT-082の作用を媒介することを示した実 施例６ように、同じ技術がグアノシンもまた一酸化炭素依存系と相互に影響する 。特に、第２４図に示すように、cNOS阻害剤、Ｌ−ニトロアルギニンメチルエス テル(L-NAMB)は、NGFの介在する神経突起発芽後成長の増強するグアノシンの能 力に影響しなかった。これらのデータはcNOSが、PC12細胞におけるグアノシンの 神経発生作用を媒介する信号変換経路に関係しなかったことを確認する。 さらに、NOよりもCOがグアノシンの神経発生作用を媒介することを示すために 、ヘムオキシゲナーゼを阻害しそしてこのためCO合成を阻害する、亜鉛プロトポ ルフィリンIX(ZnPP)を成長中に細胞に加える。第２５図に示さ れるように、ZnPPはグアノシンの神経発生作用を消滅させたがNGFのこの作用に は影響しなかった。対照に、関連するプロトポルフィリン誘導体である、銅プロ トポルフィルンIX(CuPP)はヘムオキシゲナーゼを阻害しない。従って、第２６図 では銅プロトポルフィルンIXがPC12細胞からNGFに依存する神経突起発芽後成長 を増強するグアノシンの能力を減少させなかったことを示す。AIT-082による場 合と同様に、これらのデータはグアノシンがCO合成を増加させたことを示す。順 次、COはsGCを活性化しそして細胞間GMPを増加させ、それにより神経突起発生を 促進した。 実施例３５ イノシンプラノベクスは神経突起発生を増強する 本発明の領域および実施可能性を示すためにイノシンプラノベクスを使用して 検討を行う。具体的にはイノシンプラノベクスはイノシンおよびDIP-PacBaの１ ：３モル比の混合物である。これらの化合物の種々の濃度をNGFを含むPC12細胞 に添加し、それは実施例１２の手順に従ってモニターされる。 第２７図に示されたように、イノシンプラノベクスは実質的に処理した細胞の 神経突起発芽後成長の量を増強した。第２７図 に示された曲線はNGF飽和濃度 を加えたイノシンプラノベクスの異なるレベルを示し、一方水平線は信頼レベル とともにNGF対照を示す。ここで処理された細胞は選択された濃度の殆どにおい て上記対照の ベースラインよりも上にある。 本発明の技術によって細胞および、より具体的には神経の活性の変成は、細胞 または神経の機能の回復を提供するため広範囲の種々の細胞のおよび神経変性性 疾患を治療するために使用できる。従って、本発明は酸化的ストレス、病気、外 傷、老化および有害な物理的または化学的因子への曝露を含むいずれかの原因か らの細胞および神経変性を治療するために使用できる。同様に、この方法および 医薬はここに、これらに限定されないが、アルツハイマー病および関連する変性 性障害、パーキンソン病および関連する変性性の障害例えば線条体黒質の変性、 旧小脳萎縮症；筋萎縮性側索硬化症、ウェルトニック−ホフマン病、ヴォルファ ルト−クンゲルベルク−ヴェランダー症候群および遺伝性痙攣性両側麻痺を含む 運動ニューロン障害、または”運動系疾患”；虚血（発作のような）、無酸素症 または低血糖症（例えば長時間の循環停止のような）によるニューロンへの損傷 、ハンティングトン病、脳性麻痺、多発性硬化症；情動障害、精神分裂病、てん かんおよび痙攣を含む精神医学的障害；いずれかからの原因からの末梢性ニュー ロパシー、学習障害および記憶障害を含む神経性の病気を治療するために使用で きる。また、放射線または電流のような物理的因子またはアルコール、アルミニ ウム、重金属、産業性毒、自然毒および適法もしくは違法薬物による、ニューロ ンまたはその過程への損傷を治療できる。この方法は さらに、ニューロンの損傷を生じる脳または脊髄への外傷の罹災者、または老化 に関する状態、例えばニューロンまたはニューロンの連結性の損失のための、良 性の健忘症および感覚、運動、反射もしくは認識能力の衰退を治療するために使 用できる。本発明の一酸化炭素依存性グアニニルシクラーゼ修飾プリン誘導体の 少なくとも１種の有効投薬量を前記細胞または神経障害のいずれかに罹っている 被検体に簡単に投与することは、細胞間の変化を誘導して機能を回復させるであ ろう。 特に、本発明の教示するところによる一酸化炭素依存性グアニリルシクラーゼ 系の変成はニューロンおよび星状細胞を含むグリア細胞での神経活性を変化させ る。例えば本発明を使用して、繊維芽細胞成長因子(FGF)、神経成長因子(NGF)、 脳由来神経栄養因子(BDNF)およびニューロトロフィン−３（NT-3）を含む、種々 の神経栄養因子およびサイトカインを合成するように星状細胞の神経活性を変成 することができる。これらの因子は生存しているニューロンからの神経突起の生 成過程の発芽（sprouting of neuritic processes）に影響を及ぼすことができ 、ならびに新しい細胞の発達を促進することができる。新シナプスが形成されそ してある機能の回復を提供できる。これらの神経栄養因子はまた、神経を保護す る役割もする。従って、それらの生成を誘導することがさらなる神経の損傷を改 善する。 本発明の教示するところにおいて多くのプリン誘導体 を使用することができる。しかし、一酸化炭素依存性グアニリルシクラーゼ系を 修飾することによって神経活性を変成する能力は全てのプリンまたはプリン誘導 体の一般的な性質ではない。例えば、以下のデータに示すように、イノシン、ア デノシン、ヒポキサンチンおよびキサンジンは全て比較的神経活性を変成するこ とに有効ではない。神経活性を変成できない他のプリン誘導体は３−（６−アミ ノ−６Ｈ−プリン−９−イル）プロピオン酸，エチルエステル（AIT-0026）、３ −（１，６−ジヒドロ−６−オキソ−９Ｈ−プリン−９−イル）−Ｎ−｛３−（ ２−オキソプロリジン−１−イル）プロピル］プロパミド（AIT-0034）およびプ ロペントフィリンである。さらに５’−Ｎ−エチルカルボキサミドアデノシン（ NECA）のような他のプリンおよびプリン誘導体は神経突起発芽後成長を刺激する ことを示すにもかかわらず、それらは一酸化炭素依存性グアニリルシクラーゼ機 構の修飾によってそれを行っていない。従って、本発明の範囲は本明細書に記載 し、および表示されたデータによって示された、細胞または神経の活性を変成す るプリン誘導体の機能的反応性によって定義される。もちろん、機能的に等しい 本発明の化合物の異性体、類似体および同族体は代用できることを当業者は認め るであろう。 さらに、本発明はその意図または主要な特性から離れることなしに他の特定の 形態に具体化できると認めるであろう。すなわち、本発明の前述の内容はその例 示的具 体例を開示したに過ぎず、他の変形は本発明の範囲内にあることを考慮したと理 解するべきである。従って、本発明は本明細書に詳細に記載された特定の具体例 に限定されない。論及はむしろ、本発明の範囲および内容を示唆する添付の請求 の範囲になされるべきである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号 ０８／４９２，９２９ (32)優先日 1995年７月20日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)， ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ， ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ， ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ラスボーン， マイケル カナダ国、オンタリオ エル８エム ２エ ックス１ ハミルトン，スパディナ アベ ェニュー 40

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 哺乳類の神経活性の長期変成のための医薬であって、有効量の、一酸化 炭素依存性グアニリルシクラーゼ修飾プリン誘導体の少なくとも１種を含む医薬 。 ２． 前記一酸化炭素依存性グアニリルシクラーゼ修飾プリン誘導体が、グア ノシン、４−［［３−（１，６−ジヒドロ−６−オキソ−９Ｈ−プリン−９−イ ル）−１−オキソ−プロピル］アミノ］安息香酸およびイノシンプラノベクスか らなる群から選択される、請求項１に記載の医薬。 ３． 前記一酸化炭素依存性グアニリルシクラーゼ修飾プリン誘導体の少なく とも１種の前記有効量が少なくとも１μMの処置濃度を与える、請求項１に記載 の医薬。 ４． 前記一酸化炭素依存性グアニリルシクラーゼ修飾プリン誘導体の少なく とも１種を哺乳類の被検体に経口的に投与するために形成される請求項２に記載 の医薬。 ５． 前記一酸化炭素依存性グアニリルシクラーゼ修飾プリン誘導体の少なく とも１種を哺乳類被検体に注射するために形成される請求項２に記載の医薬。 ６． 前記変成された哺乳類の神経活性がニューロトロフィンの生成である請 求項１に記載の医薬。 ７． 前記変成された哺乳類の神経活性がプレイオトロフィンの生成である請 求項１に記載の医薬。 ８． 前記変成された哺乳類の神経活性が増大されたニューロンの生存である 請求項１に記載の医薬。 ９． 前記変成された哺乳類の神経活性が側副枝神経回路の形成である請求項 １に記載の医薬。 １０． 前記変成された哺乳類の神経活性が神経突起発生である請求項１に記載 の医薬。 １１． 前記変成された哺乳類の神経活性がシナプス形成である請求項１に記載 の医薬。 １２． 前記変成された哺乳類の神経活性がサイクリックプリンヌクレオチドの 生成である請求項１に記載の医薬。 １３． 前記変成された哺乳類神経活性が増強されたニューロトロフィンまたは プレイオトロフィン活性である医薬。 １４． 前記増強されたニューロトロフィンまたはプレイオトロフィン活性が、 神経成長因子、線維芽細胞成長因子、ニューロトロフィン−３、脳由来神経栄養 因子、ニューロトロフィン−４／５毛様体神経栄養因子、Ｓ１００Ｂおよびそれ らの組合せからなる群から選択される神経栄養因子によって生じる請求項１３に 記載の医薬。 １５． 有効量の、一酸化炭素依存性グアニリルシクラーゼ修飾プリン誘導体の 少なくとも１種を含む哺乳類の神経性疾病の治療のための医薬。 １６． 前記一酸化炭素依存性グアニリルシクラーゼ修飾プリン誘導体が、グア ノシン、４−［［３−（１，６− ジヒドロ−６−オキソ−９Ｈ−プリン−９−イル）−１−オキソ−プロピル］ア ミノ］安息香酸およびイノシンプラノベクスからなる群から選択される、請求項 １５に記載の医薬。 １７． 前記一酸化炭素依存性グアニリルシクラーゼ修飾プリン誘導体の少なく とも１種の前記有効量が少なくとも１μMの処置濃度を与える、請求項１５に記 載の医薬。 １８． 前記一酸化炭素依存性グアニリルシクラーゼ修飾プリン誘導体の少なく とも１種を哺乳類の被検体に経口的に投与するために形成される請求項１６に記 載の医薬。 １９． 前記一酸化炭素依存性グアニリルシクラーゼ修飾プリン誘導体の少なく とも１種を哺乳類被検体に注射するために形成される請求項１６に記載の医薬。 ２０． 前記哺乳類の神経性疾病がアルツハイマー病および関連する変性障害で ある請求項１５に記載の医薬。 ２１． 前記哺乳類の神経性疾病が老齢の良性の健忘症および関連する障害であ る請求項１５に記載の医薬。 ２２． 前記哺乳類の神経性疾病が老化に関連するニューロンまたはニューロン の連結性の損失および関連する知覚、運動、反射または認識能力の衰退である請 求項１５に記載の医薬。 ２３． 前記哺乳類の神経性疾病がパーキンソン病および関連する障害である請 求項１５に記載の医薬。 ２４． 前記哺乳類の神経性疾病が旧小脳萎縮である請求項１５に記載の医薬。 ２５． 前記哺乳類の神経性疾病が運動ニューロパシーである請求項１５に記載 の医薬。 ２６． 前記哺乳類の神経性疾病が物理的因子によるニューロンまたはそれらの 経路への損傷である請求項１５に記載の医薬。 ２７． 前記哺乳類の神経性疾病が虚血症、無酸素症または低血糖症によるニュ ーロンへの損傷である請求項１５に記載の医薬。 ２８． 前記哺乳類の神経性疾病が化学的因子によるニューロンへの損傷である 請求項１５に記載の医薬。 ２９． 前記哺乳類の神経性疾病が脳または脊髄への外傷である請求項１５に記 載の医薬。 ３０． 前記哺乳類の神経性疾病がてんかんまたは痙攣である請求項１５に記載 の医薬。 ３１． 前記哺乳類の神経性疾病が末梢性ニューロパシーである請求項１５に記 載の医薬。 ３２． 前記哺乳類の神経性疾病が学習障害である請求項１５に記載の医薬。 ３３． 前記哺乳類の神経性疾病が脳性麻痺である請求項１５に記載の医薬。 ３４． 前記哺乳類の神経性疾病が精神医学的障害である請求項１５に記載の医 薬。 ３５． 前記哺乳類の神経性疾病が記憶障害である請求項 １５に記載の医薬。 ３６． 前記哺乳類の神経性疾病がハンチングトン病である請求項１５に記載の 医薬。 ３７． 哺乳類のニューロンの膜電位における長期変化のための医薬であって、 有効量の、一酸化炭素依存性グアニリルシクラーゼ修飾プリン誘導体の少なくと も１種を含む医薬。 ３８． 前記一酸化炭素依存性グアニリルシクラーゼ修飾プリン誘導体が、グア ノシン、４−［［３−（１，６−ジヒドロ−６−オキソ−９Ｈ−プリン−９−イ ル）−１−オキソ−プロピル］アミノ］安息香酸およびイノシンプラノベクスか らなる群から選択される、請求項３７に記載の医薬。 ３９． 前記一酸化炭素依存性グアニリルシクラーゼ修飾プリン誘導体の少なく とも１種の前記有効量が少なくとも１μMの処置濃度を与える、請求項３７に記 載の医薬。 ４０． 哺乳類における天然由来の遺伝的にコード化された分子の少なくとも１ 種の生体内での遺伝的な発現を、選択的または調節可能に誘導するための医薬で あって、有効量の、一酸化炭素依存性グアニリルシクラーゼ修飾プリン誘導体の 少なくとも１種を含む医薬。 ４１． 前記一酸化炭素依存性グアニリルシクラーゼ修飾プリン誘導体が、グア ノシン、４−［［３−（１，６−ジヒドロ−６−オキソ−９Ｈ−プリン−９−イ ル）−１ −オキソ−プロピル］アミノ］安息香酸およびイノシンプラノベクスからなる群 から選択される、請求項４０に記載の医薬。 ４２． 前記一酸化炭素依存性グアニリルシクラーゼ修飾プリン誘導体の少なく とも１種の前記有効量が少なくとも１μMの処置濃度を与える、請求項４０に記 載の医薬。 ４３． 前記一酸化炭素依存性グアニリルシクラーゼ修飾プリン誘導体の少なく とも１種が前記哺乳類に経口的に投与される請求項４０に記載の医薬。 ４４． 前記一酸化炭素依存性グアニリルシクラーゼ修飾プリン誘導体の少なく とも１種が前記哺乳類に注射により投与される請求項４０に記載の医薬。 ４５． 前記天然由来の遺伝的にコード化された分子の少なくとも１種が神経栄 養因子である請求項４０に記載の医薬。 ４６． 前記神経栄養因子がニューロトロフィンである請求項４５に記載の医薬 。 ４７． 前記神経栄養因子がプレイオトロフィンである請求項４５に記載の医薬 。 ４８． 前記神経栄養因子が、神経成長因子、線維芽細胞成長因子、ニューロト ロフィン−３、脳由来神経栄養因子、ニューロトロフィン−４／５毛様体神経栄 養因子、Ｓ１００Ｂおよびそれらの組合せからなる群から選択される請求項４５ に記載の医薬。 ４９． 哺乳類における天然由来の遺伝的にコード化された分子の生体内での遺 伝的な発現を選択的に誘導することによる、前記哺乳類における前記分子の少な くとも１種の、有効な直接投与のための医薬であって、前記哺乳類に対し、有効 量の一酸化炭素依存性グアニリルシクラーゼ修飾プリン誘導体の少なくとも１種 の工程を含む医薬。 ５０． 前記一酸化炭素依存性グアニリルシクラーゼ修飾プリン誘導体が、グア ノシン、４−［［３−（１，６−ジヒドロ−６−オキソ−９Ｈ−プリン−９−イ ル）−１−オキソ−プロピル］アミノ］安息香酸およびイノシンプラノベクスか らなる群から選択される、請求項４９に記載の医薬。 ５１． 前記一酸化炭素依存性グアニリルシクラーゼ修飾プリン誘導体の少なく とも１種の前記有効量が少なくとも１μMの処置濃度を与える、請求項４９に記 載の医薬。 ５２． 前記一酸化炭素依存性グアニリルシクラーゼ修飾プリン誘導体の少なく とも１種が前記哺乳類に経口的に投与される請求項４９に記載の医薬。 ５３． 前記一酸化炭素依存性グアニリルシクラーゼ修飾プリン誘導体の少なく とも１種が前記哺乳類に注射により投与される請求項４９に記載の医薬。 ５４． 前記天然由来の遺伝的にコード化された分子の少なくとも１種が神経栄 養因子である請求項４９に記載の 医薬。 ５５． 前記神経栄養因子がニューロトロフィンである請求項５４に記載の医薬 。 ５６． 前記神経栄養因子がプレイオトロフィンである請求項５４に記載の医薬 。 ５７． 前記神経栄養因子が、神経成長因子、線維芽細胞成長因子、ニューロト ロフィン−３、脳由来神経栄養因子、ニューロトロフィン−４／５毛様体神経栄 養因子、Ｓ１００Ｂおよびそれらの組合せからなる群から選択される請求項５４ に記載の医薬。 ５８． 天然由来の内因性抗酸化剤の少なくとも１種の生体内での生成を誘導す ることによる、酸化ストレスのよる細胞損傷に関係する哺乳類の病態の治療のた めの医薬であって、有効量の一酸化炭素依存性グアニリルシクラーゼ修飾プリン 誘導体の少なくとも１種の工程を含む医薬。 ５９． 前記一酸化炭素依存性グアニリルシクラーゼ修飾プリン誘導体が、グア ノシン、４−［［３−（１，６−ジヒドロ−６−オキソ−９Ｈ−プリン−９−イ ル）−１−オキソ−プロピル］アミノ］安息香酸およびイノシンプラノベクスか らなる群から選択される、請求項５８に記載の医薬。 ６０． 前記一酸化炭素依存性グアニリルシクラーゼ修飾プリン誘導体の少なく とも１種の前記有効量が少なくとも１μMの処置濃度を与える、請求項５８に記 載の医薬 。 ６１． 前記一酸化炭素依存性グアニリルシクラーゼ修飾プリン誘導体の少なく とも１種を経口的に投与するために形成される請求項５９に記載の医薬。 ６２． 前記一酸化炭素依存性グアニリルシクラーゼ修飾プリン誘導体の少なく とも１種を注射するために形成される請求項５９に記載の医薬。 ６３． 前記哺乳類の病態がアルツハイマー病および関連する変性障害である請 求項５８に記載の医薬。 ６４． 前記哺乳類の病態が老齢の良性の健忘症および関連する障害である請求 項５８に記載の医薬。 ６５． 前記哺乳類の病態が老化に関連するニューロンまたはニューロンの連結 性の損失に関するおよび関連する知覚、運動、反射または認識能力の衰退である 請求項５８に記載の医薬。 ６６． 前記哺乳類の病態がパーキンソン病および関連する障害である請求項５ ８に記載の医薬。 ６７． 前記哺乳類の病態が旧小脳萎縮である請求項５８に記載の医薬。 ６８． 前記哺乳類の病態が運動ニューロパシーまたは筋萎縮性側索硬化である 請求項５８に記載の医薬。 ６９． 前記哺乳類の病態が物理的因子によるニューロンまたはそれらの工程へ の損傷である請求項５８に記載の医薬。 ７０． 前記哺乳類の病態が虚血症、無酸素症、低酸素症 または低血糖症によるニューロンへの損傷である請求項５９に記載の医薬。 ７１． 前記哺乳類の病態が化学的因子によるニューロンへの損傷である請求項 ５８に記載の医薬。 ７２． 前記哺乳類の病態が心臓、脳または脊髄への外傷である請求項５８に記 載の医薬。 ７３． 前記哺乳類の病態がてんかんまたは痙攣である請求項５８に記載の医薬 。 ７４． 前記哺乳類の病態が末梢性ニューロパシーである請求項５８に記載の医 薬。 ７５． 前記哺乳類の病態が学習障害である請求項５８に記載の医薬。 ７６． 前記哺乳類の病態が脳性麻痺である請求項５８に記載の医薬。 ７７． 前記哺乳類の病態が精神医学的障害である請求項５８に記載の医薬。 ７８． 前記哺乳類の病態が記憶障害である請求項５８に記載の医薬。 ７９． 前記哺乳類の病態がハンチングトン病である請求項５８に記載の医薬。 ８０． 前記内因性抗酸化剤が胆汁色素である請求項５８に記載の医薬。 ８１． 前記胆汁色素がビリベルジンまたはビリルビンからなる群から選択され る請求項８０に記載の医薬。 ８２． 前記胆汁色素がヘムオキシゲナーゼによりヘムの 分解の工程によって生成される請求項８０に記載の医薬。 ８３． 哺乳類におけるヘムオキシゲナーゼの生体内での生成を誘導する医薬で あって、有効量の、一酸化炭素依存性グアニリルシクラーゼ修飾プリン誘導体の 少なくとも１種を含む医薬。 ８４． 前記一酸化炭素依存性グアニリルシクラーゼ修飾プリン誘導体が、グア ノシン、４−［［３−（１，６−ジヒドロ−６−オキソ−９Ｈ−プリン−９−イ ル）−１−オキソ−プロピル］アミノ］安息香酸およびイノシンプラノベクスか らなる群から選択される、請求項８３に記載の医薬。 ８５． 前記一酸化炭素依存性グアニリルシクラーゼ修飾プリン誘導体の少なく とも１種の前記有効量が少なくとも１μMの処置濃度を与える、請求項８３に記 載の医薬。 ８６． 前記一酸化炭素依存性グアニリルシクラーゼ修飾プリン誘導体の少なく とも１種を経口的に投与するために形成される請求項８４に記載の医薬。 ８７． 前記一酸化炭素依存性グアニリルシクラーゼ修飾プリン誘導体の少なく とも１種を注射するために形成される請求項８４に記載の医薬。 ８８． 胆汁色素および一酸化炭素を内因的に生じさせるために、前記ヘムオキ シゲナーゼによる前記哺乳類におけるヘムの分解を誘導する請求項８３に記載の 医薬。 ８９． 前記医薬が前記内因的に生成する一酸化炭素によって前記哺乳類におけ るグアニリルシクラーゼを修飾する請求項８８に記載の医薬。 ９０． 前記医薬が前記内因的に生成する胆汁色素によって前記哺乳類における フリーラジカルを中和または封鎖する請求項８８に記載の医薬。 ９１． 前記医薬が前記内因的に生成する一酸化炭素によって前記哺乳類の血圧 の低下を誘導する請求項８８に記載の医薬。