HUT55799A - Process for producing hirudine-like peptides - Google Patents

Description

Amerikai Egyesült Államok

A nemzetközi bejelentés száma: PCT/US89/00848

A nemzetközi közzététel száma: WO 90/03391

A jelen találmány olyan uj, biológiailag aktív peptldekkel foglalkozik, amelyek a hirudin antlkoaguláns aktivitásával rendelkeznek, Közelebbről, olyan peptldekkel foglalkozik, amelyek a hirudinnak a C«terminál!són lévő 26 aminosavával legalább részben homológok, Ezekre a peptidekre jellemző lehet a tirozin osoport módosítása, A jelen talál mány foglalkozik még ezen peptidek peptidomlmetikus és kova lene analógjaival, amelyek antlkoaguláns aktivitással ren delkeznek, A találmány tárgyal még olyan készítményeket, ősz szetételeket és módszereket, amelyek ezeket a peptldeket vagy analógokat terápiás, prof 1 laktikus vagy diagnosztikus célok** ra használják fel, A találmány megad egy uj módszert a pép tidben vagy polipeptldben lévő tirozin osoport szulfatálására.

Az akut érrendszeri betegségek, igy a miokardlálls infarktus, szélütés, tüdőembólia, mélyvénás trombózis, peri fériás artériás elzáródás és más vérrendszeri trombózisok az egészségre nagy veszéllyel járnak, Ezeket a betegségeket az ereknek fibrlnből álló véralvadék általi részleges vagy teljes elzáródása okozza,

A trombolltlkus betegségek jelenleg szokásos ke zelésére és megelőzésére olyan gyógyszereket alkalmazunk, amelyek két különböző ut egyike szerint hatnak, A gyógyszerek első típusa gátolja a trombin aktivitását vagy a trombtn képződését, így megelőzvén az alvadók képződését, Ezek a szerek gátolják a trombooita aktiválódást és aggregáolót is,

A gyógyszerek másik kategóriája meggyorsítja a trombolizlst, és feloldja a véralvadékot, így eltávolitva azt a véredényből, és újból lehetővé téve a vér áramlását (J,P,Cazenave és munkatársai, Agents Aotlon, 15» Suppl,, 24-49 (1964)1 ·

A heparint, amely az első osoporthoz tartozik, széleskörűen alkalmazzák olyan körülmények között, amelyekben a trombin—aktivitás a felelős a trombus képződéséért és kiterjedéséért. Bár a he parin hatásos, több nem kívánatos mellékhatása is van, beleértve a vérzéseket és a trombooitopén! át, Ez vezetett egy speolfikusabb és kevésbé toxikus antlkoaguláns kutatásához,

A hi midin természetes eredetű polipeptld, amelyet a vérszivó pióoa, a Hirudo medici na lis termel. Ez a vegyűlet, amely a pióoa nyálmirigyében képződik, a véralvadás leghatásosabb ismert természetes gátlója, A hl midin azáltal előzi meg a véralvadást, hogy erősen kötődik a trombin**11 hoz (K^*v 2 x 10 M) 1:1 arányú sztöohíometrlkus komplexet képezve |!S,R,Stone és J,Hofsteenge: Kinetios of the Inhlbltion of Thrombin by Hirudln, BLöohemlstry, 25, 4622-4620 (1966)] , Másfelől gátolja, hogy a trombin katalizálja a flbrinogénnek flbrlnné (alvadék) való átalakulását,

A hl midi nr ól az a vélemény, hogy az a trombinnak szelektív és speolfikus gátlója, és nem fejt kL gátló aktivitást más koaguláolós faktorokra, Feltételezték azonban, hogy a hirudln gátolja mind az X faktor iXa faktor általi aktiválását, mind a protrombin Xa faktor általi

aktiválását [E,W, Davis és munkatársai ”Blood Coagulatlon _t Adv, Enzymol; 48, 277-318 (1979); J,S,Rosenberg és munkatársai: “Antivátton of Humán Prothrombtn by Highly Purlfled Humán Baotors V and Xa m the Presenoe of Humán Antlthrombin“ , J,Biol. Chem.; 250, 1607-1617 (1975)1 · Újabban bebizonyították! hogy a tisztított hlrudín gyorsítja a ¹²^l-dal jelzett Xajfaktor kijutását a tenyésztett endotéllális sejtekből, és hogy a ^^T-dal jelzett hlrudín kötődik az Xa faktorhoz; valamint, hogy a tisztított hlrudín nem gátolja a kis kromogén szubsztrát, az S-2222 Xa faktor általi lehasadását [R»0· Friedberg és munkatársai: “The Role of Bndothellum in Faotor Xa Regula ti on: The Effeot of Plasma Proteinase Inhibitora and Hlrudín, Blood, 71, 1321-1328 (1988)1 ,

Azonban a hlrudín ezen vizsgálatainak egyike sem zárja ki annak lehetőségét, hogy az alkalmazott készítményekben egy Xa faktor aktivitással rendelkező fehérje szennyező anyag van esetleg jelen, Ennek megfelelően mindeddig nincs meggyőző bizonyíték arra, hogy a hlrudín vagy a hlrudlnnal rokon szerkezetű vegyületek gátolják az TXa és az Xa faktort, Az előzőekben tanulmányozott hlrudín készítményeknek egy lehetséges szennyezése az antisztazinnak megfelelő anyag lehet, egy olyan fehérje, amelyet a mexikói plóoából (Haemanteria offiolnalls) tisztítottak, és amely szelektíven gátolja az Xa faktort [G,P,Tuszynskl és munkatársai:

Isolatlon and Charaoteristics of Antlstasín, J,Biol,Chem,

262« 971θ (1987)1 , Az antlsztazín azonban eltérően a hirudlntól, gátolja az S-2222 Xa faktor általi hasadását, Ez arra utal/ hogy az Xa faktor htrudln általi gátlása más mechanizmus szerint történik, mint az Xa faktor antlsztazín általi gátlása,

A hl rúd ín és a trombin közötti kapcsolódás két lépéses folyamat. Kezdetben a hirudin a trombin molekulán egy ••alacsony” afftnttásu helyhez kötődik (Κ^^1 x 10 M), amely elkülönült az aktív helytől. Az alacsony affinltásu kötődést követően a hirudin konformációs változáson megy át, és ezután kötődik a trombin ”nagy” affinltásu helyéhez. Ez utóbbi hely megfelel a trombin aktív helyének,

A hirudin izolálása, tisztítása és kémiai összetétele a szakterületen járatosak előtt ismert [P,Walsmann és F,Markwardt: “Bloohemioal and Pharmacological Aspeots of the Thrombin Inhibitor Hirudin, Pharmazie, 36, 653*660 (1981)] , Az utóbbi időben felderítették a polipeptld teljes amlnosav-szekvenoláját is (J,Dodt és munkatársai: The Complete Covalent Structure of Hirudin: Looalizatlon of the Disulflde Bonds, Bioi,Chem· Hoppe-Seyler, 366, 379—385 (1985); S,J,T, Mao és munkatársai: Rapid Pufification and Revised Amino Terminál Sequence of Hirudin: A Specifio Ihrombin inhibitor of the Blood-Sucking Leeoh, Anal, Btochem,, 161, 514—518 (1987)/ és R,P,Harvey és munkatársat: Cloning and Expresszi on of a cDNA Codlng fór the Anti-Coagúlánt

Hlrudln from the Bloodsuoking Leech, Hirudo medioinalis'’, Proo,Natl,Aoad,Soi, USA, 83, 1084-1088 (1986)),

A hlrudln legalább két lzospeolflkus formájának, a HV—1-nek és HV-2-nek a szekvenciáját megvizsgálták, és az aminosav-szekvencíékat kis mértékben eltérőnek találták [R,P,Harvey és munkatársai, lásd fent) , A hlrudln mindkét formája egyetlen poltpeptid lánoból álló fehérje, amely 65 amlnosavat tartalmaz, és amelyben az ami no-terminális rész hidrofób aminosavakat tartalmaz, a karboxi-terminálisra pedig jellemző a poláros aminósavak jelenléte, Még pontosabban, a hlrudln mindkét formájára jellemző egy N-terminálts dómén (1-39 osoportok), amelyet három dlszulfld-hld stabilizál az 1-2, 35 és 4“6 fél-otszteinil osoportok által, valamint egy erősen savanyu C-terminális szegmentum (40-65 osoportok), Ezen kívül a hlrudln C-terminális szegmentumára jellemző a 63-as helyen lévő tlrozin osoport jelenléte, amely osoport szulfatált,

Az állatkísérletekben a pióoából nyert és tisztított hlrudln hatásosnak bizonyult a vénás trombózis, a vaszkulárls sönt elzáródása és a trombin által indukált dlsszemlnált lntravaszkuláris koaguláció kivédésében, A hlrudln továbbá csekély toxioltásu, antigénttása Időst vagy mnos, és a keringésből igen rövid idő alatt kiürül, [F,Markwardt és munkatársai: Phartnaoologloal Studles on the Anti thrombotlo Aotlon of Hlrudln in Experlmental

Animals”, Ihromb, Haemostasís, 47* 226-229 (1982)1 »

A hl midin hatásossága ellenére azonban a vizsgálatok azt mutatták, hogy a hlrudln dózistól függő mértékben meghosszabbítja a vérzés! Időt, Így a megfelelő adagok meghatározása és adása igen lényeges, A magas ár és a természetben előforduló teraék csekély rendelkezésre álló mennyisége azonban gátolja széleskörű elterjedését.

A nagyobb mennyiségű hlrudln előállítására irányuló törékvések során megkísérelték a poll peptid előállítását rekombinána DNS technikával, A természetes hlrudinban lévő O-szulfatált tlrozln csoport és az a tény, hogy a mikroorganizmusok hasonló fehérje módosulatot nem képesek termelni, a rekombináns biológiailag aktív hl midin termelésének a kilátását nagymértékben kérdésessé tették. Az a megfigyelés, hogy a deszulfato-hirudin közel olyan hatásos, mint a szulf a tál t megfelelője (4 654 302 sz, amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás) elvezetett a hlrudln E,ooliban (158,564, 168,342 és 171,024 számú nyilvánosságra hozott európai szabadalmi bejelentések) és élesztőben (200,655 számú európai szabadalmi bejelentés) való klónozásához és expressziójához, Ezen eredmények ellenére még mindig költséges a hlrudln előállítása és a kereskedő lemben nem kiterjedt a beszerezhetősége,

Az utóbbi Időben eredményeket értek el a természetes hlrudln olyan peptld-fragmentuniainak az azonosító8 aában, amelyek szintén hatásosak az alvadásl Idő csökkentésében. A hlrudlnnak egy nem-szulfatált, 21 aminosavból álló C-terminális fragmentuma, az l^-acetll-hlinidin^^g^ in vitro gátolja az alvadék képződését· Ezen kívül több más, kisebb, nem szulfátéit peptid, amelyek megfelelnek a hírudln C-terminális 11 vagy 12 aminosavának (55-65 és 54-65 csoportok) szintén hatásos in vitro az alvadék képződésének gátlásában ÍJ,L, Krstenansky és munkatársai: Anti thrombín Propertles of C-termlnus of Hlrudln Uslng Sythetlo Unsalfated N^a-aoetll-hlrudin_Zí5-65, FEBS Lett,, 211, 10-16 (1987)1 , Ezek a peptld-fragmentumok azonban nem teljesen kielégítő hatásnak a véralvadék feloldásában folyamatos kezelési mód esetében, Például az N⁰⁰-aoetll-hlrudln^^_g^-nek négy nagyságrenddel alacsonyabb a specifikus aktivitása, mint a természetes hlrudlnnak,

A flbrln alvadék képzésének a katalizélásán kívül a trombinnak még más bioreguláoiós szerepel is vannak fJ,W,Fonton, II, Uirombin Bioregulatory Funotions, Adv, Cím, Enzymol,, 6, 186-193 (1988)] , Például a trombln közvetlenül aktiválja a tromboclta aggregácíót és felszabadulási reakotót. Ez azt jelenti, hogy a trombm központi szerepet játszik az akut trombocltától függő trombózisban fS,R,Hanson és L,A, Harker: Interruptíon of Acute Platelet-Dependent Thrombosis by the Sythetlo Antithrombín D-Phenyl η1αηγ1-]>-ΡΓθ171-]>·Αχ·^ΐην1οΗ1θΓοηΐθΐΗνΏί;θΐοηθ, Proo.Natl, Aoad.Soi, USA,, 85, 318/:-3188 (1988)] ,

A trombin képes közvetlenül aktiválni egy gyulladásos reakciót a tromboolta aktiváló faktor (Platóiét Aotivating Faotor, továbbiakban PAF) endotéllális sejtek általi szintézisének a stlmulálásával [S ,M,Prescott és munkatársai : Humán Endothelial Cella m CJulture Produoe Platelet-Aotivating Faotor (1-alkyl-2—aoetyl—sn-glycero— 3~ -phosphoohollne) Tíhen Stlmulated with 'Ihrombin”, Proo,Natl, Acad.Soi, USA,, 81, 3534-3538 (1984)] , A PAF az endotéllális sejtek felületén helyezkedik el, és a neutrofil adhézió és az ezt követő degranuláoió llgandumaként szolgál [G,M. Verooletti és munkatársai, Platelet-Aottvating Faotor Prlmes Neutrophil Responses to Agonists: Role m Promoting Néutrophll-Mediated Endothelial Damage, Blood, 71, 1100-1107 (1988)],

A mechanizmus, amellyel a trombln aktiválja a trombool téka t és az endotellálls sejteket, egy receptort foglal magában és alacsonyabb koncéntráoiónál is hatékony, mint amilyen a flbrinogén hasításához szükséges fJ,T,Hármon és G.A, Járni esőn, The Glycocalcm Portion of Clyooprotein Tb Expresses Both Hlgh. and Moderato Afftmty Receptor Sites fór Ihrombinⁿ, J,Blol,Chem,, 28, 13224-13229 (1986)] , A reagensek, amelyek blokkolják a trombin aktív helyét, így a hl midin íe'f megszakítja a tromboolták és endotellálls sej- 10 tek aktiválását [C,L,Khupp, Effeot of Thrombln Inhibitora on Ihrorabín—Induoed Roleaso and Aggr ©gátion” , Thrombosls

Rés,, 49» 23-26 (1988)J , Ni nos azonban bizonyíték arra, hogy a trombln—receptor kötődésének csupán a megszakítása ele— gendő-e ennek az aktivitásnak a gátlására·

Ennek megfelelően a jelenlegi eredmények ellenére fennáll kis, szintetikus peptldek iránti igény, amelyeket az alvadék képződés, a trombln által indukált trombooita aktiválódás és az endotellálls sejt aktiválódás megnövekedett gátlása jellemez, és amelyeket kereskedelemben hozzáférhető mennyiségben lehet előállítani·

A jelen találmány a fentiekben leírt problémákat olyan peptldekkel oldja meg, amelyekre jellemző a természetes hlrudln biológiai aktivitása, Pontosabban, a Jelen találmány szerinti peptldek és analógok, valamint az ezeket tartalmazó készítmények és összetételek hatásos antlkoagulánsok, amelyek az alvadásl idő megnövekedését eredményezik, Kis adagokban ezek a peptldek gátolják a trombln által indukált trombooíta aggregáolót és trombooíta felszabadulást (továbbiakban trombooíta aktiválódás), valamint az endotells sejtekből a gyulladást keltő anyagok felszabadulását (továbbiakban endotellálls aktiválódás) anélkül, hogy szigmflkánsav megnövelnék az alvadásl időt, A peptldek viszonylag kis mérete (8 és 26 aminosav között) előnyös, mert lehetővé teszi azok szintetikus előállítását, így eze• ·

- 11 két különlegesen magas hozammal lehet előállítani, könnyen tiszti that ók összehasonlítva akár a természetes hirudtnnal, akár annak teljes hosszúságú rekombináns DNS-sel előállított megfelelőjével,

A jelen találmány szexi ntl peptidek, ellentétben a hirudlnnal, korlátozott hatást fejtenek ki az alvadást Időre, így ezen peptldek terápiás és profi laktikus alkalmazásakor kiküszöbölődik a szokásos antlkoagulánsok esetében fellépő túladagolás veszélye és esetleges végzetes következmények, A jelen találmány peptidjelnek a kis mérete csökkenti az ellentétes hatású antigén!tás lehetőségét az ezzel kezelt betegekben.

Amint az alábbiakból érthetővé válik, a jelen találmány szerinti peptldek, készítmények, összetételek és módszerek alkalmazhatók a trombln nem kívánatos hatásinak tulajdonítható érrendszeri betegségek kezelésére, megelőzésére vagy diagnózisára, valamint m vitro diagnosztikai Vizsgálatokra,

Az ábrák rövid leírása:

1, ábra: A szulfo-Tyr^jhirudln^^^^ tisztítása fordított fázisú HPLC-vel,

2, ábra: HPLC kromatogranauok, amelyek a jelen találmány szexinti szulfatálásl eljárás relatív hatásosságát mutatják be (2o) összehasonlítva a szokásos szulfatálásl eljárásokkal (2a és 2b ábrák) nagy mennyiségű peptldek reakciója esetében.

- 12 3· ábra: A szulfonil-Tyr^hirudin^..^ és a szulfo-Tyr^htrudln^^ő^ keverékének HPLC kromatográfiás eluolós profilja,

4, ábra: A hirudtn^^^ és a szulf o-Tyr^hirudin^.,.^ antlkoaguláns aktivitása különböző peptld konoentráoiék esetében,

5, ábra: A jelen találmány szerinti htrudln peptidek kovalens szerkezetét; valamint ezek antlkoaguláns aktivitását bemutató táblázat. Az ábrában az aminosavakat az alábbi egybetűs kóddal jelöltük:

Phe:	F	Leu:	L	Ile:	I	Met:
Val:	V	Ser:	S	Pro:	P	Thr:
Alá:	A	Tyr:	Y	His:	H	Gin:
Asn:	N	Lys:	K	Asp:	D	Glu:
Cys:	0	Trp:	w	Arg:	R	Gly:

különböző mennyiségeinek a trombin-időket gátló hatása,

7, ábra: A szulf o-Tyr^ghírudln^^^ különböző mennyiségeinek a hatása a marha trombin**időre és a humán trotnbln-időre,

8, ábra: A heparin, a szulf o-Tyrg ^hirudí ás a he pár ín és szulfo-Tyr^jhirudin^^^ 1:1 arányú keverékének hatásai az aktivált parciális tromboplaszttn időre,

9, ábra: A szulf o-Tyr^yilrudín^^^ m vivő antlkoaguláns aktivitása Balb/o egereken végzett dózis-hatás vizsgálatban.

10, ábra: Az X faktor XXa faktor általi aktivitásának gátlása szulf o-'iyrg^hirudin^^-őZ:’'^®'¹·*

11₉ ábra: A protrombln Xa faktor aktiválásának a szulfotörténő gátlását akrilamld gél₉

SDS-poli12a - 12o, ábrák: A jelen találmány szerinti peptidek peptidomimetlkus

-nekj és hirulog-3“Qak a szintézise,

13« ábra: A jelen találmány szerinti peptidek peptldomimetlkus analógjának, a hirulog-4-nek a szintézise.

14A és 14B, ábrák: A jelen találmány szerinti peptidek peptidomimetlkus analógjainak, a hirulog— 5-nek és hirulog—6-nak a szintézise«

15« ábra: A jelen találmány pép ti d jel peptidomimetlkus analógjának, a hirulog-7-nek a szintézise·

16, ábra: Kis dózis szulfo-Tyr^^hirudln^^.g^ hatásai a trombin által indukált tromboolta aggregáolóra és alvadá sl időre, ^7« ábra: Az Argg^hirudin^,.^ hatásai az ADP és a kollagén által indukált trombocita aggregáolóra,

A jelen találmány olyan peptidekkel foglalkozik, amelyek megfelelnek a hlrudtn karboxi-terminális aminosav-szekvenoiájának, és amelyek a természetes hirudm biológiai aktivitásával rendelkeznek. Pontosabban, a jelen találmány peptidjel homológok a természetes hlrudln karboxi— -terminális 26 amlnosavának legalább egy részével, A jelen találmány egyik megvalósítása szerint ezen peptidek szár • 4 l

- 1¼ mazékalt állítjuk elő, hogy az egyetlen tlrozm csoporthoz negatív töltéső oldallánocsoportot kapcsolunk,

A jelen találmány szerinti hírűd!n peptldek közé a következők tartoznak anélkül, hogy az oltalmi kör csak ezek re korlátozódna: lényegében a következő képletnek megfelelő aminosavszekvenciát tartalmazó peptldek:

Asn-Gly—Asp—Phe-Glu-Glu-Tie—Pro-Glu-Glu-Tyr—X, és ezek D-retro formái/ amelyekben az X-et COOH-ból, Leuból és Leu-Gln-ből álló csoportból választjuk ki, Ezen kívül a találmány szerinti hlrudin peptldek közé tartoznak olyan peptldek is, amelyekre jellemző, hogy lényegében a következő képletnek megfelelő aminosav-szekvenolát tartalmazó peptldek: Y— Phe-Glu—Glu—Ιχθ—Pro-Glu—Glu-Tyr-Z és ezek D—retro formál; amelyekben az Y-t NH^-ből, amino-védőosoportból, a következő aminosav-szekvenciának legalább a C-terminális részéből: Val-Uir—Gly-Glu—Gly—lhr-Pro—Lys—Pro—Gin-Ser—Hí s-Asn—Asp-Gly— -*Asp és a következő aminosav-szekvenolának legalább a C- terminális részéből: Val-Thr-Gly-Glu-Gly-lhr- Pro-Asn-Pro-Glu-Ser-His-Asn—Asn-Gly-Asp álló csoportból választjuk ki, a Z-t COOH-ból, Leu-ból és Leu-Gln-ből álló csoportból válasz juk ki, és a tirozin csoportra jellemző egy negatív töltésű csoport, amelyet szulfátból, foszfátból, karboxilátból, szulfonátból, foszfonátból, karbonátból, metil-szulfonát— ból, metll-foszfonátból és ezek variánsaiból álló csoportból választjuk ki· A jelen találmány egyik megvalósítása ·««* ·· • · · a · szerint ezen peptidek közé olyanok tartoznak, amelyekben Y jelentése Asn-Gly-Asp, Z jelentése Leu és a tlrozln osoport szulfát ált, Ezen kívül a jelen találmány peptldjelre jellemző lehet az ami no-terminális aminosavon egy N-aoetll osoport jelenléte,

A jelen találmány szerinti peptidek előállítása a szakterületen Ismert számos eljárással elvégezhető, Például a peptldet az ép hlrudln molekulából lehet származtatni speolflkus endopeptldázok exopeptldázokkal való kombinációjával végzett proteollzisével, Edman lebontással vagy mindkettővel, Az ép hlrudln molekula természetes forrásából, a H,medlolnállsb61 tisztítható szokásos módszerekkel, Más megoldásként a hlrudln előállítható ismert rekombináns DNS technikákkal oDNS-eket használva (H,P,HarVey és munkatársat: Proo,Natl,Aoad,Soi, USA,, 83, 1084-1088 (1986); J.Dodt és munkatársat: Expresslon Seoretton and Prooesslng of Hlrudln in E,tíoll Using the Alkalma Phosphatase Signal Sequenoe” BEBS Lett,, 202, 373-377 (1986)1 vagy egy kémiatalag szintetizált génnel [C,Bergmann és munkatársai: Chemloal Synthesls and Expression of a Gene Coding fór Hlrudln, the Thrombln-Speoifio Inhibitor from the Leech, Hl rúd o medlolnalls” ,Biol,Chem, Hoppe-Seyler, 367, 731-740 (1986)1 , Előnyösen, ha közvetlenül a jelen találmány szerinti peptldeket állítjuk elő, így kiküszöbölve a kiindulást anyagként szolgáló teljes hlrudln molekula szüksé*··· ee «· i • « · · · · ··· ·· « · · • ♦ · * « · ··· ·4 ·* ···

-16 gesBégét. Ez megoldható jól ismert rekombináns technikákkal, amelyekben csak a kívánt pepiidet kódoló DNS szekvenciákat fejezzük ki a transzformált gazdasejtben·

Más megoldásként a jelen találmány szerinti peptid ek előáll!thatók szokásos kémiai szintetikus módszerekkel is, A találmány előnyös megvalósítási módja szerint a hirudm peptldeket folyadék-fázisban lehet szintetizálni vagy szilárd fázisú peptid szintézissel lehet előállítani, és adott esetben emészteni lehet karboxipepiidázzal (a C-terminális aminósavak eltávolítására) vagy Edman lebontással lehet manuálisan lebontani (az N-terminális aminósavak eltávolítására), Az ezen az utón előállított peptldek ezután a szakterületen széleskörűen ismert elválasztási technikákkal tisztíthatok. Előnyösen lehet alkalmazni például fordított fázisú HPLC-t, Az oldatban végzett szintézis előnyösen lehetővé teszi az aminósav származékok közvetlen hozzáadását a peptidlánc növelése során. Ez elkerülhetővé teszi a következő derlvatlzáolós lépést a jelen találmány peptldjel tirozm csoportjának a módosítására,

A találmány leírásában és az igénypontokban az aminósavak és csoportjaik rövidítései megfelelnek az általánosan alkalmazott nomenklatúra szabályainak, és az oc-amlnosavakra és azok íz-sorozathoz tartozó csoportjaira Vonatkoznak, A jelen találmány vonatkozik azonban az itt leírt peptldek D-retro formáira is. Ezeket úgy állítjuk elő,

•·· • · •· •· ····· hogy a szintézishez ellentétes orientációjú D-aminosavakat használunk a szintézist a karboxi-terminális Ir-antí.nosavval kezdve,

A találmány szerinti hirudin peptldek származékainak az előállítása magába foglalja az egyetlen tlrozin csoportnak akár a szabad fenolos hidroxiljára, akár a benzol 1 meta-szénatomjára negatív töltésű csoport kapcsolását, A származék előállítása magába foglalhatja különböző negatív töltésű csoportok kapcsolását, amelyek a szakterületen ismertek, A származékok előállításának a módszerei a következők lehetnek, de nem korlátozódnak ezekre: a tlrozln benzol 1 méta-szénatomon szulfonálása, me ti 1-szulf onálása, foszfort lálása, meti1-foszfonálása és karboxilezése, Ezen reakciók végrehajtásának a módszerei szintén jól ismertek a szakterületen,

Még előnyösebb, ha a jelen találmány szerinti peptldek szulfátéit származékait állítjuk elő, A jelen találmány szerinti egyik előnyös peptid a szulfo-Tyr^^hirudln^^^ (az indexben irt számok a természetes hirudin molekulában lévő aminosav helyeket jelentik), egy 12 aatnosavból álló peptid, amely egy szulfátéit tlrozln csoportot tartalmaz, és amely homológ a természetes hirudin 53-64 csoportjaival, Egy másik előnyös peptid, a szulfontl-iyr^jhirudin^^g^» amely egy szulfónált tlrozln csoportot tartalmaz, Ez a szulfónéit peptid hosszabb biológiai felezési idővel rendel18 kezlk, mint annak szulfátéit megfelelője.

A jelen találmány szerinti hlrudln peptidek szulfatálása végezhető akár biológiai (enzimes), akár kémiai módszerrel, A jelen találmány egyik előnyős megvalósítása szerint a jelen találmány szerinti egyik tisztított peptidet egyidejűleg reagáltatj-uk dioíklohexil-karbodiImiddel és kénsavval egy szerves oldószerben. Ezen szulfatálási eljárásban mellékreakoíóként a méta-szénatom szulfatálása is vég** bemegy,

Nagyobb léptékű szulfatálás esetében a szulfatálási eljárást olymódon módosítottuk, hogy a peptid grammos mennyiségeit először feloldottuk egy szerves oldószerben, előnyösen dlraetil-f ormamidban, ezután dehldratáló szerrel reagáltattuk, előnyösen dioiklohexil-karbodiimlddel, A peptid dehidratált tlrozln csoportját ezután szulfatáltuk kénsavas reakcióval, A reakció az oldhatatlan dloiklohexl 1-karbamid-só képződésével válik teljessé. Ennek a módosításnak az eredményeképpen magas hozammal kaptuk a szulfátéit peptidet a nagyobb léptékű eljárás során. Ez az uj szulfatálási technika alkalmazható bármely peptid vagy pollpeptid tlrozln csoportjainak a szulfátálására, akár izoláltak és tisztítottak azok, akár nyers készítményben vannak, Bármelyik szulfatálási reakciót követően a szulfátéit peptidet el lehet különíteni a szulfonált peptidek bármelyikétől, valamint az el nem reagált peptidekből HPLC-vel, DEAE-kro19 matografálással vagy bármelyik más szokásos elválasztási technikával,

A szulfatálás elvégezhető egy jelen találmány szerinti pepiidet kéntrioxtd-trletanolamin sóval plridinben reagáltatva, E_zen kívül alkalmazható egy tlrozil^szulfotranszferáz aktivitású enzim is, akár nyers készítményként, akár tiszta enzimként a tlrozln szulfatálására [R.W.H.Lee és W,B,Huttner: “Tyrosine 0 Sulfated Proteins of PC-12 Pheo Chromo Fytoma Cella and Thelr Sulfation by a Tyrosyl Protein Sulfotransferase , J,Bt ol,Chera,, 258, 11326-1133¾ (1983 )] , A jelen találmány szerinti hirudin peptidek foszforilálása vagy karboxilálása elvégezhető a fentiekben a szulf a tálásnál leirt reakcióhoz hasonló módon a kénsav helyett foszforsavat, illetve hangyasavat használva, Ezekben a reakciókban foszfonálás és karbonílezés is fellép mellékreakcióként· Más megoldásként enzlmatikus módszerek is alkalmazhatók a jelen találmány szerinti hirudin peptidek karboxtlezésére vagy foszfőrilálására·

A találmány szerinti hirudin peptidek metil-szulf onálását és metll-foszfonálását a szakterületen ismert módszerekkel lehet elvégezni, beleértve, déjsemmiképpen sem korlátozóan a klór-szulfonsavval vagy klór-foszfonsavval való alkilezést,

A szulfatálás! reakció mértékének a követése spektrofotometriásán végezhető, A szulfátéit peptid abszorpciós spektrisnában a maximális abszorpció eltolódik

275 nem-ről körülbelül 250-265 nm-re, A származék keletkezését úgy lehet bizonyítani, hogy a pepiidet 30 %-os trifluor—ecetsavval 60°C-on 30 percig deszulfatáljuk, Ez azt eredményezi, hogy a maxi rááll s abszorpció visszatolódik 275 nm-re.

A jelen találmány egy másik megvalósítása szerint a hirudin peptidek származékait úgy is előállíthatjuk, hogy azok ami no-terminálisához egy N-aoetil osoporot kapcsolunk, Az N-acetllezés megvalósítható bármely, a szakterületen jártasak által ismert technikával. Az aoetilezés előnyösen végrehajtható N-aoetll-amlnosav származékot alkalmazva a jelen találmány szerinti peptid szintézisnél. Más megoldásként az N-aoetllezés elérhető a peptid eoetsavanhldriddel való reakciójával, A találmány szerinti N-aoetllezett hirudin peptidek megnövekedett biosta bilit ást mutatnak a nekik megfelelő nem-aoetllezett pepiidhez viszonyítva,

A jelen találmány szerinti hirudin peptidek antikoaguláns aktivitását bármelyik szokásos technikával lehet vizsgálni. Előnyösen közvetlenül mérhetjük a peptid trombln gátló aktivitását. Ezek a vizsgálatok kolorlmetriás szubsztrátok trombln által katalizált hasadásának a gátlását mérik, vagy még előnyösebben az aktivált parciális trornboplasztm idők (Aottvated Parttal Thromboplastlne Time, továbbiakban APTT) és a trombln idő (ihrombin Times, továbbiakban TT) növekedését mérik, Az utóbbi vizsgálatban a véralvadás ⁿintrinsic^u (belső) faktorait mérjük. Egy másik megoldás szerint az alkalmazott vizsgálat tisztított trombtni és fibrlnogént használ, és az A és B flbrlnopeptldek felszabadulásának a gátlását mén radloimmuiivizsgálattal vagy ELISA—val,

A jelen találmány szenntl peptldek antlkoaguláns képessége részben az in vivő felezési idejüktől függ, Ennek megfelelően a jelen találmány vonatkozik olyan gyógyászati készítményekre is/ amelyek a hlrudln peptideket akár kovalensen, akár nem-kovalensen gyógyászatilag megfelelő polimerekhez kapcsoltan tartalmazzák, és ezáltal megnövelik ezen peptldek biológiai felezési Idejét, Például a jelen találmány szenntl ilyen hlrudln pepiidet kapcsolni lehet egy aktivált polletllén-gllkol (PEG) származékhoz szokásos technikákat alkalmazva, Előnyösen egy PEG-N-szukolntmldll-szukcinátot kapcsolunk egy peptid α-amtno-részéhez, Ez a kapcsolás a pepiidnek a PEG-N-szukclnlmldll-szukolnát reagenssel (SS-PEG) egy szerves oldószerben vagy egy 7-nél magasabb pH-ju pufferolt oldatban való reakciójával megy végbe, Még előnyösebb, ha közelítőleg 50-szeres moláris feleslegben lévő SS—PEG (átlagos molekulasúly a $000 Dalton) reagál egy pepiiddel 20 mM nátrium borát puff erben 9,0 pH-nál,

A jelen találmány szerinti hlrudln peptldek alkalmazhatók önmagukban vagy készítményekben, összetételekben és módszerekben a vérrendszerben lévő trombózisnak tulajdonítható érrendszeri betegségek kezelésére és megelőzésére, Például a jelen találmány szerinti peptldek, az azokat tartalmazó készítmények ás összetételek alkalmazhatók a heparin helyettesítésére profilaktikus célokra, heparin helyettesitésére a trombooitopénia kezelésében, dlsszemlnált intravaszkuláris koaguláció kezelésére és érben lévő trombusók kezelésére, amelyek bármilyen betegségtől származhatnak· A jelen találmány szerinti hírudin peptldek, valamint az ezeket tartalmazó készítmények és összetételek alkalmazhatók érrendszeri betegségek kezelésére vagy megelőzésére betegekben/ beleértve emlősöket, különösen embert.

Más megoldásként a jelen találmány szerinti hírudln peptldeket heparinnal vagy kis molekula tömegű, heparinnal kombinálva is lehet alkalmazni. Az ilyen kombinációk esetében előnyösen kisebb dózis heparin vagy kis molekulatömegü heparin szükséges a kívánt antlkoaguláns hatáshoz, mint bármelyik Vegyületet külön alkalmazva, Továbbá ezek a kombinációk előnyösen csökkentik a lehetséges vérzéses komplikációkat, amelyek gyakran társulnak a heparin alkalmazásához· Ezek a kombi náci ók meglepő módon nagyobb antlkoaguláns aktivitással rendelkeznek, mint az egyes komponensek monoterápiája alapján várható lenne, Az itt használt értelemben kombináció kifejezés egy olyan egyszeri adagolási formát jelent, amely legalább egy jelen találmány szerinti peptidet és heparlnt vagy kis molekulatömegü heparlnt tartalmaz egy többszörös kiszerelési formában, amikoris a két szert külön adjuk, de egymás mellett, vagy egy többszörös adagolási formában, amikor a két szert külön,de egymást követően adjuk.

A jelen találmány szerinti hírudin peptldek szokásos módszerekkel formázhatók gyógyászatilag megfelelő készítmények és kombinációk előállítása céljából, Ezek a készítmények előnyösen legalább egy gyógyászatilag megfelelő vivőanyagot is tartalmaznak, Lásd Remlngton's Phamnacau ti cal Scienoes (E,W,Martin) , A jelen találmány szerinti gyógyszerkészítmények a hírudin peptldek mellett egy gyógyászatilag megfelelő puffért, előnyösen fosfáttal pufferőit sóoldatot, egy gyógyászatilag megfelelő, az izotónlás nyomást beállító vegyületet, így nátrlum-klorldot, manmtot, vagy szorbttot tartalmaznak, A jelen találmány szerinti készítmények a fenti vegyületeken kívül még tartalmaznak egy kis adag heparint vagy kis molekulatömegü heparínt is, előnyösen körülbelül 25OO-5OOO egységnél kevesebbet.

Különböző adagolási formák alkalmazhatók a jelen találmány szerinti hírudin peptldeket tartalmazó készítmények és összetételek adására. Ezek közé tartoznak - de nem korlátozódnak csupán ezekre - párontorális beadás, a szájon át való beadás és a helyi alkalmazás. Az adagolás és az adag mértéke különböző faktoroktól függ, Így a specifikus kombinációtól, a kezelés céljától, azaz attól, hogy terápiáról vagy megelőzésről van szó, és a kezelő orvos megítélésétől.

Az injekciós készítmények lehetnek llofilizált vagy oldat formájában, A helyi alkalmazásra szolgáló ké- 24 szitmények például lehetnek vizes gélek, olajos szuszpenziók vagy emulgeált kenőcsök. Az előállított kiszerelések a hlrudln peptldek olyan mennyiségét tartalmazzák, amely hatásos a véralvadás megelőzésére vagy csökkentésére,

Injekciós alkalmazás esetében a találmány peptid jelnek a terápiás mennyisége normálisan napi 0,2-től 75 mg/testtömeg-kg adagok között van, előnyösen közelítőleg 0,5-től 10 mg/testtömeg-kg között, A hatásos adagok médiatár ozásának a módszerei ismertek a szakemberek számára. Azonban ezek az adagok közelítőleg azonosak vagy kevesebbek, mint a más trombolítikus szerek esetében alkalmazottak, azaz közelítőleg 3,5 mg/testtömeg-kg adagok, majd ezt követően a fenntartó adag 7 mg/óra l,v, közelítőleg 7-10 napon keresztül, Minthogy a jelen találmány szerinti hlrudln peptldek PEG-származékai hosszabb felezési idejűek a természetes hlrudinhoz képest, ezek adagjainak nagysága előnyösen alacsonyabb, mint a fent leírt* de nem-derivatízált peptldek esetében,

A jelen találmány szerinti készítmények és összetételek más komponenseket is tartalmazhatnak, amelyek hatásosak a fibrinolltikus terápiában. Ezek tartalmazhatnak - de semmiképpen sem korlát ozóan szöveti plazminogén aktivá tort, urokinázt és egtreptokinázt, Ezek a vegyületek különálló komponensként lehetnek jelen a találmány szerinti hl rúd m pepiidet tartalmazó készítményekben, M£s megoldásként a hl- 25 rudln peptldeket konjugálnl lehet az ilyen fi brlnoli tikus szerekkel, A konjugációt a szakterületen ismert bármely módszerrel el lehet végezni, A hirudin peptidek és fi brlnoli— tikus szerek egyetlen molekulaként is jelen lehetnek; azaz fúziós fehérje formájában, amelyet rekombináns DNS technikákkal vagy in vttro szintézissel lehet előállítani,

A jelen találmány a hirudin peptldeket tartalmazó készítmények tumor metasztázlsok kezelésére szolgáló módszerekkel is foglalkozik, A jelen találmány szerinti hirudin peptldeknak az áttétek növekedésének a gátlásán keresztüli hatásossága a tumor metasztázlsok kezelésében azon alapszik, hogy bizonyos ráksejtekben egy prokoaguláló enzim van jelen £l,Ealanga és S,G, Gordon: Tsolatlon and Charaoterlzation of Cancer Procoagulant: A Cystetne Proteinase from Malignant TLssue”, Biochenüstry, 2fr, 5558-5567 (1985); S,G,Gordon és munkatársai: Cystelne Proteinase Procoagulant from Amnlon— -Chorion”, Blood, 66, 1261-1265 (1985); és A,Ealanga és munkatársai: ⁿA New Procoagulant m Aoute Leukémia”, Blood, 71* 870-875 (1988)] , Ez az enzim aktiválja az X faktor átalakulását Xa faktorrá a koaguláció3 kaszkádban, ez a fibrin lerakódását eredményezi, amely viszont a tumor növekedés s zubs z t rá t jaként szolgál, Ezért az Xa faktor,a trombin vagy mindkettő gátlásával gátolva a fibrin lerakódását a jelen találmány szerinti hirudin peptidek hatásos antl-metasztatikus tumor elleni szerekként hatnak, A jelen ta26 lálmány szerinti peptidekkel kezelhető áttételes daganatokra példák, de nem korlátozó példák az agy karolnóma, máj kard nóma, tüdő kardnóma, csont kard nóma és neoplasztíkus plazma sejt karoínóma,

A jelen találmány olyan módszerekkel és készítményekkel is foglalkozik, amelyek a találmány szerinti peptldek és analógjaik kis adagjait alkalmazzák a trombin által indukált tromboctta aktiválódás és a trombin által indukált endotellálls sejt aktiválódás gátlására. Az endotell— álls sejt aktiválódás gátlása a Jelen találmány szerinti módszerekkel és készítményekkel ezen sejteknek a trombodta aktiváló faktor (Piatelet Aotivatlng Eaotor, továbbiakban PAF) szintézisének a repressziójából áll, A gátlás ezen mechanizmusának fontos alkalmazása lehetséges ezen betegségek kezelésében, amelyekre a trombin által indukált gyulladás jellemző, és amelyekről feltételezett, hogy a PAF közvetíti· A jelen találmány olyan készitn ényekkel is foglalkozik, amelyek a jelen találmány szerinti peptldek és analógjaik kis adagjait tartalmazzák, és az ezeket tartalmazó készítményekkel olyan betegek kezelése lehetséges, akik trombin által indukált gyulladásban szenvednek. Ezen betegségek közé tartoznak, de nem korlátozódnak csak ezekre, a felnőttkori légzési elégtelenség! tünet, a szeptikus sokk, a szeptikémia és a reperfuziós károsodás,

A hlrudín peptldek kis adagjának az alkalmazása • ·

- 27 meglepő és nem várt módon lehetővé teszi a fent leirt gátló hatások elérését a kezelt betegben úgy, hogy az antl— koaguláns hatás minimális· Ennek megfelelően a hlrudln peptldek kis adagjainak az alkalmazása előnyös olyan körülmények között, amikor a trombooiták és endotellálls sejtek aktiválódásának a gátlása vagy a trombln által indukált gyulladással jellemzett betegségek kezelése kívánatos anélkül, hogy ezzel együtt antlkoaguláns hatásokat fejtsen ki,

A jelen találmány szerinti előnyös készítmények a trombooíta és endotellális sejt aktiválás gátlására közelítőleg 0,0001 mg/testtömeg-kg és közelítőleg 0,099 mg/ /testtömeg—kg adagokat tartalmaznak. Még előnyösebben, ezek a készítmények közelítőleg 0,001 mg/testtömeg-kg és közelítőleg 0,05 mg/testtömeg-kg közötti adagokat tartalmaznak,

A jelen találmány foglalkozik a szervezeten kívüli vér hlrúdin peptldekkel vagy ezeket tartalmazó készítményekkel való antlkoaguláns kezelésével. Az itt használt értelemben a szervezeten kívüli vér kifejezés olyan vért jelent, amelyet a betegből közvetlenül levesznek, majd a betegbe visszajuttatják dialízis eljárással vagy vér-szűréssel vagy műtét során bypass-szal, A kifejezés vonatkozik olyan vérkészítményekre is, amelyeket szervezeten kívül tárolnak a betegnek való esetleges beadás céljából, Ezek a termékek teljes vért, plazmát vagy valamilyen olyan vér-frakciót tartalmaznak, amelyekben kívánatos az alvadás

- 28 gátlása· Ezek a készítmények hasonlóak a fent leírt injekciós készítményekhez, Az ilyen tipusu készítményekben az aktív peptid mennyisége vagy koncentrációja a kezelendő vér térfogatától, még előnyösebben annak trornbm-tartalmától függ,

A jelen találmány foglalkozik még a hlrudln peptidek vagy az azokat tartalmazó készítmények bioanalitikai alkalmazásával, amelynek célja az IXa faktor, Xa faktor, trombin vagy ezek keveréke koncentrációjának a meghatározása biológiai mintában, Ezeket a peptldeket és készítményeket ugyanolyan módon lehet használni, mint a szokásos vizsgálatokban alkalmazott reagenseket. Ezen kívül a jelen találmány szerinti peptldeket alkalmazni lehet a jelenleg rendelkezésre álló módszerekben és vizsgálati készletekben (klt-ekben), amelyek az TXa faktor, Xa fektor, trombln vagy ezek keverékének a kimutatására szolgálnak,

A jelen találmány szerinti peptldeket továbbá fel lehet használni a t rom bús ex vivő megállapítására emberekben és más emlősökben, A találmány egyik megvalósítási módja szerint a hlrudln peptldeket rádióizotóppal radloaktivan jelezzük, A rádióizotóp kiválasztása jól ismert tényezők alapján történik, például a toxidtás, biológiai felezési idő és a kimutathat óság, Előnyös rádiói zotópoknak ff 40 O számítanak - de nem korlátozódnak ezekre - a -’i,

111 és a Ih, A peptidek jelzésének a technikái a szakterű• · · * * • · 4 · · létén jól ismertek, Legelőnyösebb a rádiói zotóp, a jelzés elvégezhető J-Bolton-Hunter reagenssel, A jelzett peptldet a betegnek beadjuk, előnyösen intravénásán, várakozással lehetővé tesszük, hogy az a fibrin alvadókban lévő trombinhoz kötődjön, ezután megfigyeljük az alvadékot jól ismert detektáló eszközökkel, mint például egy kamerával, amely képes detektálni a radioaktivitást és amely egy komputer képalkotó rendszerhez kapcsolt. Ez a technika képet alkot a trombooitóhoz kötött trombinról és meizotromblnról is«

Ez a találmány foglalkozik még az itt leírt hirudln peptidek peptldomlmetlkus analógjaival is* A peptídomimetlkus analógok utánozzák a peptidben lévő aktív hely háromdimenziós szerkezetét, Azt gondoljuk, hogy ezek az analógok hasonló aktivitással rendelkeznek, mint peptid megfelelőik, A jelen találmány egyik megvalósítása szerint a hirudln peptidek analógjai lehetnek szeml-peptid vagy nem-peptld természetűek, Ezen peptldomlmetlkus analógok előnye, hogy nagyobb a felezési idejük és a biostabilitásuk az eredeti vegyülethez viszonyítva. Továbbá a jelen találmány szerinti peptldomlmetlkus analógok biológiai megfelelősége nagyobb lehet, mint a megfelelő peptldeké, ha azokat szájon át vagy helyileg alkalmazzuk. Továbbá ezek az analógok megnövekedett antlkoaguláns aktivitással rendelkezhetnek,

A jelen találmány foglalkozik a találmány szerinti

hlrudln. peptldek olyan analógjaival, amelyek kovalens kötést képesek létrehozni a tromblnnal· Az egyik megvalósítást mód szerint ezekre az analógokra jellemző a peptldek ami no—terminálisához kapcsolt dini tro-fem 1-os oport jelenléte· Egy másik megvalósítás szerint ezekre az analógokra jellemző a tirozln vagy a tirozln származék, valamint bármely más karboxi-termlnálls osoport helyettesítése mtro-amzollal, Az analógok mindkét csoportja rendelkezik azzal a képességgel, hogy kovalens köt és-képezzen a tromblnnal, és ezért nagyobb az affinitásuk ehhez a molekulához· Ennek a nagyobb af fim tásnak az eredményeképpen ezek a hlrudln peptid analógok lényegében hatásosabbak, mint a jelen találmány szerinti más hlrudln peptldek, amelyek a trombitához ionos kölcsönhatással kötődnek.

Lényeges, hogy a jelen találmány szerinti peptldomlmetlkus és kovalens analógokra jellemző azok biológiai aktivitása, amely hasonló az itt leírt hlrudln peptldekéhez, en

Ennek megfelelő/ezeket az analógokat készítményekben, összetételekben és módszerekben lehet alkalmazni a találmány szerinti peptldekhez hasonló módon diagnózisra, kezelésre és megelőzésre,

A találmány foglalkozik olyan hlrudln peptidek-

amelyek azonosak a fent leírt peptidekkel, kivéve,

hogy ezekre jellemzi, hogy az Asp^ vagy Asn^ egy arginlnnel szekvenciát tartalmaznak, amely kötődik és gátolja a t rom boci ta felületén léőv glikoprotein Hb/lIIa-t. Ezek a peptldek meglepő és nem várt módon gátló aktivitással rendelkeznek bármely anyag által kiváltott trombooíta aktiválódással, valamint antigoaguláns aktivitással szemben· Továbbá az Arg-Gly-Asp szökvenőia arra szolgál,hogy ezeket a peptideket a trombooltákban gazdag alvadék helyére irányítsa, Mihelyt a peptldek elérik ezt a cél-helyet, gátolják a további trombooíta aggregációt és a flbrin keletkezését. Ez a hatás megakadályozza a véralvadók kiterjedését, és hatása eredményeként megnövekszik az alvadék feloldódása, Ezeket az uj peptideket alkalmazni lehet olyan készítményekben és módszerekben, amelyek célja az alvadásl idő meghosszabbítása és a tromboolták aktiválódásának a gátlása.

A jelen találmány egy másik megvalósításának megfelelően egy peptid, vagy a hirudin peptldek bármelyikének vagy analógjának a kombinációja alkalmazható készítményekben és módszerekben, amelyek egy betegbe bevitt eszköz bevonására szolgálnak. Ezek a készítmények és módszerek eredményeképpen csökken a trombotlkus komplikációk veszélye az ezt az eszközt kapó betegekben, A jelen találmány szerint módszerekkel és készítményekkel bevont felületek lehetnek például proteázisok, mesterséges billentyűk, beépített erek, tamponok és katéterek, Ezen felületek bevonásának a módszerei a szakterületen Ismertek, Ez lehet a hirudin pép- 32 ~ /

tld vagy analóg tartalmú összetétel kémiai keresztkötése vagy fizikai adszorboiója az eszköz felületéhez,

A. jelen találmány még teljesebb megértése céljából a következő példákat adjuk meg, Ezek a példák úgy értendők, hogy csak a bemutatás célját szolgálják, és semmi módon sem korlátozzák a jelen találmány oltalmi körét.

Az alábbiakban leírt peptid szintézisek minden példájában elvégeztük a szintetizált peptidek amlnosan analízisét, Az aminosav hídrolizátumokat úgy készítettük, hogy a mintákat ón sósav oldatban, vákuumban, 110°C-on 24 órán át kezeltük, ezt követően Beokman System 6300 analizátorral ioncserélő kromatográfiának vetettük alá,

A szintetikus peptidek tisztaságát rutinszerűen analizáltuk fordított fázisú HPIXJ-vel, Ha másként nem jelöljük, a peptid mintákat (20-100 yug) Vydao 0^ oszlopra (0,46 x 25 cm) vagy egy Aquapore RP-300 Οθ oszlopra (0,46 x 3,0 00) Vittük fel, és Beokman Hquld Choromatographlo System-et,Illetve egy Applled Blosystem 150A Chromatographyo System-et alkalmaztunk, A Vydao oszlopot 0,1% trifluor—ecetsavat (trifluoracetlo add, továbbiakban TEA) tartalmazó vízzel egyensúlyoztuk ki, és a kifejlesztést O-tól 80 %-lg gradiensen növekvő aoetonitrll koncentrációjú fenti TFA tartalmú oldattal végeztük, A gradienst 30 perc alatt fejlesztettük ki, és az átfolyási sebesség 1,0 ml/pero volt, Az átfolyt oldat abszorpcióját

- 33 215 nm-nél mértük folyamatosan, Az Aquapore Cg oszlopot 0,1% TFA tartalmú vízzel egyensúlyoztuk ki, és a kifejlesztést O-tól 70 Le gradiensen növekvő aoetonLtrll koncentrációjú 0,085 % TFA tartalmú vízzel végeztük, A gradienst 45 perc alatt fejlesztettük ki, és az átfolyási sebesség 0,5 ml/pero volt, Az átfolyt lé abszorpcióját 214 nm-nél mértük folyamatosan.

1, példa

A hirudln^3.5^ és a hirudin^^^ szintézise

A hirudin^^g^ képlete a következő:

HgN-AsnrGly-Asp-Phe-Glu-Glwlle-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-COOH,

A hirudin^^^^ képlete a következő:

Hg N-Glu-S er-Hí s-As n-As n-Gly-As ρ-Phe-Glu-Glu-Tle-Pfc· o-GluGlu-Tyr-Leu-COOH, Ezeket a peptideket szllárdfázlsu peptidszintézlssel egy egyszeri szintézis részeként állítottuk elő Applied Biosystems 430 A Péptide Synthetizer (Applied Biosystems, Fostér City, CA) segítségével,

Részletezve, 0,259 mekv Boo-Leu-O-gyantát (1 % dlvin±l~benzol gyanta, továbbiakban DVB) reagáltatunk egymást követően 2 mmól-nyi védett aminosav-mennyiségekkel, A szintézis 11, ciklusát követően 0,42 g nedves gyantát kiveszünk a reakd óedényből, A visszamaradó nedves gyantának a 0,43 g-os részét két alkalommal reagáltatjuk 2 mmól védett aminosav mennyiségekkel 4 cikluson keresztül. Az »4·4 ·· • · · * » · ·«» ·· * · » ♦ » · · · • *♦ · « »· * · ·

- 34 igy szintetizált hirudin^^.^ ^{hixnd iD}Z,9-64 védőcsoportjait teljesen eltávolítjuk viaaentes HF:p-krezol:etil-metil-szulfát (10:1:1 t/t/t) eleggyel kezelve· A peptid-hozam 56 %, illetve 53 % volt a hirudin^p..^, illetve hirudin^y6k esetében,

A peptidek egyedi HPLC analízise azt mutatja, hogy azok tisztasága nagyfokú, és egyetlen fő, 214 mn-nél abszorbeáló csúcs eluálódlk 16, 1 percnél, Illetve 16,3 peronéi a hlrudln^^-64, ¹¹¹®^tv® ^{a hlrudin}53~64 ®^s®'^l:ében, 2, példa

Dez(iyr“Leu)hlrudin^2„^2 ^szihtézlse

A dez(iyr“Leu)hirudln^2«g2 képlete a következő: HgN-Asn-Giy-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-COOH, A dez(Tyr-Leu)-hírűd!^a következő módon állítjuk elő:

Először karboxlpeptldáz A-t állítottunk elő lényegében az R,P, Ambler által leírt módon (Enzymatio Hydrolysls wlt Carboxypeptldases, Methods Enzymol·, 25, part B, 143-154)· Az enzimet (1,0 mg) 1,0 ml ionmentes vízben felszuszpendáljuk 4°C-on, és mlkrooentrifuga berendezésben lecentrifugáljuk· A felíiluszót eldobjuk, és a csapadékhoz 100 /ul 1 t%-os nátrium-hidrogén-karbonát-oldatot adunk. Ezután oseppenként 0, 1n nátrlum-hidroxid-oldatot adunk hozzá mindaddig, míg a csapadék fel nem oldódik, Ezután a pH-t 8,0-ra állítjuk 0, 1n sósavoldat cseppenkéntl

adagolásával· Az enzim koncentrációját 1 mg/ml-re állítjuk 0,1 mólos N-mettl-morfoltn-acetát (pH=8,25) hozzáadásával,

Az 1, példában leírt módon előállított 1,3 mg

hozzá, és két órán át 37°Con inkubáljuk,

A peptid fragmentumokat fordított fázisú HPLC-Vel tisztítjuk Aquapore RP-300 Cg oszlopon (0,46 x 3,0 cm) és egy Applled Blosystems 150 A folyadékkromatográfiás rendszer segítségével· Az oszlopot 0,1 t% TFA tartalmú vízzel egyensúlyozzuk ki, és a kifejlesztést O-tól 35 %~ig gradiensen növekvő aoetonltrll koncentrációjú 0,085 t% TFA tartalmú vízzel végezzük, a gradienst 45 pero alatt fejlesztjük ki, az átfolyási sebesség 0,5 ml/pero· Az átfolyó oldat abszorpcióját 214 nm-nél mérjük folyamatosan, A frakciókat manuálisan gyűjtjük, vákuumban megszárltjuk, és analizáljuk ami nosav-ös szét été lüket és humán plazmában az alva— dásl időre kifejtett hatásukat. Megállapítjuk, hogy a dez(Tyr-Leu)hlrudln^2-.g2 ^a Visszamaradó ép hírudin^ eluálódlk,

3, példa

A hirudlngy_wg^ szintézise

• ••· 4· ··« • · · 4 ·· ··· ·· · ·9 • · * ·· · ··· ·· ·· ·»»

HgN-Glu-Glu—Tle—Phe—Glu-Glu—Tyr—Leu-COOH, A hirudin^..^ szintézisekor az 1« példában leírt eljárást követjük, kivéve, hogy 0,55 nnnól Boo-Leu-OCHgPAM gyantát (1 % DVB) alkalmazunk (Applled Biosystems) a Boc-Leu-O-gyanta (1 % DVB) helyett. Ezután 2 mmól-nyl védett aminosavakat adunk a kapcsolás minden ciklusában, A nyers peptid hozama 17 »9 A HPLC analízis szerint egyetlen fó osucs eluálódlk 14,2 pero után a gradiensben,

4« példa

A hlrudin^^^^ szintézise

A hlrudln^képlete a következő: H^N-Thr-Pro—Asn-Pro-Glu-Ser—Hls—Asn-Asn—Gly-Asp-Phe-Glu—Glu-Ile—Pro-Glu— -Glu-Tyr—Leu-COOH, A hlrudtn^^g^-et 0,259 mekv Boc-Leu-O-gyantából (1 % DVB) kiindulva szintetizáljuk. Az 1, példában leírtakat követjük, kivéve, hogy a 2 mmól-nyi védett amlnosavakat alkalmazzuk minden kapcsolási lépésben a szintézis első 13 oiklusában, A szintézis további 6 lépésében kétszer 2 mmól védett amlnosavat alkalmazunk, A peptldek védőcső— portjait teljesen eltávolítjuk, lehasltjuk a DVB gyantáról vízmentes HF:p-krezol :etll-metll-szulfát (10:1:1 t/t/1) eleggyel, Közelítőleg 100 mg peptldet állítunk elő a gyantát 30 %-os eoetsavval extrahálva, A hlrudln^^^ hozama 17 %,

A HPLC analízis szerint a termék nagymértékben tiszta ( > 90 %) és egyetlen 214 ran-en abszorbeáló fő osuos eluálódlk 14,4 pero után az aoetonltrll gradiensben.

··· ···« ·· ·· • · · « · ··· ·· · · • · * · · ··· ·· ··

5, példa

A szintézise

A hlrudin^^^^ képlete a következő: N^N-Asp-Phe— -Glu-Glu-Ile-Pro—Glu-Glu—Tyr-Leu~COOH, A hlrudin^^^^^-ct az 1, példában leirt módon állítjuk elő 0,0259 mekv Boc-Leu-O— -gyantát (1 % DVB) alkalmazva. Ezután 2 mmól aminősav mennyiségeket adunk minden kapcsolási lépésben a növekvő peptidhez, A védőosoportok eltávolítása és a gyantáról való lehasltás az előző példákban leirt módon történik, A peptid hozama 30 %,

A HPLC analízis szerint tisztasága nagyokú (>95 $), és egyetlen fő osuos eluálódlk az aoetomtrll gradiensben a 16,1, percben,

6, példa

A hirudln^^.^ szintézise

A hirudin^-45 képlete a következő: HgN-Leu-Tyr-Glü-Glu-Pro-Ile-Glu-Glu-Phe-Asp-Gly-As n-As n-Hi s-Ser-Glu-Pro-Asn-Pro-Thr-COOH, A hirudm^^^-t az 1, példában leírtak szerint szintetizáljuk, kivéve, hogy 0,259 mekv Boc-O-benztl-L-treoni 1-0-gyantát ( 1 % °VB) alkalmazunk a Boc-Leu-O-gyanta ( 1 % DVB) helyett. Minden kapós olást lépésben 2 mmól-nyi aminősav mennyiségeket használunk a szintézis első hat lépésében, A szintézis további ciklusaiban kétszer 2 mmól-nyi védett aminosavakat alkalmazunk, A peptid védőcsoportjait teljesen eltávolítjuk és a gyantáról vízmentes HF kezeléssel lehasltjuk, A 30 %-os eoetsavas extrakoló után 120 mg peptldet kapunk, és a Hrudin^^ hozama 19,9 %·

A HPLC analízis szerint a peptld tisztasága a termékben nagyfokú ( >90 %), és egyetlen fő csúcs eluálódlk az aoetonltrll gradiensben 13,7 peronéi·

A hlrudin^^jj-öt kontrollként alkalmaztuk a jelen találmány szerinti különböző peptidek anttkoaguláns aktivitásának mérésekor,

7, példa

A hlrudin^^,^ szintézise

A hlrudtn^_—képlete a következő: H^N-Gly-Asp-Phe—Glu-Glu—Tle—Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-COOH, A hlrudtn^^^g^-et az 1 .példában leírtakkal azonos módon szintetizáljuk, 2 mmól-nyi védett aminosav mennyiségeket alkalmazunk a szintézis minden kapcsolást lépésében, A szintézis után a pepiidről a védőcsoportokat teljesen eltávolítjuk, lehasltjuk a DVB gyantáról az előző példákhoz hasonló módon,

A HPLC analízis szerint a termék tisztasága nagyfokú ( > 60 %), és egyetlen fő, 214 nm-en abszorbeáló csuosot tartalmaz,

8, példa

A hlrudln peptidek továbbttsztítása HPLC-vei

Az aktivitás vizsgálatok céljára a fentiek sze39 rint előállított hírűd!n^^^-et, hlrudin^^g^-et és hl rudlttg 1 homogenitásig tisztítottuk prepára ti v fordított fázisú HPLC-vel Waters Assooiates (líllford, MA.) folyadékkromatográfiás készülékkel· A nyers peptid mintákat (a hlrudln^wg^ és hlrudin^p.,^ ®^se,fc^^beli rag-t, a hlrudin^esetében 30 mg-ot) oldjuk 2,0 ml 0, 1 %-os TFA tartalmú vízben. Ezután 1,0 ml 6 mólos guantdínium-klorid oldatot adunk a hlmidln^^g^ és hlrudín23_-g^ nyers mintákhoz, hogy növeljük az oldékonyságot, A mintákat külön-külön injektáljuk a Vydao °18 oszlopra (22 mm x 25 cm), amelyet előzőleg 0, 1 % TFA tartalmú vízzel kiegyensúlyoztunk, A kromatográfíát O-tól 80 % lineáris gradiensen növekvő aoetonttrll konoentráolóju azonos TFA tartalmú oldattal végezzük, 45 percen át, az átfolyási sebesség 4,0 ml/pero, Az átfolyó oldatot 229 nm-nél folyamatosan ellenőrizzük, és a f rakó lókat manuálisan gyűjtjük,

A jelen találmány szerinti már hl midin peptldek hasonló módon állíthatók elő és tiszti that ók,

9« példa

Az N-acetll-hirudln23.6^ szintézise

A jelen találmány szerinti hirudín peptldek N-ace— tilezése közvetlenül megvalósítható a peptid szintézis közben, Például az N-acetll-hímidin^^^g^-et a hírűd!»53.54 szintézisének az alapeljárásával szintetizáljuk az 1, példában leírtak szerint, Az N-aoetllezés céljából azonban úgy módosítjuk az eljárást, hogy a 2 mmól aszparagin helyett 2 mmól N-acetíl-aszparagint használunk a peptldszlntézis utolsó lépésében, A jelen találmány szerinti más peptideket is hasonló módon lehet N-aoetilezni a terminá11s nem-aoetllezett aminosavat N—acetll formával helyettesítve a peptldszlntézis utolsó lépésében,

10, példa

A hlrudln peptldek szulfatálása

0-szulfatlrozin csoportjának az

oéljából T.Nakahara [T.Nakahara és munkatársai, Prepáration of Tyrostne-O-(^S) Sulfated Choleoystokinín Ootapeptde from a Non-Sulfated Preoursor Peptlde”, Anal, Bioohem,, 154>

194-199 (1986)] kémiai módosító eljárását alkalmazva, A 9, példában leírt módon előállított

1,5 mg hlrudin^^^-et oldunk 50 yul dimeti 1-formamidban, majd az oldatot N₂-atBioszférában megszárltjuk. Ezután a peptldet ismét feloldjuk 40 /ul dimetll-formamidban (továbbiakban DMF), amely 2 x 10^ mól kénsavat tartalmaz, Ehhez yul olyan oldatot adunk, amely 40 yul DMF-ben. 50 yug N,N’-dlciklohexil-karbodllmidet (7,0 x 10 5 mól) tartalmaz, A reakció 5-10 perces 25°C—on való állás közben végbemegy, ezután 750 ^ul ionmentes vizet adunk hozzá. Az oldhatatlan reakció termékeket mlkrooentri41 fuga készülékben centrifugálva eltávolítjuk a további tisztítás előtt.

tői és reakció komponensektől fordított fázisú HPLC-vel tisztítjuk meg Vydao Ο^θ oszlopon (4,6 x 25 cm) egy Applled Btosystems, Ino, folyadékkromatográfiás rendszer segítségével, Az oszlopot 0,1 % TFA tartalmú vízzel egyensúlyozzuk ki, és a kifejlesztést 0,085 % TFA tartalmú oldattal végezzük 9θ percen át; az átfolyási sebesség 0,8 ml/pero, Frakciókat gyűjtünk, vákuum gyorsbepárló készülékben megszáritjuk, és ionmentes vízben ismét feloldjuk. Amint az 1, ábrából látható, számos 214 nm-nél abszorbeáló csúcsot választunk el.

A csúcsokban lévő anyagok antlkoaguláns aktivitását vizsgálva két lehetséges szulf o-Tyr^jhimdín^^g^ tartalmú frakciót azonosítunk (a és B csúcsok, 1, ábra), A csúcs semleges pH-η elvégzett ultraibolya spektrum analízise 258-264 nm-nél mutatott maximális abszorpciót, jelezvén egy módosított tlrozm osoport jelenlétét, Az A csúcsban lévő peptid aminosav analízise megerősített a hírudin^^g^ szerkezetet, Ezek az adatok bizonyítják, hogy az A csúcs

erősítettük úgy is, hogy az A csúcsban lévő peptldet 30 %-os TFA-val kezeltük 6o°C-on 1 órán át a szulfátősoport eltávolítása céljábó, Ezután megszárltottuk a peptldet, víz ben újra feloldottuk, és fordított fázisú HPLC vizsgálatnak Vetettük alá, A deszulfatált szulfo-Tyr^^hírudín^^.,^^ HPLC analízisét egy Aquapore RP-300 Οθ oszlopon (0,46 x 3,0 cm) végeztük egy Applled Btosystems 15θΑ HPLC rendszerben. Az oszlopot 0, 1 % TFA-t tartalmazó vízzel egyensúlyoztuk ki, és a kifejlesztést O-tól 70 %-ig gradiensen növekvő aoeto— nltrll koncentrációjú 0,085 % TFA tartalmú vízzel végeztük 45 peroen át 0,5 ml/perc átfolyási sebességgel, A peptid a nem-szulfatált hírűd!n^^^-gyel azonosan viselkedett a HPLC kromatografálás során. Ezen kívül a kezelt peptid abszopd ós maximuma visszaállt 275-280 nm-re, amely jelienző a nem módosított tlrozln csoportot tartalmazó peptídekre, Ezután a fent leírt szulfatálásl eljárást nagyobb mennyiségű megfelelő H-aoetllezett peptidekkel is elvégezzük, Amint a 2a ábrában lévő HPLC kormatogrammból látható, 25 mg N'-acotll-hlmidin^^^g^-et (a 9, példa szerint készült) Nakahara módszere szerint kezelve 80,0 % hozammal kezelik a kívánt Tyr-szulfatált termék. Az a törekvés azonban, hogy a reakciót arányosan 50 mg N-acetll—hlrudln^^^-gyel végezzük el, csak 48,5 % Tyr-szulfatált származék hozammal jár (2,b ábra),

Ennek megfelelően, jelentősen megváltoztatjuk Ifekahara eljárásának a kémiáját, hogy a Tyr-szulfatált termék magasabb hozamát érjük el nagyobb méretű szulfatálásl reakdóban· Még pontosabban, 1 g N^acetil-hirudin^^..g^-et oldunk 40 ml dlmetll-f orraamidban 5,0 ml NjN’-dioiklóhexil-karbodilmld oldat (0,2 g/0,16 ml dlmetíl-formamid) jelenlétében, Az elegyet 0°C-on kevertetjük, és cseppenként 0,5 ml koncentrált kénsavat adunk a reakcióolegyhez, míg csapadék képződik, 5 perc múlva a redc dót leállítjuk 40 ml víz hozzáadásával, A reakcióé légy fordított fázisú HPLC elválasztása (2o ábra) azt mutatja, hogy a szulfátéit peptldet, a szulfo—Tyrg^-N-acetil-hirudin^^^^^^-®'*' θ'* >7 % hozammal állítottuk elő·

A szulfátéit hirudln peptid nagyobb méretű tisztítását egylépéses anioncserélő kromatografálássál érjük el. Pontosabban, a nyers szulfo-Tyr^-N-aoetil-hirudin^^^-et DEAE-Sepharose oszlopon (250 ml nedves gyanta/5 g nyers peptid) tisztítjuk. Az oszlopot előzetesen kiegyensúlyozzuk, és a mintát is 20 mM nátrlum-aoetát-oldatban (pH»,5,0) viszszük fel, A kromatogram kifejlesztését lineáris nátrium-klorid gradienssel (0-0,4M) végezzük, A szulfo-Tyr^yN-acetil-liirudin^^^^'’^öt közelítőleg O,2-O_t3M nátrium-klorid koncentrációnál eluáljuk a nem—szulfátéit peptid után, de a szulfonált melléktermék szulf ontl-Tyr^g-N-aoetll-hlruding2«64 előtt,

A jelen találmány más hlrudln peptidjelt is lehet szulfátéin!, tisztítani és analizálni az előbbiekben leírtakkal azonos módon.

♦. * » · • ·

11, példa

A hirudin peptldek szulfonálása

Az N-aoetíl-hlrudin^^g^-et Tyr-szulfonált származékává, azaz szulfonil-Tyrg^-N-aoetll-hirudin^^^-gyé alakítjuk a 1O, példában leírt módon, A szulfonil-Tyr^yN-aoetll-hlrudin^^g^

-et az ebben a példában leirt nagyobb méretben elvégzett szulfatálásl reakció melléktermékeként nyerjük, Ennék megfelelően a szulf onil-Tyr^ yN-ace ti 1-hlrudln^^-^^-et 30-40 % hozammal állítjuk elő, és az a fordított fázisú HPLC elválasztásnál a szulf o-Tyr^yhlrudln^^.gj^ előtt eluálÓdlk (lásd 3, ábra).

12, példa

Az antlkoaguláns aktivitás in vitro vizsgálata

Ez a példa a jelen találmány szerinti hirudin peptldek trombinnal szembeni gátló hatását mutatja be az aktivált parciális tromboplasztin idő (APTT) mérése alapján. Az antlkoaguláns aktivitást az összegyűjtött nonnál, humán plazma (George Ring Biomedlcal, Inc,, Overland Park, Kansas) (4 í 1 t/t arányban hígítva, plazma:viz) APTT vizsgálata alapján határozzuk meg egy Coag-A-Mate 2001 készülékkel (Generál Diagnostics, In,, Morris Plains, New Jersey), Pontosabban, a hígított plazmát 750 /ug/ml körüli koncentrációjú vizes hirudin peptid törzsoldattal keverjük nem-szulfatált hirudin peltidek esetében, és 35 /ug/ml konoentrá—

oíóju oldattal a szulfatált peptidek esetében· A plazmát és a hirudln peptideket 125 yul végső térfogatban keverjük össze az APTT meghatározása előtt·

Az APTT Vizsgálatot úgy kezdjük, hogy 92 yul nyers tromboplasztm szuszpenziót (Generál Diagnostlos) és

100 /ul 0,3 M.os kalolum-klorld reagenst

lemez vályatainak mindegyikébe (Generál Diagnostlos) APTT meghatározásonként olymódon, hogy a vizsgálati elegy végső térfogata a vályatban 317 yul legyen, A kalolum-klorldot minden vizsgálat előtt frissen készítjük, Az aktivációs idő 180 másodpercen át állandó, Ezen vizsgálatok eredményeinek a hlmidín^j^^ és a szulfo-Tyrgjhirudin^j^g^ APTT értékeivel való összehasonlítása a 3« ábrában látható, A 4,ábra azt mutatja, hogy a szulfatált hirudln peptid előnyösen egy magasabb szintű aktivitással növeli az alvadásl időt, mint a megfelelő nem-szulfatált peptid, A szulfonált peptid, a szulf ont 1-Tyrg jhlmdl n^ j„g^ hasonló APTT értéket mutat, mint a

Az 5,ábra a jelen találmány különböző hirudln peptldjeinek ΜΟΤ^θ értékelnek (ΜΟΤ^θ a peptid mmól mennyisége a hígított plazma 125yul-ében, amely az alvadásl időnek az APTT vizsgálatban mért maximális növekedésének 50 ^•os növeléséhez szükséges), A hirudln^y. 64^MCT5O értéke

0,77* A peptid megfelelő szulfatált párjának, a szulfo-Tyrg^hlrudin^j-g^-nek nincs hatása az alvadásl idő növekedésére »· ·

hasonlítva· Hasonló módon, egy peptid, amely nem tartalmaz

zik összehasonlítható mértékű alvadásl időt növelő hatással·

Egy aszparagln osoport (a közölt HV-2 szekvenoia megfelelő Asn^yjának megfelelően) és egy tlrozln osoport (a hlrudln

mény, hogy azok fontosak a jelen találmány szerinti peptidek antlkoaguláns aktivitásában·

okozza, a hatást egy két lépcsős, dózistól függő mértékű módon fejti ki, amikoris először egy szűk koncentráció tartományban lévő peptid az APTT 20 másodperces növekedését okozza, majd a tágabb határok közötti peptid koncentráció az alvadásl időnek csak egy további 10-15 másodperces növeked sét eredményezi.

A jelen találmány szerinti hlrudln peptidek tromblnnal szembeni speolf1tásának a vizsgálata céljából vizsgáltuk azok hatását a trombin idő (thrombin tlme, továbbiakban TT) növelésére, A trombin időt a ferde-csöves módszerrel mértük. Pontosabban, humán α-tromblnt (Diagnostlos Stago, Ásni ere, ík*ance) 2,5 E/ml koncentrációban oldottunk 0,01 M Trls—HOL (pH»7,4)-ben, amdL y 0,15 M nátrlum-klorldot és 10 mM kálcium-klorídot tartalmazott, A trombin oldat

100 yul— ét összekevertük 200 /ul normál humán plazmával (George KLfcg Btomedical, Inc,, KA), amelyet előzőleg O-1O /ug/ml szulfo-iyr^^hlmidin^^g^-gyel (0,8 E/ml végső trombita koncentráció) kevertünk össze, A normál plazma trombln ideje jellegzetesen 15 másodperc,

A 6, ábrában összehasonlítottuk a hlrudln (Sigma, St.Louls, MO) és a szulfo-Tyr^^hlrudin^^gj^ trombln Időt *•8 növelő hatását, A szulfo-Tyr^hirudln^,.^ 3,3 x 1θ M koncentrációja a TT-t 15-ről 55 másodpercre növeli, A hlrudlnnal összehasonlítva a szulfo-Tyr^^hlrudlközelítőleg 50-szer nagyobb moláris specifikus gátló aktivitással rendelkezik a tromblnnal szemben. Ezek az APTT vizsgálatban megfigyelt gátló aktivitásokkal azonosak,

Amint fent bemutattuk, a vizsgált nem-szulfátált peptid maximális antlkoaguláns aktivitását a hlrudln^^g^ fejtette ki, Az Asn^ynak megfelelő aszparagin csoport a gátló aktivitásnak minimálisan kétszeres csökkenését eredményezi, A hirudin^^^-ből a C-terminális Tyr és Leu eltávolítása egy olyan peptldet eredményez, a hirudm^^gg—t, amelynek nincs említésre méltó gátló aktivitása, A szulfatált hlrudln^(szulfo-Tyr^hirudln^,^) a nem-szulfatált megfelelő vegyülethez képest 10-szeresen megnöveli az alvadásl időt.

Ezekre a megfigyelésekre alapozva feltételezzük, hogy - legalább részben - az intakt hirudin peptid O-terminális aminosav csoportjainak a funkciója ezekeben a fehér • ··

- 48 jékben az an ti trombin aktivitás. Azonkívül azt is megállapítottuk/ hogy az ép hlrudtnban ezeken a C-termlnális csoportokon belül egy szegmentum (a hirudin peptid-láncoal ellentétes orientációban, azaz a COOH-tól az NHg terminális irányában) homológ á humán trombomodulin feltételezetten trombínt kötő dóm énjében lévő szegmentumával ÍD,W©n és munkatársai, Humán Thrombomodulln: Complete cDNA Sequenoe and Chromosorae Localízatlon of the Gene, Bioaheraistry, 26, 4350-4357 (1987)1 ,

A trombomodulin egy endotellálls sejt-felületi gllkoprotein, amely sztöchlometrlkus komplexet képez a trombinnal [C,T,Esman: The Regulatlon of Na tural Antlooagulant Pathways, Scienoe, 235, 1348-1352 (1987)1 · A hirudin C-texmlnálls szegmentumának és a trombomodulln prekurzor 150-155 csoportjai homológiájának az azonosítása feltételezhetővé teszi, hogy a trom bőm odúimban ez a szegmentum részt vesz a trombinnal való komplex képzésben. Előzőleg megfigyeltük, hogy úgy a hirudin-trombin [J,L,Krstenansky és S,J,T, Mao: FEBS Lett,, 211, 10-16 (1987)1 , mint a trombomodulin-trombm komplex képződése egy katalitikus hellyel rendelkező protelnázt eredményez, Együttvéve ezek a megfigyelések feltételezhetővé teszik, hogy a flbrinopeptidekben lévő szerkezeti komponensek (produktív módon) és a trombomodúimban és hlrudinban (gátló módon) kölcsönhatásba lépnek a szubsztrát felismerő hellyel a tromblnon, amely alkalmassá teszi a fibrinogén kötődésére. Az a véleményünk, hogy a • ·* ·· e · · • · · * · · *·· ·· ·· ' ···

- 49 himidin peptídek trombinhoz való kötődése vezet a C-fehérje aktiválódásához, igy tovább gyorsítva azok antlkoaguláns tulajdonságait az Va faktor és a Villa faktor C-fehérja általi lebomlásán keresztül, Minthogy a hírudín szintén gyengíti a trombín katalitikus aktivitását, nem valószínű, hogy részt vesz ebben a hatásban, Ennek megfelelően az a véleményünk, hogy a jelen találmány szerinti hírudín peptídek, antlkoaguláns aktivitása a pepiidnek a trombín nem-katalitlkus helyéhez Való kötődéséből származik, Így a trombín által katalizált flbrinogén hidrolízis egy megnövekedett K értéin két eredményezi,

13, példa

A hl midin peptídek speolfitása a humán trombtnnal szemben

A hl midül peptídek humán a-tromfomnál szembeni speölfltását úgy határoztuk meg, hogy összehasonlítottuk a humán a-tromfomnál és a marha α-tromblnnal szembeni relatív gátló hatásukat TT vizsgálatban, A 7, ábra bemutatja, hogy a szulfo—Tyr^^-N-acetil-hírudln^^g^ 4-5-ször hatásosabb inhibitora a humán cc-trombinnak, mint a marha a-trom— binnak, A humán α-trombín és a marha a-trombín szerkezete nagymértékben hasonló, kivéve; hogy a humán molekulában a β-lánc 149« helyén egyetlen llzín csoport van. Ez a csoport meghatározza a gansna-autokatali tlkus lebomlás hely ét« Feltételezzük; hogy a Lys^p a humán α-trombinban fontos szerkezeti meghatározó a jelen találmány hírudín pepiidjelnek a trombínhoz való kötődésében,

14, példa

A heparin és a hírudin peptldek szlnerglzmusa az antlkoaguláns aktivitásban

A hírudin a trombinnal való kölosönhatását a heparln/antttrombin Hl blokkolni látszik [S,R,Stone és

J.Hofsteerlge$ ^HEffeot of Heparin on the Tnteraotlon Between Thr om bt n and Hirudin”, Eur, J, Bj. oohem ,, 169, 373-376 (1907)1 · Ez annak a ténynek tulajdonítható, hogy úgy a hírudin, mint a hsparln/antltrombln Hl komplexet képez a trombinnal, ameL y blokkolja ennek az enzimnek a katalitikus helyét. Megfigyeltük, hogy a jelen találmány szerinti hírudin peptldek gátolják a trombin flbrinolltlfcus aktivitását, de nem gátolják az amldolltíkus aktivitást. Ennek megfelelően elvégeztünk egy vizsgálatot annak meghatározására, hogy a hírudin peptldek additív vagy szlnergetlkus módon hatnak-e a heparinnal a humán plazma antlkoagulánsaként, A hírudin peptldeknek a heparlnnal való sztnergetlkus hatását figyeltük meg az APTT vizsgálatokban az összegyűjtött normál humán plazmában,

A 8, ábra az APTT vizsgálatok dózis függésének az eredményeit mutatja csak szulfo-Tyr^jhírudln^^^-et, csak heparínt vagy a pép ti de t és a heparínt kombináltan alkalmazva. Az APTT vizsgálatokat a 12. példában leírtak szerint végeztük, Mind a heparínt (Sigma, St.Louis, M0.), mind a szulfo-Tyr^hlrudin^^^-et (a 10, példa szerinti készítve) 10 yug/ml koncentrációban alkalmaztuk, Az eredmények azt mutatták, hogy a szulf o-Tyr^^hírudln^^^^ és a heparin az alvadásl időnek nagyobb növekedését okozza, mint amit elértünk az egyes molekulákkal vagy azok előre számított kombinált antlkoaguláns aktivitása, £&nthogy a heparin alkalmazását vérzésl komplikációk kísérik, ezen kombinációk előnye, hogy kisebb adagokkal érhető el az antlkoaguláns hatás,

15, példa

A trombln-aktivitás mérése

A jelen találmány szerinti hlrudln peptldek trlpeptldll p-nttroanllld szubsztrát tozll-Gly-Por-Arg-p-notroanllid (Chromozym ΊΗ, Boehrlnger Mannheim, Tndlanapolls, In·) trombin által katalizált hidrolízisének a gátlását spektrofotometriásán analizáltuk 420 nm-nél egy Cary 219 kétsugaras spektrofotométerrel· A reakció során 10 /ul trombin oldatot (marha trombin, Calblochem, Behring Diagnostlos, La Jolla, CA.) (0,1 mg/ml 0,1 M Tris-HCl, pHs =7,4, 0,15 M NaCl) kevertünk össze 1,0 olOJM Trls-HCl, pH®7,4, 0,15 M NaCl pufferrel, Ezután 25 /ul szubsztrát oldatot (4 mg/ml tozll-Gly-Pro-Arg-p-nltrantlld a fenti pufferben) és különböző mennyiségű himidln^^g^-et (a 4, példa szerint előállítva) adtunk hozzá egy 1,0 mg/ml törzs52 oldatból 1,035 tál végső térfogatig, a trombín végső kon— •8 ·»2ι oentráolója 2,8 x 10 M és a szubsztráté 1,4 x 10 volt·

Azt találtuk, hogy a 4,2 x 10~^M és 2, 1 χ 1θ”^Μ koncentráolók között a hírudin^^^^ nem mutatott mérhető gátló hatást a szintetikus szubsztrát trombín által katalizált hidrolízisére· Ezzel ellentétben 1,2 és 2,4 x 10 M intakt hlrudln koncentráolók 48 %-os, illetve 73 %~os gátló hatást fejtettek ki, Ezekre a megfigyelésekre alapozva feltételeztük, hogy a hlrudln C-terminá 11 s 21 aminosavának megfelelő peptidek és ezek kisebb származékai nem gátolják a kis szintetikus szubsztrátok trombín általi hasítását· Ez teljesen megegyezik azzal a feltételezésünkkel, hogy a jelen találmány szerinti peptidek nem kötődnek a trombín katalitikus helyéhez, Ennek megfelelően azt gondoljuk, hogy a jelen találmány szerinti peptidek által az alvadásl Időre kifejtett gátló hatás a tromblnnak más, nem a katalitikus helyéhez való affinitásának tulajdonítható,

16, példa

Az ín vivő antlkoaguláns aktivitás mérése

Ezután a jelen találmány hlrudln peptldjelnek a dózistól függő alvadásl dl őt növelő aktivitását vizsgáltuk ín vivő a szulfo-Tyrgghirudi1 intravénásán adva Balb/o egereknek (Charles RíVer Laboratorles, Boston, Hass,), A szulf o-Tyrg^hirudin^^g^ 10, 50, 100 és 250 yug adagjait injektáltuk az állatokba, 5 perc után az állatokat kivár ez tettük, A vért oltrátps edénybe gyűjtöttük és a plazmát centrifugálással elkülönítettük. Az egér plazma aktivált paroiálls tromboplasztin idejét (ÁPTT) a 12, példában leirtak szerint mértük, A 9, ábra mutatja, hogy a szulfo-Tyr^ hirudin^2«g^ dózistól függő mértékben növeli in vivő az APTT-t az egér plazmában,

17, példa

A szulf o-Tyr^^hirudin^“P^olietllénglikol konjugátum előálli tása

A jelen találmány szerinti hirudin peptidet gyógyászatilag megfelelő polimerrel kapcsoljuk, hogy megnövel jük a peptid felezési idejét. Még pontosabban, a pöltét! léngükol egy származékát, a polietilénglikol-N-szukoinimldil—szukoinátot (SS-PEG), (Ms a 5000) állítjuk elő szokásos módszerrel [Abuohowsky és munkatársai: Cancer Biochem, Biophys,, 7, 175-186 (1984)1 , Ezután 100 /ug szulfo-Tyr^y hirudin^^g^-et, amelyet a 10, példa szerint átütöttünk elő, oldunk 200 yul 20 mNHos nátrium-borátban, pHs9,0, és 50-szeres moláris felesleg SS-PEG—gél reagáljuk, A reakokóelegyet szobahőmérsékleten éjjelen át állni hagyjuk, és ezután fordított fázisú HPLC-vel tisztítjuk és jellemezzük,

A fordított fázisú HPLC-t egy Aquapore RP-300 Οθ oszlopon (0,46 x 3,θ cm) végezzük Applted Blosystems 15θ A kromatográfiás rendszerben. Az oszlopot 0,1 % TFA tartalmú vízzel kiegyensúlyozzuk, és O-tól 50 lg gradiensen növekvő aoetonltrll koncentrációju 0,085 % TFA tartalom oldattal eluáljuk 45 perc alatt 0,5 ml/perc átfolyási sebességgel, Az átfolyt oldat abszorpcióját 214 nm—nél folyamatosan ellenőrizzük, Megfigyeltük, hogy a szulfo-Tyr^y-hirudln^^^ SS—PEG származéka előbb eluálódik, mint a nem-derivatlzált forma és egy szélesebb csúcsban helyezkedik szulf o-Tyr^^hlrudin^^^^ derivatlzált és a nem-derlvatlzált formálnak az antlkoaguláns aktivitását összehason lítva megállapítottuk, hogy az APTT növelésében azonos módon dózis függő a hatásuk, így, az SS-PEG-szulf o-Tyr^^hlru^din53*64 ^a ^^β3,βη találmány szerinti peptldeknek egy aktív származéka^ amelynek előnye, hogy a vérkeringésben a felezési Ideje a megfelelő nem-derivatizált vegyülethez képest megnőtt.

18, példa

Az IXa faktor és Xa faktor gátlásának a vizsgálata

Az IXa faktor szülio-Tyr^^tirvAí gátlását közvetetten mértük arra a megfigyelésre alapozva, hogy az IXa faktor katalizálja az X faktor Xa faktorral való aktiválását, és, hogy a szulf o-Tyr^^htrudin^^gj^ nem gátolja a kis kromogén szubsztrát, az S-2222 Xa faktor általi hasítását.

Egy IXa faktor (X faktor) foszfollpld elegyet készítettünk Coatest Vili faktor vizsgálati készletből (Kabivitrum, Helena Laboratőrlés, Beaumont, TX) a gyártó cég előírása szerint a 10, példában leírtak szerint készült különböző koncentrációban jelenlévő szulfo-Tyr^^hirudín^^^-gyel (O-tól 66,7 /ug/ml), Az elegyet 25 nM kálotum-klorld és humán plassaa részletek hozzáadásával aktiváltuk a gyártó oég előírása szerint, Miután a mintákat 10 percen át ínkuháltuk 37°G-on, 100 yul S-2222 oldatot adtunk minden mintához (Kabivitrum, Helena Iaboratorles, Beaumont, TX). A reakciót 5 perc után savanyítással leállítottuk, Az S—2222 hasadásának a mértékét spektrofotometriásán követtük 405 nm-nél,

A 10, ábra mutatja, hogy a szulfo-Tyr^^hlrudin^^g^ dózistól függő mértékű gátló hatást fejt ki ebben a vizsgálatban az S-2222 hasításra. Minthogy ez a peptld nem gátolja az S-2222-nek az Xa faktor általi hasítását, ez az eredmény azt mutatja, hogy a peptld növekvő mennyisége az Xa faktor csökkenő képződését eredményezi, Ezért a szulfo-Tyr^y htxnidln^2„5i^“^nek gátolni kell az X faktor IXA faktor általi ••6 aktiválását, Az TXa faktor gátlása 6 x. 10 M peptld koncentrációnál volt teljes,

Az Xa faktor protrombtn aktiválásának a szulfo— -Tyr63hirudln53-64 általi gátlását SDS-PAGE alkalmazásával vizsgáltuk, iXa, faktor/X faktor elegyből Xa faktor képződését váltottuk ki kálolum-foszfollpld és hígított plazma jelenlétében az előbbi méréshez hasonlóan, Az Így kész!

tett Xa faktor normál humán szérumból Ihompson módszerével [A.,R,lhonipson: J.Clin.Invest«, 59, 900905 (1977)1 tisztított protrombinnal (130 /ug/ml) ínkubáltuk 315 /ul 0,05 M Trls-HCl, pHfc7,5, 0,1 M nátrium-klorid oldatban, amely szulfo-Tyr^^hirudln^^^-öt (0-95 yug/ml) vagy hirudlnt (025 E/ml) tartalmazott, Miután 60 percig 37°C-on inkubáltuk, összekevertük IfX nem-redukáló SDS-PAGE mintapuferrel, és a mintát 10 %-os akrllamid-gélben SDS-PAGE-val analizáltuk, A gélt Coomassle Blue-val festettük meg az elektroforézls után, A protrombín Xa, faktor általi aktiválásának a gátlását vizuálisan értékeltük a reakció termékek gélben való vizsgálatával, A 11, ábra bemutatja a protrombín trombinná alakulásának a dózistól függő mértékű gátlását szulfo-Tyr^^htrudíkoncentrációja növekedésének függvényében.

Egy másik megoldás szerint a fenti módon készített mintákban a keletkező trombln aktivitást mértük

Chromozym ΊΗ szubsztráttal (Boehringer Manriheim, Indíanapolls, IN,), Minden minta 5 /ul-es alikvotjait egy küvettába tettük, amelyben 1,0 ml 0,01 M Tris-HCl, pH=7,5, 0,15 M NaCl és 4 yug/ml Chromozym TH volt,A trombin aktivitást folyamatosan követtük 420 nm-nél, A trombin aktivitás ilyen

módon történő analízise azt mutatta, hogy a 70 szulfo-Tyrg^tilrudin^2.64 koncentrációnál a protrombín ész téről! tlkus aktivitásának az Xa faktor általi aktiválódása negyedére redukálódott·

Összegezve, ezen adatok azt mutatják, hogy a szulf o-Tyr^hlrudln gátolja az X faktor IXa faktor általi aktiválását, valamint a protrombin Xa faktor általi aktiválását, de mindkét esetben nem a katalitikus helyen· Azonban az iXa és az Xa faktor gátlásának a szintje körülbelül 10-szer kisebb, mint a trombin gátlás színje. Ezen adatok alapján feltételezhető, hogy a hirudlnban az a szerkezet, amely kölosönhatásba lép az IXa faktorral és az Xa faktorral a C-terminálls szegmentumra lokál!zálódlk, azaz a gátlás nem-katalitikus hely(ek) kölosönhatásán keresztül jön létre, Ez maga után vonja, hogy a hlrudín különböző formál, amelyek nem tartalmazzák a szulfatált Tyr^-at, nem mutatják a természetes pióca hl rúd innak a nem-antl trombin antlkoaguláns tulajdonságát,

19, példa

A hlrudín peptldek antl-metasztatlkus aktivitása

A hlrudín peptldek, előnyösen a szulfo-Tyr^hlrudln^,,^, antlraetasztatlkus aktivitását szarkóma T24 1 sejteken [L,A,Látottá és munkatársai: Natúré, 284, Ó7”Ó8 (1980)] és színgenetlkus C578L/6 egereken (Jaokson Laboratory,

Bar Harbor, ME) lehet vizsgálni. Az egereknek akár intravénásán vagy szubkután 0-250 g/kg szulfo-Tyr^^i^^ib^^^g^ -et injektáltunk; amelyet a 10, példa szerint készítettünk, majd 10^-10^ T241 twaor sejtet adtunk intravénásán, 15 nap után az állatokat le öl tűk, és a tüdőben lévő tumor telepek mennyiségét meghatároztuk, A hirudln peptid antl-metasz— tatlkus aktivitást a tumor telepek százalékos csökkenésével mértük a plaoebóval kezelt kontrollal összehasonlítva,

20, példa

A hirudln peptidek peptidomimetlkus analógjai

A jelen találmány szerinti peptidek, előnyösen a szulfo-Tyrg^hirudin^^g^, felhasználhatók szem!-peptid vagy nem-peptid analógok,olyan szintetikus molekulák előállítására, amelyek antltrombin és antlkoaguláns aktivitással rendelkeznek, Ezek a paptldorníinetikus analógok rendelkeznek a flbrinogén trombin általi hidrolízisét gátló aktivitással, valamint az X faktor TXa faktor általi aktiválását és a protrombin Xa faktor általi aktiválását gátló hatással, amely jellemző a találmány szerinti hirudln peptidekre,

A jelen találmány szerinti peptidomimetlkus analógokat a továbbiakban ”hlrulog^,,-oknak nevezzük, és a következő kémiai szerkezetűek:

Hiruloq-1;

Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu \ , / Gly Tyr(SO-) \ / ³ Asn-Cys-S-S-Cys-Leu « «

	«α / - 59 **
Hirulog-2:	Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu \ \ Gly Tyr(SO-) / / 3 Asn-Cys-S-s-(CH2)n-S-S-Cys-Leu
Hirulog-3:	Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu \ \ Gly Tyr(SO-) / / 3 Asn-Cys-S-CH-(CH2)n-CH-S-Cys-Leu COOH COOH
Hirulog-4:	Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu \ \ Gly 0 Tyr(SO-) / Η II / 3 Asn-Lys-N-C-(CH-) -C-N-Lys-Leu II 2 “ H 0
Hirulog-5:	Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ala / \ 0 Pro 1 1 C=O G1U \ / Leu-(SO3)Tyr-Glu
Hirulog-6:	Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ala-Pro

G1U \ /

Leu-(S0₃)Tyr-Ser

Hirulog-7: Cys-Gly-Asp-Cys-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr(so₃)-Leu

S ' S \ / s-(ch₂)₂-s

A jelen találmány szerinti peptidek szemi-peptid peptldomUnatikus analógjait úgy lehet előállítani,hogy az eredeti paptldben lévő hurkot, tekeredést vagy helíkális kenet formációt stabilizáljuk· Például egy hurokszarkezet/lehet képezni a szulfo-Tyr^hlrudin^.,^ N- és C-terminálls végeihez císzteinil- vagy lízil-c söpör tót kapcsolva, A terminális olsztein csoportot oxidációval keresztkötésbe hézva állítjuk elő a hirulog-1—et (12a ábra), egy alifás di ti óllal oxidálva hirulog-2 keletkezik (12b ábra) vagy alifás dihaloacetáttal vagy -propionáttal alkilezve hirulog—3 (12c ábra) keletkezik, A terminális llzil-csoportokat számos imidát anyaggal változó hosszúságú vagy dihldroszukcinimidii alifás reagensekkel kérész tköt és be hozva hirulog-3 (13, ábra) keletkezik,

A szulfo-Tyr^^hirudin^^-g^’’⁰®¹¹ lévő Pro-8 körül egy tekeredés létrehozása úgy törté nik, hogy az Ile-7*ct klór-alaninnal helyettesítjük, akár a Glu-9 vagy Glu-10 (L) vagy (D) szerinnel való helyettesítésével együtt vagy anélkül, A csak klór-alanint tartalmazó peptidomltnetlkus analógokban a Glu-9 vagy Glu-10-et az Ateró-hoz egy keton kötéssel kapcsolva a hirulog-5 (14a,ábra) keletkezik, A

I

I

9-es vagy 10-es helyzetben lévő szerin származékait éter kötéssel lehet kapcsolni, és igy hirulog-6 (14b ábra) keletkezik·

A peptidomimetikus analógokban a helikális szerkezetét úgy lehet megtartani, (n) és az (n+3) helyeken lévő hogy a hirudin pepiidben az ciszteinil csoportokat szubsztltuáljuk, és akár közvetlen oxidációval alifás ditlollal oxidálva, vagy alifás dlhaloaoetáttal alkllezVe összekapcsőijuk, Például, ha a szulfo-Tyr^jhirudln^^^ ás

Phe-4-ét oiszteinekkel helyettesítjük és etándlollal oxldál juk (15, ábra), a származékban az ami no-terminált són megma rad a helikális tekeredés, és a peptid származékban stabil

Teljesen nem-pepiid peptidomimetikus analógokat a jelen találmány szerint elő lehet állitant tekintetbe véve a fent leirt stratégiákat, amelyek a peptid Vegyületek megtartására irányulnak.

21, példa

A hirudin peptidek alkalmazása a trombusról alkotott kép kialakításában

A hirudin peptldeket, mint a szulfo-Tyr^hiru* módosítani lehet ^^1, vagy ^^In tar^53-64^-°^ talnru kémiai csoportokkal kovalensen kapcsolva, Például a

10,példa szerint készített szulfo-Tyr^jhirudin^^^ a-aramóniian csoportját reagál tat juk ¹²^i-Bolton-Hunter reagenssel (Név» England Nuölear, Boston, MA,) 0,1 M nátrium-borát bán, pHss9,0-nél, A ¹²^T-vel jelzett peptidet (specifikus aktivitás 5 yuCt//ug) ezután Biogel P2 oszlopon sómentesltjük, amelyet előzőleg egy foszfát-puffe125 rés sóoldattál kiegyensúlyoztunk· A I-vel jelzett peptidet trombln idő és az APTT vizsgálattal tesztelhetjük az antltrombln aktivitás esetleges csökkenésének a megállapítására·

A kísérletes trombusok ex vivő képének a kialakítását lényegében T,M,Palabrloa fT,M, Palabrlca és munkatársai :”Ihrom bús Imaglng in a Prtmate Model with Antlbodles Specifio fór an External Memgrane Protein of Aotivated Platelets, Proo.l&tl, Aoad,Scl, USA,, 86, 1036-1040 (1989)1 által leírt módon végezzük, Pontosabban, a vizsgálatot babulnokban (Paplo bábuin) a fémorális artéria és femorálls véna közötti külső Tiooflex sönttel végezzük. Kísérletes trombust úgy képezzük, hogy az elQre megalvasztott Daoron

125 graft szegmentwnot a söntbe helyezzük, A T-vel jelzett szulfo-Tyr^hlrudln^^^-et a Ttcoflex sönt vénás részébe injektáljuk. Sorozat elülső képet kapunk 0,5-1 órán át Ohio Nuclear Series 100 Gamma Camera segítségével egy PDP—11/34 komputerrel. A graft és gyűjtött vér ^²^I hl— rudln fölvételének a kinetikája az így kapott radtonuküd képből következik, • * «

- 63 Ugyanezt a technikát lehet alkalmazni a mély— Vénás trotnbusók ex vivő képének a megállapítására, amelyet a babul nők femorálls vénájában előidézett pangással hoztunk létre. Minthogy a szulfo-Tyr^^hiiudin^^^ a trombinhoz nagy speolfltássál kötődik, a radloaktivan jelzett hlrudln peptidek lehetővé teszik az ex vivő képalkotást a kísérletes trombusok esetében. Tehát a hlrudln peptidek kis mérete, ellentétben a természetes hirudlnnal vagy a tromblnnal szembeni antitestekkel, lehetővé teszik, hogy a radioaktivan jelzett peptid képet adjon a trombocitához kötött trombín·· ról és melzotromblnról, valamint a flbrin alvadókban lévő tromblnról,

22,példa

Kis adag hlrudln peptidek tromboclta aggregádóra és alvadásl időre kifejtett gátló hatásának az összehasonlítása.

Ttrombocitákbán gazdag és trombocitákban szegény palzmát állítottunk elő J,A, Jakubowskl és N,G,Ardlle módszerével p* Módi fi ca tton of Humán Platóiét Funotlon By a Diet Enriched in Saturated of Polyunsaturated Eat, Atherosolerosls, 31» 335-344 (1978)1, Pontosabban, önként jelentkező emberektől vért gyűjtöttünk 21-es pillangós csővel 1/10 végső koncentrádóju 3,8 %-os trinátrlum-dtrátba, A vér gyűjtése előtt legalább két héten át minden donor tartózkodott minden gyógyszer szedésétől, A trombodtában gazdag plazanát a dtrátos teljes vér szobahőmérsékleten ·♦·

- 6fy —

100 x g-vei 15 percen át SorVal rotorban való oentrifugá— lásával nyertük, A trombocliákban szegény plazmát a oitrátos teljes vér 15 peroen át 12 000 χ g-vel való oentrlfugálásával állítottuk elő,

A szulfo-Tyr^jhlmdin^^^^ antlkoaguláns és antltromboolta aktivitását 0-0,55 yug/ml koncentráció határok között vizsgáltuk. Az antlkoaguláns aktivitást a ^.példában leírt APTT mérésével Vizsgáltuk, A tromboolta aggregáolót 0,05 ml vízben lévő szulfo-Tyr^^-N-acetíl-hlrudln^^^^ 37°Ct®· előre felmelegitett 0,4 ml trombocl tákban gazdag plazmához adva Vizsgáltuk, Az elegyet 1 percen át kevertük 37°C-on, és ezután trombtnt adtunk hozzá 0,4 E/ml végső koncentrációig, Az aggregáolót turbidlmetriásan követtük 4 peroen át Biodata PAP 4-ohannel Piatelet Prolfller (Blodata, Hatboro, PA,) segítségével,

Az ezekben a vizsgálatokban alkalmazott legnagyobb szulfo-Tyr^—N—acetil-hirudinjj^^ koncentráció olyan APTT értéket adott, amely kevesebb volt, mint a normál szérum 125 $-a. Ezzel ellentétben a szulfo-Tyr^-N-aoetil-hirudln^,,^ a tromboolta aggregáolót 50 $-ban gátolja 0,15-0,35 yug/ml koncentrációk között (16, ábra). Ez azt mutatja, hogy a jelen találmány szerinti hirudin peptidek kis adagjai hatásosabban bolokkolják a tromboolta aktiválódást olyan körülmények között, amelyek terápiásán nem fejtenek ki hatást áz alvadésra (azaz az APTT 150-200 ^-osan növekszik a kontroliban) ,

- 65 2 3 · pé Ida

A hírudin, szulf o-T^rg^hirudin^j^g^ és a hinriln^^ endotellálls sejtekre kifejtett hatásainak az összehasonlítása

Vizsgáltuk a hlrudin^j..^, illetve a szulf o-Tyrgy hirudín^j^g^ trombin által indukált trombootta aktiváló faktor (PAF) szintézist gátló képességét humán köldökzsinór véna endotellálls sejt tenyészetek segítségével (htanán xenbllical Vein endothellal oell, továbbiakban HUVEC), A HUVEC-et humán köldökzsinórból vontuk ki kollagenáz emésztéssel, Ismert eljárásokkal IM.A, Gimbrone, Jr, Culture of Vasoular Endothellum”, Prog.Hemost, Thromb,, 3, 1-28 (197ó)J · A HUVEC-et összefolyásig növesztettük egy 9ó vályatos mlkrotlter lemezen (¾)^-aoetll-PAF jelenlétében· Az Így tenyésztett sejtek (^Hj-acetll-PAF-ot termeltek, amelyek mennyiségileg meghatározhatók a HUVEC membrán fosai* ollpldek extrakolójával,

A (¾)-aoθtáttal jelzett HUVEC-hez a trombln adása előtt (végső koncentráció 1 E/ml) vagy hlrudlnt (0-1 yug/ml), hlrudlnj3_g^~et (0-200 /ug/ml) vagy szulf* o-Tyr63hlrudin,j3..6j!_í*“^e’^fc (°-8 /ug/tnl) adtunk, A sejteket 5 percen át inkubáltuk, és a felüluszót eltávolitottuk, Ezután a HUVEC-hez 0, 1 $ zselatint, 50 mM ecet savat tartalmazó metanolt (2:1, t/t) adtunk, A PAF-ot sztandard technikákkal kivontuk, és meghatároztuk a mennyiségét fT.M.Molntyre ·♦* ·· ée munkatársat: ’Oultured Endothellal Cella Syntheslze Both Platelet-Aotivating Eaotor and Prostaoyolin in Response to Histamlne, Bradyklntn and Adenosine Triphosphate, J.Clin. Znvest,, 76, 271-280 (1985)] , A három gátló anyag IC^_Q értékeit a következőkben adjuk meg:

Gátló anyag

IC_so(nM) hirudin

364

trombin által indukált polimorfonukleárís leükoolta (polymorphonuolear leukooyte, továbbiakban PMN) HUVEC-hez való adhéziójára kifejtett hatását is· A HUVEC-et 1 $ borjumagzat szérum tartalmú MÉM-ben növesztettük 24 vályatu lemezeken összefolyásig, A tápközeget eltávolltottuk, és a sejteket kétszer mostuk friss, szérum-mentes közeggel, és azonos közegben inkubáltuk 10—30 percig 37°C-on a szérumban lévő anyagok eltávolítása céljából· Ezután minden vályathoz 1 ml PMN-t (2,5 x 10⁶/ml) adtunk, amelyet előzőleg 37°C-ra kiegyensúlyoztunk, Hagytuk a PMN-t leülepedni a HUVEC mono-rétegre, Ezután szulf o-Tyr^^N-aoeti l-hirudin^_3-g^“et (5 /ug/ral) vagy sóoldatot adtunk minden vályatba, majd rögtön ezt követően trombint (0,1 vagy 1,0 E/ml) adtunk hozzá, A sejteket 5 percen át 37°C-on inkubáltuk, kétszer mostuk,

ée ezután fázlskontraszt-nükroszkópos módszerrel vizsgáltuk, Az odatapadt PMN-eket közvetlenül számláltuk. Az eredmények azt mutatták, hogy a PMN tapadás teljesen megszűnt azokban a mintákban, amelyek szulfo-Tyrg^-N-aoetll-hiruⁿ53-64®^ 1 E/ml tromblnt tartalmaztak, és a tapadás #-ban volt gátolt azon mintákban, amelyek 1,0 E/ml tromblnt tartalmaztak,

24, példa

Az N-aoetll-Arg^j^irudln^h^ásai a kollagénnel Indukált trombooita aggregáolóra

Az N-aoetll-Arg^-hlrudin^^g^-et szllárdfázisu peptldszlntézlssBl állítottuk elő, és >95 $-os tisztaságban nyertük az 1, példában leírt módon eljárva. Ez a peptid egy

Arg-Gly-Asp szekvenciát tartalmaz, amely számos adhéztv fehérje esetében gyakori,amelyek kölcsönhatásba lépnek a trombooita gllkoprotein ITb/TIIa-val [M,D, Plersohbacher és E,Ruoslahtl: Cell Attachment Aotivity of Flbroneotln can be Dulloated by Small Synthetlc Fragments of the Moleoule , Natúré, 309» 3θ“33 ( Ι9θ*ΐ)ί ·

Az N-acstll-Arg^j-hirudin^^g^ antíkoaguláns aktivitását a 12, példában leírt APTT vizsgálattal tanulmányoztuk, Az N-aoetll-Arg^j-hlrudln^^^^ antíkoaguláns aktivitásának 7®, 9 %-át mutatta az N-acetil-hirudín^^g^ aktivitásának. Az N-acetll-Arg^j-hlrudin^j^g^ trombooita :··· ··· ···

• · · · •· ·· ··· — 68 — aktiválódást gátló hatását is meghatároztuk a 22. példában leírttal azonos módszerrel, kivéve, hogy a trombodta aggregáclót vagy kollagén (40 yug/ml) vagy ADP (10 yuM) adásával stimuláltuk, A 17« ábra azt mutatja, hogy az N-acetll“Arg₅₃-hlrudin₅₃_₆₄ a trombodta aggregáolót dózistól függő mértékben gátolja, az iC^o közelítőleg 190 yug/tnl a kollagénnel előidézett aggregádó esetében és 490 /ug/ml az ADP-Vel előidézett aggregádó esetében.

Ezek az eredmények azt mutatják, hogy az N-aoe— til-Arg₅₃-hlrudin_53<-ÓZ} képes blokkolni a trombln által közvetített trombózist akár a fibrinogén hasítása, akár a tromboclták aktiválásának az utján, valamint akár kollagén nel, ADP-vel, eplnefrinnel, tromboxán Ag-vel vagy bármely más trombooltát aktiváló vegyülettel előidézett trombocltátói függő trombózis esetében. Ezen kívül az Arg-Gly-Asp szekvencia a trombushoz Irányíthatja ezt a peptldet, és Így növeli ezen a helyen a trombln gátló anyag koncentrádó ját,

25, példa

A tromblnnal kovalens komplexet létrehozni képes hlrudln peptid analógok szintézise

A hlrudln analóg dlnitro-fenil-szulf o-Tyr^hLrudin^^g^-et (továbbiakban DNF^szulfo-Tyr^^irudin^^^g^) sztöchlometrlkus mennyiségeit dinttro-dlfluor-benzollal (DNDEB) reagáltatva

dimetil-formamidban, A reakcióelegyet 24 órán át inkubáltuk 22°C-on, és ezután vákuumban megszárltottuk, és 0, 1 % TEA tartalmú vízben ismét felold ottuk, A kapott terméket HPLO kromatografálással választottuk el Aquapore RP—300 Cg oktaszllll oszlopon (0,46 x 3,0 om). Az oszlopot előzőleg 0, 1 % TEA tartalmú vízzel kiegyensúlyoztuk, A minta felvitele után a kromatogrammot O-tól 50 $~ig lineáris gradiensen növekvő koncentrációjú B-oldattal (0,005 $ TFA/70 % aceto— nLtril) fejlesztettük ki 45 percen keresztül, Az átfolyó oldat abszorpcióját 2 14 nm-nél folymatosan ellenőriztük, A

DNF-szulfo-Tyrgyhlrudl a B-oldószer 4θ %-ánál eluáló— dott,

A hirudin nttroanizolgjhlrudln^.,^ analógját két lépéses módszerrel szintetizáltuk, Először metoxltlro zllgyirudln^^.gy®·* szintetizáltunk szilárd fázisú technikával az 1, példában leírt módon a Boc-O-Leu gyantát a szintézis során Boc-O-met oxi-tlrozln gyantával helyettesít ve, A pepiidet lehasitottuk a gyantáról, és HPLC-vel tisztítottuk Vydac oszlopon, amint azt az 1, példában leírtuk, Ezt követően a tisztított metoxi-tlrozllgyhlrudln^^g^ -at nltráltuk feleslegben adva hozzá 20 mM-os Tris/HCl-ben (pH a 8,0) lévő tetramtro-metánt, A reakcióelegyet 4 órán át ítíkubáltuk 27°C-on, A kapott termékeket lloflllzáltuk, 20 mM-os ansnónium-hldrogén-karbonát oldatban ismét feloldottuk, és Biogél P-4 oszlopon ( 1 x 30 om) sóment esi tettük, amely oszlopot 20 tnM—os ammónium-hidrogén-karbonát-oldattal

elválasztását HPLC—Vei végeztük Aquapore RP—300 Οθ oktaszilíl oszlopon (0,46 x 3,θ cm) a fent leírtak szerint·

26, példa

szulfatáltunk a szulfatálásl eljárás során (lásd 10« példa)·

moláris feleslegét adtuk egy oldathoz, amely 0,35 mmól humán tromblnt tartalmazott foszfáttal pufferolt sóoldatban.

Miután az elegyet 3 órán át inkubáltuk, a mintát SDS-pollakrllamld-gél elektroforézlsnek vetettük alá (12,5 % akrilamid). Az autoradlográflát követően láthatóvá tettük a jelzett sávot, amely megfelelt a tromfom méretének. Ha a kapcsolási lépést 50 vagy 5°0-szoros nem jelzett N-acetll-

jelenlétében hajtottuk végre, a kovalens komplex keletkezése blokkolt volt,

Bár az előbbiekben a jelen találmány számos megvalósítási módját megadtuk, nyilvánvaló, hogy az alapelgondolásunkat meg lehet változtatni olyan más megvalósítások lehetővé tétele céljából, amelyek a jelen tá&linány

- 71 tárgykörét az alábbiakban közölt Igénypontok inkább meghatározzák, mint az előbbiekben a példákban megadott specifikus megvalósítások.

Claims (45)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1, Antlkoaguláns aktivitással rendelkező peptid, azzal jellemezve, hogy az adott peptldet a következőkből álló csoportból választjuk ki:

   (a) peptldek, melyekre lényegében a következő képletnek megfelelő aminosav szekvencia Jellemző:

   Asn-Gly—Asp—Phe-Glu—Glu—Ile-Pro—Glu—Glu—Tyr—X;

   és (b) az (a) peptldek D-retro formál;

   amelyekben az X-et COOH-ból, Leuból és Leu-Gln-ből álló os oportból választjuk ki,
2. 2, Antlkoaguláns aktivitással rendelkező peptid, azzal jellemezve, hogy az adott peptldet a következőkből álló csoportból választjuk ki:

   (a) peptid, melyre lényegében a következő képletnek megfelelő aminosav szekvencia jellemző:

   Y-Phe-Glu-Glu—Tle-Pro-Glu-Glu-Tyr-Z;

   és (b) az (a) peptldek D-retro formál:

   amelyekben az Y-t NHg-t, egy amlno-védőcsoportot és a következő aminosav szekvenciának legalább a C-termlnálls részét: Val-Ihr-Gly-Glu-Gly-Thr-Pro-Lys-Pro-Gln-Ser-His-Asn-Asp-Gly-Asp, és a következő aminosav szekvenciának legalább a C-termlnálls részét:

   Val-Thr-Gly-Glu-Gly-Thr-Pro-Asn-Pro-GluSer-Hls-As n-As n-Gly-Asp; tartalmazó csoportból választjuk ki és a Z-t COOH-ból, Leu—ból és Leu-Gln-ből álló csoportból választjuk ki és a tirozin osoport egy negatív töltésű csoportot tartalmaz·
3. 3, A 2, igénypontnak megfelelő peptid, azzal jellemezve, hogy a negatív töltésű csoportot szulfátból, foszfátból, karboxilátból, szulfonátból, foszfonátból, karbonátból, meti1-szulfonátból és meti1-szulfonátból álló csoportból választjuk ki·
4. 4« A 2, igénypontnak megfelelő peptid, azzal jellemezve, hogy a negativ töltésű osoportot szulfátból és szulfonátból álló csoportból választjuk ki·
5. 5, A 4, igénypontnak megfelelő peptid, azzal jellemezve, hogy az Y Asn-Gln-Asp, a Z Leu, és az adott negatív töltésű csoport szulfát, az adott peptid szulf o-

   -64’
6. 6, A 4, igény pontnak megfeldő peptid, azzal jellemezve, hogy az Y Asn-Gln-Asp, a Z Leu, és az adott negatív töltéső csoport szulfonát, az adott peptid szulfonll-Tyr^hí ^maiD53-6ll·'
7. 7· Az 1, vagy 2· igénypontnak megfelelő peptid, azzal jellemezve, hogy az ami no-terminális aminosav N-acetllezett,
8. 8. A 7. igénypontnak megfelelő peptid, azzal et jellemezve, hogy az adott peptfd/szulfo-Tyr^yN-acetll-hlrudin^^^^-ből és N-acetl 1-szulfontl-Tyrg^hlrudl^3-64 -ből álló csoportból választjuk ki,
9. 9, Az 1, vagy 2, Igénypontoknak megfelelő peptid, azzal jellemezve, hogy az amino-terminális aminosav dinttrofluorobenzilezett·
10. 10, Antlkoaguláns aktivitással rendelkező peptid, amely peptid képes a trombinnal kovalens kötést létrehozni, azzal jellemezve, hogy az adott peptldet a következőkből álló csoportból választjuk ki :

    (a) peptid, melyre lényegében a következő képletnek megfelelő aminosav szekvencia jellemző:

    Y-Phe-Glu-Glu-Tle-Pro-Glu-Glu-W; és (b) az (a) peptldek D-retro formál, amelyekben az Y-t NHg-t egy amino-védőosoportót és a következő aminosav szekvenciának legalább a C-termtnálls részét:

    Val-lhr—Tly-Glu-Gly-Thr-Pro-Lys-Pro-Gln-Ser-Hls-Asn-Asp— -Gly-Asp, és a következő aminosav szekvenciának legalább a C-termlnális részét tartalmazó:

    Val-Thr-Gly-Glu-Gly-Thr-Pr o- As n-Pr o~Gln-Ser-Hi s-As n-As n-Gly-Asp csoportból választjuk ki és a V tUtroanlzol,
11. 11, Antlkoaguláns és antitromboclta aktivitással rendelkező peptid, azzal jellemezve, hogy az adott peptldet a következőkből álló csoportból választ juk ki:

    (a) peptid, melyre lényegében a következő képletnek megfelelő aminosav szekvencia jellemző:

    V—Arg—Gly—Asp-Phe-Glu—Glu-Ile—Pro-Glu-Glu—Tyr—Z;

    és (b) az (a) peptldek D-retro formál;

    amelyekben a V-t NH^-t, egy amlno-védőosoportot, a következő aminosav szekvenciának legalább a C-terminális részét: Val—ΊΙιγ—Gly-Glu—Gly-lhr—Pro-Lys-Pro-Gln-Ser—His—Asn, és a következő aminosav szekvenciának legalább a C-terminális részét tartalmazó:

    Va l-Thr—Gly-Glu-Gly -Thr-Pr o-As n- Pr o-Gln-Ser -Hl s - As n csoportból választjuk ki, a Z-t COOH-ból, Leu-ból és Leu-Gln-ből álló csoportból választjuk ki és a tirozin csoport egy negatív töltésű csoportot tartalmaz*
12. 12, Az 1,, 2*, 10, vagy 11. igénypontok bármelyikének megfelelő peptid, azzal jellemezve, hogy az egy gyógyászatilag megfelelő polimerrel konjugált,
13. 13, A 12, Igénypontnak megfelelő peptid, azzal jellemezve, hogy az adott polimer polletllénglikol-N-szukcinimidi 1-s zukoi nát *
14. 14, Az 1,, 2,, 10, vagy 11, igénypontok bármelyikének megfelelő peptid, azzal jellemezve, hogy az adott peptid egy fibrinolitikus szerrel konjugált,
15. 15, Az 1, vagy 2, igénypontok szerinti peptidek peptldomimetikus analógja, azzal jellemezve, hogy az adott analóg gátolja a fibrinogén trombín általi hidrolízisét és antlkoaguláns aktivitással rendelkezik*
16. 16, A 15,igénypont szerinti peptldomimetikus analóg, azzal jellemezve, hogy az adott analógot a hlrulog-1-et, hirulog-2-t, hirulog-3-at, hirulog-4-et, hlrulog-5-öt, • · hirulog-6-ot és hlrulog-7-et tartalmazó csoportból választjuk ki,
17. 17, A 15, vagy 16, igénypontok szerinti peptldomimetikus analóg, azzal jellemezve, hogy az adott peptidomimetlkus analóg egy flbrinoll tlkus szerrel konjugált,
18. 18, Gyógyászatilag megfelelő készítmény a véralvadási idő növelésére betegekben vagy szervezeten kívüli vérben, azzal jellemezve, hogy azí-től 14, igénypontok bármelyikének megfelelő péptldékből és a 15“ 17« igénypontok bármelyike szerinti peptidomimetlkus analógokból álló csoportból kiválasztott legalább egy komponensnek gyógyászati lag hatásos mennyiségét tartalmazza,
19. 19« A 18, Igénypont szerinti készítmény, amely még tartalmaz egy vegyületet, amelyet heparinból és kis molekulatömegü heparinból álló csoportból választunk ki, azzal jellemezve, hogy az adott heparin egy kis molekulatömegü heparin adagja kevesebb, mint amennyi szükséges lenne a kívánt eredmény elérérésére,ha az adott heparint vagy kis molekulatömegü heparint monoterápiás szerként alkalmazzuk,
20. 20, A 19, igénypontnak megfelelő készítmény, azzal jellemezve, hogy az adott heparin vagy kis molekulatömegű heparin kevesebb, mint 2500-tól 5000 egység,
21. 21, A 18-20, igénypontok bármelyike szerinti készítmény, azzal jellemezve,hogy az adott készítmény még egy flbronolitikus szer hatásos mennyiségét is tartalmazza.
22. 22, Módszer egy betegben vagy szervezeten kívüli vérben a véralvadási idő növelésére, azzal jellemezve, hogy az adott beteg vagy az adott szervezeten kívüli vér kezelési lépése gyógyászatllag megfelelő módon a 18-21, igénypontok bármelyike szerinti készítménnyel történik,
23. 23, Módszer egy betegben érrendszeri betegség megelőzésére vagy kezelésére, azzal jellemezve, hogy az az adott beteg gyógyászatilag megfelelő kezelési lépését foglalja magában a 18-21, igénypontok bármelyikének megfelelő készítménnyel,
24. 24« A 18-21, igénypontok bármelyikének megfelelő készítmény érrendszeri betegség megelőzésére vagy kezelésére,
25. 25, Készítmény az IXa faktor, Xa faktor, trombln vagy ezek keveréke mennyiségének a meghatározására biológiai mintában, azzal jellemezve, hogy az adott készítmény az 1-6, igénypontok bármelyikének megfelelő legalább egy peptidet magában foglal,
26. 26, Módszer az IXa faktor, Xa faktor, trombln vag^zek keveréke konoentráolójának a meghatározására egy biológiai mintában, azzal jellemezve, hogy az adott módszer egy olyan lépésből áll, amely az adott mintát a 25, Igénypontnak megfelelő készítménnyel hozza érintkezésbe,
27. 27, Diagnosztikai készlet az IXa faktor, Xa faktor, trombln vagy ezek keveréke vizsgálatára biológiai mintában,azzal jellemezve, hogy a készlet az 1-6, igénypontok bármelyikének megfelelő legalább egy peptidet magában foglal,
28. 28, Gyógyászatilag megfelelő készítmény a metasztatikus tumorok növekedésének a gátlására, azzal jellemezve, hogy az adott készítmény gyógyászatilag hatásos mennyiségben magában foglal legalább egyet az 1-14« Igénypontok bármelyikének megfelelő peptldekből és a 15-17, Igénypontoknak megfelelő peptidomimetikus analógokból álló csoportból,
29. 29, Módszer betegekben a metasztatikus tumorok növekedésének a gátlására, azzal jellemezve, hogy az adott módszer az adott beteg ke eb lésének egy lépését foglalja magában, amely gyógyászatilag megfelelő módon a 28, igénypontnak megfelelő készítménnyel történik,
30. 30, A 29· igénypont szerinti módszer, azzal jellemezve, hogy az adott metasztatikus tumor egy karoinóma, tudó karoinóma, máj karoinóma, osont karoinóma és neoplasztlkus sejt karoinóma osoportba tartozik,
31. 31, Az 1,, 2,, 7,, 9,, 10, vagy 11, Igénypontok bármelyikének megfelelő peptid, azzal jellemezve, hogy az adott peptid ^²^T-t, ^²^I-t és ¹^In-t tartalmazó osoportból választott radloizotóppal jelzett,
32. 32, Készítmény a fibrin vagy tromboclta trombus ex vívó képének a megállapítás ára egy beteg esetében, azzal jellemezve, hogy az a 31, igénypont szerinti peptldet foglalja magában,
33. 33, Módszer a fibrin vagy tromboclta trombus t 9

    9*e· ex vivő képének a megállapítására betegben, azzal jellemezve, hogy az a következő lépésekből áll:

    (a) a betegnek a 32, igénypont szerinti készítményt adjuk; és (b) és kimutatási eszköz alkalmazunk az adott készítmény megfigyelésére,
34. 34« Készítmény egy betegbe bevezetett eszköz felületének a bevonására, azzal jellemezve, hogy az adott készítmény legalább egyet tartalmaz az 1-14, Igénypontok bármelyikének megfelelő peptidékből és a 15** 17, Igénypontok bármelyikének megfelelő peptldomlmetlkus analógokból,
35. 35, Módszer egy betegbe bevezetett eszköz felületének a bevonására, azzal jellemezve,hogy az adott módszer magában foglalja az adott felület érintkezését a 34, igénypontnak megfelelő készítménnyel,
36. 36, Gyógyszerkészítmény betegekben a véralvadási Idő növelésére és a tromboolta aktiválás gátlására, azzal jellemezve, hogy az adott készítmény a ;11, igénypontnak megfelelő peptid gyógyászatilag hatásos mennyiségét tartalmazza,
37. 37« Módszer betegekben a véralvadási idő növelésére és a tromboolta aktiválódás gátlására, azzal jellemezve, hogy az adott tromboolta aktiválódást bármely szer indukálja, az adott módszer magában foglalja az adott beteg kezelésének egy lépését a 36, igénypont szerinti készítménnyel, •4·· 44 ·· · • · 4 4 4·

    444 ·4 4 ·« ··· ·« ··44«

    - 80
38. 38· Gyógyszerkészítmény betegben a trombin által indukált trombodta aktiválódás és a trombin által indukált endoteüálls sejt aktiválódás gátlására, azzal jellemezve, hogy az adott készítmény az 1-8, igénypontok bármelyikének megfelelő pepiidnek a gyógyászatilag hatásos kis adagját tartalmazza, amely adott kis adag körülbelül 0,0001 mg/tesfítömeg-kg és körülbelül 0,099 mg/testtömeg-kg között van,
39. 39, Módszer betegekben trombin által indukált trombodta aktiválódás és trombin által indukált endotellálls sejt aktiválódás gátlására, azzal jellemezve, hogy az adott módszer az adott beteg 38, igénypont szerinti készítménnyel történő kezelésének a lépését foglalja magában·
40. 40, Gyógyászatilag megfelelő készítmény betegek trombin által indukált gyulladásának a kezelésére, azzal jellemezve, hogy az adott készítmény az 1-8, igénypontok bármelyikének megfelelő peptid gyógyászatilag hatásos

    (.foglalja. ₇ kis adagjátjSagában,áz adott kis adag körülbelül 0,0001 mg/testtömeg—kg és körülbelül 0, 099 mg/testtömeg-kg között van·
41. 41, Módszer betegekben trombin által előidézett gyulladás kezelésére, azzal jellemezve, hogy aa adott módszer a betegnek a 4θ· Igénypontnak megfelelő készítmény adásának a lépését foglalja magában,
42. 42, A 41« igénypont szerinti módszer, azzal jellemezve, hogy az adott trombin által előidézett gyulla··«» 99 99 · • e ♦ 9 · ·

    999 99 9 9 9

    9 9 9 9 9 9

    999 99 99 999 f

    dás a felnőttkort légzési elégtelenségl tünet, szeptikus sokk, szeptikénna és reperfuzlós károsodás csoportjába tartozik,
43. 43, Módszer egy peptld vagy pollpeptld tlrozín csoportjának a szulf a tálás ára, azzal jellemezve, hogy az adott módszer a következő lépésekből áll:

    (a) az adott peptld vagy pollpeptld oldása egy szerves oldószerben;

    (b) az adott oldott peptld vagy pollpeptld reagáltatása egy dehlratáló reagenssel az adott peptld vagy pollpeptld tlrozln csoportjának a dehldrálása céljából; és (o) az adott dehidrált tlrozln csoport szulfatálása kénsav cseppenkéntl adagolásával az adott oldott peptldhez vagy pollpeptidhez nüog csapadék képződik,
44. 44, A 43· igénypont szerinti módszer, azzal jellemezve, hogy az adott peptldet N-aoetil-hirudln^^.gy -bői és hírudin^^gyből álló csoportból választjuk ki,
45. 45, A 43, Igénypont szerinti módszer, azzal jellemezve, hogy az adott szerves oldószer dlmetll-formamld és az adott dehldratáló reagens dioiklohexil-karbodilmid.