HUT56881A

HUT56881A - Process for expressing human nerve growth factor in arthropoda frugiperda cells infected with recombinant baculovirus

Info

Publication number: HUT56881A
Application number: HU91643A
Authority: HU
Inventors: Francesco Della-Valle; Lanfranco Callegaro; Allesandro Negro
Original assignee: Fidia Spa
Priority date: 1990-02-27
Filing date: 1991-02-26
Publication date: 1991-10-28
Also published as: HU910643D0; IL97324A0; KR910021478A; JPH05103666A; IT9041538A1; EP0444638A3; IT9041538A0; IT1239271B; EP0444638A2

Description

A jelen találmány tárgya eljárás a humán ideg növekedési faktornak (h^NGF) nevezett polipeptid előállítására olyan sejtekből, amelyek rekombináns Baculovírussal vannak fertőzve; a találmány tárgya továbbá olyan fertőzött rovarséjtek. előállítása, amelyek termelik ennek a faktornak az érett, biológiailag aktív, humán formáját, a nevezett sejtek előállításához rekombináns DNS technikát alkalmazva, az Arthropoda frugiperda sejtvonalba beiktatandó genetikai konstrukcióból kiindulva.

Az alábbiakban ismertetjük a technika állását ezen a szakterületen.

A. Az ideg növekedési faktor (NGF)

Az ideg növekedési faktort (NGF) először egér szarkóma tumorokban fedezték fel ^Levi-Montalcini R. és munkatársai: J.Exp. Zool. 116, 321 (1951 )^-]) majd később homogenitásig tisztították hím egér állkapocs alatti (szubmaxilláris) mirigyből [Varon 8· és munkatársai: Biochemistry 6, 2202 (1967)J és kígyóméregből ^Angeletti R.H.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 65, 668 (1970)J . Beszámoltak az NGF más, viszonylag gazdag forrásairól is, ide értve a tengeri malac prosztatát ^Harper G.P. és munkatársai: Natúré 279, 160 (1979) I és a humán placentát ^Goldstein L.D. és munkatársai: Neurochem, Rés. 3_> 175 (1978); Walker P. és munkatársai: Life Science 26, 195 (1980); Fidia szabadalom (477A5 A 88)J . Kis mennyiségű NGF-et találtak más szövetekben is, pl. emlős központi idegrendszerben (Varon S.: Discussions in Neuroscience, II. kötet. 3- szám (1985); Hefti F. és munkatársai: Neuroscience 14, 55(1985)]. A fiziológiai összefüggés az NGF-nek ezen lehetséges forrásai és látszólagos hatási helyei között nem túl világos, de általában feltételezhető, hogy az NGF azokból a különböző pe rifériás szövetekből választódik ki, amelyek beidegzettséget igényelnek az NGF-re választ adó sejtek révén.

Az egér állkapocs alatti mirigyből kapott NGF az az NGFfajta, amelyet legszélesebb körben alkalmaznak az NGF aktivitásának tanulmányozására mind in vivő, mind in vitro. Biológiai aktivitásának tartományát meghatározták in vitro mind primer neuron sejteken, mind klónozott sejtvonalakon. Azok között a primer neuron sejtek között, amelyek in vitro válaszolnak az NGFre, találhatók az embrió érzékelő neuronok (8-12. embrionális napok) a gerincoszlopi ganglion gyökérből, az autonóm, noradrenerg embrió neuronok a szimpatetikus ganglionokból, a kolinerg embrió neuronok a szeptumból és a kromaffin mellékvese sejtek a fejlődés során. Míg az érzékelő és szimpatetikus neuronok az NGFtől a túlélés és kifejlődés szintjén függnek, a kolinerg neuronok, úgy tűnik, túlélésükhöz nem igénylik az NGF-et, csak differenciálódásukhoz, vagyis a neurotranszmitterrel összekapcsolt jellegzetes fenotípusos vonásaik kifejeződéséhez. Az NGF hozzáadása a kromaffin mellékvese sejtekhez (amelyek a neuronális taréjból származnak) fejlődésük első stádiumában a neuronális fenotípus kifejeződését idézi elő. Azok között a sejtvonalak között, amelyek az irodalomban leírtak alapján in vitro válaszolnak NGF-re, találhatók a neuronális taréj feokromocitómának (PC12) nevezett tumoraiból származó kromaffin mellékvese sejtek, valamint a humán neuroblasztóma sejtek. NGF-fel végzett kezelés után ezek a sejtek különbözőképpen viselkednek, áthaladva egy nagy mértékben burjánzó fázistól egy posztmitotikus állapotig.

Az egér állkapocs alatti mirigyekből kapott ideg növekedési faktort jobban jellemezték, mint a másféle ideg növekedési fakto4 ·

- 4 rókát, mind kémiai, mind immunkémiai szempontból. A rágcsáló miműködik rigyekből való NGF 7S-típusú fehérje komplexkéntYT mintegy 140000 dalton molekulatömeg), -amely három különböző alegységből (y, β, j ) tevődik össze, amelyek koordinálnak egy Zn atomot. A 78 molekula biológiai aktivitása szempontjából legérdekesebb része két polipeptid láncból tevődik össze, ahol mindegyikük molekulatömege 13250 és 118 aminosavból áll. Mindegyik lánc vagy monomer három diszulfid híddal bír, amelyek kovalens kötést képeznek két cisztein aminosavgyök-között, így erős stabilitást nyújtva a fehérje három dimenziós szerkezetének. Az NGF két monomerje, amelyek gyenge kötéssel vannak összekapcsolva, 26500 molekulatömegű óimért képez. Kimutatták, hogy a biológiai aktivitás a 2,58-ként ismert dimerhez, hagyományos nevén p alegységhez társul. Az, hogy az ilyen aktivitás jelen lenne a monomerben is, nem ismeretes. A jelen bejelentés a humán NGF-nek a biológiailag aktív részére vonatkozik, bármiféle rövidítés-típust is alkalmaznak ennek megnevezésére (hNGF; hpNGF; 2,5 NGF; 2,5hNGF). A genetikai manipulációs eljárások lehetővé tették, hogy azonosítsák azt a gént, amely kódolja az NGF j~. alegységének (/NGF) molekuláját | Bcott J. és munkatársai: Natúré 302, 538(1983); Ullrich A. és munkatársai: Natúré 303, 821 (1983)J · A molekulát kódoló humán gén az I. kromoszóma rövid karjában helyezkedik el és egy lényegesen nagyobb molekula szintézisét kódolja, mint a 26500 molekulatömegű molekula, amely a biológiailag aktív molekulát alkotja. A gén ennek megfelelően egy nagyobb NGF vagy pro-NGF prekurzor szintézisére küld útmutatást. Azt is kimutatták, hogy az NGF p-alegységének génje nagy mértékben megőrződött különböző fajokban, a madaraktól az emberig |Meier R. és munkatársai: EMBO J. 5, 1489(1986)1. A rágI *

• · · · csáló, humán, szarvasmarha és csirke eredetű NGF nukleotid szekvenciája lehetővé teszi számunkra, hogy összehasonlítsuk ezen molekulák megőrzött és meg nem őrzött helyeit és kapcsolataikat a biológiai aktivitással és antigenicitással. A βNGF általános megőrzöttsége az evolúció során meglepően nagy. A hím egér állkapocs alatti mirigyéből tisztított ^NGF érett formájának 118 aminosavából csak 16 aminosav változik a szarvasmarha pNGF-ben, 19a csirke pNGF-ben és 11 a humán pNGF-ben, és csak 6 aminosav különbözik a szarvasmarha pNGF és a humán pNGF között. Az összes cisztein gyök szigorúan megőrződött az összes fajban. A/9NGF három S-S hídjának redukciója a biológiai aktivitás teljes elvesztéséhez vezet. A nyilvánvaló ellentmondás az aminosavszekvencia általános megőrzöttsége és az immunkémiai típusú keresztreaktivitás alacsony szintje között annak a ténynek tulajdonítható, hogy az aminosavak változásai fajról-fajra egy speciális csomón belül helyezkednek el. Hidropátiás nyomjelzőket alkalmazva ki lehet mutatni, hogy ezek a változások csaknem kizárólag a hidrofil helyeken mennek végbe, amelyeket lehetséges antigén determinánsoknak tekintenek. Csak egy hidrofil terület bizonyult tökéletesen megőrzöttnek az eddig tanulmányozott összes faj NGF molekuláiban.

B. Rekombináns DNS technika

A rekombináns DNS technika lehetővé teszi, hogy vektorok sorozatát alkossuk meg, amelyek képesek nagy mennyiséget kifejezni a kívánt fehérjéből. Ez az új technológia lehetővé teszi a molekulárbiológusoknak, hogy DNS szekvenciákat állítsanak öszsze és így olyan hibrid molekulákat alkossanak meg, amelyek képesek a kívánt fehérje termelésére. Az eljárás különféle reakciókon alapul; ilyenek pl. a hasítás restrikciós enzimekkel, az • · · ·

- 6 így kapott fragmentumok összekapcsolása ligázzal, az összeállítandó oligonukleotidők kémiai szintézise, és más eljárások, amelyet a szakterületen működő különböző laboratóriumok ötlöttek ki ^Maniatis T. és munkatársai: MoleculapCloning. A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1982)J . Abból a célból, hogy magas szintű kifejeződéshez jussunk, az összeállítandó DNS elemeknek bizonyos jelentős információtartalommal kell bírniok, pl. replikációs origóval, antibiotikum szelekciós lehetőséggel, a szóban forgó gén kifejező promotorjával és transzkripciós aktívátórával, és további olyan jellemzőkkel, amelyek a szakterület szakértői számára ismertek. Amennyiben ezeket az elemeket megfelelően kombináljuk, vektort kapunk; és ha a szóban forgó gén a transzkripció és transzdukció szabályozó szekvenciái szempontjából természetes módon van beiktatva, az így létrejövő plazmidot kifejező plazmidnak nevezzük. A kifejező plazmid vagy vektor így képes kifejezni a fehérjét a gazdasejtben. A fehérjét ezután tisztítással lehet kinyerni.

Azok az elemek (promotorok), amelyek természetes módon szabályozzák különböző gének, pl. a növekedési faktorok génjeinek kifejeződését, saját kifejeződésükben nem nagyon erősek és csak megfelelő természetes körülmények közt aktiválódnak, amelyek gyakran ismeretlenek.

Ezért ismert aktivitású promotorokat alkalmazunk, amilyen pl. a Baculovírus polihedrinjének prorr.otora, vagy más promotor gén szekvenciák. A magasszintű kifejeződéshez alkalmazott elemek ennél fogva különböző eredetű (eukarióta, bakteriális, virális, stb.) DNb-ek kombinációi, amelyek különböző, egymással összekapcsolt gén-részletekből tevődnek össze, hibridet képezve. Egy gén • ·

- 7 transzkripciós és transzdukciós aktivitásai függnek attól, menynyire megfelelőek a távolságok a szabályozó és a kódoló szekvenciák között.

Elmondható, hogy a szabályozó szekvenciák megfelelő működéséhez a legjobb út, ha a bevezetendő gén abban a helyzetben van, amelyet a természetes gén foglalt el eredetileg. Az egyik alkalmazott rendszerben a szabályozó szekvenciák magukban foglalják a kódoló szekvenciák néhány aminosavát is. Az egyesülés a bevezetett génnel egy fűziós fehérjét eredményez. Másrészt viszont ha a fuzionált részt eltávolítjuk, lehet, hogy magasabb biológiai értékeket kapunk. Ha nem használjuk a fúziós fehérjéket alkalmazó technikát, a hagyományos technika a szabályozó szekvenciák szoros közelségében elhelyezett gének kialakítására attól függ, hogy vannak-e alkalmas restrikciós helyek, amelyek lehetővé teszik a klónozást. Ha nincsenek a közelben kompatibilis helyek, csak eltérő helyek, lehetséges úgy végrehajtani a szegmensek egyesítését, hogy egy kívánt restrikciós helyet tartalmazó oligonukleotidőt vagy kapcsolót szintetizálunk. Ha nincsenek a közelben restrikciós helyek, amelyek lehetővé tennék ezeknek a kacsolóknak az alkalmazását, akkor a DNS Bal31-gyel vagy S1-gyel végzett kiiktatásának technikáját alkalmazhatjuk. Ez a lehetőség nem engedi meg a pontos kiiktatást és különböző kiónokat kell ellenőrizni időnként szekvenciaelemzéssel, hogy megláthassuk: melyik a legalkalmasabb klón. Ezek az eljárások nagyon korlátozottak a molekulárbiológusok számára, következésképpen alternatív stratégiákat kell kidolgozni a most már rendelkezésre álló új technikák figyelembevételével; ilyen pl. a polimeráz láncreakció (PCR)PSaiki és munkatársai: Science 239 , 487(1988) ; Scharf S.J.: Science 233, 1076(1986)^]. Ez-

zel a technikával egy génszegmens akár 106-szoros sokszorozása is lehetséges. Az elv két olyan oligonukleotid alkalmazásán alapul, amelyek mindegyike párt képez a sokszorozandó DNS szálak valamelyikével. A távolság a két nukleotid között, a vizsgálat alatt álló gén szempontjából, megadja az előállítandó molekula méreteit. Ezt a két oligonukleotidot úgy alkotjuk meg, hogy az egyes oligolegyen^/ nukleotidok szekvenciáján belül /egy olyan restrikciós hely, amely lehetővé teszi ezek egymás utáni klónozását. Ez a restrikciós hely vagy természetes módon van jelen, vagy ad hoc alkotjuk meg minimális számú nukleotid degenerálásával. Ez a megközelítés, amelyet helyre irányuló mutagenezisnek nevezünk, lehetővé teszi restrikciós helyek megalkotását olyan helyeken, amelyet a molekulárbiológus maga határoz meg. A más gén-szegmensekkel kompatibilis helyek megalkotása nem csupán a klónozást teszi könnyűvé, hanem mindenek felett lehetővé teszi kívánság szerint különböző génszegmensek összekapcsolását. Ezt a technikát úgy írhatjuk le, mint klónozást közvetlen mutagenezissel. Gyakorlatban a rekombináns DN8 technika segítségével lehetséges komplett heterológ polipeptideket kifejezni közvetlen kifejezéssel, vagy egy másik eljárás szerint lehet a heterológ polipeptideket egy analóg polipeptid aminosavszekvenciájának egy részéhez fuzionálva kifejezni. Általában azonban az így kapott termékek biológiailag nem aktívak [Ν 200767A számon közzétett brit szabadalmi bejelentés; Wenzel: American 8cientist 68, 664(1980)|.

Az a lehetőség, hogy az ideg növekedési faktor p alegység izolálható, fontos új utat nyit meg. Ebből a ritka fehérjéből rekombináns DN8 technikával megfelelő mennyiséget elő lehet állítani. 8őt, az ideg növekedési fehérjét el lehet fogadni klinikai • · • · 4·

- 9 alkalmazásra is különböző neuro-degeneratív betegségek kezelésére. Ebben a témában már jelentős dokumentáció gyűlt össze az NGF p alegység kinyerésével kapcsolatban rekombináns DNS technikával [>21388 lajstromszámú Európa szabadalom; Bruce G. és munkatársai: Neurobiology of Aging 1 0, 89(1989); Hu G. és munkatársai: Nucleic Acid Research 70, 57(1988); Edwards R.H. és munkatársai·: Mól.

Cell Bioi. 8, 2456(1988); Emfors P.: Proc. Natl. Acad. Sci. 86, 4756(1989^; 48564A89 számon közzétett olasz szabadalmi bejelentésj . A termelés céljára az emlős sejtek a baktériumoknál csak abban az esetben előnyösebbek, ha a kifejeződés a mikrobiológiai sejtekben, bár kevésbbé drága, gyakorlatilag nehezen kivitelezhető. Sokkal gazdaságosabb tehát bizonyos fehéjéket bakteriális vonalakban, pl. E. coliban kifejezni, de ez a gazdaszervezet/vektor rendszer az aminosavaknak csak a fehérjét alkotó lineáris szekvenciáját reprodukálja híven, oldhatatlan masszát alakítva ki a baktériumon belül. Abban az esetben, ha ebből az anyagból bizonyos terméket gazdaságosan ki lehet nyerni, az E. coli lehet az előnyös rendszer, elsősorban bizonyos kisebb molekulák, mint interferonok, és bizonyos állati növekedési fehérjék esetében, amelyek in vitro megfelelően összehajtogathatók. Ezek a rendszerek a leggazdaságosabbak azokban az esetekben, ahol olyan fehérjékről van szó, amelyek egyetlen diszulfid híddal bírnak és olyan peptidekről vagy fehérjékről van szó, amelyek nem igényelnek pontosan meghatározott szerkezetet felhasználásukhoz (pl. diagnosztikus antigénként vagy vakcina komponensként).

A jelen találmány tárgya eljárás a biológiailag aktív humán ideg növekedési faktor előállítására a rovarsejt/Baculovírus kifejező rendszert alkalmazva.

9 • · · · ·· « •9« · · · « • · · · · * ·· ·· *· ··· ·

- 10 A biotechnológia alkalmazásával és különböző rendszerekkel a kívánt fehérje kifejeződésének jelentős szintjét lehet elérni. Ezek azonban biológiailag nem mindig aktívak; a jelen találmányfigyelembe veszi mind azt, hogy a kifejeződés szintje magas legyen, mind azt(és ezt elsősorban), hogy az anyag biológiailag aktív legyen. A hNGF molekula esetében ennek kifejezése prokarióta és eukarióta rendszerekben ismert. A prokarióta vonalakban (E. coli) valő kifejeződéskor lehet gazdaságosan elérni a kifejeződés jelentős szintjét, (Je a polipeptid gyakran tartalmaz egy iniciációs metionint, amelyet nem lehet eltávolítani. A legtöbb esetben az anyag a sejten belül csapódik, ki oldhatatlan részecskeként; kivonásuk kaotróp szereket igényel és ahhoz, hogy biológiailag aktív anyagot kapjunk ezeket újra kell hajtogatni és molekuláik dimerizálódását ellenőrizni kell. Hangsúlyoznunk kell, hogy az NGF molekula három, szerkezetileg jól meghatározott diszulfid híddal bír, és hogy a molekula biológiai aktivitása a két, dimert képző molekula összekapcsolódásának tulajdonítható, és ez meg is őrzi biológiai aktivitását. Az emlős sejteket lehet alkalmazni humán eredetű molekulák kifejezéséhez, de ezek alkalmazásának fő hátránya az, hogy nagy mennyiségű tápközeget és szérumot igényelnek, amelyek nagyon drága alapanyag-források, és ez az ipari folyamatoknál nagyon fontos szempont. Ezen kívül ezekben a kifejeződési szint általában sokkal kisebb, mint a prokarióta rendszerekben történő kifejezésnél kapott értékek.

A Baculovírus rendszer lekűzdi mindezeket a fentebbiekben vázolt nehézségeket; ez gazdaságosabb ipari szempontból mivel kevesebb táptalaj-költséget igényel, az anyag épen megtartja biológiai aktivitását, ugyanis a sejtekben sikerül korrekt diszulfid hidakat kialakítani, és a dimer képződés folyamata a p-alegység kialakítására nem igényli a molekula újra-hajtogatását, mivel ez természetes úton végbemegy. Ez a transzdukció utáni folyamat fontos ennek biológiai aktivitásához.

A gyógyászati fehérjéket, amelyek egyike az ideg növekedési faktor (pNGF), korrekt módon kell kialakítani abból a célból, hogy aktivak és felhasználásra alkalmasak legyenek, és ezeknek menteseknek kell lenniök mindenféle antigén választól. A rekombináns DNS-ből kapott fehérje kinyerésének folyamata magában foglalhatja a glikozilezést, a korrekt diszulfid kötések képződését és más transzdukció utáni módosításokat. Az E. coli bakteriális sejtvonal nem képes kielégíteni ezeket a követelményeket, míg az emlős eukarióta sejtek és az élesztők képesek. Ezek olyan problémák, amelyeket figyelembe kell vennünk, amikor a humán NGF-nek, mint biotechnológiai úton nyert gyógyszernek a lehetséges alkalmazását fontolgatjuk.

Kimutatták, hogy az NGF aktivitása függ dimer formájától, vagyis a két, 118-118 aminosavból álló analóg polipeptid összekapcsolásától. A '3 -merkapto-etanollal végzett redukció csaknem teljesen tönkreteszi a biológiai aktivitást. Azok a kísérletek, amelyek a három diszulfid kötés renaturálására irányulnak, statisztikailag 1:15 valószínűséget eredményeztek a korrekt szerkezetű, a természetes molekulának megfelelő molekulát kialakító ciszteinek újra összeállítása tekintetében. Következésképpen amikor a molekulát E. coliban alakítjuk ki, a molekulák szerkezetének homológiája és humán gyógyszerként alkalmazhatósága nem garantálható.

Ha azonban az E. coliból a humán NGF-et homogenitásig tisz12 títjuk, ez rágcsáló pNGF-re fajlagos poliklonális antitestekkel végzett immun-foltképzés során egy sor olyan csíkot mutat, amelyek nem tulajdoníthatók a biológiailag aktív dimer formának. A szerkezetek és formák ezen keverékének biológiai aktivitása tízszer nagyobbnak bizonyult, mint a természetes forrásokból, pl. placentából tisztított analóg humán formáé. Egyrészt tehát az E. coliban végzett klónozásnak és az ideg növekedési faktor kinyerésének ezen eljárása a szóban forgó fehérje kifejezésének magas szintjét eredményezi. Másrészt viszont ez egy sor olyan megváltozott molekulát termel, amelyek, ha in vitro vezetjük be, szekunder hatásokat alakítanak ki, pl. olyan antitesteket alakítanak ki, amelyek felismerik, és blokkolják a természetes módon jelen levő molekulák biológiai aktivitását. Ugyanakkor az érett molekula klónozása E. coliban egy iniciációs metionint jelent, amelyet nem lehet eltávolítani és így bizonyára immunogén, mivel ez a molekula exponált részén helyezkedik el.

Egy másik megközelítés a prepro NGF klónozását foglalja magában eukarióta sejtekben, és kihasználja az eukarióta sejtekben természetes módon jelen levő fajlagos peptidázoknak. a hasítási képességét az érett molekula kinyerésében. Pontosabban a kifejeződés bpodoptera frugiperda sejtekben megy végbe. A rendelkezésre álló irodalom azt mutatja, hogy a humán NGF teljes genomikus kiónjának szekvenciaelemzése még nem történt meg, de azt már kimutatták, hogy a gén mintegy 10 kDa kiterjedésű [Ullrleh A. é_Smunkatársai: Natúré 303, 821(1983)]. Az ilyen kiterjedésű gén nem tesz lehetővé hagyományos klónozást a teljes genomikus szekvenciából kiindulva. Az alkalmazandó megközelítés az, hogy a fehérjének csak a kódoló részeit tartalmazó cDNíi egy részét klónozzuk.

• · · ·

- 13 A humán ^NGF teljes cDNS-ét még nem izolálták, (néhány szekvencia az 5’ végen még ismeretlen), de már többet tudunk más eredetű (egér, szarvasmarha, csirke, stb.) NGF üzenetekről (messenger) ^Meier R. és munkatársai: EMBO J. 5., 1489(1986); Selby H.J. : J: of Neuron Research 1 8, 293(1987)] , amelyekből bizonyos érdekes következtetéseket vonhatunk le. Az egér NGF gén egyetlen kópiában van jelen és legalább négy különböző, eltérő méretű üzenetet termel j^Selby M.J. és munkatársai: Mól. Cell Bioi. 7, 3057 1987)J. A különböző méretek mindenek előtt azt tükrözik, hogy AUG iniciátor kodonjaik különböznek; ezek közül a legfontosabbak a -187-nél és a -121-nél vannak az érett fehérje szekvenciájához viszonyítva. Ezek az üzenetek különböző mennyiségekben vannak, jelen a különböző szövetek szerint. Azok, amelyek a -187-nél kezdődnek, az állkapocs alatti mirigyben tízszer dúsabban vannak jelen, mint azok, amelyek a -121-nél kezdődnek. Összeválogatott bizonyatékok viszont azt mutatják, hogy az agyban kifejezett NGF üzenetek legnagyobb arányban ezeket a -121-nél levő AUG-ket alkalmazzák.

Ezen bizonyítékok alapján olyan humán NGF klónozásába kezdtünk, amely a -121 . metioninnál kezdődik. A hidropátiás profil (1. ábra) elemzése azt mutatja, hogy a -121 és -104 közti aminosavak peptid vezető szekvenciaként működnek, jelezve, hogy a fehérje kiválasztható. Abból a célból, hogy az érett fehérjéhez lehessen jutni, itt van egy fajlagos peptidáz, amelynek segítségével megkaphatjuk a biológiailag aktív pepiidnek megfelelő +1 - +118 aminosavszekvenciát. Ez a peptid mindenütt jelen van, mivel sokféle típusú emlős sejtben egyaránt megtalálható. A prepro NGF részét tartalmazó és különböző típusú sejtekbe fertőzött konstrukciók is képesek érett NGF-et kiválasztani, lehetővé téve • * · · · · • · · · · · · ··· · · · · ·· · · ···· ·· ·· ··· · egy olyan molekula termelését, amely denaturáló és redukáló körülmények között gélen 14 kDa méretű ^Edwards R.H.: Mól. Cell. Bioi. 8, 2456(1988)] .

fentebb leírt, az ideg növekedési faktor ^-alegységének előállításával kapcsolatos korábbi tapasztalatok alap’ján telje sen új megközelítést alkalmazunk egy vektor megalkotására, amelyet rekombináns eszközként alkalmazunk a természetes Baculovírussal együtt Arthropoda frugipeda sejtek fertőzésére. A prepro NGF klónozásához a POR technikát alkalmazzuk, amellyel olyan restrikciós helyeket alkotunk meg, amelyek a szabályozó és a kódoló szekvenciák között a lehető legtermészetesebb távolságokat tartják meg és lehetővé teszik a pVL vektor könnyű klónozását. A prepro NGF egy részletét hozzákapcsoljuk egy módosított természetes humán NGF (hpNGF) szekvenciához, amely a British Biotechnoiogy £,td (Oxford, Nagy-Britannia) terméke; ebben a termékben a restrikciós helyek úgy vannak kialakítva, hogy lehetővé tegyék a ir.utagenezist . A jelen találmány céljaira ezeknek a restrikciós helyeknek a jelenlétét nem tekintjük korlátozó tényezőnek, és nem tekintjük annak a gén origóját sem.

Ezen előfeltételek alapján a prepro hjNGF-et a Baculovírus polihedrinjének szabályozása alatt klónozzuk. Ezt a konstrukciót átfertőzzük Spodoptera frugiperda sejtekbe a természetes Baculovírussal együtt. Tisztítás után egy k.iméra rekombináns vírust izolálunk, amely genorr.jában vagy kromoszómájában hordozza a humán ideg növekedési faktort (hNGF) a Baculovírus polihedrinjének és a szintéziséhez alkalmazott összes szekvenciának szabályozása alatt.. Ezt a rekombináns vírust alkalmazzuk Arthropoda frugiperda sejtek újra fertőzéséhez, igazolva, hogy a fertőzött sejtek • · · · • · ·· * · · ·· • ·· megfelelő tenyészközegben képesek termelni a hpNGF polipeptidet érett és biológiailag aktív formájában. A molekula összeállításához esszenciálisnak bizonyul az a prepro NGF részlet, amely lehetővé teszi a palegység kifejeződését, és bizonyítja, hogy a genetikai konstrukció korrektnek tekinthető.

Az alábbiakban röviden összefoglaljuk a találmányt.

A jelen találmány tárgya eljárás a humán NGF j3 alegységének, előállítására Baculovírus rendszerből, pontosabban

- genetikai konstrukció előállítása olyan módon, hogy a távolság a szabályozó szekvencia (polihedrin promotor) és a szóban forgó fehérjét kódoló szekvencia között természetes legyen;

- azok az eszközök, amelyek véghezviszik a fentebb említett konstrukció rekombinálását valamely vad típusú vírussal; és

- azok az eszközök, amelyek lehetővé teszik a tenyésztést és a humán ideg növekedési faktor (hNGF)p alegysége érett formájának kinyerését a polipeptidhez fuzionált egy vagy több olyan aminosav nélkül, amelyek eltérnek a természetes szekvenciában jelen levő aminosavaktól.

Az így kapott polipeptid megfelelő biológiai aktivitást mutat, amikor megfelelő célsejteken alkalmazzák. A jelen találmányban leírt hpNGF-et alkalmazhatjuk az idegműködés fenntartására vagy az idegműködés elvesztésének megakadályozására, az idegműködés visszanyerésére krónikus vagy akut patológiás körülmények között, neurodegeneratív szituációkban akut patológiás állapotok késői stádiumaiban, pl. agyérrendszeri, fertőző, gyulladásos, vérnyomásbeli és metabolikus elváltozások esetén, és az immunrendszer módosulásai esetében. A kapott polipeptid mentes más, humán eredetű szennyező fehérjéktől, amelyek nem kívánt biológiai akti16 vitásokat mutathatnak.

A találmány foglalkozik továbbá azzal a transzformált sejtvonallal, amely tartalmazzaa a szóban forgó vektort, valamint ennek olyan tenyészeteivel, amelyek hpNGF-et termelnek.

A jelen találmány foglalkozik továbbá olyan gyógyászati készítményekkel, amelyek aktív vegyületként a neuronotróf faktor |3 egysége és egy természetes gangliozid közti új komplexekből egyet vagy többet tartalmaz, vagy ezek valamely származékát, félszintetikus analógját vagy sóját tartalmazza.

A találmány foglalkozik továbbá a gangliozidoknak vagy származékaiknak az NGF ideg növekedési faktor p alegységével képzett össze komplexeinek terápiás alkalmazásával a fentebb említett indikációk esetén. Az itt következő példák bemutatják az új vegyületek előállítását, az előállítás munkamenetét, a gyógyászati készítményeket és ezek felhasználását.

Az alábbiakban röviden ismertetjük a bejelentés ábráit.

Az 1 . ábra a humán eredetű ideg növekedési faktor p alegység polipeptid hidropátiás profilja az alábbi irodalmi helyen leírt eljárás szerint: Hopp és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 3824(1981 ). A —121/-104-ként jelzett hely a vezető peptid szekvenciát azonosítja, míg a +1/+1l8-ként jelzett hely a humán eredetű ideg növekedési faktor p alegység polipeptidjének aminosavszekvenciáját azonosítja [Ullrich és munkatársai: Natúré 303, 821(1983)].

A 2. ábra a píSVLhNGF kifejező vektor megalkotásának vázlata.

Az alábbiakban részletesen ismertetjük a találmányt, vagyis hogyan hajthatjuk végre a jelen találmány tárgya szerinti eljárásokat. Ezek az ismertetések csak a bemutatás célját szolgálják és semmiképpen sem kívánják korlátozni a találmány oltalmi körét,' minden olyan változatot, amely a szakterület ismerői számára nyilvánvalónak tűnik, a találmány oltalmi körén belül levőnek tekintünk .

A DNS lánc kezelését restrikciós enzimekkel a gyártók útmutatása szerint hajtjuk végre. Általában 1 ,/íg plazmidot hasítunk

V egység enzimmel 20 Ml oldatban; a hőmérséklet és az inkubációs idő függ az alkalmazott enzimtől, de általában 1 óra 37°C hőmérsékleten. Az inkubálás után a plazmidokat és a gén szegmenseket minden esetben agaróz gélen tisztítjuk £LMP Agarose (BRL-USA)J 40 mmól/1 trisz.HCl-t, 20 mmól/1 nátrium-acetátot és 1 mmól/1 EDTA-t tartalmazó oldatban, majd az agarózról a GENECLEANTM készlet ^BIO 101 Inc.,(La Jolla, Kalifornia, USA)J segítségével eluáljuk. Az 5’ végnél levő replikációs reakciókhoz a DNS-t 15 percig kezeljük 15°C hőmérsékleten 10 egység Klenow polimerázzal. Abból a célból, hogy a restrikciós enzimekkel hasított DNS-t defoszforilezzük, bakteriális alkálikus foszfatázt (GIBCO-BRL) alkalmazunk. A reakciót 150 mmól/1 trisz pufferban (pH 8) hajtjuk végre egység alkálikus foszfatázt alkalmazva 20,511-ben 60°C hőmérsékleten 1 órán át. Ligázként T4 ligázt alkalmazunk 1 egység/0,5 Afg DNS koncentrációban, 20y>11 reakciótérfogatban 13°C hőmérsékleten 12 órán át. A korrekt plazmid szekvencia igazolására végzett elemzéseket úgy hajtjuk végre, hogy HB101 sejtekbe transzformálunk és a transzformált sejteket agaróz lemezeken szelektáljuk LB (Luria Bertani) tápközegben, amely 50y4g/ml ampicillin antibiotikumot is tartalmaz. A HB101-ben levő plazmidokat 100 /4g/ml arr.picillint is tartalmazó LB-tápközegben tenyésztjük, majd tisztítjuk mind kisebb, mind nagyobb mennyiségű készítmény formájában, « · · • · · · · • · · · · · • · · · · · • · · · • · · · »·

- 18 Quiagen készletet J^DIAGEN GmbH(Düsseldorf, Németország)J alkalmazva. A kifejező vektorokat baktériumsejtekből állítjuk elő a Quiagen eljárással.

A PCR reakciókhoz a DNS-t humán placentából az alábbiak szerint állítjuk elő. A korion bolyhok egy 0,4' cm -es darabját ollóval finoman felaprítjuk és 700/( 1 olyan oldatban szuszpendáljuk, amely 50.mmól/1 trisz.HCl-t(pH 7,8), 100 mmól/1 EDTA-tj 100 mmól/1 NaCl-t és 1 % SDS-t tartalmaz. Ehhez azután hozzáadunk 35

K proteinázt (100/tg/ml) és az egészet egy éjszakán át inkubáljuk 55°C hőmérsékleten. Ezután 20/f 1 13/lg/ml-es RN-áz A oldatot adunk hozzá és további 2 órán át inkubáljuk. Ezt két extrahálás követi fenollal és két extrahálás kloroformmal. A DNS-t ezután finom üvegcsőbe kicsapjuk 1 térfogat izopropanol hozzáadásával. Ezután ezt többször átvisszük 70 %-os, majd 100 etanolos kezelésen, majd megszárítjuk. A DNS-t ezután pufferban feloldjuk £l0 mmól/1 trisz.HC1 (pH 7,4), 1 mmól/1 EDTA*] egy kémcsőben gyengéd keverés közben. Néhány órával később a feloldott DNS a gén-sokszorozásra kész. Általában 0,1 Mg DNS elegendő a PCR kivitelezéséhez .

A transzfer vektor megalkotása.

Mivel a Baculovírus genom nagyon terjedelmes (125 Kb) és eddig még nincs az egyedi restrikciós helyek szempontjából feltárva, egy rekombinációs munkamenetet kell kidolgozni a transzfer konstrukció és a Baculovírus között. Ilyen módon kiméra Baculovírust kapunk, amelybe a hNGF molekula be van építve.

Az alkalmazott transzfer vektor a PVL [ez az INVITROGEN-től (San Diego, Kalifornia) szerezhető bej, amelyben egy egyedi BamHI hely van kialakítva közvetlenül a polihedrin után. Abból a célból, » · · · • · · · • · · · · • · · · · • · · • · · · 9

- 19 hogy ebbe a vektorba klónozzunk, a hNGF vektort úgy manipuláljuk, hogy hozzáadunk egy összefonódási (splicing) és poliadenilezési helyet közvetlenül a gén után, és az egész két BamHI hely között helyezkedik el, hogy könnyebb legyen a klónozás.

A prepro NGF PVL-Baculovírus transzfer vektorban való klónozásának részletes leírása.

A prepro NGF-et a PCR technikával klónozzuk. Két oligonukleotidot szintetizálunk: az első, a 9122. és 9147 bázisok között [jJllrich A.: Natúré 303, 821 (1983)] a következő szekvenciával bír: - Met Ser Met Leu Phe

5’ GCATAGCGTA ATG TCC ATG TTG TTC T3’ .

A nukleotidokat az iniciációs AUG előtt megváltoztatjuk és a szintetizált oligonukleotid ennek megfelelően a következő szekvenciával bír:

Xbal Met Ser Met Leu Phe

5’TGT CTAG AGT ATG TCC ATG TGG TTC T3’

Ezt az oligonukleotidot (Xbal)-nek nevezzük. A második oligonukleotid, amely a 9521. és 9342. közti bázisokat tartalmazza ^Ullrich A.: Natúré 303, 821 (1983)], k omplementer ezzel a szekvenciával, hogy lehetővé tegye a PCR-t, és az alábbi szekvenciával bír: EcoRI

5’GGCGG AATT CTCGGTGGTGGAC3’·

Ezen a nukleotidon belül található az az EcoRI hely, amely lehetővé teszi a prepro NGF egyesítését az érett NGF-fel. Ezt az oligonukleotidot (EcoRI)-nek hívjuk. A két oligonukleotidot szilárd fázisban szintetizáljuk oligonukleotid. szintetizáló berendezésen a foszfoamiditet alkalmazó eljárással a 380B DNA Synthezer berendezéshez (Applied Biosystems - USA) tartozó standard munkamenet szerint. Ezeket 55°C hőmérsékleten 12 órán át kezeljük NH3-ban, majd vákuumban szárítjuk. Ezután ezeket újra szuszpendáljuk 2,5 mól/l-es ammónium-acetátban, majd kicsapjuk 3 térfogat hideg etanollal (-20°C). Ezeket újra mossuk 80%-os hideg etanollal és újra szuszpendáljuk vízben. A két oligonukleotid koncentrációját spektrofotométerrel határozzuk meg. A terjesz• ·

- 20 test Perkin Elmer Cetus DNA Thermal Cycler berendezésen hajtjuk végre, és a terjesztéshez alkalmazott reagensek azok, amelyeket az ide vonatkozó DNATM Amplifier készlet (Perkin ElmerCetus) tartalmaz: 200-200/1 mól/1 az egyes oligonukleotidokból: 0,5-0,5/4.1 dATP, dTTP, dCTP, dGTP , és 0,1 /ig humán DNS, továbbá reakciópuffer olyan mennyiségben, hogy a teljes keverék 100 /ι 1

V legyen, továbbá 0,5 egység TAQ polimeráz^mindez paraffin olajjal fedve, hogy az elpárolgást megakadályozzuk. A kiterjesztési reakciót úgy hajtjuk végre, hogy a berendezést 35 ciklusra állítjuk be humán DNS esetében. A ciklus mindkét esetben a következő: 1 perc 94°C, 2 perc 45°C, 3 perc 72°C. A 300 bp-s kibővített fragmentumot Low Melting Agarose gélen (NuSieve) tisztítjuk, a GENECLEANTM készletet (BIO 101 Inc., La Jolla, Kalifornia, USA) alkalmazva, hogy az agarózt feloldjuk. A DNS-t Xbal és EcoRI restrikciós enzimekkel hasítjuk és a fentiek szerint újra tisztítjuk. Az így tisztított, fragmentált anyagot a pGEM4 vektor (Promega) Xbal és EcoRI helyeibe klónozzuk. A kapott plazmidot pGEM4Xba-NGFnek nevezzük. Ezt a plazmidot HindlII-mal és EcoRI-gyel hasítjuk és a 300 bp-s fragmentumot, miután megtisztítottuk, a pUCl8BBG26 vektor (British Biotechnology Ltd., Oxford, Egyesült Királyság) HindlII-EcoRI helyeibe klónozzuk. A pUC18BBG26 plazmid tartalmaz egy szintetikus hpNGF gént; ez olyan restrikciós helyeket tartalmaz, amely egy természetes génben nincs jelen, ezáltal lehetővé téve bizonyos tartományok (domének) helyettesítését. Az így kapott vektort pUC18hNGFC-nek. nevezzük.

Ezután ezt a plazmidot a PvuII és Xbal helyeken elhasítjuk, és a 800 bp-s fragmentumot a pGEM4 vektorba klónozzuk a PvuII és az Xbal helyek közé. Ilyen módon kapjuk meg a pGEMBamNGF vektort.

- 21 Ezen a módon a hNGF gén két BamHI restrikciós hely között található. Ekkor a Baculovírus pVL kifejező vektort BamHI-vel nyitjuk, alkálikus foszfatázzal átfoszforilezzük, majd beiktatjuk a pGEMBamNGF vektor 760 bp-s BamHI fragmentumát; így kapjuk meg a psVLhNGF kifejező vektort. A különböző bakteriális kiónokat, amelyek a rekombináns plazmidot hordozzák, elemezzük, hogy el tudjuk bírálni az NGF gén korrekt elhelyezkedését a polihedrin promotor szempontjából. A 2. ábra a klőnozási eljárás összefoglalását mutatja be.

Rovarsejt tenyészetek.

Ezeknek a sejteknek a tenyésztési eljárása önmagában ismert azok számára, akik a szakterületen jártasak. Ezek tenyésztésére pl. eljárást ismertetnek az alábbi irodalmi helyek: Eummers H.D. és munkatársai (1987); 127.839 lajst romszámú Európa szabadalmi leírás (ümith G.E.); és 4,745,051 lajstromszámú amerikai egyesült államok-beli szabadalmi leírás

A jelen találmány céljaira a üpodoptera frugiperda (8fg) sejtjeit alkalmazzuk, mivel ezeket növeszthetjük egy-rétegben is és szuszpenzióban is. Egy-rétégként ezek COg jelenléte nélkül is fenntarthatók 25-30°C hőmérsékleten, és az összefolyás! stádiumban ezek hetenként 2-3-szor osztódnak. A szuszpenzióban végzett tenyésztés feltételei a tápközegtől és a tenyészet térfogatától g függnek. Fermentorban mintegy 2.10 sejt/ml koncentrációig tudunk növeszteni erőteljes levegőbevezetés mellett. A szérummentes tápközeg alap-tápközege a Grace-féle rovarsejt tápközeg (GIBCO, BRL), amelyhez még valamely lipid komponenst és peptont adunk. Védőszerként valamely antibiotikumot is adunk a tápközeghez. F 68 feronikus anyagot is adunk a tápközeghez, hogy a sejteket a ráza·· · · ·· • · · V · • · · · · • « · • · · · ·

- 22 fásból eredő károsodástól megóvjuk.

& rekombináns vírus előállítása és izolálása.

A rekombináns vírus izolálásának részletes eljárásai megtalálhatók a 0 127 839 lajstromszámú európai szabadalmi leírásban. Általában 2j^g, hNGF molekulát hordozó transzfer vektor DNS-t és 1j4g AcNPV vírus DNS-t együtt transzformálunk Spodoptera frugiperda sejtek egy-rétegébe. A sejtek 3-4 nap múlva mutatják a vírus befogadását, és a sejtek 10-50 %-a fertőzött. A vírus 10 titer értékkel megy át a tápközegbe, és ezeknek mintegy 0,1-0,5 %-a rekombináns vírus. Többféle eljárás is ismeretes a rekombináns vírus izolálására. Hibridizációs tarfoltokat - vizsgáló mintaként hNGF génnel-, vagy m^NGF elleni antitesteket - amelyek kereszt-reagálnak h.pNGF-fel - alkalmazhatunk erre a célra. A jelen találmány esetében a rekombináns vírus izolálását a sejtek lágy agarózzal fedett egy-rétegében végzett sorozathigitásával hajtjuk végre. 2-3 ciklus után a rekombináns vírus negatív okkluziós jellemzőket mutat. A mintegy 10000 vírust tartalmazó tarfoltokat steril pipettával átvisszük 2 ml tápközegbe. Az izolálás után ezek képviselik a rekombináns vírusokat, amelyeket ezután fertőzésre és hNGF termelésére használhatunk Spodoptera frugiperda se jtekben.

A biológiai aktivitás meghatározása

A rekombináns vírussal fertőzött Spodoptera frugiperda sejtvonal tenyészközegébe kiválasztott humán NGF biológiai meghatározására szolgáló in vitro tanulmányokat P-12 embrió feokromocitóma sejteken végezzük ^Greene L.A. és munkatársai: A. Rév. Neurosci. 3, 353(1982)]. A reakció fajlagosságát úgy határozzuk meg, hogy a természetes vírussal fertőzött Spodoptera frugiperda tenyészközegét is felhasználjuk, vagy a rágcsáló vagy szarvasmarha ere···<

- 23 detű pNGF elleni fajlagos poliklonális antitestekkel blokkoljuk a tenyészközegben jelen levő h^NGF aktivitását.

A fentebb említett rekombináns vírussal fertőzött sejtek a humán NGF |3-alegységét termelik biológiailag aktív formában, és ki is választják azt a tenyészközegbe. A kifejezett fehérjéket a felülúszóból vizsgáljuk SDS géleken.

Gyógyászati készítmények.

A rekombináns DNb-ből származó humán NGF molekulát ( ^-alegység) tartalmazó gyógyászati készítmények, akár gangliozidokkal és foszfolipidekkel együtt, akár azok nélkül, a gyógyászatilag elfogadható készítmények előállításánál ismert eljárásokkal állíthatók elő, ahol a készítmény előállításának az a fő szempontja, hogy ez a betegekbe jól bevezethető legyen. Ehhez a hNGF molekula hatékony mennyiségét valamely gyógyászatilag elfogadható hordozóval kell összekeverni. A megfelelő hordozók és esetleg más fehérjéket is tartalmazó kiszerelések le vannak írva pl. az alábbi szakkönyvben: Remington’s Pharmaceutical Sciences. ^Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack. Publishing Company, Easton, Pennsylvania, U8A(1985)J. Ezek között a készítmények között találjuk az injektálható depót, vagyis raktározott kiszereléseket is.

A gyógyászati kiszerelések között találjuk az ideg növekedési faktor oldatait, vagy ezek fagyasztva szárított porát egy vagy több gyógyászatilag elfogadható hordozóval vagy higitóval együtt megfelelő pH-jú pufferolt, és a fiziológiás folyadékokkal izozmotikus közegben - de eljárásunk nemcsak ezekre korlátozódik. Fagyasztva szárított készítmények esetében lehetséges kisegítő kötőanyagokat is alkalmazni, pl. (a korlátozás szándéka nélkül említve) mannitot vagy glicerint, és a kívánt térfogatú megfelelő pufférőit oldatokat úgy alakíthatjuk ki, hogy ez kívánt pH-jú, izotóniás pufferolt oldat legyen. Hasonló oldatokat alkalmazhatunk a rekombináns DNS-ből kapott ideg növekedési faktor molekula kívánt térfogatú, izotóniás oldatban levő gyógyászati kompozícióihoz; az ilyen jellegű alkalmazások között találjuk (a korlátozás szándéka nélkül) a megfelelő koncentrációjú citráttal és foszfáttal pufferolt fiziológiás oldatok alkalmazását, amely oldatok azon kívül, hogy gyógyászatilag fiziológiásak, a megkívánt pH értékre (általában semleges pH értékre) vannak beállítva.

A gyógyászati készítmények lehetnek orális, rektális, parenterális, lokális és intracerebrális felhasználásúak, vagy inhalációs készítmények. Ennek megfelelően ezek a gyógyászati készítmények lehetnek szilárd vagy félszilárd formájúak, pl. pilulák, tabletták, zselatin kapszulák, kapszulák, végbélkúpok, lágy zselatin kapszulák. A parenterális és intracerebrális alkalmazáshoz az intramuszkuláris és szubkután beadást alkalmazhatjuk, vagy infúziót vagy intravénás vagy intracerebrális injekciót; az ezekhez alkalmas kiszereléseknek ennél fogva az aktív-anyag oldatának kell lenniök, vagy az aktív anyag fagyasztva szárított porainak; ezekhez a porokhoz felhasználás előtt egy vagy több gyógyászatilag elfogadható hordozót vagy hígítót kell adni, amelyek a fentebb említett felhasználásra alkalmasak, és olyan ozmolaritást biztosítanak, amely a fiziológiai folyadékokkal kompatibilis. Helyi használatra a krém vagy balzsam kiszerelések tekinthetők elfogadhatónak, az inhalációs alkalmazásra a permetek, pl. orrpermetek tekinthetők alkalmasnak. A találmány szerinti készítmények állatoknak vagy embereknek való beadás célját szolgálják. Ezek a készítmények általában 0,1-10 % aktív komponenst • ·

- 25 tartalmaznak szilárd készítmények esetében.

A beadandó dózis a felhasználó egyéntől, az elérni kívánt hatástól és a kiválasztott beadási úttól függ. A napi dózis embereknek injekcióban (szubkután, intramuszkuláris vagy intracerebrális) általában 0,05 mg és 5 mg aktív vegyület között van testtömeg kg-onként. A gyógyászati kiszerelési formák között tápláljuk a végbélenát történő beadásra alkalmas kúpokat, amelyek lipofil kötőanyagokat tartalmaznak; ilyenek pl. a vízoldható, önemulziót képző kötőanyagok, mint a glikozselatin és hasonlók - de eljárásunkat nemcsak ezekre korlátozzuk. Ezekben a készítményekben a rekombináns DNö-ből kapott ideg növekedési faktor 0,01 és 1 tömeg % közti mennyiségben lehet jelen az összes kötőanyagra számítva. A végbélkúpok tartalmazhatnak megfelelő mennyiségű acetil-szalicilátot is, de a kisegítő anyagok nemcsak erre korlátozódnak .

A leírás jobb megértése céljából, de nem korlátozó jelleggel, példákat adunk néhány, jelen találmány szerint készített gyógyászati kompozícióra.

A. PÉLDÁK INJEKTÁLHATÓ OLDATOKRA

1. készítmény - 1	db	2 ml-es ampulla az alábbiakat	tartalmazza
Aktív vegyület		1/lg (3200	BU)
Nátrium-klorid		1 6 mg
Citrát puffer (pH	7)	injekcióhoz
alkalmas vízben		2 ml
2. készítmény - 1	db	2 ml-es ampulla az alábbiakat	tartalmazza
Aktív vegyület		10 (32000 BU)
Nátrium-klorid		1 6 mg
Citrát puffer (pH	7)	injekcióhoz
alkalmas vízben		2 ml

· • · · · ·· ·· ··»

3. készítmény - 1 db 2 ml-es ampulla	az alábbiakat tartalmazza:
Aktív vegyület	1 / g (3200 BU)
Nátrium-klorid	1 6 mg
Gangliozidok nátriumsó formájában	1 00 mg

Citrát puffer (pH 7) injekcióhoz

alkalmas vízben	2 ml
4. készítmény - 1 db 2 ml-es ampulla	az alábbiakat tartalmazza:
Aktyv vegyület	10/)g (332000 BU)
Nátrium-klorid	16 mg
Gangliozidok nátriumsó formájában	50 mg

Citrát puffer (pH 7) injekcióhoz

alkalmas vízben	2 ml
5. készítmény - 1 db 2 ml-es ampulla	az alábbiakat tartalmazza:
Aktív vegyület	1 g (32000 BU)
Nátrium-klorid	16 mg
Monoszialo-tetrahexozil-gangliozid	1 00 mg

(GM^ ) nátriumsó

Citrát puffer (pH 7) injekcióhoz

alkalmas vízben	2 ml
6. készítmény - 1 db 2 ml-es ampulla	az alábbiakat tartalmazza:
Aktív vegyület	10/lg (32000 BU)
Nátrium-klorid	16 mg
Monoszialo-tetrahexozil-gangliozid	100 mg

(GM^) nátriumsó

Citrát puffer (pH 7) injekcióhoz

alkalmas vízben

2 ml

• · · ·

7. készítmény

a.) 1 db 2 ml-es ampulla az alábbiakat	tartalmazza:
Fagyasztva szárított aktív vegyület	4/tg (12800 BU)
Glicin	30 mg
b.) 1 db 2 ml-es oldószeres ampulla az	alábbiakat tartalmazza:
Nátrium-klorid	16 mg

Citrát puffer injekcióhoz

alkalmas vízben

2 ml

8. készítmény

a.) 1 db 2 ml-es ampulla az alábbiakat	tartalmazza:
Fagyasztva szárított aktív vegyület	4/(g (12800 BU)
Mannit	40 mg
b.) 1 db 2 ml-es oldószeres ampulla az	alábbiakat tartalmazza:
Nátrium-klorid	1 6 mg

Citrát puffer injekcióhoz

alkalmas vízben

2 ml

9. készítmény

a.) 1 db 3 ml-es ampulla az alábbiakat

t d r t d 1 m d z z d .

a.) Fagyasztva szárított aktív vegyület Ί 0./(g (32000 BU)

Glicin	45 mg
b.) 1 db 3 ml-es oldószeres ampulla az	alábbiakat tartalmazza:
Nátrium-klorid	24 mg

Citrát puffer injekcióhoz

alkalmas vízben

3 ml

10. készítmény

a.) 1 db 3 ml-es ampulla az alábbiakat	tartalmazza:
Fagyasztva szárított aktív vegyület	10/tg (32000 BU)
Gangliozidok nátriumsó formájában	100 mg

Glicin mg

b.) 1 db 3 ml-es oldószeres ampulla az nátrium-klorid

Citrát puffer injekcióhoz alkalmas vízben

11. készítmény

a.) 1 db 3 ml-es ampulla az alábbiakat

Fagyasztva szárított aktív vegyület

Gangliozidok nátriumsó formájában

Glicin

b.) 1 db 3 ml-es oldószeres ampulla az

Nátrium-klorid

Citrát puffer injekcióhoz alkalmas vízben

12. készítmény

a.) 1 db 3 ml-es ampulla az alábbiakat

Fagyasztva szárított aktív vegyület

Monoszialo-tet rahexozi 1-gangliozid (GM^) nátriumsó

Glicin

b.) 1 db 3 ml-es oldószeres ampulla az • ·· • · · ·· • ·· • · · · alábbiakat tartalmazza:

mg ml tartalmazza:

10^g (32000 BU) mg mg alábbiakat tartalmazza:

mg ml tartalmazza:

g (3200 BU)

00 mg alábbiakat tartalmazza:

Nátrium-klorid

Citrát puffer injekcióhoz alkalmas vízben mg ml

13- készítmény

a.) 1 db 3 ml-es ampulla az alábbiakat tartalmazza:

Fagyasztva szárított aktív vegyület 10 Mg (32000 BU)

V

Monoszialo-tetra.hexozil-gangliozid 100 mg (GM1) nátriumsó

Glicin mg

b.) 1 db 3 ml-es oldószeres ampulla az

Nátrium-klorid

Citrát puffer injekcióhoz alkalmas vízben

14. készítmény

a.) 1 db 3 ml-es ampulla az alábbiakat

Fagyasztva szárított aktív vegyület

3-sn-foszfatidil-L-szerin

Lecitin

Mannit • ·· · • ·· • · · ·· • ·· ···· alábbiakat tartalmazza:

mg ml tartalmazza:

10^g (32000 BU) mg mg

100 mg

b.) 1 db 4 ml-es oldószeres ampulla az alábbiakat tartalmazza:

Nátrium-klorid mg

Injekcióhoz alkalmas víz ml

15- készítmény

a.) 1 db 3 ml-es ampulla az alábbiakat tartalmazza:

Fagyasztva szárított aktív vegyület

At g (32000 BU)

Mannit mg

b.) 1 db 3 ml-es oldószeres ampulla az alábbiakat tartalmazza:

Nátrium-klorid

Citrát puffer injekcióhoz alkalmas vízben mg ml

B. PÉLDÁK SZUBKUTÁN INJEKCIÓS KÉSZÍTMÉNYEKRE

16. készítmény

a.) 1 db 2 ml-es ampulla az alábbiakat tartalmazza:

Fagyasztva szárított aktív vegyület

5/(g (16000 BU)

Mannit mg

b.) 1 db 2 ml-es oldószeres ampulla az alábbiakat tartalmazza:

Nátrium-klorid 16 mg

Citrát puffer injekcióhoz alkalmas vízben 2 ml

C. PÉLDÁK REKTÁLIS ÚTON BEADHATÓ KÚPOKRA

17. kézítmény

Aktív vegyület

Kakaóvaj

18. készítmény

Aktív vegyület

Carbowax 1540

Carbowax 6000

19· készítmény

Aktív vegyület

Tween 61

Lanolin

20. készítmény

Aktív vegyület

Glicerin

Víz

Zselatin

A találmányban eddig járásokat sokféleképpen nem térnek el a találmány lO^g (32000 BU)

2,5 mg

10^g (32000 BU) leírtakból lehet módosítani.

céljától és ,75 g

0,75 g

Mg (32000 BU)

2,125 g

0,25 g víg (32000 BU) k

1,5 g

0,25 g

0,25 g világos, hogy ezeket az elAz ilyen módosítások szellemétől; ezek a módos!

tások. azok számára, akik a szakterületen jártasok, nyilvánvalók.

A találmány oltalmi körét tehát a most következő igénypontok szabják meg.

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1.) Rekombináns Baculovírus azzal jellemezve, hogy az átvivő ge- netikai konstrukció tartalmaz:

a.) egy nem természetes restrikciós helyeket magában foglaló.

és a humán eredetű ideg növekedési faktor polipeptid p alegységet (p>NGF) kódoló szintetikus génszekvenciát, ahol a humán idegi növekedési faktoron annak érett formáját vagy valamely biológiailag aktív származékát értjük; és ahol

b. ) az említett a.) génszekvencia 5’-vége fuzionálva van a humán ^NGF prepro terület természetes szekvenciájának 5’ végéhez;

c. ) az említett, humán j3NGF-et kódoló a.) génszekvencia 3’ vége egy poliadenilező és összefonódási (splicing) szekvenciához van fuzionálva; és

d.) az említett humán prepro /3NGF-et kódoló, az említett genetikai konstrukcióban jelen levő DNS szekvencia 5’- és 3’- vége működőképesen össze van kapcsolva a polihedrin promotor szabályozó elemeivel.
2. ) Az 1. igénypont szerinti rekombináns Baculovírus azzal jellemezve, hogy sejtfértőzéssel képes kifejezni az említett humán/’NGFet tenyészközegben.
3. ) Az 1. vagy 2. igénypont szerinti rekombináns Baculovírus azzal jellemezve, hogy az érett forma jelenleg ismert aminosavszekvenciájához fuzionált egy vagy több aminosavat kódoló terület hiányzik az említett genetikai konstrukcióból.
4. ) A 3- igénypont szerinti rekombináns Baculovírus azzal jellemezve, hogy az említett genetikai konstrukció tartalmazza a^alegység említett érett formáját kódoló génszekvenciát a prepro területet kódoló DNS szekvencia nélkül.

• · ♦ ·
5. ) Rekombináns Baculovírus átvivő vektor azzal jellemezve, hogy tartalmazza az 1.-4. igénypontok bármelyike szerint jellemzett genetikai konstrukciót és képes bevinni azt a Baculovírus genomba.
6. ) Rekombináns Baculovírus átvivő vektor azzal jellemezve, hogy ez a pSVLhNGF vektor.
7. ) Eljárás az 1.-4. igénypontok bármelyike szerinti rekombináns Baculovírus előállítása azzal jellemezve, hogy valamely 5. vagy

6. igénypont szerinti rekombináns Baculovírus átvivő vektort és egy Baculovírus receptort bevezetünk valamely gazdasejtbe_tlehetővé téve az említett genetikai konstrukció átvitelét az említett Baculovírus átvivő vektorból az említett Baculovírus receptorba, majd izoláljuk az 1.-4. igénypontok bármelyike szerinti rekombináns Baculovírusok valamelyikét.
8. ) Rekombináns rovarsejt azzal jellemezve, hogy tartalmaz egy, az 1.-4. igénypontok bármelyike szerinti rekombináns Baculovírust és képes kifejezni az említett humán pNGF-et érett formájában.
9. ) A 8. igénypont szerinti rekombináns rovarsejt azzal jellemezve, hogy bpodoptera frugiperda-ból származik.
10. ) Eljárás biológiailag aktív humán ideg növekedési faktor (^NGF) előállítására azzal jellemezve, hogy valamely 8. vagy 9. igénypont szerinti rekombináns sejtet tenyésztünk és a tenyészetből az említett humán pNGF-et kinyerjük.
11. ) A 10. igénypont szerinti eljárás az említett p alegység előállítására érett formájában, azzal jellemezve, hogy nem kell az említett alegységet más olyan alegységektől elválasztani, amelyek a természetes konstrukcióban egyébként jelen vannak.
12. ) A 10. vagy 11. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy az említett humán ^3NGF-et más humán eredetű termékek vagy fehérjék szennyezésétől mentesen kapjuk meg.
13·) Biológiailag aktív humán ideg növekedési faktor (ySNGF) azzal jellemezve, hogy a 10.-12. igénypontok bármelyike szerinti eljárással kapjuk, meg és mentes más humán eredetű termékektől és fehérjéktől.
14.) Gyógyászati készítmény azzal jellemezve, hogy valamely 13· igénypont szerinti, biológiailag aktív humán ideg növekedési faktort tartalmaz.
15·) A 14. igénypont szerinti gyógyászati készítmény azzal jellemezve, hogy a biológiailag aktív humán ideg növekedési faktoron kívül tartalmaz még valamely természetes gangliozidot, vagy tartalmazza ennek származékát, félszintetikus analógját, vagy mindezek valamely sóját.
16. ) A 14. vagy 15· igénypont szerinti gyógyászati készítmény azzal jellemezve, hogy parenterális, intracerebrális, orális, rektális, topikális vagy inhalációs úton adható be.
17. ) A 14.-16. igénypontok bármelyike szerinti gyógyászati készítmény azzal jellemezve, hogy az akut vagy krónikus patológiás állapotokban az idegműködés fenntartására, az idegműködés megóvására vagy az idegműködés visszanyerésére szolgál.
18. ) A 17- igénypont szerinti gyógyászati készítmény azzal jellemezve, hogy az említett patológiás állapotok akut, elősorban cerebrovaszkuláris, fertőző, gyulladásos, vérnyomásbeli vagy rn.etabolikus betegségek.
19·) A 17- igénypont szerinti gyógyászati készítmény azzal jellemezve, hogy az említett patológiás állapotok krónikus, neurodegeneratív típusúak, ide értve az akut patológiás állapotok késői • · ·· stádiumait is.
20.) A 14.-16. igénypontok bármelyike szerinti gyógyászati készítmény azzal jellemezve, hogy az idegrendszer elöregedése által okozott neuropatológiás állapotok kezelésére vagy az immunrendszerre ható betegségek kezelésére alkalmasak.