HU226662B1 - Nucleic acids coding for ezf-rb fusion polypeptides and expression vectors containing the same - Google Patents
Nucleic acids coding for ezf-rb fusion polypeptides and expression vectors containing the same Download PDFInfo
- Publication number
- HU226662B1 HU226662B1 HU9903864A HUP9903864A HU226662B1 HU 226662 B1 HU226662 B1 HU 226662B1 HU 9903864 A HU9903864 A HU 9903864A HU P9903864 A HUP9903864 A HU P9903864A HU 226662 B1 HU226662 B1 HU 226662B1
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- cells
- promoter
- vector
- tissue
- expression
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims description 53
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims description 50
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims description 48
- 230000004927 fusion Effects 0.000 title claims description 44
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title claims description 26
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 title claims description 18
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title claims description 13
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title claims description 13
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 50
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 31
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 claims description 28
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 claims description 28
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 26
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 23
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 claims description 19
- 210000002460 smooth muscle Anatomy 0.000 claims description 19
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 15
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 13
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 13
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 10
- 201000000582 Retinoblastoma Diseases 0.000 claims description 9
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 9
- 206010053759 Growth retardation Diseases 0.000 claims description 7
- 102000002554 Cyclin A Human genes 0.000 claims description 6
- 108010068192 Cyclin A Proteins 0.000 claims description 6
- 230000010076 replication Effects 0.000 claims description 6
- 102000001388 E2F Transcription Factors Human genes 0.000 claims description 5
- 108010093502 E2F Transcription Factors Proteins 0.000 claims description 5
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 claims description 3
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 claims description 3
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 claims description 3
- 230000002950 deficient Effects 0.000 claims 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 120
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 45
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 29
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 28
- 102100022644 26S proteasome regulatory subunit 4 Human genes 0.000 description 23
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 20
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 20
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 19
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 18
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 18
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 17
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 16
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 15
- 210000000329 smooth muscle myocyte Anatomy 0.000 description 15
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 13
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 13
- 230000003463 hyperproliferative effect Effects 0.000 description 13
- 238000000034 method Methods 0.000 description 13
- WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N beta-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N 0.000 description 12
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 12
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 12
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 11
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 11
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 10
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 10
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 9
- 210000001715 carotid artery Anatomy 0.000 description 9
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 9
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 8
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 8
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 7
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 7
- 238000005734 heterodimerization reaction Methods 0.000 description 7
- 108700038605 human Smooth muscle Proteins 0.000 description 7
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 7
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 7
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 6
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 6
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 6
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 6
- 102000043827 human Smooth muscle Human genes 0.000 description 6
- 208000037803 restenosis Diseases 0.000 description 6
- 230000037426 transcriptional repression Effects 0.000 description 6
- 101710155964 Diuretic hormone 1 Proteins 0.000 description 5
- 208000034827 Neointima Diseases 0.000 description 5
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 5
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 5
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 5
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 5
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 5
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 5
- 210000000663 muscle cell Anatomy 0.000 description 5
- 108700038606 rat Smooth muscle Proteins 0.000 description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 102100022005 B-lymphocyte antigen CD20 Human genes 0.000 description 4
- 108020004638 Circular DNA Proteins 0.000 description 4
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 4
- 101000897405 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD20 Proteins 0.000 description 4
- 241001135569 Human adenovirus 5 Species 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 230000018199 S phase Effects 0.000 description 4
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 4
- 238000002399 angioplasty Methods 0.000 description 4
- 201000008275 breast carcinoma Diseases 0.000 description 4
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical group C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 4
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 4
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 4
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 4
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 4
- 230000008692 neointimal formation Effects 0.000 description 4
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 4
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 4
- 230000023603 positive regulation of transcription initiation, DNA-dependent Effects 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 description 4
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108050002653 Retinoblastoma protein Proteins 0.000 description 3
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 3
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 210000001168 carotid artery common Anatomy 0.000 description 3
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 3
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 3
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 3
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 3
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 208000002154 non-small cell lung carcinoma Diseases 0.000 description 3
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 3
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 3
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 3
- WEXRUCMBJFQVBZ-UHFFFAOYSA-N pentobarbital Chemical compound CCCC(C)C1(CC)C(=O)NC(=O)NC1=O WEXRUCMBJFQVBZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 3
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 description 3
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 3
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 3
- 230000000754 repressing effect Effects 0.000 description 3
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 3
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 3
- OYHQOLUKZRVURQ-NTGFUMLPSA-N (9Z,12Z)-9,10,12,13-tetratritiooctadeca-9,12-dienoic acid Chemical compound C(CCCCCCC\C(=C(/C\C(=C(/CCCCC)\[3H])\[3H])\[3H])\[3H])(=O)O OYHQOLUKZRVURQ-NTGFUMLPSA-N 0.000 description 2
- WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N (E)-8-Octadecenoic acid Natural products CCCCCCCCCC=CCCCCCCC(O)=O WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 20:1omega9c fatty acid Natural products CCCCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 9-Heptadecensaeure Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 108090000943 Cholesterol 7-alpha-monooxygenases Proteins 0.000 description 2
- 102000004410 Cholesterol 7-alpha-monooxygenases Human genes 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 206010012689 Diabetic retinopathy Diseases 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101001111338 Homo sapiens Neurofilament heavy polypeptide Proteins 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000009869 Neu-Laxova syndrome Diseases 0.000 description 2
- 102100024007 Neurofilament heavy polypeptide Human genes 0.000 description 2
- 108010077850 Nuclear Localization Signals Proteins 0.000 description 2
- 239000005642 Oleic acid Substances 0.000 description 2
- ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N Oleic acid Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000012288 Phosphopyruvate Hydratase Human genes 0.000 description 2
- 108010022181 Phosphopyruvate Hydratase Proteins 0.000 description 2
- 102000004022 Protein-Tyrosine Kinases Human genes 0.000 description 2
- 108090000412 Protein-Tyrosine Kinases Proteins 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- 229930182558 Sterol Natural products 0.000 description 2
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 2
- 108700029229 Transcriptional Regulatory Elements Proteins 0.000 description 2
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 2
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 239000008365 aqueous carrier Substances 0.000 description 2
- 210000001367 artery Anatomy 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 108010006025 bovine growth hormone Proteins 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N eosin Chemical compound [Na+].OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(Br)C(=O)C(Br)=C2OC2=C(Br)C(O)=C(Br)C=C21 YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 2
- IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N hexadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FUZZWVXGSFPDMH-UHFFFAOYSA-N hexanoic acid Chemical compound CCCCCC(O)=O FUZZWVXGSFPDMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 2
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 2
- -1 inhalation Substances 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 102000028416 insulin-like growth factor binding Human genes 0.000 description 2
- 108091022911 insulin-like growth factor binding Proteins 0.000 description 2
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 2
- QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N isooleic acid Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCCC(O)=O QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L magnesium stearate Chemical compound [Mg+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 230000011278 mitosis Effects 0.000 description 2
- WWZKQHOCKIZLMA-UHFFFAOYSA-N octanoic acid Chemical compound CCCCCCCC(O)=O WWZKQHOCKIZLMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N oleic acid Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N 0.000 description 2
- 235000021313 oleic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 2
- 229960001412 pentobarbital Drugs 0.000 description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 2
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 2
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 2
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 2
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 239000003380 propellant Substances 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 150000003432 sterols Chemical class 0.000 description 2
- 235000003702 sterols Nutrition 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 2
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 description 1
- ICLYJLBTOGPLMC-KVVVOXFISA-N (z)-octadec-9-enoate;tris(2-hydroxyethyl)azanium Chemical compound OCCN(CCO)CCO.CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O ICLYJLBTOGPLMC-KVVVOXFISA-N 0.000 description 1
- IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 1-palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCC IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 0.000 description 1
- GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 1-prop-2-ynoxypropan-2-ol Chemical compound CC(O)COCC#C GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HSTOKWSFWGCZMH-UHFFFAOYSA-N 3,3'-diaminobenzidine Chemical compound C1=C(N)C(N)=CC=C1C1=CC=C(N)C(N)=C1 HSTOKWSFWGCZMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CYDQOEWLBCCFJZ-UHFFFAOYSA-N 4-(4-fluorophenyl)oxane-4-carboxylic acid Chemical compound C=1C=C(F)C=CC=1C1(C(=O)O)CCOCC1 CYDQOEWLBCCFJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020003589 5' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 1
- 108010051457 Acid Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 102000013563 Acid Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 102100023635 Alpha-fetoprotein Human genes 0.000 description 1
- 239000004382 Amylase Substances 0.000 description 1
- 102000013142 Amylases Human genes 0.000 description 1
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 description 1
- 102000005427 Asialoglycoprotein Receptor Human genes 0.000 description 1
- 206010004446 Benign prostatic hyperplasia Diseases 0.000 description 1
- 239000004604 Blowing Agent Substances 0.000 description 1
- 201000011057 Breast sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 108010074051 C-Reactive Protein Proteins 0.000 description 1
- 102100032752 C-reactive protein Human genes 0.000 description 1
- 101100478314 Caenorhabditis elegans sre-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010035563 Chloramphenicol O-acetyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 102100035371 Chymotrypsin-like elastase family member 1 Human genes 0.000 description 1
- 101710138848 Chymotrypsin-like elastase family member 1 Proteins 0.000 description 1
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 1
- 102000012422 Collagen Type I Human genes 0.000 description 1
- 108010022452 Collagen Type I Proteins 0.000 description 1
- 102000004420 Creatine Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108010042126 Creatine kinase Proteins 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 1
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 1
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 108010069091 Dystrophin Proteins 0.000 description 1
- 102000001039 Dystrophin Human genes 0.000 description 1
- 101710099240 Elastase-1 Proteins 0.000 description 1
- 238000012413 Fluorescence activated cell sorting analysis Methods 0.000 description 1
- 102000001390 Fructose-Bisphosphate Aldolase Human genes 0.000 description 1
- 108010068561 Fructose-Bisphosphate Aldolase Proteins 0.000 description 1
- 102100039556 Galectin-4 Human genes 0.000 description 1
- 102100028652 Gamma-enolase Human genes 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 1
- 101710103262 Glandular kallikrein Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 206010018498 Goitre Diseases 0.000 description 1
- 102100021186 Granulysin Human genes 0.000 description 1
- 102100030385 Granzyme B Human genes 0.000 description 1
- 208000003807 Graves Disease Diseases 0.000 description 1
- 208000015023 Graves' disease Diseases 0.000 description 1
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 1
- 101710155188 Hexon-interlacing protein Proteins 0.000 description 1
- 101000946384 Homo sapiens Alpha-lactalbumin Proteins 0.000 description 1
- 101000942118 Homo sapiens C-reactive protein Proteins 0.000 description 1
- 101100273713 Homo sapiens CD2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101000608765 Homo sapiens Galectin-4 Proteins 0.000 description 1
- 101001040751 Homo sapiens Granulysin Proteins 0.000 description 1
- 101001009603 Homo sapiens Granzyme B Proteins 0.000 description 1
- 101000840558 Homo sapiens Hexokinase-4 Proteins 0.000 description 1
- 101000854886 Homo sapiens Immunoglobulin iota chain Proteins 0.000 description 1
- 101000840267 Homo sapiens Immunoglobulin lambda-like polypeptide 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000742859 Homo sapiens Retinoblastoma-associated protein Proteins 0.000 description 1
- 101000766306 Homo sapiens Serotransferrin Proteins 0.000 description 1
- 101001049954 Human adenovirus C serotype 2 Early 4 ORF6 protein Proteins 0.000 description 1
- 241000700588 Human alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 1
- 241000701024 Human betaherpesvirus 5 Species 0.000 description 1
- 102000004286 Hydroxymethylglutaryl CoA Reductases Human genes 0.000 description 1
- 108090000895 Hydroxymethylglutaryl CoA Reductases Proteins 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 102100020744 Immunoglobulin iota chain Human genes 0.000 description 1
- 102100029616 Immunoglobulin lambda-like polypeptide 1 Human genes 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 201000011062 Li-Fraumeni syndrome Diseases 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010057281 Lipocalin 1 Proteins 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 241000713869 Moloney murine leukemia virus Species 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 101000892448 Neisseria gonorrhoeae Type II restriction enzyme NgoMIV Proteins 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 108700019961 Neoplasm Genes Proteins 0.000 description 1
- 102000048850 Neoplasm Genes Human genes 0.000 description 1
- CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N O-Xylene Chemical compound CC1=CC=CC=C1C CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 1
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000021314 Palmitic acid Nutrition 0.000 description 1
- 102000016387 Pancreatic elastase Human genes 0.000 description 1
- 108010067372 Pancreatic elastase Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 208000018262 Peripheral vascular disease Diseases 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- RVGRUAULSDPKGF-UHFFFAOYSA-N Poloxamer Chemical compound C1CO1.CC1CO1 RVGRUAULSDPKGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010039918 Polylysine Proteins 0.000 description 1
- 108010072866 Prostate-Specific Antigen Proteins 0.000 description 1
- 102100038358 Prostate-specific antigen Human genes 0.000 description 1
- 208000004403 Prostatic Hyperplasia Diseases 0.000 description 1
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 1
- 102100036547 Protein phosphatase 1 regulatory subunit 12A Human genes 0.000 description 1
- 102100027384 Proto-oncogene tyrosine-protein kinase Src Human genes 0.000 description 1
- 101710122944 Proto-oncogene tyrosine-protein kinase Src Proteins 0.000 description 1
- 201000004681 Psoriasis Diseases 0.000 description 1
- 101150020201 RB gene Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 102000040739 Secretory proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091058545 Secretory proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 235000021355 Stearic acid Nutrition 0.000 description 1
- 108010055297 Sterol Esterase Proteins 0.000 description 1
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- 229940100514 Syk tyrosine kinase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 101100388071 Thermococcus sp. (strain GE8) pol gene Proteins 0.000 description 1
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 102000003848 Uteroglobin Human genes 0.000 description 1
- 108090000203 Uteroglobin Proteins 0.000 description 1
- 206010047139 Vasoconstriction Diseases 0.000 description 1
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 1
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101000756604 Xenopus laevis Actin, cytoplasmic 1 Proteins 0.000 description 1
- HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N [3-[hydroxy(2-hydroxyethoxy)phosphoryl]oxy-2-[(e)-octadec-9-enoyl]oxypropyl] (e)-octadec-9-enoate Chemical compound CCCCCCCC\C=C\CCCCCCCC(=O)OCC(COP(O)(=O)OCCO)OC(=O)CCCCCCC\C=C\CCCCCCCC HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000001919 adrenal effect Effects 0.000 description 1
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 1
- 108010026331 alpha-Fetoproteins Proteins 0.000 description 1
- OBETXYAYXDNJHR-UHFFFAOYSA-N alpha-ethylcaproic acid Natural products CCCCC(CC)C(O)=O OBETXYAYXDNJHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019418 amylase Nutrition 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000004873 anchoring Methods 0.000 description 1
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 108010006523 asialoglycoprotein receptor Proteins 0.000 description 1
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 210000003443 bladder cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 1
- 201000008274 breast adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000006172 buffering agent Substances 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000000269 carotid artery external Anatomy 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000035572 chemosensitivity Effects 0.000 description 1
- 210000000038 chest Anatomy 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- 238000012761 co-transfection Methods 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 230000030944 contact inhibition Effects 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 230000002900 effect on cell Effects 0.000 description 1
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 1
- 238000013156 embolectomy Methods 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 230000012202 endocytosis Effects 0.000 description 1
- 210000004696 endometrium Anatomy 0.000 description 1
- 210000001163 endosome Anatomy 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 1
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 125000005456 glyceride group Chemical group 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 210000005003 heart tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 1
- 231100000844 hepatocellular carcinoma Toxicity 0.000 description 1
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 description 1
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000002998 immunogenetic effect Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000013546 insoluble monolayer Substances 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000010262 intracellular communication Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 1
- 239000000787 lecithin Substances 0.000 description 1
- 229940067606 lecithin Drugs 0.000 description 1
- 235000010445 lecithin Nutrition 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000004973 liquid crystal related substance Substances 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- ZLNQQNXFFQJAID-UHFFFAOYSA-L magnesium carbonate Chemical compound [Mg+2].[O-]C([O-])=O ZLNQQNXFFQJAID-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000001095 magnesium carbonate Substances 0.000 description 1
- 229910000021 magnesium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019359 magnesium stearate Nutrition 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 210000004779 membrane envelope Anatomy 0.000 description 1
- 230000004630 mental health Effects 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 239000000693 micelle Substances 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 238000007431 microscopic evaluation Methods 0.000 description 1
- 231100000782 microtubule inhibitor Toxicity 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000000329 molecular dynamics simulation Methods 0.000 description 1
- 238000007491 morphometric analysis Methods 0.000 description 1
- 230000036457 multidrug resistance Effects 0.000 description 1
- WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N n-Pentadecanoic acid Natural products CCCCCCCCCCCCCCC(O)=O WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Natural products CCCCCCCC(C)CCCCCCCCC(O)=O OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 239000003002 pH adjusting agent Substances 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229930029653 phosphoenolpyruvate Natural products 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 229920001992 poloxamer 407 Polymers 0.000 description 1
- 229940044476 poloxamer 407 Drugs 0.000 description 1
- 229920000656 polylysine Polymers 0.000 description 1
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M propidium iodide Chemical compound [I-].[I-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CCC[N+](C)(CC)CC)=C1C1=CC=CC=C1 XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 1
- XNSAINXGIQZQOO-SRVKXCTJSA-N protirelin Chemical compound NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H]1NC(=O)CC1)CC1=CN=CN1 XNSAINXGIQZQOO-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- 230000010837 receptor-mediated endocytosis Effects 0.000 description 1
- 230000007115 recruitment Effects 0.000 description 1
- 230000022983 regulation of cell cycle Effects 0.000 description 1
- 230000021014 regulation of cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 230000008844 regulatory mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- CVHZOJJKTDOEJC-UHFFFAOYSA-N saccharin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)NS(=O)(=O)C2=C1 CVHZOJJKTDOEJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 210000002027 skeletal muscle Anatomy 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000001540 sodium lactate Substances 0.000 description 1
- 229940005581 sodium lactate Drugs 0.000 description 1
- 235000011088 sodium lactate Nutrition 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000008247 solid mixture Substances 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 235000010356 sorbitol Nutrition 0.000 description 1
- 238000013222 sprague-dawley male rat Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000008117 stearic acid Substances 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 150000005846 sugar alcohols Polymers 0.000 description 1
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 239000000454 talc Substances 0.000 description 1
- 229910052623 talc Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 1
- 108091006107 transcriptional repressors Proteins 0.000 description 1
- 230000037317 transdermal delivery Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 229940117013 triethanolamine oleate Drugs 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 238000007631 vascular surgery Methods 0.000 description 1
- 230000025033 vasoconstriction Effects 0.000 description 1
- 210000001835 viscera Anatomy 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 description 1
- 239000008096 xylene Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4736—Retinoblastoma protein
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
- A61P13/08—Drugs for disorders of the urinary system of the prostate
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/06—Antipsoriatics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
- A61P27/02—Ophthalmic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2799/00—Uses of viruses
- C12N2799/02—Uses of viruses as vector
- C12N2799/021—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid
- C12N2799/022—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid where the vector is derived from an adenovirus
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Ophthalmology & Optometry (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Hydrogenated Pyridines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
A retinoblasztómagén (RB) és az E2F jelű transzkripciós faktor egyaránt kritikus szerepet játszik a sejtnövekedés szabályozásában [összefoglaló irodalmat lásd Adams, P. & Kaelin, W., Seminars in Cancer Biology 6, 99-108 (1995)]. Az RB-lokusz gyakran inaktiválódik különféle humán tumorsejtekben. Vad típusú RB-gén [például Bookstein et al., Science 247, 712-715 (1990)] vagy RB-fehérje (pRB) [például Antelman et al., Oncogene 10, 697-704 (1995)] visszavitele RBneg/RBmut-sejtekbe szuppresszálhatja a tenyészet növekedését és in vivő tumorgenitását (tumorképző képességét).
Mivel az E2F S-fázisú gének transzkripciójának aktiválására szolgál, aktivitását RB-vel megfelelő célra irányíthatjuk. Az RB rögzíti a sejteket úgy, hogy blokkolja a G-ből az S-fázisba jutást [például Dowdy et al., Cell 73, 499-511 (1993)], de a rögzítés pontos folyamata tisztázatlan maradt.
Bár az E2F képes komplexet kialakítani RB-vel, a komplex kialakulása hatékonyabb, ha E2F-fel rokon szerkezetű fehérje, DP-1 van jelen. E2F-1 és DP-1 stabil heterodimert alakítanak ki, amely DNS-hez képes kötődni [például Qin et al., Genes and Dev. 6, 953-964 (1992)]. DP-1-E2F-komplexek E2F-függő gének transzkripciójának kooperatív aktiválására szolgálnak. Ilyen transzkripció pRB-vel ugyanazon úton represszálható, mint az E2F-1 vagy DP-1 által aktivált transzkripció.
Gének RB-vel való transzkripciós repressziója bizonyos esetekben elérhető úgy, hogy pRB-t kapcsolunk egy promoterhez. Például GAL4-pRB-fúziók GAL4-DNS-kötő doménekhez kötődnek, és transzkripciót represszálnak p53-, Sp-1- vagy AP-1-elemekben [Adnane et al., J. Bioi. Chem. 270, 8837-8843 (1995); Weintraub et al., Natúré 358, 259-261 (1995)]. Sellers és munkatársai [Proc. Natl. Acad. Sci. 92, 11544-11548 (1995)] leírták az E2F 1-368. aminosavcsoportjainak fúzióját az RB 379-792. vagy 379-928. csoportjaival.
Chang és munkatársai [Science 267, 518-521 (1995)] leírtak replikációdefektív adenovírus-RB-konstrukció alkalmazását neointima kialakulásának csökkentésére két resztenózisos (egy hiperproliferatív rendellenesség) állatmodellben.
A találmány tárgya azon a meglepő eredményen alapul, hogy E2F-polipeptidből és RB-polipeptidből álló fúzió hatékonyabb E2F-promoter által vezérelt transzkripció repressziójában, mint RB egyedül, és ezek a fúziók sejtciklusrögzítést képesek okozni sokféle sejttípusban. Ilyen fúziókra mielőbbi szükség van hiperproliferatív rendellenességek, például rák terápiájában.
A találmány tárgya egyik vonatkozásában egy polipeptid, amely egy transzkripciós faktor (a transzkripciós faktor DNS-kötő domént tartalmaz) és egy retinoblasztómapolipeptid (RB-polipeptid) (a retinoblasztómapolipeptid növekedési szuppressziós domént tartalmaz) fúzióját tartalmazza. A találmány tárgya más vonatkozásában ilyen fúziós polipeptidet kódoló DNS. A DNS inszertálva lehet adenovírusvektorba.
A találmány néhány megvalósítási módja szerint a transzkripciós faktor E2F. Az E2F ciklin-A-kötő doménje deletálva lehet, vagy funkcióképtelen lehet. Az E2F körülbelül a 95-194. aminosavcsoportokat vagy a találmány néhány előnyös megvalósítási módja szerint körülbelül a 95-286. aminosavcsoportokat tartalmazhatja.
A retinoblasztómapolipeptid lehet vad típusú RB, RB56 vagy ezek variánsa vagy fragmentuma. A találmány néhány előnyös megvalósítási módja szerint a retinoblasztómapolipeptid körülbelül 379-928. aminosavcsoportokat tartalmaz. Előnyös aminosavszubsztitúciók az RB-polipeptidben a 2., 608., 788., 807. és 811. helyzetben vannak.
A találmány tárgya másik vonatkozásában olyan polipeptidet kódoló DNS-t tartalmazó expressziós vektor, amely polipeptid egy transzkripciós faktor (a transzkripciós faktor DNS-kötő domént tartalmaz) és egy retinoblasztómapolipeptid (RB-polipeptid) (a retinoblasztómapolipeptid növekedési szuppressziós domént tartalmaz) fúzióját tartalmazza. A találmány néhány előnyös megvalósítási módja szerint egy szövetspecifikus promoter működőképesen kapcsolódik a fúziós polipeptidet kódoló DNS-hez. A szövetspecifikus promoter lehet simaizomból származó alfa-aktinpromoter.
A találmány szerinti E2F-RB fúziós polipeptidek alkalmazhatók hiperproliferatív rendellenességek kezelésére. A hiperproliferatív rendellenesség lehet rák. A találmány néhány előnyös megvalósítási módja szerint a hiperproliferatív rendellenesség resztenózis. A fúziós polipeptidet vagy a fúziós polipeptidet kódoló nukleinsavat érsebészetben (angioplasztikában) használt eszközök bevonására is alkalmazhatjuk.
Az 1A. ábrán az E2F előre látható aminosavszekvenciáját ábrázoljuk.
Az 1B. ábrán az E2F transzkripciós faktor nukleotidszekvenciáját ábrázoljuk.
A 2A. ábrán a pRB nukleotidszekvenciáját ábrázoljuk, Lee és munkatársai közleménye alapján [Natúré 329, 642-645 (1987)].
A 2B. ábrán a pRB kikövetkeztethető aminosavszekvenciáját ábrázoljuk.
A 3. ábrán a pCTM plazmid grafikus ábrázolása látható.
A 4. ábrán a pCTM plazmid nukleotidszekvenciája látható.
A 5. ábrán a pCTMI plazmid grafikus ábrázolása látható.
A 6. ábrán a pCTMI plazmid nukleotidszekvenciája látható.
A 7. ábrán a pCTMlE plazmid grafikus ábrázolása látható.
A 8. ábrán a pCTMlE plazmid nukleotidszekvenciája látható.
A 9. ábrán bemutatjuk a kísérletekben alkalmazott fúziós konstrukciókat. Valamennyi E2Fkonstrukció a 95. aminosavhelyzetnél kezdődik, és a ciklin-A-kötö dómén részei hiányoznak belőlük. Az E2F-437 DNS-kötő domént (fekete), heterodimerizációs domént (fehér) és transzaktivációs domént
HU 226 662 Β1 (árnyalt) tartalmaz. Az E2F-194 kizárólag DNS-kötő domént tartalmaz. Az E2F-286 DNS-kötő domént és DP-1 heterodimerizációs domént tartalmaz. Az E2F194-RB56-5S és az E2F286-RB56-5S előállítása céljából az E2F-konstrukciókat egy fázisban fuzionáltuk az RB-5s 379. kodonjához. A C706F egy inaktiváló pontmutáció.
A 10. ábra E2F-RB fúziós konstrukciók transzkripciós represszióját ábrázolja.
A 11. ábra (A-D) E2F-RB fúziós fehérjék expresszióját ábrázolja emlőssejtvonalakban. A sejtekből extraktumokat preparáltunk, melyeket E2-CAT riporter vizsgálati eljárásokban vagy FACS vizsgálati eljárásokban alkalmaztunk, és anti-RB monoklonális antitesttel analizáltunk. Az A-sorban C33A-sejtek transzfekciójából kapott eredményeket mutatjuk be (3) RB56-H209-cel, (4) vad típusú RB56-tal, (5) RB56-5s-sel, (6) E2F286-5s-sel, (7) E2F194-5s-sel, (8) E2F194-gyel, (9) E2F286-tal, (10) E2F437tel. Az (1 )-sáv RB56 fehérjestandard. A (2)sáv áltranszfekció. A B-sorban Saos-2-sejtek transzfekciójából kapott eredményeket mutatjuk be (1) RB56-tal, (2,3) E2F194-5ssel és (4,5) E2F286-5s-sel. A C-sorban 5637-sejtek transzfekciójából kapott eredményeket mutatjuk be (2,3) vad típusú RB56-tal, (4,5) RB56-5s-sel, (6,7) E2F194-5s-sel, (7,8) E2F286-5s-sel. Az (1)-sáv RB56 fehérjestandard. A D-sorban NIH-3T3 transzfekciójából kapott eredményeket mutatjuk be (3) RB56-tal, (4) E2F286-5s-sel, (5) E2F194-5s-sel. Az (1 )sáv RB56-standard; a (2)-sáv RB110-standard.
A 12. ábra RB-t expresszáló NIH-3T3-sejtek áramlási citometriás analíziseinek hisztogramjait ábrázolja.
A 13A. ábrán CMV által vezérelt rekombináns adenovírus (ACN56) hatásainak összehasonlítása látható humán simaizomból származó alfa-aktinpromoter által vezérelt, olyan E2F-p56 fúziós konstrukció két izolátumával, amelyek az E2F 95-286. aminosavait tartalmazzák közvetlenül, egy fázisban p56hoz (RB-cDNS 379-928. aminosavjai) kapcsolva, kontrollvírussal (ACN) szemben, 3H-timidin-felvétel mérésére alapuló vizsgálati eljárásban, A7R5 jelű, patkányeredetű simaizom-sejtvonalban. A (B) ábra ugyanezen konstrukciók hatásait ábrázolja A10 jelű, patkányeredetű simaizom-sejtvonalban.
A 14. ábrán a 13. ábránál leírt vírusok hatásait ábrázoljuk nem izomeredetű sejtekben. Az (A) ábrán MDA-MB468 jelű, mellkarcinómasejtvonaiban kapott eredményeket ábrázoljuk. A (B) ábrán H358 jelű, nem kissejtes tüdőkarcinóma-sejtvonalban kapott eredményeket ábrázoljuk.
A 15. ábra (felső rész) különböző sejtvonalak adenovírussal való fertőzhetőségét mutatja adenovírussal, melyet β-galaktozidáz- (βgal) festődéssel határoztunk meg, azonos mennyiségű, CMV-promoter vezérlete alatt β-gal-t expresszálni képes, rekombináns adenovírussal való fertőzést követően. H358 egy nem kissejtes tüdőkarcinómasejtvonal; MB468 egy mellkarcinóma-sejtvonal; A7R5 és A10 simaizom-sejtvonalak. Az ábra alsó része az expresszált p56-fehérje relatív mennyiségét ábrázolja ugyanezekben a sejtvonalakban, ha ACN56 jelű rekombináns adenovírussal fertőztük, amelyben a p56-cDNS-t nem szövetspecifikus CMV-promoter vezérli.
A 16. ábrán simaizomból származó alfa-aktinpromoterrel vezérelt E2F-p56 fúziós konstrukcióval (ASN286-56) fertőzött sejtekben expresszálódott relatív fehérjemennyiségeket ábrázolunk. UN jelentése: nem fertőzött; 50, 100, 250 és 500 jelentése: a fertőzési egységek (MOI) száma.
A 17. ábrán látható oszlopdiagram az intima/media területarányt ábrázolja olyan patkányeredetű nyaki verőér-artériákból vett keresztirányú metszeteken (n=9) (neointima kialakulásának gátlásaként mérve), amelyeken sérülést hoztunk létre, és β-gal-t, RB-t (ACNRB) vagy p56-ot (ACN56) expresszálni képes, rekombináns adenovírusokkal kezeltünk, valamennyi expressziót CMV-promoter vezérelt.
A 18. ábrán bemutatunk három fényképet, amelyek resztenózist ábrázolnak patkányon végzett angioplasztikamodellben. A bal oldali kép normálállatból származik; a középső kép sérült és β-gal-t expresszálni képes, rekombináns vírussal kezelt állatból származik; a jobb oldali kép sérült és p56-ot expresszálni képes, rekombináns adenovírussal (ACN56) kezelt állatból származik.
A 19. ábra simaizomból származó aktinpromoter specifitását mutatja, amint β-gal-transzgént szelektíven képes expresszálni izomsejtekben, de nem képes nem izomsejtekben. Az ábra bal oldali részén összehasonlítjuk a β-gal-expressziót MB468 jelű mellkarcinóma-sejtvonalban, melyet az egyik esetben 1 fertőzési egység (MOI) CMV-vezérelt β-gal-lal (ACNBGAL) fertőztünk azzal szemben, amikor 100 fertőzési egység (MOI) simaizomból származó promoterrel vezérelt konstrukcióval fertőztünk (ASNBGAL). Az ábra jobb oldali részén β-gal-expressziót ábrázolunk A7R5 jelű patkányeredetű simaizom-sejtvonalban, melyet 1 fertő3
HU 226 662 Β1 zési egység (MOI) ACNBGAL-lal vagy 50 fertőzési egység (MOI) ASNBGAL-lal fertőzünk. ASNBGAL-expresszió látható simaizom-sejtvonalban, de nem látható nem izomsejtvonalban, annak ellenére, hogy a sejtek fertőzhetősége nagymértékű.
A 20. ábrán bemutatjuk, hogy RB-t expresszáló, rekombináns adenovírus milyen mértékben képes patkányeredetű verőér-artériákat transzdukálni. Rekombináns adenovírussal (1*10 pfu) kezelt artériákat ballonsérülés és fertőzés után két napig tenyésztettünk. Keresztirányú metszeteket fixáltunk, és RB-specifikus antitestet alkalmaztunk a szövetben lévő RB-fehérje jelenlétének kimutatására. Kontrolivírusként ACN-t alkalmaztunk. Az RB-fehérje festődése az ACNRB-vel kezelt mintában egyértelmű volt, különösen nagyobb nagyításokban.
A21.ábránCMV által vezérelt p56 rekombináns adenovírus (ACN56E4) hatásainak összehasonlítása látható humán simaizomból származó alfa-aktinpromoter által vezérelt E2F-p56 fúziós konstrukcióval (ASN286-56) és kontroll-adenovíruskonstrukciókkal, melyek CMV- vagy simaizomból származó aktinpromotert tartalmaznak 3'-irányban (szintézisirányban) lévő transzgén (ACNE3 vagy ASBE3-2-izolátumokat mutatjuk be, sorrendben) nélkül. A vizsgálati eljárások 1H-timidin-felvételre alapulnak patkányeredetű simaizom-sejtvonalban (A7R5) vagy nem izomeredetű sejtvonalban (MDA-MB468, mellkarcinóma). Az eredmények izomszövet-specifitást mutatnak simaizomból származó alfa-aktinpromoter alkalmazása esetén, és specifikus gátlást mind a p56-, mind az E2F-p56transzgénnel, megfelelő kontrolijaikhoz viszonyítva.
A találmány tárgyát RB-E2F fúziós konstrukciók képezik, beleértve fúziós polipeptideket és azokat kódoló nukleinsavakat és kifejező expressziós vektorokat, valamint eljárások ilyen konstrukciók alkalmazására hiperproliferatív betegségek kezelésében. Bármilyenfajta E2F használható, tipikusan E2F-1, -2, -3, -4 vagy -5 [lásd például Wu et al., Mól. Cell. Bioi. 15, 2536-2546 (1995); Ivey-Hoyle et al., Mól. Cell. Bioi. 13, 7802 (1993); Vairo et al., Genes and Dev. 9, 869 (1995); Beijersbergen et al., Genes and Dev. 8, 2680 (1994); Ginsberg et al., Genes and Dev. 8, 2665 (1994); Buck et al., Oncogene 11, 31 (1995)], tipikusaidban E2F-1. Tipikusan az E2F-polipeptid legalább az E2F DNS-kötő doménjét tartalmazza, és adott esetben tartalmazhatja a heterodimerizációs domént és/vagy a transzaktivációs domént. A ciklin-A-kötő dómén hiányzik, vagy nem funkcionális. A leírásban ismertetett E2F nukleotid- és aminosavszekvenciája a Genbank HUME2F-ből való, bemutatjuk az 1B. és 1A. ábrán. Ilyen E2F-polipeptidet kódoló nukleinsav, előnyösen DNS azonos leolvasási fázisban van fuzionálva RB-polipeptidet kódoló nukleinsavhoz. Az RB-polipeptid bármilyen RB-polipeptid lehet, például konzervatív aminosavvariánsok, allélvariánsok, szubsztituált, deletált vagy inszertált aminosavakat tartalmazó mutánsok, vagy ezek fragmentumai. Az RB-polipeptid növekedési szuppressziós doménje (azaz 379-928. aminosavcsoportjai) előnyösen funkcionális [Hiebert et al., MCB 13, 3384-3391 (1993); Qin et al., Genes and Dev. 6, 953-964 (1992)]. A találmány néhány előnyös megvalósítási módja szerint vad típusú pRB110-et alkalmazunk. Előnyösebben az RB, RB56 rövidített verzióit alkalmazzuk. Az RB56 a pRB110 379-928. aminosavcsoportjait tartalmazza [Hiebert et al., MCB 13, 3384-3391 (1993); Qin et al., Genes and Dev. 6, 953-964 (1992)]. A találmány néhány előnyös megvalósítási módja szerint az RB 2.,
608., 612., 788., 807. vagy 811. helyzetében egyedi vagy kombinációban lévő aminosawariációkat alkalmazunk. Az RB56-5s-variáns a vad típusú RB56 608.,
612., 788., 807. és 811. helyzetében rendelkezik alaninszubsztitúciókkal. Az RB aminosavait és nukleinsavait Lee és munkatársai által közölt [Natúré 329, 642-645 (1987)] RB-szekvencia szerint számozzuk, melyet teljes egészében a kitanítás részének tekintünk bármilyen célból (2. ábra).
A találmány szerinti polipeptidet kódoló nukleinsav lehet DNS vagy RNS. A „kódoló nukleinsavszekvencia” kifejezés jelentése olyan nukleinsav, amely specifikus fehérje vagy peptid expresszióját vezérli. A nukleinsavszekvencia egyaránt lehet DNS-szálból álló szekvencia, amely RNS-re átíródik, vagy RNS-szekvencia, amely fehérjére transzlálódik. A nukleinsavszekvenciák lehetnek teljes hosszúságú nukleinsavszekvenciák, valamint a teljes hosszúságú fehérjéből származó, nem teljes hosszúságú szekvenciák. Továbbá érthető, hogy a szekvencia a natív szekvencia degenerált kodonjait, vagy olyan szekvenciákat tartalmaz, amelyeket egy specifikus gazdasejtben kodonpreferencia biztosítása céljából vihetünk be.
A „vektor” kifejezésen virális expressziós rendszereket, autonóm replikációra képes, cirkuláris DNS-t (plazmidokat) és expressziós, valamint nem expressziós plazmidokat egyaránt értünk. Ha egy rekombináns mikroorganizmust vagy sejttenyészetet egy „expressziós vektor gazdaszervezeteként írunk le, akkor ezen extrakromoszomális cirkuláris DNS-t és a gazdaszervezet kromoszómájába (kromoszómáiba) beépült DNS-t egyaránt értünk. Ha egy vektort fenntartunk egy gazdasejtben, akkor a vektort a sejtek stabilan replikálhatják a mitózis alatt autonóm struktúraként, vagy beépíthetik a gazdaszervezet genomjába. Egy vektor több genetikai elemet tartalmaz, helyzetre és sorrendre tekintettel elhelyezve, azaz működőképesen kapcsolódva más szükséges elemmel úgy, hogy a vektorban a fúziós polipeptidet kódoló nukleinsav átíródhasson, és ha szükséges, transzlálódhasson transzfektált sejtekben.
A „gén” kifejezésen a leírásban egy polipeptidet kódoló nukleinsavszekvenciát értünk. Ez a definíció ma4
HU 226 662 Β1 gában foglal olyan különböző szekvenciapolimorfizmusokat, mutációkat és/vagy szekvenciavariánsokat, amelyekben az ilyen változások nem befolyásolják a géntermék funkcióját. A „gén” kifejezésen nemcsak kódolószekvenciákat értünk, hanem szabályozórégiókat is, például promotereket, enhanszereket és terminációs régiókat. A kifejezésbe tartozik továbbá valamennyi intron és más DNS-szekvencia, amely a „splicing” során jön létre az mRNS-transzkriptumból, olyan variánsokkal együtt, amelyeket alternatív „splicing” eredményez.
A „plazmid” kifejezés autonóm, cirkuláris DNS-molekulát jelent, amely egy sejtben replikálódni képes, és expressziós és nem expressziós típusú lehet. Ha egy rekombináns mikroorganizmust vagy sejttenyészetet egy „expressziós plazmid gazdaszervezeteként írunk le, akkor ezen extrakromoszomális cirkuláris DNS-molekulát és a gazdaszervezet kromoszómájába (kromoszómáiba) beépült DNS-t egyaránt értünk. Ha egy plazmidot fenntartunk egy gazdasejtben, akkor a plazmidot a sejtek stabilan replikálhatják a mitózis alatt autonóm struktúraként, vagy beépíthetik a gazdaszervezet genomjába.
A „rekombináns fehérje” vagy „rekombinánsan termelt fehérje” olyan peptidet vagy fehérjét jelent, amelyet olyan nem natív sejtek alkalmazásával állítunk elő, amelyek nem rendelkeznek a fehérjét expresszálni képes DNS endogén kópiájával. A sejtek azért termelik a fehérjét, mert genetikailag meg lettek változtatva a megfelelő nukleinsavszekvencia bevitelével. A rekombináns fehérje nem található asszociálva a fehérjét termelő sejttel normálisan asszociált fehérjékkel vagy más szubcelluláris komponensekkel. A „fehérje” és „polipeptid kifejezések felcserélhető fogalmak.
A találmány szerinti konstrukciókat általában expressziós vektorban állítjuk elő, amely az alábbi elemeket tartalmazza egymást követően, megfelelő távolságban kapcsolva funkcionális expresszió céljából: szövetspecifikus promoter, transzkripciós iniciációs hely, 3’-végi nem transzlálódó régió, 5’-végi mRNS vezetőszekvencia, a találmány szerinti polipeptídet kódoló nukleinsavszekvencia és poliadenilálási szignál. Ilyen kapcsolatot „működőképesen kapcsoltának nevezünk. Enhanszerszekvenciákat és más, expressziót és/vagy szekréciót elősegítő szekvenciákat is tartalmazhat egy expressziós vektor. További géneket is tartalmazhat, például olyanokat, amelyek drogrezisztenciát kódolnak a rekombináns vektor jelenlétére való szelekciót vagy szűrést lehetővé téve. Ilyen további gének lehetnek például neomicinrezisztenciát, multidrogrezisztenciát, timidin-kinázt, béta-galaktozidázt, dihidrofolát-reduktázt (DHFR) és klór-amfenikol-acetil-transzferázt kódoló gének.
A találmány szerinti megoldásban a találmány szerinti RB-konstrukciók szövetspecifikus expressziójához előnyösen olyan promotert alkalmazunk, amely elsősorban a kérdéses szövetben működik. Szövetspecifikus promoterek például kreatin-kináz-promoter, amelyet disztrofin-cDNS expressziójának vezérlésére alkalmaznak izom- és szívszövetben [Cox et al., Natúré
364, 725-729 (1993)]; immunoglobulin nehéz vagy könnyű láncának promoterei öngyilkos gének expressziójára B-sejtekben [Maxwell et al., Cancer Rés. 51, 4299-4304 (1991)]. Endotél-sejtspecifikus szabályozórégiókat is jellemeztek [Jahroudi et al., Mól. Cell. Bioi. 14, 999-1008 (1994)]. Amfoter retrovírusvektorokat állítottak elő, melyekben herpes simplex vírusból származó timidin-kináz-gén volt vagy albumin-, vagy alfa-fetoproteinpromoterek vezérletével [Huber et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 8039-8043 (1991)] májsejtvonal és hepatómasejtek megcélzására, sorrendben. Ilyen szövetspecifikus promotereket retrovírusvektorokban [Hartzoglou et al., J. Bioi. Chem. 265, 17285-17293 (1990)] és adenovírusvektorokban [Friedman et al., Mól. Cell. Bioi. 6, 3791-3797 (1986); Wills et al., Cancer Gene Therapy 3, 191-197 (1995)] lehet alkalmazni, és még megőrzik szövetspecifitásukat.
A találmány szerinti megoldásban exogén gének szövetspecifikus expressziójára előnyösen alkalmazott promoter a simaizomból származó alfa-aktinpromoter. Reddy és munkatársai [J. Cell. Biology 265, 1683-1687 (1990)] közleményükben ismertették a promoter izolálását és nukleotidszekvenciáját, míg Nakano és munkatársai [Gene 99, 285-289 (1991)] közleményükben ismertették az 5'-végi transzkripciós szabályozóelemeket és a humán simaizomból származó (aorta típusú) alfa-aktingén első intronrégióit.
Petropoulos és munkatársai [J. Virol. 66, 3391-3397 (1992)] közleményükben összehasonlították bakteriális klór-amfenikol-szintetáz (CAT) expresszióját egyik esetben csirkéből származó vázizomeredetű alfa-aktinpromoter vezérletével, másik esetben citoplazmatikus béta-aktinpromoter vezérletével. Ezeket a konstrukciókat retrovírusvektorba vitték, és ezt alkalmazták csirketojások fertőzésére.
Szövetspecifikus expressziós elemek májra, például HMG-CoA-reduktáz promoter [Luskey, Mól. Cell. Bioi. 7 (5), 1881-1893 (1987)]; szterol 1. szabályozóelem [SRE-1; Smith et al., J. Bioi. Chem. 265 (4), 2306-2310 (1990)]; foszfoenol-piruvát-karboxi-kináz (PEPCK) promotere [Eisenberger et al., Mól. Cell BioL. 12 (3), 1396-1403 (1992)]; humán C-reaktív fehérje (CRP) promotere [Li et al., J. Bioi. Chem. 265 (7), 4136-4142 (1990)]; humán glükokinázpromoter [Tanizawa et al., Mól. Endocrinology 6 (7), 1070-81 (1992)]; koleszterin-7-alfa-hidroxiláz (CYP-7) promotere [Lee et al., J. Bioi. Chem. 269 (20), 14681-9 (1994)]; béta-galaktozidáz alfa-2,6-szialiltranszferáz promoter [Svensson et al., J. Bioi. Chem. 265 (34), 20863-8 (1990)]; inzulinszerű növekedési faktort kötő fehérje (IGFBP-1) promotere [Babajko et al., Biochem. Biophys. Rés. Comm. 196 (1), 480-6 (1993)]; aldoláz-B-promoter [Bingle et al., Biochem. J. 294 (Pt2), 473-9 (1993)]; humán transzferrin promotere [Mendelzon et al., Nucl. Acids Rés. 18 (19), 5717-21 (1990)]; I. típusú kollagén promotere [Houglum et al., J. Clin. Invest. 94 (2), 808-14(1994)].
Szövetspecifikus expressziós elemek prosztatához például a prosztatából származó savas foszfatáz
HU 226 662 Β1 (PAP) promotere [Bánás et al., Biochim. Biophys. Acta 1217 (2), 188-94 (1994)]; a prosztatából származó szekréciós fehérje 94 (PSP 94) promotere [Nolet et al., Biochim. Biophys. Acta 1098 (2), 247-9 (1991)]; a prosztataspecifikus antigénkomplex promotere [Casper et al., J. Steroid Biochem. Mól. Bioi. 47 (1-6), 127-35 (1993)]; a humán glanduláris kallikreingén promotere (hgt-1) [Lilja et al., World J. Urology 11 (4), 188-91 (1993)].
Szövetspecifikus expressziós elemek gyomorszövethez például a humán H+/K+-ATPáz alfa-alegységének promotere [Tanúra et al., FEBS Letters 298 (2-3), 137-41 (1992)].
Szövetspecifikus expressziós elemek hasnyálmirigyhez például a hasnyálmiriggyel asszociált fehérje promotere (PAP) [Dusetti et al., J. Bioi. Chem. 268 (19), 14470-5 (1993)]; elasztáz-1 transzkripciós enhanszere [Kruse et al., Genes and Development 7 (5), 774-86 (1993)]; a hasnyálmirigy-specifikus amiláz és elasztáz enhanszer promotere [Wu et al., Mól. Cell. Bioi. 11 (9), 4423-30 (1991); Keller et al., Genes & Dev. 4 (8), 1316-21 (1990)]; a hasnyálmirigyből származó koleszterin-észteráz-gén promotere [Fontaine et al., Biochemistry 30 (28), 7008-14 (1991)].
Szövetspecifikus expressziós elemek méhnyálkahártyához például az uteroglobin promoter [Helftenbein et al., Annál. NY Acad. Sci. 622, 69-79 (1991)].
Szövetspecifikus expressziós elemek mellékvesesejtekhez például a koleszterin-oldalláncot hasító (SCC) enzim promotere [Rice et al., J. Bioi. Chem. 265, 11713-20(1990)].
Szövetspecifikus expressziós elemek az általános idegrendszerhez például a gamma-enoláz (neuronspecifikus enoláz, NSE) promotere [Forss-Petter et al., Neuron 5(2), 187-97(1990)].
Szövetspecifikus expressziós elemek az agyhoz például a neurofilamentum nehéz láncának (NF-H) promotere [Schwartz et al., J. Bioi. Chem. 269 (18), 13444-50 (1994)].
Szövetspecifikus expressziós elemek limfocitákhoz például a humán CGL-1/granzim-B promoter [Hanson et al., J. Bioi. Chem. 266 (36), 24433-8 (1991)]; a terminális dezoxitranszferáz (TdT), lambda-5, VpreB és lek (limfocitaspecifikus tirozin-protein-kináz p561ck) promotere [Lo et al., Mól. Cell. Bioi. 11 (10), 5229-43 (1991)]; a humán CD2-promoter és 3'-végi transzkripciós enhanszere [Laké et al., EMBO J. 9 (10), 3129-36 (1990)] és a humán NK és T-sejt-specifikus aktivációs (NKG5) promoter [Houchins et al., Immunogenetics 37 (2), 102-7(1993)].
Szövetspecifikus expressziós elemek vastagbélhez például a pp60c-src tirozin-kináz promoter [Talamonti etal., J. Clin. Invest. 91 (1), 53-60 (1993)]; szervspecifikus neoantigének (OSNs), mw 40 kDa (p40) promoter [llantzis et al., Microbiol. Immunoi. 37 (2), 119-28 (1993)]; vastagbélre specifikus antigén-P promotere [Sharkey et al., Cancer 73 (3 supp.), 864-77 (1994)].
Szövetspecifikus expressziós elemek mellsejtekhez például a humán alfa-laktalbuminpromoter [Thean et al., British J. Cancer 61 (5), 773-5 (1990)].
Az expresszió specifitásának elősegítésére szolgáló más elemek lehetnek egy kérdéses szövetben, például szekréciós vezetőszekvenciák, enhanszerek, nukleáris lokalizációs szignálok, endozmolitikus peptidek stb. Ezek az elemek előnyösen abból a kérdéses szövetből származnak, ahol a specifitást elősegítik.
A találmány szerinti nukleinsavszekvenciák nukleinsavmanipulálására szolgáló technikák például polipeptideket kódoló nukleinsavszekvenciák szubklónozása expressziós vektorokba, próbák jelölése, DNShibridizáció és hasonlók, melyek általános leírását lásd Sambrook és munkatársai, „Molecular Cloning - A Laboratory Manual” (2. kiadás), 1-3. kötet, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1989), amely a kitanítás részét képezi. Erre a kézikönyvre a továbbiakban „Sambrook és munkatársai címmel hivatkozunk.
Ha egy kérdéses szekvenciát kódoló DNS-t izoláltunk és klónoztunk, sokféle rekombinánsan előállított sejtben expresszálhatjuk a kódolt fehérjéket. Várható, hogy szakember számos expressziós rendszert ismer, amely DNS által kódolt fehérjét expresszál. Nem kíséreljük meg részletesen ismertetni a különböző ismert módszereket, amelyek fehérjék expressziójára szolgálnak prokariótákban vagy eukariótákban.
Röviden összefoglalva, egy kérdéses szekvenciát kódoló, természetes vagy szintetikus nuklelnsavak expresszióját tipikusan úgy érjük el, hogy a DNS-t vagy cDNS-t működőképesen egy promoterhez kapcsoljuk (amely konstitutív vagy indukálható), azt követően expressziós vektorba visszük. A vektorok replikációra és integrációra alkalmasak lehetnek prokariótákban vagy eukariótákban. Tipikus expressziós vektorok tartalmaznak transzkripciós és transzlációs terminátorokat, iniciációs szekvenciákat és promotereket, amelyek alkalmasak a kérdéses polinukleotidszekvencia expressziójára. A klónozott gén nagymértékű expressziójának céljából kívánatos expressziós plazmidokat előállítani, amelyek minimálisan egy erős promotert a transzkripció vezérlésére, egy riboszómakötő helyet a transzlációs iniciáláshoz és egy transzkripciós/transzlációs terminátort tartalmaznak. Az expressziós vektorok tartalmazhatnak nem specifikus expressziós kazettákat, amelyek legalább egy független terminátorszekvenciát, a plazmid replikációját mind eukariótákban, mind prokariótákban lehetővé tevő szekvenciákat (azaz ingázóvektorokat), valamint mind prokarióta, mind eukarióta rendszerekben alkalmazható szelekciós markereket is. Lásd „Sambrook és munkatársai könyvét.
A találmány szerinti E2F-RB fúziós konstrukciókat bejuttathatjuk a kérdéses szövetbe in vivő vagy ex vivő, sokféle módszer alkalmazásával. A találmány néhány előnyös megvalósítási módja szerint a vektornak a sejtekbe juttatására szolgáló eljárás lehet mikroinjekció, kalcium-foszfátos kicsapás, liposzómafúzió vagy biolisztikus módszer. A találmány további előnyös megvalósítási módjai szerint a DNS-t közvetlenül veszi fel a kérdéses szövet. A találmány más előnyös megvalósítási módjai szerint a konstrukciókat virális vektor6
HU 226 662 Β1 rendszerbe csomagoljuk a sejtekbe juttatás elősegítése céljából.
A találmány szerinti megoldásban használható vitális vektorrendszer például adenovírus, herpeszvírus, adenoasszociált vírus, egérből származó „minute”-vírus (MVM), HÍV, sindbisvírus és retrovírusok, például Rous-szarkóma-vírus és MoMLV. A találmány szerinti konstrukciókat tipikusan ilyen vektorokba inszertáljuk, hogy lehetővé tegyük az E2F-RB-t expresszáló konstrukció csomagolását tipikusan vitális DNS-sel kísérve, egy érzékeny gazdasejt fertőzését és az E2F-RB-gén expresszióját. Különösen előnyös vektor Wills és munkatársai által leírt [Hűm. Gene Therapy 5, 1079-1088 (1994)] adenovírusvektor.
A találmány másik előnyös megvalósítási módja szerint a találmány szerinti rekombináns DNS-konstrukciókat sejtreceptor-ligandumhoz konjugáljuk a felvétel elősegítése céljából (például burkolt ciszternák invaginációja és az endoszóma internalizációja), egy DNSkötőcsoporton keresztül [Wu et al., J. Bioi. Chem. 263, 14621-14624 (1988); WO 92/06180 számú szabadalmi irat]. Például a találmány szerinti DNS-konstrukciókat polilizincsoporton keresztül kapcsolhatjuk aszialooromukocidhoz, amely hepatociták aszialo-glikoprotein-receptorainak liganduma.
Ehhez hasonlóan a találmány szerinti konstrukciók csomagolására alkalmazott vírusburkokat módosíthatjuk receptorligandumok vagy receptorra specifikus antitest hozzáadásával, lehetővé téve receptorközvetített endocitózist specifikus sejtekbe (például WO 93/20221, WO 93/14188; WO 94/06923 számú szabadalmi iratok). A találmány néhány előnyös megvalósítási módja szerint a találmány szerinti DNS-konstrukciókat vírusfehérjékhez, például adenovíruspartikulumokhoz kapcsoljuk az endocitózis elősegítése céljából [Curiel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 8850-8854 (1991)]. A találmány más előnyös megvalósítási módjai szerint a találmány szerinti molekuláris konjugátumok tartalmazhatnak mikrotubulusinhibitorokat (WO/9406922); influenzavírusból származó hemagglutinint mimetizáló szintetikus peptideket [Piánk et al., J. Bioi. Chem. 269, 12918-12924 (1994)]; és nukleáris lokalizációs szignálokat, például SV40-T-antigént (WO 93/19768 számú szabadalmi irat).
A találmány néhány előnyös megvalósítási módja szerint a találmány szerinti fúziós polipeptideket közvetlenül a kezelésre szoruló páciensnek adjuk be. „Terápiásán hatásos dózis akkora polipeptiddózis, amely elegendő hiperproliferatív rendellenesség megelőzésére vagy súlyosságának csökkentésére. A leírásban „hiperproliferatív sejtek” kifejezésen például olyan sejteket értünk, amelyek rendelkeznek az autonóm növekedés képességével, azaz a normál-szabályozómechanizmusoktól függetlenül képesek létezni és magukat reprodukálni. A hiperproliferatív betegségeket kategorizálhatjuk patológiás rendellenességként, azaz normálsejtektől eltérő, az adott betegségre jellemző állapotként, vagy kategorizálhatjuk nem patológiás rendellenességként, azaz normálsejtektől eltérő, de a betegállapottal nem társult állapotként. Patológiás hiperproliferatív sejtek az alábbi betegállapotokra jellemzőek: resztenózis, diabetikus retinopátia, tiroidhiperplázia, Grave-féle betegség, pikkelysömör, jóindulatú prosztatahipertrófia, Li-Fraumeni-szindróma, például mellrák, szarkómák és más neopláziák, hólyagrák, vastagbélrák, tüdőrák, különböző leukémiák és limfómák. Nem patológiás hiperproliferatív sejteket találhatunk például az emlővezeték epitélsejtjeiben a tejtermelés kifejlődése alatt és a sebgyógyulással asszociált sejtekben. Patológiás hiperproliferatív sejtek jellemző módon elvesztik a kontaktgátlást, és csökken szelektív tapadóképességük, ami maga után vonja az intracelluláris kommunikáció további romlását. Ezek a változások magukban foglalják az osztódás stimulálását és proteolitikus enzimek szekrécióját.
A találmány szerinti konstrukciók hasznosak különféle rákos megbetegedések és más olyan állapotok terápiájában, amelyekben RB beadása előnyös, például perifériás vaszkuláris betegségek és diabetikus retlnopátia esetén. Noha bármilyen olyan szövet megcélozható, amelyre valamilyen szövetspecifikus expressziós elemet, például promotert lehet azonosítani, különleges jelentősége van RB-konstrukció szövetspecifikus beadásának hiperproliferatív rendellenességek, például resztenózis esetén, amely esetben a simaizomból származó aktinpromoter előnyösen alkalmazható.
A találmány szerinti készítményeket szakember által ismert módszerekkel hozzuk olyan beadásra szánt formára, amely emlősnek, előnyösen embernek való beadásra elfogadható. A találmány néhány előnyös megvalósítási módja szerint a találmány szerinti készítményeket beadhatjuk közvetlenül szövetbe injekcióval vagy a kérdéses szövetet ellátó véredénybe. A találmány további előnyös megvalósítási módjai szerint a találmány szerinti készítményeket „lokoregionálisan” adjuk be, azaz intravezikálisan, sérülésbe és/vagy topikálisan. A találmány más előnyös megvalósítási módjai szerint a találmány szerinti készítményeket szisztémásán adjuk be injekcióval, inhalálással, kúpban, transzdermális célba juttatással stb. A találmány további előnyös megvalósítási módjai szerint a készítményeket katéteren keresztül vagy olyan eszközzel adjuk be, amely lehetővé teszi nehezen hozzáférhető szövetek, például belső szervek elérését. A találmány szerinti készítményeket beadhatjuk nagyobb készletet tartalmazó eszköz alkalmazásával, implantátumokban vagy kapszulázott formákban is, amelyek lehetővé teszik a készítmények lassú vagy visszatartott felszabadulását.
A találmány tárgyát képezik beadásra szánt készítmények, amelyek oldat formában tartalmazzák a találmány szerinti készítményeket, feloldva vagy szuszpendálva elfogadható hordozóban, előnyösen vizes hordozóban. Sokféle vizes hordozó alkalmazható, például víz, puffereit víz, 0,8%-os nátrium-klorid-oldat, 0,3%-os glicin, hialuronsav és hasonlók. Ezeket a készítményeket sterilizálhatjuk szokásos, jól ismert sterilizálási technikák alkalmazásával, vagy sterilre szűrhetjük azokat. Az így kapott vizes oldatokat felhasználás céljára csomagolhatjuk, úgy, ahogy vannak, vagy liofilizálhatjuk, a liofilizált preparátumot beadás előtt egy steril ol7
HU 226 662 Β1 dattal fel kell oldani. A készítmények tartalmazhatnak gyógyászatilag elfogadható segédanyagokat, amelyek a fiziológiás körülmények megközelítéséhez szükségesek, például pH-t szabályozó és pufferelő ágenseket, ionerősséget szabályozó ágenseket, nedvesítőágenseket és hasonlókat, például nátrium-acetátot, nátriumlaktátot, nátrium-kloridot, kálium-kloridot, kalcium-kloridot, szorbit-monolaurátot, trietanol-amin-oleátot stb.
A találmány szerinti készítmények koncentrációja a gyógyszerformákban széles határok között változhat, azaz kevesebb mint 0,1%-tól, rendszerint legalább körülbelül 2%, egészen 20-50%-ig, vagy még több (tömeg%), és elsősorban a folyadék térfogata, viszkozitása stb. alapján választjuk ki, a kiválasztott konkrét beadási móddal összhangban.
A találmány szerinti készítményeket beadhatjuk liposzómákkal is. Liposzómák lehetnek emulziók, habok, micellák, oldhatatlan egyrétegű anyagok, folyadékkristályok, foszfolipiddiszperziók, lamelláris rétegek és hasonlók. Ezekben a preparátumokban a találmány szerinti, célba juttatandó készítmények egy liposzóma részét képezik, egymagukban vagy olyan molekulával együtt, amely a kívánt célhoz képes kötődni, például antitesttel, vagy más terápiás vagy immunogén készítményekkel. A találmány szerinti, kívánt készítménnyel így megtöltött vagy azzal kapcsolt liposzómákat szisztémásán juttatjuk célba, vagy a kérdéses szövethez irányíthatjuk, ahol a liposzómák azután továbbítják a kiválasztott terápiás/immunogén peptidkészítményeket.
A találmány szerint alkalmazott liposzómákat standard vezikulumformáló lipidekből állítjuk elő, amelyek általában semleges vagy negatívan töltött foszfolipideket és egy szterolt, például koleszterint tartalmaznak. A lipidek kiválasztásánál általában figyelembe vesszük például a liposzóma méretét, savra való érzékenységét és a liposzómák stabilitását a véráramban. Sokféle módszer áll rendelkezésre liposzómák előállítására, leírásukat lásd például Szoka és munkatársai, Ann. Rév. Biophys. Bioeng. 9, 467 (1980), USP 4.235.871, 4.501.728, 4.837.028 és 5.019.369 számú szabadalmi iratokat, melyek a kitanítás részét képezik.
A találmány szerinti készítményt tartalmazó liposzómaszuszpenziót beadhatjuk intravénásán, lokálisan, topikálisan stb. olyan dózisban, amely változhat, többek között, a beadás módjától, a találmány szerinti, célba juttatandó készítménytől és a kezelendő betegség állapotától.
Szilárd készítményekben nem toxikus szilárd hordozót alkalmazhatunk, például gyógyszerészeti tisztaságú mannitot, laktózt, keményítőt, magnézium-sztearátot, nátrium-szacharint, talkumot, cellulózt, glükózt, szacharózt, magnézium-karbonátot és hasonlókat. Orális beadás céljára gyógyászatilag elfogadható nem toxikus készítményt úgy állítunk elő, hogy bármelyik normálisan alkalmazott segédanyagot, például a fentebb felsorolt hordozók valamelyikét beépítjük, és általában 10-95% hatóanyagot, amely egy vagy több találmány szerinti készítmény, és előnyösebben 25-75% koncentrációban.
Aeroszol útján történő beadáshoz a találmány szerinti készítményeket előnyösen a véglegesen felhasználandó formára hozzuk felületaktív anyaggal és hajtóanyaggal. A találmány szerinti készítmények tipikus százalékos aránya 0,01%-20% (tömeg%), előnyösen 1 %—10%. A felületaktív anyagnak természetesen nem szabad toxikusnak lenni, és előnyösen oldhatónak kell lennie a hajtóanyagban. Ilyen ágensek lehetnek például 6-22 szénatomos zsírsavak észterei vagy parciális észterei, például kapronsav, oktánsav, laurilsav, palmitinsav, sztearinsav, linolsav, linolénsav, oleszterinsav vagy olajsav egy alifás polihidroxi-alkohollal vagy ciklikus anhidridjével. Vegyes észterek, például vegyes vagy természetes gliceridek is alkalmazhatók. A felületaktív anyag mennyisége 0,1%-20%-a (tömeg%) a készítménynek, előnyösen 0,25-5%-a. A készítmény kiegyensúlyozása szokásos módon a hajtóanyaggal történik. Kívánt esetben hordozót is tartalmazhat, például intranazális célba juttatás esetén lecitint.
A találmány szerinti készítményeket beadhatjuk továbbá készlet típusú rendszerben, kapszulázott formában vagy implantátumokban, amely technikák szakember által jól ismertek. Ehhez hasonlóan a konstrukciók célba juttathatók egy pumpán keresztül a kérdéses szövethez.
A találmány néhány előnyös megvalósítási módja szerint a találmány szerinti készítmények beadhatók ex vivő a páciensből kivett sejtekbe vagy szövetekbe, azután azok visszajuttathatók a páciensbe. Génterápiás konstrukciók ex vivő beadását lásd például az alábbi közleményekben: Artega és munkatársai, Cancer Research 56 (5), 1098-1103 (1996); Nolta és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 (6), 2414-9 (1996); Koc és munkatársai, Seminars in Oncology 23 (1), 46-65 (1996); Raper és munkatársai, Annals of Surgery 223 (2), 116-26 (1996); Dalesandro és munkatársai, J. Thorac. Cardi. Surg. 11 (2), 416-22 (1996); és Makarov és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 (1),402-6(1996).
A találmány néhány előnyös megvalósítási módja szerint a találmány szerinti konstrukciókat nyaki ütőérartériába adjuk be, ballonangioplasztika után, resztenózis megelőzésére vagy súlyosságának csökkentésére. A találmány szerinti készítményeket angioplasztikában használt eszközök burkolóanyagaként alkalmazhatjuk [lásd például Willart et al., Circulation 89, 2190-2197 (1994); French et al., Circulation 90, 2402-2413 (1995)]. A találmány további előnyös megvalósítási módjai szerint a találmány szerinti fúziós polipeptideket ehhez hasonló módon alkalmazhatjuk.
Az alábbi példákkal a találmány szerinti megoldást kívánjuk szemléltetni, anélkül azonban, hogy igényünket az ismertetettekre korlátoznánk.
1. példa
E2F-RB-fúziók
A. Bevezetés
Ebben a kísérletben RB56-polipeptidhez fuzionált, különböző E2F-szegmenseket kódoló expressziós plazmidokat állítunk elő. Az RB56 a teljes hosszúságú RB alfragmentuma, amely a növekedési szuppresszíóhoz szükséges „zseb”-doméneket tartalmazza [Hiebert
HU 226 662 Β1 et al., MCB 13, 3384-3391 (1993); Qin et al., Genes and Dev. 6, 953-964 (1992)]. Az E2F194 az E2F 95-194. aminosavait tartalmazza. Ez a fragmentum csak az E2F DNS-kötőhelyét tartalmazza. Az E2F286 a DNS-kötő domént és a DP-1 heterodimerizációs domént tartalmazza. Mindkét E2F-fragmentumból hiányzik az N-terminális ciklin-A-kináz-kötő dómén, amely úgy tűnik, hogy szabályozza az E2F DNS-kötő aktivitását [Krek et al., Cell 83,1149-1158 (1995); Krek et al., Cell 78, 161-172(1994)].
B. Vektorok előállítása
A pCTM-plazmid CMV-promotert, T7- és SP6-promoterek által szegélyezett, három részből álló adenovírus-vezetőszekvenciát és többszörös klónozóhelyet tartalmaz marhaeredetű növekedési hormonból (BGH) származó poliadenilálási hellyel és SV-40 poliadenilációs hellyel, szintézisirányban. A pCTM vázlatos ábrázolása a 3. ábrán látható. A pCTM DNS-szekvenciáját a 4. ábrán mutatjuk be.
A pCTMI-t pCTM-ből állítjuk elő úgy, hogy pCTM-et emésztünk Xhol- és Notl-enzimekkel, és szubklónozunk egy pCMV-p-gal-vektorból (Clontech) származó, 180 bp méretű Xhol/Notl-intronfragmentumot. A pCTMI-t vázlatosan bemutatjuk az 5. ábrán. A DNSszekvenciát a 6. ábrán mutatjuk be.
A pCTMIE-t úgy állítjuk elő, hogy SV40 vírus-DNSből származó SV40-enhanszert amplifikálunk polimeráz-láncreakcióban. Az amplifikált terméket Bglll-enzimmel emésztjük és BamHI-enzimmel emésztett pCMTI-be inszertáljuk, és BamHI-enzim jelenlétében ligáljuk. A plazmidot a 7. ábrán ábrázoljuk vázlatosan. A DNS-szekvenciát a 8. ábrán mutatjuk be.
A pCTM-RB-t az alábbiak szerint állítjuk elő. A teljes hosszúságú humán RB-cDNS-t tartalmazó pETRBc 3,2 kb méretű Xbal/Clal-fragmentumát [Huang et al., Natúré 350, 160-162 (1991)] ligáljuk Xbal/Clal-enzimekkel emésztett pCTM-be. A pCTM-RB56-ot úgy állítjuk elő, hogy az emésztett pCTM-et RB56-ot kódoló szekvenciát tartalmazó, 1,7 kb méretű Xbal/Clal-fragmentumhoz ligáljuk. A pCTMI-RB, pCTMIE-RB, pCTMI-RB56 (381-928. aminosavak) és a pCTMIE-RB56 (321-928. aminosavak) ugyanilyen módszerrel lett előállítva.
C. E2F-RB fúziós konstrukciók
A 9. ábrán bemutatjuk a kísérletekben alkalmazott fúziós konstrukciókat. Ezek az E2F-konstrukciók a 95. aminosavhelyzetnél kezdődnek és a ciklin-A-kötő dómén részei hiányoznak belőlük. Az E2F437 DNS-kötő domént (fekete), heterodimerizációs domént (fehér) és transzaktivációs domént (árnyalt) tartalmaz. Az E2F194 kizárólag a DNS-kötő domént tartalmazza. Az E2F286 a DNS-kötő domént és a DP-1 heterodimerizációs domént tartalmazza. Az RB56-5S egy olyan RB-variánst jelöl, amely a 606., 612., 788., 807. és 811. aminosavcsoportoknál alaninszubsztitúciókkal rendelkezik. Az E2F194-RB56-5s-ben és az E2F286-RB56-5s-ben az E2F-fragmentumokat egy fázisban fuzionáltuk az RB-5s 379. kodonjához. Az
RB56-C706F egy inaktiváló pontmutácíót tartalmaz [Kaye et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 6922-6926 (1990)].
A pCMV-E2F194-et és a pCMV-E2F437-et az alábbiak szerint állítjuk elő. Az E2F 95-194. aminosavait (a DNS-kötő domént tartalmazza) vagy 95-437. aminosavait kódoló DNS-t polimeráz-láncreakcióban amplifikáljuk, Hindll-enzimmel emésztjük, és Smal/Hindll-enzimmel emésztett pCMV-RB56-vektorokba ligáljuk. A pCMV-E2F286-ot úgy állítjuk elő, hogy a pCMV-E2F437-et Aflll-enzimmel emésztjük, a végeket DNS-pol-l-enzimmel (Klenow-fragmentum) kezeljük, és újra ligáljuk Aflll-enzim jelenlétében. A tompa végű ligálás egy stopkodont hoz létre a 287. helyzetben. A pCMV-E2F286-5s-t úgy állítjuk elő, hogy Aflll(tompa)/Hindlll-enzimekkel emésztett pE2F437-et ligálunk RB56-5s kódolószekvenciát tartalmazó Sall(tompa)/Hindlll-fragmentumhoz. A pCTMIE-E2F194-5s-t és pCTMIE-E2F286-RB5s-t úgy állítjuk elő, hogy EcoRI/EcoRV-enzimekkel emésztett pCTMIE-t (4,2 kb méretű) ligálunk pCMV-E2F194-RB5s-ből vagy pCMV-E2F286-RB5s-ből származó Hindlll(tompa)/EcoRI-fragmentumokhoz.
D. Promoterrepresszió
Az E2F-RB fúziós fehérjék hatásainak mérése céljából nyaki karcinóma-sejtvonalat (ATCC# HTB-31) transzfektálunk ekvivalens mennyiségű E2F194-RB56tal vagy E2F-RB56 plusz E2-CAT riporterplazmiddal [lásd például Weintraub et al., Natúré 358, 259-261 (1992)].
A C33A vizsgálati eljárásban 250 000 C33A-sejtet szélesztünk 6 tenyésztőhelyet tartalmazó szövettenyésztő tálcák egyes helyeire, és egy éjszakán át hagyjuk letapadni azokat. 5 pg pCMV-RB56-, pCMV-E2F-RB56- vagy pCMV-E2F-plazmidot 5 pg E2-CAT vagy SVCAT jelölt riporterkonstrukcióval és 2,5 pg β-gal-plazmiddal (pCMV-β, Clontech) kotranszfektálunk (kalcium-foszfátos módszer, MBS transzfekciós reagenskészlet, Stratagene) tenyésztőhelyenként, két párhuzamossal. A sejteket a transzfekció után 72 óráig tenyésztjük, és extraktumokat preparálunk.
Az 5637 vizsgálati eljárásban 250 000 5637-sejtet szélesztünk a fentebb leírtak szerint, 1-1 pg RB-t vagy E2F-RB fúziós plazmidot, E2-CAT vagy SV-CAT riporterplazmidot és pCMV-p-galaktozidázt kotranszfektálunk lipofektinreagens (BRL, Bethesda, Maryland) alkalmazásával, a gyártó utasításai szerint.
A CAT vizsgálati eljárást 20 pl (C33A) vagy 50 pl (5637) sejtmentes extraktum [Gorman et al., Mól. Cell. Bioi. 2, 1044 (1982)] alkalmazásával végezzük. A TLCket Phosphoimager SF (Molecular Dynamics) készüléken analizáljuk. A CAT-aktivitásokat transzfekciós hatékonyságra normalizáljuk az egyes extraktumok β-galaktozidáz-aktivitása szerint. Az extraktumok β-galaktozidáz-aktivitásait Rosenthal és munkatársai [Meth. Enzym. 152, 704 (1987)] által leírt vizsgálati eljárás szerint végezzük.
A vizsgálatok eredményei az alábbiak. Az E2-CAT riporterrel való transzfekció egymagában vagy nem
HU 226 662 Β1 funkcionális, kontroll-RB56-H209-mutáns jelenlétében viszonylag magas CAT-aktivitást eredményezett. Vad típusú RB56 vagy RB56-5s-variánssal való kotranszfekció a CAT-aktivitás 10-12-szeres represszióját eredményezte, ami azt mutatta, hogy az RB56 vagy az RB56-5s egyaránt képes hatékonyan represszálni E2F-függő transzkripciót. Az E2F194-RB5s és az E2F286-RB5s körülbelül 50-szeresen represszált transzkripciót. A transzkripciós represszióhoz RB56-ra és a fúziós fehérjék E2F-komponenseire egyaránt szükség van, míg E2F194 és E2F286 expressziója nem médiái transzkripciós repressziót. Az SV40-CAT transzkripcióját nem represszálták az E2F-RB-konstrukciók, ami alátámasztja az E2FRB általi transzkripciós represszió specifitását az E2-promoterre. Ezeket az eredményeket a 10. ábrán mutatjuk be vázlatosan.
E. Sejtciklus rögzítése
E2F-RB fúziós polipeptideknek azt a tulajdonságát vizsgáljuk, hogy Saos-2- (RB-/-sejtek) (ATCC No. HTB-85) és C33A-sejtekben képesek G1-rögzítést okozni. Korábbi kísérletekben kimutatták, hogy RB-mediált E2-promoterrepresszió és G1-rögzítés kapcsolt Saos-2-sejtekben, de szétválik C33A-sejtekben (RBmut) [Xu et al., PNAS 92, 1357-1361 (1992)]. A sejteket PBS-ben mossuk és 1 ml -20 °C-os, 70%-os etanolban fixáljuk 30 percig. A sejteket lecentrifugáljuk és 0,5 ml, 10 pg/ml RnázA-t tartalmazó, 2%-os szérumban felszuszpendáljuk, és 30 percig inkubáljuk azokat 37 °C-on. Propidium-jodidot (100 pg/ml) tartalmazó, 0,5 ml PBS-t adunk minden egyes mintához, összekeverjük azokat, és a sejteket FACS-csőre illeszthető szűrőn (FACS tűbe capstrainer) keresztül szűrjük. A FACS-analíziseket FACS-Scan (BectonDickinson) készüléken végezzük, dublett diszkriminációt alkalmazva. 5000-10 000 CD20+ eseményt analizálunk. Go/Grben, S-ben és G2/M-ben lévő sejtek százalékos mennyiségét „Modfit modeling” szoftver alkalmazásával határozzuk meg.
A kísérlet eredményeit az alábbiakban ismertetjük. A teljes hosszúságú RB110 és a rövidített RB56-verzió egyaránt okozott, de a kontroll mutáns RB-H209 nem okozott Grrögzítést Saos-sejtekben (1. táblázat). Ehhez hasonlóan az RB56-5s, E2F-194-RB56-5S és az E2F286-RB56-5s mind képes volt sejteket rögzíteni G0/Gi-ben. A DNS-kötő dómén, az E2F194 transzfekciója nem blokkolta az S-fázisba jutást Saos-2-ben, amint azt már leírták rágcsálókból származó sejtekre [Dobrowolski et al., Oncogene 9, 2605-2612 (1994)]. Ezzel ellentétben RB110, RB56 és E2F-RB fúziós fehérjék nem voltak képesek C33A-sejtvonalakat rögzíteni, ami azt mutatja, hogy ezekben a sejtekben megfigyelt transzkripciós represszió nem jut Grrögzítésbe.
Megfigyeltük, hogy az E2F-RB fúziós fehérjék képesek 5637-sejteket is rögzíteni (2. táblázat). RB56 és RB56-5s egyaránt hatékonyan képes sejteket rögzíteni G0/Gi-ben (a sejtek körülbelül 90%-a Go/Grben volt), míg E2F194-RB56-5s és E2F286-RB56-5s valamivel kevésbé hatékony (a sejtek körülbelül 80%-a Go/Grben volt) Go/Grrögzítés elősegítésében. Anélkül, hogy elköteleznénk magunkat bármelyik elmélethez, úgy tűnik, hogy mind a Saos-2, mind az 5637-sejtek kevésbé hatékony rögzíthetőségének oka E2F-RB fúziós fehérjékkel az alacsonyabb stacionárius („steady-state) fehérjeszint miatt van ezekben a sejtekben (11. ábra, b és c panel).
1. táblázat
Sejtciklus-szabályozás RB-vel és E2F-RB fúziós fehérjékkel RBneg-sejtekben
| Sejtek (%) | |||
| CD20+ Gq/Gi | g2/m | S-fázis | |
| H209 | 52,1 | 27,1 | 20,8 |
| p56RB | 78,8 | 14,2 | 7,0 |
| p110RB | 70,9 | 14,3 | 14,8 |
| p56RB-5s | 84,8 | 13,2 | 2,0 |
| p56RB-p5 | 81,3 | 11,5 | 7,3 |
| E2F-194-5S | 77,8 | 14,9 | 7,3 |
| E2F-286-5S | 72,2 | 15,0 | 12,8 |
| E2F-194 | 49,9 | 28,0 | 22,1 |
2. táblázat
5637-hólyagsejtek növekedési szuppressziója RB-vel és E2F-RB fúziós fehérjékkel
| 5637/CD20+ | Sejtek (%) | ||
| Gq/Gt | S | G2M | |
| CD20 | 59,7 | 16,9 | 20,6 |
| RB56-C706F | 57,4 | 16,3 | 24,3 |
| RB56WT | 90,7 | 4,12 | 4,88 |
| RB56-5S | 89,91 | 3,51 | 6,1 |
| E2F-194-5S | 80,1 | 1,31 | 0 |
| E2F-286-5S | 79,21 | 8,1 | 0 |
F. Fúziós fehérjék aktivitása funkcionális
RB-háttérben
Azután meghatározzuk E2F-RB fúziós fehérjék aktivitását funkcionális RB-t tartalmazó celluláris háttérben. NIH-3T3-sejteket transzfektálunk RB56-tal vagy E2F-RB56-fúziókkal, és 3C8jelű anti-RB monoklonális antitesttel festjük azokat [Wen et al., J. Immunoi. Meth. 169, 231-240 (1994)]. Elvégezzük az RB-t expresszáló sejtek FACS-analízisét. Az eredményeket a 12. ábrán bemutatjuk. A „nem kapuzott (non-gated) populáció (g) jellemző sejtciklusmegoszlást mutat NIH-3T3-sejtekre (60% G0, 28% S, 10% G2/M). Ezzel szemben RB56-tal (a, b) vagy E2F-RB fúziós fehérjékkel (c—f) transzfektált sejtekben az RB-t expresszáló sejtek több mint 90%-a G0/Gi-ben volt rögzítve. Ezek az adatok azt mutatják, hogy RB és E2F-RB56-fúziók képessége sejtek Go/Grben való rögzítésére nem korlátozódik RB-negatív tumorsejtekre. A transzfektált NIH-3T310
HU 226 662 Β1 sejtekben expresszált fehérje relatív mennyiségét is vizsgáltuk. Az RB110 nem expresszálódott hatékonyan ezekben a sejtekben.
Tehát ezek az adatok azt mutatják, hogy E2F-RB fúziós fehérjék hatékonyabb transzkripciós represszorok, mint p56 vagy RB56 egyedül alkalmazva, és hogy az RB inkább képes transzkripciót represszálni E2Fhez kötődött állapotban, mint közvetlenül az E2F transzaktivációs doménjét blokkolva. Ezek az adatok alátámasztják E2F-RB-fúziók alkalmazásának lehetőségét RB-antagonistaként RB(+)-sejtekben és RB-negatív vagy RB-mutáns sejtekben.
2. példa
E2F-RB-fúziók szövetspecifikus expressziója
A. Rekombináns adenovírus előállítása
Ebben a kísérletben RB-polipeptidet tartalmazó, rekombináns adenovírusokat állítunk elő CMV vagy simaizomból származó alfa-aktinpromoter vezérlete alatt.
A simaizomból származó a-aktinpromotert [-670től +5-ig terjedő bázisok, Reddy et al., „Structure of the Humán Smooth Muscle α-Actin Gene”, J. Bioi. Chem. 265, 1683-1687 (1990); Nakano et al., „Transcriptional Regulatory Elements In The 5' Upstream and First Intron Regions of The Humán Smooth Muscle (aortic type) α-Actin-Encoding Gene”, Gene 99, 285-289 (1991)] PCR alkalmazásával izolálunk genomi könyvtárból 5’-végi Xhol- és Avrll-hasítóhelyek és 3'-végi Xbal-, Clal- és Hindlll-hasítóhelyek hozzáadásával klónozási célokból. A fragmentumot Xhol/HindlII-fragmentumként szubklónozzuk egy plazmidba szekvenálás céljára, hogy igazoljuk a bázisösszetételt. A p56-hoz (a teljes hosszúságú RB 379-928. aminosavjaihoz) kapcsolt, E2F-1 DNS-kötő és heterodimerizációs doménjét (95-286. bázisok) tartalmazó fúziós konstrukciót (286-56.) Xbal/Clal-fragmentumként szubklónozunk a simaizomból származó α-aktinpromoterhez közvetlenül szintézisirányban, és ezt az expressziós kazettát kiemésztjük, és pAd/ITR/IX(-)-plazmidba klónozzuk Xbal-Avrll- és Clal-fragmentumként, így jutunk a pASN286-56-plazmidhoz. Ez a plazmid 5. típusú adenovírusból származó, fordított terminális ismétlődő szekvenciából (ITR), csomagolószignálokból és Elaenhanszerből áll, melyet humán simaizomból származó α-aktinpromoter és 286-56-kazetta követ, azután az Ad2-szekvencia (4021-10462.) (amely E1b/protein IX eredetű poliA-szignált tartalmaz), pBR322-háttérben. Rekombináns adenovírust standardeljárások alkalmazásával állítunk elő. A pASN286-56-plazmidot NgoMIenzimmel linearizáljuk, és 293-sejtekbe kotranszfektáljuk Clal-enzimmel emésztett rAd34 nagy fragmentumával, amely az 5. típusú adenovírus E3- és E4-régiójában egyaránt tartalmaz deléciókat. Az Ad34 egy 1,9 kb méretű deléciót a korai 3. régióban tartalmaz (amely egy Xbal-restrikciós fragmentum deléciójából származik, 28593-30470. Ad5-helyzetekben), és egy 1,4 kb méretű deléciót a korai 4. régióban (az E4 Taq 1-fragmentumából származik, 33055-35573. helyzetekben) tartalmaz, melyeket E4-ORF6-ot és -6/7-et tartalmazó cDNS-sel helyettesítünk.
Homológ rekombinációval termelt rekombináns adenovírust izolálunk és azonosítunk restrikciós emésztést alkalmazó analízissel, és tovább tisztítjuk limitált hígítással. További kontrollként alkalmazott, rekombináns adenovírusokat már leírtak, például az ACN-kontrollvírust [CMV-promoter, Wills et al., „Gene Therapy Fór Hepatocellular Carcinoma: Chemosensitivity Conferred By Adenovirus-Mediated Transfer of The HSV-1 Thymidine Kinase Gene”, Cancer Gene Therapy 2, 191-197 (1995)] és az ACN56-ot [RB CMVpromoter vezérletével expresszálva],
ACN56-ot az alábbiak szerint állítunk elő. p56cDNS-t tartalmazó plazmidot úgy állítunk elő, hogy az ACNP53-plazmidban lévő p53-cDNS-t [Wills et al., Humán Gene Therapy 5, 1079-1088 (1994)] helyettesítjük pET9a-Rb56-plazmidból izolált, 1,7 kb méretű Xbal/BamHI-fragmentummal [Antelman et al., Oncogene 10, 697-704 (1995)], amely p56-cDNS-t tartalmaz. Az így kapott plazmid a p56 381-928. aminosavait, Ad5 fordított terminális ismétlődő szekvenciát, virális csomagolószignálokat és Ela-enhanszert tartalmaz, melyet humán citomegalovírusból származó, azonnali korai promoter (CMV) és Ad2 három részből álló vezető cDNS-szekvencia követ p56-expresszió vezérlése céljából. A p56-cDNS-t Ad2-szekvencia (4021-10462.) követi pBR322-háttérben. Ezt a plazmidot EcoRI-enzimmel linearizáljuk és bsp106-tal emésztett DL327 [E3-deletált; Thimmappaaya et al., Cell 31, 543-551 (1982)] vagy h5ile4 [E4-deletált; Hemstrom et al., J. Vírol. 62, 3258-3264 (1988)] nagy fragmentumával együtt kotranszfektáljuk. A rekombináns vírusokat limitált hígítással tisztítjuk tovább.
B. Celluláris proliferáció
Ebben a kísérletben tenyészetben lévő sejtvonalakat fertőzünk rekombináns adenovírus RB-konstrukciókkal annak meghatározása céljából, hogy mekkora mértékű az RB-polipeptid relatív expressziója és a sejtproliferációra kifejtett hatás.
H358-sejtek (ATCC No. Crl 5807) és MDA-MB468sejtek (ATCC No. HTB 132, mell-adenokarcinómasejtek) esetén, 5000 sejtet szélesztünk tenyésztőhelyenként normál növesztési tápközegben, 96 tenyésztőhelyet tartalmazó mikrotitertálcára (Costar), és egy éjszakán át inkubáljuk 37 °C-on, 7% szén-dioxidban. A vírusokat sorozathígítjuk növesztés! tápközegben, és a sejtek fertőzésére használjuk azokat a jelölt dózisban, 48 óra hosszáig. Ekkor hozzáadunk 3H-timidint (Amersham, 0,5 pCi/tenyésztőhely), és a sejteket 37 °C-on inkubáljuk további 3 óra hosszáig a tenyésztés befejezéséig. Az A7r5-sejteket (ATCC CRL1444, patkánysimaizomból származik) és A10-sejteket (ATCC CRL 1476, patkánysimaizomból származik) 3000 sejt/tenyésztőhely sűrűséggel szélesztjük 0,5% FCS-t tartalmazó DME-be (A7r5-sejteket) vagy 20% FCS-t tartalmazó DME-be (A10-sejteket). A vírust sorozathígítjuk a szélesztő tápközegbe, és a sejtek fertőzésére használjuk azokat az ábrákon jelölt dózisban. A fertőzés és a jelölési eljárás ugyanaz A10-sejtek esetén, mint a H358- és MDA-MB468-sejtek esetén, kivéve azt, hogy
HU 226 662 Β1 μθ jelölést alkalmazunk tenyésztőhelyenként. Az A7r5-sejteket nem fertőzzük még vírussal a szélesztés utáni 48. óráig. A fertőzés után 48 órával a szérumkoncentrációt 10% FCS-re emeljük, és 2 pCi/tenyésztőhely 3H-timidint adagolunk, és a sejteket 37 °C-on inkubáljuk további 3 óra hosszáig a tenyésztés befejezéséig. Valamennyi sejtről leszívjuk a tápközeget a tenyésztőhelyen, a sejteket tripszinnel kezeljük, és gyűjtjük azokat 96 helyet tartalmazó GF/C-szűrő és „Packard Top sejtszámláló alkalmazásával. Az eredmények a 13. és 14. ábrán láthatók, mint a tápközeges kezeléssel kiváltott kontrollproliferáció átlagos százaléka (+/- SD) a vírusdózis függvényében.
Tehát a 13. ábrán p56-adenovíruskonstrukciók A10 és A7R5 jelű izomsejtekre kifejtett hatásainak összehasonlítását láthatjuk. A CMV által vezérelt p56vírus (CAN 56) körülbelül ugyanakkora mértékben gátolta az A10 növekedését, mint az aktinpromoter által vezérelt E2F-fúziós konstrukciók (ASN586-56 #25,26). A 14. ábrán az adenovíruskonstrukciók hatásait ábrázoljuk az MDA Μβ468 jelű, mellráksejtvonalra, és a H358 jelű, nem kissejtes tüdőkarcinóma-sejtvonalra. Ezekben a kísérletekben az aktinpromoter által vezérelt E2F-p56 hatástalan volt, miközben a CMV-promoter által vezérelt p56 hatékony volt nem simaizomsejtek növekedésének gátlására.
Annak meghatározása céljából, hogy vajon nem simaizomsejtek adenovírussal való fertőzésre hajlamosabbak-e, mint az alkalmazott simaizom-sejtvonalak, négy sejtvonalat (H358, MB468, A7R5 és A10) megfertőzünk 5 fertőzési egység (MOI) β-galaktozidázt expresszálni képes adenovírussal [AC6GL; Wills et al., Humán Gene Therapy 5, 1079-1088 (1994)], és a β-galfestődés mértékét vizsgáljuk. Amint a 15. ábrán (felső részen) bemutatjuk, a nem simaizom-sejtvonalak szignifikánsan hajlamosabbak voltak a fertőzésre, mint a simaizom-sejtvonalak. Egy további tesztben sejteket ACN56tal fertőzünk több fertőzési egységgel (50, 100, 250, 500), és a megfertőzött sejtekben lévő p56 mennyiségét autoradiográfiával detektáljuk. Ahogyan a 15. ábrán látható (alsó részen), a nem simaizom-sejtvonalak szignifikánsan több p56-ot tartalmaztak, mivel fertőzésre való nagyobb hajlamuk következtében a fertőzött sejtek több vírust tartalmaztak, és emiatt több kópia p56-templátot nem szövetspecifikus CMV-promoter által vezérelve.
Egy további kísérletben meghatározzuk simaizomból származó aktinpromoter specifitását simaizomszövetre. Ebben a kísérletben különböző promoterekkel vezérelt β-gal-konstrukciókkal fertőzött sejtekben mérjük a β-gal-expresszió mértékét. Ahogyan a 19. ábrán láthatjuk, fertőződésre való kisebb hajlamuk ellenére a simaizomsejtekben az expresszió csak ezekben a sejtekben volt egyértelmű simaizomból származó alfa-aktinpromoter alkalmazásával.
A 21. ábrán CMV által vezérelt p56 rekombináns adenovírus (ACN56E4) hatásainak összehasonlítása látható humán simaizomból származó alfa-aktinpromoter által vezérelt E2F-p56 fúziós konstrukció (ASN286-56) és olyan kontroll-adenovíruskonstrukció hatásaival, amely vagy CMV- vagy simaizomból származó alfa-aktinpromotert tartalmazott szintézisirányban elhelyezkedő transzgén nélkül (ACNE3- vagy ASBE3-2izolátumok, sorrendben). A vizsgálati eljárásban 3H-timidin-felvételt mérünk simaizom-sejtvonalban (A7R5) vagy nem simaizom-sejtvonalban (MDA-MBA468, mellkarcinóma). Az eredmények izomszövet-specifitást mutatnak simaizomból származó alfa-aktinpromoter alkalmazása esetén, és specifikus gátlást p56 és E2F-p56transzgének esetén egyaránt, megfelelő kontrolijaikhoz viszonyítva.
C. Resztenózis gátlása
A ballonsérülés modellje Clowes és munkatársai által leírtakra alapul [Clowes, Láb. Invest. 49, 327-333 (1983)]. 400-500 g tömegű, hím Sprague-DawIey-féle patkányokat elaltatunk nátrium-pentobarbitál intraperitoneális injekciójával (45 mg/kg, Abbot Laboratories, North Chicago, Illinois). A bal, közönséges nyaki verőér elágazását egy középvonalú metszéssel hozzáférhetővé tesszük, és a bal, közönséges belső és külső nyaki verőér-artériákat Ideiglenesen elkötjük. 2F, embolektómiás katétert (Baxter Edwards Healthcare Corp., Irvine, CA) bevezetünk a külső nyaki verőérbe, és tovább vezetjük a közönséges nyaki verőér távolabbi (dlsztális) elkötése felé. A ballont feltöltjük nátrium-klorid-oldattal, és az érmetszés helye felé húzzuk háromszor felfújt, dezendotelizált sérülést létrehozva, azután a katétert visszahúzzuk. 10 pl adenovírust [1*109 pfu Ad-RB (ACNRb) vagy Ad-p56 (ACN56)] injektálunk 100 μΙ-re hígítva 15%-os (wt/vol) Poloxamer 407-tel (BASF, Parsippany, N. J.) vagy Ad-6-Gal-lal (1*109 pfu, a fentebb leírtak szerint hígítva) egy punkciós tűn keresztül, amely közvetlenül a nyaki verőér elágazása mellé, az artéria ideiglenesen izolált szegmensébe van Inszertálva. Az adenovírusoldatot 20 percig inkubáljuk, majd a virálls Infúziót leállítjuk, és a punkciós tűt kivesszük. A proximális nyaki verőér-artériát azután elkötjük, és a véráramot helyreállítjuk a közönséges nyaki verőér-artériában az érelkötés eltávolításával. A kísérleti eljárást jóváhagyta az „Institutional Animál Care and Use Committee”, és összhangban van a „Guide fór the Care and Use of Laboratory Animals által leírtakkal (NIH közlemény No. 86-23, átdolgozva 1985-ben).
A patkányokat a kezelést követően 14 nappal elpusztítjuk pentobarbital intraperitoneális injekciójával (100 mg/kg). A bal közönséges nyaki verőér-artéria eredeti ballonsérült szegmensét az omohyoidizom proximális szélétől a nyaki verőér elágazásáig nátrium-klorid-oldattal átáztatjuk, és kimetsszük a környező szövettől szabaddá téve. A szövetet 100%-os metanolban fixáljuk a paraffinba ágyazásig. Néhány 4 m-es metszetet vágunk ki mindegyik szövetmintából. Az egyes mintákból vett egyik metszetet hematoxilinnel és eozinnal festjük, egy másikat Richardson-féle kombinációval, elasztikus-háromszínű festékkel, hagyományos fénymikroszkópos analízishez.
Az artériametszetek hematoxilinnel, valamint eozinnal vagy elasztikus-háromszínű festékkel festett keresztmetszeteinek hisztológiai képeit digitalizáló ernyőre (Summagraphics) vetítjük, és az intimális, mediális
HU 226 662 Β1 és luminális területeket mérjük kvantitatív, morfometriás analízissel, számítógépes rajzolóprogram (MACMEASURE, 1.9 verzió, National Institute of Mentái Health) alkalmazásával.
Az eredményeket átlagoljuk ±S.E.M. A csoportok közötti különbségeket páratlan, lassú kifutású Studentféle t-teszt alkalmazásával analizáljuk. Meghatározzuk a statisztikai szignifikanciát, ha a nullhatás valószínűsége <0,05.
Az eredményeket a 17. és 18. ábrán bemutatjuk. A 17. ábrán neointima kialakulásának relatív gátlását ábrázoljuk grafikusan, ami azt mutatja, hogy p56 és RB képes gátolni neointima kialakulását. A 18. ábrán bemutatott fényképeken neointima drámai csökkenésére látható p56 jelenlétében.
Az adenovírussal kezelt nyaki ütőér-artériákat 2 nappal a ballonsérülés és fertőzések után vettük ki a patkányokból. A szöveteket foszfáttal puffereit formaiinban fixáltuk a paraffinos beágyazásig. A szövetből 4 pm-es keresztirányú metszeteket vágunk, és xilolban, valamint tiszta alkoholokban zsírtalanítjuk. Az endogén peroxidázt 1 %-os hidrogén-peroxiddal kvencseljük 30 percig. Az antigént 10 mM nátrium-citrát-pufferben, pH=6,0-on nyerjük vissza 95 °C-on 10 percig. Monoklonális anti-RB-antítestet alkalmazunk 10 pg/ml-es koncentrációban, PBS-ben, nedves kamrában 4 °C-on 24 óra hosszáig. Második antitestként „Unitect Mouse Immunochemistry Kit”-et (Oncogene Sciences, Uniondale, New York) alkalmazunk a gyártó utasításai szerint. Az antitestkomplexeket 3,3'-diamino-benzidinnel (DAB, Vector Laboratories, Burlingame, CA) tesszük láthatóvá. A metszeteket hematoxilinnel vékonyan utánszínezzük és tárgylemezre helyezzük. Az eredményeket a 20. ábrán mutatjuk be.
Az idézett hivatkozások teljes egészükben a kitanítás részét képezik.
Claims (18)
- SZABADALMI IGÉNYPONTOK1. Nukleinsav, amely egy olyan fúziós polipeptidet kódol, amely egy E2F transzkripciós faktor DNS-kötő doménjének és egy retinoblasztóma (RB)-polipeptid funkcionális növekedési szuppressziós doménjének fúzióját tartalmazza, ahol a fúziós polipeptidből hiányzik az E2F transzkripciós faktor funkcionális ciklin A-kinázkötő doménje.
- 2. Az 1. igénypont szerinti nukleinsav, amely egy adenovírusvektorba inszertált.
- 3. Expressziós vektor, amely egy olyan fúziós polipeptidet kódoló DNS-t tartalmaz, amely egy E2F transzkripciós faktor DNS-kötő doménjének és egy retinoblasztóma (RB)-polipeptid funkcionális növekedési szuppressziós doménjének fúzióját tartalmazza, ahol a fúziós polipeptidből hiányzik az E2F transzkripciós faktor funkcionális ciklin A-kináz-kötő doménje.
- 4. A 3. igénypont szerinti expressziós vektor, amely egy, a fúziót kódoló DNS-hez működőképesen kapcsolt szövetspecifikus promotert tartalmaz.
- 5. A 4. igénypont szerinti expressziós vektor, amelyben a szövetspecifikus promoter egy simaizomaktinpromoter.
- 6. A 3. igénypont szerinti expressziós vektor, amely egy virális vektor.
- 7. A 6. igénypont szerinti expressziós vektor, amely egy adenovírusvektor.
- 8. A 7. igénypont szerinti expressziós vektor, amely egy replikációhiányos adenovírusvektor.
- 9. A 3. igénypont szerinti expressziós vektor, amely egy plazmid.
- 10. Az 5. igénypont szerinti expressziós vektor, amelyben az aktinpromoter egy alfa-aktinpromoter.
- 11. Nukleinsavszekvencia, amely olyan fúziós polipeptidet kódol, amely az E2F 95-194. aminosavcsoportjainak (1 A. ábra) és az RB 379-928. aminosavcsoportjainak (2B. ábra) fúzióját tartalmazza.
- 12. A 11. igénypont szerinti nukleinsavszekvenciát tartalmazó vektor.
- 13. A 12. igénypont szerinti vektor, amely egy virális vektor.
- 14. A 13. igénypont szerinti vektor, amely egy adenovírusvektor.
- 15. A 12. igénypont szerinti vektor, amely replikációhiányos adenovírusvektor.
- 16. A 11. igénypont szerinti nukleinsavszekvencia, amely tartalmaz továbbá egy szövetspecifikus promotert, ahol a fúziós polipeptid a szövetspecifikus promoter vezérlete alatt expresszálódik.
- 17. A 16. igénypont szerinti nukleinsavszekvencia, amelyben a szövetspecifikus promoter egy simaizomaktinpromoter.
- 18. A 17. igénypont szerinti nukleinsavszekvencia, amelyben a simaizom-aktinpromoter egy alfa-aktinpromoter.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US75151796A | 1996-11-15 | 1996-11-15 | |
| US08/801,092 US6074850A (en) | 1996-11-15 | 1997-02-14 | Retinoblastoma fusion polypeptides |
| PCT/US1997/021821 WO1998021228A1 (en) | 1996-11-15 | 1997-11-13 | Tissue specific expression of retinoblastoma protein |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HUP9903864A2 HUP9903864A2 (hu) | 2001-04-28 |
| HUP9903864A3 HUP9903864A3 (en) | 2001-09-28 |
| HU226662B1 true HU226662B1 (en) | 2009-06-29 |
Family
ID=27115430
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU9903864A HU226662B1 (en) | 1996-11-15 | 1997-11-13 | Nucleic acids coding for ezf-rb fusion polypeptides and expression vectors containing the same |
Country Status (16)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US6902731B1 (hu) |
| EP (1) | EP0948520B1 (hu) |
| JP (1) | JP4109721B2 (hu) |
| KR (1) | KR100336551B1 (hu) |
| CN (1) | CN100338219C (hu) |
| AT (1) | ATE286908T1 (hu) |
| AU (1) | AU723660B2 (hu) |
| BR (1) | BR9712767B1 (hu) |
| CA (1) | CA2271478C (hu) |
| DE (1) | DE69732246T2 (hu) |
| ES (1) | ES2234040T3 (hu) |
| HK (1) | HK1019751A1 (hu) |
| HU (1) | HU226662B1 (hu) |
| IL (1) | IL129922A0 (hu) |
| NZ (1) | NZ335738A (hu) |
| WO (1) | WO1998021228A1 (hu) |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1054969A2 (en) * | 1998-02-12 | 2000-11-29 | Curagen Corporation | Retinoblastoma protein complexes and retinoblastoma interacting proteins |
| AU6497799A (en) * | 1998-10-15 | 2000-05-01 | Canji, Inc. | Methods and compositions to induce antitumor response |
| US6649158B1 (en) | 1998-10-15 | 2003-11-18 | Canji, Inc. | Methods and compositions to induce antitumor response |
| KR100841815B1 (ko) * | 1998-10-15 | 2008-06-26 | 캔지, 인크. | 선택적으로 복제하는 바이러스 벡터 |
| US7691370B2 (en) | 1998-10-15 | 2010-04-06 | Canji, Inc. | Selectivity replicating viral vector |
| WO2002050101A1 (en) * | 2000-12-19 | 2002-06-27 | The Council Of The Queensland Institute Of Medical Research | Retinoblastoma-binding protein |
| US6866994B2 (en) * | 2001-05-30 | 2005-03-15 | Neomatrix, Llc | Noninvasive intraductal fluid diagnostic screen |
| CN103463646A (zh) * | 2013-09-19 | 2013-12-25 | 浙江大学 | E2f1蛋白在制备诊断和治疗骨肉瘤药物中的应用 |
| GB2544843B (en) * | 2015-07-14 | 2022-08-03 | Professional Compounding Centers Of America Pcca | Poloxamer-based intralesional injections for the delivery of chemotherapeutic agents |
Family Cites Families (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4235871A (en) | 1978-02-24 | 1980-11-25 | Papahadjopoulos Demetrios P | Method of encapsulating biologically active materials in lipid vesicles |
| US4501728A (en) | 1983-01-06 | 1985-02-26 | Technology Unlimited, Inc. | Masking of liposomes from RES recognition |
| US5019369A (en) | 1984-10-22 | 1991-05-28 | Vestar, Inc. | Method of targeting tumors in humans |
| US4837028A (en) | 1986-12-24 | 1989-06-06 | Liposome Technology, Inc. | Liposomes with enhanced circulation time |
| CA2092323A1 (en) | 1990-10-01 | 1992-04-02 | George Y. Wu | Targeting viruses and cells for selective internalization by cells |
| AU3434393A (en) | 1992-01-17 | 1993-08-03 | Regents Of The University Of Michigan, The | Targeted virus |
| CA2133323C (en) | 1992-04-03 | 2010-10-26 | Francis C. Szoka, Jr. | Self-assembling polynucleotide delivery system |
| WO1993020221A1 (en) | 1992-04-03 | 1993-10-14 | Young Alexander T | Gene therapy using targeted viral vectors |
| WO1994006923A1 (en) | 1992-09-24 | 1994-03-31 | The University Of Connecticut | Modification of a virus to redirect infectivity and enhance targeted delivery of polynucleotides to cells |
| US5656609A (en) | 1992-09-24 | 1997-08-12 | University Of Connecticut | Method of enhancing and/or prolonging expression of gene introduced into a cell using colchicine |
| ZA947065B (en) * | 1993-09-13 | 1995-05-03 | Univ California | Therapeutic use of the retinoblastoma susceptibility gene product |
| US5473056A (en) * | 1993-10-13 | 1995-12-05 | Merck & Co., Inc. | E2F-2, a novel mammalian transcription factor |
-
1997
- 1997-11-13 KR KR1019997004327A patent/KR100336551B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1997-11-13 AU AU55899/98A patent/AU723660B2/en not_active Ceased
- 1997-11-13 NZ NZ335738A patent/NZ335738A/en not_active IP Right Cessation
- 1997-11-13 DE DE69732246T patent/DE69732246T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1997-11-13 HU HU9903864A patent/HU226662B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1997-11-13 IL IL12992297A patent/IL129922A0/xx active IP Right Grant
- 1997-11-13 CN CNB971813175A patent/CN100338219C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1997-11-13 CA CA002271478A patent/CA2271478C/en not_active Expired - Fee Related
- 1997-11-13 BR BRPI9712767-1A patent/BR9712767B1/pt not_active IP Right Cessation
- 1997-11-13 JP JP52295898A patent/JP4109721B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1997-11-13 EP EP97952238A patent/EP0948520B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-11-13 WO PCT/US1997/021821 patent/WO1998021228A1/en active IP Right Grant
- 1997-11-13 ES ES97952238T patent/ES2234040T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1997-11-13 AT AT97952238T patent/ATE286908T1/de not_active IP Right Cessation
-
1999
- 1999-05-19 US US09/315,116 patent/US6902731B1/en not_active Expired - Fee Related
- 1999-05-19 US US09/315,113 patent/US6379927B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-10-15 HK HK99104577A patent/HK1019751A1/xx not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO1998021228A1 (en) | 1998-05-22 |
| CA2271478A1 (en) | 1998-05-22 |
| HUP9903864A2 (hu) | 2001-04-28 |
| CN1244870A (zh) | 2000-02-16 |
| US6379927B1 (en) | 2002-04-30 |
| US6902731B1 (en) | 2005-06-07 |
| AU5589998A (en) | 1998-06-03 |
| HK1019751A1 (en) | 2000-02-25 |
| ES2234040T3 (es) | 2005-06-16 |
| DE69732246T2 (de) | 2005-12-08 |
| BR9712767B1 (pt) | 2010-11-30 |
| JP2001503638A (ja) | 2001-03-21 |
| NZ335738A (en) | 2001-02-23 |
| EP0948520B1 (en) | 2005-01-12 |
| BR9712767A (pt) | 1999-10-26 |
| CA2271478C (en) | 2003-02-04 |
| EP0948520A1 (en) | 1999-10-13 |
| JP4109721B2 (ja) | 2008-07-02 |
| KR100336551B1 (ko) | 2002-05-11 |
| IL129922A0 (en) | 2000-02-29 |
| AU723660B2 (en) | 2000-08-31 |
| DE69732246D1 (de) | 2005-02-17 |
| CN100338219C (zh) | 2007-09-19 |
| EP0948520A4 (en) | 2003-03-12 |
| KR20000053323A (ko) | 2000-08-25 |
| HUP9903864A3 (en) | 2001-09-28 |
| ATE286908T1 (de) | 2005-01-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5648478A (en) | Tissue-specific enhancer active in prostate | |
| Takada et al. | Cytoplasmic retention of the p53 tumor suppressor gene product is observed in the hepatitis B virus X gene-transfected cells | |
| JP2001525173A (ja) | 遺伝子発現を誘導するための組成物および方法 | |
| US20070244064A1 (en) | Methods and compositions to induce antitumor response | |
| PT918874E (pt) | Vectores de expressao episomicas de autoreproducao que conferem uma expressao genica especifica dos tecidos | |
| US20080166373A1 (en) | METHODS AND COMPOSITIONS FOR DELIVERY AND EXPRESSION OF INTERFERON-alpha NUCLEIC ACIDS | |
| JP2008301832A (ja) | インターフェロン−α核酸の送達および発現のための方法および組成物 | |
| HU226662B1 (en) | Nucleic acids coding for ezf-rb fusion polypeptides and expression vectors containing the same | |
| US6503498B1 (en) | Apolipoprotein A-1 adenovirus vector compositions and methods | |
| US6608037B2 (en) | TCF responsive element | |
| WO1998021228A9 (en) | Tissue specific expression of retinoblastoma protein | |
| JP2002507384A (ja) | アデノウイルスベクターの製造方法、それによって製造したベクターおよびその使用 | |
| IL129922A (en) | A unique form of expression for retinoblastoma protein tissue | |
| CA2178745A1 (en) | A novel tumor suppressor gene | |
| MXPA99004499A (en) | Tissue specific expression of retinoblastoma protein | |
| WO1996015245A1 (en) | A process of inhibiting non-neoplastic pathological cell proliferation | |
| JP2003523722A (ja) | 抗新生物性組成物およびその使用 | |
| US20020152486A1 (en) | Vascular specific regulatory elements contained in the desmin 5' flanking region | |
| MXPA00005516A (es) | Composiciones y metodos para inducir la expresion de genes | |
| AU3521101A (en) | Methods and compositions for delivery and expression of interferon-alpha nucleic acids | |
| AU3521301A (en) | Methods and compositions for delivery and expressions of interferon-alpha nucleic acids |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FH91 | Appointment of a representative |
Free format text: FORMER REPRESENTATIVE(S): BELICZAY LASZLO, S.B.G. & K. BUDAPESTI NEMZETKOEZI SZABADALMI IRODA, HU Representative=s name: DR. LANG TIVADARNE, S.B.G. & K. SZABADALMI UEG, HU |
|
| FH92 | Termination of representative |
Representative=s name: BELICZAY LASZLO, S.B.G. & K. BUDAPESTI NEMZETK, HU |
|
| MM4A | Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees |