HU223006B1 - CD23-hoz kötődő vegyületek - Google Patents

CD23-hoz kötődő vegyületek Download PDF

Info

Publication number
HU223006B1
HU223006B1 HU9800339A HU9800339A HU223006B1 HU 223006 B1 HU223006 B1 HU 223006B1 HU 9800339 A HU9800339 A HU 9800339A HU 9800339 A HU9800339 A HU 9800339A HU 223006 B1 HU223006 B1 HU 223006B1
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
antibody
binding
cd11b
treatment
monocytes
Prior art date
Application number
HU9800339A
Other languages
English (en)
Other versions
HUT77572A (hu
Inventor
Jean-Yves Marcel Paul Bonnefoy
Original Assignee
Glaxo Group Ltd.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=27267444&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=HU223006(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Priority claimed from GB9421463A external-priority patent/GB9421463D0/en
Priority claimed from GBGB9512480.6A external-priority patent/GB9512480D0/en
Priority claimed from GBGB9513415.1A external-priority patent/GB9513415D0/en
Application filed by Glaxo Group Ltd. filed Critical Glaxo Group Ltd.
Publication of HUT77572A publication Critical patent/HUT77572A/hu
Publication of HU223006B1 publication Critical patent/HU223006B1/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/6432—Coagulation factor Xa (3.4.21.6)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/12—Antidiarrhoeals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/02—Drugs for disorders of the urinary system of urine or of the urinary tract, e.g. urine acidifiers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A61P27/14—Decongestants or antiallergics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/16—Otologicals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/7056—Lectin superfamily, e.g. CD23, CD72
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2839—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the integrin superfamily
    • C07K16/2845—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the integrin superfamily against integrin beta2-subunit-containing molecules, e.g. CD11, CD18
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2851—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the lectin superfamily, e.g. CD23, CD72
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21006—Coagulation factor Xa (3.4.21.6)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16211—Lymphocryptovirus, e.g. human herpesvirus 4, Epstein-Barr Virus
    • C12N2710/16222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16611—Simplexvirus, e.g. human herpesvirus 1, 2
    • C12N2710/16622—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Dermatology (AREA)

Abstract

A találmány CD23-hoz kötődő vegyületekre vonatkozik, amelyekgyulladásos, autoimmun vagy allergiás betegségek kezelésére vagymegelőzésére alkalmazhatók. A kötődő vegyületek lehetnek ellenanyagok;azok fragmense; egy ellenanyagot vagy annak fragmensét tartalmazómesterséges konstrukciók; vagy az ellenanyagok kötődését vagy azokfragmenseinek kötődését utánzó konstrukciók (mimetikumok); vagy azelőbbi kötődő vegyületek valamelyiké- nek származékai. ŕ

Description

A találmány tárgyát olyan különleges kötődő vegyületek képezik, amelyek gyulladásos, autoimmun és allergiás eredetű betegségek kezelésére alkalmazhatók.
A CD23 (FCeRII) a C-lektin-családba tartozó, II típusú molekula, e családba tartozik továbbá a limfocita „homing” receptor (MEL-14) és az endotheliális leukocita adhéziós molekula-1 (ELAM-1). Ez a molekula alacsony affinitású IgE-receptor. Emberben, különböző hematopoetikus sejttípusok expresszálnak felszínükön CD23-at, például a follikuláris dentritikus sejtek, Bsejtek, T-sejtek és makrofágok. A CD23 biológiai folyadékokban szolubilis formában is jelen van. A szolubilis CD23-molekulák (sCD23) a transzmembránreceptor proteolitikus hasítása révén keletkeznek. A CD23 több különböző aktivitással rendelkezik, ilyen például a sejtadhézió közvetítése, IgE- és hisztaminkibocsátás szabályozása, B-sejtek apoptózistól (sejthaláltól) való megvédése és a mieloid sejtszaporodás szabályozása. Ezek a funkcionális hatások meghatározott ligandumoknak a sejttel kapcsolódó CD23-hoz vagy az sCD23-hoz (oldható CD23-hoz) történő kötődésén keresztül jönnek létre; az utóbbi a citokinekhez hasonló módon fejti ki hatását [Conrad D. H. Annu Rév. Immunoi. 8, 149 (1991); Bonnefoy J. Y. és munkatársai: Curr. Opin. Immunoi. 5, 944 (1993)].
Számos inflammatorikus (gyulladásos eredetű) betegségben megfigyelték a CD23 fokozott expresszióját. A CD23-at kimutatták krónikus szinovitiszben (ízületi hártya gyulladásban) szenvedő betegből származó szinoviális (ízületi hártyából vett) biopsziákban, míg az sCD23 a normális tar- tományt meghaladó koncentrációban mutatható ki reumatoid arthritisben szenvedő betegek szérumában és szinoviális folyadékában [Bansal A. S., Olivér W., Marsh Μ. N., Pumphrey R. S. és Wilson P. B.: Immunogy 79, 285 (1993); Hellen E. A., Rowlands D. C, Hansel T. T., Kitas G. D. és Crocker J. J.: Clin. Pathol. 44, 293 (1991); Chomarat P., Brioloay J., Banchereau J. és Miossec P.: Artritis Rheum. 89, 234 (1993); Bansal A. és munkatársai: Clin. Exp. Immunoi. 89, 452 (1992); Rezonew R. és Newkrk Μ. M.: Clin. Immunoi. Immunpathol. 71, 156 (1994)]. Ezenfelül, reumatoid arthritisben szenvedő betegek szérumában található sCD23-szintek kapcsolatba hozhatók a betegség súlyosságával, és párhuzamosan alakulnak a szérumban a reumatoid faktor mennyiségével [Bansal A. S. és munkatársai: Clin. Exp. Rheumatol. 12, 281 (1994)]. A pro- inflammatorikus citokinek - úgy tűnik - különösen lényeges funkciót töltenek be reumatoid arthritisben, és feltételezik, hogy a TNF-α és IL-Ιβ központi szerepet játszanak az ízületek károsodásának létrejöttében (Brennan F. M., Chantry D., Jackson A., Maini R. M. és Feldman M.: Br. J. Rheumatol. 31, 293 (1992)].
Kimutatták továbbá, hogy a CD23-CD21 kölcsönhatások szerepet játszanak az IgE-termelődésben [Flores-Romo L. és munkatársai: Science 261, 1038 (1993); Aubry és munkatársai: Natúré 358, 505 (1992)].
A CDllb és CDI le adhéziós molekulák, amelyek számos sejt-sejt és sejt-mátrix kölcsönhatásban részt vesznek. A CDllb/CD18 és CDllc/CD18 (a CDllb és CD18, illetve a CDllc és CD18 kapcsolódása révén keletkező molekulák) több ligandum kötésére képesek, ilyenek például a felsoroltak: CD54, fibrinogén, Xfaktor, LPS, ConA és zimozán (Springer T. A.: Natúré 346, 425 (1990)]. A fenti kötőmolekulák szerepe azonban nem tisztázott teljesen. A CDllb/CD18 és CDllc/CD18 molekulák MAC-1 és pl50,95 néven is ismertek. Ezek a β2-integrin-családba tartoznak (amelyeket esetenként Leu-CAM-molekuláknak, azaz leukocita adhéziós molekuláknak is neveznek). A fenti családba tartozik továbbá az LFA-1 (amely CDlla/CD18 molekulaként is ismert).
Az EP 0205405 számú európai szabadalmi leírásban IgE-kötő limfocita sejtreceptorokkal (FCeR) szemben irányuló Mab-kat (monoklonális ellenanyagokat) ismertetnek, amelyek keresztreakciót adnak humán immunglobulin-E-kötő faktorral (IgE-BF), valamint azok származékait ismertetik. Ishii N. és munkatársai [J. Invest. Dermatol., 102, 321-327 (1994)] ismertették, hogy anti-CD23 antitestek nagy dózisa egérmodellben képes az összes szenzitivitást iniciálé sejtet eliminálni, és ezáltal az allergia egy formáját, a kontakt szenzitivitást megelőzni. Heyman és munkatársai [European Journal of Immunology, 23 (7), 1739-1742 (1993)] arról tudósítottak, hogy egerek anti-CD23 antitesttel történő előkezelése meggátolta egy antigénspecifikus IgG és IgM antitestválasz IgE közreműködésével történő fokozódását. A WO 93/04173 számú nemzetközi közzétételi iratban FCEL-hez (alacsony affinitású FCeRII IgE-receptorhoz) vagy FCLH-hoz (nagy affinitású FCeRII-receptorhoz) kötődő polipeptideket írnak le, amelyek azonban lényegében nem képesek kötődni a többi FCEL- vagy FCEH-receptorokhoz. Allergiás betegségek kezelésére alkalmazhatók FCEL- vagy FCEH-specifikus polipeptidek (amennyiben a FCEH-specifikus polipeptid nem képes FCEH-receptorok közti keresztkötések létrehozására és hisztaminkibocsátás kiváltására).
Az EP 069728 számú európai szabadalmi leírás humán limfocita IgE-receptorokkal szemben irányuló Mab-kat ismertet.
Az EP 0259585 számú európai szabadalmi leírás tárgyát CDllb/CD18 és CDllc/CD18 (a CDllb és CD18, illetve a CDllc és CD18 kapcsolódása révén keletkező molekulák) több ligandum kötésére képesek, ilyenek például a felsoroltak: CD54, fibrinogén, Xfaktor, LPS, ConA és zimozán (Springer T. A.: Natúré 346, 425 (1990)]. A fenti kötőmolekulák szerepe azonban nem tisztázott teljesen. A CDllb/CD18 és CDllc/CD18 molekulák MAC-1 és pl50,95 néven is ismertek. Ezek a β2-integrin-családba tartoznak (amelyeket esetenként Leu-CAM-molekuláknak, azaz leukocita adhéziós molekuláknak is neveznek). A fenti családba tartozik továbbá az LFA-1 (amely CDI la/CD18 molekulaként is ismert).
Az EP 0205405 számú európai szabadalmi leírásban IgE-kötő limfocita sejtreceptorokkal (FCeR) szemben irányuló Mab-kat (monoklonális ellenanyagokat) ismertetnek, amelyek keresztreakciót adnak humán immunglobulin-E-kötő faktorral (IgE-BF), valamint azok származékait ismertetik.
I
HU 223 006 Bl
A WO 93/04173 számú nemzetközi közzétételi iratban FCEL-hez (alacsony affmitású FCeRII IgE-receptorhoz) vagy FCLH-hoz (nagy affmitású FCeRII-receptorhoz) kötődő polipeptideket írnak le, amelyek azonban lényegében nem képesek kötődni a többi FCELvagy FCEH-receptorokhoz. Allergiás betegségek kezelésére alkalmazhatók FCEL- vagy FCEH-specifikus polipeptidek (amennyiben a FCEH-specifikus polipeptid nem képes FCEH-receptorok közti keresztkötések létrehozására és hisztaminkibocsátás kiváltására).
Az EP 069728 számú európai szabadalmi leírás humán limfocita IgE-receptorokkal szemben irányuló Mab-kat ismertet.
Az EP 0259585 számú európai szabadalmi leírás tárgyát humán B-limfocitákon található felszíni IgE-receptorok (FCcR) felismerésére képes Mab-k képezik.
A WO 93/02108 számú nemzetközi közzétételi iratban terápiás célra alkalmazható, főemlősből származó részt tartalmazó („primatised”) ellenanyagokat írnak le.
Meglepő módon azt találtuk, hogy CD23-hoz kötődő vegyületek alkalmazhatók különböző betegségek kezelésére és azok megelőzésére, közelebbről, ízületi gyulladás (arthritis) kezelésére és megelőzésére. A korábbiakban nem volt ismert olyan adat, amely ilyen irányú alkalmazási lehetőségre utalt volna, annak ellenére, hogy számos, CD23-mal foglalkozó közlemény jelent meg.
A találmány tárgyát képezik CD23-hoz kötődő vegyületek, amelyek alkalmazhatók gyulladásos, autoimmun és allergiás eredetű betegségek kezelésére vagy azok megelőzésére.
A kötővegyület hatását kifejtheti úgy, hogy gátolja a CD23 és az ahhoz kötődő ligandum közti kölcsönhatást. Az említett gátlóhatás vizsgálatára in vitro vizsgálati eljárások, például radioimmun vizsgálati eljárások alkalmazhatók.
A kötővegyület lehet izolált formában, vagy képezheti gyógyászati készítmény részét. Az említett vegyület előnyösen steril formában van. Általánosságban CD23-ra specifikus kötővegyületek alkalmazhatók a fent említett betegségek kezelésére/megelőzésére.
Kimutattuk, hogy a találmány szerinti kötővegyületek alkalmazhatók in vivő, gyulladásos vagy autoimmun betegségek kezelésére vagy megelőzésére.
A fenti megfigyelések azért bírnak nagy jelentőséggel, mivel számos ilyen betegség kezelése nehéz vagy lehetetlen, annak ellenére, hogy azok természetét és okait régóta kutatják. Ez különösen érvényes az arthritisek vonatkozásában, amely gyakran középkorú embereket érint, és az érintett betegeket arra kényszeríti, hogy idő előtt feladják munkájukat. Arthritisek kezelésére alkalmas hatékony eljárások kidolgozása számos kutatócsoport régi keletű célját képezi.
Előnyös kötővegyületek például a következők: ellenanyagok; azok fragmensei; vagy ellenanyagokat vagy azok fragmenseit tartalmazó mesterséges konstrukciók; vagy az ellenanyagok kötődését vagy azok fragmenseinek kötődését utánzó mesterséges konstrukciók. Ilyen kötővegyületeket tárgyalnak például Dougall és munkatársai [Tibtech 12, 372 (1994)].
Ilyen vegyületek lehetnek például teljes ellenanyagok, F(ab’)2-fragmensek, Fab-fragmensek, Fv-fragmensek, ScFv-fragmensek, más fragmensek, CDR-peptidek és az említettek hatását utánzó vegyületek (mimetikumok). A fentiek kinyerhetők/előállíthatók szakember számára jól ismert eljárásokkal. Például, enzimes emésztést alkalmazhatunk F(ab’)2- és Fab-fragmensek előállítására (például IgG-molekulákat pepszinnel vagy papainnal hasíthatunk). A leírásban „ellenanyag” alatt valamennyi fent említett lehetőséget értjük.
Alkalmazhatunk rekombináns ellenanyagokat is. Az ellenanyagokat humanizálhatjuk vagy előállíthatunk kiméra ellenanyagokat.
Az EP-A-0239400 számú európai közzétételi iratban tipikus humanizált ellenanyagokat ismertetnek, amelyekben az ellenanyag variábilis doménjának CDR-régiói (kompatibilitást meghatározó régiói) más fajból származnak, mint a keretrégiók. A CDR-ek származhatnak patkány vagy egér monoklonális ellenanyagokból. A módosított ellenanyag variábilis doménjának keretrégiói és az ellenanyag konstans doménjai származhatnak humán ellenanyagból. Az ilyen humanizált ellenanyagok embernek történő beadásukat követően elhanyagolható mértékű immunválaszt váltanak ki, a patkány- vagy egérellenanyaggal szemben emberben létrejövő immunválaszhoz képest.
Az ellenanyag lehet továbbá kiméra ellenanyag, mint például a WO 86/01533 számú nemzetközi közzétételi iratban ismertetett típusú ellenanyag.
A WO 86/01533 számú nemzetközi közzétételi iratban ismertetett kiméra ellenanyag antigénkötő régiót és nemimmunglobulin régiót tartalmaz. Az antigénkötő régió ellenanyag könnyű lánc variábilis dómén vagy nehéz lánc variábilis dómén. Tipikusan, a kiméra ellenanyag mind könnyű lánc, mind nehéz lánc variábilis doménokat tartalmaz. A nemimmunglobulin régió annak C-terminális végén van fuzionálva az antigénkötő régióval. A nemimmunglobulin régió tipikusan egy nemimmunglobulin protein, ez lehet enzimrégió, ismert kötőspecifitással rendelkező proteinből származó régió, a fenti régió származhat proteintermészetű toxinból vagy bármely, gén által expresszált proteinből. A kiméra ellenanyag két régióját hasítható linkerszekvencia (kapcsolószekvencia) kötheti össze.
Az ellenanyag lehet humán IgG, például patkány vagy egér variábilis régiókat tartalmazó (kiméra) vagy ilyen CDR-eket tartalmazó (humanizált) IgGl, IgG2, IgG3, IgG4; IgM; IgA; IgE vagy IgD.
Alkalmazhatunk primatizáló technikákat is, például a WO 93/02108 számú nemzetközi közzétételi iratban ismertetett technikákat.
Szakember számára nyilvánvaló, hogy a leírásban szereplő meghatározott kötővegyületeken felül azok származékai is alkalmazhatók. „Származékoknak” nevezzük a leírt vegyületek variánsait, amelyek az eredeti vegyületekhez képest egy vagy több aminosavszubsztitúciót, -deléciót vagy -inszerciót tartalmaznak, azzal a kikötéssel, hogy azok az említett kötő aktivitással rendelkeznek. Ezek a származékok előnyösen jelentős mértékű aminosavszekvencia-azonosságot mutatnak a találmány szerinti kötő vegyületekkel.
HU 223 006 Bl
Az aminosavszekvencia-azonosság fokát komputerprogramok alkalmazásával határozhatjuk meg, például a „bestfit” program alkalmazásával [Smith és Waterman: „Advances in Applied Mathematics”, 482-489. oldal, (1981)], hogy megtaláljuk valamely két szekvencia közt a legnagyobb fokú hasonlóságot mutató szegmenseket. A szekvenciák összevetése az aminosavhasonlóságokat jellemző mátrix alkalmazásával kapott pontszám maximalizálásán alapul [lásd például a következő szakirodalmi helyet: Schwarz és Dayhof: „Atlas of protein Sequence and Structure”, Dayhof Μ. O. (szerk.), 353-358. oldal (1979)].
A szekvencia azonosságának foka előnyösen legalább 50%, előnyösebben legalább 75%. A szekvenciaazonosság foka még előnyösebben legalább 90%, és legelőnyösebben legalább 95%.
Szakember számára nyilvánvaló, hogy nem feltétlenül kell nagyfokú szekvenciaazonosságnak fennállnia, mivel különböző aminosavak gyakran felcserélhetők más, hasonló tulajdonsággal rendelkező aminosavakkal, anélkül, hogy a protein egyes sajátságai lényegesen megváltoznának, vagy a változtatás a protein tulajdonságait hátrányosan érintené. Például a glicin, valin, leucin vagy izoleucin aminosavak (alifás oldallánccal rendelkező aminosavak) gyakran helyettesíthetők egymással. Egymással gyakran helyettesíthető további aminosavak például a következők: fenil-alanin, tirozin és triptofán (aromás oldallánccal rendelkező aminosavak); lizin, arginin és hisztidin (bázikus oldallánccal rendelkező aminosavak); aszpartát és glutamát (savas oldallánccal rendelkező aminosavak); aszparagin és glutamin (amidoldallánccal rendelkező aminosavak); cisztein és metionin (kéntartalmú oldallánccal rendelkező aminosavak). „Származéknak” nevezünk tehát olyan aminosavszekvencia-variánsokat is, amelyek az említett szekvenciához képest egy vagy több, ilyen „konzervatív” cserét tartalmaznak.
A találmány tárgyát képezik továbbá a találmány szerinti kötővegyületek fragmensei vagy azok származékainak fragmensei, amennyiben azok a leírt kötő aktivitással rendelkeznek. A fragmensek előnyösen legalább tíz aminosav hosszúságúak, de lehetnek hosszabbak is (például akár 50-100 aminosav hosszúságúak).
A találmány szerinti kötővegyületek alkalmazhatók több humán betegség kezelésére vagy megelőzésére, például a következő betegségek esetén: arthritis, lupus erythematosus, Mashimotos-féle thyreoiditis (pajzsmirigygyulladás), sclerosis multiplex, diabétesz (cukorbetegség), uveitis, dermatitis, psoriasis, csalánkiütés (urticaria), nefrotikus szindróma, glomerulonephritis, gyulladásos bélbetegségek, colitis ulcerosa, Crohn-betegség, Sjögren-szindróma, allergiák, asztma, rhinitis, ekcéma, GVH, COPD, a hasnyálmirigy szigeteinek gyulladása, bronchitis (különösen krónikus bronchitis) vagy diabétesz (különösen I típusú diabétesz).
A találmány szerinti vegyületek alkalmazhatók továbbá a CD23 és különböző ligandumok közti kölcsönhatások vizsgálatára, például CD23 és CD21 közti, CD23 és CDI lb közti, CD23 és CDI le közti, CD23 és egy 70-85 kDa endotheliális sejtprotein (amely lehet 76 kDa, 80 kDa vagy 85 kDa méretű sejtprotein) közti, vagy CD23 és egy 115 kDa méretű endotheliális protein közti kölcsönhatás vizsgálatára (amely utóbbi feltehetően rokonságban áll a 70-85 kDa endotheliális proteinnel). Feltételezzük, hogy a fenti kölcsönhatások közül egy vagy több in vivő végbemegy. A fenti kölcsönhatások megakadályozására képes ellenanyagok vagy más kötővegyületek különösen előnyösek, mivel azok feltehetően különösen előnyösen alkalmazhatók citokinek által közvetített gyulladásos hatások mérséklésére. Alkalmazhatók továbbá B-sejtes malignomák, például krónikus limfocitás leukémia és „szőrös” sejtes („hairy cell”) leukémia ellen.
A találmány szerinti kötővegyületek különösen előnyösen alkalmazhatók reumatoid arthritis kezelésére vagy megelőzésére. Anélkül, hogy igényünket valamilyen elmélettel korlátozni kívánnánk, a következő magyarázatok lehetségesek.
A reumatoid arthritisnél található gyulladásos ízületi hártyában (szinoviában) a makrofágok mind CD23-at, mind CDllb és CDI le p2-integrineket expresszálnak, lehetővé téve, hogy a fenti szövetben homotípusos kölcsönhatások menjenek végbe. Ezenfelül lehetséges az is, hogy szolubilis CD23-molekulák diffúndálnak az ízületi hártyán keresztül, és azok kötődnek az integrinligandumokkal. In vivő létezhet tehát egy, CD23-CDllb/CDllc kölcsönhatásokat magában foglaló pozitív aktivációs hurok. Reumatoid arthritisben szenvedő betegekben ennek jelenléte magyarázatul szolgálhat egyes, a betegség fellángolásában és krónikussá válásában szerepet játszó kóroki mechanizmusokra, és alátámasztja azt a feltevést, hogy az ízületekre lokalizálódva, a makrofágok maguk képesek a gyulladás fenntartására és a gyulladás fellángolásának kiváltására egy olyan reakcióúton keresztül, amelyben szerepet játszanak CD23-molekulák, CDllb és CDI le p2-integrinek, valamint TNF-α, IL— 1 β és IL-6 proinflammatorikus citokinek.
Anti-CD23 alkalmazásán alapuló terápia megvalósulhat továbbá az IgE-immunválasz gátlásán keresztül.
Korábbi közlemények szerint patkányok in vivő kezelése anti-CD23-ellenanyaggal az IgE-termelődés antigénspecifikus gátlásához vezetett, feltehetően az IgE-elkötelezett B-sejtek teljes éréséhez szükséges CD23-CD21 kölcsönhatások gátlásán keresztül [Flores-Romo és munkatársai: Science 261, 1038 (1993)].
A találmány tárgyát képezik a fenti válasz gátlására képes, CD23-hoz kötődő vegyületek.
Strukturális szempontból, a CD21-protein felépítése a következő: 15 [Moore és munkatársai: „Molecular cloning of the cDNA encoding the Epstein Barr Vírus C3d rceptor (complement receptor type 2) of humán B lymphocyte”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 9194 (1987)] vagy 16 [Weis és munkatársai: „Structure of the humán B Lymphocyte receptor fór C3d and Epstein Barr Vírus and relatedness to other members of the family of C3/C4 binding proteins”, J. Exp. Med. 167, 1047 (1988)], 60-75 aminosavból felépülő ismétlődő egységből, az úgynevezett rövid konszenzus imétlődő
HU 223 006 Bl egységekből („short consensus repeats”, SRC) álló extracelluláris dómén, amelyet egy (24 aminosavból álló) transzmembrándomén és egy, 34 aminosavból álló intracitoplazmatikus régió követ. Az extracitoplazmatikus SRC-régiókon belül deléciókat hordozó CD21-mutánsok alkalmazásával [Carel és munkatársai: „Structural requirements fór C3d,g/Epstein Bán Vírus receptor (CR2/CD21) ligand binding, intemalization, and viral infection”, J. Bioi. Chem. 265, 12293 (1990)] kimutattuk, hogy a CD23 a CD21-en kötődik az 5-8. és 1-2. SRC-khez. A CD23 kötődése az 5-8. SRC-khez lektinszerű kölcsönhatás, amelyben a 295. pozícióban és a 370. pozícióban található Asn aminosavon található szénhidrátok játszanak szerepet. Ezzel szemben a CD23 kötődése az 1 -2. SRC-khez protein-protein kölcsönhatás [Aubry és munkatársai: „CD23 interacts with a new functional extracytoplasmic domain involving N-linked oligosaccharides on CD21”, J. Immunoi. 152, 5806 (1994)]. Vizsgáltuk a CD21 további ligandumjainak (EBV, C3d,g és INF-α) hatását a CD23 CD21-hez történő kötődésére, valamint az Igtermelődés szabályozására, IL-4 jelenlétében. Csupán az EBV-részecskék és EBV-eredetű peptidek voltak képesek a CD23 CD21-hez történő kötődésének gátlására. Ezenfelül az EBV-peptid szelektív módon csökkentette az IgE- és IgG4-termelődést, és fokozta az IgM-termelést. A fenti adatok szerint a CD23 kötődése a CD21 EBV-kötő helyére szelektív módon szabályozza a humán Ig-termelést IL-4 jelenlétében.
Megint anélkül, hogy igényünket bármely elmélettel korlátozni kívánnánk, úgy véljük, hogy a találmány szerinti megoldás hatékony kezelést tesz lehetővé, a proinflammatorikus citokinek de novo szintézisének gátlásán keresztül.
Ez szemben áll azzal a megközelítési móddal, amely szerint az ellenanyagokat egyszerűen a gyulladásos szövetekben már eredetileg jelen levő citokinmolekulák közvetlen neutralizálására alkalmazták.
Megjegyzendő továbbá, hogy a szakirodalomban találhatók olyan közlemények, amelyekben számos ellenanyagot, valamint számos olyan betegséget sorolnak fel, amelyek kezelésére az említett ellenanyagok feltételezhetően alkalmazhatók, de a legtöbb lehetséges kombinációra vonatkozólag nem szolgáltatnak semmilyen konkrét bizonyítékot vagy adatot. Ilyen közlemény például a WO 93/02108 számú nemzetközi közzétételi irat, amely elsősorban bizonyos kiméra ellenanyagok termelését ismerteti.
A jelen találmány nyilvánvalóan eltér az említett közleményektől, mivel olyan, meghatározott molekulákhoz kötődő vegyületeket ismertetünk, amelyekről - az ismertetett adatok és magyarázatok tükrében egyértelműen bizonyítást nyert, hogy alkalmazhatók bizonyos betegségek kezelésére vagy megelőzésére.
A találmány szerinti kötővegyületek különösen előnyösen alkalmazhatók allergiás betegségek kezelésében vagy megelőzésében, ezen belül nem IgE közvetítette betegségek kezelésére vagy megelőzésére. Az említett kötővegyületek alkalmazhatók colitis ulcerosa kezelésére és megelőzésére. A fenti vegyületek alkalmazásának lehetősége felmerül továbbá Crohn-betegség kezelésében és megelőzésében.
A találmány szerinti kötővegyületeket alkalmazhatjuk egymagukban vagy immunszupresszív hatóanyagokkal kombinálva, például szteroidokkal, ciklosporinnal kombinálva; vagy ellenanyagokkal kombinálva, például antilimfocita ellenanyagokkal; előnyösebben, toleranciát kiváltó antiautoimmun vagy antiinflammatorikus hatóanyaggal, például CD4+T-sejt-gátló hatóanyaggal, például anti-CD4-ellenanyaggal (előnyösen egy blokkoló vagy nem kimerítő ellenanyaggal), antiCD8-ellenanyaggal; TNF-antagonistával, például antiTNF-ellenanyaggal vagy TNF-gátlóval, például oldható TNF-receptorral; vagy más hatóanyagokkal, mint például NSAID-vegyületekkel kombinálva.
A kötővegyületet általánosságban steril, gyógyszergyártásban elfogadható készítmény részeként szereljük ki. Ezt a gyógyászati készítményt bármely alkalmas formában előállíthatjuk, a betegnek történő adagolás kívánt módjától függően, ami lehet adagolási egység formájában, vagy lehet reagenskészlet része. Ilyen reagenskészlet rendszerint (de nem szükségszerűen) a reagenskészlet alkalmazására vonatkozó utasításokat is tartalmaz.
A kötővegyületet általánosságban parenterális úton adagoljuk, például intravénásán, intramuszkulárisan (izomba) vagy szubkután (bőr alá). A kötővegyületet általában injekcióban vagy infúzióban adjuk be. Ebből a célból a kötővegyületet gyógyászatilag elfogadható hordozóanyagot vagy hígítóanyagot tartalmazó gyógyászati készítményben szereljük ki. Bármely alkalmas hordozóanyagot vagy hígítóanyagot alkalmazhatunk, például izotóniás sóoldatot. A gyógyászati készítményhez adhatunk továbbá stabilizátort, például fémkelátort, hogy a vegyület réz által kiváltott hasítását elkerüljük.
Kelátorként alkalmazható EDTA, DPTA vagy nátrium-citrát.
Az említett készítmény, különösen légzőszervi rendellenességek kezelése esetén, beadható szájon át (orálisan) vagy orron át (nazálisán), spray alkalmazásával.
A készítmény formulázható krémként vagy kenőcsként, különösen bőrbetegségek kezelése céljából.
A gyógyászati készítmény előállítható továbbá cseppek vagy hasonló készítmény formájában, szembe történő adagolás céljára, például tavaszi kötőhártya-gyulladás kezelésére.
Injektálható oldatok esetén hordozóanyagként alkalmazhatunk például vizet, alkoholokat, poliolokat, glicerint és növényi olajokat.
A gyógyászati készítmény tartalmazhat továbbá konzerválószereket, szolubilizálóanyagokat, stabilizálóanyagokat, nedvesítőanyagokat, emulgeálószereket, édesítőszereket, színezékeket, illatosítóanyagokat, sókat, puffereket, bevonóanyagokat vagy antioxidánsokat. Ezenfelül a készítmények tartalmazhatnak más terápiásán aktív hatóanyagot is.
A találmány szerinti vegyületek adagolása több faktortól függ, például a kezelendő betegség vagy rendellenesség természetétől, a beadás módjától és a kezelendő egyén korától és testtömegétől. Anélkül, hogy igényünket bármely meghatározott dózisra korlátoznánk, pél5
HU 223 006 Bl dául parenterális adagolás esetén, tipikus felnőtt kezelésére alkalmazható napi dózis 0,01-50 mg/kg találmány szerinti kötővegyület (rendszerint a fent említett gyógyászati készítmény részeként). A napi adag még előnyösebben 0,05-10 mg/kg, például 0,1-2 mg/kg.
Ezt a dózist szükség szerinti gyakorisággal ismételhetjük. A készítményt tipikusan hetente 1-7 alkalommal adjuk be. Amennyiben mellékhatások lépnének fel, a dózis mennyiségét és/vagy a beadás gyakoriságát csökkentenünk kell.
Gyógyászati készítmény tipikus egységdózisa legalább 1 mg kötővegyületet, előnyösen 1 -1000 mg kötővegyületet tartalmaz.
A találmány tárgyát képezi továbbá vizsgálati eljárás annak meghatározására, hogy egy adott, CD23-hoz kötődő vegyület alkalmazható-e gyulladásos, autoimmun vagy allergiás betegségek kezelésére, amely eljárás szerint meghatározzuk azt, hogy a vegyület képes-e CD23 és CDllb közti kölcsönhatás gátlására, vagy CD23 és CDI le közti kölcsönhatás gátlására, vagy CD23 és egy, endothel sejteken expresszálódó, 70-85 kDa (például 76 kDa, 85 kDa vagy 80 kDa) méretű protein vagy egy 115 kDa méretű protein közti kölcsönhatás gátlására.
A fenti vizsgálati eljárás alkalmazható vegyületek vagy molekulák szűrésére, a megfelelő molekulákat expresszáló sejtvonalak alkalmazásával. Az említett vizsgálati eljárásokban előnyösen a CDI lb-t CDI lb/CD18 formájában, a CDllc-t CDllc/CD18 formájában alkalmazzuk. A CDllb/CD18 és CDllc/CD18 a sejtfelszínen együtt expresszáltatható.
Alkalmazhatjuk bármely vizsgálati technikát, alkalmazhatunk például protein-nem protein vizsgálati eljárásokat (például a proteinek kémiai vegyületekkel vagy cukrokkal történő kölcsönhatásának vizsgálatára), protein-protein vizsgálati eljárásokat vagy protein-sejt vizsgálati eljárásokat.
A találmány szerinti megoldást a továbbiakban konkrét megvalósítási példákon keresztül kívánjuk szemléltetni, csupán a csatolt ábrákra történő utalással.
Az 1. ábrán arthritis megelőző kezelésének hatásait szemléltetjük, egerekben, CD23-ellenanyag alkalmazásával.
A 2. ábrán egerekben, anti-CD23-ellenanyag alkalmazásával végzett kezelés hatásait ábrázoltuk, kifejlődött arthritis esetében; ebben a kísérletben az ellenanyagkezelést több alkalommal végeztük.
A 3. ábrán egerekben, anti-CD23-ellenanyag alkalmazásával végzett kezelés hatásait foglaltuk össze, kifejlődött arthritis esetében; ebben a kísérletben az ellenanyagkezelést egyetlen alkalommal végeztük.
A 4a. és 4b. ábrákon egerekben, monoklonális antiCD23-ellenanyag alkalmazásával végzett kezelés hatásait foglaltuk össze, kifejlődött arthritis esetében; a kezelést több alkalommal végeztük.
A 4c. és 4d. ábrákon egerekben, monoklonális antiCD23-ellenanyag F(ab’)2- és Fab-fragmenseinek alkalmazásával történő kezelés hatásait foglaltuk össze, kifejlődött arthritis esetében; a kezelést több alkalommal végeztük.
Az 5a. ábrán CD23-liposzómák kötődését szemléltetjük véreredetű, CD14-pozitív mononukleáris sejtekhez.
Az 5b. ábrán különböző, CD23-hoz történő kötődés alapján, affinitásos eljárással tisztított proteineket mutatunk be SDS-PAGE gélen.
A 6. ábrán a CD23-liposzómák véreredetű aktivált monocitákhoz történő kötődésének százalékban kifejezett gátlását ábrázoltuk, egyes monoklonális ellenanyagok alkalmazásával.
A 7. ábrán CD23-liposzómák különböző transzfektált sejtekhez történő kötődését ábrázoltuk.
A 8. ábrán különböző hatóanyagok CD23-CD1 lb és CD23-CDllc kölcsönhatásra kifejtett hatását szemléltetjük.
A 9. ábrán CD23 CDI lb-hez és CDI lc-hez történő kötődésének hatásait ábrázoltuk monocitákban, a nitrittermelődésre és az oxidatív „burst” részét képező folyamatokra.
A 10. ábrán azt szemléltettük, hogy a rekombináns CD23 CDI lb-hez és CDI lc-hez történő kötődése monocitákban, specifikus módon fokozza a citokintermelődést.
Példák (Az alábbi példákban esetenként az „ip.”, „id.” és „n” rövidítéseket használjuk. Ezek megfelelnek az „intraperitoneális”, „intradermális” és „állatok száma” kifejezéseknek.)
1. példa
Egerek megelőző célú kezelése arthritis kialakulásával szemben, anti-CD23-ellenanyagok alkalmazásával
Hím DMA/1-egereket (8-12 hetes korú egereket) 0,1 ml, 1:10 arányban hígított „Fentanyl/Fluanisol Hyponorm” ip. alkalmazásával elhódítottunk, és intradermálisan, a farok tövénél, 100 mg, Freund-féle komplett adjuvánsban (Difco) emulgeált, szarvasmarha-eredetű II típusú kollagénnel (CII) kezeltünk. A ClI-immunizációt követő 13. napon a vizsgálandó egereket egyetlen injekció alkalmazásával, protein-A-Sepharose gélen tisztított, nyúlban termelt anti-CD23-IgG-vel kezeltük (BioProcessing, UK) (2 mg/egér; ip.) (n=16, - ). A tisztított anti-CD23-IgG 3-5% specifikus ellenanyagot tartalmazott.
Az ellenanyag előállításának részletes leírása megtalálható a következő szakirodalmi helyen: Flores-Romo
L. és munkatársai: Science 261, 1038 (1993). Röviden: poliklonális ellenanyagot állítottunk elő nyúlban, a teljes hosszúságú humán CD23, 150-321. aminosavpozí6
HU 223 006 Bl ciónak megfelelő, csonkított formájával szemben [Kikutani és munkatársai: Cell 47, 657 (1986)]. A csonka polipeptidet E. coliban állítottuk elő, és E. coli mosott sejtüledékéből tisztítottuk, ioncserélő és gélszűrő kromatográfiás eljárásokkal.
A protein 25 kDa molekulatömeggel rendelkezett, és tisztítást követően nyulaknak injektáltuk. A kapott antiszérum, rekombináns humán CD23 alkalmazásával, mind ELISA-, mind protein-immunblot-eljárás szerint pozitívnak bizonyult.
Ezt követően, protein-A-Sepharose affmitásos oszlopon végzett kromatográfiával IgG-frakciót izoláltunk. Kontrollállatokat normális nyúlszérumból protein-A alkalmazásával tisztított IgG-vel kezeltünk (2 mg/egér) (n=17; ·-·). Az egereket naponta megvizsgáltuk arthritis klinikai tüneteire nézve. A betegség súlyosságát az egyes lábak esetében Williams és munkatársai eljárása szerint [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 9784 (1992)] a következő skála alapján pontoztuk: 0=tünetmentes; 3=jelentős duzzanat, eritéma és mozgáskorlátozottság; a betegségnek az egyes lábakra való kiterjedtségét az érintett lábak száma alapján határoztuk meg. A csoportokat statisztikai analízissel hasonlítottuk össze, az (a) kísérletben kétmintás t-teszt alkalmazásával, a (b) kísérletben nemparaméteres Mann-Whitney-teszt alkalmazásával; *0,05>p>0,01; **0,01>p>0,005; ***0,0005>p.
Nem volt eltérés megfigyelhető sem a betegség fellépésének idejében (a betegség jelentkezésének átlagos ideje +sem: a tesztcsoportban 20+0,7; a kontrollcsoportban 20+0,5 volt), sem a betegség előfordulási arányában (mindkét csoport esetében az állatok 100%-ában arthritis alakult ki), ami azt jelenti, hogy az anti-CD23ellenanyaggal történő kezelésnek a T-sejt-proliferáció és az IgG antikollagén ellenanyag-termelődés kiváltásának idején nincs hatása a betegség kialakulására. A klinikai tünetek jellemzésére alkalmazott pontszámok azonban összességében alacsonyabbak voltak az anti-CD23ellenanyaggal kezelt egerekben (la. ábra). A legszembetűnőbb a lábak érintettségének mérsékelt csökkenése volt az anti-CD23-ellenanyaggal kezelt csoportban (lb. ábra). A fenti eredmények szerint a kezelés lényegesen befolyásolta a betegség hosszú távú kimenetelét.
2. példa
Kialakult arthritis kezelése (több alkalommal végzett kezelés)
Arthritist váltottunk ki az 1. példában ismertetettek szerint, és az egereket naponta megfigyeltük a gyulladás látható jeleire nézve. Véletlenszerűen három csoportra osztott egereken kezelést alkalmaztunk a gyulladás klinikai tünetei megjelenésének 1. napján (1. nap) és két nappal később (3. nap). A tesztelendő egerek protein-Atisztított anti-CD23-IgG-t kaptak (200 pg/injektálás; n=6, 400 pg/injektálás; n=8, -);
a kontroliegerek normális nyúlszérumból származó, protein-A-tisztított IgG-t kaptak (200 pg/injektálás; n=15, •---·). A betegség súlyosságát az 1. példában ismertetettek szerint értékeltük (2a. ábra). A gyulladás súlyosságát úgy határoztuk meg, hogy az első lábon, amelyen az arthritis kialakulását észleltük, az 1. naptól kezdve, tolómérce alkalmazásával mértük a duzzanat növekedésének mértékét („Proctest-2T”, Kroeplin Langenmesstechnik). A csoportokat kétmintás t-teszt alkalmazásával hasonlítottuk össze; *0,05>p>0,01; *0,01>p>0,005; *0,0005>p.
A dózissal arányosan, a betegség jelentős mértékű javulása volt megfigyelhető. A CD23-IgG antiinflammatorikus sajátságát világosan mutatta az ellenanyagkezelésben részesült csoport esetében a lábak duzzanatának csökkent mértéke.
3. példa
Kialakult arthritis kezelése (egy alkalommal végzett kezelés)
A kísérlet menete megegyezett a 2. példában leírtakkal, azzal az eltéréssel, hogy az egereket csak egy alkalommal kezeltük, az arthritis kialakulásának 1. napján, egerenként 2 mg, protein-A-tisztított anti-CD23-IgGvel (n= 10, - ) vagy normális nyúlszérumból tisztított IgG-vel (n=10, ·---·). A klinikai tünetek jellemzésére alkalmazott pontszámok meghatározása és a végtagok érintettségének megállapítása az 1. példában leírtak szerint történt.
Az 1. napon történő egyetlen injektálás szignifikáns hatása a végtagok érintettségére arra utal, hogy az ízületek érintettségének vonatkozásában az arthritis kialakulását követően alkalmazott egyetlen injektálás elegendő a betegség további súlyosbodásának megakadályozására (3b. ábra).
4. példa
Kialakult arthritis kezelése monoklonális antiCD23-ellenanyag alkalmazásával
Arthritises DBA/l-egereket az 1. példában ismertetettek szerint nyertünk. A betegség klinikai tüneteinek első jelentkezésekor az egereket véletlenszerűen négy csoportra osztottuk, és az 1. és 3. napon monoklonális anti-CD23-ellenanyag három különböző dózisának alkalmazásával kezeltük [B3B4, D. Conrad professzor ajándéka, Richmond, Virginia, USA; Pharmingen; J. Immunoi. 138, 1845 (1987)]; B3B4 25 pg/injekció, n=4, O...O; B3B4 50 pg/injekció, n=4, ----;
B3B4 100 pg/injekció, n=5, - ). A kontrollegerek PBS-kezelésben részesültek (n=6, ·---·). A klinikai tünetek jellemzésére alkalmazott pontszámok meghatározása és az 1. naptól számított végtagduzzanat megállapítása a 2. példában leírtak szerint történt.
pg B3B4 ellenanyag intraperitoneális injektálása elegendő volt a terápiás hatás eléréséhez, amint azt a fenti kezelési tervet követően, a klinikai tünetek súlyosságának jellemzésére alkalmazott pontszámok és az érintett végtagok számának csökkenése jelezte. Ezzel szemben, 25 pg monoklonális ellenanyaggal kezelt egerekben a betegség súlyosságának vonatkozásában nem volt kimutatható az 50 pg B3B4 ellenanyaggal történt kezelést követően tapasztalható terápiás hatás (4. ábra). A B3B4 ellenanyag dózisfüggő antiinflammatorikus hatását szemléltetjük a 4b. ábrán, amely szerint az arthritises lábak duzzanata 50 pg vagy 100 pg B3B4 jelű monoklonális ellenanyag ip. injektálását követően nem fo7
HU 223 006 Bl kozódott az 1. naptól számítva. Az egyéb klinikai tünetek értékelésére használt mutatókhoz hasonlóan a betegség jelentkezését követően alkalmazott 25 pg monoklonális CD23-ellenanyag nem rendelkezett kimutatható terápiás hatással, és a lábak duzzanatának fokozódása ha- 5 sonlóképp alakult, mint a kontroloknál (4b. ábra). Hasonlóképp, 50 pg, affinitásos eljárással tisztított poliklonális anti-CD23-IgG-vel történő kezelést követően a már kifejlődött arthritis súlyossága szignifikánsan csökkent (az adatokat nem tüntettük fel).
Az anti-CD23-ellenanyaggal (mind monoklonális, mind poliklonális ellenanyaggal) történő kezelést követően a klinikai tünetek javulását az arthritises lábakból vett szövettani vizsgálattal is igazoltuk. A kezelt egerek esetében a betegség súlyossága mérséklődött, a porcés csontszövet károsodása kevésbé volt szembetűnő, és az ízületi hártya alatt található réteg sejtes beszűrődése jelentősen csökkent. Ezenfelül az anti-CD23-ellenanyaggal kezelt állatoknál a súlyosan érintett ízületek aránya lényegesen alacsonyabb volt, mint a kontrollegereknél (0% versus 94%); míg a normális struktúrát meg10 tartó ízületek aránya az előbbieknél szignifikánsan nagyobbnak bizonyult (80% versus 0%).
A fentieket szemlélteti az 1. táblázat.
1. táblázat
A lábak hisztopatológiai vizsgálatának eredménye: Az egerek kezelését és az ízületek feldolgozását a 4. ábra esetében alkalmazott módon végeztük. A szövettani készítményeket a módszereknél ismertetettek szerint értékeltük
I Kezelés Normális (%) Enyhe(%) Közepes (%) Súlyos Összes vizsgált ízületek száma
Anti-CD23 (n=6) 80 8 12 0 59
Kontroll (n=6) 0 0 6 94 69
A fenti táblázat szövettani készítmények összehason- 25 lításának eredményeit mutatja, anti-CD23-ellenanyaggal kezelt egerekből és kontrollegerekből származó ízületekre vonatkoztatva. Az egereket a 4. ábrával kapcsolatban fent ismertetettek szerint kezeltük.
A hisztopatológiai vizsgálatot az alábbiak szerint vé- 30 geztük.
Az első, arthritises tüneteket mutató lábat az állat leölését követően eltávolítottuk, 10% (tömeg/térf.) puffereit formaiinban fixáltuk, majd puffereit formaiinban (5,5%) oldott EDTA-val dekalcifikáltuk. Ezt követően a 35 lábakat paraffinba beágyaztuk, metszetet készítettünk belőle, majd azt hematoxilinnel és eozinnel festettük. A szövettani készítményeket (lábanként 3 metszetet) a következő szempontok alapján értékeltük: enyhe=kismértékű szinovitisz, a porckárosodás és csontpusztulás különálló foltokra korlátozott; mérsékelt=kimutatható szinovitisz és szövetpusztulás, de az ízület felépítése ép; súlyos=kiteqedt szinovitisz és szövetpusztulás, az ízület felépítésének károsodásával. Az egyes metszetekben található valamennyi ízületet értékeltünk, majd meghatároztuk a nor- 45 mális, enyhe és súlyos elváltozást mutató ízületek százalékos arányát. A gyulladás mértékét a lábak vastagságának a kezelés első napján mérhető vastagsághoz viszonyított növekedése alapján, tolómércével határoztuk meg (, ,Proctest-2T”, Kroeplin Langenmesstechnik).
A fenti kezelés specifitását igazolták azok az eredmények is, amelyeket arthritises egerek B3B4 jelű monoklonális ellenanyag Fab- és F(ab’)2-fragmenseivel végzett kezelésével kaptunk. Az intakt IgG-molekulánál ugyan kevésbé, de a B3B4 jelű monoklonális ellenanyag Fab- és F(ab’)2-fragmensei még hatékonynak bizonyultak, arra utalva, hogy az ellenanyag Fc-részének jelenléte nem feltétlenül szükséges az aktivitáshoz (2. táblázat). Ezenfelül, a B-sejteken nagy mennyiségben expresszáló CD72- és B220-molekulákkal szembeni ellenanyagok kismértékű terápiás hatást mutattak, vagy egyáltalán nem volt ilyen hatásuk (2. táblázat). Továbbá, a TNF-α- [Williams és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 36, 9784 (1992)] és a CD5- [Plater-Zyberk és munkatársai: Clin. Exp. Immunoi. 98, 442 (1994)] ellenanyagokkal történő összehasonlítás azt mutatta, hogy az általunk alkalmazott kísérleti körülmények mellett az anti-CD23-ellenanyaggal végzett kezelés volt a leghatásosabb (2. táblázat).
A monoklonális ellenanyagok alkalmazására vonatkozó további adatokat ábrázoltunk a 4c. és 4d. ábrákon. Ezeket az adatokat a következő kísérlet során kaptuk.
2. táblázat
Különböző kezelési tervek alkalmazására adott válaszok összehasonlítása
II típusú kollagénnel immunizált egereket az arthritis klinikai tünetei jelentkezésének 1. és 3. napján monoklonális ellenanyaggal ip. kezeltünk. Az 5. napon a kísérletben alkalmazott izotípuskontrollokhoz viszonyítva, százalékosan kifejezve, meghatároztuk a klinikai tünetek javulását.
Mab Klón Kezelés Izotípus Klinikai tünetek javulása (%)
CD23 B3B4 50 pgx2 75 pgx2 150 pgx2 patkány-IgG2a patkány-F(ab)2 patkány-Fab 74 52 56
HU 223 006 Bl
2. táblázat (folytatás)
Mab Klón Kezelés Izotípus Klinikai tünetek javulása (%)
TNF-a 1F3F3D4 50 pgx2 patkány-IgM 63
CD5 TIB 104 200 pg x 2 patkány-IgG2a 30
B220 TIB 146 200 pg χ 2 patkány-IgM 5
CD72 TIB 165 200 Mg x 2 egér-IgG2b 0
Nyolc-tizenkét (8-12) hetes, hím DBA/l-egereket 100 gg komplett Freund-féle adjuvánsban emulgeált, szarvasmarha-eredetű, II típusú kollagénnel kezeltünk.
A betegség klinikai tüneteinek első jelentkezésekor (±3 hét elteltével) az egereket az alábbi, monoklonális 15 ellenanyagokat tartalmazó készítményekkel injektáltuk, ip. (az injektálást az 1. és 3. napon végeztük):
B3B4 teljes IgG2a 50 gg/injekció ip., n=8;
B3B4Fab 150 gg/injekció ip., n=6;
B3B4 F(ab)2 75 gg/injekció ip., n=7; 20
M6 kontroll IgG2a 50 gg/injekció ip., n=7.
Az egereket naponta megvizsgáltuk, és az egyes lábak esetében értékeltük a betegség klinikai tüneteinek súlyosságát (max/láb=3; max/egér=12). A betegség klinikai tüneteinek értékelése során kapott eredménye- 25 két a 4c. ábrán ábrázoltuk.
Az első, arthritis jeleit mutató láb duzzanatát tolómércével végzett méréssel folyamatosan követtük.
A lábduzzanat értékelése során kapott eredményeket a 4d. ábrán összegeztük.
Az egereket az arthritis jelentkezését követő 10. napon leöltük, az első, arthritis jeleit mutató lábból metszeteket készítettünk, azokat fixáltuk, és hisztopatológiai vizsgálat céljára dekalcifikáltuk.
CD23 és CDllb, valamint CD23 és CDI le közti kölcsönhatás
Anélkül, hogy igényünket bármely elmélettel korlátozni kívánnánk, mivel nem teljesen világos, hogy az anti-CD23-ellenanyagok miként érik el a fenti meglepő hatást, feltételeztük, hogy az CD23 és CDllb és/vagy 40 CD23 és CDI le közti kölcsönhatás következménye lehet. A fenti lehetőség vizsgálatát szemléltetjük az 5-10. példákban és a csatolt ábrákon (lásd később).
Ezekben a példákban fluoreszcens liposzómákba foglalt, teljes hosszúságú rekombináns CD23-ról mutattuk 45 ki, hogy azok CDI lb/CD18-at vagy CDI lc/CD18-at kódoló cDNS-sel transzfektált COS-sejtekhez kötődnek, de nem kötődnek CDI la/CD18-at expresszáló transzfektánsokhoz. A CD23-liposzómák és CDllb/CD18- vagy CD 11 c/CD 18-transzfektált COS-sejtek közti kölcsönha- 50 tás anti-CDllb- vagy anti-CDllc-ellenanyaggal, valamint anti-CD23-ellenanyaggal specifikus módon gátolható volt. A fenti ligandumpárosítás funkcionális jelentőségét úgy szemléltettük, hogy a monocitákon található CDI lb-t és CDI lc-t célzottan, rekombináns CD23-mal 55 vagy anti-CDllb és anti-CDllc monoklonális ellenanyagokkal érintkeztettük, hogy a nitrit (NO2 _)-termelődés, az oxidatív termékek (H2O2) és proinflammatorikus citokinek (IL-Ιβ, IL-6 és TNF-α) szintjének jelentős emelkedését érjük el. A fenti, CD23 közvetítette hatá- 60 sokat az anti-CDllb, anti-CDllc és anti-CD23 monoklonális ellenanyagok Fab-fragmenseinek alkalmazása csökkentette. A fenti eredmények szerint, a CDllb és CDI le jelű, felszíni adhéziós molekulák CD23-receptorként működnek, és a fenti új ligandumpárosítás a monocitákban lényeges funkciókat szabályoz.
Az alábbiakban röviden ismertetjük az 5-10. példákban leírt kísérletek menetét (lásd az alábbiakban), és a mögöttük rejlő okfejtéseket.
Teljes vérből nyert mononukleáris sejteket fluoreszcens liposzómákba foglalt, rekombináns, teljes hosszúságú CD23-mal inkubáltunk, és „flow cytometriás” (áramlásos citometriás) eljárással analizáltunk [Pochon S. és munkatársai: J. Exp. Med. 176, 389 (1992)]. A sejtek egy részéhez - amelyek kettős festődés alapján CD14pozitív sejteknek (azaz monocitáknak) bizonyultak CD23-liposzómák kötődtek (5. példa, 5a. ábra). Annak bizonyítására, hogy a monociták képesek voltak CD23liposzómák megkötésére, vérből izolált mononukleáris sejteket FACS („fluorescein activated cell sorter”) készülékkel, CD14-pozitív és CD14-negatív populációra osztottunk (5. példa, 5a. ábra). Kimutattuk, hogy a CD23liposzómák csak a CD14-pozitív populációhoz kötődtek (5. példa, 5a. ábra). Mivel a monociták sem membránIgE-t, sem CD21-et nem expresszálnak (az adatokat nem tüntettük fel) - amely utóbbiak a CD23 ismert ligandumai -, megvizsgáltuk, hogy a monociták expresszálnak-e egy további CD23-receptort. Monocitákat lizáltunk, és sejtextraktumokat rekombináns oldható CD23mal kapcsolt affinitásoszlopon tisztítottunk. Az eluált anyag SDS-PAGE-analízise és ezüstfestése körülbelül 80 kDa és 160 kDa molekulatömegű („molecular weith”, MW) csíkok jelenlétét mutatta (5. példa, 5b. ábra). Monocitákon közismerten expresszálódó, a fenti MWtartományba eső antigénekkel szemben irányuló ellenanyagokat vizsgáltunk FACS készülékkel arra nézve, hogy képesek-e CD23-liposzómák monocitákhoz történő kötődését gátolni (6. példa, 6. ábra). Mind az antiCD1 lb, mind az anti-CDl le monoklonális ellenanyagok - különböző hatékonysággal - gátolták a CD23-liposzómák monocitákhoz történő kötődését (6. példa, 6. ábra). Az anti-CD13-, anti-CD49d-, anti-CD21- (egy monocitákon nem expresszálódó antigénnel szemben irányuló ellenanyag), valamint anti-CDl la-ellenanyag (az adhéziós molekulák β2-integrin családjának harmadik tagjával szemben irányuló ellenanyag) alkalmazása nem mutatott szignifikáns hatást (6. példa, 6. ábra). Ugyancsak vizsgáltuk a monocitákon nagy mennyiségben expresszálódó I. osztályú MHC-, II. osztályú MHC-, CD14- és CD45-antigénekkel szemben irányuló ellenanyagok hatását a
HU 223 006 Bl
CD23-liposzómák kötődésére. A felsoroltak közül egyik sem rendelkezett kimutatható hatással (az adatokat nem tüntettük fel). Az anti-CD18 monoklonális ellenanyag részben gátolta a CD23 kötődését. Ennek magyarázata lehet szterikus gátlás, vagy az, hogy az anti-CD18 monoklonális ellenanyag kötődése a CDllb- és CDllc-molekulák konformációjának megváltozását eredményezi. A CD23 affinitásoszlopról eluált monocitaeredetű proteinek immunreaktivitást mutattak anti-CDllc- (5. példa, 5b. ábra) és anti-CDllc/CD18 ellenanyagokkal (az adatokat nem tüntettük fel).
Annak kimutatására, hogy a CDllb/CD18 és CDllc/CDllb valóban a CD23 receptorai, CDllb-t és CDllc-t kódoló, teljes hosszúságú cDNS-eket tranziens módon, CD18-cDNS-sel együtt COS-sejtekbe transzfektáltunk. CDllb/CD18-at és CDllc/CD18-at expresszáló transzfektánsokról kimutattuk, hogy azok képesek CD23liposzómák kötésére, ezzel szemben a CDlla/CD18 expresszáló transzfektánsok nem kötődtek CD23-liposzómákhoz (7. példa, 7. ábra). A fenti jelenség magyarázata lehet az, hogy a CDllb és a CDI le egymással nagyobb fokú homológiát mutat, mint az említett molekulák CDlla-val szemben kimutatható homológiája. A kölcsönhatás specifitását úgy igazoltuk, hogy a CD23-liposzómakötődést anti-CDl lb, anti-CDl le és anti-CD23 monoklonális ellenanyagokkal gátoltuk. Ugyanezt az eredményt kaptuk akkor, amikor CDllb/CD18 és CDI lc/CD18 expresszáló BHK-sejteket alkalmaztunk (az adatokat nem tüntettük fel). A CD23-kölcsönhatás specifikus jellegének további bizonyítékaként leukocita adhézióra nézve deficiens („Leukocyte Adhesion Deficiency”) beteg véréből nyert, aktivált monociták - amelyek a β-alegységet kódoló génben létrejött mutáció következtében nem expresszáltak p2-integrineket - nem voltak képesek CD23liposzómákhoz történő kötődésre (az adatokat nem tüntettük fel). A fenti adatok összességében azt mutatják, hogy a CD23 normális humán monocitákon és transzfektánsokon kölcsönhatásba lép a CDllb- és CDllc-antigénekkel.
A CDllb és CDI le számos, sejt-sejt és sejt-mátrix kölcsönhatásban szerepet játszó adhéziós molekulák. A példák szerint a CDI lb/CD18 és CDI lc/CD18 további adhéziós szerepet tölthetnek be, annak révén, hogy képesek CD23-at kötni. A CD23 - úgy tűnik - az Xfaktoron található epitóphoz hasonló vagy azzal azonos epitópot ismer fel, hiszen az X-faktor dózisfiiggő módon képes a CD23-liposzómák kötődését gátolni (8. példa,
8. ábra), anélkül, hogy a monociták felszínén a CDllb vagy CDI le expresszálódását befolyásolná (az adatokat nem tüntettük fel). A további vizsgált ligandumok közül egyiknek sem volt hatása. A CD23 CDllb-vel és CDllc-vel létesített kölcsönhatása során feltehetően C típusú lektinként viselkedik. Az EDTA csökkenti a CD23 monocitákhoz történő kötődését (8. példa,
8. ábra), oly módon, hogy a CD23 kötődéséhez szükséges Ca2+-mal kelátot képez, és/vagy a ligandumoknak a CDllb-hez vagy CDllc-hez történő kötődéséhez szükséges divalens kationokkal kelátot képez [Altieri D. C. J. Immunoi. 147, 1891 (1991)]. A CD23-CDllb/CDllc kölcsönhatásban feltételezzük, hogy cukrok szerepet játszanak, de kizártuk a sziálsav szerepét, hiszen tunicamycin képes volt, de neuraminidáz nem volt képes CD23 monocitákhoz történő kötődését csökkenteni. A CD23 extracellulárisan tartalmazza az (Asp, Gly, Arg) aminosavtripletet, amely fordított orientációban az integrinreceptorok szokásos felismerési helye. Egy, a fenti triplettel szemben irányuló poliklonális ellenanyagot tehát arra nézve teszteltünk, hogy képes-e a CD23 monocitákhoz történő kötődését gátolni. A fenti esetben nem volt gátlás megfigyelhető, ami megerősíti fibrinogén alkalmazásakor a gátlás hiányát (8. példa, 8. ábra). Az IgE, amely a CD23 lektindoménjához kötődik, részben gátolta CD23 monocitákhoz történő kötődését (8. példa, 8. ábra). A fenti eredmények arra utalnak, hogy a CD23 a fenti kölcsönhatásban - részben cukor, részben proteintermészetű struktúrák felismerésén keresztül - C típusú lektinként hat, és ez a hatás emlékeztet a CD23 és CD21 közt létrejövő kölcsönhatás jellegére (Aubry J-P. és munkatársai: J. Immunoi. 152, 5806 (1994)].
A CD23 és CDllb, valamint CDI le közti kölcsönhatás funkcionális jelentőségének kiderítése céljából vizsgáltuk azt, hogy a CD23/CD1 lb vagy CD23/CD1 le kölcsönhatás monocitákban képes-e proinflammatorikus mediátorok, például nitrogén-oxid, H2O2 és citokinek kibocsátását kiváltani. Letapadás révén aktivált normális monociták célzott kezelése rekombináns, oldható CD23-mal vagy anti-CDl lb- vagy anti-CDl lcellenanyagokkal a NO2-termelődés fokozódását eredményezte, arra utalva, hogy a NO-reakcióút aktiválódott [Moncada S., Palmer R. M. J. & Higgs E. A.: Pharmacol. Rév. 43, 109 (1991)]. A CD23 nitrittermelődésre kifejtett hatását anti-CD23 monoklonális ellenanyag Fabfragmense, valamint nitro-arginin - a NO-szintézisreakcióút specifikus inhibitora - gátolta (9. példa, 9a. ábra). Az oxidatív „bursf ’ részét képező folyamatokról ugyancsak kimutattuk, hogy azok szabályozásában a CDllb és CDI le szerepet játszik, mivel mind a rekombináns, oldható CD23, mind az anti-CDl lb és antiCDllc monoklonális ellenanyagok hidroetidin etidiumbromiddá történő oxidálódását eredményezték monocitákban (9. példa, 9c. ábra). Ez megerősíti és bővíti azokat az eredményeket, amelyek szerint anti-CDl lb monoklonális ellenanyagok monocitákban az oxidatív „burst” részét képező folyamatok felerősödését eredményezik [Trezzini C, Schüepp B., Maly F. E. & Jungi T. W.: Brit. J. Haematol. 77, 16 (1991)]. A CD23 CDllb-hez és CDllc-hez történő kötődése véreredetű monocitákban korai specifikus Ca2+-áramlással volt kapcsolatos (az adatokat nem tüntettük fel).
Mivel az aktivált makrofágok proinflammatorikus citokinek előállításának lényeges forrását képezik, monocitákban vizsgáltuk rekombináns oldható CD23, valamint anti-CDl lb és anti-CDllc monoklonális ellenanyagok hatását az említett citokinek termelődésére. A rekombináns oldható CD23, valamint az anti-CDl lb és antiCDl le monoklonális ellenanyagok hatékonyan stimulálták az IL-Ιβ-, IL-6- és TNF-a-termelődést. A fenti hatás specifitását ugyancsak anti-CDl lb, anti-CDl le és anti-CD23 monoklonális ellenanyagok Fab-fragmenseinek alkalmazásával mutattuk ki (10. példa, 10. ábra). Erde10
HU 223 006 Bl kés módon az IL-1 és a TNF-α hatékonyan fokozta a CD23-liposzómák monocitákhoz történő kötődését (az adatokat nem tüntettük fel), arra utalva, hogy a CDI lbés CDllc-stimuláción és -szabályozáson keresztül egy esetleges citokin-autokrin hurok létezik.
5. példa
a) CD23-liposzómák kötődnek véreredetű, CD 14pozitiv mononukleáris sejtekhez (lásd 5a. ábrát)
Véreredetű, CD14-pozitív mononukleáris sejteket an- 10 ti-CD14 monoklonális ellenanyaggal (Becton Dickinson, Erembodegem, Belgium), majd egér-IgG- és IgM-ellenanyagokkal szemben birkában előállított, FITC-konjugált F(ab)2-ellenanyagokkal (Bioart, Maudon, Franciaország) festettünk; a FACS készülékkel („FACStar Plus”, Becton Dickinson) CD14-pozitív és CD14-negatív sejtpopulációra történő osztályozást megelőzően mindkét ellenanyagot 0,5% BSA-t és 0,05% nátrium-azidot tartalmazó PBS-ben hígítottuk. A különválasztott sejteket CD23-liposzómákkal vagy kontroll-liposzómákkal [0,5% BSA-t, 20 0,1% nátrium-azidot, 2 mmol/1 CaCl2-ot, 140 mmol/1 NaCl-ot és 20 mmol/1 HEPES-puffert (pH=7) tartalmazó PBS-ben szuszpendált glikophorin-A-liposzómákkal] festettük, és 2 órán át 4 °C-on inkubáltuk [Pochon S. és munkatársai : J. Exp. Med. 176, 389 (1992)]. Mosásokat köve- 25 tőén a sejteket FACS készülékkel analizáltuk (5000 eseményt észleltünk a választott körülmények mellett).
b) CD23 affinitásos eljárással tisztított, véreredetű monocitaproteinek látszólagos molekulatömege és a proteinek anti-CDllc monoklonális ellen- 30 anyaggal mutatott immunreaktivitása (lásd 5b. ábrát)
Véreredetű monociták lizátumát CD23-oszlopon, affinitáseljárással tisztítottuk, az eluált proteineket SDSPAGE-géleken szétválasztottuk, és nitro-cellulózra vit- 35 tűk át. A molekulatömeg-markereket a gél bal oldalán ábrázoltuk. A gélt ezüstfestéses eljárással kezeltük (bal csík). A filtereket izotípusnak megfelelő ellenanyaggal (középső csík) vagy anti-CDllc monoklonális ellenanyaggal (BU-15, jobb oldali csík) inkubáltuk, majd torma-peroxidázzal konjugált, kecskében termelt, antiegér-ellenanyag (Kpl; Gaithersburg, Massachusetts) jelenlétében inkubáltuk.
6. példa
Az anti-CDllb és anti-CDllc monoklonális ellenanyagok csökkentik a CD23-liposzómák aktivált monocitákhoz történő kötődését (6. ábra)
Monocitákat mononukleáris sejtekből Ficoll-gradiens alkalmazásával és műanyag edényhez tapasztással dúsítottunk 2 mmol/1 glutaminnal és 10% hőinaktivált FCS-sel kiegészített RPMI-1640 tápfolyadékban (Seromed, Berlin, Németország). Az aktivált monocitákat ezután CD23liposzómákkal inkubáltuk, 10 pg/ml koncentráció mellett alkalmazott, különböző anti-CD monoklonális ellenanyagok vagy izotípusazonos kontrollok (CTRL, Becton Dickinson) jelenlétében. A 25.3 és B-B15 jelű anti-CDlla monoklonális ellenanyagokat az Immunotech (Luminy, 15 Franciaország), illetve a Serotec (Oxford, Nagy-Britannia) cégektől szereztük be. A 44 jelű anti-CDl lb monoklonális ellenanyagot a Serotec, a mon.gran-1 ellenanyagot a Janssen (Beerse, Belgium), a Leu-15 ellenanyagot a Becton-Dickinson (Erembodegem, Belgium) és a Bear-1 ellenanyagot a Sera-Lab Ltd. (Sussex, NagyBritannia) cégektől szereztük be. A 3.9 jelű anti-CDllc ellenanyagot a Serotec, az SL9 jelűt a Sera-Lab, a BU-15 jelűt a „The Binding Site” (Birmingham, NagyBritannia) cégektől szereztük be. Az anti-CD13 (SJ1D1), anti-CDl 8 (BL5), anti-CD23 (mAb25) és anti-CD49d (HP2.1) monoklonális ellenanyagokat az Immunotech cég szállította. A BL13 jelű anti-CD21 monoklonális ellenanyagot az Immunotech, az OKB7 jelűt az „Ortho Diagnostics System Inc.” (Raritan, NJ), a BU-33 jelűt dr. MacLennantól (Birmingham University, Nagy-Britannia), a HB-5 jelűt az ATCC intézettől szereztük be, az OKB7 jelű ellenanyagot az „Ortho Diagnostics System Inc.” szállította (Raritan, NJ). Az anti-CD14, anti-CD3, anti-CD16 és anti-CD20 jelű monoklonális ellenanyagokat a Becton-Dickinson cégtől szereztük be. A sejteket FACS készülékkel analizáltuk, és az átlagos fluoreszcenciaintenzitást („mean fluorescence intensity”, MFI) mértük. Egy reprezentatív kísérlet adatait mutatjuk be. Eszerint kontroll-liposzómákkal festett sejtek MFI-értéke 40 6,5 volt, a CD23-liposzómákkal festett sejteké pedig 84,5. A gátlás százalékban kifejezett mértékét, aritmetikus lineáris MFI-értékek alkalmazásával, a következő képlet alapján számítottuk:
% gátlás=MFI [(CD23-lipo)] - [(CD23 -lipo)+Mab] xl00
7. példa
CD23-liposzömák rekombináns transzfektánsokon
CDllb/CD18 és CDllc/CD18 α,-láncaihoz kötődnek (lásd 7. ábrát)
CDI la-t kódoló cDNS-eket [Corbi A. L., Miller L.
J., O’Connor K, Larson R. S. & Springer T. A.: EMBO J. 6, 4023 (1987)] a pCDNAl plazmidba klónoztunk át 55 (Invitrogen, San Diego, CA). CDllb-t kódoló cDNS-t [Corbi A. L., Kishimoto T. K.., Miller L. J. & Springer T.
A.: J. Bioi. Chem. 263, 12403 (1988)] és CD18-at kódoló cDNS-t [Kishimoto T. K., O’Connor IC, Lee A., Roberts T. M. & Springer T. A.: Cell 48, 681 (1987)] a 60 (CD23-lipo) pCDM8 plazmidba klónoztunk [Seed B.: Natúré 329, 50 840 (1987)]. 20 pg DNS-t elektroporációs eljárással (260 V, 960 pFD), „Gene Pulser’-készülék (BioRad, Richmond, CA) és 0,4 cm méretű küvetták alkalmazásával, 150 mmol/1 NaCl-ot tartalmazó, 20 mmol/1 HEPESpufferben (pH=7,4), COS-7-sejtekbe (ATCC) transzfektáltunk. CDlla, CDllb, CDllc vagy CD18 alkalmazásával kotranszfekciót végeztünk, hogy a P2-integrinek sejtfelszíni expresszálódását elérjük. A kontrollok esetében egyláncú transzfekciót végeztünk. A transzfekciót követően 48 órával a COS-sejteket anti-CDlla, anti-CDllb és anti-CDllc monoklonális ellenanyagokkal vagy izo11
HU 223 006 Bl típusnak megfelelő monoklonális ellenanyagokkal (kontroll) festettük, majd birkában termelt, FITC-jelölt, antiegér-ellenanyagokkal festettük. A megfelelő monoklonális ellenanyaggal történő festés szerint a sejtek 10-15%-a expresszált CDlla-, -b-, -c-antigéneket vagy CD18-antigéneket. A CD23-liposzómákkal történő festést megelőzően a CD18-pozitív transzfektált COS-sejteket FACS készülékkel osztályoztuk, a p2-integrineket expresszáló sejtek arányának növelése érdekében. Ezután a CDlla/CD18, CDllb/CD18 és CDllc/CD18 transzfektáns sejteket CD23-liposzómákkal (2. sáv) vagy kontroll (glikophorin-A)-liposzómákkal (1. sáv) inkubáltuk. A CD23 CDI lb-vel és CDllc-vel létrejövő kölcsönhatásának specifitását úgy igazoltuk, hogy a CD23-liposzómákanti-CDllb/CD18 és CDllc/CD18 transzfektánsokhoz történő kötődését anti-CDl lb (4. sáv), anti-CD23 (5. sáv) és anti-CDl le (6. sáv) monoklonális ellenanyagokkal gátoltuk. CDlla/CD18 transzfektánsok esetében nem volt CD23-liposzóma-kötődés megfigyelhető, és az anti-CDl la monoklonális ellenanyagnak nem volt kimutatható hatása (3. sáv).
8. példa
A CD23-CDllb/CDllc kölcsönhatás strukturális jellemzése (lásd 8. ábrát) (a) Cukrok és divalens kationok szerepe
Tisztított, aktivált, véreredetű monocitákat 48 óráig tunicamycinnel kezeltünk (10 pg/ml, Boehringer Mannheim, Németország) vagy kezeletlenül hagytunk, illetve 45 percig neuraminidázzal (0,1 U/ml; 0,1 egység/ml; Boehringer Mannheim, Németország) kezeltünk vagy kezeletlenül hagytunk. Ezt követően a sejteket CD23-liposzómákkal vagy kontroll-liposzómákkal inkubáltuk, EDTA (0,5 mmol/1; bal felső ábrarész), Ca2+ vagy Mn2+ (1-10 mmol/1 jobb felső ábrarész) jelenlétében vagy annak hiányában.
(b) X-faktor gátolja a CD23 monocitákhoz történő kötődését
Tisztított, aktivált, véreredetű monocitákat CD23liposzómákkal inkubáltunk, X-faktor (0,1-10 egység/ml; Sigma) (bal alsó ábrarész), fibrinogén (50 pg/ml; Sigma), tisztított, rekombináns ICÁM-1 (saját laboratóriumunkban előállított vegyszer), LPS (1 pg/ml; Sigma), humán szérummal opszonizált zimozán (1 mg/ml; Sigma), IgE (50 pg/ml; The Binding Site, Birmingham) vagy RGD-peptiddel szemben előállított poliklonális ellenanyag (1/5000, ATCC) jelenlétében vagy annak hiányában (jobb alsó ábrarész). A sejteket FACS készülékkel analizáltuk, és az MFI-értékeket mértük. A gátlást a
6. példában ismertetettek szerint számítottuk ki és százalékban adtuk meg.
9. példa
Rekombináns CD23 CDllb-hez és CDllc-hez kötődve monocitákban specifikus módon növeli (a) a nitrittermelődést és (b) az oxidatív „burst részét képező folyamatokat
Monocitákat (a) 4 napon át 37 °C-on, illetve (b) egy éjszakán át rekombináns oldható CD23 [Graber P. és munkatársai: J. Immunoi. Methods 149, 215 (1992)] (50 ng/ml) vagy anti-CDl la (25.3 jelű klón), antiCDl lb (44 jelű klón), anti-CDl le (BU-15 jelű klón) monoklonális ellenanyagok jelenlétében vagy annak hiányában inkubáltunk (valamennyit 10 pg/ml koncentrációban alkalmaztuk).
A termelődött NO mennyiségének meghatározására a tenyészetek felülúszóját Green és munkatársai eljárása szerint NO, NO2~ és NO3~ stabil végtermékeire nézve analizáltuk [Green és munkatársai: Annu. Rév. Immunoi. 2, 199 (1984)] (a kísérlet eredményeit a 9a. ábrán összegeztük). A NO2~-termelődés CD23 által közvetített fokozódásának specifikus voltát úgy igazoltuk, hogy a NO2--termelődést anti-CD23 monoklonális ellenanyag (mAb25) Fab-fragmensei (10 pg/ml koncentráció alkalmazása mellett), valamint nitro-arginin (N-Arg; 1 mol/1 koncentrációban) (Sigma) alkalmazásával gátoltuk.
Az aktivált monocitákat 30 percig 37 °C-on hidroetidinnel inkubáltuk (Molecular Probes, Eugene, OR) (0,3 pg/ml) [Rothe G. és munkatársai: J. Leukoc. Bioi. 47, 440 1990)] és FACS készülékkel analizáltuk. Az ábrán a stimulált monociták által kibocsátott vörös fluoreszcencia fokozódásának százalékban megadott értékét ábrázoltuk, összehasonlítva kezeletlen monociták vizsgálatával kapott értékekkel (lásd 9b. ábra). Azon monociták esetében, amelyekben az oxidatív „burst” folyamatai felerősödtek, a kezeletlen monocitákhoz képest fokozott vörös fluoreszcens jelet észleltünk, tükrözve azt, hogy a hidroetidin etidium-bromiddá oxidálódott [Lacal P. M. és munkatársai: Biochem. J. 268, 707 (1990)]. A csak monocitákra vonatkoztatott MFI-értékek 159±10 tartományba estek. Hat kísérlet eredményei alapján számított átlag±SD (átlag±standard deviáció) értékeket közöltünk. Pozitív kontrollként ConA-t alkalmaztunk, amelyről ismert, hogy monocitákban fokozza a respiratorikus „burst” folyamatát. A CD23 és CDllb, illetve CDI le közti kölcsönhatás specifitását a H2O2-termelődés CD23 közvetítette fokozódásának, anti-CDl lb (44 jelű klón), anti-CDl le (BU-15 jelű klón) és anti-CD23 (mAb25) monoklonális ellenanyagokkal történő gátlásával szemléltettük (valamennyit 10 pg/ml koncentrációban alkalmaztuk).
10. példa
Rekombináns CD23 kötődése CDllb-hez és
CDllc-hez specifikus módon fokozza a monociták citokintermelését (lásd 10. ábrát)
Monocitákat egy éjszakán át 37 °C-on a felsoroltak jelenlétében vagy annak hiányában inkubáltunk: rekombináns, oldható CD23 [Graber P. és munkatársai: J. Immunoi. Methods 149, 215 (1992)] (50 ng/ml), antiCDlla (25.3 jelű klón), anti-CDl lb (44 jelű klón), anti-CDl le (BU-15 jelű klón) és anti-CD23 (mAb25; az utóbbi ellenanyag hozzáférhető az Immunotechtől; az ellenanyagot az EP-A-0269728 számú európai közzétételi irat ismerteti) monoklonális ellenanyagok, ConA (Sigma) (valamennyit 10 pg/ml koncentrációban alkalmaztuk), LPS (1 ng/ml) (Sigma) vagy PMA (5 ng/ml) (Calbiochem, La Jolla, CA). A tenyészet felülúszójában specifikus ELlSA-eljárással meghatároztuk a citokinek
HU 223 006 Bl mennyiségét. Az ELISA-eljárás érzékenységének küszöbe IL-Ιβ-ra nézve 0,05 ng/ml [Ferrua és munkatársai: J. Immunoi. Methods 114, 41 (1988)], TNF-a-ra nézve 0,01 ng/ml [Medgenix, Biotechnie, Rungis, F) és IL-6-ra nézve <0,01 ng/ml [Manie és munkatársai: Eur. Cytokine Netw. 4, 51 (1993)] volt. A CD23 és CDllb, illetve CDI le közti kölcsönhatás specifitását a CD23 közvetítette citokintermelődés, anti-CDllb (4 jelű klón), anti-CDllc (BU-15 jelű klón) és antiCD23 (mAb25) monoklonális ellenanyagokkal történő gátlásával szemléltettük (valamennyit 10 pg/ml koncentrációban alkalmaztuk).
Négy kísérlet eredményei alapján számított átlag±SD (átlag±standard deviáció) értékeket közöltünk.
11. példa
Rekombináns E. co/z'-eredetű, oldható, humán CD23antigénnel szemben irányuló monoklonális ellenanyagokat egerekben állítottunk elő, ismert eljárások alkalmazásával, azzal az eltéréssel, hogy lépsejtek helyett nyirokcsomóból származó sejteket használtunk.
12. példa
Colitis ulcerosa
Három oroszlánmajmocskát (tamarin majmot) antiCD23 Mab-val kezeltünk, anélkül, hogy azoknál káros mellékhatások léptek volna fel; az állatok székletürítésében javulást észleltünk.
A kezelésnél minden negyedik napon 1 mg ellenanyagot alkalmaztunk intramuszkuláris injekcióban.
13. példa
A közölt vizsgálati eljárások egyikében sem észleltünk toxikus hatást.

Claims (9)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. CD23-hoz kötődő ágens, amely in vivő blokkolja a CD23 és a CD23-hoz kötődő ligandum közötti kölcsönhatást, alkalmazása autoimmun betegségek kezelésére vagy megelőzésére szolgáló gyógyszerkészítmények előállítására.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a ligandum CD21, CDllb vagy CDI le.
  3. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a CD23 sejttel kapcsolatos CD23.
  4. 4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás arthritis, lupus erythematosus, szisztémás lupus erythematosus, Mashimotos-féle pajzsmirigygyulladás, sclerosis multiplex, cukorbetegség, uveagyulladás, dermatitis, psoriasis, csalánkiütés, nefrotikus szindróma, glomerulonephritis, gyulladásos bélbetegségek, colitis ulcerosa, Crohn-betegség, Sjögren-szindróma, hasnyálmirigy szigeteinek gyulladása kezelésére vagy megelőzésére szolgáló gyógyszerkészítmények előállítására.
  5. 5. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás reumás arthritis kezelésére vagy megelőzésére szolgáló gyógyszerkészítmények előállítására.
  6. 6. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol a kötődő ágens egy antitest.
  7. 7. A 6. igénypont szerinti alkalmazás, ahol az ágens egy antitestnek F(ab’)2-, Fab-, FV- vagy ScFV-fragmensét tartalmazza.
  8. 8. A 6. igénypont szerinti alkalmazás, ahol az ágens egy mesterséges konstrukció, amely egy antitestet vagy annak egy fragmensét vagy mimetikumát, vagy ezeknek valamely származékát tartalmazza.
  9. 9. A 6-8. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol az antitest humanizált formában van.
HU9800339A 1994-10-25 1995-10-20 CD23-hoz kötődő vegyületek HU223006B1 (hu)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB9421463A GB9421463D0 (en) 1994-10-25 1994-10-25 Binding agents
GBGB9512480.6A GB9512480D0 (en) 1995-06-20 1995-06-20 Binding agents
GBGB9513415.1A GB9513415D0 (en) 1995-06-30 1995-06-30 Binding agents
PCT/EP1995/004109 WO1996012741A1 (en) 1994-10-25 1995-10-20 Binding agents to cd23

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HUT77572A HUT77572A (hu) 1998-06-29
HU223006B1 true HU223006B1 (hu) 2004-03-01

Family

ID=27267444

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9800339A HU223006B1 (hu) 1994-10-25 1995-10-20 CD23-hoz kötődő vegyületek

Country Status (21)

Country Link
US (2) US6627195B1 (hu)
EP (3) EP0788514A1 (hu)
JP (3) JPH10507460A (hu)
KR (1) KR20040058016A (hu)
CN (1) CN1171119A (hu)
AT (1) ATE198895T1 (hu)
AU (2) AU710369B2 (hu)
BR (2) BR9509434A (hu)
CA (2) CA2203364A1 (hu)
DE (1) DE69519997T2 (hu)
DK (1) DK0788513T3 (hu)
ES (1) ES2154741T3 (hu)
FI (1) FI971756A0 (hu)
HK (1) HK1002765A1 (hu)
HU (1) HU223006B1 (hu)
IL (1) IL115733A (hu)
MX (1) MX9702797A (hu)
NO (1) NO971902L (hu)
NZ (2) NZ295158A (hu)
PT (1) PT788513E (hu)
WO (2) WO1996012742A1 (hu)

Families Citing this family (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7033589B1 (en) 1997-02-20 2006-04-25 Biogen Idec Ma Inc. γ-1 anti-human CD23 monoclonal antibodies and use thereof as therapeutics
US6011138A (en) * 1997-02-20 2000-01-04 Idec Pharmaceuticals Corporation Gamma-1 anti-human CD23 monoclonal antibodies
US6893636B2 (en) 1997-02-20 2005-05-17 Biogen Idec Ma Inc. Gamma-1 and gamma-3 anti-human CD23 monoclonal antibodies and use thereof as therapeutics
WO1999045777A1 (en) * 1998-03-10 1999-09-16 The Children's Hospital Of Philadelphia Compositions and methods for treatment of asthma
GB9809839D0 (en) 1998-05-09 1998-07-08 Glaxo Group Ltd Antibody
US6299875B1 (en) 1998-06-04 2001-10-09 Panacea Pharmaceuticals, Llc Methods to block IGE binding to cell surface receptors of mast cells
AU1960100A (en) * 1999-01-06 2000-07-24 Mcmaster University Method of preventing immune and hypersensitivity reactions
EP1239877B1 (en) * 1999-10-06 2008-01-09 Abbott GmbH & Co. KG Composition comprising a tnf-alpha inhibitor and an integrin alphavbeta3 receptor antagonist
US20020028178A1 (en) * 2000-07-12 2002-03-07 Nabil Hanna Treatment of B cell malignancies using combination of B cell depleting antibody and immune modulating antibody related applications
US20030103971A1 (en) * 2001-11-09 2003-06-05 Kandasamy Hariharan Immunoregulatory antibodies and uses thereof
US20030211107A1 (en) * 2002-01-31 2003-11-13 Kandasamy Hariharan Use of CD23 antagonists for the treatment of neoplastic disorders
US20070065436A1 (en) * 2001-01-31 2007-03-22 Biogen Idec Inc. Anti-cd80 antibody having adcc activity for adcc mediated killing of b cell lymphoma cells alone or in combination with other therapies
US20020159996A1 (en) * 2001-01-31 2002-10-31 Kandasamy Hariharan Use of CD23 antagonists for the treatment of neoplastic disorders
US6820011B2 (en) 2001-04-11 2004-11-16 The Regents Of The University Of Colorado Three-dimensional structure of complement receptor type 2 and uses thereof
CN100460015C (zh) * 2003-02-14 2009-02-11 上海张江生物技术有限公司 免疫调节剂及其应用
JP2006522811A (ja) * 2003-04-09 2006-10-05 ジェネンテック・インコーポレーテッド ＴＮＦαインヒビターに対して不十分な反応を示す患者の自己免疫疾患治療法
EP2322547A1 (en) 2003-06-25 2011-05-18 Crucell Holland B.V. Myeloid cell-specific lectin
EP1733231B1 (en) * 2004-04-05 2011-05-04 Université Bordeaux 2 Peptides and peptidomimetics binding to cd23
WO2006017574A1 (en) * 2004-08-03 2006-02-16 Mayo Foundation For Medical Education And Research Improving treatments
US20090291048A1 (en) * 2005-10-25 2009-11-26 Baker Idi Heart And Diabetes Institute Holdings Limited Leukocyte-binding polypeptides and uses thereof
RU2489166C2 (ru) * 2006-04-09 2013-08-10 Джинентех, Инк. Применение антитела для лечения аутоиммунных заболеваний у пациента с неадекватным ответом на ингибитор tnf-альфа
CA2656063C (en) 2006-06-21 2016-10-18 Musc Foundation For Research Development Targeting complement factor h for treatment of diseases
WO2009043051A2 (en) * 2007-09-27 2009-04-02 Biogen Idec Ma Inc. Cd23 binding molecules and methods of use thereof
AU2010266127B2 (en) 2009-07-02 2015-11-05 Musc Foundation For Research Development Methods of stimulating liver regeneration
EP2496259B1 (en) 2009-11-05 2017-02-22 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Treatment of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria
US9650447B2 (en) 2010-05-14 2017-05-16 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Complement receptor 2 (CR2) targeting groups
EA201291328A1 (ru) 2010-06-22 2013-10-30 Дзе Риджентс Оф Дзе Юниверсити Оф Колорадо, Э Боди Корпорейт АНТИТЕЛА К ФРАГМЕНТУ C3d КОМПОНЕНТА КОМПЛЕМЕНТА 3
KR101813482B1 (ko) * 2010-11-24 2017-12-29 더 유나이티드 스테이츠 오브 어메리카, 애즈 리프리젠티드 바이 더 시크리터리, 디파트먼트 오브 헬쓰 앤드 휴먼 서비시스 루푸스의 치료 또는 예방을 위한 조성물 및 방법
US10017762B2 (en) * 2010-11-24 2018-07-10 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services Compositions and methods for treating or preventing lupus
US10413620B2 (en) 2012-08-17 2019-09-17 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Light-emitting versions of the monoclonal antibody to C3D (MAB 3D29) for imaging
WO2014028865A1 (en) 2012-08-17 2014-02-20 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Compositions and methods for detecting complement activation

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4946788A (en) * 1985-06-11 1990-08-07 Ciba-Geigy Corporation Purified immunoglobulin-related factor, novel monoclonal antibodies, hybridoma cell lines, processes and applications
FR2599513B1 (fr) * 1986-05-27 1989-09-15 Unicet Laboratoires Anticorps monoclonaux inhibant la liaison de ige soluble aux lymphocytes humains, hybridomes monoclonaux produisant de tels anticorps, leur utilisation
GB8726230D0 (en) * 1987-11-10 1987-12-16 Rosen H Antibodies
EP0321842A1 (en) * 1987-12-22 1989-06-28 Kishimoto, Tadamitsu, Prof. Soluble recombinant Fc-Epsilon-receptor, the preparation and the use thereof
DE3830271A1 (de) * 1988-09-06 1990-03-15 Goetze Otto Mittel mit immunsuppressiver wirkung
WO1990004176A1 (en) * 1988-10-03 1990-04-19 Scripps Clinic And Research Foundation THE RECEPTOR BINDING REGION OF EBVgp350
US5530101A (en) * 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
IE912528A1 (en) * 1990-07-19 1992-01-29 Scripps Clinic Res Inhabition of mac-1 receptor binding fibrinogen using d30¹homologs
AU673499B2 (en) * 1991-07-25 1996-11-14 Biogen Idec Inc. Recombinant antibodies for human therapy
WO1993009803A1 (en) * 1991-11-22 1993-05-27 The Scripps Research Institute Factor x-derived polypeptides and anti-peptide antibodies, systems and therapeutic methods for inhibiting inflammation
US5766943A (en) * 1992-08-17 1998-06-16 University Of Iowa Research Foundation DNA sequences for soluble form of CD23
EP0670734A4 (en) * 1992-10-09 1998-01-14 Blood Res Center SUB-POPULATION OF Mac-1 MOLECULES (CD11B / CD 18) THAT INDUCE NEUTROPHILIC ADHESION TO ICAM-1 AND FIBRINOGEN.

Also Published As

Publication number Publication date
EP1018517A2 (en) 2000-07-12
AU3867995A (en) 1996-05-15
JPH10507460A (ja) 1998-07-21
NZ295158A (en) 1999-09-29
AU710369B2 (en) 1999-09-16
CN1171119A (zh) 1998-01-21
CA2203364A1 (en) 1996-05-02
HUT77572A (hu) 1998-06-29
EP1018517A3 (en) 2000-07-26
AU698158B2 (en) 1998-10-22
HK1002765A1 (en) 1998-09-18
PT788513E (pt) 2001-06-29
DE69519997D1 (de) 2001-03-01
WO1996012742A1 (en) 1996-05-02
BR9509434A (pt) 1998-01-06
AU3843595A (en) 1996-05-15
WO1996012741A1 (en) 1996-05-02
BR9509498A (pt) 1997-12-23
ES2154741T3 (es) 2001-04-16
CA2203363A1 (en) 1996-05-02
US6627195B1 (en) 2003-09-30
US20040022783A1 (en) 2004-02-05
IL115733A (en) 1999-12-22
IL115733A0 (en) 1996-01-19
EP0788514A1 (en) 1997-08-13
NO971902D0 (no) 1997-04-24
DE69519997T2 (de) 2001-06-21
JP2001316291A (ja) 2001-11-13
EP0788513B1 (en) 2001-01-24
JPH09511757A (ja) 1997-11-25
EP0788513A1 (en) 1997-08-13
JP3323508B2 (ja) 2002-09-09
FI971756A (fi) 1997-04-24
ATE198895T1 (de) 2001-02-15
MX9702797A (es) 1997-06-28
NZ295352A (en) 1999-09-29
FI971756A0 (fi) 1997-04-24
DK0788513T3 (da) 2001-04-02
NO971902L (no) 1997-04-24
KR20040058016A (ko) 2004-07-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU223006B1 (hu) CD23-hoz kötődő vegyületek
US20220403011A1 (en) Method of providing disease-specific binding molecules and targets
WO1996012741A9 (en) Binding agents to cd23
US8906367B2 (en) Method of providing disease-specific binding molecules and targets
CA3012037A1 (en) Recombinant igg fc multimers
KR20110112299A (ko) 자가면역 및 염증성 장애의 치료에 사용하기 위한 가용성 폴리펩티드
MXPA97002772A (en) Linking agents for the treatment of inflammatory, autoimmune or alergi treatments
MXPA97002797A (en) Link agents a c
CN1169735A (zh) Cd23结合剂
AU2013204620A1 (en) Method of Providing Disease-Specific Binding Molecules and Targets

Legal Events

Date Code Title Description
HFG4 Patent granted, date of granting

Effective date: 20031216

MM4A Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees