HUT74846A - Method of stimulating hematopoiesis with hemoglobin - Google Patents

Description

A HEMATOPOIEZIS HEMOGLOBINNAL VALÓ STIMULÁLÁSÁRA SZOLGÁLÓ

MÓDSZER

Ez a szabadalmi leírás az 1994 március 8-án iktatott

08/208,740 sorozatszámú Rosenthal és Gerber féle szabadalom folytatólagos része.

A TALÁLMÁNY TERÜLETE

A jelen találmány egy olyan új módszerrel kapcsolatos, melynek révén a hematopoiezis hemoglobin megfelelő mennyiségének adagolásával stimulálható.

A TALÁLMÁNY HÁTTERE

A hematopoiezis a vérsejt termelés olyan folyamata, mely a csontvelőben történik. A csontvelőben a törzs sejtek a keringő vérben található összes eltérő sejt típus őssejtjei. Ezek a • · • ·

I

törzs sejtek funkcionálisan a letálisan besugárzott állatok esetében a hosszútávú hematopoietikus sejt vonalak újra benépesítési kapacitásuk alapján definiálhatók (Nicola, N.A. (1993) in Application of Basic Science to Hematopoiesis and the Treatment of Desease, E.D. Thomas and S.K. Carter (ed), Révén press, NY). Szabályozó folyamatok komplex sorozatán keresztül a törzs sejtek különböző sejt típusokká differenciálódnak, ideértve legalább a vörösvérsejteket, a leukocitákat, a limfocitákat, a vérlemezkéket (thrombocitákat), a monocitákat, a makrofágokat, a hízósejteket, a basophil sejteket, az eozinofil sejteket, a B-limfocitákat és a T-limfocitákat. Az egyes új vérsejt típusok milliói termelődnek naponta és szabadulnak be a vérkeringésbe az elpusztult vérsejtek helyettesítésére és a homeosztázis fenntartása céljából (Náthán, D.G. (1992) in Cecil Textbook of MEdicine, J.B.

Wyngaarden, L.H. Smith and J.C. Bennett ed., W.B. Saunders Co, Philadelphia, 817-836).

A különböző sejt típusok termelése módosítható exogén stimulusra, például fertőzésre vagy vér veszteségre való válaszként.

Például, fertőzés során a fehérvérsejtek a perifériás raktárakból mobilizálódnak, például az érfalak szélei mentén (ez az úgy nevezett demarginalizáció folyamata) és van egy ezzel együtt járó leukocita termelés növekedés a csontvelőben (Bagby, G.C. (1992) in Cecil Textbook of Medicine, J.B. Wyngaarden, L.H. Smith and J.C. Bennett, ed.,

W.B. Saunders Co., Philadelphia, 914-920). Az akut vérvesztés, mint például, a menstruáció, a trauma, vagy a sebészeti vér veszteség olyan anémiát eredményezhet, ahol a vér vörösvértest, hemoglobin vagy teljes térfogat (hematokrit kisebb mint 40 %,

hemoglobin kisebb 12 g/dl, vörösvértest kisebb mint 4 x 10⁶/μ1 vagy az átlag sejt térfogat kisebb mint 80 fi; Náthán, D.G. (1992) in Cecil Textbook of Medicine, J.B. Wyngaarden, L.H. Smith and J.C. Bennett, ed., W.B. Saunders Co. , Philadelphia, 817-836) hiányos lesz. A vörösvértest tömeg (összes vörös vérsejt, vagy a teljes szám, vagy a teljes térfogat) egy olyan szervként működik, ami a szövetekhez szállítja az oxigént. A vörösvértest tömeg és a vörösvértest termelés sebessége szorosan összefügg a test szöveteinek oxigén ellátottságával és igényével. A vörösvértest termelést az oxigén alacsony szövet nyomása (tenziója) stimulálja. Az anemiás körülmények a szövetek csökkent oxigén szintjéből adódnak (hypoxia). A vesében a hypoxiát a vese parenchima érzékeli, ami az erithropoietin veséből való felszabadulását stimulálja. Az erithropoietin az erithropoiesis fő szabályozó hormonja, ami a vörösvértest tömeg megváltozásából adódó hipoxiára adott válaszként termelődik (Erslev, A.J. (1990) in Heamtology, W.J. Williams, E. Beutler, A.J. Erslev and M.A. Lichtman eds, McGraw-Hill inc. new York, 389-407) .

A specifikus keringő sejt típusok egyéb hiánya szintén bekövetkezhet. A leukopenia - egy olyan általános fogalom, ami a különböző leukocita sejt populációk számában bekövetkező csökkenést ír le - ami a demarginációs folyamat valamint az őssejt csontvelő sejtvonalakból differenciálódott sejtek kicserélődésének sebessége elválásának eredménye (Bagby, G.C. (1992) in Cecil Textbook of Medicine, J.B. Wyngaarden, L.H. Smith and J.C. Bennett, ed., W.B. Saunders Co. , Philadelphia, 914-920) . A neutropenia - a keringő neutrofil sejtek 2 x 10⁹ sejt/liter érték alá való csökkenése - a súlyos bakteriális • · · · · · · • ··· ·· · · · ···· ·· ·· ···· ·· fertőzések jelentősen megnövekedett rizikóját eredményezi

Textbook of Medicine, J.B.

Wyngaarden, L.H. Smith and J.C.

Bennett, ed., W.B.

Saunders

Co., Philadelphia, 907-914). A thrombocitopeniák a keringő vérlemezkék megközelítően 100000 vérlemezke/μΐ érték alá való csökkenésként definiálhatók (Scuman,M. (1992) in Cecil

Textbook of Medicine, J.B. Wyngaarden, L.H. Smith and J.C. Bennett, ed.,

W.B. Saunders Co., vérlemezkék alacsony száma számos olyan körülmény eredménye lehet, mint például a csontvelő sérülés, a kemotoxikus anyagok használata, a csontvelő kemoterápiás vagy radioterápiás anyagokkal való gátlása, nehéz fém mérgezés, a hemolitikus uremiás szindróma, HÍV fertőzés, tuberkolózis, aplasztikus anémia, thrombotikus thrombocitpoeniás purpura és immun rendellenességek, mint például az idiopatikus thrombocitopeniás purpura, a leukémiák és a mielofibrosis. Ezek a thrombocitopéniák életveszélyes, szabályozhatatlan vérzéseket eredményezhetnek (Shuman,M. (1992) in Cecil Textbook of

Medicine, J.B. Wyngaarden, L.H. Smith and J.C. Bennett, ed.,

W.B. Saunders Co., Philadelphia, 987-999).

A hematopoiesis ezen zavarai a csontvelő differenciálódás ami újra biztosítja a hiányos sejt populációt. Azonban, a hematopoiesis néhány zavara olyan súlyos, hogy terápiás beavatkozást tesz szükségessé.

A citopeniák (bármely adott vérsejt típus keringő populációjának csökkenése) széles köre csupán egy korlátozott számú terápiás körülménnyel kezelhető. Például a kezelése általában az alapul szolgáló, neutropéniát neutropenia eredményező • ·· · betegség állapot kezelésére korlátozódik. Az ilyen betegségek közé tartozik a Felty-féle szindróma, a myelodysplasia (gerincfejlődlsi zavar), a hypersplenia (fokozott lépműködés), bizonyos rák betegségek, és olyan csontvelő átmenet, ami például a toxikus kemoterápiás gyógyszerekből vagy toxinokből erednek. Van néhány kezelés, amit specifikusan a vérben levő neutrofil sejtek számának növelésére terveztek Ezen kezelések közé tartoznak a:

1) a lítium karbonátos kezelés, bár úgy tűnik ez jelentős toxicitással rendelkezik;

2) az immunogátlásos terápia, tipikusan olyan betegek esetére tartalékolják, akiknek neutropeniája egy autoimmunológiai úton közvetített neutrofil leépülés eredménye;

3) a csontvelő átültetés, mely bár hatékony, ha sikeres, jelentős halálozással jár;

és

4) a neutrofil transzfúzió, mely költséges lehet és kevésbé hatékony, hacsak nem tartják fenn jelentősebb ideig, a véráramban levő neutrofil sejtek nagyon rövid felezési ideje miatt (Káplán, M.E. (1992) in Cecil Textbook of Medicine, J.B. Wyngaarden, L.H. Smith and J.C. Bennett, ed., W.B. Saunders Co., Philadelphia, 907-914).

• · • · · · • · · • ·

A thrombocitopenia kezelése tipikusan vérlemezkék infúzióját jelenti. A vérlemezke infúzió, mint bármilyen humán eredetű ismételt vér készítmény infúziója jelentős kockázatot jelent a anyagok transzmissziójával. Továbbá, a vérlemezkék transzfúziója a többszörös alloantátestek képződését okozhatja, melyek nem csupán a transzfúzionált vérlemezkék lebontását eredményezi, hanem a beteg endogén thrombocita polpulációjának lebomlását is.

Az anémiák megoldhatók az anémiák okainak kezelésével, mint például a vese problémák, máj betegségek, az endokrin rendellenességek, a parvovírus,

Epstein-Barr vírus vagy a hepatitis C vírus kezelésével.

Azonban vörösvértestek közvetlen képződése korlátozott számú gyógyszerészeti készítménnyel stimulálható. A kezelések közé tartoznak a vas, hemin (vas forrás) vagy erithropoietin természetesen előforduló vagy rekombinánsan termelt hematopoietikus növekedési faktor alkalmazása. A vas vagy hemin terápia hatékonysága korlátozott ezen készítményekben a vas gyenge bioelérhetöségének következtében, valamint az erithropoiesis fokozásához szükséges magas dózisok toxicitása miatt. Továbbá, a vas terápia nem hasznos olyan anémiák esetében, melyek nem csupán az egyszerű vas hiány következményei. Az erithropoietin terápia azért korlátozott, mert nem bizonyul hatékonynak az endogén vas raktárak mobilizálásában valamint csupán az erithroid ős sejtek termelését fokozza.

Ezen vas tartalékok mobilizálása nélkül az erithropoiesis nem tartható fenn.

Például a rekombináns erithropoietin rendszeres adagolása krónikus vese elégtelenség által indukált anémiás, dialízises betegeknek fenntartott erithropoiesist és megnövekedett

hematokrit értéket eredményez. Azonban ebben az esetben a továbbra is fenntartott erithropoiesis gyakran vezet olyan vas hiányhoz, ami korlátozhatja ezen kezelési körülmény hosszútávú hatékonyságát (Grützmacher, P. (1992) Clin. Nephrol. 38 S92S97) .

A legígéretesebb terápiás körülmény számos citopenia kezelésében a hematopoietikus növekedési faktorok alkalmazása köré összpontosul. A neutropenia kezelésre került GM-CSF vagy G-CSF (sorrendben granulocita-makrofág telep stimuláló faktor és granulocita stimuláló faktor) alkalmazásával. Ahogy korábban tárgyaltuk, a krónikus vese eleégtelenség esetén fellépő anémiát erithropoietinnel kezeljük.

Azonban, a hematopoietikus rendszer komplex; a fenntartott, fokozott hematopoiesis a növekedési faktorok, inhibitorok és receptorok közötti komplex kölcsönhatásokat jelent. Ezideig, integy 20 növekedési faktort ismerünk (Nicola, N.A. (1993) in Application os Basic Science to Hematopoiesis and the Treatment os Desease, E.D. Thomas and S.K. carter Oed) , Raven Press, NY) . Ezek közé tartoznak a Granulocytemacrophage Colony Stimulating Factor (Granulocita-Makrofág

Telep Stimuláló Faktor; GM-CSF), a Macrophage Colony Stimulating Factor (Makrofág Telep Stimuláló Faktor; M-CSF), a

Granulocyte Colony Stimulating Factor (Granulocita

Telep

Stimuláló Faktor; G-CSF), a Stem Cell

Sej t az

Interleukin

1-13 (IL-1

IL-7; [Quesenberry, in

Hematology,

W. J.

Williams, E. Beutler, A.J.

Erslev and M.A.

Lichtmad Oeds),

McGraw-Hill, Inc. New York, 129-147; Nicola, N.A. (1993) in

Application os Basic Science to Hematopoiesis and the Treatment os Desease, E.D. Thomas and S.K. Carter (ed), Raven Press, NY) .

Ezen növekedési faktorok közül sokat klónoztak és rekombináns módon expresszáltak. Ezek közé tartoznak a G-CSF (Souza, L.M., 4,810,643 számú US szabadalom), az M-CSF (Clark, S.C. and Wong, G.G., 4,868,119 számú US szabadalom) az IL-3 (Blasdale, J.H.C. 355093 számú EP) , az erithropoietin (Lin, 4,703,008 számú US szabadalom), a törzs sejt faktor (Zsebo K.M. et al., PCT/US90/05548 számú szabadalom) és a GM-CSF (Deeley M. et al. , 5,023,676 számú US szabdalaom) . Ezek magukban vagy kombinációkban való alkalmazása szignifikáns hematopoiesist eredményez in vitro és in vivő is (Mertelsmann, R.H. (1993) in Application os Basic Science to Hematopoiesis and the Treatment os Desease, E.D. Thomas and S.K. Carter (ed), Raven Press, NY; Williams 5,032,396 számú US szabadalom; Zsebo et al. , PCT/US90/05548; Gillis, S. 5,199,942 számú US szabadalom; Donahue, R.E. 5,198,417 számú US szabadalom). Ezen növekedési faktorok közül az erithropoietin szokatlan abban, hogy olyan hematopoietikus szabályozóként működik, mely szelektív egy sejtvonalra, a vörösvérsejt vonalra. A legtöbb hematopoietikus növekedési faktor nem specifikus és különböző mértékig többféle hematopoieteikus sejvonalra van hatással. A legtöbb hematopoieteikus növekedési faktor a test több helyén termelődik és közülük sok lokálisan hat és ritkán található meg a vérkeringésben (Nicola, N.A. (1993) in Application os Basic Science to Hematopoiesis and the Treatment os Desease, E.D. Thomas and S.K. Carter (ed) , Raven Press, NY) . A hematopoieteikus növekedési faktorok rendkívül kis mennyiségben vannak jelen és nehéz ezeket detektálni a mesterséges tenyész rendszerekben és kondicionált tápközegben való detektálást kivéve. Azonkívül, a hematopoieteikus növekedési faktorok kizárólag a hematopoieteikus sejtvonalak növekedésének és/vagy differenciálódásának módosítására hatnak. A jelen találmány leírói meglepetésre azt találták, hogy a hemoglobin, melynek fő funkciója az oxigén testben való szállítása, és mely nagy koncentrációban található a vörösvérsejtekben, ha tisztítják és kis dózisokban alkalmazzák hematopoieteikus növekedési faktorként működik.

Korábbi felfedezők azt sugallták, hogy a hematopoietezis stimulálódott a sejtmentes hemoglobin alkalmazása után (Hooper et al. , (1920) Am. J. Physiol 53:263-282; Naswitis, K. (1922) Dtsch. med. Wohenschrift 48:187-188; Furukawa, K. (1922) Kiin. Wohenschrift 1:723-725; Amberson (1937) Bioi Revs. 12:48-86; Ferrari, R. (1932) Arch. Sci. Biologishe 27:25-40; Hawkins and Johnson (1939) Am. J. Physiol. 126:326-336) . Ezek a felfedezők azt állították, hogy a lizált vörösvérsejtekből felszabadított hemoglobin primer hematopoieteikus faktor, mely az erithropoiesis fokozásáért felelős vagy a hematopoieteikus szövetre való közvetlen hatása miatt vagy az erithropoiezishez szükséges bizonyos anyagok szolgáltatásán keresztül, vagy mindkét hatása révén (Amberson (1937) Bioi. Revs. 12:48-86 és az ebben közölt hivatkozások). Amberson és munkatársai (1949,

J. Appl. Physiol 1:469-489) később azt figyelték meg, hogy a nyers hemoglobin oldat alkalmazása után 5 betegből 3-ben megnőtt a retikulociták száma és a hematokrit érték (mindkettő az erithropoiesis indikátora). Azonban korai vizsgálatokban felhasznált nyers hemoglobin alkalmazása vese károsodást, anaphylaxiát okozott és halálhoz vezethetett (Amberson et al. , (1949) J. Appl. Physiol. 1: 469-489) . A hemoglobin adagolás ezen toxikus hatásai az olyan szennyező anyagoknak, mint az sztoma, vagy a hemoglobin készítményekben levő endotoxinoknak köszönhető, vagy magának a hemoglobin természetének (DeVenuto et al . , (1979) Surg. Gyn. Obstet. 149:417-436; Sunder-Plassmann et al. , (1975) Europ. J. Intensive Care Med. 1: 37-42; Feola et al. , (1990) Biomat. Art. Cell. Art. Org. 18:233-249). A kezeletlen humán hemoglobin tetramer két alfa alegységből és két béta alegységből áll. A tetramer, ha a vörösvértesten kívül van két alfa/beta dimerre disszociál, melyek a vesébe tudnak jutni és vese elégtelenséget okoznak magasabb dózisokban. Bármelyik keresztkötés nélküli hemoglobin, még akkor is, ha alacsony dózisokban alkalmazzák, nagyon gyorsan, percek alatt kiürül a testből. A gyengén tisztított vörösvértest készítményekből származó sztróma anaphylaxist okoz. így, bár bizonyítékok álltak rendelkezésre azt tekintve, hogy a hemoglobin adagolás erithropoiezist eredményezhet, nincs olyan hemoglobin oldat, mely biztonságosan és hatékonyan alkalmazható lenne.

A nyers hemoglobin oldatok alkalmazása során bekövetkező erithropoiezis fokozása egybeesik azzal a megfigyeléssel, hogy a hemolízisnek köszönhető anémia egy sokkal hangsúlyozottabb erithroid hyperplasiával és retikulocytosisszal kapcsolatos, mint az ugyanilyen nagyságrendű vérveszteségi anémia (Erslev, A.J. (1990) in Hematology, W.J. Williams, E. Beutler, A.J. Erslev and M.A. Lichtmad (eds) , McGraw-Hill, Inc. New Yoerk, 389-407) .

Az 1970-es évek végén a laboratóriumokban végzett munka azt mutatta, hogy az egér erithroleukémia sejtek valamint a normális csontvelő sejtek heminnel való kezelése ílte a transzkripciós szinten a hemoglobin szintézisét (Rosí ancL

Sautner, D.

(1976) cell 8:513; Dabney, B.J.

and Beaut A.L.

(1977) Arch. Biochem. Biophys. 179:106;

Porter, P.N. al., (1979) Exp. Hematol. 7:11) . A hemin az oxidált hem kloisója, míg a hemoglobin redukált hemet tartalmaz az egyesjlobin alegységek hem-zsebében. Még később, Monette és munkatsainak munkája azt mutatta, hogy a hemin szinergikusan .t az interleukin-3-mai az erithroid ős sejtek nővektsének elősegítésében in vitro és in vivő (egerekben). Számos nkában (Holdén,

S.AA. et

Exp. Hematol. 11:5-960;

Monette,

F.C. et al.,

Exp .

Hematol. 12:782-787; Mette,

F.C. and

Sigounas,

G.

Exp.

Hematol. 16:727-729; Miette,

Ann.

NY

Acad.

Sci .

554:49-58) Monette vi&gosan bemutatta a hemin azon képességét, hogy közvetlenül növeli sejt specifikus módon a primitív csontvelő erithroid őssejtek:

szaporodását és differenciálódását. Kappas és Abraham szintén, megfigyelték az erithroid őssejtek növekedésének lehetővé tételét hemin adagolásával in vivő (PCT közzététel· PCT/US91/05283) . Azonban, ezen kutatók egyike sem vizsgálta, vagy feltételezte a szabad hemoglobin szerepét az erithropoiesis stimulálásában, ezenkívül egyik vizsgálat sem sugallja azt, hogy maga a hemoglobin erithropoietikus hatású lenne a biológiailag elérhető vas egyszerű biztosításán felül.

Valójában, a hemoglobin erithropoietikus hatása csupán akkor figyelhető meg, ha nagyon nagy mennyiségű hemoglobin kerül felhasználásra. Például Feola et al (1992) Surg. Gyn. Obstet 174:379-386) szarvasmarha hemoglobin oldat (a beteg teljes vér térfogatának 25 %-a, megközelítően 17-35 g szarvasmarha hemoglobin, vagy 1,75 g hemoglobin/kg testsúly) nagy mennyiségét alkalmazta sarlósejtes gyermekek esetében a vaso-occlusive vagy aplastikus krízisben. A kilenc beteg ezen csoportjában - 5 - 13 évesek - a perifériás retikulociták száma 3,7 + 3,9 % értékről 49 + 6,5 % értékre nőtt 3 nap után és a vér hemoglobin 6,34 ± 2,0 g/dl értékről 10,6 ± 1,3 g/dl értékre nőtt 1 hét után. Azonban Feola és munkatársai antibiotikumokat és malária elleni szereket is alkalmaztak a hemoglobin kezeléssel egyidejűleg és a kérdéses fertőzések közvetítése magában erithropoiezist eredményezhetett. Továbbá, bármelyik hemoglobin ilyen nagy mennyiségben való alkalmazása különösen a nem humán eredetű szarvasmarha hemoglobin alkalmazása váratlan és nem kívánatos immunológiai hatást eredményezhet. Feola és munkatársai megállapították, hogy további vizsgálatokra van szükség annak meghatározásához, hogy vajon immunológiai reakciók kialakulnak-e a szarvasmarha eredetű hemoglobin oldat ismételt alkalmazása következtében. A hemoglobin magas dózisban való alkalmazása egyszerűen biológiailag elérhető vas forrásként szolgálhat és így szignifikánsan nem tér el az anémia egyszerű vassal való kezelésétől. A jelen találmány leírói meglepően azt találták, hogy egy rekombináns hemoglobin alacsony dóziban való alkalmazása szintén hematopoiezist eredményez.

A TALÁLMÁNY ÖSSZEFOGLALÁSA

A jelen találmány a hematopoiezis emlősökben való stimulálására szolgáló módszerrel kapcsolatos, mely a hemoglobin terápiás szempontból hatékony mennyiségének alkalmazását foglalja magába. Előnyösen a hemoglobin terápiás szempontból hatékony mennyisége alacsony dózisú hemoglobint jelent, előnyösen 1 g hemoglobin/kg testsúly értéknél kisebb mennyiséget, még előnyösebben 100 mg hemoglobin/kg testsúly értéknél kisebb mennyiséget és legelőnyösebben körülbelül 10 mg hemoglobin/kg testsúly mennyiséget jelent.

A jelen találmány emlősökben a hematopoiezis stimulálását biztosítja oly módon, hogy egy hemoglobin tiszta oldatát - , előnyösen rekombináns technológából származó hemoglobin oldatát, még előnyösebben egy hemoglobin E. coli-val történő expressziójából származó hemoglobin oldatát, legelőnyösebben egy olyan mutációt tartalmazó hemoglobin oldatát, melyben a hemoglobin tetramer két alfa vagy két béta vagy bármely alfa vagy bármely béta alegysége kapcsolódik - alkalmazzuk.

A találmány egy megvalósulásában a jelen találmány egy cytopeniában szenvedő emlős kezelésével kapcsolatos, mely kezelés a hemoglobin egy hatékony mennyiségének adagolásával a hematopoiezis stimulálását foglalja magába.

A találmány egy további megvalósulása egy anémiában vagy egy anemia-szerű állapotban szenvedő emlős kezelésével kapcsolatos, mely kezelés a hemoglobin egy hatékony mennyiségének adagolásával a hematopoiezis stimulálását foglalja magába.

A találmány egy másik megvalósulása a hemoglobin egy hatékony mennyiségének adagolásával a hematopoiezis vagy egy cytopenia kezelésének stimulálását foglalja magába más hematopoieteikus növekedési faktorok együttes alaklamzásával, ideértve az ezekre való korlátozás nélkül az erithropoietint, a csont morfogenikus proteinjét (BMP), a vérlemezke eredetű növekedési faktort (PDGF), az interleukineket, mint az IL-3 vagy az IL-11, a telep stimuláló faktorokat, mint a G-CSF vagy a GM-CSF vagy a törzs sejt faktort.

A találmány egy további megvalósulása egy cachexiában szenvedő emlős kezelésével kapcsolatos, mely kezelés a hemoglobin egy hatékony mennyiségének magában való adagolásával vagy más hematopoieteikus növekedési faktorokkal való együttes alkalmazásával valósul meg.

A jelen találmány egy további megvalósulása hemoglobin egy hatékony mennyiségének magában való adagolását vagy más hematopoieteikus növekedési faktorokkal való együttes alkalmazását jelenti a kemoterápiás vagy radioterápiás kezelési körülmények lehetővé tétele céljából a rákos sejtek növekedésének fokozásával és így a rákos sejtek kemo- vagy radioterápiás sebezhetőségének fokozásával.

A jelen találmány egy további megvalósulása a hemoglobin sejt tenyésztő tápközeg adalékaként való használatát foglalja magába, mely tápközeget az őssejt törzs sejtek vagy vérsejtek ex vivő expnaziójára használunk.

A jelen találmány egy további megvalósulása a hemoglobin erithroid őssejtek szaporodásának fokozására szolgáló tenyésztépközeg adalékaként való használatát foglalja magába.

A jelen találmány egy megint más megvalósulásában a hemoglobin más hematopoieteikus faktorokkal való együttes alkalmazását foglalja magába, a vér alkotók ex vivő expanziój ának fokozására szolgáló sejt tenyésztő tápközeg adalékaként.

A jelen találmány egy megint más megvalósulásában a hemoglobin más hematopoieteikus faktorokkal való együttes alkalmazását foglalja magába, a hematopoieteikus ossej tek szaporodásának fokozására szolgáló sejt tenyésztő tápközeg adalékaként.

A jelen találmány egy megint más megvalósulásában a hemoglobint magában vagy más növekedési faktorokkal együtt használjuk a hematopoiezis stimulálására csontvelő sérülést követően.

A jelen találmány egy további megvalósulásában a hemoglobint magában vagy más növekedési faktorokkal együtt alkalmazzuk egy anémiában stimulálására.

A jelen találmány egy másik fontos megvalósulása egy olyan gyógyszerészeti készítmény, mely a jelen találmány módszerében hasznos, és mely gyógyszerészeti készítmény a hemoglobin egy hatékony mennyiségét foglalja magába.

A találmány más jellemzői és előnyei az előnyben részesített megvalósulások leírásából valamint az igénypontokból leszenk egyértelműek.

Hacsak másként nem definiáljuk, a találmányban használt technikai és tudományos szakkifejezések a tudomány e területén átlagosan képzett szakember által általában elfogadott jelentéssel bírnak. Bár bármilyen az itt leírtakhoz hasonló vagy azokkal megegyező módszerek és anyagok felhasználhatók a gyakorlatban vagy a jelen találmány tesztelésében, leírásra az előnyben részesített módszerek kerülnek. Hacsak másként nem jeleztük, az alkalmazott vagy tervezett technikák a tudomány e területén átlagosan képzett szakember ismeretén belüli standard módszereket jelentenek. Az anyagok, módszerek és a példák a találmány illusztrálására és nem korlátozására szolgálnak.

A hematopoiezis a jelen találmány céljaira egy olyan általános fogalmat jelöl, ami az őssejtekből történő vérsejtek képződésének és fejlődésének folyamatára, valamint az ezen vérsejtek őssejtjeinek keletkezésére utal. A vérsejtek közé tartoznak az ezekre való korlátozás nélkül az erithrociták, a retikulociták, a monociták, a neutrofil sejtek, a megakariociták, az eozinofil sejtek, a bazofil sejtek, a fisejtek, a makrofágok, a granulociták, a hízósejtek, a thrombociták és a leukociták. Az őssejtek közé tartoznak az ezekre való korlátozás nélkül a sarj-képző egységek (burstforming units) -erithroid (BFU-E), a telep képző egységek erithroid (CFU-E), a telep-képző egységek-megakariocita (CFUMeg) a telep-képző egységek-granulocita-makrofág (CFU-GM), a telep-képző egységek-makrofág (CFU-M), a telep-képző egységekgranulocita (CFU-G), a telep-képző egységek-granulocita, erithroid,makrofág,megakariocita (CFU-GEMM), a telep-képző egységek-monocita (CFU-M), a telep-képző egységek-eozinofil (CFU-Eo), a telep-képző egységek-lép (CFU-S), a telep-képző egységek-bazofil (CFU-B), pluripotens törzs sejtek, totipotens törzs sejtek, mieloid törzs sejtek és a limfoid törzs sejtek.

····

A találmány csatolt igénypontjai szerinti használatban az erithropoiezis a hematopoieteikus reakcióút olyan szakaszára vonatkozik, mely a vörösvértestek képződéséhez vezet.

A találmány csatolt igénypontjai szerinti használatban a thrombopoiezis kifejezés a hematopoieteikus reakcióút azon szakaszára vonatkozik, mely a thrombociták kialakulásához vezet.

A találmány csatolt igénypontjai szerinti használatban a leukopoiezis a hematopoieteikus reakcióút azon szakaszára vonatkozik, mely a leukociták képződéséhez vezet.

A vérkeringés más sejtjeinek képződési folyamatát analóg módon határozzuk meg, és a poiezis vagy poietikus végződéssel különböztetjük meg.

A találmány csatolt igénypontjai szerinti használatban a hemoglobin hatékony mennyisége kifejezés a természetes eredetű, vagy rekombináns módon termelt hemoglobin azon mennyisége, mely egy hiányos vérsejtekre vagy vérsejtek egy sejttenyészetével való kezelésre igényt tartó emlősnek való adagoláskor megfelelő mennyiséget jelent a vérsejtek vagy az őssejtek számának növeléséhez. Az őssejtek számának növekedése az adott térfogat szerinti teljes sejtszám növekedést jelentheti és például egy sejt tenyészetben az ilyen növekedés a kérdéses telep-képző egységben bekövetkező növekedés statisztikailag szignifikáns növekedésével mérhető. Másrészt viszont, a vérkeringésben egy ilyen növekedés a teljes sejtszámban bekövetkező növekedést, az egyes sejtek méretében bekövetkező növekedést, vagy specifikusan az erithroid sejtek esetében az egyes sejtek hemoglobin tartalmában bekövetkezett növekedést jelenthet. Például, az erithroid sejtek esetében ez

···· előtti mért értéke) feletti a növekedés az alapvonal szint (a vagy koncentrációjának kezelés legalább 6 %-ot, előnyösebben az alapvonal feletti 10 %-ot, és még előnyösebben az alapvonal feletti 20 %-ot, legelőnyösebben alapj ában véve az in vivő normál szintekre való növekedést j elent. Az sej t tenyészetek esetében (például ex vivő expanzió, sej ttenyészet, sejtek abszolút számának növekedését, a specifikus sejtek méretének növekedését, vagy a sej ttenyészetben szaporodó sejtek szaporodási sebességében bekövetkező növekedést jelenthet. Ezek a növekedések a hemoglobin alkalmazását követő is bekövetkezhetnek, azonban igénybe vehet ismételt és/vagy folyamatos terápiás hemoglobin egy napon belül több hónapos adagolást is. A hematopoiezis fokozásához szükséges hemoglobin mennyiségeket az átlagos képzettségű klinikusa könnyen meghatározza és függ a cytopeniás állapottól, az egyén jellemzőitől, az alkalmazás módjától és más hasonlóktól.

A cytopeniás állapot vagy a cytopenia bármely keringő vérsejt típus számában, térfogatában, működésében vagy megoszlásában bekövetkező klinikailag szignifikáns csökkenésként kerül meghatározásra. A cytopenia legalább az anémiát, a throbocytopeniát, a neutropeniát és a leukopeniát foglalja magába.

A cachexia általános súlycsökkenést és olyan leromlást foglal magába, mely krónikus betegségek lefolyása során, a króniukus betegségek kezelésére használt kemoterápia vagy radioterápia toxikus hatásainak (az ilyen toxikus hatások például a 3¹-azido-3¹-dezoxitimidin (AZT) toxikus hatása, vagy

··· a rákos állapot kezelésére használt radioterápia hatása) vagy érzelmi zavarok eredményeként következik be.

AZ ÁBRÁK LEÍRÁSA

Az 1. ábra a normál BDF1 rágcsáló csontvelő 0,01, 1 és 10 μΜ AZT jelenlétében szaporított tenyészetéhez való 1 μΜ, 0,01 μΜ vagy 0,1 nN hemoglobin hozzáadása után 10 nappal a sejttenyészetben számolt BFU-E telepek számát mutatja.

A 2. ábra a SCID (Severely Compromised Immunodéticient Disorder) egér csontvelő sejtek 0,4 U/ml EPO és/vagy 0,01 μΜ AZT jelenlétében szaporított sejttenyészetében a BFU-E telepek számát mutatja egyszer hemoglobin hozzáadása nélkül, majd 10 nappal 1 μΜ hemoglobin hozzáadása után.

A 3. ábra a humán csontvelő 0,01, 0,1, 1 és 10 μΜ AZT jelenlétében szaporított tenyészetéhez való 1 μΜ, 0,01 μΜ vagy 0,1 nM hemoglobin hozzáadása után 10 nappal a sejttenyészetben számolt BFU-E telepek számát mutatja.

A 4. ábra három héttel a következőkkel:

(1) nincs kezelés, jelölés: kontrol, (2) orális AZT, jelölés: AZT, (3) orális AZT és 10 egység EPO heti háromszori szubkután injektálása, jelölés: AZT + EPO, (4) orális AZT és 0,5 mg/kg hemoglobin heti háromszori intravénás injektálása, jelölés: AZT + 0,5 mg/kg Hb, (5) orális AZT és 1 mg/kg hemoglobin heti háromszori intravénás injektálása, jelölés: AZT + 1 mg/kg Hb, (6) orális AZT, 10 egység EPO heti háromszori szubkután injektálása és 0,5 mg/kg hemoglobin heti háromszori intravénás injektálása, jelölés: AZT + EPO + 0,5 mg/kg Hb, (7) orális AZT, 10 egység EPO heti háromszori szubkután injektálása és 1 mg/kg hemoglobin heti háromszori intravénás injektálása, jelölése: AZT + EPO + 1 mg/kg Hb való kezelés után BDF1 egerekben a Burst Forming Units-Erythroid (BFU-E) grafikus bemutatását adja.

Az AZT-t a kontrol állatokat kivéve az összes egér megkapja 5 hetes időtartamig a megfelelő AZT hatás biztosítására végzett kísérletek előtt.

Az 5. ábra a normál BDF1 egerek hematokrit (százalékos) értékét mutatja a következők alkalmazása után:

(1) nincs kezelés, jelölés: kontrol, (2) orális AZT, jelölés: AZT, (3) orális AZT és 10 egység EPO heti háromszori szubkután injektálása, jelölés: AZT + EPO, (4) orális AZT és 0,5 mg/kg hemoglobin heti háromszori intravénás injektálása, jelölés: AZT + 0,5 mg/kg Hb, (5) orális AZT és 1 mg/kg hemoglobin heti háromszori intravénás injektálása, jelölés: AZT + 1 mg/kg Hb, (6) orális AZT, 10 egység EPO heti háromszori szubkután injektálása és 0,5 mg/kg hemoglobin heti háromszori intravénás injektálása, jelölés: AZT + EPO +0,5 mg/kg Hb,

···· (7) orális AZT, 10 egység EPO heti háromszori szubkután injektálása és 1 mg/kg hemoglobin heti háromszori intravénás injektálása, jelölés: AZT + EPO + 1 mg/kg Hb.

Az AZT-t a kontrol állatokat kivéve az összes egér megkapja 5 hetes időtartamig a megfelelő AZT hatás biztosítására végzett kísérletek előtt.

A 6. ábra a sejtszámok grafikus ábrázolását mutatja normál BDF1 egerek esetében. A fehér vérsejt számot sötét árnyalatú területtel, a vörösvértest számot csíkozott területtel ábrázoljuk. A sejteket a következő kezelések után három héttel számolj uk:

(1) nincs kezelés, jelölés: kontrol, (2) orális AZT, jelölés: AZT, (3) orális AZT és 10 egység EPO heti háromszori szubkután injektálása, jelölés: AZT + EPO, (4) orális AZT és 0,5 mg/kg hemoglobin heti háromszori intravénás injektálása, jelölés: AZT +0,5 mg/kg Hb, (5) orális AZT és 1 mg/kg hemoglobin heti háromszori intravénás injektálása, jelölés: AZT + 1 mg/kg Hb, (6) orális AZT, 10 egység EPO heti háromszori szubkután injektálása és 0,5 mg/kg hemoglobin heti háromszori intravénás injektálása, jelölés: AZT + EPO + 0,5 mg/kg Hb, (7) orális AZT, 10 egység EPO heti háromszori szubkután injektálása és 1 mg/kg hemoglobin heti háromszori intravénás injektálása, jelölés: AZT + EPO + 1 mg/kg Hb.

Az AZT-t a kontrol állatokat kivéve az összes egér megkapja 5 hetes időtartamig a megfelelő AZT hatás biztosítására végzett kísérletek előtt.

A 7. ábra a BFU-E (Burst Forming Units-Erythroid) SCID egerekben való számának grafikus ábrázolását mutatja három héttel a következő kezelések után:

(1) nincs kezelés, jelölés: kontrol, (2) orális AZT, jelölés: AZT, (3) orális AZT és 10 egység EPO heti háromszori szubkután injektálása, jelölés: AZT + EPO, (4) orális AZT és 0,5 mg/kg hemoglobin heti háromszori intravénás injektálása, jelölés: AZT + 0,5 mg/kg Hb, (5) orális AZT és 1 mg/kg hemoglobin heti háromszori intravénás injektálása, jelölés: AZT + 1 mg/kg Hb, (6) orális AZT, 10 egység EPO heti háromszori szubkután injektálása és 0,5 mg/kg hemoglobin heti háromszori intravénás injektálása, jelölés: AZT + EPO +0,5 mg/kg Hb, (7) orális AZT, 10 egység EPO heti háromszori szubkután injektálása és 1 mg/kg hemoglobin heti háromszori intravénás injektálása, jelölés: AZT + EPO + 1 mg/kg Hb.

Az AZT-t a kontrol állatokat kivéve az összes egér megkapja 5 hetes időtartamig a megfelelő AZT hatás biztosítására végzett kísérletek előtt.

A 8. ábra a SCID egerek sejtszámának grafikus ábrázolását mutatja. A fehér vérsejt számot sötét árnyalatú területtel, a vörösvértest számot csíkozott területtel ábrázoljuk. A sejteket a következő kezelések után három héttel számoljuk:

(1) nincs kezelés, jelölés: kontrol, (2) orális AZT, jelölés: AZT, (3) orális AZT és 10 egység EPO heti háromszori szubkután injektálása, jelölés: AZT + EPO,

(4) orális AZT és 0,5 mg/kg hemoglobin heti háromszori intravénás injektálása, jelölés: AZT +0,5 mg/kg Hb, (5) orális AZT és 1 mg/kg hemoglobin heti háromszori intravénás injektálása, jelölés: AZT + 1 mg/kg Hb, (6) orális AZT, 10 egység EPO heti háromszori szubkután injektálása és 0,5 mg/kg hemoglobin heti háromszori intravénás injektálása, jelölés: AZT + EPO +0,5 mg/kg Hb, (7) orális AZT, 10 egység EPO heti háromszori szubkután injektálása és 1 mg/kg hemoglobin heti háromszori intravénás injektálása, jelölés: AZT + EPO + 1 mg/kg Hb.

Az AZT-t a kontrol állatokat kivéve az összes egér megkapja 5 hetes időtartamig a megfelelő AZT hatás biztosítására végzett kísérletek előtt.

A 9. ábra a normál BDF1 egerek testsúlyát mutatja három héttel a következő kezelések után:

(1) nincs kezelés, jelölés: kontrol, (2) orális AZT, jelölés: AZT, (3) orális AZT és 10 egység EPO heti háromszori szubkután injektálása, jelölés: AZT + EPO, (4) orális AZT és 0,5 mg/kg hemoglobin heti háromszori intravénás injektálása, jelölés: AZT +0,5 mg/kg Hb, (5) orális AZT és 1 mg/kg hemoglobin heti háromszori intravénás injektálása, jelölés: AZT + 1 mg/kg Hb, (6) orális AZT, 10 egység EPO heti háromszori szubkután injektálása és 0,5 mg/kg hemoglobin heti háromszori intravénás injektálása, jelölés: AZT + EPO +0,5 mg/kg Hb,

(7) orális AZT, 10 egység EPO heti háromszori szubkután injektálása és 1 mg/kg hemoglobin heti háromszori intravénás injektálása, jelölés: AZT + EPO + 1 mg/kg Hb.

Az AZT-t a kontrol állatokat kivéve az összes egér megkapja 5 hetes időtartamig a megfelelő AZT hatás biztosítására végzett kísérletek előtt.

A 10. ábra A SCID egerek testsúlyát mutatja a következő kezelések után három héttel:

(1) nincs kezelés, jelölés: kontrol, (2) orális AZT, jelölés: AZT, (3) orális AZT és 10 egység EPO heti háromszori szubkután injektálása, jelölés: AZT + EPO, (4) orális AZT és 0,5 mg/kg hemoglobin heti háromszori intravénás injektálása, jelölés: AZT + 0,5 mg/kg Hb, (5) orális AZT és 1 mg/kg hemoglobin heti háromszori intravénás injektálása, jelölés: AZT + 1 mg/kg Hb, (6) orális AZT, 10 egység EPO heti háromszori szubkután injektálása és 0,5 mg/kg hemoglobin heti háromszori intravénás injektálása, jelölés: AZT + EPO +0,5 mg/kg Hb, (7) orális AZT, 10 egység EPO heti háromszori szubkután injektálása és 1 mg/kg hemoglobin heti háromszori intravénás injektálása, jelölés: AZT + EPO + 1 mg/kg Hb.

Az AZT-t a kontrol állatokat kivéve az összes egér megkapja 5 hetes időtartamig a megfelelő AZT hatás biztosítására végzett kísérletek előtt.

A 11. ábra a Telep-képző Egység-Lép (Colony Forming UnitsSpleen) szám grafikus ábrázolását mutatja besugárzott

állatokban 8 nappal a BDF1 egerekből gyűjtött csontvelővel való beinjektálás után, mely egereket három hétig 0,5 vagy 1,0 mg/kg testsúly hemoglobinnal intravénásán kezeltünk, 10 Egység/egér EPO-val, EPO-val és 0,5 vagy 1,0 mg/kg testsúly hemoglobinnal, vagy csak AZT-vel kezeltünk a csontvelő transzplantációhoz való begyűjtése előtt. Az AZT-t a kontrol állatokat kivéve az összes egér megkapja 5 hetes időtartamig a megfelelő AZT hatás biztosítására végzett kísérletek előtt.

A 12. ábra a humán csontvelő sejtek folyadék tenyészetében számolt erithroid sejtek számát mutatja a 0,1 vagy 1 μΜ AZT-vel történő 7 napig tartó preinkubáció után, majd a hemoglobinnal vagy hemoglobin + AZT-vel való 7 napig tartó inkubáció után.

A TALÁLMÁNY RÉSZLETES LEÍRÁSA

A jelen találmány egy olyan emlősökben való hematopoiezis stimulálására szolgáló módszerrel kapcsolatos, melynek során egy alapjában véve tiszta hemoglobin, előnyösen egy rekombináns módon termelt hemoglobin, legelőnyösebben egy dimerekre nem disszociáló rekombináns módon termelt hemoglobin egy gyógyszerészetileg hatékony mennyiségét alkalmazzuk.

Az emlős hemoglobin általában egy két alfa globin tetramer.

alfal és alfa2 vagy a betal és alegységek nem kovalens két béta globin alegységből

Nincs beta2 módon, Van dér szekvencia alegységek eltérés az között. Az

Waals erőkkel, hirogén kötésekkel és a dezoxi Hb (az oxigént nem szállító hemoglobin) esetében sóhidakkal kapcsolódnak. A tetramer hemoglobinról ismert, hogy alfalbetal és alfa2beta2 dimerekre disszociálnak, amit a vese szűréssel eltávolít a véráramból. A módosítatlan emlős hemoglobin dimerek ilyen vese szűrése vese elégtelenséghez és halálhoz vezethet. A hemoglobin dimerek könnyen kiléphetnek a szövetekbe és elveszhetnek a keringési rendszerből, így egy nem-dimerizálódó hemoglobin előnyben részesül a jelen találmányban és ilyen dimer hemoglobin alkalmazható a sejt tenyészetben. A hemoglobin intravasculáris retenciója javul például a tetramerek alegységeinek fúziójával, ahogy azt többen is állítják (Hoffman, S.J és Nagai, K. 5,028,588 számú US szabadalom; Hoffman et al. , WO 90/13645 és Anderson, D. et al . , 1991 november 8-án iktatott 789,179 számú US szabadalmi Alkalmazás) vagy egy egyedüli tetrameren belül az alegységek kémiai keresztkötésével, vagy két vagy több tetramer keresztkötésével (Bonhard, L. and Kothe, Ν., 4,777,244 számú US szabadalom; Bonhard, K. and Boysen, U. , 4,336,248 számú US szabadalom; Bonsen, P., et al., 4,001,401, 4,053,590 és 4,001,200 számú US szabadalmak; Bucci, E. et al . , 4,584,130 számú US szabadalom; Feller, W. , et al. , 4,920,194 számú US szabadalom; Feola, Μ., et al., PCT közzététel, PCT/US90/07442 ; garlick, R.L. et al., PCT közzététel, PCT/US91/07155; lián, E. et al., EP közzététel EP 0361719; Iwasaki, K. , et al. , 4,670,417 számú US szabadalom és EP 0206448 számú EP; Kluger, R. and Wodzinska, J., PCT közzététel PCT/CA92/00221 és 5,250,665 számú US szabadalom; Kothe, N et al., 3,525,272 számú US szabadalom; Morris, K.C. et al. , 4,061,736 számú US szabadalom; Pepper, D.S. and McDonald, S.L. EP 0459788 számú EP; Scannon, P.J. 4,473,496 számú US szabadalom; Sehgal, L.R. et al.,4,826,811 számú US szabadalom; Tye, R.W. 4,529,719 számú

• r·· ” ·*.*.·

US szabadalom; Walder, J.A. 4,598,064 és 4,600,531 számú US szabadalmak; és lián, E., EP 0361719 számú EP, többek között). Ezen formák bármelyikében a hemoglobin alfalbetal és alfa2beta2 dimerkké való disszociációját megakadályzták, így megnövelték a protein intravsculáris retencióját és csökkentették a vese toxicitást és fokozták a hemoglobin in vivő terápiás alkalmazásban való használhatóságát.

A hemoglobin könnyen beszerezhető számos természetes és rekombináns forrásból. Például a mészárszékek nagyon nagy mennyiségű hemoglobint tartalmazó vért termelnek, amit jelenleg olcsó műtrágyaként árulnak. Továbbá, ha egy adott állat faj vagy fajta egy adott alkalmazáshoz specifikusan megfelelő hemoglobint termel, ezeket az állatokat specifikusan ilyen céllal lehet tenyészteni az igényelt vér ellátásának biztosítása céljából. Olyan transzgenikus állatok hozhatók létre, melyek nem endogén hemoglobint expresszálnak (Logan,

J. S. et al., PCT közzététel PCT/US92/05000). Humán vér visszanyerhető humán vér bankokból, melyek a humán vért bizonyos lejárati idő után ki kell dobják.

A természetes vagy rekombináns forrásokból származó hemoglobinokat különböző technikák alkalmazásával kémiailag módosítani kell a disszociáció kivédése céljából. Ezen technikák bármelyike felhasználható az ezen találmányhoz megfelelő hemoglobin létrehozása céljából. Az ilyen módosításokra szolgáló példákat találhatunk: Iwashita, Y. , et al. , 4,412,989 számú US szabadalom; Iwashita, Y. and Ajisaka,

K. 4,301,144 számú US szabadalom; Iwashita, K., et al., 4,670,417 számú US szabadalom; Nicolau, Y.-C, 4,321,259 számú US szabadalom; Nicolau, Y.-C, and Gersonde, K., 4,473,563 számú

US szabadalom; Wong, J.T., 4,710,488 számú US szabadalom; Wong, J.T.F. 4,650,786 számú US szabadalom; Bonhard, K. , et al., 4,336,248 számú US szabadalom; Walder, J.A. 4,598,064 számú US szabadalom; Walder, J.A. 4,500,531 számú US szabadalom és Ajisaka, K, and Iwashita 4,377,512 számú US szabadalom többek között. Általában a hemoglobin ezen kémiai módosításai magukba foglalják a hemoglobin molekula egy vagy több aminosav maradékának kémiai megváltoztatását vagy egy reagenssel való reagáltatását, mely vagy kémiailag kötődik az alfa/beta dimerekhez, vagy a hemoglobin sterikus transzformációját módosítja például a difoszfo-glicerát kötő hely kötésével, vagy a dimereket köti és ugyanakkor módosítják az oxigén kötő tulajdonságokat. Az olyan módosítások, mint a globin láncok kémiai polimerizációja, a glikoziláció és a pegiláció és/vagy egy liposzómába vagy sejt membránba való bekapszulázás szintén megtervezhető.

Az állati forrásokból való extrakción túl a kívánt természetesen előforduló vagy mutáns hemoglobin alegységeit kódoló gének (ahogy a találmányban definiáljuk) klónozhatok, egy megfelelő expressziós vektorba helyezhetők és egy organizmusba inzertálhatók, például egy mikroorganizmusba, állatba, vagy növénybe, vagy tenyésztett állati vagy növényi sejtekbe vagy szövetekbe. Ezek az organizmusok standard rekombináns DNS technikák felhasználásával hozhatók létre. A humán alfa és béta globin géneket Leibhaber et al. , (Proc. Natl. Acad. Sci . USA 77:7053-7058, 1980) klónozták és Marotta et al. , (Journal of Biological Chemistry 252:5040-5053, 1977) szekvenálták. A vad típusú és a mutáns alfa és béta globinok expresszálásának valamint hemoglobinná való összeépítésük

technikáit Hoffman, S.J. és Nagai, K., 5,028,588 számú US szabadalomban, Hoffman, S.J. et al. , a PCT/US90/02654-ben, Townes, T.M. and McCune, S.L. PCT/US91/09624-ben, Logan, J.S. et al. , PCT/US92/05000-ben és Rausch, C.W. and Feola, M. a 87116556.9. számú Európai Szabadalmi Alkalmazában írták le. Az egyedi globin láncokat újraválogatjuk a globin láncok módosított formáival egy fél-szintetikus hemoglobin szintetizálása céljából (Luisis et al. , Natúré 320,-555-556, 1986 és Nagai et al., Natúré 329:858-860, 1987).

A rekombináns DNS expressziójával létrehozott hemoglobint részesítjük leginkább előnyben, mivel ez maga könnyű módosításhoz vezet, mentes fertőző anyagoktól és korlátlan mennyiségben termelhető. A hely specifikus mutagenezis standard technikájának globin gének esetében való alkalmazásával (Kruse et al. , Biotechniques 6:338-339, 1988 ; Zoller et al . , Methods in Eznymology 100:468-500, 1987) bármilyen aminosav vagy aminosav kombináció hozzáadható, elvehető, vagy megváltoztatható a kapott globin láncban. Bármely hemoglobin vagy ezek bármely fragmentje módosítható a biológiai aktivitás megváltoztatása céljából. Például, a módosított hemoglobinok, vagy hemoglobin fragmentek rendelkezhetnek megváltozott oxigén affinitással, vagy szolgálhatnak sokkal hatékonyabb hematopoieteikus növekedési faktorként (Hoffman and Nagai 5,028,588 számú US szabadalom; Hoffmann 07/789,179 sorozatszámú számú US szabadalom).

A csatolt igénypontok céljaihoz a hemoglobin egy olyan hemoglobint, vagy hemoglobin-szerű proteint jelent, mely egy vagy több tetramerből áll. Az egyes tetramerek (a) két alfa globin-szerű és két béta globin-szerű polipeptidből állnak, (b) egy di-alfa globin-szerű és két béta globin-szerű polipeptidből, (c) két alfa globin-szerű és egy di-beta globinszerű polipeptidből, (d) egy di-alfa globin-szerű és egy dibeta globin-szerű polipeptidből, (e) egy fúzionált alfa/beta globin-szerű polipeptidből és egy szeparált alfa és béta globin-szerű polipeptidből, (f) két fúzionált alfa/beta globinszerű polipeptidből, (g) az alfa globin-szerű és/vagy béta globin-szerű globinok magasabbszámú többszöröseiből, például négy alfa globin-szerű alegységből. A di előtag az alfa vagy a béta globin előtt azt jelenti, hogy egy alfa (vagy béta) alegység C terminusa egy második alfa (vagy béta) alegység N terminusához kötődik, akár közvetlenül, akár egy egy vagy több aminosavból álló peptid kötőn keresztül; a peptid kötés kifejezés mind a két lehetőséget magába foglalja. A di-alfa globin-szerű polipeptid előnyösen képes arra, hogy a béta globinnal összetekeredjen és a hemet magába foglalja létrehozva így egy funkcionális hemoglobin-szerű proteint. A di-beta globin-szerű polipeptid analóg módon határozható meg.

Egy hemoglobin tetramer egy globin alegysége, akár természetes, akár rekombináns eredetű, keresztköthető vagy genetikailag egy másik tetramer globin alegységéhez fúzionáltatható. Egy hemoglobint akkor mondunk multimernek, ha négynél több globin alegységet vagy domént tartalmaz. A multimer kifejezés így oktamer hemoglobint (két összekötött tetramer), valamint magasabb számú multimereket foglal magába attól függetlenül, hogy rekombináns vagy természetes módon fordul elő. A multimer hemoglobinokról a kapcsolódó Anderson et al PCT közzétételben esik szó (PCT/US92/09752, címe: Production and Use of Multimeric Hemoglobins).

.··..·· .·· ···.·

........ .· . .

.:.. ·..· *·· ......

Egy genetikailag fúzionált hemoglobin egy legalább egy genetikailag fúzionált globin-szerű polipeptid-et tartalmazó hemoglobin-szerű protein, a globin-szerű polipeptid két vagy több globin-szerű domént tartalmaz, melyek lehetnek azonosak vagy eltérőek.

Biztosíthatunk egy alfa/beta globin-szerű pszeudodimert is, melyben egy alfa globin-szerű szekvencia peptid kötésekkel kapcsolódik egy béta globin-szerű szekvenciához. Ezekre az alfa/beta globin-szerű polipeptidekre, valamint a di-alfa és di-beta globin-szerű polipeptidekre közösen pszeudodimer globin-szerű polipeptidekként vagy diglobinokként utalhatunk. Az extenzió révén egy di-alfa, egy di-beta vagy egy alfa/beta globin-szerű polipeptidet tartalmazó hemoglobin-szerű protein egy pszeudotetramer.

Egy humán alfa globin-szerű dómén vagy polipeptid egy natív humán alfa globin vagy ennek egy olyan mutánsa, mely a natív szekvenciától egy vagy több helyettesítésben, delécióban vagy inzertációban tér el, míg alapjában véve homológ (a későbbiekben kerül meghatározásra) marad a humán alfa globinnal és a továbbiakban is képes egy tetramer egység létrehozására. Egy béta globin-szerű dómén vagy polipeptid analóg módon határozható meg. Az állati hemoglobinok alegységei, vagy ezek mutánsai valamint a humán hemoglobin kisebb komponensei vagy ezek mutánsai - melyek megfelelőképpen homológok a humán alfa vagy béta globinnal szintén a humán alfa vagy béta globinszerű dómén vagy polipeptid kifejezés körébe tartoznak. Az alfa és béta globin-szerű polipeptidekre közösen globinokként utalhatunk. A kényelem kedvéért a polipeptid kifejezés egy hosszabb polipeptid lánc egységnyi láncára vagy doménjére vonatkozik. Előnyösen a globin-szerű dómén vagy polipeptid képes magába foglalni a hemet.

Annak meghatározásában, hogy egy polipeptid homológ-e globinnal, a szekvencia hasonlóság egy fontos, de nem kizárólagos kritáriuma. A szekvencia hasonlóság hagyományos algoritmusokkal határozható meg, melyek tipikusan lehetővé teszik egy kisebb számú rés bejuttatását a legjobb illeszkedés megvalósítása céljából.

Előnyösen, az alfa doménjei) legalább 75 %-os szekvencia azonosságot mutatnak a vad típusú humán alfa globinnal. Azonban, a kisebb szekvencia azonossággal rendelkező polipeptid még mindig alapjában véve homológnak tekinthető az alfa globinnal ha az nagyobb szekvencia azonossággal rendelkezik, mint ami a véletlen folytán várható lenne, valamint jellegzetesen magasabb alfa globin szerkezettel és hasonló biológiai aktivitással rendelkezik.

Összehasonlításként az

Artemia hem-köto doménjeiről azt tartják, hogy homológok a myoglobinnal, még akkor is ha a primer szekvencia hasonlóság nem több, mint 27 %

A hem-kötő domének konzervált maradékok körüli felsorakozása és az eltérő hemoglobinokban konzervált maradékok (azaz a hem egymáshoz viszonyított helikális szegmentek viszonyát meghatározók) azt sugallj ák, hogy az Artemia domének klasszikus A

H globin hélixekkel rendelkeznek megfelelő fordulóikban valamint konzervált globin család maradékokkal. Továbbá, különböző a szerin proteáz inhibitorok között vannak olyan homológnak ismert protein családok, melyekben mintegy 30 %-os szekvencia homológiájú pár tagok találhatók.

• ·

Több, mint 100 humán hemoglobin mutáns ismeretes, melyek mind az alfa és a béta láncokat befolyásolják, valamint ismert ezen mutációk oxigén kötésre és más hemoglobin tulajdonságokra kifejtett hatása is. A humán alfa és béta globinok maguk is eltérnek 84 pozícióban. A globin szekvenciában a fajok közötti variációkat kiterjedt vizsgálatoknak vetették alá. Dickerson (Hemoglobin Structure, Function, Evolution and Pathology eh. 3, 1982) arról számolt be, hogy 1982-ben a 60 ismert gerinces alfa globin azonos maradékokkal rendelkezett a 141 pozíció 23 helyénél, míg a vizsgált 66 gerinces béta globin a 146 aminosav közül 20 esetben azonos volt. A 60 gerinces myoglobin, mely szintén a globin családba tratozik, a 153 pozícióból 27 esetben azonos aminosavakat tartalmazott. Ha csak az emlősöket vesszük figyelembe, az alfa és a béta globin aminosavak mintegy 35 % állandó. Az állandó pozíciók a molekula aktív centruma a hem hasadék körül csoportosulnak és az interalegységek kapcsolódnak. A variábilis aminosavak közül néhány a konszenzus szekvenciától csupán a figyelembe vett faj egy kis frakciójában térnek el. A humán alfa globin és más homológ gerinces alfa globinok közötti összes eltérések száma a következő: rhesus majom (4), szarvasmarha (17), kacsacsőrű emlős (39), csirke (35), humán zeta (embrionális (61), ponty (71) és a cápa (88).A gerinctelen globinok homológ családján belüli eltérések a következők: tengeri ingola (113), kagyló (124), Glycera (tengeri vérféreg) (124) és a Chironomus (muslica) (131) . A humán béta globin és más homológ gerinces béta globinok közötti eltérések közé tartoznak: rhesus majom (8), humán delta globin (10), szarvasmarha béta globin (25), szarvasmarha gamma globin (33), humán gamma globin (39), humán epszilon (embrionális) globin (36) , kacsacsőrű emlős (34) , csirke (45) , cápa (96) , tengeri ingola (123), kagyló (127), Glycera (125) és Chironomus (128) .

Ezen eltérések közűi sok félrevezető lehet - a variábilis aminosavak mutathatja csupán egy aminosav egy másik funkcionálisan ekvivalensre való konzervatív helyettesítését. Egy konzervatív helyettesítésen egy olyan helyettesítést értünk, mely nem szünteti meg a globin-szerű polipeptid (vagy dómén) hem beépítési képességét, valamint egy tetramer (vagy pszeudotetramer) hemoglobin-szerű proteinből számazó alfa és béta globinokkal való kapcsolódási képességét. A következő források felhasználhatók a konzervatív helyettesítések (deléciók vagy inzertációk) azonosítására:

' (a) a hemoglobin mutánsok adatai (több mint 100 ilyen mutáns létezik);

(b) a gerincesek, különösen az emlősök közötti szekvencia variációk adatai, alfa globinok és béta globinok;

(c) a gerincesek, különösen az emlősök közötti szekvencia variációk adatai, myoglobinok;

(d) a gerincesek és a gerinctelenek globinjai közötti vagy a gerinctelen globinok közötti szekvencia variációk adatai;

(e) a humán hemoglobin három dimenziós szerkezetének adatai és más alapjában véve homológ proteinek, melyeket molekuláris modellező software-rel kapcsoltunk össze a szekvencia változás szerkezetre kifejtett hatásának felméréséhez; és (f) a homológ proteinek családtagjai között előforduló aminosav változások gyakoriságának adatai (nem korlátozódik csak a globin családra). Lásd például az 1-2 táblázatot - Schulz adn Schirmer, principles of Protein Structure (Sprimger Verlag, 1979), valamint a 3-9 táblázatokat - Creighton, Proteins Structure and Molecular Properties (W.H. Freeman, 1983).

Míg az (a) - (d) adatok a rokon proteinekben a variációs helyeknél levő tolerálható mutációk meghatározásában a leghasznosabbak, segítséget nyújthat a molekulában analóg helyeken előforduló tolerálható mutációk meghatározásában is. Az (f) kategóriában szereplő adatokra alapozva a következő csere csoportok azonosíthatók, melyeken belül az aminosav szubsztitúciók gyakran konzervatívak:

I. kis alifás, nem poláros vagy enyhén poláros maradékok Alá, Ser, Thr (Pro, Gly)

II. negatív töltésű maradékok és amidjaik - Asn, Asp, Glu Gin

III. pozitív töltésű maradékok - His, Arg, Lys

IV. nagy alifás nem poláros maradékok - Met, Leu, Ile, Val, (Cys)

V. nagy aromás maradékok - Phe, Tyr, Trp.

Ezek a maradékok azért szerepelnek zárójelben, mert a protein építészetben speciális szerepet töltenek be. A Gly az egyetlen oldallánc nélküli maradék így rugalmasságot biztosít a ···· ···· láncnak. A Pro szokatlan geometriájú, ami szorosan rögzíti a láncot. A Cys részt vehet a diszulfid kötésekben, ami a proteint egy adott hajtogatódásban tartja. Említésre méltó, hogy Schulz és Schimer a fenti I-es és a ΙΙ-es kategóriákat összevonná. Az is említésre méltó, hogy a Tyr a hidrogén kötő potenciálja révén valamelyest rokonságban van a Ser-nel, a Thrnal stb. Ezért a korábban említett bármely forrásból nyert korábban említett hemoglobinok bármelyike a jelen találmány céljaira megfelelőnek tekinthető, ha a hemoglobin egyszer tisztított formába kerül.

A hemoglobin tisztítása a tudomány e területén jól ismert technikákkal végezhető el. Például a hemoglobin izolálható és tisztítható lejárt humán vörösvértestből az erithrociták hemolízisével majd kationcserés kromatográfiájával (Bonhard, K. et al., 4,439,357 számú US szabadalom), anioncserés kromatográfiájával (Tayot, J.L. et al., 0 132 178 számú Európai Szabadalmi Alkalmazás) affinitás kromatográfiájával (Hsia, J.C. 0 231 236 B1 EP) mikropórusos membránokon való szűréssel (Rabiner, S.F., 1967 et al., J. Exp. Med. 126:1127-1142), a félig tisztított hemoglobin deoxigenált oldatának melegítésével a szennyeződések kicsapatása céljából (Estep, T.N. PCT közzététel PCT/US89/014890, Estep, T.N. 4,861,867 számú US szabadalom), a szennyeződések polivalens ionok és poliszulfátok hozzáadásával történő kicsapatásával (Simmonds, R.S. and Owen, W.P. 4,401,652 számú US szabadalom), vagy magának a hemoglobinnak zinkkel való kicsapatásával, amit reszuszpendáció követ (Tye, R.W. 4,473,494 számú US szabadalom). A hemoglobin tisztítható más forrásokból is, például szarvasmarha vérből, és a fenti módszerek bármelyikével kezelhető, vagy mikropórusos

···· ·· szűréssel vagy ultraszűréssel és végül ioncserés kromatográfiával kezelhető (Rausch, C.W. and Feola, M. EP 0 277 289 Bl), vagy csupán ultraszűréssel (Kothe, N. and Eichentopf, B. 4,562,715 számú US szabadalom). A transzgenikus álltokban termelt rekombináns hemoglobinokat kromatofokuszálással tisztítjuk (Townes, T.M. and McCune, PCT közzététel, PCT/US/09624); az élesztőgombákban termelt hemoglobinokat ioncserés kromatográfiával tisztítjuk (Hoffman, S.J. and Nagai,

K. 5,028,588 számú US szabadalom és Hoffman et al., WO 90/13645) . A különösen előnyben részesített rekombináns hemoglobin tisztításra szolgáló módszerek a kapcsolódó WO 95/03322 (1994 július 22-én iktatott) szabadalomban - melynek címe: Nickel Free Hemoglobin and Methods fór producing Such Hemoglobins - valamint a WO 90/135645 (1991 november 8-án iktatott) szabadalomban - melynek címe: Production in Bacteria and yeast of Hemoglobin and Analogues Thereof - és a PCT/US94/13034 (1994 november 14-én iktatott) szabadalomban, melynek címe: Purification of Hemoglobin - és a Looker et. al., (1994) Methods in Enzymology 231:364-374 - áltaL írt műben kerültek leírásra.

Bár tiszta hemoglobint számos eltérő forrásból tisztítottak számos eltérő technika segítségével, csupán nemrégiben valósult meg, hogy olyan tiszta hemoglobin oldatok lettek beszerezhetők, melyek stabilizáltak a dimer képződés ellen. A magyon egységes mikro és ultraszűrő membránok bevezetése, valamint a szelektív kromatográfiás oszlopok és a keresztkötéses kémia az 1960-as évek végén való bevezetése előtt, az összes úgynevezett tisztított vagy sztroma mentes hemoglobin valójában celluláris alkotórészekkel fertőzött volt

és ki volt téve a dimerek képződésének (Winslow, W.M. (1992) Hemoglobin-based Cell Substitutes, The John Hopkins University Press, Baltimore, 242 pp) . A hemoglobinban levő ezen szennyeződések és/vagy a nem kereszt kötött vagy más módon stabilizált hemoglobin dimerizációja émelygéshez, hányáshoz, izomfájáshoz, vesetoxicitáshoz, komplementum aktivitáshoz, láz reakcióhoz és bradycardiához vezetett (Winslow, W.M. (1992) hemoglobin-based Red Cell

Substitutes,

The John Hopkins

University Press, Baltimore,

Még a megfelelően tisztított kémiai keresztkötéses hemoglobinok is tartalmazhatnak vírusokat, visszatarthatják a nem keresztkötött hemoglobinok kis részecskéit, vagy tartalmazhatnak a potenciálisan toxikus nem reagált keresztkötőkből kis mennyiségeket.

Ennek eredményeként egy előnyben részesített hemoglobin rekombináns eredetű hemoglobin, még előnyösebben egy

E. coli-ban termelt olyan hemoglobin mely legalább egy mutációt tartalmaz, a dimerek képződése elleni stabilizálás céljából, legelőnyösebben egy olyan E. coli-ban termelt hemoglobin - mely legalább egy mutációt tartalmaz a dimer képződés elleni stabilizáláshoz és egy mutációt az oxigén affinitás megváltoztatásához (jelölése: rHbl.l) - a kapcsolatos WO 90/135645 (1991 nov. 8-án iktatott - Production in Bacteria and Yeast of Hemoglobin and Analogues Thereof) szabadalomban került leírásra és a kapcsolatos PCT/US94/13034 (1994 november

14-én iktatott - Purification os Hemoglobin) szabadalomban vagy a kapcsolatos WO 90/135645 (1991 nov. 8-án iktatott

Production in Bacteria and Yeast of Hemoglobin and Analogues Thereof) szabadalomban leírt módon került termeltetésre és tisztításra.

• ··· ··· • · · · · .......·

A korábbi bármely formában levő, bármilyen forrásból származó és a fent említett bármely módszerrel tisztított hemoglobin magában vagy más alkotórészekkel együtt a következőkben lehet hasznos:

(1) a hematopoiezis stimulálásában;

(2) egy cytopeniában, például anémiában vagy thrombocytopeniában szenvedő emlős kezelésében;

(3) egy cachexiában, különösen a citopeniával kapcsolatos cachexiában, mint az AIDS-szel vagy az AIDS elleni terápiában az AZT-vel kapcsolatos cachexiában szenvedő emlősök kezelésében;

(4) egy cytopeniában, különösen anémiában vagy thrombocytopeniában szenvedő emlősök kezelésére szolgáló gyógyszerészeti készítmény aktív alkotórészeként;

(5) egy cytopeniában, különösen anémiában vagy thrombocytopeniában szenvedő emlősök kezelésére szolgáló gyógyszerészeti készítményben egyedül vagy annak egy alkotórészeként más hematopoieteikus faktorokkal kombinációban;

kapcsolatos cachexiában, mint az

AIDS-szel vagy az AIDS elleni terápiában az AZT-vel emlősök kezelésére egy gyógyszerészeti készítmény aktív alkotórészeként;

• · · ···· (7) egy citopeniával kapcsolatos cachexiában, mint az

AIDS-szel vagy az AIDS elleni terápiában az AZT-vel kapcsolatos cachexiában szenvedő emlősök kezelésére magában vagy egy gyógyszerészeti készítmény alkotórészeként más hematopoieteikus faktorokkal együtt;

(8) magában vagy más hematopoieteikus faktorokkal együtt egy komponensként, vagy egy sejt tenyésztő tápközeg adalékaként a vérsejtek és őssejtek ex vivő expanziójának fokozására vagy stimulálására.

A jelen találmány a hematopoiezis stimulálására, az anémia kezelésére, a cytopenia kezelésére, a cachexia kezelésére, a vérsejtek ex vivő expanziójához és a sejt tenyészet stimulálásához biztosít ilyen készítményeket és gyógyszerészeti összetételeket. A jelen találmány összetevői beépíthetők hagyományos szilárd vagy folyadék alakú gyógyszerészeti készítményekbe (például tablettákba, kapszulákba, injektálható vagy orálisan alkalmazható oldatokba) az erre igényt tartó emlősök kezelésében való felhasználáshoz. A jelen találmány készítményei a jelen találmány hemoglobinjának egy fiziológiai és/vagy gyógyszerészeti és/vagy terápiás mennyiségét foglalja magába aktív alkotórészként magában vagy más aktív vagy inért anyagokkal kombinációban. Például egy parenterális terápiás készítmény tartalmazhat egy steril izotóniás sóoldatot, ami 0,1-90 % súly/térfogat mennyiségben tartalmaz hemoglobint. Egy előnyben részesített hemoglobin oldat 1-15 % hemoglobint legelőnyösebben körülbelül 7-10 % hemoglobint (súly/térfogat)

• · ♦ ·*· tartalmaz. Továbbá, a fiziológiailag elfogadható oldat 0 - 200 mM egy vagy több fiziológiai puffért, 0 - 200 mM egy vagy több nem redukáló szénhidrátot, 0 - 200 mM egy vagy több alkoholt vagy poli alkoholt, 0 - 200 mM egy vagy több fiziológiailag elfogadható sót és 0 - 1 % egy vagy több felületaktív anyagot tartalmaz és pH értéke körülbelül 6,6 - 7,9. Még előnyösebben a fiziológiailag elfogadható oldat 0 - 150 mM egy vagy több klorid sót, 0-50 mM egy vagy több nem redukáló cukrot és 0 0,5 % felületaktív anyagot, például Tweent [poliszorbens 80] tartalmaz. Még előnyösebben a fiziológiailag elfogadható oldat 0 - 150 mM NaCl-ot, 0-10 mM nátrium foszfátot, 0-50 mM szacharózt és 0 - 0,1 % felületaktív anyagot, például Tweent [poliszorbens 80] tartalmaz. Legelőnyösebben, a fiziológiailag elfogadható gyógyszerészeti készítmény 5 mM Na foszfátot, 150 mM NaCl-ot és 0,06 % Tween 80-at tartalmaz, pH értéke pedig 6,8-7,2. Szükség esetén más alkotórészek is hozzáadhatok, mint például redukáló anyagok, anti-oxidánsok, baktérium ellenes anyagok, onkotikus feszültség anyagok (például albumin, vagy polietilén glikolok) és más fiziológiai szempontból elfogadható sók és cukrok. A fiziológiailag elfogadható redukáló anyagok közé tartoznak az ezekre való korlátozás nélkül a ditionit, a vas sók (például a vas pirofoszfát) , a nátrium bór-hidrid, az alfa tokoferol és az aszkorbát vagy ezek sói. Legelőnyösebben a fiziológiailag elfogadható redukáló anyag az aszkorbinsav nátrium sója. Egy alternatív megfelelő készítményben 5 - 7 % a hemoglobin van 150 mM NaCl-ben, 5 mM nátrium foszfát pH értéke pedig 7,4.

Az egyénnek biztosított gyógyszerészeti készítmény terápiásán hatékony mennyisége elegendő ahhoz, hogy a vér ···· koncentrációt 0,0001 pmol és 1 mmol hemoglobin érték között biztosítsa. Feola és munkatársaival (1992, Surg. Gyn. Obstet 174:379-386) ellentétben, akik 1,7 gm hemoglobinnál nagyobb dózist injektálnak be testsúly kg-onként, a jelen találmány módszere a hemoglobin koncentráció alacsony értékénél, tipikusan 1 ng - 1 g hemoglobin/a beteg testsúly kg-ja mennyiségben következik be. A dózisok lehetnek 0,001 - 1000 mg hemoglobin/kg testsúly közöttiek, előnyösen 0,01 mg - 100 mg hemoglobin/kg testsúly közöttiek, legelőnyösebben 1 mg - 10 mg hemoglobin/kg testsúly közöttiek.

Érthető, hogy az egyes dózis formák egyes dózisaiban levő aktív alkotórészek egység tartalma nem kell, hogy a hatékony mennyiséget magában tartalmazza, mivel a hatékony mennyiség számos kapszula, tabletta, injekció stb., vagy ezek kombinációjának alkalmazásával érhető el.

A jelen találmány minden egyes készítménye továbbá tartalmazhat inért alkotórészeket, ideértve a gyógyszerészetileg elfogadható hordozókat, hígítókat, töltőanyagokat, sókat és más a tudomány e területén jól ismert anyagokat, melyek kiválasztása az alkalmazott dózis formától, a kezet állapottól, a tudomány e területén átlagosan képzett szakember által meghatározott elérendő adott céltól és az ilyen adalékok tulajdonságaitól függ.

A találmány gyógyszerészeti készítményei az egyénnek hagyományos eszközökkel adhatók, mint például orálisan, aeroszollal, transzdermális adszorpcióval, a nyálkahártyán keresztüli adszorpcióval vagy injekcióval. A parenterális alkalmazást előnyben részesítjük, különösen az intravénás vagy az intraarteriás alkalmazást.

A hemoglobin alkalmazás percektől - hetekig tartó ideig tarthat, azonban a szokásos időtartam általában néhány héten keresztül tart a maximális hematopoieteikus hatás elérése és a cytopenia folyamatának javítása érdekében. A tipikus alkalmazási időszak lehet 1-10 hét, még előnyösebben 4-9 hét, legelőnyösebben 6-8 hét.

A hemoglobin dózisai heti 1-7 alkalommal adhatók, előnyösebben heti 2 alkalommal , legelőnyösebben heti 3 alkalommal.

A jelen találmány módszere az emlősök cytopeniás állapotának kezelésében használható.

A cytopeniák olyan állapotok, ahol a keringő vérsejtek bármelyike csökkent mennyiségű.

Az összes cytopenia a keringő vérsejtek különböző csökkent szintjeivel jellemezhetők és széleskörűen meghatározhatók.

Például az anémia kifejezés arra az állapotra utal, amikor vérben kevés a vörösvértest, hemoglobin vagy a teljes térfogat. Az anémiát általában hemoglobin (gramm/deciliter), a hematokrit (a vörösvértestek által elfoglalt vértérfogat százaléka) vagy a vörösvértest szám (a vörösvértestek száma x 10θ/μ1) normál értékekkel való összehasonlításával határozzuk meg. Ezek a normál értékek önkényesen megállapítottak mint az értékek +2 standard eltérései egy egészséges populációban (lásd az 1. táblázatot) • ·

1. táblázat

A felnőttek (*) vér paramétereinek normál értékei

hemoglobin (gm/dl)	12,0 - 17,7
hematokrit (%)	36 - 52
vörösvértest (x ΙΟ^/μΙ)	4,0 - 6,0
átlag sejt térfogat (fi)	80 - 100

(*) = az adatok a következő műből származnak: Náthán, D.G.

in (1992) in Cecil Textbook of Medicine, J.B. Wyngaarden,

L.H. Smith and J.C. Bennett, ed., W.B. Saunders Co.,

Philadelphia, 817-836.

Azonban a normál értékeket korrigálni kell a magasabban lakó emberek esetében, valamint a különböző népcsoportok és a nemek esetében. Az anémiát a dehidráció álcázhatja, ahol a csökkent plazma térfogat látható normál hemoglobin koncentrációt eredményez, és hasonlóképpen az anémiát a megnövekedett plazma térfogat is utánozhatja, mint például terhesség esetében. így az anémia diagnózisa útmutatóként a publikált értékek felhasználásával adható meg, azonban a tudomány e területén képzett szakember kell, hogy megállapítsa. A többi cytopenia, mint például a neutropenia és a thrombocytopenia meghatározása szintén nehézségekbe ütközik. Például a neutropeniát általában úgy tartják, hogy akkor következik be, amikor a keringő neutrofil sejtek száma 2,0 x 10^/liter érték alá esik, azonban ez a normál érték számos népcsoport esetében alacsonyabb. A thrombocytopeniát úgy határozzuk meg, mint amikor a vérlemezkék száma 100000/μ1 érték alá esik. Ez esetben is csak útmutatóként szolgál ez az érték a thrombocytopenia diagnózisában, azonban a • · · · · · • ··· ··· · ···· ·· ·· ···· végső diagnózit a tudomány e területén képzett szakember kell megadj a.

A cytopeniák egy sor összefüggő állapot eredményeként következnek be. Például számos AIDS-es betegben kialakul az anémia ami magának a betegségnek az eredménye, vagy a betegség által szükségessé vált terápiás beavatkozás eredménye. Az AIDSes betegek krónikus AZT kezelése anti-metabolitként működik és megzavarja a normális hematopoiezist. A jelen találmány különösen hasznos az AZT terápia által indukált cytopeniák visszafordításában, sőt akár az AZT terápia vagy az AIDS betegség által okozott együttjáró cachexia javításában, vagy más súlyveszteséggel járó betegség javításában.

Krónikus veseelégtelenség esetén az erythropoietin termelése nem kielégítő, csupán marginális erythropoiezist és szimptomás krónikus anémiát eredményez. A rekombináns hematopoieteikus növekedési faktor erythropoietin rendszeres alkalmazása a veseelégtelenség következtében anemiás, dialízises betegek esetében fenntartott erythropoiezist és megnövekedett hematokrit értéket eredményez. Azonban, ebben a betegségi stádiumban a folyamatos erythropoietin terápia gyakran eredményez vas hiányt, ami korlátozhatja ezen kezelési mód hatékonyságát. Az orális vagy intravénás vas terápia alkalmazása visszaállíthatja ezen vas tartalékokat, de a dialízises anémiás krónikus veseelégtelenségben szenvedő betegek közül néhányan nem képesek az orális vas abszorbeálására vagy a mellékhatások miatt nem szedik azt be. Az intravénás vas dextrán alkalmazása megkísérelhető ezekben a különösen makacs esetekben, azonban az ilyen alkalmazás anaphylaxiás sokkot eredményezhet.

• · ·

Más a cytopeniát eredményező betegségek közé tartoznak az ezekre való korlátozás nélkül a máj betegség, az endokrin rendellenességek, mint például a hypotyroidizmus, a myelodysplasticus szindróma, a szideroblasztos anémiák, a sarlósejtes anémiák, a thalassemiák, bizonyos gyógyszer, környezeti vagy ipari toxicitás, autoimmun rendellenességek, mint például a reumás arthritis, a rák, a kemoterápia és radioterápia és más hasonlók. Ezen cytopeniák bármelyike enyhíthető a jelen találmány hemoglobinjának alacsony dózisú alkalmazásával.

Továbbá, a jelen találmány hasznos a vér komponensek ex vivő expanziójában, amikor a tisztított hemoglobin oldatot egy tenyésztápközegbe adjuk. A hemoglobin egy sejt tenyészethez való hozzáadása része lehet a fentiek szerint leírt gyógyszerészeti készítménynek, vagy egy eltérő puffereit oldatnak. A vér alkotórészek ex vivő expanziója, különösen az erythroid sejtvonal expanziója a következők szerint valósítható meg: először őssejteket gyűjtünk csontvelőből, a keringési rendszerből, a lépből, vagy magzati májból, ezeket a sejteket megfelelő tápközegben szaporítjuk és a differenciálódást és a szaporodást megfelelő növekedési faktorokkal (Tsukamoto, A., et al., 5,061,620 számú US szabadalom; Palsson, B.O., et al., PCT közzététel, PCT/US93/01803 ; Emerson, S.G. et al., PCT közzététel, PCT/US91/09173 ; Boyse, E.A. et al., PCT közzététel PCT/US88/04044; Shih, C.-C., PCT közzététel, PCT/US93/01852; Sardonini, C. et al. , PCT közzététel, PCT/US93/02043) indukáljuk. Az összegyűjtés és az expanzió után a hematopoieteikus sejteket a betegbe juttatjuk infúzióval, például csontvelő transzplantáció után, vagy a hematopoieteikus e · · sejteket genetikailag igazítjuk a genetikai hiba kijavítására,, mint például a thalassemia, vagy a sarlósejtes anémia korrigálására, majd újra a betegbe juttatjuk infúzióval. Mivel a növekedési faktorok szinergista módon hatnak, a hemoglobin lehetséges növekedési faktorokhoz való hozzáadása nagyobb sejt szaporodást és több sejtvonal differenciálódását teszi lehetővé, mint ami korábban lehetséges lett volna.

A jelen találmány hasznos továbbá a kemoterápiás vagy radioterápiás kezelések elősegítésében. Növekedési faktorokat használunk a leukémiás őssejtek ciklusba való indukálására és így a kemoterápiás anyagokkal szemben vagy a radioterápiával szemben érzékenyebbé tesszük ezeket (Mertelsman, R.H., 1993, in Application of Basic Science to Hematopoieses and the Treatment of Desease, E.D. Thomas and S.K. Carter (ed)). Egy rákos beteg hemoglobinnal való kezelése a kemoterápiás vagy radioterápiás beavatkozás előtt, ezzel egyidőben vagy közvetlenül a kezelés után növeli a citotoxikus anyag letalitását, attól függetlenül, hogy a citotoxikus anyag kemoterápia vagy radioterápia formájában van-e.

Továbbá, a jelen találmány hasznos lehet az őssejtek tenyészetben való szaporításának fokozásában, a hemoglobin tenyész tápközeghez való hozzáadása révén magában vagy más növekedési faktorokkal való együttes alkalmazás révén. Az ezen módszerrel szaporított őssejtek ezután a diagnosztikában, további növekedési faktorok termelésében és az in vivő hematopoiesis megértéséhez való modell rendszerek kifejlesztésében használhatók. Az őssejtek szaporodása jól ismert a tudomány e területén és megvalósítható a Tsukamoto, A. és munkatársai által leírtak szerint (5,061,620 számú US

szabadalom,	Palsson,	B.O.	et	al. ,	PCT	közzététel,
PCT/US93/01803	; Emerson,	S .G.	et	al. ,	PCT	közzététel,
PCT/US91/09173	; Boyse,	E .A.	et	al. ,	PCT	közzététel,

PCT/US88/04044; Shih, C.-C., PCT közzététel, PCT/US93/01852;

Sardonini,

Cipolleschi, M.G. et al. ,

PCT közzététel, PCT/US93/02043 ,

1993, Blood 82:2031-2037; Abraham,

N.G. , et al., 1991

Acta hematol.

86:189-193

Chertkov, J.L. et al·., 1992, J. Láb. Clin. med. 119:412-419.

A jelen találmány tervezi további hematopoieteikus faktorok alkalmazását is, együtt alkalmazzák ezeket melyek ha tisztított hemoglobinnal a hematopoiezist nagyobb mértékben stimulálják, mint bármelyik terápiás készítmény magában. Az ilyen további hematopoieteikus faktorokra példák az ezekre való korlátozás nélkül a Granulocita-makrofág Telep Stimuláló Faktor (Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor = GM-CSF), a

Makrofág Telep Stimuláló faktor (Macrophage Colony Stimulating

Factor = M-CSF), a Granulocita Telep Stimuláló Faktor (Granulocyte Colony Stimulating Factor = G-CSF), a Törzs Sejt

Faktor (Stem Cell Factor = SCF) , az Eythropoietin (EPO) és az Interleukin 1-13 (ILI- IL13) [Souza, L.M., 4,810,643 számú US szabadalom; Clark, S.C. and Wong, G.G. 4,868,119 számú US szabadalom; Blasdale, J.H.C. EP 355093; Quesenberry, P.J. in Hematology W.J. Williams, E. Beutler, A.J. Erslev and M.A. Lichtman (eds), 1990, McGraw-Hill, Inc. New York, pp 129-147;

Lin 4,703,008 számú US szabadalom; Zsebo, K.M. et al. , PCT/US90/05548; Nicola, N.A. (1993) in Application os Basic Science to Hematopoiesis and the Treatment os Desease, E.D. Thomas and S.K. Carter (ed), Raven Press, NY; Deeley Μ. , et al., 5,023,676 számú US szabadalom).

• ·

Más hozzáadott hematopoieteikus faktorokkal együtt alkalmazott tisztított hemoglobin ugyanabban a dózis készítményben adható mintha magában alkalmazzuk a maximális terápiás hatás elérése céljából. Az optimális dózist a tudomány e területén képzett szakember határozza meg.

A specifikus megvalósulások következő leírása felfedi a találmány általános természetét így mások a jelen ismereteket felhasználva könnyen módosíthatják és/vagy adaptálhatják azt különböző alkalmazásokhoz, specifikus megvalósulásokhoz az általános koncepciótól való eltérés nélkül; az ilyen adaptációk és módosítások a leírt megvalósulások ekvivalenseinek körén belül vannak. El kell fogadni, hogy a találmány során alkalmazott kifejezések és terminológia a találmány leírását és nem annak korlátozását szolgálja.

• ·

PÉLDÁK

A további példák a jelen találmány specifikus megvalósulásainak leírását szolgálják a találmány körének bármilyen korlátozása nélkül.

1. példa

A tisztított rekombináns hemoglobinnal kezelt normál (BDF1) egerekből gyűjtött BFU-E (Burst Forming Units - Erythroid) szaporodásának fokozása 'A hemoglobint a 08/097273 számú 1993 július 23-án iktatott kapcsolódó szabadalomban (címe: Nickel Free Hemoglobin and Methods fór Producing Such Hemoglobins) leírtak szerint állítjuk elő és formulázzuk. Csontvelőt gyűjtünk normál BDF1 egerekből (8-12 hetesek, Charles River, Wilmington, DE) . Az ezen vizsgálatokban használt csontvelő tenyésztési technikákat már korábban leírták (Abraham, Ν. , et al. , 1989, Blood 74:139144) és ezek jól ismertek a tudomány e területén. Röviden, csontvelő erithroid telepeket (BFU-E - burst forming ubiterythrocyte) szaporítunk 0,4 U/ml erythropoietint tartalmazó 1,12 % metilcellulózban 5 napig. A tisztított rekombináns hemoglobin 3 koncentrációját (1 μΜ, 10 nM és 0,1 nM) adjuk az AZT 0,01, 0,1, 1 és 10 μΜ mennyiségeivel kezelt különböző tenyészetekhez. Az összes tenyészetet három ismétlésben végezzük, általában 9-12 meghatározást teszünk minden egyes pont esetében. A BFU-E szaporodást a harmadik napon értékeljük.

• · · • · · · ·· ··«· ··

Amint az az 1. ábrán látható az AZT dózis-függő módon gátolja a BFU-E telep képződését normál BDF1 egerek esetében. Az 1 μΜ koncentrációjú hemoglobin az AZT 1 μΜ koncentrációnál kisebb koncentrációi esetében képes volt ezt a hatást megfordítani. Megjegyezendő, hogy a 10 és 100 μΜ koncentrációval azonos vagy annál nagyobb koncentrációjú hemoglobin koncentrációk a BFU-E mérhető szintek fölé való növekedéséhez vezetnek, ezért erről nem is számolunk be.

2. példa

A BFU-E szaporodásának fokozása tisztított rekombináns hemoglobin - SCID egér csontvelővel

Csontvelő mononukleáris BFU-E-ket gyűjtünk SCID egerekből (8-12 hetes Severely Combined Immunodéiicient Disorder egerek, Taconic Farms, Germantown, NY) és az 1. példában leírtak szerint szaporítjuk. Az 1 μΜ koncentrációjú rHbl.1 képes volt a 0,1 μΜ AZT hatását visszafordítani (2. ábra).

3. példa

A BFU-E szaporodásának fokozása tisztított rekombináns hemoglobin humán csontvelő tenyésztette!

Az 1. példában leírt kísérletet pontosan az

1. példában leírtak szerint végezzük el, azzal az eltéréssel, hogy normál önkéntesekből gyűjtött normál humán csontvelőt használunk.

Ahogy az 1. példában leírtuk 1 μΜ rekombináns tisztított • « V ··ί ···« · · · · hemoglobin tenvész rendszerhez való hozzáadása megfordítja az

AZT toxicitást 1 μΜ koncentrációnál kisebb AZT koncentrációk esetében. Ezen in vitro kísérlet eredményeit ábrán mutatjuk be.

4. példa

A BFU-E erithropoiesis in vivő fokozása - normál egér

A csontvelőben levő BFU-E sejtek a vörösvértestek korai prekurzorai. Az rHbl.1 BFU-E sejtekre kifejtett hatását megfelelő kezelés után az egerek csontvelőjében levő BFU-E mérésével értékeljük. A normál BDF1 egereket anemiássá tesszük oly ' módon, hogy ivóvizükbe 5 héten keresztül 2,5 mg/ml koncentrációjú AZT-t adunk. A normál kontrol állatokat (normál BDF1 egerek, 8-12 hetesek, Charles River, Wilmington, DE) ugyanilyen időtartamig tartjuk, azzal a különbséggel, hogy ivóvizükbe nem teszünk AZT-t. A rekombináns humán erythropoietinnel (EPO, Toyoba, Osaka, Japan), vagy rekombináns hemoglobinnal vagy ezek kombinációjával való kezelést az AZT kezelés után 5 héttel kezdjük meg. Az egerek tovább kapják az AZT-t a terápiás dózis tervek három hete alatt. A testsúlyt és a vér indexeket rutin módszerekkel határozzuk meg. Az egerek csoportjai 4-12 egeret jelentenek csoportonként. Ezek a csoportok a következők:

(1) normál kontrol, (2) AZT kezelt állatok, (3) AZT/EPO (10 U/egér), • · · · · · * ··«· »· ·· ···♦ * (4) AZT/EPO/0,5 mg rekombináns tisztított hemoglobin/kg testsúly (5) AZT/EPO/1,0 mg rekombináns tisztított hemoglobin/kg testsúly (6) AZT/0,5 mg rekombináns tisztított hemoglobin/kg testsúly (7) AZT/1,0 mg rekombináns tisztított hemoglobin/kg testsúly

Ha az állatok erythropoietint kapnak, akkor 10 egység rekombináns humán erythropoietint (Toyobo, Osaka, Japam, körülbelül 500 U/kg dózisnak felel meg; ami az AZT-vel indukált anémia emberekben való kezeléséhez normál dózisnak számít) adunk szubkután módon hetente három alkalommal. Az egerek hemoglobint is kapnak intravénásán 0,5 vagy 1,0 mg/kg dózisban heti három alkalommal. A rekombináns hemoglobin oldatot foszfát puffereit sóoldatban állítjuk elő, pH értéke 7,4.

Öt hetes időtartam után az AZT-vel kezelt egerek jelentős anémiát, thrombocytopeniát és leukopeniát mutatnak. A hemoglobin adagolás a BFU-E sejtek növekedését eredményezi (4. ábra). Amint az a 4. ábrán is látható a rekombináns hemoglobin szignifikánsan növeli a BFU-E számot az AZT-vel kezelt normál BDF1 egerek esetében. Ezen sejttípus stimulálása nem észlelhető az EPO esetében ezekben a modelekben, ez az eredmény megegyezik a korábbi vizsgálatok eredményeivel, miszerint az EPO minimális hatást fejt ki a korai vörösvértest őssejtekre az AZT kezelést követően (Abraham, N. 1989, Blood, 74:139-144).

• · · • · · ·

5. példa

A hematokrit érték in vivő növelése tisztított rekombináns hemoglobinnal való kezeléssel - normál (BDF-1) egér

A hematokrit értéket - a megrakott vörösvértestek térfogatának a teljes vér térfogatához viszonyított aránya - a 4. példában leírtak szerint kezelt egerekben mérjük. A hemoglobin a hematokrit gátlás sokkal tekintélyesebb viszafordulását okozza mint a magában, 10 U/egér dóziban alkalmazott EPO és úgy tűnik, függetlenül hat az exogén adagolt EPO-tól ha a két ayagot együtt alkalmazzuk. Ahogy az az 5. ábrán látható az erythropoiezis ezen fokozása megnövekedett hematokrit értékben manifesztálódik.

Az AZT-vel indukált anémiás egérben a hematokrit megközelítően 20 % értékre esik, ha azt feltételezzük, hogy 5 mmol Hb/1 az RBC vagy 0,005 mmol Hb/1 az RBC és az egér teljes vértérfogata 3 ml, akkor a vér térfogat megközelítően 20 %-a (0,6 ml) vörösvértest. Ez a 0,6 ml RBC 0,003 mmol Hb-t vagy 0,012 mmol Fe-at jelent. Ha összesen 9 ^g Hb/gm testsúly kezelést alkalmazunk és feltételezzük, hogy az egér 200 gm súlyú, akkor az egér összesen 0,028 gmol Hb-t vagy 0,1125 μιηοΐ Fe-at kap. Azonban a Hb ilyen alkalmazása a hematokrit érték körülbelül 40 %-os értékre való váratlan emelkedéséhez vezet (a legrosszabb esetben AZT + Hb, 1,0). A hematokrit érték megközelítően megduplázódik, 20 %-ről 40 %-ra (ismét azt feltételezve, hogy a teljes vér térfogat 3 ml, 0,6 ml-1,2 ml), 3 μπιοί Hb szintézisét és igy 120 μπιοί Fe szintézisét igényelve.

• ·

Ezért tehát a hemoglobin nem csupán vas forrásként hat, hanem erythropoietikus faktorként is működik.

6. példa

A sejtszám in vivő növelése tisztított rekombináns hemoglobinnal való kezeléssel - normál (BDF-1) egerek

A fehérvérsejteket és a vörösvértesteket is megszámoljuk a 4. példa szerint kezelt egerek esetében. A hemoglobin a vér szám gátlás sokkal tekintélyesebb viszafordulását okozza mint a magában, 10 U/egér dóziban alkalmazott EPO és úgy tűnik, függetlenül hat az exogén módon adagolt EPO-tól ha a két ayagot együtt alkalmazzuk. Ahogy az a 6. ábrán látható a hematopoiezis ezen fokozása a két vérsejt típus számának növelésében manifesztálódik, az alacsony dózisú hemoglobin széleskörű hematopoieteikus hatását jelezve.

7. példa

A BFU-E erithropoiesis in vivő fokozása - SCID egerek

A BFU-E sejtek a csontvelőben a vörösvértestek korai prekurzorai. Az rHbl.1 BFU-E sejtekre kifejtett hatását megfelelő kezelés után az egerek csontvelőjében levő BFU-E mérésével értékeljük. A SCID egereket anemiássá tesszük oly módon, hogy ivóvizükbe 5 héten keresztül 2,5 mg/ml koncentrációjú AZT-t adunk. A SCID egereket korábban a HIV-1gyel - az AIDS fertőző ágense - fertőzött emberekben tapasztalt • · immonodeficiencia modeljeként használtuk. (Aldrovani, G.M., 1993 Natúré 363:732-6) . A normál kontrol állatokat (normál BDF1 egerek, 8-12 hetesek, Charles River, Wilmington, DE) ugyanilyen időtartamig tartjuk, azzal a különbséggel, hogy ivóvizükbe nem teszünk AZT-t. A rekombináns humán erythropoietinnel (EPO, Toyoba, Osaka, Japan), vagy rekombináns hemoglobinnal vagy ezek kombinációjával való kezelést az AZT kezelés után 5 héttel kezdjük meg. Az egerek tovább kapják az AZT-t a terápiás dózis tervek három hete alatt. A testsúlyt és a vér indexeket rutin módszerekkel határozzuk meg. Az egerek csoportjai 4-12 egeret jelentenek csoportonként. Ezek a csoportok a következők:

(1) normál kontrol, (2) AZT kezelt állatok, (3) ΑΖΤ/ΞΡΟ (10 U/egér) , (4) AZT/EPO/0,5 mg rekombináns tisztított hemoglobin/kg testsúly (5) AZT/EPO/1,0 mg rekombináns tisztított hemoglobin/kg testsúly (6) AZT/0,5 mg rekombináns tisztított hemoglobin/kg testsúly (7) AZT/1,0 mg rekombináns tisztított hemoglobin/kg testsúly

Ha az állatok erythropoietint kapnak, akkor 10 egység rekombináns humán erythropoietint (Toyobo, Osaka, Japam, körülbelül 500 U/kg dózisnak felel meg; ami az AZT-vel indukált anémia emberekben való kezeléséhez normál dózisnak számít) adunk szubkután módon hetente három alkalommal. Az egerek hemoglobint is kapnak intravénásán 0,5 vagy 1,0 mg/kg dózisban • · · · • · heti három alkalommal. A rekombináns hemoglobin oldatot foszfát puffereit sóoldatban állítjuk elő, pH értéke 7,4.

Öt hetes időtartam után az AZT-vel kezelt egerek jelentős anémiát, thrombocytopeniát és leukopeniát mutatnak. A 0,5 vagy 1 mg/kg testsúly dózisú hemoglobin adagolás a BFU-E sejtek növekedését eredményezi (7. ábra) SCID egerekben.

8. példa

A sejtszám in vivő növelése tisztított rekombináns hemoglobinnal való kezeléssel - SCID egerek

A fehérvérsejteket és a vörösvértesteket is megszámoljuk a

7. példa szerint kezelt egerek esetében. A hemoglobin a vér szám gátlás sokkal tekintélyesebb viszafordulását okozza mint a magában, 10 U/egér dóziban alkalmazott EPO és úgy tűnik, függetlenül hat az exogén módon adagolt EPO-tól ha a két ayagot együtt alkalmazzuk. Ahogy az a 8. ábrán látható a hematopoiezis ezen fokozása a két vérsejt típus számának növelésében manifesztálódik, az alacsony dózisú hemoglobin széleskörű hematopoieteikus hatását jelezve.

9. példa

A hemoglobin hatása az AZT indukálta testsúly csökkenésre (cachexia) - normál egerek

A hematopoieteikus gátláson kívül az AZT toxicitás egy másik megnyilvánulása a sűlyveszteség (cachexia), ezt gyakran • · manifesztálódik AIDS-es betegek esetében. A cachexia megbízható prognosztikus indikátornak tekinthető az AIDS klinikai kimenetelének (Huang et al., 1989, Clin. Chem. 34: 1957-1959). A 4. példaában leírtak szerint kezelt egerek testsúlyát mérjük. Amint az a 9. ábrán látható az AZT szignifikáns testsúly csökkenést okoz a BDF-1 egerek esetében noha a hemoglobin maga képes volt csillapítani az AZT toxicitás ezen megnyilvánulását.

10. példa

A hemoglobin hatása az AZT indukálta testsúly csökkenésre (cachexia) - SCID egerek 'A hematopoieteikus gátláson kívül az AZT toxicitás egy másik megnyilvánulása a súlyveszteség (cachexia), ezt gyakran manifesztálódik AIDS-es betegek esetében. A cachexia megbízható prognosztikus indikátornak tekinthető az AIDS klinikai kimenetelének (Huang et al . , 1989, Clin. Chem. 34: 1957-1959). A 7. példaában leírtak szerint kezelt egerek testsúlyát mérjük. Amint az a 10. ábrán látható az AZT szignifikáns testsúly csökkenést okoz SCID egerek esetében noha a hemoglobin maga képes volt csillapítani az AZT toxicitás ezen megnyilvánulását.

11. példa

A lép telep-képző egység (CFU-S) meghatározása

Annak felbecsüléséhez, hogy vajon a hemoglobin az elkötelezett erythroid prekurzor tól(CFU-E, BFU-E) eltérő szinten hat-e, a hemoglobin nagyon, korai el nem kötelezett őssejtekre, a CFU-S sejtekre (Colony Forming Unit-Spleen) kifejtett hatását értékeljük. Kimutatták, hogy ezek a sejtek alapjában véve az erythroid, myeloid és limfoid vonalakat eredményezik és benépesítik a letálisan besugárzott állatok legyengült csontvelőjét (van Zant et al. , 1984, J. Exp. Med. 159: 679-685; Reincke, U. , et al. , 1985, Exp. Hematol 13:545553) . A legyengült csontvelő benépesítése a CFU-S által képviselt multimpotens őssejtek jelenlétének indikátora. A lép telepeket 8 nappal a 4. példában leírtak szerint EPO-val, hemoglobinnal vagy ezek kombinációjával korábban kezelt normál vagy AZT-vel kezelt állatokból származó 2x10^ csontvelő sejttel intravénásán beibjekciózott, 8,5 Gy-besugárzott egerek esetében számoljuk. Ahogy a II. ábrán látható, az 5 és 10 mg/kg koncentrációjú hemoglobin jelentősen növeli a letálisan besugárzott majd ezt követően az AZT-n túl még tisztított hemoglobint kapott egerekből származó csontvelő infúziót kapott egerekben képződött CFU-S számot. Az alacsonyabb dózis szint, a 0,5 mg hemoglobin/kg testsúly úgy tűnik jobban működik, mint a magasabb dózisú hemoglobin, azt sugallva, hogy a maximális hatás egy a vártnál jóval alacsonyabb dózisnál következik be. Az elmélet megkötöttsége nélkül, a hemoglobin teljes vérkeringés újra benépesítését stimuláló képessége azt jelzi, hogy az alacsony szintű hemoglobin alkalmazása vagy közvetlenül az őssejtekre hat, vagy közvetve a hematopoiezist fokozza.

12. példa

A rekombináns hemoglobin hatása az AZT által indukált toxicitásra humán eredetű erithroid folyadék szuszpenzió tenyészetekben

Humán csontvelő sejteket gyűjtünk egészséges humán önkéntesek hátulsó csípőtaréjából. Mononukleáris sejteket (MNCs) izolálunk a heaprinizált csontvelő minták FicollHistopaque-on való gradiens centrifugálásával. Az izolált MNCket 10 % magzati borjú szérummal (FBS) kiegészített Hank-féle egyensúlyi sóoldatban [a Hank-féle sóoldatot és a magzati borjú szérumot is a GIBCO-tól (BRL, Grand Island, New York) szeretők be] mossuk.

Megközelítően 4x10^ MNC-t inkubálunk egy T-25 lombikban legalább 2 órán keresztül minimál tápközegben (McCoy-féle 5A tápközeg és tápanyagok, Gibco/BRL) 37 C° hőmérsékleten 5 % CC>2 alatt a monociták és a makrofágok adhéziója céljából. A hematopoieteikus őssejtek (CD34⁺) dúsításához a mononukleáris nem adherens sejteket pelletizáljuk és 1 ml hideg foszfát puffereit sóoldat (PBS), 2 % FBS és 0,1 % nátrium azid elegyében reszuszpendáljuk, majd ezt követően 200 μΐ anti-CD34 monoklonális antitestet adunk hozzá. Egy óráig jégen és sötétben való inkubálás után a sejteket kétszer mossuk hideg PBS-ben a feleslegben levő antitestek eltávolítása céljából és 3 ml McCoy-féle 5A tápközeg, valamint ml-enként 5 ng propidium jodidot tartalmazó tápközeg elegyében reszuszpendáljuk. A CD34⁺ sejteket ezután pozitívan szelektáljuk egy FACStar készülékkel (Becton-Dickinson, Mountain View, California) való sejt • · • · · · · · · ······· · · • ····· · .

···· ·· ·· ···· ·· válogatással. A CD34⁺ sejtek tisztasága 99 %-nál nagyobb, 96 %nál nagyobb variabilitással, ahogy azt tripán kék festéssel mértük.

A sejteket McCoy-féle 5A kiegészített, 15 % FBS-sel és 0,1 mM alfa-merkaptoetanollal dúsított tápközegben tenyésztjük. A tisztított CD34⁺ sejteket (1,7 χ 10⁴ - 2,0 χ 10⁴ sejt/ml) humán rekombináns erythropoietin (2 U/ml), törzssejt faktor (SCF, 7 ng/ml) és humán rekombináns IL-3 (100 U/ml) és vagy 0,1 vagy 1 μΜ AZT jelenlétében tenyésztjük 24 üregű szövettenyésztö lemezen. Hét napig tartó inkubálás után a sejteket mossuk és AZT-mentes tápközeg, 10 rekombináns hemoglobin, ÍO'^M rekombináns hemoglobin/0,1 μΜ AZT vagy 10^-6 M rekombináns hemoglobin/1 μΜ AZT elegyében reszuszpendáljuk. További 14 napig tartó inkubálás után az életképes sejteket az egyes üregekben megszámoljuk és fenotipizáljuk. Az összes kísérletet három ismétlésben végezzük el. A 14 napig tenyésztett sejtek életképessége 95 %-nál nagyobb, ahogy azt tripan kékkel való festéssel meghatároztuk.

A primer izolált nem adherens MNC-ket és a tenyésztett sejteket a 14 napos inkubálást követően átfolyásos citometriával analizáljuk. Az IgGl-fluoreszcein izotiocianátot (FTTC) és az IgG2b-fikoerithrint használjuk negatív kontrolként a pontos mérés biztosítása céljából. A sejteket (10⁵) 50 ml hideg PBS, 2 % FBS és 0,1 % nátrium azid elegyében inkubáljuk 4 C° hőmérsékleten sötétben 5 μΐ glikoforin A-FTTC-vel (egy eerithrocita marker). Hatvan percen keresztül tartó inkubálás után a sejteket kétszer mossuk PBS-sel. Ezután a sejteket 1 % paraformaldehidet tartalmazó PBS-ben reszuszpendáljuk és egy ··· ····

FACStar készülékkel (becton-Dickinson) analizáljuk a lizis programot használva a kettős fluoreszcencia analíziséhez.

Ahogy az a 12 . ábrán látható az AZT dózis függő módon gátolja a humánén eryhtroid szaporodását folyadék szuszpenziós tenyészetben. Az 1 μΜ koncentrációjú hemoglobin képes volt ezen hatást csökkenteni.

Claims (28)

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Egy a hematopoiézis emlősökben való stimulálására szolgáló módszer azzal jellemezve, hogy az emlősnek tisztított, fiziológiai szempontból elfogadható hemoglobin egy hematopoietikus szempontból hatékony mennyiségét adjuk.

2. Emlősben a cvtopenia kezelésére szolgáló módszer azzal jellemezve, hogy egy emlősnek tisztított, fiziológiai szempontból elfogadható hemoglobin egy cytopeniát csökkentő hatékony mennyiségét adjuk.

3. Emlősben az anemiás szimptomák kezelésére szolgáló módszer azzal jellemezve, hogy egy emlősnek tisztított, fiziológiai szempontból elfogadható hemoglobin egy anémiát csökkentő hatékony mennyiségét adjuk.

4 . A 3 . igénypont szerinti módszer azzal jellemezve, hogy az anemiás szimptomákat az AZT által indukált anémia

eredményezi.

- 5 mM nátrium foszfátot tartalmaz, és pH értékét körülbelül 7,4 értékre állítjuk.

• * ···· • · ·· « · V ···♦ ··«·

- 5 mM nátrium foszfátot tartalmaz, és pH értékét körülbelül 7,4 értékre állítjuk.

5. Emlősben a kemoterápiás vagy radioterápiás kezelési

körülmények lehetővé tételére szolgáló módszer azzal jellemezve, hogy az emlősnek tisztított, fiziológiai szempontból elfogadható hemoglobin egy sejt szaporodási

szempontból hatékony mennyiségét adjuk.

• ·

6. Emlősben a cachexia kezelésére szolgáló módszer azzal jellemezve, hogy egy emlősnek tisztított, fiziológiai szempontból elfogadható hemoglobin egy cachexiát csökkentő hatékony mennyiségét adjuk.

7. A 6. igénypont szerinti módszer azzal jellemezve, hogy a cachexiát az AZT kezelés vagy a Szerzett Immunhiány Betegség (Acquired Immuné Deficiency Syndrome = AIDS) eredményezi.

8. Egy az emlős eritroid őssejtek szaporodásának és/vagy fejlődésének fokozására szolgáló módszer azzal jellemezve, hogy az emlősnek tisztított, fiziológiai szempontból elfogadható hemoglobin egy emlős eritroid őssejt stimulálás szempontjából hatékony mennyiségét adjuk.

9. Egy az ős törzs sejtek ex vivő kiterjesztésére szolgáló módszer azzal jellemezve, hogy egy törzs sejt populáció tenyészetéhez tisztított hemoglobin egy törzs sejt stimulálás szempontjából hatékony mennyiségét adjuk.

10. Az 1. - 9 igénypontok bármelyike szerinti módszer azzal jellemezve, hogy a hemoglobin egy nem-dimerizáló hemoglobin képviseli.

11. Az 1. - 9 igénypontok bármelyike szerinti módszer azzal jellemezve, hogy a hemoglobin egy mutáns hemoglobint jelent.

12. Az 1. - 9 igénypontok bármelyike szerinti módszer azzal jellemezve, hogy a hemoglobin egy rekombináns módon létrehozott hemoglobint jelent.

13. Az 1. - 9 igénypontok bármelyike szerinti módszer azzal jellemezve, hogy a hemoglobin egy rekombináns módon létrehozott mutáns hemoglobint jelent.

14. Az 1. - 9 igénypontok bármelyike szerinti módszer azzal jellemezve, hogy a hemogüobint a di-alfa hemoglobint, dibeta-hemoglobint, az oktamer hemoglobint és a multimer hemoglobint magába foglaló csoportból szelektáljuk.

15. Az 1. - 8. vagy 10. - 14. igénypontok bármelyike szerinti módszer azzal jellemezve, hogy a hemoglobin hatékony mennyisége körülbelül 0,001 mg - 10000 mg/kg testsúly mennyiségek között változik.

16. A 15. igénypont szerinti módszer azzal jellemezve, hogy a hemoglobin hetékony mennyisége körülbelül 0,01 mg - 1000 mg/kg testsúly között változik.

17. Az 1. - 16. igénypontok bármelyike szerinti módszer továbbá azzal jellemezve, hogy egy vagy több hematopoietikus növekedési faktort egyidejűleg adagolunk.

·· ····

18. A 17. igénypont szerinti módszer azzal jellemezve, hogy az említett hematopoietikus növekedési faktort a GM-CSFet, az M-CSF-et, a G-CSF-et, a G-CSF-et, az SCF-et, az EPO-t, az IL-l-et, az IL-2-ot, az IL-3-at, az IL-4-et, az IL-5-öt, az IL-6-ot, az IL-7-et, az IL-8-at, az IL-9-et, az IL-10-et, az IL-ll-et, az IL-12-őt az IL-13-at és a PDGF-et magába foglaló csoportból szelektáljuk.

19. Egy gyógyszerészeti készítmény azzal jellemezve, hogy körülbelül 0,1 % - körülbelül 90 % (súly/térfogat) tisztított hemoglobint,

- 0-200 mM egy vagy több fiziológiai puffért,

- 0-200 mM egy vagy több alkoholt vagy polialkoholt,

0-200 mM egy vagy több fiziológiailag elfogadható sót,

- 0-1 % egy vagy több felületaktív anyagot,

- 0-5 mM egy vagy több redukáló anyagot tartalmaz, valamint pH értékét körülbelül 6,6-7,9 értékek közé állítjuk.

20. A 19. igénypont szerinti gyógyszerészeti készítmény azzal jellemezve, hogy körülbelül 1 % - körülbelül 15 % (súly/térfogat) hemoglobint,

- 0 - 150 mM egy vagy több fiziológiai szempontból elfogadható sót - ahol a fiziológiai szempontból elfogadható só klorid sót jelent,

- 0-0,5 % egy vagy több felületaktív anyagot,

- 0-5 mM egy vagy több redukáló anyagot, és ·· ·· • ♦ · • ··· • · · ···· ·· « «· tartalmaz, és pH értékét körülbelül 6,8-7,2 értékek közé állítjuk.

21. A 22. igénypont szerinti gyógyszerészeti készítmény azzal jellemezve, hogy körülbelül 0,1 % - körülbelül 90 % (súly/térfogat) hemoglobint,

- 150 mM NaCl-ot,

22. Egy sejt tenyészet adalék azzal jellemezve, hogy körülbelül 0,1 % - körülbelül 90 % (súly/térfogat) tisztított hemoglobint,

- 0-200 mM egy vagy több fiziológiai puffért,

- 0-200 mM egy vagy több alkoholt vagy polialkoholt,

- 0-200 mM egy vagy több fiziológiailag elfogadható sót,

- 0-1 % egy vagy több felületaktív anyagot,

- 0-5 mM egy vagy több redukáló anyagot tartalmaz, valamint pH értékét körülbelül 6,6-7,9 értékek közé állítjuk.

23. Egy a 22. igénypont szerinti sejt tenyészet adalék azzal jellemezve, hogy körülbelül 0,1 % - körülbelül 90 % (súly/térfogat) hemoglobint,

- 150 mM NaCl-ot,

24. Tisztított hemoglobin használata azzal jellemezve, hogy a hematopoiezis stimulálására szolgáló gyógyszerészeti készítmény előállítására használjuk.

25. Tisztított hemoglobin használata azzal jellemezve, hogy a cytopenia kezelésére szolgáló gyógyszerészeti készítmény előállítására használjuk.

26. Tisztított hemoglobin használata azzal jellemezve, hogy a cachexia kezelésére szolgáló gyógyszerészeti készítmény előállítására használjuk.

27. Tisztított hemoglobin használata azzal jellemezve, hogy az anémia kezelésére szolgáló gyógyszerészeti készítmény előállítására használjuk.

28. Tisztított hemoglobin használata azzal jellemezve, hogy a HÍV fertőzéses betegek AZT kezeléséből eredő anemiás szimptomák kezelésére szolgáló gyógyszerészeti készítmény előállítására használjuk.