HUT66755A - Low diol polyalkylene oxide biologically active proteinaceous substances - Google Patents
Low diol polyalkylene oxide biologically active proteinaceous substances Download PDFInfo
- Publication number
- HUT66755A HUT66755A HU9302440A HU9302440A HUT66755A HU T66755 A HUT66755 A HU T66755A HU 9302440 A HU9302440 A HU 9302440A HU 9302440 A HU9302440 A HU 9302440A HU T66755 A HUT66755 A HU T66755A
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- peg
- polyethylene glycol
- sod
- composition
- diol
- Prior art date
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
- A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
- A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Description
A találmány tárgya javított, polialkilénoxidot és biológiailag aktív protein típusú anyagot tartalmazó készítmények, eljárás ezek előállítására, továbbá módszer ezek alkalmazására különféle fiziológiai rendellenességekhez társuló betegségek kezelésében, amelyekben a biológiailag aktív protein típusú anyag valamilyen immunválaszt vált ki. Közelebbről, a találmány javított, polietilénglikol-szuperoxid-dizmutázt tartalmazó készítményekre, ezek előállítására, valamint ezeknek szuperoxid-anion szövetkárosító hatásával összefüggő kórfolyamatok - így például iszkémiás állapotok, reperfúziós károsodás, traumás állapotok és gyulladásos folyamatok - kezelésében való alkalmazására vonatkozik.
Régóta úgy gondolják, hogy a biológiailag aktív proteinek, különösen az enzimek és a peptid-hormonok specificitásuknak és gyors katalitikus hatásuknak köszönhetően különféle betegségek ideális gyógyszerei lehetnének.
Ilyen enzimek péládul az
- oxidoreduktáz enzimek, péládul az urát: oxigén oxidoreduktáz (1.7.3.3; urikáz); hidrogén-peroxid: hidrogénperoxid-oxidoreduktáz (1.11.1.6; kataláz); koleszterein, redukált-NADP: oxigén-oxidoreduktáz (20-B-hidroxilálás) (1.14.1.9; koleszterein-20-hidroxiláz);
- transzferáz enzimek, például az UDP glükuronát: glükuronil-transzferáz (akceptorra nem specifikus) (2.4.1.17; UDP glükuronil-transzferáz) ; UDP glükóz: a-D-galaktóz-1-foszfát-uridilil-transzferáz (2.7.7.12) ;
- hidrolázok, például a mukopeptid N-acetil-muramil-hidroláz (3.2.1.17; lizozim); triszin (3,4,4,4); L-aszparagin-
- 3 -I r
-amino-hidroláz (3.5.1.1; aszparagináz);
- lizáz enzimek, például a frukóz-1,6-difoszfát D-glicerinaldehid-3-foszfát-liáz (4.1.2.12; aldoláz);
- izomerázok, például a D-xilóz ketol-izomeráz (5.3.1.5; xilóz izomeráz); és
- ligázok, például az L-citrullin: L-aszpartát-ligáz (AMP) (6.3.4.5).
A peptid-hormonok körébe tartoznak: az inzulin, ACTH, glukagon, szomatosztatin, szomatotropin, timozin, parathormon, pigment hormonok, szomatomedin, eritropoietin, luteinizáló hormon, koriongonadotropin, hipotalamusz kibocsátó faktorok, antidiuretikus hormonok, tiroid stimuláló hormon, kalcitonin és prolaktin.
Az enzim-terápia, kevés kivételtől eltekintve, különösen nem humán eredetű enzimek alkalmazásakor, azonban nemigen tekinthető sikeresnek, részben a viszonylag rövid felezési idő miatt és immunogenitásuk következményeként. Adagolásuk után a gazdaszervezet védőrendszere az idegen enzimek eltávolítására törekedvén, velük szemben antitestek képződését indítja el, ily módon azok terápiás hatékonyságát számottevően csökkentve vagy akár meg is szüntetve. Az idegen, vagy egyébként rövid felezési idejű humán enzimek ismételt adagolása lényegében hatástalan, és veszélyes is lehet az együttjáró allergiás válasz miatt. E problémák kiküszöbölésére különféle kísérletek folynak, például mikrokapszulázás, liposzómákban való alkalmazás, génsebészeti megoldás és az enzimek polimerekhez kapcsolása révén keresik a megoldást. Közülük is a legígéretesebbnek az az út látszik, amelyben • ·
- 4 A protein típusú anyagokat polialkilénoxid (rövidítve PAO) polimerekhez, különösen polietilénglikol (rövidítve PEG) polimerekhez kapcsolnak. E törekvéseket az alábbiakban mutatjuk be.
A 4 179 337 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírás tárgya proteinekhez kapcsolt PEG vagy polipropilénglikol alkalmazása fiziológiailag aktív nem-immunogén vízoldékony polipeptid készítmény előállítására, amelyben a PEG arra szolgál, hogy megvédje a polipeptidet az aktivitás elvesztésétől számottevő immunogén válasz kiváltása nélkül. Az idézett leírásban a PEG proteinhez való kapcsolására több módszert ismertetnek, így egyrészt egy protein aminocsoportot amidvagy peszudoamid-származékká alakítanak át, aminek következményeként az aminocsoport az általa képviselt töltést elveszti; másrészt a protein aminocsoportjára vagy ahhoz vicinális helyzetben, valamilyen heteroatom szubsztitutenst, például hidroxilcsoportot, vagy valamilyen gyűrűrendszert visznek be, ami a polimer vázában nem ismétlődik.
Mások arról számolnak be [Veronese, F.M., Boccu, E., Schaivon, Ο., Velő, G.P., Conforti, A., Franco, L., és Milanino, R. : Journal of Pharmacy and Pharmacology, 35, 757758 (1983)], hogy marhaeritrocitákból (vörösvérsejtekből) származó szuperoxid-dizmutázt polietilénglikol-karbonsavnak N-hidroxi-szukcinimiddel képzett aktív észterével módosítva, patkányokban vizsgálva az enzim felezési ideje hosszabb lett, mint módosítás nélkül.
A 0 200 467 számú európai találmányi bejelentés (Anjinomoto, Inc.) egy szuperoxid diszmutázt ír le, amelyet mindkét • · « * · « · · · ··· · • ······ * · • · · · · « végén aktivált karboxil kapcsoló, a proteinnel reagálni képes csoportokkal funkcionalizált polialkilénoxiddal módosítottak. Mivel az aktivált kapcsolási helyek a polimer lánc ellentétes végein helyezkednek el, nem valószínű, hogy a lánc egyik végén lévő aktivált csoport a polimer lánc másik végén lévő csoport reaktivitását jelentősen befolyásolná. E polimerek mindkét végükön képesek reakcióba lépni, és így proteinekkel kereszkötést létesítve, a protein és a polialkilénoxid között kopolimereket létesíteni. Az ilyen típusú kopolimerek nem rendelkeznek jól definiált vagy molekulárisán sztöchiometrikus összetétellel.
Egy újabb szakirodalmi adat szerint [Veronese, F.M. és társai: Journal of Controlled Release, 10, 145-154 (1989)] szuperoxid-diszmutáz (rövidítve SÓD) monometoxi-polietilénglikollal végzett reagáltatása heterogén termékkeverékhez vezet. Igazolták, hogy a heterogenitás a monofunkcionális metoxilezett molekulákban lévő bifunkcionális polietilénglikol (rövidítve DPEG) jelenlététől függ.
A fentiek eredményeként általában hosszabb felezési idejű és immunogenitást kevésbé okozó (azaz immunválaszt kevésbé kiváltó) protein típusú biológiailag aktív anyagokat kaptak. Mindazonáltal további javítások szükségesek ahhoz, hogy különféle betegségeket ezekkel az ígéretes biológiailag aktív vegyületekkel sikeresen kezelhessünk.
Úgy találtuk, hogy biológiailag aktív protein típusú anyagok felezési idejét megnövelhetjük és elérhetjük azt is, hogy kevesebb immunogén tulajdonságuk legyen, olyan módon, hogy azokat alacsony dioltartalmú polialkilénoxiddal, külö·· « ·· *··· • » · · · • ··« · · · · • ······ 9 9
9 · ·· · nősen alacsony dioltartalmú polietilénglikollal kémiailag módosítjuk.
A találmány tárgya biológiailag aktív protein típusú készítmény, amely tartalmaz egy polialkilénoxidhoz kovalensen kötött biológiailag aktív proteint, ahol a polialkilénoxid molekulatömege mintegy 1000-től 15000 daltonig terjed, és monometoxilezett és nem-metoxilezett polialkilénoxidból áll úgy, hogy a nem-monometoxilezett polialkilénoxidból kevesebb, mint mintegy 10 tömeg%-ot tartalmaz.
A találmány leírása során a szuperoxid-dizmutázra hivatkozunk, meg kell érteni azonban, hogy alacsony diol-taralmú polialkilénoxidokkal más biológiailag aktív anyagot is lehet kémiailag módosítani.
A találmány értelmében biológiailag aktív proteinek felezési idejét megnöveljük és immunogenitásukat csökkentjük vagy megszüntetjük annak révén, hogy a biológiailag aktív proteint egy alacsony dioltartalmú polialkilénoxiddal, előnyösen alacsony dioltartalmú polietilénglikollal, polietilénglikol aktív észter köztitermék alkalmazásával, kovalensen módosítjuk.
Úgy találtuk, hogy a mintegy 1000-től mintegy 15000 daltonig terjedő átlagos molekulatömegű és nem több, mint mintegy 10 tömeg% nem-monometoxilezett polietilénglikolt tartalmazó polietilénglikol polimerek, különösen alkalmasak biológiailag aktív proteinekhez, különösen szuperoxid-dizmutázhoz történő kovalens kapcsolásra. A találmány szerint még előnyösebbek, a mintegy 2000-től mintegy 10000 daltonig terjedő molekulatömegű, és különösen előnyösek a mintegy 4000-
- 7 tői mintegy 6000 daltonig terjedő átlagos molekulatömegű polietilénglikolok, ahol a polietilénglikol előnyösen kevesebb, mint mintegy 7 tömeg% és különösen előnyösen kevesebb, mint mintegy 5 tömeg% nem-monometoxilezett polietilénglikolt tartalmaz.
A találmány szerinti eljárásban alacsony dioltartalmú polietilénglikolt kovalensen kapcsolunk a biológiailag aktív proteinhez, miként azt az 1. reakcióvázlaton illusztráljuk.
Az LDPEG rövidítést az alacsony dioltartalmű polietilénglikol kifejezésre használjuk, míg az LDPEG-COOH jelölés a hidroxilcsoportokon karboxilezett LDPEG-et jelenti, és n az LDPEG proteinnel való kapcsolódási helyeinek számát adja meg. A reakcióvázlat értelmében úgy járunk el, hogy az LDPEG-t a hidroxilcsoportokban karboxilezzük, majd a karboxilcsoportokat egy karboxil aktiváló ágenssel észterezzük és a kapott aktív észtereket a protein molekulához kapcsoljuk. A proteinhez kapcsolt LDPEG molekulák száma a protein molekulában lévő reaktív csoportok, például aminocsoportok, számának függvényében változik.
A találmány szerinti eljárást biológiailag aktív proteinek széles körére, és úgynszintén bizonyos peptid-hormonok esetében alkalmazhatjuk. A biológiailag aktív fehérjék csoportja az alábbiakat foglalja magában
- rekombináns humán interleukin-4 (rhulL-4);
- proteáz szubtilisin Carlsberg;
- szuperoxid dizmutázok, így marha- és humáneredetűek, továbbá különféle rekombináns szuperoxid dizmutázok, ez utóbbiakra példa a rekombináns humán szuperoxid dizmutáz • · • · · · • · · · « · ' • · ··· · ♦ · · « · ······ · · ··· ·· · · · ·
- 8 (rhuSOD); és a
- fentiekben ismertetett oxidoreduktázok, transzferázok, hidrolázok, liázok, izomerázok és ligázok.
Peptid-hormonok a fentiekben ismertetett peptid-hormonok lehetnek.
A találmány egyik előnyös megvalósítását képezi az alacsony dioltartalmú polietilénglikolhoz kovalensen kapcsolt SÓD enzim. A polialkilénoxiddal, így például polietilénglikollal összefüggésben használt alacsony dioltartalmú megjelölés egy, nem több, mint mintegy 10 % nem monoalkoxilezett polialkilénoxidot, előnyösen nem monometoxilezett polietilénglikolt, tartalmazó lineáris polialkilénoxidra vonatkozik.
A szuperoxid dizmutáz az intracelluláris enzimek csoportjába tartozik és minden oxigént-metabolizáló sejtben jelen van. Feladata a szuperoxid gyök oxigénné és hidrogén-peroxiddá történő átalakulásának katalizálása. Úgy vélik, hogy a szuperoxid gyök és az abból származó ágensek számos különféle gyulladásos betegséggel oki összefüggésben állnak. A szuperoxid dizmutázt orgotein védett néven bizonyos gyulladásos állapotok kezelésére használják. Alkalmazását vizsgálják továbbá bronchopulmonáris diszplázia, hiperbázikus oxigén toxicitás, égés és fertőzések következtében kialakuló akut gyulladások, szervátültetést követő reperfúziós sérülés, retrolentális fibroplázia, terápiás ionizációs sugárzás mellékhatásai és bizonyos bőrgyógyászati kórképek esetében. A SÓD emlősöknek intravénás injekció formájában történő adagolásakor azonban az enzim felezési ideje mindössze né·· • · ··« ··· * • · ······ · · ··· ·· · ·· ·
- 9 hány perc, és a keringésből gyorsan eltűnik. Következésképpen az enzim-aktivitás nem elegendő mértékű toxikus anyagoknak a vérből való eltávolításához. Másrészt, az ismételt adagolás káros reakciókat vált ki.
Alacsony dioltartalmú polialkilénoxid (LDPAO), amely különböző molekulatömegű polialkilénoxid láncokból áll és lánconként legalább egy hidroxilcsoportot tartalmaz, így például az alacsony dioltartalmú polietilénglikol (LDPEG), szuperoxid dizmutázhoz hozzákapcsolva, a természetes SOD-nál vagy a PAO-SOD-nál hosszabb felezési idejű és immunogenitással kevésbé rendelkező biológiailag aktív készítményt képez.
Az LDPEG szuperoxid dizmutázhoz kapcsolására vonatkozó eljárás három lépésből áll. Az első lépésben szukcinilezéssel, előnyösen borostyánkősavanhidriddel (rövidítve SA), aktiváljuk az alacsony dioltartalmú metoxi-polietilénglikolt, amelyek átlagos molekulatömege mintegy 1000-től mintegy 15000 daltonig terjedhet, előnyösebben 2000-től 10000 daltonig, különösen előnyösen 4000-től 6000 daltonig, és amely nem több, mint 10 % nem-monometoxilezett PEG-et tartalmaz. Az így kapott LDPEG-szukcinátból (rövidítve LDPEG-S) a második lépésben előnyösen N-hidroxi-szukcinimiddel (NHS), egy reaktív észtert készítünk, majd a kapott LDPEG-SS származékot a harmadik lépésben a SÓD valamely hozzáférhető reaktív helyzetével, előnyösen a SÓD egy primer aminocsoportjával, főként lizin e-amino csoportjával reagáltatjuk.
Az eljárást az LDPEG-SOD előállításával illusztráljuk és a 2. reakcióvázlaton mutatjuk be. A rövidítések jelentését az alábbiakban adjuk meg.
- LDPEG-OH jelenléte alacsony dioltartalmú CH3O-PEG-OH, amely legfeljebb mintegy 10 tömeg% HO-PEG-OH-t tartalmaz;
- LDPEG-S jelentése alacsony dioltartalmú CH3O-PEG-OCOCH2CH2COOH, amelynek [HOOC-CH2CH2-COO]2PEG tartalma legfeljebb 10 %;
- LDPEG-SS jelentése alacsony diói CH3O-PEG-OCOCH2CH2COO(C4H4NO2), amelynek [(C4H4O2N)OOC-CH2CH2COO]2-PEG tartalma legfeljebb 10 %;
- (LDPEG)nbSOD jelentése alacsony diói(CH3O-PEG-OCOCH1CH2CO)n-bSOD;
- (LDPEG)n_ibSOD-S jelentése alacsony diói(CH3O-PEG-OCOCH2CH2CO)n_1-bSOD-COCH2CH2COOH; és
- DCC diciklohexil-karbodiimidet, SA borostyánkősavanhidridet, bSOD marha szuperoxid dizmutázt, NHS N-hidroxi-szukcinimidet [képlete: (C4H4NO2)OH], SAcid borostyánkősavat, n szuperoxid dizmutázra jutó alacsony dioltartalmú polietilénglikolok számát, továbbá Κχ, Kobs» k2 ®s k3 reakció sebességi állandókat jelentenek.
Az LDPEG-SOD-ot úgy állítjuk elő, hogy aktíváit LDPEG-et SÓD reaktív helyeihez, elősorban reaktív amino részeihez, így például e-lizin aminocsoportjához kovalensen hozzákapcsoljuk. így minden egyes kapcsolt LDPEG-nek megfelelően az e-lizin aminocsoportokból amidokat kapunk. A kapott LDPEG-SOD termék mind a PEG-egységek beviteli foka (az úgynevezett pegálási fok) szempontjából, mind pedig az LDPEG kapcsolási helyének szempontjából heterogén, mivel a reakció a rendelkezésre álló aminhelyek bármely számával mehet végbe.
Ráadásul, ha az LDPEG bifunkcionális, vagyis, amikor az • ·· 4 ····«· • · · · · · · · 444 4 · ·4 · 44··*· · • « 4 ·· · ··4 aktivált reagens LDPEG diol-ból képződik, a protein aktív helyeivel potenciálisan az LDPEG egység mindkét vége reagálhat.
A protein-S-LDPEG kötési hely közelében a lokális kémiai környezet lényegében független az LDPEG lánc ellentétes végén lévő funkciós csoport jelenlététől, így a SOD-S-LDPEG-X, az egység SOD-S végéhez közel, nem függve attól, hogy X helyén metoxi- vagy hidroxilcsoport vagy O-szukcinát- vagy O—S-SOD-csoport van. Ebben a vontkozásban SOD-S-LDPEG-X molekulával szembeni antitestek az SOD-S-LDPEG és SOD-S-LDPEG-S-SOD között szimmetria okokból nem kellene, hogy különbséget tegyenek a proteinhez közeli régiókban. Ez éppúgy igaz a SOD-S-LDPEG egységből, illetve a SOD-S-LDPEG-S-SOD egységből kicsapódott SOD-S részletre is. Valójában, egy hosszú láncú polietilénoxid szimmetriája megkívánná, hogy az etilénoxid szegmentumot felismerő antitestek a CH3O-LDPEG-S-SOD és SOD-S-LDPEG-S-SOD molekulákat egymástól ne legyenek képesek megkülönböztetni. Csupán a változó régió a polietilénoxid végén képezne az antitest számára egy egyféleképpen értelmezhető epitóp (antigéndetermináns) helyet. Ilyeténképpen azt várhatnánk, hogy CH3O-LDPEG-S-SOD és SOD-S-LDPEG-S-SOD molekulákból álló vegyületosztállyal szembeni antitestek a CH3O-LDPEG végrészletet egyedülálló módon felismernék, de nem lennének képesek egyedi módon megkülönböztetni az LDPEG-S-SOD részletet a CH3O-LDPEG-S-SOD és SOD-S-LDPEG-S-SOD molekulában, az inherensen jelenlévő szimmetria miatt. Ennek megfelelően, egy az előző keverékből álló rendszerben, ha a CH3O-LDPEG-S-SOD relatív mennyiségét a SOD-S-LDPEG-S-SOD ·· 4 · « · · 4·· · • · ··««·· · · ··· ·· · · · *
- 12 mennyiségéhez viszonyítva megnövelnénk, majd a rendszert a korábbi rendszerrel szemben létesült antitestekkel hoznák össze, úgy az antitestektől a CH3O-LDPEG epitóppal szemben fokozott, így a LDPEG-S-SOD epitóppal szemben változatlan nagyságú választ várnánk.
A találmányt a mellékelt ábrákkal jellemzzük közelebbről, az oltalmi kör korlátozása nélkül.
Az ábrához magyarázatként az alábbiakat fűzzük.
1A ábra: magas dioltartalmú PEG-SOD méretkiszorításos nagynyomású folyadékkromatográfiás vizsgálatát ábrázolja. (A továbbiakban: a méretkiszorításos nagynyomású folyadékkromatográfia rövidítése SEHPLC).
1B ábra: Alacsony dioltartalmú PEG-SOD SEHPLC vizsgálata
IC ábra: Természetes SÓD SEHPLC vizsgálata
2. ábra: A PEG-SS dioltartalmának a kelekezett nagy molekulatömegű (HMW) PEG-SOD mennyiségére gyakorolt hatását mutatjba be.
3. ábra: Magas dioltartalmú PEG-SOD kisnyomású méretkiszorításos kromatográfiával (LPSEC) Superose 6 típusú preparatív oszlopon kapott elúciós görbéjét ábrázolja.
4. ábra: A 3. ábrán szereplő frakcióegyesítések (pool) SEHPLC görbéjét mutatja be.
5. ábra: Alacsony dioltartalmú PEG-SOD kisnyomású méretkiszorításos kromatográfiával (LPSEC) Superose 6 típusú preparatív oszlopon kapott elúciós görbéjét ábrázolja.
6. ábra: Az 5. ábrán szereplő frakcióegyesítések (pool”) SEHPLC görbéjét mutatja be.
··*· ·* · • · * · · · · • · «···«· · • * «···· · · ··· ·· · «· ·
7. ábra: Az 5. ábra szerinti magas dioltartalmau 1. és 3. (LMW) frakcióinak olvadási hőmérsékletét ábrázolja.
8. ábra: Frakcionálatlan magas dioltartalmú PEG-SOD; 3. ábra szerinti 1. (HMW), 2. és 3. (LMW) frakciók SEHPLC profilját mutatja be a vizgálat kezdetekor és 2 hetes 50 %-os kezelés után.
9. ábra: Magas dioltartalmú, bázikusan hidrolizált PEGSOD kromatogrammját ábrázolja.
10. ábra: Magas (HMW) és alacsony (HMW és LMW) diol-tartalmú bázikusan hidrolizált PEG-SOD-ból kapott termékek elúciós görbéjét mutatja be.
11. ábra: Magas dioltartalmú PEG-SOD steril/pirogénmentes Superose 6 típusú preparatív oszlopon végzett frakcionálása.
12. ábra: A 11. ábra szerinti frakciók kromatogrammját mutatj a.
Magas és alacsony dioltartalmú monometoxilezett-PEG-ből előállított PEG-SOD különböző molekulatömegű komponenseit a következőképpen különítettük el és jellemeztük azokat.
A proteinek molekulatömegének jellemzésére szokásosan alkalmazott módszerek, így a méretkiszorításos kromatográfia (rövidítése SEC), ioncserélő kromatográfia (IEC) és a poliakrilamid gél-elektroforézis (PAGE) polietilénglikolokkal módosított proteinek vizsgálatára nemigen alkalmasak, mivel a képződő termék lineáris (PEG) és globuláris (SÓD) molekulák kombinációja. A SEC esetében, a kapott molekulatömeg értékek látszólagosak, minthogy az alkalmazott oszlopokat gobuláris anyagok frakcionálására tervezték, és ezért egy, a ·· ···· • · · · · ··· · • · · **«1 · · · •·· · ·· ·
- 14 protein felszínén lévő kinyújtott lineáris molekulának a jelenléte, a teljes molekulát látszólag nagyobbá teszi, mint amilyen az a valóságban. Polietilénglikolokkal módosított proteinek vizsgálatára az IEC alkalmazása sem különösebben megfelelő, mivel a PEG csoportok kinyújtott szerkezete a protein felszín és a szilárd fázis szoros kölcsönhatását nem teszi lehetővé. Az alap PAGE vizsgálatban, a migrációs jellemzőket a teljes molekula töltése és mérete befolyásolja, így festés után a PEG-SOD elkent sávokat ad. Az SDS-PAGE mintakészítés meglehetősen szigorú feltételeket szab (SDS kezelés forró vízben), így a SÓD és PEG közötti kapcsolatot létesítő részben az észterkötések részlegesen hidrolzálnak, amely miatt a kapott gélre nem kapunk felbontást és a szétkenődés is igen jelentős. Polietilénglikolhoz kapcsolt (úgynevezett pegált) proteinek vizsgálatára ezüsttel való festés nem alkalmazható, valószinűlag a protein szennyeződő felszíne és a PEG-csoportok közötti interferencia miatt, így a szennyezés tekintetében helyesen coomassie-ra kell hagyatkoznunk.
Polietilénglikollal módosított SÓD különböző molekulatömegű komponenseinek frakcionálását és ezek jellemzését SEC, foton-korrelációs spektronkópia (PCS), differenciális scanning (vizsgáló) kalorimetria (DSC) segítségével, továbbá magas hőmérsékleten végzett kezelés és bázikus hidrolízis révén, az alábbiakban ismertetjük.
Anyagok és módszerek
1. Magas és alacsony dioltartalmau PEG-SOD
Szuperoxid dizmutázt [forgalmmazója DDI, Inc. (Mountain• 4 « • » · · · • · · · ··· · * » · · * ·♦ *» ·· · diol-tar- 15 view, CA) ], magas (14-17 %) és alacsony (2,3 %) talmú metoxi-polietilénglikolból (MPEG) (Unión Carbide Corporation cégtől szereztük be) származtatott reagensekkel pegálunk. A névleges átlagos molekulatömeget alsó indexben adjuk meg.
2. Méretkiszorításos nagynyomású folyadékkromatográfia (SEHPLC)
Szilárd fázisként Superose 6 Prep Grade HR 10/30 típusú oszlopot (forgalmazója Pharmacia, Inc.), míg mozgó fázisként 150 mmólos nátrium-klorid oldatot tartalmazó 50 mmólos foszfát puffért (pH-ja 6,2) használunk. 0,7 ml/perc áramlási sebességet állítunk be, és a detektálást 214 nm-en végezzük.
SOD-ból és magas vagy alacsony dioltartalmú MeO-PEG5QQQ-ből előállított PEG-SOD-ból készített mintákat Superose HR 10/30 típusú kolonnába injektáljuk (l.ábra). A SOD-ra 24,3 perces retenciós időt kapunk (16. ábra), amely 34000-es molekulatömegnek felel meg (molekulatömeg standardok retenciós ideje alapján határoztuk meg). A magas diol-tartalmú PEG-SS-ből előállított PEG-SOD (1A. ábra) bimodális elúciós profilt ad, amelyek fő csúcsa (LMW) 18,0 percnél (látszólagos molekulatömege 400 000), míg egy korai fázisban megjelenő csúcsa (HMW) 15,4 percnél (látszólagos molekulatömege 1 000 000) figyelhető meg, együtt egy kevés, az oszlop üres térfogatába eluált anyaggal (kiszorítási hatás: 40 milliós móltömeg). A magas dioltartalmú PEG-SOD-nak megfelelő először eluálódó csúcs (HMW), a csúcs alatti terület alapján a teljes protein 30 %-ig terjedő mennyiségét képezi. Az alacsony dioltartalmú PEG-SS-ből előállított PEG-SOD (1B.
ábra) olyan bimodális elúciós profilt eredményez, amelynek magas molekulatömegű komponense, a csúcs alatti terület alapján, a teljes protein mintegy 4,8 %-a. Az alacsony dioltartalmú PEG-SOD fő csúcsának (LMW) retenciós ideje 18,6 perc (látszólagos olekulatömege 370 000), a korai fázisban eluálódó csúcsé (HMW) peidg 16,6 perc (látszólagos molekulatömege 550 000).
Miként azt az IC. ábrán illusztráljuk, a SÓD retenciós ideje 24,3 perc és ennek megfelelően számított molekulatömege 34 000. Abban az esetben, ha a SOD-ot magas diol-tartalmú PEG5Q0Q-hez kovalensen hozzákapcsoljuk, a keletkező anyag teljes molekulatömege növekszik. A magas dioltartalmú MeO-PEG5QQQ-ből előállított PEG-SOD bimodális eloszlást mutat a termék heterogenitására utalva (1A ábra).
A két főcsúcs 15,4, illetve 18,0 percnél jelenik meg, amelyek a csúcs alatti területek alapján a teljes protein 30, illetve 70 %-át képezik. A korábban eluálódó csúcsnak (retenciós ideje 15,4 perc, ez a magas molekulatömegű, rövidítve HMW, csúcs) mintegy 1 000 000 nagyságú látszólagos, számított molekulatömeg felel meg. Ez a jel egyébként egy kevés, az oszlop üres részébe eluálódó anyagot (10 percnél) is tartalmaz, ez utóbbi látszólagos moleulatömege nagyobb, mint 40 millió (VHMW). A később eluálódó csúcsnak (retenciós ideje 18,0 perc, LMW) mintegy 400 000 nagyságú látszólagos számított moleulatömeg felel meg. A módosított protein valóságos molekulatömegét ezzel a kromatográfiás módszerrel nem lehet meghatározni, mivel az oszlop látszólagos molekulatömegeket mér, minthogy a szilárd fázist kizárólag globu17 láris, és nem lineáris, proteinek felbontására tervezték. A SÓD felületéhez hozzákapcsolódó lineáris PEG molekula révén a teljes molekula szerkezete nagymértékben kinyújtotta válik, és emiatt a SEHPLC technikával végzett moleulatömeg meghatározás kvalitatíve a legjobb.
Az alacsony dioltartalmú metoxi-PEGsQQQ-ből előállított PEG-SOD elúciós profilja bár még bimodális (1B. ábra), de a HMW jel a teljes proteinre vonatkoztatva mintegy 4,8 %-ra csökken. Továbbá a HMW és LMW csúcsok retenciós ideje valamivel hosszabb (16,6, illetve 18,6 perc), mint a magas diol-tartalmú PEG-SOD esetében. Ez a megfigyelés, azzal a ténnyel együtt, hogy az alacsony dioltartalmú termék semmiféle, az oszlop üres térfogatában megjelenő VHMW típusú anyagot nem tartalmaz, arra utal, hogy a dioltartalom 2,3 %ra (14-17 %-ról) csökkentése a magas molekulatömegű anyag képződését jelentősen mérsékli. Úgy véljük, hogy a VHMW és HMW anyagok keletkezésének elsődleges oka a bisz-SS-PEG jelenléte, ami a metoxi-PEG diol-komponenséből képződik, és amely a pegálás folyamán keresztkötést létesít a különálló SÓD molekulák egymáshoz közel lévő lizin csoportjai között. Amennyiben hipotézisünk helyes, úgy a keletkező HMW anyag mennyisége arányos kell, hogy legyen a MeO-PEG kiindulási vegyület dioltartalmával.
A 2. ábrán a HMW anyag százalékát három különböző diol-tartalmú PEG-SOD dioltartalmának (14 %, 2,3 % és 1,3 % diói) függvényében ábrázoltuk. A vizsgált dioltartományban a HMW százalék és dioltartalom között csaknem lineáris összefüggés van, hipotézisünket alátámasztva, miszerint a végter18 mékben jelen lévő képződött HMW anyag mennyisége a MeO-PEG dioltartalmával arányos. Vizsgálatunk alapján, míg egy magas dioltartalmú PEG-SS-ből készített PEG-SOD előállításakor mintegy 30 % HMW anyagot tartalmazott, 5 °C-on 2 éven át tárolva a HMW-nek megfelelő jel mintegy 10 % -ra csökken, jeléül annak, hogy a HMW anyag bomlékony és tárolás közben alacsonyabb molekulatömegű anyaggá alalul át.
3. Alacsonynyomású méretkiszorításos kromatográfia (LPSEC)
1,56 1 Superose 6 (Prep Grade típusú, forgalmazója
Pharmacia) töltetű XK 50/100 típusú oszlopot, míg mozgó fázisként 500 mmólos nátrium-klorid oldatot tartalmazó 50 mmólos foszfát puffért (pH-ja 6,2) használunk. Az áramlási sebességet 2 ml/perc értékre állítjuk és a detektálást 280 nm-en végezzük. A frakciókat (12 ml) Frac-100 típusú frakciőgyűjtővel (forgalmazója Pharmacia) szedjük, SEHPLCvel analizáljuk, majd egyesítjük.
a) Magas dioltartalmú PEG-SOD frakcionálása ml magas dioltartalmú PEG-SOD-ot (koncentrációja 35,3 mg/ml) 1,59 1 Superose 6 Prep Grade típusú oszlopra viszünk. A kapott elúciós görbét a 3. ábrán mutatjuk be. A minták SEHPL analízise szerint a 15-30 frakciók, ezek egyesítve képezik az első egyesített mintát (Pool 1) (HMW-t tartalmaz) , a 40-60 frakciók a második egyesített mintát (Pool
2) , míg a 70-90 frakciók a harmadik egyesített mintát (Pool
3) (LMW) képezik.
Az egyesített minták SEHPLC elúciós görbéjét a 4. ábrán mutatjuk be.
b) Alacsony dioltartalmú PEG-SOD frakcionálása ml alacsony dioltartalmú PEG-SOD-ot (koncentrációja 28 mg/ml) 1,59 1 Superose Prep Grade 6 típusú oszlopra viszünk fel. A kapott elúciós görbét az 5. ábrán mutatjuk be. A frakciók SEHPLC analízise alapján az 5-15 frakciókat (Pool 1) (HMW) és az 50-70 frakciókat (Pool 2) (LMW) egyesítjük. Az egyesített minták (SEHPLC) elúciós görbéjét a 6. ábrán mutatjuk be.
Magas dioltartalmú PEG-SOD készítmény Superose 6 Prep Grade típusú oszlopon végzett frakcionálásával kapott elúciós görbe (3. ábra) igen hasonló az e vizsgálatban használt SEHPLC rendszerrel kapott görbéhez (1A ábra). A kapott HMW egyesített minta (4B ábra) azonban nem teljesen mentes az LMW anyagtól, valósznüleg a Superose 6 típusú oszlop feloldó-kapacitása miatt. Úgyszintén, a magas dioltartalmú PEGSOD készítményből kapott LMW anyagot (4D. ábra) kétszer kell frakcionálni, mert az LMW egyesített mintában több, mint 15 % HMW anyag van még jelen az első frakciconálás után. Másodszorra viszont, a HMW jelet a teljes protein tartalomra vonatkoztatva 9,6 %-ra lehet csökkenteni.
A frakcionált HMW és LMW anyagok enzimaktivitását is megvizsgálva, mindkettő aktívnak bizonyul (ezeket az adatokat nem adtuk meg). Specifikus aktivitását tekintve a HMW anyag inaktiválódását a frackionálatlan PEG-SOD-hoz vagy LMW anyaghoz hasonlítva, nem tapasztaltunk. E vizgálatok, és más adatok szerint is [Veronese és társai, Journal of Controlled Release, 10, 145-154 (1989)] úgy tűnik, hogy a SÓD enzim-akvitásában magas vagy alacsony dioltartalmú PEG-SS-vel vég- 20 zett módosítás után bekövetkező csökkenés az aminocsoportok módosulásával függ össze, aminek révén az enzim felületén a töltés megváltozik. A dioltartalmú PEG által okozott méretnövekedés (vagyis HMW képződése) szignifikáns aktivitás-csökkenést nem okoz. Az, hogy a HMW anyag szignifikánsan kevésbé aktív más frakciókhoz képest abszolút értelemben, egyelőre csupán spekuláció tárgyát képezi, mivel a protein-koncentráció és enzim-aktivitás mérések sokfélesége jelentős hibát okoz az adatokban.
Alacsony dioltartalmú PEG-SS-ből ellőállított PEG-SOD Superose 6 Prep Grade típusú oszlopon végzett frakcionálásával az 5. ábrán bemutatott elúciós görbét kapjuk. Miként azt a magas dioltartalmú PEG-SOD esetében tapasztaljuk, az alacsony dioltartalmú PEG-SOD elúciós görbéje igen hasonló az analitikai SEHPLC rendszerrel kapott kromatogrammhoz. Az alacsony dioltartalmú PEG-SOD esetében a terhelési/beviteli paraméterek és körülmények a magas dioltartalmú PEG-SOD esetében alkalmazottakkal csaknem azonosak, de az egyesített HMW és LMW frakciók (6B, illetve 6C ábrák) egymást szinte egyáltalán nem szennyezik; retenciós idejük 15,9, illetve
18,4 perc. Meg kell még jegyezzük, hogy a főcsúcs = LMW) mind a magas, mind pedig az alacsony dioltartalmú termék, esetében közel azonos retenciós idővel (magas dioltartalom esetében 18,0, alacsony dioltartalmú termékeknél 18,6 percnél) jelenik meg, arra utalva hogy a főtermék, a dioltartalomtól függetlenül, hasonló.
4. Foton korrelációs spektroszkópia (PCS)
A molekulaméret meghatározására Maivein Model 4700 PCS » ·
- 21 készüléket 3 Wattos Spectraphysics lézerrel 488 nm-en működtetve használ. A mintákat és a referens oldatot 25 °C-on tartjuk SOD-ból (ionmentes vízben) és PEG-SOD-ból (magas és alacsony dioltartalmú termékek) 150 mmólos nátrium-kloridot tartalmazó 50 mmólos foszfát pufferrel (pH-ja 6,2) 10 mg/ml koncentrációjú oldatokat készítünk. A HMW és LMW mintákat 500 mmólos nátrium-klorid oldatot tartalmazó 50 mmólos foszfát pufferrel (pH-ja 6,2) 10 mg/ml koncentrációkban készítjük el. A 2 ml térfogatú mintákat 0,2 /xm-es, 25 mm átmérőjű Millipore GV típusú szűrőn tiszta küvettákba szűrjük és minden mérés előtt 15 percen át ekvilibráljuk.
A SÓD - amelyet ez esetben referensként használtunk molekuláris mérete 3 nm-nek adódik, jó egyezésben az irodalmi adattal, míg a nem-frakcionált magas dioltartalmú PEGSOD molekuláris mérete 14 nm. A magas dioltartalmú PEG-SOD frakcionálásával nyert HMW és LMW termékek molekuláris mérete 22, illetve 12 nm. A nem-frakcionált alacsony diol-tartalmú PEG-SOD átlagos molekuláris mérete 11 nm.
5. Differenciális scanning kalorimetria (differential scanning calorimetry, DSC)
Mikrokal MC-2 típusú differenciális scanning kalorimétert használunk. A kiindulási hőmérséklet 36 °C, mérési (scanning) sebesség 60 °C/óra és a véghőmérséklet 105 °C a mérés során, mérési koncentrációk: 5 mg/ml SÓD és az 1. számú egyesített minta (HMW) esetében, és 6,9 mg/ml a 3. számú minta (LMW) esetében (az 1. és 3. számú mintákat magas dioltartalmú PEG-SOD frakcionálásával kaptuk). A mintákat 500 mmólos nátrium-klorid oldatot tartalmazó 50 mmólos fősz« ·
fát pufferrel (pH-ja 6,2) készítjük. A mintákat és a referens puffért 0,2 gm méretű szűrőn szűrjük át és a mérés előtt 30 percen át 35 °C-on ekvilibráljuk.
A magas dioltartalmú PEG-SOD-ból frakcionálással nyert 1. és 3. számú (LMW) minták olvadási hőmérséklete, Tm, közelítőleg 71 °C, illetve 91 °C (lásd 7. ábra), míg a referensként használt SÓD olvadási hőmérséklete 93 °C (ezt az adatot nem tüntettük fel az ábrán).
6. Steril/pirogénmentes gélszűrés (S/PF GF)
A 3. pontban ismertetett oszlopot használjuk. Az oszlopot 2 1 0,1 mólos nátrium-hidroxid-oldattal előmossuk és legalább 10 1, előzetesen 0,2 gm méretű szűrőn átszűrt és endotoxinoktól mentes (kvantitatív kromogén LAL mérés Whittaker Bioproducts, P/N 50-647-U - szerint) pufferrel ekvilibráljuk. Amiután az oszlop eluens endotoxin szintje kevesebb, mint 1 EU/ml értéknek felel meg, az elúciót és mintagyűjtést a 3. pontban leírtak szerint végezük. Magas dioltartalmú PEG-SOD 25 ml-ét pirogénmentesített 1,56 1-es Superose 6 Prep Grade típusú oszlopra visszük fel; a kapott elúciós görbét a 11. ábrán mutatjuk be. A frakciókat analitikai SEHPLC szerint egyesítjük, majd újra kromatografáljuk; az így kapott kromatogrammokat a 12. ábrán mutatjuk be (ahol Pool 1 VHMW-nak, a Pool 2 HMW-nek és a Pool 3 LMW-nek felel meg) . A frakciók hozamát (mg fehérjében kifejezve) és endotoxin tartalmát az 1. táblázatban foglaljuk össze.
1. táblázat
Steril/pirogénmentes gélszűrés
Magas dioltartalmú PEG-SOD különböző molekulatömegű komponenseinek hozama
| Egyesített minta (Pool) | Mintanév | mg/ml | ml | mg | EU/ml | EU/mg |
| 1. | VHMW | 1,55 | 4 | 6,2 | 25 | 16 |
| 2. | HMW | 4,65 | 14 | 65 | 1 | 0,1 |
| 3. | LMW | 22,2 | 11,5 | 255 | 360 | 16 |
7. Kezelés magas hőmérsékleten
Magas dioltartalmú PEG-SOD frakcionálásával nyert termékből, valamint nem-frakcionált magas dioltartalmú PEG-SOD-ból foszfát/só pufferrel 2 mg/ml koncentrációjú oldatot készítünk és az oldatokat sterilen szűrjük. A mintákat üveg ampullákba helyezzük, majd azokat 4, 22, 30, 40 és 50 °C hőmérsékleten tartjuk. Ezután, előre meghatározott időpontokban SEHPLC módszerrel analízist végzünk.
Nem-frakcionáált magas dioltartalmú PEG-SOD SEHPLC kromatogrammjait a vizsgálat kezdetekor a 3. ábrán, ahol az 1. számú egyesített minta (Pool 1) HMW-nek, a 2. és 3. számú (Pool 2 és Pool 3) LMW-nek felel meg; az 50 °C-on 2 héten át végzett tárolás után a 8. ábrán mutatjuk be.
A HMW és LMW anyagok 7. ábrán bemutatott termogrammjai alapján megállapíthatjuk, hogy a HMW anyag olvadáspontja sokkal alacsonyabb (71 °C, szemben a 91 °C-kal), amely arra utal, hogy a HMW termék hőérzékenysége jelentősen nagyobb. Ez egyben magyarázat lehet arra, hogy a HMW anyag, még hűtőszekrényben tárolva is, tárolás közben LMW anyaggá alakul * ·
- 24 át. A mindkét termogrammon megfigyelhető szekunder csúcs valószínűleg onnan ered, hogy a HMW mintát LMW, míg az LMW mintát HMW szennyezi (lásd 4A és 4D ábrák).
A következőkben PEG-SOD, HMW, 2. számú egyesített minta (Pool 2) és az LMW minták molekuláris eloszlását vizsgáljuk 2 hetes 50 °C-on végzett kezelés után. Miként azt a 8. ábrán a SEHPLC jel mutatja, a HMW anyag molekuláris integritására ez a kezelés jelentős hatást fejt ki. A magas dioltartalmú PEG-SOD (8A és 8B ábrák) esetében a HMW csúcs a teljes protein tartalom több, mint 30 %-áról kevesebb, mint 10 %ára csökken, ugyanakkor a főcsúcs retenciós ideje 18,3 percről 19,1 percre nő. A frakcionált HMW minta esetében az 50 °C-on végzett kezelés az anyaag eredeti szerkezetét teljesen megbontja és olyan elúciós görbét kapunk, amely magas dioltartalmú MeO-PEG-ből előállított, 2 éven át 4 °C-on tárolt PEG-SOD-éhoz (az ábrán ezt nem tüntettük fel) igen hasonló. Az 50 °C-on kezelt HMW főcsúcs 19,3 percnél figyelhető meg, és ez a teljes tartalom csaknem 90 %-át képviseli (lásd 8C és 8D ábrák). Hasonló hatások figyelhetők meg a 3. számú egyesített minta (Pool 2) és az LMW frakciók esetében is, ahol a HMW jel gyakorlatilag eltűnik. Mindent egybevetve, a differenciális scanning kalorimetriás mérés és az 50 ’C-os hőkezelés adatai azt mutatják, hogy a HMW anyag hőérzékeny és lényegében nem stabilis. E megfigyeléseket 4 °C-os tárolásra is extrapoIálhatjuk, és akkor az várható, hogy a HMW jel időben csökken.
8. Bázikus hidrolízis
HMW, LMW és nem-frakcionált magas dioltartalmú PEG-SOD mintákat bázikusan hidrolizálunk (pH 10,8-12,02 tartományban). Az oldatok pH-ját 0,1 mólos nátrium-hidroxid oldattal állítjuk be és a mintákat szobahőmérsékleten 2 órán át inkubáljuk. A mintákat protein meghatározás céljából SEHPLC módszerrel kromatografáljuk, referensként SÓD és szukcinil-SOD mintákat használunk (a módszert az 1. pontban ismertettük) . A szabad PEG-et a 6. pontban leírt HPLC-módszerrel mérjük.
Protein komponens: Magas dioltartalmú PEG-SOD minták bázikus, 10,5 és 12,3 közötti pH-tartományban (0,3 pH egységenként) végzett hidrolízisének elúciós profilját a 9. ábrán mutatjuk be, referensként SÓD és szukcinil-SOD szerepel az ábrán.
PEG komponens: Magas dioltartalmú HMW minták bázikus, pH = 12,3 értéken végzett hidrolízisének elúciós görbéjét a 10A ábrán adjuk meg. Magas dioltartalmú PEG-SS (5000 MW) SEHPLC kromatogrammját a 10B ábrán mutatjuk be. Alacsony dioltartalmú HMW és LMW minták bázikus hidrolízisével nyert elúciós görbéket a 10C, illetve a 10D ábrákon tüntettük fel. A különböző dioltartalmú PEG-SOD minták bázikus hidrolízisével kapott PEG retenciós időket és referens vegyületeket a 2. táblázatban ismertetjük.
• ·
- 26 2. táblázat PEG kromatográfia Bázikus hidrolízissel magas és alacsony dioltartalmú készítményekből kapott PEG-SOD HMW termékek és különböző molekulatömegű PEG-ek retenciós ideje
| Minta | Diói | Retenciós idő | csúcs | % |
| PEG-SOD, HMW | magas | 13,19 | 1 | 24 |
| magas | 13,72 | 2 | 76 | |
| PEG-SOD, HMW | alacsony | 13,19 | 1 | 5 |
| alacsony | 13,72 | 2 | 95 | |
| MeO-PEG 5000 | magas | 13,05 | 1 | 28 |
| magas | 13,59 | 2 | 72 | |
| MeO-PEG 5000 | alacsony | 13,19 | 1 | 1 |
| alacsony | 13,72 | 2 | 99 | |
| Peg 8000 | * | 13,14 | 1 | 100 |
| Peg 10000 | * | 12,82 | 1 | 100 |
* molekultömeg marker; 100 % diói
Magas dioltartalmú PEG-SOD különböző mértékű bázikus hidrolízisekor (9. ábra), ha a hidrolízist pH > 10,8 értékeknél végezzük, egy, a szukcinil-SOD-nak megfelelő csúcs (retenciós ideje 23,8 perc) kezd el megjelenni (lásd 9C ábra). A pH-t 10,8 -ról 12,3-ra növelve, az eredeti PEG-SOD csúcs fokozatos csökkenése és a szukcinil-SOD csúcsához hasonló csúcs megjelenése figyelhető meg. Végül, 12,0 és 12,3 közötti pH értékeken (9F és 9G ábrák) a hidrolízis teljesnek látszik és a végtermék retenciós ideje hasonló a szukcinil-SOD retenciós idejéhez. Még enyhén bázikus körülmények között is (9B ára) , a HMW jel rendkívül érzékeny bázis hatására, arra utalva, hogy e termékben egy primer kötés valószínűleg észter-kötés. Ezek az adatok alapvetően fontosak a HMW anyag jellemzéséhez. Bár e helyen nem mutattuk be, meg• · • · · · · « · * · ·*···· · • · · · · ·β · · · ··· ·· · ·· ·
- 27 állapítottuk, hogy nem-frakcionált PEG-SOD-ot és HMW anyagot nátrium-dodecil-szulfáttal kezelve (SDS kezelés) nem történik változás, annak jeleként, hogy a HMW anyagot nem-ionos kötések tartják össze. SDS jelenlétében merkapto-etanollal végzett redukcióban is a HMW anyag változatlan marad, ez esetben arra utalva, hogy a HMW anyagot nem diszulfid kötések tartják össze.
Magas és alacsony dioltartalmú PEG-SOD-ból származó HMW anyagot bázikusan hidrolizálva valamennyi hidrolizátum elúciós görbéje jelentősen eltér a szabad MeO-PEG-elúciós görbéjétől (lásd 10. ábra). A 10A ábrából kitűnik, hogy a magas dioltartalmú PEG-SOD-ból származó HMW egy jellegében bimodális PEG csúcsot ad, a csúcsok megjelenési helye 13,2 és 13,7 perc, amelyek 8000-es, illetve 5000-es molekulatömegnek felelnek meg (vö. 2. tálázat). A pegálási reakcióban használt MeO-PEG átlagos molekulatömege 5000. A 8000-es molekulatömegű PEG jelenléte olyan diói anyaggal van összefüggésben, amely etilén-oxid polimerizációja alatt képződik, és amely magasabb molekulatömegű PEG polimer képződéséhez vezet a polimer mindkét végén végbemenő láncnövekedés révén (vö. 8000 molekulatömeg szemben az 5000-es molekulatömeggel). A 8000-es és 5000-es molekulatömegű PEG csúcs alatti területek aránya a HMW hidrolizátumban mintegy 24 : 76, míg a PEG-SS kiindulási anyag esetében a megfelelő érték 14 : 86. Ezért, nyilvánvalóan a HMW anyagban a 8000-es molekulatömegű PEG nagyobb arányban van jelen. Ezzel szemben, alacsony diol-tartalmú PEG-SOD-ból származó HMW vagy LMW frakciókat bázikus hidrolízis után analizálva, a domináns csúcs (95 %-nál • · · · · • ··*··· · • ······ · · •· · ·· · nagyobb) az 5000-es molekulatömegű PEG-nek felel meg, míg a 8000-es molekultömegű PEG csak kis mennyiségben van jelen (HMW esetében 5 %-ban és LMW esetében 1 %-nál kevesebb; lásd 10C és 10D ábrák). A 8000-es molekulatömegű PEG szennyezés már az alacsony dioltartalmú PEG-SS-ben jelen van (vö. 2. táblázat), és hasonlóan a magas dioltartalmau PEG-SOD-nál tapasztaltakhoz, a 8000-es moleulatömegű PEG, úgy tűnik, hogy a HMW anyagban halmozódik fel. E vizsgálatokból következik, hogy a 8000-es molekulatömegű PEG SEHPLC jelet markerként használhatjuk bázikus hidrolízis után a termékben lévő keresztkötéssel bíró PEG-SOD mennyiségének meghatározására.
Az eredmények arra engednek következtetni, hogy a végtermék PEG-SOD-ban képződött HMW anyag mennyisége a szintézishez használt MEO-PEG dioltartalmával van összefüggésben. A SÓD koncentrációja a reakcióélégyben szintén befolyásolhatja a keletkező HMW anyag mennyiségét (tömeghatás révén), mégis a HMW anyag képződésnek alap mechanizmusaként a bisz-SS-PEG által médiáit SÓD molekulák közötti keresztkötések kialakulása szolgálhat.
Kiindulási anyagok, intermedierek és reagensek Szuperoxid-dizmutáz
Szuperoxid-dizmutáz alatt enzimek egy olyan csoportját értjük, amelyek a szuperoxid anion gyök (02~‘ oxigénre és hidrogén-peroxidra való szétesését katalizálják. Az International Unión of Biochemistry (Nemzetközi Biokémiai Egyesület) szisztémátikus nómenklatúrája szerint a SÓD neve szuperoxid oxido-reduktáz, klasszifikációs száma 1.15.1.1. Az ilyen típusú anyagokat orogteineknek és hemokupreineknek, úgyszintén szuperoxid-dizmutázoknak nevezik; molekutatömegük mintegy 4000-től mintegy 48000-ig terjed. A réz-cink dizmutázok a teljes szerkezeti tulajdonságok tekintetében figyelemre méltóan konzervált családot képeznek. Kivétel nélkül igazolták, hogy a tisztított enzimeknek dimer szerkezetük van (molekulatömegük rendszerint 31000-33000), és mólonként 2 mól réz- és 2 mól cink-iont tartalmaznak. A mangán/vas tartalmú enzim-család nem ilyen egységes olyan alaptulajdonságok tekintetében, mint amilyen a molekulatömeg, alegység szerkezet és fémtartalom. Némelyikük dimer, mások tetramer szerkezettel rendelkeznek. A fémtartalam mintegy 0,5 és 1 mól között változhat a polipeptid lánc alegység 1 móljára vonatkoztatva. A kinézetben előforduló Zn/Cu-tartalmú emlőseredetű enzimeket és szerkezetileg megfelelő analógjaikat, valamint mutánsaikat emlős Zn/Cu szuperoxid dizmutázoknak (mSOD) tekintjük.
A találmány szerinti készítményekben az mSOD bármilyen eredetű lehet. így kereskedelemben beszerezhető, marha és humán eritrocitákból (vörösvérsejtekből) származó, és mikroorganizmusokban rekombináns szintézissel kapott, például E.coli-ban és élesztőben előállított mSOD. Más eredetű is lehet, például Cupri-Zinc marhamáj szuperoxiddizmutázt (SÓD, EC 1.15.1.1) is használhatunk, amelyet a DDI Pharmaceuticals cégtől (Mountain View, California) szerezhetünk be.
Polietilénglikol
A találmány értelmében alacsony dioltartalmú PEG-et használunk biológiailag aktív proteinekhez való hozzákapcso• ·
lásra. Bizonyos molekutlatömegű metoxi-polietilénglikol termékek a kereskedelemben hozzáférhetők (például a metoxi-PEG5000 Két formában szerezhető be az Unión Carbide Corporation cégtől, a szokásosan árusotítt magas diol-tartalmú metoxi-PEG50QQ, amely 14-17 % nagyobb molekulatömegű PEG dióit tartalmaz, és egy alacsony dioltartalmú termék, amely kevesebb, mint 4 % PEG dióit tartalmaz) . Másokat készíteni és tisztítani kell, hogy a pegált protein alacsony immunogenitással rendelkezzék. így például, a SÓD valamilyen, kereskedelemből származó metoxi-PEG-SS-sel végzett pegálásával nagy molekulatömegű komponenseket tartalmazó terméket kapunk (ezt méretkiszorításos kromatográfiával a fentiek szerint igazoltuk). Úgy véljük, hogy a magas molekulatömegű termék úgy képződik, hogy a kereskedelmi M-PEG-ben különböző mennyiségben jelen lévő PEG-diol-ból aktív diészter képződik, amelynek közreműködésével protein keresztkötések létesülnek. Az egyedileg előforduló aktív észterek, bár ugyanazon a polimer láncon találhatók, kémiai szempontból egymástól távol vannak. Vagyis, egy második reaktív funkciós hely jelenléte a polimerben az első reaktív funkciós hely reaktivitás között. Az egyéni reaktivitások így a polimer lánc ellentétes végein egymástól függetlenül kezdenek működni, és ezért, hacsak a reagensek nem végtelenül híg oldatban vannak jelen, a keresztkötés nem kerülhető el. Ennek megfelelően, lényeges, hogy olyan M-PEG-SS terméket állítsunk elő, amely ismert módon csak nagyon kevés diésztert, előnyösen diésztert egyáltalán nem tartalmaz. Polietilégnlikol 2000 metoxi-polietilénglikol 2000-től való megtisztítását • · · · ·* ···» • · * · · » ♦ ·· ··«··· V · ······ · · ··· «· · ·* · leírják (S. Zalipsky és társai: Journal of Bioactive and Compatible Polymers, Vol. 1990. április 5., pp. 227-231). Szukcinát-észtereket is előállítunk és elkülönítésüket ioncsere kromatográfiával DEAE-Sephadexen végezzük el. A preparatív módszert a 4. példában írjuk le.
Jóllehet a 4. példában ismertetett módszer jól használható PAEG-2000 esetében, nagyobb molekulatömegű polietilénglikoloknál nem alkalmazható. A magasabb molekulatömegű PEG savak nem kötődnek sem anionos sem kationos gyantákhoz, mivel a polietilén váz nagyobb tömege, a feltételezés szerint, a megfelelő sav minden ionos tulajdonságát elfedi. Úgy találtuk, hogy PEG-szukcinátok kötéséhez rendkívül alacsony ionerősségű puffért kell használni, és elúciójukat az ionerősség nagyon kis növelésével lehet megvalósítani. Ez azt mutatja, hogy a gyanta azokat csak nagyon gyenge kötéssel köti.
Vizsgálataink szerint magas molekulatömegű metoxi-PEG-ek a diói komponensektől elkülöníthetők, ha a hidroxil-funkciókat először dimetoxi-tritil (DMT) éterekké alakítjuk, majd fordított fázisú vékonyréteg kromatográfiát végzünk. A hidroxilcsoportokat ezután savas kezeléssel tehetjük szabaddá.
Metoxi-PEG5QQQ-(dimetoxi-tritil) (rövidítése M-PEG-DMT) származékok előállítását és tisztítását főbb vonalakban az alábbiakban, részleteiben az 5-8. példákban írjuk le.
M-PEG-DMT és DMT-PEG-DMT előállítását azonos módon végeztük.
A poliétert etanolmentes kloroformban feloldjuk, és az oldatot úgy szárítjuk meg, hogy atmoszférikus nyomáson argon • ·· « ·· • · · · « 9 a·*·*··· · • · ····«· · · ··· ·· · ·· ·
- 32 alatt a kloroform mintegy felét kidesztilláljuk. Ezután az oldatot szobahőmérsékletre hagyjuk lehűlni argon alatt, majd egymás után, feleslegben véve diizopropil-etil-amint (1,5 ekvivanlenst), katalizátorként 20 mól% 4-(dimetil-amino)-piridint és végül, ugyancsak feleslegben (1,2 ekvivalenst), 4,4-dimetoxi-tritil-kloridot adunk hozzá. Az oldatot 15 óra múlva rotavapor készüléken betöményítjük, és a maradékot vízmentes éterhez adjuk a tritilezett PEG leválasztás a céljából. Normálfázisu vékonyréteg kromatográfiás vizsgálatot végezve, a termék a kindulási anyagtól jól elkülönül, a PEGváz Dragendorf-féle reagenssel megfestődik. Abban az esetben, ha az M-PEG-DMT a DMT-PEG-DMT-től nem válik el normálfázisu vékonyréteg kromatogáfiával, úgy C-18 fordított fázisú vékonyrétegen az M-PEG-DMT, DMT-PEG-DMT, DMT-klorid és DMT-alkohol egymástól jól elválnak (mozgó fázisként acetonitril-víz-izopropanol 4:1:1 elegyet használunk). A PEGvázat a Dragendorf-féle festéssel kapott narancsszín, míg a tritilcsoport beépülését a lap sósav gőzzel végzett kezelése után megjelenő narancszín erősíti meg.
Autentikus M-PEG-DMT 5000 és autentikus DMT-PEG-DMT 8000 egymástól jól elkülönülnek Waters C-8, 300 A pórusméretű,
15-20 μ részecskeméretű Preg-Pak Bondapak típusú tölteten. A nyers M-PEG-DMT-t 30 % acetonitrilt tartalmazó vízben mintegy 12 mg/ml koncentárcióban szonikálással feloldjuk és 2,5 μ méretű szűrőn átszűrjük. A mintát az eluálószerként használt 30 % acetonitrilt tartalmazó vízben (2 g-ot 25 ml-ben) feloldva visszük fel az oszlopra. Izokratikus elúciót végzünk 8 percen át, amikoris egy szennyező csúcs eluálódik (ez ·« «
- 33 a komponens ismeretlen; 280 nm-en intenzív abszorbcióval, de igen alacsony relatív tömeggel rendelkezik). Ezután 30-70 % acetonitril/víz rendszerrel gradiens elúciót végzünk 21 percen át. A kívánt termék, az M-PEG-DMT, 58-60 % acetonitriltartalomnál, míg az autentikus DM-T-PEG-DMT jellemzően 80 % acetonitriltartalomnál eluálódik. A kívánt csúcs első 3/4 részét összegyűjtük, az utolsó 1/4-ét elöntjük. Ily módon
22,6 g nyers M-PEG-DMT vegyületből 15,4 g tisztított M-PEGDMT terméket kapunk.
A tritilcsoport lehasítását a fenti M-PEG-DMT termékről a következőképpen végezzük.
A DMT lehasítását M-PEG-DMT-ből hidrogén-kloriddal végezve, a hígítatlan nyers reakcióelegy vékonyréteg kromatográfiás vizgálata alapján, a tritilcsoport teljesen lehasad. A kloroformos extraktum betöményítésével azonban egy fordított irányú reakció megy végbe, amelynek eredménye a PEG jelentős részének ujratritileződése. Szelektív lecsapással ezt a terméket nem tudtuk megtisztítani. A hidratált tritil-kation és klorid nyilvánvalóan egyensúlyban vannak, ami azzal jár, hogy a dehidratálás, amely az oldószer eltávolításakor megy végbe, számottevő mennyiségű DMT-kloridot eredményez. Az újratritileződést nem-ekvilibráló ellenion alkalmazásával előzhetjük meg. Kénsav, a vizsgálatok szerint, az M-PEG-DMT vegyület irreverzibilisen detritilezi. A kénsavas hasítással kapott M-PEG-et kloroformba extraháljuk át, majd az extraktumot betöményítjük és éterhez adva kicsapjuk a diol-mentes terméket. így 10 g M-PEG-DMT hasításával 8,68 g diol-mentes M-PEG-et kapunk. Méretkiszorításos kromatográfiás vizsgálat «4 «
- 34 alapján a termék dioltartalma kevesebb, mint 0,3 %.
Más, magasabb molekulatömegű metoxi-PEG-származékokat analóg módszerekkel állíthatunk elő.
A találmányt az alábbi példákkal világítjuk meg közelebbről az oltalmi kör korlátozása nélkül.
1. példa
A. lépés: Metoxi-polietilénglikol-szukcinát (M-PEG-S)
Egy 2 1-es lombikba 100 g (0,02 mól) metoxi-PEG5ooo~et (M-PEG) mérünk be és keverés közben 300 ml 40 °C-os vízmentes toluolban feloldjuk. Nitorégatmoszférában aezotróposan 147 ml toluolt desztillálunk ki, ily módon a M-PEG víztartalmát 1,73 %-ról 0,23 %-ra csökkentjük. Az oldatot szobahőmérsékletre lehűtjük, és 233 ml száraz metilén-kloridőt, majd 3,0 g (0,09 mól) borostyánkősav-anhidridet és 1,1 g (0,01 mól) 4-(dimetil-amino)-piridint (DMAP) adunk hozzá. A reakcióelegyet keverés közben egy éjjelen át visszafolyatással forraljuk, majd vákuumban 200 ml metilén-kloridot ledesztillálunk. A maradékot egy 4 1-es lombikban 1,6 1 éterhez adjuk keverés közben. A keverést 45 percen át folytatjuk, majd a szilárd anyagot szűréssel elkülönítjük, és a nuccstortát 70 ml éterrel mossuk, majd vákuumban szárítjuk, így 100,4 g nyers, fehér színű szilárd m-PEG-szukcinátot (m—PEG-S) kapunk, amely DMAP-t is tartalmaz.
A nyers M-PEG-S 100 g-ját 633 ml metilén-kloridban feloldjuk és az oldatot 114 g, előzőleg 272 ml dioxánnal, majd 316 ml száraz metién-kloriddal mosott, Dowex 50x8-100H+ típusú gyantát tartalmazó oszlopon eresztjük át. Az oszlopot még további 316 ml metilén-kloriddal mossuk, majd az eluátu• μ ···· • 9 · · · ··· · • · · ··»· · · · • ·· ·· 9 ·· ·
- 35 mókát egyesítjük és vízmentes magnézium-szulfáton szárítjuk. Ezután a metilén-kloridot (800 ml-t) vákuumban lepároljuk. A maradék oldatot keverés közben 4 1-es lombikban 1600 ml éterhez adjuk. A keverést 30 percen át folytatjuk, majd a szuszpenziót további 30 percen át állni hagyjuk, és szűrjük. A csapadékot 75 ml éterrel mossuk, vákuumban szárítjuk. így fehér szilárd anyagként 96,0 g (hozam: 94 %) m-PEG-S vegyületet kapunk, amelynek 1H NMR spektruma a várt szerkezettel összhangban van. 1H NMR (CDC13): 4,27 (triplett, 2H, -CH2-O-C(=O)-), 3,68 (nagy szingulett, skálán kívül PEG metilén 0-CH2-), 3,39 (szingulett, 3H, OCH3) és 2,65 ppm (keskeny multiplett, 4H, -C(=O)-CH2-CH2-C(=0)-). A savtartalmat titrálással határozzuk meg, értéke: 0,000207 mól/g.
B. lépés: Metoxi-polietilénglikol-N-szukcininidil-szukcinát (M—PEG—SS)
Egy 2 1-es lombikban 98,48 g (0,0192 mól) metoxi-polietilénglikol-szukcinátot (m-PEG-S) 468 ml száraz toluolban 40 °C-ra melegítve feloldunk. Az oldatot leszűrjük, és térfogatát 263 ml-rel csökkentjük nitrogénatmoszférában végzett azeotropikus desztillációval. A kapott viszkózus folyadékot 22 ml száraz metilén-kloriddal nitrogénatmoszférában 1 1-es háromnyaku lombikba visszük át, majd 2,22 g (0,0192 mól) N—hidroxi-szukcinimidet adunk hozzá és addig keverjük, míg az N-hidroxi-szukcinimid fel nem oldódig. Ezt köetően a reakcióelegyet jégfürdővel 5 °C-ra hűtjük és 4,44 g (0,0125 mól) diciklohexil-kabrodiimid (DCC) 24 ml metilén-kloriddal készített oldatát 5 perc alatt hozzácsepegtetjük. Az oldat becsepegése közben a reakcióelegyből a diciklohexil-karbamid ·4··
- 36 (DCU) kiválása megkezdődik. A reakcióelegyet szobahőmérsékletre hagyjuk felmelegedni és egy éjjelen át keverjük. Ezután a reakcióelegyet egy 2 1-es lombikba öntjük át, és a lombikot 25 ml metilén-kloriddal átöblítjük. Az oldatból vákuumban 30 °C-on 250 ml metilén-kloridot párolunk le, és a kapott szuszpenziót leszűrjük. A nuccstortát 25 ml száraz toluollal mossuk. A szürletet 1,2 1 vízmentes éterhez adjuk keverés közben és a kapott szuszpenziót 45 percen át keverjük, majd szűrjük. A nuccstortát 100 ml vízmentes éterrel átöblítjük, majd 2 órán át latex gumizár alatt szárítjuk.
A kapott szilárd anyagot nagyvákuumban szárítjuk és argonsátorban üvegedénybe tesszük. így 96,13 g (hozama 96,1 %) cim szerinti vegyületet (m-PEG-SS) kapunk fehér szilárd formában. ^-H NMR spektruma összhangban van a várt szerkezettel. XH NMR (CDC13): 4,32 (triplett, 2H, -CH2-O-C(=0)-), 3,68 (nagy szingulett, skálán kivül, PEG metilén O-CH2~), 3,39 (szingulett, 3H, OCH3) , 2,99 és 2,80 (triplett pár, 2-2H, szukcinát -C(=0)-CH2CH2_C(=0)-) és 2,85 ppm (szingulett, 4H, szukcinimid -C(=O)-CH2CH2~C(=O)-). A termék aktív-észter tartalmát feleslegben vett benzil-aminnal toluolban végzett reakciót követő visszatitrálással határozzuk meg. A visszatitrálást perklórsawal dioxánban metilvörös indikátor-végpontig végezzük. Az aktív-észter tartalom 0,000182 mól/g.
C. lépés: Alacsony dioltartalmú PEG-SOD
SÓD vízzel készített 82,1 mg protein/g oldat koncentrációjú oldatának 11,8 g-ját 0,1 mólos foszfát pufferrel pH
7,8 értéken 200 g össztömegre hígítjuk. A mágneses keverővei kevert oldathoz 30 °C-on ezután 3,4 g IB példa szerint elő- állított alacsony dioltartalmú metoxi PEG-SS vegyületet adunk. A reakcióelegy pH-ját adott esetben állandóan pH 7,8-en tartjuk, ezt Mettler DL25 típusú titráló berendezéssel biztosítjuk, amelyet pH stat üzemmódban működtetünk, és elegendő mennyiségben 0,5 n nátrium-hidroxid oldattal látjuk el. A reakcióelegyet 1 óra múlva 0,2 mikron méretű alacsony fehérje kötő képességű poliszulfon szűrőn szűrjük át, majd mintegy 60 ml-re töményítjük. Ezt rozsdamentes acél Millipore Mini-tan típusú berendezéssel végezzük, amelyet 30000 NMWL 4pk típusú membránnal láttunk el. Ezután 2 1 mmólos nátrium-foszfáttal puff éráit 0,85 %-os sóoldattal szemben, 6,2-6,3 pH értéken, diaszűrést végzünk.
2. példa
Magas dioltartalmú PEG-SOD
Magas dioltartalmú PEG-SOD-ot magas dioltartalmú PEG-SSből állítjuk elő, mint ahogyan az alacsony dioltartalmú PEGSOD-ot állítottuk elő.
3. példa
A. lépés: Monometoxi-polietilénglikol-szukcinát
Egy 12 1-es háromnyakú lombikba 4 1 toluolt és 2212 g metoxi-polietilénglikolt töltünk be, nitrogénatmoszférában 70 °C-ra történt felmelegítés után. Ezután csökkentett nyomáson azeotropikusan 1,3 1 toluolt eltávolítunk az elegyből, majd az oldatot 30 °C-ra hűtjük és 4 1 metilén-kloridot, majd 66,4 g borostyánkősavanhidridet és 24,4 g 4-(dimetil-amino)-piridint adunk hozzá. A reakcióelegyet 32 órán át visszafolyatással forraljuk, majd 3,8 1 metilén-kloridot atmoszférikus nyomáson kidesztillálunk. A reakcióelegyet le- 38 hűtjük és keverés közben 28 1 metil-terc-butil-étert tartalmazó 25 1-es üveg ballonba öntjük. A kapott szuszpenziót 1 órán át keverjük, és Lapp-szűrőn szűrjük. A nuccstortát 1 1 metil-terc-butil-éterrel mossuk. Vákuumban, egy éjjelen át szobahőmérsékleten végzett szárítás után 2,252 kg nyers, fehér színű szilárd cím szerinti vegyületet kapunk.
A nyers cím szerinti vegyületet 8 1 metilén-kloridban feloldjuk, és 3,0 kg Dowex 50W-X8 típusú gyantát (hidrogén-formában lévő kationcserélő gyanta) tartalmazó üveg nyomásálló oszlopon - amelyet előzőleg 5 1 acetonnal, majd 4 1 metilén-kloriddal mosunk - átbocsátjuk. Az oszlopon ezután 3 1 metilén-kloriddal mossuk. Az eluátumokat egyesítjük és 10 1 metilén-kloridot atmoszférikus nyomáson eltávolítunk. A visszamaradó oldatot keverés közben 26 1 metil-terc-butil-éterbe öntjük. A kapott szuszpenziót 45 percen át keverjük, majd a szilárd anyagot szűréssel elkülönítjük és 3 1 metil-terc-butil-éterrel mossuk. Vákuum szárítószekrényben szobahőmérsékleten szárítjuk. így 2,46 kg (hozam 95 %) fehér színű szilárd cím szerinti vegyületet kapunk, amely 1,5 % metoxi-polietilénglikolt tartalmaz, és tartalma mérés szerint 2,72 x 10~4 mól/g (számított tartalom 1,96 χ 10“4 mól/g).
B. lépés: Metoxi-polietilénglikol-N-szukcinimidil-szukcinát
Egy 12 1-es lombikban nitrogénatmoszférában 1,5 kg monometoxi-polietilénglikol-szukcinátot 7,2 1 toluolban melegen feloldunk, és az oldat térfogatát a víz eltávolítása céljából vákuumban 2,8 1-re csökkentjük. A kapott viszkózus óla• · .: . . · . « ... *·· · .:. ·..· ··:· *..* *·
- 39 jat 40-45 °C-ra hűtjük és 3,4 1 metilén-kloridőt, majd
33,89 g N-hidroxi-szukcinimidet adunk hozzá. A reakcióelegyet 1 órán át keverjük, míg az N-hidroxi-szukcinimid teljes mennyisége fel nem oldódik. Ezután 20 °C-ra hűtjük és 67,75 g 1,3 diciklohexil-karbodiimid (DCC) 368 ml metilén-kloriddal készített oldatát csepegtetjük hozzá 30 perc alatt. A reakcióelegyet lassan szobahőmérsékletre engedjük felmelegedni, miközben 18 órán át keverjük, majd térfogatát atmoszférikus nyomáson 3,2 1-rel csökkentjük. A kapott szuszpenziót 0-5 °C-ra hűtjük és 30 percen át keverjük, majd szűrjük. A nuccstortát 250 ml toluollal mossuk, a szürletet és a mosóiét keverés közben 28 1 metil-terc-butil-éterhez adjuk. Az így kapott szuszpenziót 45 percen át keverjük, majd Lapp-szűrőn leszűrjük. A nuccstortát 1 1 metil-terc-butil-éterrel mossuk és latex gumi zár alatt 4 órán át szárítjuk. A további szárítást szobahőmérsékleten vákuum szárítószekrényben egy éjjelen át végezzük. Hozam: 1,5 kg (100 %), fehér színű szilárd anyag, amelynek tartalma 1,79 x 10-4 mól/g (szárított tartalom 1,92 x 10-4 mól/g).
C. lépés: Metoxi-polietilénglikol-szukcinoil szarvasmarha szuperoxid-dizmutáz
Egy 42 1-es pH elektródával ellátott reaktorba 32 1 foszfát puffért (pH-ja 7,8) mérünk be és 29-30 °C-ra melegítjük, majd 194,0 g szarvasmarha eritrocita szuperoxid-dizmutázt adunk hozzá. A térfogatot 30,5 1-re állítjuk be és az elegyet 29 °C-ra melegítjük. A pH-titráló berendezés nátrium-hidroxidot bevezető csövét a reaktor közepénél elvezetve, közvetlenül az oldat felszíne fölé helyezzük. A pH-titrálót működésbe helyezzük és 0,5 n nátrium-hidroxid-oldattal pH
7,8 értéket állítunk be, majd 614,7 g metoxi-polietilénglikol N-szukcinimidil-szukcinátot adunk az elegyhez 2 perc alatt. A reakcióelegyet 41 percen át keverjük, miközben 0,5 n nátrium-hidroxid oldattal a pH-t 7,8-ra állítjuk és a hőmérsékletet 30 ’C-on tartjuk. A reakcióelegyet 200 Millipak típusú szűrőn átszűrjük és Millipore rozsdamentes acél Pellicon típusú diaszűrő rendszerrel betöményítjük. A reaktort ezután 600 ml foszfát pufferrel, amelynek pH-ja 6,2, átöblítjük, és az öblítőiét a diaszűrő rendszerrel kapott koncentrátumhoz adjuk. A koncentrátum végtérfogata mintegy 9 1, amelyet a továbbiakban Millipore Pellicon típusú diaszűrő berendezésben 200 1 foszfát pufferrel (pH-ja 6,2) szemben 2,17 órán át diaszűrésnek vetünk alá. A koncentrátum végtérfogata így mintegy 8 1, amelyet egy Millipore 200 Millipak típusú bemeneti szűrőn át egy tiszta 25 1-es üveg ballonba öntünk, majd a szűrőt 500 ml foszfát pufferrel (pHja 6,2) átöblítjük. így 11,98 (91,4 %) cim szerinti vegyületet kapunk, tiszta, zöldeskék színű oldat formájában, amelynek aktivitása 32960 egység/ml.
4. példa
A. lépés: Részlegesen karboximetilezett polietilénoxid g polietilénoxidot (móltömege 2000, 25 mekv OH; forgalmazója Fluka) 120 ml toluolban feloldunk és az oldatot azeotropikusan mindaddig szárítjuk, amíg víz jelenik meg a Dean-Stark feltétben (mintegy 25 ml toluolt desztillálunk ki). Az oldatot ezután 50 °C-ra hűtjük és 1,7 g (15 mmól) kálium-terc-butoxiddal kezeljük. Az oldatot forrás hőmérsék• · letre melegítjük és még mintegy 25 ml toluolt kidesztillálunk. Keverés közben a reakcióelegyet 25 °C-ra hűtjük és egy éjjelen át 2,4 ml (16 mmól) etil-(bróm-acetát)-tál kezeljük. A kivált sót gravitációs szűréssel elkülönítjük és 30 ml metilén-kloriddal mossuk. A polimert oly módon nyerjük ki, hogy a szűrletet először mintegy 60 ml-re töményítjük be, majd azt 5 °C-on intenzív keverés közben 300 ml etil-éterhez lassan hozzá öntjük. Az elkülönítés után kapott fehér polimer port vákuumban szárítjuk. Hozama: 24 g, IR (film) spektrumában karakterisztikus észter abszorpció figyelhető meg 1753 cm-1-nél. A polimert 50 ml In nátrium-hidroxid oldatban feloldjuk és 10 g nátrium-kloridot adunk hozzá. Mintegy 45 perc múlva 6 n sósavval az oldat pH-ját 3,0-ra állítjuk be és 3 x 60 ml metilén-kloriddal extraháljuk. Az egyesített szerves fázisokat magnézium-szulfáton szárítjuk, majd mintegy 50 ml-re töményítjük be. A koncentrátumot keverés közben 300 ml éterbe öntjük. A kivált terméket szűréssel elkülönítjük és vákuumban szárítjuk. Hozam: 22 g, amelynek IR (film) spektrumában 1730 cm-1-nél megjelenő sáv az «υ-karboxilccsoportnak felel meg.
B. lépés: α-Hidroxi- cd -karboximetil-polietilénoxid előállítása tiszta formában részlegesen karboximetilezett PEO DEAE-sephadex oszlopon végzett elkülönítésével g homo- és heterobifunkcionális polietilénoxidok keverékét 40 ml vízben feloldunk és DEAE-sephadex A-25 típusú töltet (27 g; 0,1 mól ioncsere) tetraborát formában tartalmazó oszlopra visszük fel. Az első frakciót ionmentes vízzel nyerjük, ez a frakció a nem-derivatizált polimert tartalmaz• ·
- 42 za. Ammónium-bikarbonát fokozaotosan növekvő iongradiensével (6-22 mmólos koncentrációig terjedően 100 ml-enként 1-2 mmólos inkrementumokkal) végezzük az elúciót akkortól, amikor az eluens negatív eredményt ad poliakrilsav (PAA) próbában a maradék PEG kimutatására. Ekkor kezdjük meg a mintegy 40 ml térfogatú frakciók gyűjtését. Pozitív eredményt adnak
2-21 frakciók a PAA próbában, és ezek tiszta monokarboxilezett polietilénoxidot tartalmaznak (Ri=0,49). A következő három frakció nem tartalmaz polietilénoxidot, míg a 25-36 frakciók tiszta polietilénoxid-disavat tartalmaznak (Rl=0,26). Az α-hidroxi- lm -karboximetil-polietilénoxidot tartalmazó frakciókat egyesítjük és mintegy 100 ml-re töményítjük be. Az oldatban 35 g nátrium-kloridot feloldunk, pHját 3-ra savanyítjuk és 3 x 100 1 metilén-kloriddal extraháljuk. Az egyesített diklór-metános fázisokat magnézium-szulfáton szárítjuk, majd mintegy 100 ml-re töményítjük és lassan, keverés közben 500 ml hideg éterbe öntjük. A kivált polimert elkülönítjük és vákuumban alaposan szárítjuk. így
8,8 g terméket kapunk. 13C-NMR (CDC13) 172,7 (COOH); 72,4 (CH2CH2OH) ; 70,4 (PEO) ; 69,0 (CH2COOH) ; 61,3 (CH20H) ppm.
Az oszlopról elkülönített bisz(karboximetil)-polietilénoxid 13C NMR vizsgálatát is elvégeztük. 13C-NMR (CDCI3): δ
172,4 (COOH); 70,4 (PEO); 68,8 (CH2COOH) ppm.
5. példa
Dimetoxi-tritil-metoxi-polietilénglikol
36,3 g (7,26 mmól) metoxi-polietilénglikolt (átlagos molekulatömege 5000 dalton) 300 ml kloroformban feloldunk, majd 250 ml kloroformot kidesztillálunk a víz eltávolítása céljából. A lombikra egy szárítócsövet helyezünk és mintegy 50 c-ra hagyjuk lehűlni. Ekkor 1,8 ml (10,3 mmól) N,N-diizopropil-etil-amint, majd 100 mg (0,8 mmól, 10 mól%) 4-(dimetil-amino)-piridint és 1,9 g 4,4-dimetoxi-tritil-kloridot (98 %-os) adunk hozzá.
A reakcióelegyet egy éjjelen át szobahőmérsékletre hagyjuk felmelegedni, majd az oldószert 60 °C-on rotavapor készülékkel lepároljuk. A maradékot kevés kloroformban felvesszük, és az oldatot 2 1 vízmentes éterbe öntjük a M-PEGDMT leválasztása céljából. A csapadékot elkülönítjük, szárítjuk és C-8 300A típusú fordított fázisú preparatív oszlopon Waters LC4000 kromatográfiás rendszerben 30-95 % acetonitrilt vízben tartalmazó eluenssel 20 percen át gradiens-elúcióval tisztítjuk. A kívánt termék 58-60 % acetonitriltartalomnál eluálódik. Egy 2 g tömegű mintát 20 ml 30 % acetonitrilt tartalmazó vizes oldatban 50 ml/perc áramlási sebeséggel felviszünk az oszlopra és ugyanilyen összetételű eluenssel izokratikus elúciót végzünk, mindaddig míg egy nagy szennyező csúcs elúciója meg nem történik; ez jellemző módon 3-5 perc időnél eluálódik (mv 280 μια) . Ezután megkezdjük a gradiens-elúciót. A következő csúcs a kívánt metoxi—PEG-DMT-5000. A csúcs első háromnegyed részét összegyűjtük, míg a csúcs végrészét elöntjük. Ezen a módon 22,6 g nyers M—EG-DMT 5000-et 2 g-os részletekben megtisztítva 15,44 g cím szerinti vegyülethez jutunk.
• ··
6. példa
Zéró dioltartalmú metoxi-polietilénglikol előállítása dimetoxi-tritil-metoxi-polietilénglikolból
Egy 500 ml-es lombikban 10 g M-PEG-DMT 5000-et 320 ml Milli-Q vízben feloldunk. Majd lassú áramban 80 ml kénsavat adunk az oldathoz, a koncentrációt 20 %-ra állítva. Az oldat piros színűvé és homogénné válik. A savas oldatot egy éjjelen át keverjük, majd 2 x 500 ml kloroformmal extraháljuk és az egyesített extraktumot magnézium-szulfáton szárítjuk. Bepárlás után vörös olajat kapunk maradékként, amelyet vékony sugárban 2 1 vízmentes éterbe öntünk 20 °C-on. A csapadékot 24 órán át ülepedni hagyjuk, majd zsugorított üvegszűrőn elkülönítjük és 2 x 200 ml vízmentes éterrel mossuk. A nuccstortát elporítva és vákuumban szárítva 8,68 g metoxi-PEG 5000-et kapunk, amely zéró dioltartalmú (a 9. példában leírtak értelmében ez azt jelenti, hogy elhanyagolható mennyiségű dióit tartalmaz).
7. példa
Zéró dioltartalmú metoxi-polietilénglikol-szukcinát előállítása zéró dioltartalmú polietilénglikolból
4,7 g (0,94 mmól) zéró dioltartalmú M-PEGKOH 5000-et 100 ml toluolban feloldunk. Az oldatot visszafolyatással forraljuk és Dean-Stark feltéttel a vizet eltávolítjuk. A forralást 1 órán át folytatjuk és összesen 80 ml toluolt kidesztillálunk. A maradékot, amely 20 ml toluolt tartalmaz, argonatmoszférában, pozitív nyomás alatt lehűlni hagyjuk. Ezután 110 mg (1,1 mmól) borostyákősavanhidridet, majd 137 mg (1,12 mmól) 4-(dimetil-amino)-piridint adunk hozzá.
Mivel a borostyánkősavanhidrid nem oldódik fel, 10 ml etanol- és vízmentes kloroformot adunk hozzá. Az így kapott oldatot visszafolyatással forraljuk, amikoris egy szárítószekrényben szárított hűtőt használunk. A visszafolyató forralást 15 órán át folytatjuk, majd az oldatot lehűtjük és 10 g kationcserélő gyantával keverjük. Ezután szűrjük, majd a szűrletet bepárolva a cím szerinti vegyületet kapjuk.
8. példa
Zéró dioltartalmú metoxi-polietilénglikol-szukcinimidilszukcinát előállítása zéró dioltartalmú metoxi-polietilénglikol szukcinátból
4,15 g (0,83 mmól) 7. példa szerinti M-PEG-szukcinát 100 ml toluollal készített oldatát azeotroposan megszárítjuk. Ezután 60 ml toluolt kidesztillálunk (a reakció lombikban így 40 ml marad) és a visszamaradó oldathoz 100 mg (0,87 mmól) N-hidroxi-szukcinimidet, majd óvatosan 30 ml etanol- és vízmentes kloroformot adunk. Ezután 25 ml oldószerkeveréket kidesztillálunk, majd az oldatot argonatmoszférában szobahőmérsékletre hagyjuk lehűlni, és 200 mg (9,7 mmól) DCC-t adunk hozzá keverés közben. A diciklohexil-karbamid 10 perc múlva kezd el kikristályosodni. A keverést 2 napon át folytatjuk, és a reakcióelegyhez további 25 mg (0,22 mmól) N-hidroxid-szukcinimidet adunk. A kivált diciklohexil-karbamidot szűréssel elkülönítjük, és toluollal mossuk. A szűrletet rotavapor készülékben betöményítjük; így további diciklohexil-karbamid válik le. A leszűrt koncentrátumot 1 1 vízmentes éterbe csepegtetjük. A kivált csapadékot Whatman 9 cm-es 6F/F típusú üvegszálas szűrőn szűrjük, majd
··· nagyvákuumban 15 órán át szárítjuk. így 3,37 g M-PEG-SS-et kapunk, amelynek aktív-észter tartalma 1,71 x 10“4 mól/g, és HPLC meghatározás szerint 1,3 % M-PEg-S-et és 1,2 % egyéb szennyezést tartalmaz; diciklohexil-karbamid viszont nem mutatható ki; az össz-szennyezés 3 %.
9. példa
Zéró dioltartalmú PEG-SOD
1,33 ml (koncentrációja 75 mg/ml) szuperoxid-dizmutázt 18,67 ml 100 mmólos nátriumfoszfát pufferhez (amelynek pH-ja 7,8) adunk és az oldatot 30 ’C hőmérsékletre melegítjük. Ekkor egyszerre 300 mg 8. példa szerinti M-PEG-SS-et adunk hozzá, miközben a pH-t 7,8 értéken tartjuk a titráló pH stat üzemmódba helyezésével. A reakcióelegy pH-ja 28 perc múlva már nem változik. A mintát Centrium típusú centrifuga membránon (móltömeg szerinti cutoff értéke 10000) betöményít jük. A betöményített mintát Dulbecco-féle PBS-sel (pHját 6,2-re állítottuk 1 n sósavval) kicserélésnek vetjük alá, és még öt cserét végzünk, összesen 60 ml-rel. A mintában SEHPLC vizsgálat szerint csupán elhanyagolható mennyiségű magas móltömegű csúcs figyelhető meg, annak jeleként, hogy a cim szerinti vegyület elhanyagolható mennyiségű dióit tartalmaz (vagyis úgynevezett zéró dioltartalmú PEG-SOD preparátum) .
• ·· J ,** *♦ · · · · ··· • « ····«* · · «·· ·· · ·· *
- 47 PEG-hez kovalens kötéssel kapcsolt egyéb biológiailag aktív proteinek előállítása
10. példa
Alacsony dioltartalojn metoxi-polietilénglikol-szukcinoil-kataláz
Kataláz vízzel készített szuszpenziójának (amely 24,0 mg proteint tartalmaz 1 ml-ben) 4,17 ml-ét 15,84 ml 0,1 mólos foszfát-pufferrel (pH-ja 7,8) hígítjuk. Az oldatot keverés közben (a keverést mágneses keverővei végezzük) 30 °C-ra melegítjük és 550 mg alacsony dioltartalmú metoxi-PEG-SS-et adunk hozzá. A reakcióelegy pH-ját 7,8 állandó értéken tartjuk. Ezt egy Mettler DL25 típusú titráló berendezés pH stat'· funkcióba történő programozásával biztosítjuk. A pHállításhoz 0,5 n nátrium-hidroxid oldatot használunk a szükséges mennyiségben. A reakcióelegyet félóra múlva 0,45 mikron méretű alacsony proteinkötő képességű poliszulfon szűrőn átszűrjük és két, Amicon Centriprep 30 Concentrator típusú berendezésbe (amelyek 30K NMWL típusú membránnal rendelkeznek) visszük. A puffért néhányszor Dulbecco-féle PBS-sel kicserélésnek vetjük alá. A visszatartott, alacsony diol-tartalmú PEG-katalázt tartalmazó oldatot végül egy 0,2 mikronos szűrőn átszűrjük.
A konjugátum képződését SEHPLC vizsgálattal és gélelektroforézissel igazoltuk.
11. példa
Alacsony dioltartalmú PEG-ovalbumin
503 mg ovalbumint (forgalmazója Sigma) 50 g 0,25 mólos foszfát pufferben (pH-ja 7,8) szobahőmérsékleten teflon-be48 vonatu mágneses keverővei ellátott polietilén főzőpohárban feloldunk. Az oldatot 15 percen át keverjük, és 1,900 g alacsony dioltartalmú M-PEG (5000)-SS-et adunk hozzá egyszerre. A reakcióelegy pH-ját 7,8 értéken tartjuk Mettler DL25 titráló berendezés pH stat üzembmódba helyezésével, a berendezéshez elegendő mennyiségű 0,5 n nátrium-hidroxid oldatot biztosítunk. A reakcióelegyet 1 órán át szobahőmérsékleten tartjuk, majd Amicon YM30 típusú membránon diaszűrést végzünk. A szűrést 1,75 kg/cm2 argon túlnyomással működő kevert sejt berendezéssel egy éjjelen át hűtőszekrényben 4 °C-on végezzük. Miután 800 ml puffer diaszűrését elvégeztük, a terméket ultraszűréssel, 0,2 mikron méretű poliszulfon szűrő alkalmazásával betöményítjük és steril ampullába töltjük, így 44,3 g oldatot kapunk, amelynek proteintartalma
10,5 mg/ml. A protein-módosítás mértéke 71,04 %, amelyet a lizin aminocsoportok titrálása alapján határoztunk meg.
12. példa
Alacsony dioltartalmú mPEGsj^—3-ovalbumin
Ovalbumin (VI. fokozat, forgalmazója Sigma) 0,25 mólos foszfát pufferrel (pH-ja 7,4) készített 10 mg/ml koncentrációjú hideg oldatának 10 ml-ét 382 mg alacsony dioltartalmú mPEG5K~SS-hez adjuk, és az oldatot 5 °C-on 16 órán át keverjük. A terméket Amicon Centriprep 30 Concentrator típusú berendezésben (3OK NWML típusú membránt használunk) Dulbeccoféle PBS kicserélő pufferrel tisztítjuk. A tisztított oldatot 0,2 mikronos szűrőn átszűrjük és így 6,539 g,
13,8 mg/ml tartalmú, 74 %-ban módosított (a meghatározást TNBS módszerrel végeztük) proteint kapunk.
• ·· ···:
- 49 A fentihez hasonlóan eljárva, 100 mg ovalbumint 283 mg alacsony dioltartalmú mPEGsR-SS-sel reagáltatva 6,274 g,
13.8 mg/ml tartalmú, 74 %-ben módosított proteint kapunk. Ugyancsak a fentihez hasonló módon 100 mg ovalbumint 190 mg alacsony dioltartalmú mPEGsR-SS-sel reagáltatva 5,704 g 67 %-ban módosított proteint kapunk, amelynek tartalma
16.8 mg/ml.
13. példa
Alacsony dioltartalmú mPEG5K-S-rhn-IL4
Rhu-IL4 (forgalmazója Immunex) 5,26 mg/ml koncentrációjú oldatának 190 μΐ-ét 772 μΐ 0,1 mólos borát pufferrel (pH-ja 8,5) hígítjuk. A kapott oldatot alacsony dioltartalmú metoxi-PEG-SS dimetil-formamiddal készített 34 mg/ml koncentrációjú oldatának 29,2 μΐ-ével kezeljük. A reakcióelegyet 1 óra 20 percen át szobahőmérsékleten tartjuk, centrifugáljuk, majd közvetlenül preparatív SEHPLC oszlopra injektáljuk. A tisztított konjugátum gél-elektroforézissel végzett vizsgálatakor lényegében egy sávot kapunk.
14. példa
Alacsony dioltartalmú mPEGsR-S-NT
8,7 mg neurotenzin (NT, forgalmazója BaChem) 2,175 ml 0,25 mólos foszfát pufferrel (pH-ja 7,8) készített oldatát 174 mg alacsony dioltartalmú mPEGsR-SS-hez adjuk. A reakcióelegyet 1,75 órán át szobahőmérsékleten tartjuk, majd hűtőszekrénybe helyezzük. Egy C—8 ' típusú’ oszlöpörrh/i/z-ácétóni'tril gradiens elúcióval preparatív fordított fázisú HPLC-t végzünk, így a terméket az NT-PEGgR-NT komponenstől elválasztjuk. Tiszta mPEG5R-S-NT terméket kapunk.
• ·· • ·· t • · « · * • · · · • · · · ··· ··
- 50 Antitestek reaktivitásának meghatározása PEG-SOD-dal kezelt egységek szérumában
Fázis-I klinikai vizsgálathoz kapcsolódóan magas dioltartalmú PEG-SOD-dal kezelt egyénektől szérum mintákat vettünk. A Fázis-I vizsgálatból kapott, kerinségben lévő antitestek alacsony és magas dioltartalmú PEG-SOD-dal szembeni reaktivitásának statisztikai analízisét is tanulmányoztuk. Az alkalmazott alacsony és magas dioltartalmú PEG-SOD készítményekben a lizin aminocsoportok módosítottságának mértéke (ezt %-ban fejezzük) azonos.
Az analízis során az összes magas dioltartalmú PEG-SOD készítménnyel kezelt egyéntől vett minták között mért optikai sűrűség különbséget vizsgáltuk, az utólag kezelt szérum minták optikai sűrűsége alacsony dioltartalmú PEG-SOD esetében lényegesen kisebbnek adódott, mint a magas dioltartalmú PEG-SOD esetében. Ez a meglepő eredmény azt jelenti, hogy az utólag kezelt szérum mintákban lévő antitestek csekély reaktivitást mutatnak az alacsony dioltartalmú PEG-SOD iránt; és továbbá arra is utal, hogy az alacsony diol-tartalmu PEG-SOD immunogenitása jelentősen kisebb, mint a magas dioltartalmau PEG-SOD immonogenitása.
Az analízist a következőképpen végezzük:
CoBind típusú mikrotiter lemez kúpjaiba 100 ml 2,5 μΐ/ml koncentrációjú magas és alacsony diol-taralmu PEG-SOD oldatot helyezünk. A lemezt parafilmmel lefedjük és szobahőmérsékleten, sötétben egy éjjelen át inkubáljuk. A nem-kötött
PEG-SOD-ot a mikrotiter lemez furataiból desztillált vízzel ötször végzett mosás és felszívás, majd azt követő alapos • 9 •9 ···· « * 9 · » ’·· * ,:.·..···:·'..· ·
- 51 felitatás révén eltávolítjuk. Ezután 1 % zselatint tartalmazó PBS-ből 200 μΐ-t adunk a furatokba és a lemezt mintegy 1 órán át 37 °C-on inkubáljuk. A lemezeket ezután 0,05 % Tween 20-at taralmaző PBS-sel ötször ismét átmossuk, majd az oldatot alaposan felitatjuk. A hígított klinikai minták mindegyikéből 100 μΐ-t adunk - háromszoros elrendezésben - a mikrotiter lemez furataiba és 1 órán át szobahőmérsékleten inkubáljuk. Mindegyik egyén esetében egy adagolás előtti (predózis) és egy adagolás utáni (posztdózis) mintát analizálunk. A lemezeket ezután a fenti módon lemossuk. Ezt követően valamennyi furatba 100 μΐ hígított torma peroxidázhoz konjugált kecske antihumán immunglobulint adunk és szobahőmérsékleten 1 órán át inkubáljuk, majd a lemezeket a fenti módon lemossuk. Utána 100 μΐ ABTS szubsztrát oldatot helyezünk valamennyi furatba és mintegy 20 percen át szobahőmérsékleten inkubáljuk. Valamennyi furat esetében az optikai sűrűséget meghatározzuk. Ezt BioTek EL 312 típusú mikrolemez leolvasóval kettős hullámhossz elrendezésben (405 nmen leolvasva, 490 nm referencia hullámhossz) végezzük. A szín kifejlődésének mértéke közvetlenül arányos a mintában lévő antitest mennyiségével. Az eredményeket a 3. táblázatban foglaljuk össze.
• <··· • · · ·♦ • · «· fe ··»·*· • « ♦··· *· · ·· · ···
- 52 3. táblázat
Magas dioltartalmú PEG-SOD-dal kezeltek szérumában lévő antitestek reaktivitásának vizsgálata
| Szérum | Elő/utó- | N Közepes | Standard | Átlagos p érték |
| minta | kezelés | optikai | deviáció | különb- |
| sűrűség | ség %-ban1 |
| alacsony diói PEG-SOD | Pre | 54 | 0,1007 | 0,053 | 16,8 | |
| II | Post | 54 | 0,2197 | 0,165 | 52,1 | >0,001 |
| magas diói PEG-SOD | Pre | 54 | 0,1210 | 0,091 | _ | |
| II | Post | 54 | 0,4583 | 0,186 | — |
n = minta-szám; 1 = magas diol-tartalmú PEG-SOD-tól való eltérés %-ban kifejezve
A PEG-SOD készítmények hasznossága oxidatív sérülések megelőzésére és kezelésére való klinikai alkamazásukban rejlik.
Feltételezések szerint szabad oxigéngyököt számos klinikai kórképben fontos szerepet játszanak, így többek között életet veszélyeztető körfolyamatokban, például karcinogenézisben, öregedésben és iszkémiával-reperfúzióval kapcsolatos sérülésekben. Vizsgálatok szerint a szabad oxigéngyökök (02~*) proteineket, lipideket, szénhidrátokat és mukleotideket kémiailag módosítják. Az 02~* gyökanion fluxus elpusztítja a baktériumokat, inaktiválja a vírusokat, felbontja az eritrocitákat, szétroncsolja a granulocitákat, károsítja a mioblaszt kultúrákat, a hialuronátot depolimerizálja, módosítja az alacsony sűrűségű lipoproteint és a DNS-t károsítja. A hidrogénperoxid potencirozhatja a proteázok (például tripszin) hatását, ennek következtében módosítva protein ti« ··· ··«
- 53 pusú szubsztrátokat, példuál fibrinogént, hemoglobint és glomeruláris alap-membránokat. így ezek különösen érzékenyekké válnak proteolízis szempontjából. A szabadgyök képződésének és felhalmozódásnak további sejt-toxikus következményei vannak, ilyenek a membrán integritásában és permeabilitásában bekövetkező változások, enzimaktivitás csökkenés a proteinek denaturálódása miatt, és fokozott gyulladásos válaszreakciók.
Endogén scavenger (gyökbefogó) enzimek, mint amilyenek például a szuperoxid-dizmutáz (SÓD) és kataláz (CAT) is, normális körülmények között eltávolítják a toxikus oxigén intermediereket, mielőtt azok szövetkárosodást okoznának. Reperfúzió alatt és bizonyos más klinikai esetekben azonban, az endogén enzim védő-mechanizmus elnyomódhat. így ezeknek az enzimeknek a pótlása terápiásán jótékony hatású. Szabad gyök befogók iszkémiával kapcsolatos, reperfúziót kisérő károsodásokat kedvezően befolyásoló hatásáról különböző állat-modellekben már többen beszámoltak. Lásd például: Shlafer, Μ., Kané, 10 P.F., Kirsch, M.M., Superoxide Dismutase Plus Catalase Enhances the Efficacy of Hypothermic Cardioplegia to Protect the Globally Ischemic, Reperfused Heart, 83: 630; Shlafer, Μ. , Kané, P.F., Wiggins, V.Y.,
Kirsch, M.M., Possible Role of Cytotoxic Oxygen Metabolites in the 15 Pathogenesis of Cardiac Ischemic Injury, Circ. 1982; 66 (Suppl I): 1-85; Casale, A.S., Bulkley, G.B.,
Bulkley, B.H., Flaherty, J.T., Gott, V.L., Gardner, T.J., Oxygen Free-Radical Scavengers Protect the Arrested, Globally Ischemic Heart Upon Reperfusion, Surg. Fórum,
1983; 34: 313; Stewart, J.R., 20 Blackwell, W.H.A., Crute,
S.L., Loughlin, V., Hess, M.L., Greenfield, L.J., Prevention of Myocardial Ischemia/Reperfusion Injury with Oxygen Free Radical Scavengers, Surg. Fórum, 1982; 33: 317; Pryzyklenk, K., Kloner, R.A., Superoxide Dismutase Plus Catalase Improve Contractile Function in the Canine Model of the 25 Stunned Myocardium, Circ. Rés. 1986; 58: 148-156; and Beckman, J.S., Minor, R.L. Jr., White, C.W., Repine, J.E., Rosen, G.M., Freeman, B.A., Superoxide Dismutase and Catalase Conjugated to Polyethylene Glycol Increases Endothelial Enzyme Activity and Oxidant Resistance, J. Bioi. Chem 1988; 263 (14): 6884-6892.
A találmány tárgyát képezi készítmény alkalmazása is, a fentiekben felírtaknak megfelelően, emlősökben oxidatív sérülések megelőzésére és/vagy kezelésére szánt gyógyszerkészítmények előállítása. A SÓD parenterális készítményben amely egy gyógyászatilag elfogadható vivőanyagot is tartalmaz - alkalmazandó mennyisége (ezt egységekben fejezzük ki) a kezelt egyén állapotától, korától, testtömegétől és más jellemzőitől függ. A kezeléskor mindezeket a tényezőket kell figyelembe venni. Az adagolásra szánt dózis testtömeg kilogrammonként mintegy 2000-től mintegy 50000 egységig, előnyösen mintegy 5000-től mintegy 25000 egységig terjedhet.
Claims (21)
- Szabadalmi igénypontok1. Biológialaig aktív protein típusú készítmény, azzal jellemezve, hogy egy biológiailag aktív protein polialkilénoxidhoz kovalensen kötött formában tartalmaz, amely polialkilénoxid molekutatömege mintegy 1000-től mintegy 15000 daltonig terjed és amely monometoxilezett és kevesebb, mint mintegy 10 tömeg % nem-monometoxilezett polialkilénoxidból áll.
- 2. Az 1. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy proteinként rekombináns humán interleukin-4-et; proteáz Subtilisin Carlsberget; szuperoxid-dizmutázt; oxidoreduktázt; transzferázt; hidrolázt; liázt; izomerázt és ligázt tartalmaz.
- 3. A 2. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy szuperoxid dizmutázként szarvasmarha szuperoxid-dizmutázt tartalmaz.
- 4. A 2. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy szuperoxid dizmutázként rekombináns szuperoxid-dizmutázt tartalmaz.
- 5. A 2. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy oxidoreduktázként oxigén-oxidoreduktázt vagy hidrogén-peroxid-oxidoreduktázt tartalmaz.
- 6. A 2. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy transzferázként UDP-glükuronil-transzferázt vagy a-D-galaktáz-l-foszfát-uridilil-transzferázt tartalmaz.
- 7. A 2. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy hidrolázként lizozimet, tripszint vagy aszparaginázt tartalmaz.
- 8. A 2. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy liázként fruktóz-1,6-difoszfátot vagy D-glicerinaldehid-3-foszfát-liázt tartalmaz.
- 9. A 2. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy izomerázként D-xiláz-ketol-izomerázt tartalmaz.
- 10. A 2. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy ligázként L-aszpartát ligázt tartalmaz.
- 11. Az 1. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy aktív proteinként egy alábbi peptid-hormont tartalmaz: inzulint, ACTH-t, glukagont, szomatosztatint, szomatotropint, timozint, paratiroid hormont, pigment hormonokat, szomtromedint, eritropoetint, luteinizáló hormont, koriongonadotropint, hipotalamusz kibocsátó faktorokat, antidiuretikus hormonokat, tiroid-stimuláló hormont, kalatonint és prolaktint.
- 12. Az 1. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy polialkilénoxidként polietilénglikolt, monometoxilezett polialkilénoxidként monometoxilezett polietilénoxidot, és nem-monometoxilezett polialkilénoxidként nem-monometoxilezett polietilénglikolt tartalmaz.
- 13. A 12. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a polietilénglikol molekulatömege mintegy 2000-től mintegy 10000 daltorrig terj-ed. ' - - — -
- 14. A 13. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a polietilénglikol molekulatömege mintegy 4000-től ·· ····- 57 mintegy 6000 daltonig terjed.
- 15. A 12. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a polietilénglikol kevesebb, mint mintegy 7 tömeg% nem metoxilezett polietilénglikolt tartalmaz.
- 16. A 15. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a polietilénglikol kevesebb, mint mintegy 5 tömeg% nem metoxilezett polietilénglikolt tartalmaz.
- 17. Eljárás biológiailag aktív protein típusú készítmény előállítására, azzal jellemezve, hogya) egy kevesebb, mint 10 tömeg% nem-monometoxilezett polietilénglikolt tartalmazó polietilénglikolt karboxilezünk,b) a kapott karboxilezett polietilénglikolt aktiváljuk, ésc) a kapott aktív polietilénglikol észtert kovalensen egy biológiailag aktív proteinhez hozzákapcsoljuk.
- 18. A 17. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy reaktív aminocsoportokat tartalmazó biológiailag aktív proteint alkalmazunk.
- 19. A 18. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a biológiailag aktív proteinhez kapcsolt polietilénglikol észterek száma kevesebb vagy egyenlő a biológiailag aktív protein reaktív aminocsoportjainak számával.
- 20. A 17. igénypont szerinti eljárás az 1-16. igénypontok bármelyike szerinti készítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat alkalmazzuk.
- 21. Emlősökben oxidativ sérülés kezelésére és/vagy meg-V ·· ··· Μ ««·· • · ···· · ·· · ·· előzésére alkalmas gyógyszerkészítmény, azzal jellemezve, hogy egy 1-16. igénypontok bármelyike szerinti készítményt tartalmaz.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US93641692A | 1992-08-27 | 1992-08-27 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HU9302440D0 HU9302440D0 (en) | 1993-11-29 |
| HUT66755A true HUT66755A (en) | 1994-12-28 |
Family
ID=25468595
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU9302440A HUT66755A (en) | 1992-08-27 | 1993-08-27 | Low diol polyalkylene oxide biologically active proteinaceous substances |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US5532150A (hu) |
| EP (1) | EP0584876A3 (hu) |
| JP (1) | JPH06172201A (hu) |
| AU (1) | AU675798B2 (hu) |
| CA (1) | CA2101361A1 (hu) |
| HU (1) | HUT66755A (hu) |
| MX (1) | MX9305082A (hu) |
Families Citing this family (37)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5766897A (en) * | 1990-06-21 | 1998-06-16 | Incyte Pharmaceuticals, Inc. | Cysteine-pegylated proteins |
| CA2101361A1 (en) * | 1992-08-27 | 1994-02-28 | Robert A. Snow | Low diol polyalkylene oxide biologically active proteinaceous substances |
| US5298410A (en) * | 1993-02-25 | 1994-03-29 | Sterling Winthrop Inc. | Lyophilized formulation of polyethylene oxide modified proteins with increased shelf-life |
| US5951974A (en) * | 1993-11-10 | 1999-09-14 | Enzon, Inc. | Interferon polymer conjugates |
| DK0730470T3 (da) * | 1993-11-10 | 2002-06-03 | Enzon Inc | Forbedrede interferonpolymerkonjugater |
| US5738846A (en) * | 1994-11-10 | 1998-04-14 | Enzon, Inc. | Interferon polymer conjugates and process for preparing the same |
| WO1996017929A1 (en) * | 1994-12-07 | 1996-06-13 | Novo Nordisk A/S | Polypeptide with reduced allergenicity |
| JPH10501823A (ja) * | 1995-04-10 | 1998-02-17 | バクスター、インターナショナル、インコーポレイテッド | クモ膜下出血の治療における架橋ヘモグロビンの使用 |
| US5868868A (en) * | 1995-06-19 | 1999-02-09 | Alcon Laboratories, Inc. | Peg-modified proteases and methods of use in contact lens cleaning |
| US5718895A (en) * | 1995-11-16 | 1998-02-17 | Alcon Laboratories, Inc. | Enzymes with low isoelectric points for use in contact lens cleaning |
| BR9510676A (pt) * | 1995-12-29 | 1999-11-23 | Procter & Gamble | Composições detergentes compreendendo enzinas imobilizadas |
| JP3092530B2 (ja) * | 1996-11-05 | 2000-09-25 | 日本油脂株式会社 | コハク酸イミジル基置換ポリオキシアルキレン誘導体の製造方法 |
| EP0973384A4 (en) * | 1997-02-13 | 2004-10-13 | Sky High Llc | ORGAN PRESERVATION SOLUTION |
| WO1998037200A2 (en) | 1997-02-21 | 1998-08-27 | Genentech, Inc. | Antibody fragment-polymer conjugates and humanized anti-il-8 monoclonal antibodies |
| US7122636B1 (en) * | 1997-02-21 | 2006-10-17 | Genentech, Inc. | Antibody fragment-polymer conjugates and uses of same |
| CA2294567A1 (en) * | 1997-06-25 | 1999-01-07 | Novo Nordisk A/S | A modified polypeptide |
| AU9027298A (en) * | 1997-08-20 | 1999-03-08 | Lxr Biotechnology Inc. | Compositions containing polyethylene glycol and uses thereof |
| US7642323B2 (en) * | 1997-11-06 | 2010-01-05 | Nektar Therapeutics | Heterobifunctional poly(ethylene glycol) derivatives and methods for their preparation |
| US6448369B1 (en) | 1997-11-06 | 2002-09-10 | Shearwater Corporation | Heterobifunctional poly(ethylene glycol) derivatives and methods for their preparation |
| US6468532B1 (en) | 1998-01-22 | 2002-10-22 | Genentech, Inc. | Methods of treating inflammatory diseases with anti-IL-8 antibody fragment-polymer conjugates |
| US6458355B1 (en) | 1998-01-22 | 2002-10-01 | Genentech, Inc. | Methods of treating inflammatory disease with anti-IL-8 antibody fragment-polymer conjugates |
| US7005504B2 (en) * | 1998-01-22 | 2006-02-28 | Genentech, Inc. | Antibody fragment-peg conjugates |
| US6066673A (en) * | 1998-03-12 | 2000-05-23 | The Procter & Gamble Company | Enzyme inhibitors |
| JP2002507426A (ja) | 1998-03-26 | 2002-03-12 | ザ、プロクター、エンド、ギャンブル、カンパニー | アミノ酸置換を有するセリンプロテアーゼ変異体 |
| US6908757B1 (en) | 1998-03-26 | 2005-06-21 | The Procter & Gamble Company | Serine protease variants having amino acid deletions and substitutions |
| US6495136B1 (en) | 1998-03-26 | 2002-12-17 | The Procter & Gamble Company | Proteases having modified amino acid sequences conjugated to addition moieties |
| MXPA02000840A (es) | 1999-07-22 | 2002-07-30 | Procter & Gamble | Variantes de proteasa de subtilisina que tienen substituciones de aminoacidos en regiones de epitopes definidas. |
| US6946128B1 (en) | 1999-07-22 | 2005-09-20 | The Procter & Gamble Company | Protease conjugates having sterically protected epitope regions |
| CZ2002171A3 (cs) | 1999-07-22 | 2002-06-12 | The Procter & Gamble Company | Proteinázový konjugát, čistící prostředek a prostředek osobní péče |
| AU5928100A (en) | 1999-07-22 | 2001-02-13 | Procter & Gamble Company, The | Subtilisin protease variants having amino acid deletions and substitutions in defined epitope regions |
| US7195923B2 (en) * | 2001-01-31 | 2007-03-27 | Scripps Laboratories, Inc. | Ratiometric determination of glycated protein |
| US7459435B2 (en) | 2002-08-29 | 2008-12-02 | Hoffmann-La Roche Inc. | Treatment of disturbances of iron distribution |
| US7459436B2 (en) | 2002-11-22 | 2008-12-02 | Hoffmann-La Roche Inc. | Treatment of disturbances of iron distribution |
| RS20050502A (en) * | 2002-12-26 | 2007-08-03 | Mountain View Pharmaceuticals Inc., | Polymer conjugates of interferon- beta with enhanced biological potency |
| ES2460671T3 (es) | 2003-12-19 | 2014-05-14 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Uso de eritropoyetina en el tratamiento de alteraciones de la distribución del hierro en enfermedades intestinales inflamatorias crónicas |
| DE102004059489C5 (de) | 2004-12-10 | 2011-12-08 | Clariant Produkte (Deutschland) Gmbh | Verfahren zur Herstellung von reinen alpha-Alkoxy-omega-hydroxy-Polyalkylenglykolen |
| CN109112119B (zh) * | 2018-08-28 | 2022-04-26 | 佛山科学技术学院 | 经化学修饰的鸭血sod制剂的制备方法 |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4179337A (en) * | 1973-07-20 | 1979-12-18 | Davis Frank F | Non-immunogenic polypeptides |
| US4732863A (en) * | 1984-12-31 | 1988-03-22 | University Of New Mexico | PEG-modified antibody with reduced affinity for cell surface Fc receptors |
| JPH084504B2 (ja) * | 1985-04-26 | 1996-01-24 | 味の素株式会社 | 安定化ス−パ−オキサイドジスムタ−ゼ |
| EP0470128B2 (en) * | 1989-04-19 | 2003-08-13 | Enzon, Inc. | Active carbonates of polyalkylene oxides for modification of polypeptides |
| AU666325B2 (en) * | 1991-08-05 | 1996-02-08 | Sanofi | Buffered formulation of peg-sod |
| CA2101361A1 (en) * | 1992-08-27 | 1994-02-28 | Robert A. Snow | Low diol polyalkylene oxide biologically active proteinaceous substances |
-
1993
- 1993-07-27 CA CA002101361A patent/CA2101361A1/en not_active Abandoned
- 1993-08-20 MX MX9305082A patent/MX9305082A/es unknown
- 1993-08-21 EP EP19930202462 patent/EP0584876A3/en not_active Withdrawn
- 1993-08-25 JP JP5210302A patent/JPH06172201A/ja not_active Withdrawn
- 1993-08-26 AU AU44885/93A patent/AU675798B2/en not_active Ceased
- 1993-08-27 HU HU9302440A patent/HUT66755A/hu unknown
-
1994
- 1994-05-19 US US08/245,999 patent/US5532150A/en not_active Expired - Fee Related
-
1996
- 1996-04-15 US US08/632,300 patent/US5661020A/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US5532150A (en) | 1996-07-02 |
| US5661020A (en) | 1997-08-26 |
| MX9305082A (es) | 1994-02-28 |
| EP0584876A3 (en) | 1994-06-29 |
| HU9302440D0 (en) | 1993-11-29 |
| AU4488593A (en) | 1994-03-03 |
| AU675798B2 (en) | 1997-02-20 |
| CA2101361A1 (en) | 1994-02-28 |
| JPH06172201A (ja) | 1994-06-21 |
| EP0584876A2 (en) | 1994-03-02 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| HUT66755A (en) | Low diol polyalkylene oxide biologically active proteinaceous substances | |
| AU660843B2 (en) | Lyophilized polyethylene oxide modified protein and polypeptide complexes with cyclodextrin | |
| JP4805911B2 (ja) | Ｈｉｖ侵入阻害剤のポリマー系組成物及び複合体 | |
| HUT75533A (en) | Improved interferon polymer conjugates | |
| US8784849B2 (en) | Hydroxyapatite-targeting poly(ethylene glycol) and related polymers | |
| JP2003518178A (ja) | 水溶性ポリマーの立体的に妨害される誘導体 | |
| AU2005260664A1 (en) | Pegylated interferon alpha-1b | |
| PL186949B1 (pl) | Fizjologicznie czynny koniugat PEG-IFN-alfa, sposób jego wytwarzania oraz zawierające go kompozycjefarmaceutyczne | |
| EP0377613B1 (en) | Conjugates of superoxide dismutase | |
| KR100888371B1 (ko) | 가지 달린 고분자 유도체와 인터페론 결합체를 포함하는 항바이러스제 | |
| KR100360946B1 (ko) | 재조합인간초-산화물불균화효소(rhSOD)의고분자결합체및이를제조하는방법 | |
| KR100480423B1 (ko) | 에리트로포이에틴과 폴리에틸렌글리콜 유도체의 배합체 | |
| KR100695587B1 (ko) | 부갑상성 호르몬과 생체적합성 고분자의 1:1 접합체,이의 제조방법과 이를 함유하는 약학 조성물 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| DGB9 | Succession in title of applicant |
Owner name: SANOFI, FR |
|
| DFD9 | Temporary protection cancelled due to non-payment of fee |