HU221629B1

HU221629B1 - Béta-amiloid fehérje képződést gátló peptidek, eljárás előállításukra és ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények

Info

Publication number: HU221629B1
Application number: HU9600832A
Authority: HU
Inventors: Michael R. Angelastro; Barbara Cordell; Viviane Dorsselaer; Jeffrey N. Higaki; Norton P. Peet; Daniel Schirlin
Original assignee: Merrell Pharmaceuticals Inc.
Priority date: 1993-10-01
Filing date: 1994-09-20
Publication date: 2002-12-28
Also published as: ATE211129T1; CA2171882A1; ES2170104T3; AU7799894A; DE69429527D1; JPH09505281A; KR960704839A; AU687449B2; ZA947529B; EP0721449A1; IL111078A0; IL111078A; CA2171882C; FI961438A; DE69429527T2; KR100316865B1; EP0721449B1; CN1132504A; HUT74004A; DK0721449T3

Abstract

A találmány olyan Ka–P2a–NH–CH(Ra)–C(?O)–Xa (IB) általános képletűvegyületekre, azok hidrátjaira, sztereoizo- merjeire és gyógyászatilagelfogadható sóira vonatkozik, ahol ha Xa jelentése hidrogénatom, akkorRa jelentése CH2Si(1–6 szénatomos alkil)2-(2–6 szénatomos alkenil)-csoport, CH2Si(1–6 szénatomos alkil)2-fenil-csoport vagy NHC(?O)-fenil-csoporttal szubsztituált benzilcsoport; vagy ha Xa jelentéseCF2C(?O)-fenetil-csoport, akkor Ra jelentése 1–7 szénatomosalkilcsoport, de terc-butil-metil-cso- porttól eltérő; vagy ha Xajelentése CF2C(?O)NHCH2Si(1–6 szénatomos alkil)3-csoport, akkor Rajelentése benzilcsoport, P2a jelentése Leu, Ala, Ile, Val, Nva, Nlevagy terc-leucin aminosavmaradék; Ka jelentése benzil-oxi-karbonil-csoport. A találmány tárgya még az (IB) képletű vegyületekelőállítására szolgáló eljárás, gyógyszerként történő alkalmazása ésezeket a vegyületeket tartalmazó gyógyszerkészítmények. A találmányszerinti vegyületek gátolják vagy megelőzik az amiloidfehérjelerakódásokat az agyban, ezáltal alkalmasak az Alzheimer-kór ésaz időskori Down-kór kezelésére. ŕ

Description

A találmány új (IB) általános képletű vegyületekre, ezek előállítási eljárására, valamint a vegyületeket hatóanyagként tartalmazó, az amiloid fehéije agybani lerakódásának gátlására vagy megelőzésére szolgáló gyógyszerkészítményekre vonatkozik. A találmány tárgya közelebbről az Alzheimer-kór kezelésére alkalmazható (IB) általános képletű peptidek.

Úgy becsülik, hogy az USA-ban a 65 éven felüli lakosság több mint 5%-át, a 85 éven felüli lakosság több mint 15%-át érinti az Alzheimer-kór. [Cross, A. J., Eur. J. Pharmacol., 82, 77-80 (1982); Terry, R. D. et al., Ann. Neurol., 14, 497-506 (1983)]. Feltételezik, hogy az idősek hosszú távú ápolásra történő elhelyezésének fő oka ebben a betegségben keresendő, és a szakszerű ellátást biztosító idősek otthonában elhaláloző embereknek körülbelül 65%-a szenved a betegségben.

Az Alzheimer-kórral együtt járó biokémiai és metabolikus jelenségekről ismerünk bizonyos tényeket Az Alzheimer-kóros agyban megfigyelt két morfológiai és hisztopatológiai elváltozás a neurofibrilláris csomósodások (elváltozások, neurofibrillary tangles, NFT) és az amiloid lerakódások. Intraneuronális neurofibrilláris elváltozások (csomósodások) jelen vannak más degeneratív betegségek esetén is, de úgy tűnik, hogy amiloid lerakódások jelenléte mind az intraneuronális terekben (neuritikus plakkok), mind az azokat körülvevő mikroérrendszerben (vaszkuláris plakkok), jellemző az Alzheimer-kórra. Úgy látszik, hogy ezek közül a neuritikus plakkok (neuritic plaques), vannak túlsúlyban [Price, D. L., et al., Drug Development Research, 5, 59-68 (1985)]. Plakkok találhatók azoknál a Down-kóros idős betegeknél is, akiknél fellép az Alzheimer-kór.

Alzheimer-kóros betegek plakkokban gazdag agyát használták fel forrásként egy körülbelül 4(2 kD „mag” („core”) polipeptid, az amiloid plakkmagfehéije [amyloid plaque core protein (APCP)] kivonására. Ezt a peptidet a β-proteinnek nevezték el a Glenner, G., et al., Biochem. Biophys. Commun., 120, 885-890 (1984) közlemény szerint. Meghatározták az aminoterminus aminosavszekvenciáját [Glenner, G., et al., Biochem Biophys. Rés. Commun., 122, 1131-1135 (1984); Masters, C. L., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 4245-4259 (1985)]. A két kutatócsoport azonos aminosavszekvenciát közölt azzal az eltéréssel, hogy Glenner és munkatársai az Alzheimer-kóros cerebrovaszkuláris amiloid 11. helyzetében glutamincsoportot ismertet, míg Master et al., glutaminsavról számol be a 11. helyzetben. Az előbbi szerzők tehát arról számolnak be, hogy a cerebrovaszkuláris amiloidnak homogén aminoterminusa van, míg az utóbbi szerzők heterogén aminoterminusokat ismertetnek. Mindkét kutatócsoport kimutatta, hogy ugyanaz a peptid található a Down-kóros felnőttek amiloid plakkmagjaiban és vaszkuláris amiloidjában, és leúják, hogy all. helyzetben glutaminsav található. Wong. C. W. és munkatársai [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 82, 8729-8732 (1985)] kimutatták, hogy egy szintetikus peptid, amely homológ volt a Masters (lásd fent) által leirt β-amiloid magfehéije első tíz aminosavjával, képes volt antitesteket termeim egerekben, és ezeket az antitesteket fel lehetett használni nemcsak az amiloiddal borított agyi véredények, hanem a neuritikus plakkok megfestésére is. Ezeket az eredményeket megerősítették Allsop, D. és munkatársai is a Neuroscience Letters, 68, 252-256 (1986) közleményükben, akik a 8-17 aminosavaknak megfelelő szintetikus peptiddel szembeni antitesteket használták. Ezek szerint az Alzheimer-kórban szenvedő betegek agyának különféle helyein talált plakkfehéije általában hasonlónak tűnik az immunreaktivitás tekintetében. Nagymértékben oldhatatlan, amit az mutat, hogy nem tudták oldhatóvá tenni sok közönségesen használt denaturálószerben, úgy mint detergensekben és kaotrop szerekben [Masters, lásd fent, Allsop, D., et al., lásd fent].

A betegséggel együtt járó amiloid depozitumoknak hat olyan ismert példája van, amelyben az amiloid prekurzorfehérjéből termelődik: primer amiloidózis esetén a prekurzor egy immunglobulin könnyű lánc; szekunder amiloidózis esetén a prekurzor amiloid A fehéije; amiloidózis esetén prealbumin vagy annak egy variánsa; a pajzsmirigy velőkarcinómája esetén egy prokalcitonin fragmens; és öröklődő agyvérzés esetén gamma-nyom (gamma-trace)-fragmens [lásd például Glenner, G., New England Journal of Medicine, 302, 1283 (1980); Sletton, K., et al., Biochem. J., 195, 561 (1981); Benditt, et al., FEBS Lett., 19, 169 (1971); Sletton K., et al., Eur. J. Biochem., 41, 117 (1974); Sletton, K„ J. Exp. Med., 143, 993 (1976)]. Az előbbiekben részleges felsorolást; adtunk, és számos további referencia van arra nézve, hogy prokalcitonin fragmens prekurzor a pajzsmirigykarcinóma amiloidja tekintetében.

Betegségekkel együtt járó amiloid lerakódások (depozitumok) más ismert példáinak analógiájára feltételezik, hogy az Alzheimer-kórral együtt járó β-amiloid magfehéije prekurzorfehérjéből keletkezik. Kang, J. és munkatársai [Natúré, 325, 733-736 (1987)] ismertetnek egy olyan fehéijét, amely egy nagyobb fehérjeszerkezeten belül tartalmazza a β-amiloid magfehérjeszekvenciát. Ennek a fehéijének a szekvenciáját egy olyan cDNS-klón szekvenciájából vezették le, amely kiónt humán fetális agyszővet cDNS-könyvtárából izoláltak, és amely 695 aminosavcsoportból áll, ahol a βamiloid magfehéije aminoterminusa az 597 helyzetben kezdődik. Egy második olyan prekurzorfehérjét, amely a β-amiloid-szekvenciát tartalmazza, Ponté és munkatársai [Natúré, 331, 525-527 (1988)] által izolált cDNS-klónból jósoltak meg. A Ponté és munkatársai által izolált cDNS-klón olyan prekurzorfehéijét kódolt, amely azzal azonos, amelyet Kang és munkatársai azonosítottak, azzal a különbséggel, hogy tartalmaz egy további 57 aminosavból álló szekvenciát, amely a β-amiloid magfehéije-szekvenciától felfelé van inszertálva. Az 57 aminosavból álló inszertált szekvencia tartalmaz egy funkcionális domént, amely erősen homológ egy sor olyan proteázinhibitorral, amelyeket Kunitz-tipusú szerin proteáz inhibitorokként ismerünk. Mások olyan további amiloid prekurzorfehéijét jellemeztek [lásd Kitaguchi, et al., Natúré, 331, 530-532 (1988)], amely 770 aminosavat tartalmaz. A Kitaguchi által azonosított prekurzor azzal a különbséggel egyezik meg a Ponté és munkatársai által izolált prekurzorral, hogy to2

HU 221 629 Bl vábbi 19 aminosavat tartalmaz az 57 aminosavból álló proteázinhibitor doménnal szomszédosán. Nem ismeretes, hogy ez a további 19 aminosav kölcsönöz-e bármilyen funkcionalitást a molekulának. A különféle amiloid prekurzorfehéijék, amelyeket a cDNS-klónokból 5 azonosítottak, alternatív message splicing eredményeként keletkeznek egy egyedülálló amiloid prekurzorgén transzkripciója során.

Kimutatták, hogy az amiloid prekurzorfehéijék a normális sejtmetabolizmus révén keletkeznek a β-ami- 10 lóid magfehéije termelése érdekében [Haas, et al., Natúré, 359, 322-325 (1992); Shoji, et al., Science, 258, 126-129 (1992); Seubert, et al., Natúré, 359, 325-327 (1992)]. Nincs tisztázva azonban, hogy az Alzheimerkórban szenvedő betegekben nagyobb mennyiségű β- 15 amiloid magfehéije termelődik-e, bár kimutatták, hogy a Down-szindrómás betegek, akiknél invariábilisan kifejlődik az Alzheimer-kór, kétszeres mennyiségű βamiloid prekurzorfehéijét fejeznek ki [Neve, et al., Neuron, 1, 669-677 (1988)]. Úgy vélik, hogy az amiloid 20 plakkok kifejlődése az Alzheimer-kóros agyban a βamiloid fehérje túltermelődésének és/vagy csökkent mértékű eltávozásának, vagy komplexszé alakulásának az eredménye. Ennélfogva, ha megteremthetjük annak eszközét, hogy beavatkozzunk a plakk-képzódés folya- 25 matába azáltal, hogy megelőzzük vagy gátoljuk az amiloid plakk magfehérje termelődésében prekurzor anyag keletkezését, egy ilyen eszköz eljárást képezhet az Alzheimer-kór progressziójának kezelésére vagy javítására. Mindeddig azonban a β-amiloid magfehérje terme- 30 lődéséhez szükséges amiloid prekurzorfehéije képződése nem volt kielégítő mértékben ismert ahhoz, hogy hatékony terápiás beavatkozást tegyen lehetővé abba a folyamatba, amely amiloid lerakódásokra vezet.

Számos közlemény ismertet olyan vélelmezett pro- 35 teinázokat, amelyeket felelősnek tekintenek a β-amiloid fehérje és/vagy az Alzheimer-kór patológiája előidézéséért. Ezek a vélelmezett proteinázok az enzimek osztályainak széles spektrumát ölelik fel, például a szerin, a cisztein és a metalloproteinázokat. Számos β- 40 amiloid-termelő proteinázt izoláltak és jellemeztek már. Néhány ismertetett jelölt a következő: multikatalitikus proteináz [FEBS 304, 57-60 (1992) és FEBS Lett. 257, 388-392 (1989)], hízósejtkináz [J. Bioi. Chem. 265, 3836-3843 (1990)], metalloendopeptidáz 45 24.15, Biochem. Biophys. Rés. Commun., 185, 746-752 (1992)], kalciumaktivált semleges proteinázok (calpain) [J. Neurosci., 10, 2400-2411 (1990)], kalciumaktivált szerin proteináz [Biochem., Biophys. Rés. Commun. 174, 790-796 (1991)], és prolil-endopep- 50 tidáz [FEBS Lett. 160, 131-134 (1990)]. Nem mutatták még ki ezen β-amiloid-termelő proteinázjelöltek mindegyikének a fiziológiai jelentőségét, például azt, hogy az enzimaktivitás gátlása blokkolt β-amiloid fehéijetermeléssel jár együtt. 55

Számos proteináz esetén számoltak be arról, hogy az megváltozik az Alzheimer-kóros agyszövetben. így például kimutatták, hogy az α-1-tripszin-szerű immunoreaktivitás megnövekszik az Alzheimer-kóros agyban [Biochem. Biophys. Rés. Commun. 193(2), 579-594 60 (1993)], három különböző metalloproteinázról ismertették, hogy aktivitása megemelkedik az Alzheimer-kóros agyban [J. Neurochem. 58, 983 -992 (1992)], megfigyelték multikatalitikus proteinázok megváltozását [Neurosc. Rés. Comm. 8(3), 185-190 (1991)], beszámoltak abnormis katepszin D és B immunreaktivitásról [Neurosc. Lett. 130, 195-198 (1991) és Proc. Natl.

Acad. Sco. 87, 3861-3865 (1990)], továbbá különféleképpen mutatták ki kalciumaktivált neutrális proteináz (calpain) aktivitásának változását Alzheimer-kóros agyszövetben, kimutatták csökkenését [Neurobio. of

Aging, 11, 425-431 (1990)], növekedését [Proc. Natl.

Acad. Sci. USA 90, 2628-2632 (1993)] vagy változatlanságát [J. Neurol. Sci, 102, 220-234 (1991).

Az előbbiek bemutatásul szolgálnak arra, hogy bár hatalmas mennyiségű munkáról számolnak be ezen a területen, nincs általános egyetértés a proteinázok azon osztálya tekintetében, amelyek hatékonyak az Alzheimer-kór kezelésében, vagy a tekintetben, hogy ezen proteinázok megváltoznak-e, ha Alzheimer-kóros agyszövettel lépnek kontaktusba.

A találmány tárgyát új (IB) képletű vegyületek és ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények képezik, melyek a β-amiloid magfehéije-képződésének és az amiloid plakkok képződésének gátlására alkalmazha- l tők Alzheimer-típusú dementiában szenvedő betegek esetén. A találmány szerinti gyógyszerkészítmény tehát az Alzheimer-kór progressziójának kezelésére ; | vagy javítására, például az Alzheimer-típusú öregkori ? * elbutulás és az időskori Down-szindróma kezelésére í j . i használható. f

A találmány tárgya továbbá az (IB) képletű vegyüle- f tek előállítása és e vegyületek alkalmazása olyan állapo- | tok kezelésére, amelyek reagálnak a betegben végbeme- | nő β-amiloid magfehérje-termelődés gátlására vagy I megelőzésére. í

A találmány tárgyát képezik tehát az (IB) általános képletű vegyületek, azok hidrátjai, sztereoizomeijei és gyógyszerészetileg elfogadható sói, ahol az általános képletben ha X^a jelentése hidrogénatom, akkor R^a jelentése CH₂Si(l-6 szénatomos alkíl)₂-(2—6 szénatomos alkenil)-csoport, CH₂Si(l-6 szénatomos alkil)₂-fenil-csoport vagy NHC(=O)-fenil-csoporttal szubsztituált benzilcsoport; vagy ha X^a jelentése CF2C(=O)-fenetil-csoport, akkor R^ajelentése 1 -7 szénatomos alkilcsoport, de terc-butil-metil-csoporttól eltérő; vagy ha X^a jelentése CF2C(=O)NHCH₂Si(l-6 szénatomos alkil)₃-csoport, akkor R^a jelentése benzilcsoport,

P₂ ^a jelentése Leu, Alá, Ile, Val, Nva, Nle vagy tercleucin aminosavmaradék;

K^a jelentése benzil-oxi-kaibonil-csoport.

A találmány tárgya továbbá eljárás az (IB) általános képletű vegyületek előállítására oly módon, hogy L valamely K^a-P2^a általános képletű csoportot, melyben K^a és P2^a jelentése a fentiekben megadott, valamely R

H₂N-CH(R^a)-C(=O)X^a általános képletű vegyülettel

- melyben R^a és X^a jelentése a fentiekben megadott kapcsolunk, vagy

HU 221 629 BI valamely K^a-P2^a általános képletű csoportot, melyben K^a és P2^a jelentése a fentiekben megadott, valamely H₂N-CH(R^a)-CH(OH)X^a általános képletű vegyülettel - melyben R^a és X^a jelentése a fentiekben megadott - kapcsolunk, és az így kapott vegyületet oxidáljuk.

A leírásban az 1-6 szénatomos alkil- vagy 1-7 szénatomos alkilcsoportok jelentése egyenes vagy elágazó láncú alkilcsoport, így például metilcsoport, etilcsoport, propilcsoport, izopropilcsoport, butilcsoport, izobutilcsoport, terc-butil-csoport, pentilcsoport, izopentilcsoport, szek-pentil-csoport, hexilcsoport, izohexilcsoport. Hasonlóképpen a 2-6 szénatomos alkiléncsoportok jelentése 2-6 szénatomot tartalmazó kétértékű csoport, amely egyenes vagy elágazó láncú lehet. Valamennyi 1-7 szénatomos csoport előnyösen 1-6 szénatomos és előnyöseb- 15 ben 1-4 szénatomos csoport Minden 1-6 szénatomos csoport előnyösen 1-4 szénatomos és előnyösebben 1-2 szénatomos csoport.

Az (IB) általános képletű vegyületek lehetnek szabad formában vagy só formában, például savaddíciós só vagy anionos só formájában. Egy ilyen vegyületet átalakíthatunk sójává vagy bázissá, ismert módon, egyiket a másikba. Előnyös sók a trifluor-acetát, a hidrokloridsók, a nátrium-, kálium- vagy ammóniumsók, bár a találmány tárgyköre kiteljed minden olyan sóra, melyet 25 a peptidkémiában ismert módon felhasználunk.

A „sztereoizomer” definíció általános definíció az egyes molekulák mindazon izomerjeire vonatkozóan, amelyek csak atomjaik térbeli orientációjában különböznek. A leírás szerinti definíció magában foglalja a 30 tükörképi izomereket (enantiomereket), a geometriai (cisz/transz) izomereket, továbbá az egynél több királis centrumot tartalmazó molekulák azon izometjeit, amelyek egymásnak nem tükörképei (diasztereo-izomereket). Aminosavak esetén a D/L vagy R/S megjelölése- 35 két alkalmazhatjuk, amint azt a IUPAC-IUB Joint Commission on Biochemical Nomenclature, Eur. J. Biochem. 138,9-37 (1984) közlemény ismerteti. A természetes aminosavak a glicin kivételével tartalmaznak királis szénatomot. Eltérő specifikus jelölés hiányában az 40 előnyös vegyületek az L-konfigurációjú optikailag aktív aminosavak; az (IB) általános képletű vegyületeket felépítő aminosavak azonban akár D- akár L-konfigurációjúak lehetnek, vagy lehetnek a D- és L-izomerek elegyei, beleértve a racém elegyeket. A későbbiekben sze- 45 replő 1. táblázatban foglaljuk össze a vegyületekben előforduló α-aminosavak elfogadott rövidítését.

A leírásban az ,Alzheimer-kór” az Alzheimer-típusú senilis dementiát is jelenti.

A „hidrát” definíció azt jelenti, hogy a találmány 50 szerinti vegyületekben lévő ketocsoport dihidroxi-metilén-csoport formájában is lehet. A találmány szerinti vegyületek normális fiziológiai körülmények között várhatóan hidratált formában vannak.

A „dezaminocsoport” jelentése a-aminosavcsoport 55 az ahhoz csatlakozó aminocsoport nélkül. Előnyös dezaminocsoportot képeznek a Val, Ala alfa-aminosavak a megfelelő terminális aminocsoportjuk nélkül.

A „szubsztituált benzilcsoport” azt jelenti, hogy a benzilcsoport a fenilrészén hozzáférhető szénatomo- 60 kon, vagyis méta-, orto- és/vagy para-helyzetben szubsztituálva van, és előnyösen a szubsztituens para-helyzetben van.

Minden α-aminosavnak van egy jellegzetes „R-cso5 portja”, ahol az R-csoport az az oldallánc vagy maradék, amely az a-aminosav α-szénatomjához kapcsolódik. Például az R-csoport oldallánc glicin esetén hidrogénatom, alanin esetén metilcsoport, valin esetén izopropilcsoport. Az α-aminosavak specifikus R-csoport10 jait vagy oldalláncait ismerteti például A. L. Lehninger „Biochemistry” [Lehninger A. L., Biochemistry, 2^ndEdition, Chapter 4, „The Aminoacid Building Blocks of Proteins”, pp. 71. (1978)], szakirodalmi hivatkozási helyen.

A természetes aminosavak a glicin kivételével tartalmaznak királis szénatomot. Eltérő specifikus jelölés hiányában az előnyös vegyületek az L-konfigurációjú optikailag aktív aminosavak; a találmány szerinti (Π3) általános képletű vegyületeket felépítő aminosavak azonban 20 akár D-, akár L-konfigurációjúak lehetnek, vagy lehetnek a D- és L-izomerek elegyei, beleértve a racém elegyeket. Az I. táblázatban foglaljuk össze a vegyületekben előforduló α-aminosavak elfogadott rövidítését:

I. táblázat

A találmány szerinti vegyületekben előforduló aminosavak nevének rövidítése

Aminosav	Jele
alanin	Ala
izoleucin	Ile
leucin	Leu
valin	Val
norvalin	Nva
norleucin	Nle

Az A reakcióvázlat általános szintézisutat mutat be az (IB) általános képletű vegyületek előállítására.

A K^a-P2^a csoportot az (1) általános képletű aminosavszármazék szabad aminocsoportjához kapcsolhatjuk. Az (1) általános képletben R^a és X^a jelentése a fentiekben megadott. A P2^a csoportot - melynek jelentése szintén a fenti - a jól ismert peptidkapcsolási eljárásokkal kapcsolhatjuk a védőcsoportot nem tartalmazó szabad aminovegyülethez.

Általában úgy hosszabbítjuk meg a peptideket, hogy eltávolítjuk a C-terminális maradék a-aminocsoportjának a védőcsoportját, és peptidkötéssel hozzákapcsoljuk a következő, megfelelően védett aminosavakat az ismertetett eljárások alkalmazásával. Ezt a védócsoport-eltávolítási és -kapcsolási eljárást addig ismételjük meg, amíg megkapjuk a kívánt szekvenciát. Ezt a kapcsolást elvégezhetjük a peptidet alkotó aminosavakkal lépésenként, amint azt az A reakcióvázlattal bemutatjuk, vagy fragmensek (két vagy több aminosav) kondenzációjával, vagy e két eljárás kombinációjával, továbbá szilárd fázisú peptidszintézissel, amely eljárást eredetileg Merrifield a J. Am. Chem. Soc., 85, 2149-2154

HU 221 629 Bl (1963) közleményében ismertetett, és amely közlemény a leírás tekintetében referenciaként szerepel. Ha szilárd fázisú szintézismódszert alkalmazunk, a C-terminális karbonsavat (karboxilcsoportot) oldhatatlan hordozóhoz (rendszerint polisztirolhoz) kapcsoljuk. Ezek az oldhatatlan hordozók olyan csoportot tartalmaznak, amely reakcióba lép az aldehidcsoporttal, és olyan kötést hoz létre, amely stabil a lánchosszabbítás körülményei között, de később könnyen hasítható. E hordozókra példák a következők: klór- vagy bróm-metil-gyanta, hidroxi-metil-gyanta és amino-metil-gyanta. E gyanták közül sok kapható a kereskedelmi forgalomban úgy, hogy már tartalmazza a kívánt C-terminális aminosavat. Azon (IB) általános képletű vegyületek esetén, melyekben X* jelentése hidrogénatom, kapcsolóvegyületet is alkalmazhatunk az A reakcióvázlat szerinti reakciókban abból a célból, hogy hozzákössünk egy gyantát az olyan (1) általános képletű aminosavszármazékok aldehid funkciós csoportjához, amelyekben X* jelentése hidrogénatom. Alkalmas kapcsolószerek például az Ll, L2 vagy L3 képletű vegyületek.

Alternatív módon a találmány szerinti vegyületeket automata peptidszintetizátor alkalmazásával is előállíthatjuk. Az előbbieken felül további peptidszintézist ismertetnek a következő művekben: Stewart és Young, „Solid Phase Peptide Synthesis” 2. kiadás, Pierce Chemical Co., Rockford, IL (1984); Gross, Meienhofer, Udenfriend (szerkesztők), „The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology”, 1., 2., 3., 5. és 9. kötet, Academic Press, New York, 1980-1987; Bodanszky, „Peptide Chemistry: A Practical Textbook”, Springer Verlag, New York (1988); valamint Bodanszky és munkatársai „The Practice of Peptide Synthesis” Springer Verlag, New York (1984), amely műveket a leírásban referenciaként szerepeltetünk.

Két aminosav, egy aminosav és egy peptid, vagy két peptidfragmens közötti kapcsolást standard kapcsolási eljárásokkal végezhetünk, úgymint az azidmódszerrel, vegyes szénsavanhidrid (izobutil-klór-formiát)módszerrel, karbodiimid (diciklohexil-karbodiimid, diizopropil-karbodiimid vagy vízoldható karbodiimid)módszerrel, aktív észter (p-nitro-fenil-észter, N-hidroxi-szucinimid-észter)-módszerrel, Woodward K reagens módszerrel, karbonil-diimidazol-módszerrel, foszfortartalmú reagens, úgymint BOP-C1 alkalmazásával vagy oxidációs-redukciós módszerekkel. E módszerek közül néhánynak (különösen a karbodiimid-módszernek) növelhetjük a hatékonyságát 1-hidroxi-benzotriazol hozzáadásával. Ezeket a kapcsolási reakciókat elvégezhetjük akár oldatban (folyadékfázisban) akár szilárd fázisban.

A peptideket felépítő aminosavak funkciós csoportjait védeni kell a kapcsolási reakciók során annak érdekében, hogy elkerüljük nemkívánatos kötések kialakulását. Az alkalmazható védőcsoportokat ismertetik a kővetkező művek: Greene „Protective Groups in Organic Chemistry”, John Wiley & Sons, New York (1981), valamint „The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology”, Vol. 3, Academic Press, New York (1981), amely közleményeket a leírásban referenciaként tekintünk.

A C-tenninális csoport α-karboxilcsoportját általában egy ilyen észterrel védjük, amelyet lehasíthatunk, hogy megkapjuk a karbonsavat. Alkalmazható védőcsoportok lehetnek: 1. alkil-észterek úgymint a metil- és a terc-butil-észter, 2. aril-észterek, úgymint a benzil- és a szubsztituált benzil-észterek vagy 3. olyan észterek, amelyeket kíméletes bázisos kezeléssel vagy enyhe reduktív kezeléssel hasíthatunk, úgymint triklór-etil- és fenacil-észterek.

Minden aminosav α-aminocsoportját védenünk kell. Erre bármely ismert védőcsoportot felhasználhatunk, A védőcsoportokra példák: 1. acil típusú védőcsoportok, úgymint formilcsoport, trifluor-acetil-csoport, ftalilcsoport és p-toluolszulfonilcsoport; 2. aromás karbarnát típusú védőcsoportok, úgymint a benzil-oxi-karbonil-csoport (Cbz vagy Z) és a szubsztituált benziloxi-karbonil-csoportok, 1 -(p-bifenil)-1 -(metil-etoxi)karbonil-csoport és a 9-fluorenil-metil-oxi-karbonilcsoport (Fmoc); 3. alifás karbamát típusú csoportok, úgymint a terc-butoxi-karbonil-csoport (Boc), etoxikarbonil-csoport, diizopropil-metoxi-karbonil-csoport, valamint az allil-oxi-karbonil-csoport; 4. ciklusos alkilkarbamát típusú csoportok, úgymint a ciklopentil-oxikarbonil-csoport és az adamantil-oxi-karbonil-csoport; 5. alkil típusú csoportok, úgymint a trifenil-metil-csoport és a benzilcsoport; 6. trialkil-szilán-csoportok, úgymint a trimetil-szilán-csoport; valamint 7. tiolcsoportot tartalmazó típusúak, úgymint a fenil-tio-karbonil-csoport és a ditia-szukcinoil-csoport. Előnyös a-aminovédő csoport a Boc vagy Fmoc csoport, előnyös közülük a Fmoc. A kereskedelmi forgalomban számos olyan aminosavszármazék kapható, amely peptidszintézis céljaira alkalmasan védve van.

Az α-aminovédő csoportot a következő aminosav kapcsolását megelőzően eltávolítjuk Ha Boc védőcsoportot alkalmazunk, választhatunk a trifluor-ecetsavval (tisztán vagy diklór-metános oldatban) vagy a dioxános sósavoldattal végzett hasítás között. A keletkezett ammóniumsót ezután semlegesítjük vagy a kapcsolást megelőzően, vagy in situ bázisos oldatokkal, úgymint vizes pufforokkal vagy pedig diklór-metánnal vagy dimetil-formamiddal készült tercier amin-oldatokkal. Ha Fmoc csoportot alkalmazunk, a választható reagensek közé tartozik a dietil-formamidban lévő piperidin vagy szubsztituált piperidin, de bármilyen szekunder aminoldatot vagy vizes bázisos oldatot használhatunk. A védőcsoport-eltávolítást 0 °C és szobahőmérséklet között végezzük.

Bármely olyan aminosavat, amelynek oldalláncbeli funkciós csoportja van, védenünk kell a peptidek előállítása során ha bármelyik felsorolt eljárást alkalmazzuk. A szakember számára ismert, hogy ezen oldalláncbeli megfelelő védőcsoportok megválasztása és alkalmazása függ az aminosavtól és a pepiidben jelen lévő más védőcsoportoktól. Az ilyen védőcsoportok megválasztásának szempontja az, hogy azokat nem szabad eltávolítani az α-aminocsoport védőcsoportjának eltávolítása és kapcsolása során.

Ha például Boc csoportot használunk a-aminovédő csoportként, a következő oldallánci védőcsoportok alkal5

HU 221 629 Bl masak: p-toluolszulfonilcsoportot (tozilcsoportot) használhatunk aminosavak amino-oldalláncának védelmére, így a Lys és az Arg esetén; p-metil-benzil-csoportot, acetamido-metil-csoportoL benzilcsoportot (Bzl) vagy tercbutil-szulfonil-csoportot használhatunk az aminosavak szulfidtartalmú oldalláncának védelmére, úgymint a risztéin esetói; továbbá benzil (Bzl)-éter-csoportot használhatunk az aminosavak hidroxicsoportot tartalmazó oldalláncainak védelmére, úgymint a Ser vagy a Thr esetén.

Ha Fmoc csoportot választunk az a-aminovédelemre, rendszerint elfogadhatók a terc-butil-alapú védőcsoportok. Például Boc csoportot használhatunk a lizin, terc-butil-éter-csoportot a szerin és a treonin, valamint terc-butil-észter-csoportot a glutaminsav esetén.

Ha a peptidlánc meghosszabbítását befejeztük, az összes védőcsoportot eltávolítjuk. Ha oldalfázisú szintézist alkalmazunk, a védőcsoportot bármely módon eltávolíthatjuk, amilyet a védőcsoport megválasztása megszab. Ezek az eljárások a szakember számára jól ismertek.

Ha szilárd fázisú szintézist alkalmazunk, a peptidet rendszerint a védőcsoportok eltávolításával egyidejűleg hasítjuk le a gyantáról. Ha a Boc-védelem sémáját alkalmazzuk a szintézis során, a pepiidnek a gyantáról való lehasítására előnyös eljárás olyan vízmentes HF-dal végzett kezelés, amely HF adalékanyagokat, úgymint dimetil-szulfoxidot, anizolt, tioanizolt vagy p-krezolt tartalmaz, és a kezelést 0 °C-on végezzük. A peptidet lehasíthatjuk más savas reagensekkel is, úgymint trifluor-metánszulfonsav/trifluor-ecetsav elegyével. Ha a Fmoc-védelem sémáját alkalmazzuk, az N-terminális Fmoc csoportot a korábban ismertetett reagensekkel hasítjuk le. A többi védőcsoportot és a peptidet a gyantáról trifluor-ecetsav és különféle adalékok, úgymint anizol, stb. oldatával hasítjuk le.

Azokat az (I) általános képletű peptideket, amelyekben X jelentése hidrogénatom, vizes sav/formaldehid rendszerrel hasíthatjuk le a kapcsolódó vegyületről és a gyantáról.

Az (I) általános képletű vegyületeket alternatív módon előállíthatjuk a szakember számára ismert standard kémiai reakciókkal analóg módon úgy is, amint azt a B reakcióvázlattal szemléltetjük.

A B reakcióvázlat alternatív általános szintézisvázlatot mutat be az (IB) általános képletű vegyületek előállítására.

A P₂ ^a csoportot, melynek jelentése a fenti, az előbbiekben leirt A reakcióvázlatnak megfelelően kapcsolhatjuk a (2) általános képletű amino-alkohol-származékok - melyekben R¹ és X» jelentése a fenti - szabad aminocsoportjához, így a (3) általános képletű peptidoalkoholokat kapjuk.

A (3) általános képletű peptido-alkoholok alkohol funkciós csoportját ezután a szakember számára ismert eljárásokkal és műveletekkel oxidáljuk, úgymint Swem-oxidációval oxalil-klorid és dimetil-szulfoxid alkalmazásával, és így kapjuk az (IB) általános képletű vegyületeket.

Az A és B reakcióvázlat szerinti kiindulási anyagok a szakember számára könnyen hozzáférhetőek. Például a P₂® aminosav, a kereskedelemben kapható, továbbá az (Ll) képletű kapcsoló (linker)-vegyületet a J. Am. Chem. Soc. 114, 3157-3159 (1992) közlemény ismerteti. A 0363284 számú európai szabadalmi bejelentés (1990. április 11.) leírja továbbá azokat a K^a-P2^a általános képletű szubsztituált aminosavakat, melyekben K^ajelentése acetilcsoport, szukcinilcsoport, benzoilcsoport, terc-butil-oxi-karbonil-csoport, karbobenzil-oxicsoport, tozilcsoport, danzilcsoport, izovalerilcsoport, metoxi-szukcinil-csoport, 1-adamantán-szulfonil-csoport, 1-adamantán-acetil-csoport, 2-karbox-benzoil-csoport, fenil-acetil-csoport, terc-butil-acetil-csoport, bisz[(l-naftil)-metil]-acetil-csoport vagy -A-Rz általános képletű csoport, ahol A jelentése (a), (b), (c) vagy (d) képletű csoport; és R_z jelentése olyan 6, 10 vagy 12 szénatomos arilcsoport, amely alkalmas módon szubsztituálva van 1-3 szubsztituenssel, amely szubsztituensek jelentése egymástól függetlenül fluor-, klór-, bróm-, jódatom, trifluor-metil-csoport, hidroxicsoport, 1-6 szénatomos alkilcsoport, 1-6 szénatomos alkoxicsoport, karboxicsoport, alkil-karbonil-amino-csoport, melyben az alkilcsoport 1-6 szénatomot tartalmaz, 5-tetrazolilcsoport, és 1-15 szénatomot tartalmazó acil-szulfonamido-csoport, azaz acil-amino-szulfonil-csoport és szulfonil-amino-karbonil-csoport, azzal a feltétellel, hogy ha az acil-szulfonamido-csoport arilcsoportot tartalmaz, ez az arilcsoport még egy szubsztituenssel szubsztituálva lehet, ahol ennek a szubsztituensnek a jelentése fluor-, klór-, bróm-, jódatom és nitrocsoport; továbbá K jelentése olyan más terminális aminovédő csoport, amely ezekkel funkcionálisan ekvivalens.

Az (1) általános képletű kiindulási aminovegyületek a szakember számára könnyen hozzáférhetőek. A következőkben példaképpen megadunk olyan közleményeket, amelyek bizonyos (I) általános képletű védett aminosavakat írnak le. Olyan (1) általános képletű vegyületeket ismertetnek tehát, ahol

X jelentése hidrogénatom és R jelentése benzilcsoport: a 0363284 számú európai és a WO 84/00365 számon nyilvánosságra hozott PCT szabadalmi bejelentések;

X jelentése hidrogénatom és R jelentése CH₂Si(CH₃)₃ képletű csoport: a 0363284 számú európai szabadalmi bejelentés, és e bejelentés 12. példája. A 13. és 14. példákban leírt vegyűleteknél csak a szililcsoporton lévő szubsztituensek különbözőek;

X jelentése hidrogénatom és R jelentése szubsztituált benzilcsoport: a PCT/US91/09741 számú szabadalmi bejelentés;

X jelentése CF₃ és CHF₂ csoport, és R jelentése benzilcsoport vagy NHC(NH)NH₂ csoporttal szubsztituált benzilcsoport: a 0195212 számú európai szabadalmi bejelentésben (nyilvánosságra hozatala 1986. szeptember 24., feltalálók: Michel Jung és társai);

X jelentése CF₂CH₂NHC(=O)R] általános képletű csoport és R jelentése benzilcsoport, intermedierként ismertetve az OPI0275101 számú európai szabadalmi bejelentésben (benyújtva 1988. január 14-én, feltalálók: Dániel Schirlin és társai); a CFHCH₂NHC(=O)Rj általános képletű csoportot tartalmazó monofluorszármazék hasonló eljárásokkal állítható elő úgy, hogy bróm6

HU 221 629 Bl (fluor-ecetsav)-etil-észtert használnak bróm-(difluorecetsav)-etil-észter helyett;

X jelentése CF₂C(O)W általános képletű csoport, melyben W jelentése NHCH₂Si(alkil)₃ általános képletű csoport, továbbá R jelentése benzilcsoport, CH₂Si(CH₃)₃vagy szubsztituált benzilcsoport: aPCT/US91/09741 számú szabadalmi bejelentés (feltalálók: Dániel Schirlin et al., benyújtva: 1991. december 20-án), és ha R jelentése (CH^-naftil-csoport, hasonló eljárásokat alkalmazhatnak ismert kiindulási vegyületek használatával;

X jelentése CF₂C(O)W általános képletű csoport, ahol W jelentése NHRj vagy Rj csoport és R jelentése benzilcsoport, CH₂Si(CH₃)₃ vagy szubsztituált benzilcsoport: a PCT/US91/09741 számú szabadalmi bejelentés (feltalálók: Dániel Schirlin és társai, benyújtva 1991. december 20-án), és ha R jelentése (CH₂)_m-naftil-csoport, hasonló eljárásokat alkalmazhatnak ismert kiindulási vegyületek használatával;

X jelentése C(O)R_t csoport és R jelentése benzilcsoport, CH₂Si(CH₃)₃, (CH₂)_m-naftil- vagy szubsztituált benzilcsoport: a 4,820,691 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás (benyújtva: 1989. április 11-én); és a transz-4-(amino-metil-ciklohexán)-karbonsavbenzil-észter kapcsolódó vegyületnek a megfelelő savból végzett előállítását az olyan (I) általános képletű vegyületek szintézise érdekében, melyekben X jelentése hidrogénatom a J. Am. Chem. Soc., 114, 3156-3157 (1992) közlemény.

A leírás szempontjából valamennyi előbbi közlemény referenciaként tekintendő.

A következő példák tipikus szintéziseket mutatnak be. A példák csak a találmány bemutatását szolgálják anélkül, hogy az oltalmi kört bármilyen módon korlátoznák. A példákban megadott jelölések jelentése a következő: gramm; „mmol” millimól; „ml” milliliter, „lp” fonáspont; „°C” Celsius-fok; „pl” mikroliter; „pg” mikrogramm; „pM” mikromól; ,JZ” vagy „Cbz” jelentése karbobenzil-oxi-csoport; „THF” tetrahidroíurán; „DCU” Ν,Ν-diklór-uretán; „Eq” ekvivalens; ,Atg” gramm atom.

1. példa (ref.)

2-[N-(Benzil-oxi-karbonil)-L-valil]-amino-4,4-difluor-l,7-difenil-3,5-dioxo-heptán előállítása [(69) képletű vegyület]

A) lépés: N-(Benzil-oxi-karbonil)-L-valil-L-fenilalanin, N, O-dimetil-hidroxamát

0,920 g (4,5 mmol) N,N’-diciklohexil-karbodiimidet adunk 0,220 g (0,55 mmol) CBz(L)-Val-PheOH és 0,93 g (0,61 mmol) hidroxi-(benzotriazol) 12 ml metilén-kloriddal készített oldatához. Az elegyet 0 °Con 1 órán át keverjük. A reakcióelegyhez 0,59 g (0,61 mmol) N,O-dimetil-hidroxil-amin.HCl-t és 0,61 g (0,61 mmol) N-metil-morfolint adunk és 12 órán keresztül keveijük 25 ’C-on. Az elegyet szüljük, metilén-kloriddal mossuk és a szűrletet vákuumban besűrítjük, így megkapjuk a nyersamidot olaj alakban. A nyersmaradékot flashkromatográfiával tisztítjuk [szilikagél, 2:8 (etil-acetát):ciklohexán], 0,250 g címbeli vegyületet kapunk.

B) lépés: N-(Benzil-oxi-karbonil)-L-valil-L-fenilalaninal

Az előzőekben készített hidroxamátból 0,220 g-ot (5 mmol) adunk 10 ml dietil-éterben oldott 0,19 g (0,49 mmol) lítium-aluminium-hidridhez, 0 ’C-on inért atmoszférában. Az elegyet 30 percig keverjük, szobahőmérsékletre hagyjuk felmelegedni, és 1 órán át keverjük. A fázisokat elválasztjuk, és a szerves fázist mossuk 10 ml telített nátrium-karbonát-oldattal, majd telített nátrium-klorid-oldattal, magnézium-szulfáton szárítjuk, szüljük és vákuumban besűrítjük. így kapjuk a címbeli vegyületet: 0,179 g CBz(L)-Val-Phe-H-t, melyet további tisztítás nélkül használunk fel.

C) lépés: 2-[N-(Benzil-oxi-karbonil)-valil]-amino4,4-difluor-l,7-difenil-3-hidroxi-5-oxo-heptán

0,019 g (0,1 ekv.) titán-tetrakloridot adunk 0,196 g (3 mAtg) aktivált cinknek 3 ml vízmentes THF-nal készített szuszpenziójához, 0 ’C-on. Nitrogéngáz alatt 30 percig keveijük, és hozzáadunk 0,42 g (1,1 mmol) CBz(L)-Val-Phe-H-t, 0,218 g (1,0 mmol) l-klór-1,1difluor-2-oxo-4-fenil-butánt 4 ml vízmentes THF-ban. Hagyjuk felmelegedni a reakcióelegyet szobahőmérsékletre, és 12 órán át keveijük. 2 ml telített ammónium-klorid-oldatot adunk hozzá. Kétszer extraháljuk 4 ml dietil-éterrel, és a szerves tézist sóoldattal mossuk, majd vízmentes magnézium-szulfáton szárítjuk. A szerves fázist vákuumban besűrítjük. A nyersmaradékot flashkromatográfiával tisztítjuk [szilikagél, 3:7(etil-acetát): ciklohexán], így 0,381 g címbeli alkoholt kapunk.

D) lépés: 2-[N-(Benzil-oxi-karbonil)-L-valil]-amino-4,4-difluor-l,7-difenil-3,5-dioxo-heptán

0,331 g (4,26 mmol) dimetil-szulfoxidot adunk 0,269 g (2,13 mmol) oxalil-klorid-oldatboz, melyet 2 ml vízmentes metilén-kloriddal készítettünk -55 ’Con nitrogéngáz alatt. 10 percig keveijük az elegyet -55 °C-on, és hozzáadunk a fent készített alkoholból 0,3 g-ot (0,53 mmol) 2 ml vízmentes metilén-kloridban oldva. A reakcióelegyet 2 órán át keveijük ezen a hőmérsékleten, majd hagyjuk felmelegedni -20 ’C-ra. 0,321 g (1,68 mmol) trietil-amint adunk hozzá, és hagyjuk szobahőmérsékletre felmelegedni. Néhány percig még keveijük az elegyet. 10 ml etil-acetáttal felhígítjuk. A szerves fázist 3x3 ml 0,1 mol/1 sósavval és telített vizes ammónium-klorid-oldattal mossuk. A szerves fázist vízmentes magnézium-szulfáton szárítjuk, szűrjük és besűrítjük vákuumban, így 0,22 g nyersterméket kapunk. A nyersanyagot kristályosítással tisztítjuk, és 0,102 g címbeli vegyületet kapunk.

Elemanalízis-adatok:

számított: C: 67,95%, H: 6,24%, N: 4,95%; talált: C: 66,99%, H: 6,15%, N: 5,30%.

2. példa (ref.)

4-[N-(Fenil-propionil)-L-valil]-amino-2,2-difluor3-oxo-5-fenil-N-benzil-pentánamid előállítása [(70) képletű vegyület]

A) lépés: N-(Benzil-oxi-karbonil)-fenil-alaninal

4,19 g CBz(L)-Phe-H aldehidet kapunk úgy, hogy 15,00 g (50 mmol) CBz(L)-Phe-OH-t redukálunk, utá7

HU 221 629 Bl na az az eljárás következik, melyet az 1. példában leírtunk [A) és B) lépés].

B) lépés: 4-(Benzil-oxi-karbonil)-amino-2,2-difluor-3-hidroxi-5-fenil-pentánsav-etil-észter

4,19 g (14,8 mmol) CBz-(L)-Phe-H-t és 6,30 g (31 mmol) etil-bróm-difluor-acetátot 40 ml száraz THF-ban hozzáadjuk egy olyan refluxáló szuszpenzióhoz, mely 2,0 g (31 mAtg) aktivált cinkforgácsot tartalmaz 10 ml száraz THF-ban, és az elegyet gyenge reflux alatt tartjuk. Az oldatot 12 órán keresztül keveijük szobahőmérsékleten. Az elegyhez 100 ml etil-acetátot, 20 ml sóoldatot, 20 ml kálium-hidrogén-szulfátot adunk. A vizes fázist 3x60 ml etil-acetáttal extraháljuk, az extraktumot magnézium-szulfáton szárítjuk és vákuumban besűrítjük. A nyersmaradékot flashkromatográfiával tisztítjuk (szilikagél, 3:7 etil-acetát: ciklohexán) és 3,70 g címbeli vegyületet kapunk.

C) lépés: 4-(Benzil-oxi-karbonil)-amino-2,2-difluor-3-hidroxi-5-fenil-N-benzil-pentánamid

1,93 g (18 mmol) benzil-amint 10 ml THF-ban oldunk. Az oldatot hozzáadjuk egy olyan oldathoz, mely 1,42 g (3,5 mmol) etil-észtert tartalmaz 10 ml THFban. Az elegyet 12 órán át keveijük. 100 ml etil-acetátot adunk hozzá, 2x100 ml 0,1 mol/1 vizes sósavval, majd 100 ml vízzel és 100 ml sóoldattal mossuk. Vízmentes magnézium-szulfáton szárítjuk. A nyersterméket flashkromatográfiával tisztítjuk (szilikagél, 2:8 etil-acetát:ciklohexán), így 1,16 g címbeli vegyületet kapunk.

D) lépés: 4-Amino-2,2-difluor-3-hidroxi-5-fenil-Nbenzil-pentánamid

Az előző lépésben készített amid 0,81 g-ját (1,70 mmol) 0,28 g 10%-os palládium/aktív szén katalizátor 75 ml absz. etanolos szuszpenziójához adjuk. 12 órán át keveijük az elegyet hidrogéngáz atmoszférában atmoszferikus nyomáson. A katalizátort leszűijük, etanollal mossuk, és a szűrletet vákuumban besűrítjük, így 0,5 g címbeli amint kapunk, amely védőcsoportot nem tartalmaz.

E) lépés: 4-[N-(Fenil-propionil)-L-valil]-amino2.2- difluor-3-hidroxi-5-fenil-N-benzil-pentánamid

0,165 g (0,80 mmol) N,N’-diciklohexil-karbodiimidet adunk 0,199 g (0,80 mmol) hidrocinnamoilVal-OH [3-(fenil-propionil)-Val-OH] 15 ml vízmentes acetonitrillel készült oldatához. Az elegyet 1 órán át keveijük 0 °C-on. Az előbb készített aminból 0,210 got (0,80 mmol) adunk a reakcióelegyhez, és 12 órán át keveijük 25 °C-on. Az elegyet szüljük, etil-acetáttal mossuk és a szűrletet vákuumban besűrítjük, és megkapjuk a nyersamidot olaj alakban. A nyersmaradékot flashkromatográfiával tisztítjuk (szilikagél, 2:8 etilacetát: ciklohexán), így 0,16 g címbeli vegyületet kapunk.

F) lépés: 4-[N-(Fenil-propionil)-L-valil]-amino2.2- difluor-3-oxo-5-fenil-N-benzil-pentánamid

A fentiekben készített alkoholból 0,145 g-ot (0,25 mmol) 10 ml metilén-kloriddal és 0,055 g (0,75 mmol) terc-butil-alkohollal elegyítünk, és ezt az elegyet hozzáadjuk 0,318 g (0,75 mmol) Dess-Martinreagens metilén-kloridos szuszpenziójához. 12 órán keresztül keveijük az elegyet szobahőmérsékleten, majd vákuumban besűrítjük. A nyersmaradékot flashkromatográfiával tisztítjuk (szilikagél, 3:7 etil-acetát :ciklobexán), így 0,063 g címbeli vegyületet kapunk. Elemanalízis-adatok a képletre:

számított: C: 68,19%, H: 6,26%, N: 7,45%;

talált: C: 67,90%, H: 6,30%, N : 7,33%.

3. példa (ref.)

2-[N-(Benzil-oxi-karbonil)-L-valil]-amino-3-(trimetil-szilil)-propanal előállítása [(75) képletű vegyület]

A) lépés: 2-[(Benzil-oxi-karbonil)-amino]-3-(trimetil-szilil)-propánsav-metil-észter

5,58 g (25 mmol) N-(benzil-oxi-karbonil)-glicin-metil-észtert feloldunk 70 ml száraz THF-ban. Ezt az oldatot cseppenként hozzáadjuk -78 °C-on 8,76 ml (62,5 mmol) lítium-diizopropil-amin és 9,43 ml (62,5 mmol) tetrametil-etilén-diamin 100 ml száraz THF-nal készített oldatához, nitrogénatmoszférában. Miután az adagolás befejeződött, az oldatot 2 órán át keveijük -78 °C-on, majd 15 percig -30 °C-on, és lehűtjük -78 °C-ra. 39 ml száraz hexametil-foszfor-amidban oldunk 5,36 g (25 mmol) jód-metil-trimetil-szilánt és cseppenként adagoljuk a kapott szirupos elegyhez. Miután az adagolást befejeztük, a reakcióelegyet felmelegítjük -50 °C-ra, 1 óráig ezen a hőmérsékleten tartjuk és lehűtjük -78 °C-ra, éppen a hidrolízis előtt. A reakcióelegyet kioltjuk víz és ammónium-klorid hozzáadásával és felhígítjuk éterrel. A szerves réteget 1 mol/1 káliumhidrogén-szulfát-oldattal, majd kétszer vízzel mossuk, és nátrium-szulfáton szárítjuk. Az oldószert elpároljuk és a nyert 8,03 g maradékot flashkromatográfiával tisztítjuk (szilikagél, etil-acetát/petroléter: 2/8). 4,30 g címbeli vegyületet kapunk (56%-os hozam, színtelen olaj). R_f=0,51 (etil-acetát/petroléter: 2/8).

B) lépés: 2-Amino-3-(trimetil-szilil)-propánsav-metil-észter-hidroklorid

Az előbbi A lépésből származó termék 0,309 g-ját (1 mmol) 30 ml etanolban oldjuk és az oldatot 1,5 ml sósavval telített száraz dietil-éteiben keveijük szobahőmérsékleten 24 órán át, hidrogénatmoszférában, 0,03 g 10%-os palládium/aktív szén katalizátor jelenlétében. A hidrogénatmoszférát nitrogénatmoszférára cseréljük, és a katalizátort kiszűijük. Az elegyet vákuumban besűrítjük, így megkapjuk a címbeli vegyületet szilárd alakban, ezt úgy ahogy van felhasználjuk a következő lépésben.

C) lépés: 2-[N-(Benzil-oxi-karbonil)-L-vatil]-amino-3-(trimetil-szilil)-propánsav-metil-észter 0,311 g (1,24 mmol)N-(benzil-oxi-karbonil)-L-valint, 1,167 g (1,24 mmol) 1-hidroxi-benzotriazolhidrátot és 0,255 g (1,24 mmol) N,N’-diciklohexil-karbodiimidet feloldunk 20 ml metilén-kloridban és 3 ml dimetil-formamidban. Keverés közben az oldathoz 0 °C-on egymás után hozzáadunk 0,262 g-ot (1,24 mmol) az előbbi B lépésben nyert aminból és 0,136 ml (1,24 mmol) N-metil-morfolint. A hűtőfurdót eltávolítjuk, és a reakcióelegyet szobahőmérsékleten 17 órán át keverjük. Ezután szűrjük a reakcióele8

HU 221 629 Bl gyet, és a szűrletet vákuumban bepároljuk. A 0,476 g maradékot flashkromatográfiával tisztítjuk (szilikagél, petroléter/etil-acetát:8/2; Rf=0,14), így kapjuk a címbeli vegyületet (0,316 g-ot, 77%-os hozam a két lépésre).

D) lépés: 2-[N-(Benzil-oxi-karbonil)-L-valil]-amino-3-(trimetil-szilil)-propanal

Hexánnal készitett 1 mol/1 diizobutil-alumíniumhidrid-oldat 1,55 ml-ét cseppenként hozzáadjuk az előbbi C) lépésben kapott észter oldatához [0,316 g (0,77 mmol) észtert 7,5 ml vízmentes éterben és 3,5 ml vízmentes toluolban oldottunk] -78 °C-on, nitrogénatmoszférában. Az oldatot -78 °C-on 45 percig keverjük, és lassan hidrolizáljuk telített, vizes ammóniumklorid-oldattal. A vizes réteget kétszer extraháljuk (2 χ 20 ml) éterrel, és a szerves fázist szukcesszíve mossuk 10 ml 1 mol/1 kálium-hidrogén-szulfáttal és 20 ml vízzel. Az egyesített szerves fázisokat nátrium-szulfáton szárítjuk, szűrjük és az oldószert vákuumban eltávolítjuk. 0,260 g szilárd maradékot kapunk, melyet flashkromatográfiával tisztítunk (szilikagél, petroléter/etil-acetát :75/25, Rf=0,25), így megkapjuk a címbeli vegyületet 53%-os hozammal (0,15 g).

Az anyagot diklór-metán/pentánból kristályosítjuk, és 0,077 g fehér, gyapotszerű szilárd anyagot kapunk. Elemanalízis-eredmények a Cj^o^C^Si képletre: számított: C: 60,29%, H: 7,99%, N: 7,40%; talált: C: 60,23%, H: 8,10%, N: 7,42%.

4. példa

4-[N-(Benzil-oxi-karbonil)-L-valil]-amino-2,2-difluor-3-oxo-4-fenil-N-(trimetil-szilil-metil)-pentánamid előállítása [(71) képletű vegyület] 4-(Benzil-oxi-karbonil)-amino-2,2-difluor-3-hidroxi-5-fenil-pentánsav-etil-észtert állítunk elő a 2. példa B) lépésében leírtak szerint.

A) lépés: 4-(Benzil-oxi-karbonil)-amino-2,2-difltíor-3-hidroxi-5-fenil-N-(trimetil-szilii-metil)-pentánamid

A fent említett difluor-alkohol 0,25 g-ját (0,61 mmol) hozzáadjuk 2,5 ml THF-ban lévő 0,81 ml (6,10 mmol) trimetil-szilil-metil-aminhoz. Az elegyet 12 órán át keveijük és visszafolyató hűtő alatt melegítjük. Vákuumban besűrítjük, majd felhígítjuk 5 ml vizes kálium-hidrogén-szulfát-oldattal és 3 χ 5 ml dietil-éterrel extraháljuk. A szerves fázist 2x15 ml vízzel mossuk, majd nátrium-szulfáton szárítjuk. A nyersmaradékot flashkromatográfiával tisztítjuk (szilikagél, 25:75 etil-acetát:ciklohexán), így 0,212 g címbeli vegyületet kapunk.

B) lépés: 4-Amino-2,2-difluor-3-hidroxi-5-fenil-N(trimetil-szilil-metil)-pentánamid

0,10 g (0,22 mmol) fentiekben készített amidot egy olyan szuszpenzióhoz adunk, mely 10 ml abszolút etanolban 0,1 g 10%-os palládium/aktív szén katalizátort tartalmaz. Az elegyet 12 órán át atmoszferikus hidrogénnyomás alatt keveijük. A katalizátort kiszűijük, etanollal mossuk és vákuumban besűrítjük, így 0,71 g címbeli amint kapunk, amely védőcsoportot nem tartalmaz.

C) lépés: 4-[N-(Benzil-oxi-karbonil)-L-valil]-amino-2,2-difluor-3-hidroxi-5-fenil-N-(trimetil-szililmetil)-pentánamid

0,055 g (0,22 mmol) CBz(L)-Val-OH és 0,03 g (0,22 mmol) hidroxi-benzotriazol 10 ml dimetil-formamiddal készült oldatához 0,045 g (0,22 mmol) N,N’-diciklohexil-karbodiimidet adunk. Az elegyet 30 percig keveijük 0 °C-on. A reakcióelegyhez a fent készített aminból 0,073 g-ot (0,22 mmol) adunk és 25 °C-on 12 órán át keveijük a reakcióelegyet. Vizet és sóoldatot adunk hozzá, majd etil-acetáttal extraháljuk, vízzel mossuk, nátrium-szulfáton szárítjuk, és besűrítjük. 5 ml acetonitrillel hígítjuk, és leválasztjuk a DCU-t. Szüljük és a szűrletet vákuumban besűrítjük, és megkapjuk a nyersamidot. A nyersmaradékot flashkromatográfiával tisztítjuk (szilikagél, 35:65 etil-acetát:petroléter), így kapunk 0,40 g címbeli vegyületet.

D) lépés: 4-[N-(Benzü-oxi-karbonil)-L-valil]-amino-2,2-difluor-3-oxo-5-fenil-N-(trimetil-szilil-metil)-pentánamid

0,031 g (0,44 mmol) dimetil-szulfoxidot 1 ml vízmentes metilén-kloridban hozzáadjuk 1 ml metilén-kloridban oldott 0,02 ml (0,22 mmol) oxalil-kloridhoz -60 °C-on. Az elegyet 5 percig -60 °C-on keveijük, és hozzáadjuk a fent készített alkohol 0,041 g-ját (0,07 mmol), melyet 2 ml metilén-kloriddal elegyítettünk. A reakcióelegyet 1 órán át keveijük ezen a hőmérsékleten. 0,09 ml (0,65 mmol) trietil-amint adunk hoz- f zá, és hagyjuk felmelegedni szobahőmérsékletre. Az * elegyet még néhány percig keveijük, majd 10 ml meri- J lén-kloriddal felhígítjuk. A szerves fázist 3x10 ml I mol/1 kálium-hidrogén-szulfáttal és 2 χ 10 ml vízzel j mossuk. A szerves fázist nátrium-szulfáton szárítjuk, fc szűqük és vákuumban besűrítjük, így megkapjuk a | nyersvegyületet. A nyersmaradékot flashkromatográfiá- j val tisztítjuk (etil-acetát: petroléter 25:75, Rf= 0,2), így i nyerünk 0,015 g címbeli vegyületet.

Elemanalízis-eredmények a C₃₁H₃₃N₃O₅F₂.0,25 H₂O képletre:

számított: C: 58,93%, H: 6,71%, N: 7,36%;

talált: C: 58,74%, H: 6,72%, N: 7,16%.

5. példa

2-[N-(Benzil-oxi-karbonil)-L-valil]-amino-3-(fenildimetil-szilil)-propanal előállítása [(76) képletű vegyület]

A) lépés: 2-(Terc-butoxi-karbonil)-amino-3-(fenildimetil-szilil)-propánsav-metil-észter

A címbeli észtert 28%-os hozammal állítjuk elő N(terc-butoxi-karbonil)-glicin-metil-észterből és jód-metil-fenil-dimetil-szilánból (81%-os hozammal készítjük a kereskedelemben kapható klór-metil-fenil-dimetil-szilánból) ezt követi a 3. példa A) lépésében leírt eljárás.

Rf=0,23 (szilikagél, etil-acetát/petroléter: 1/9).

B) lépés: 2-Amino-3-(fenil-dimetil-szilán)-propán- ...

sav-metil-észter

Az előbbi A) lépésben kapott 0,92 g (2,73 mmol) ve- 8 gyületet 30 ml hangyasavban oldjuk, az oldatot 2 órán keresztül szobahőmérsékleten tartjuk. Miután a hangya- ' savat vákuumban eltávolítottuk, a maradékot feloldjuk

HU 221 629 BI ml etil-acetátban, 20 ml 1 mol/1 nátrium-karbonáttal extraháljuk és kétszer mossuk vízzel, a vizes fázist még egyszer extraháljuk 20 ml etil-acetáttal. Az egyesített szerves fázisokat nátrium-szulfáton szárítjuk, az oldószert bepároljuk és megkapjuk a címbeli vegyületet (0,64 g-ot) 98%-os hozammal.

C) lépés: 2-[N-(Benzil-oxi-karbonil)-L-valil]-amino-3-(fenil-dimetil-szilil)-propánsav-metil-észter

A címbeli vegyületet az előbbi B) lépésben előállított aminból és N-(benzil-oxi-karbonil)-L-valinból kapjuk a 3. példa C) lépésében leírt kapcsolási módszert alkalmazva, de l-etil-3-(3-dimetil-amino-propil)-karbodiimid-hidrokloridot használunk N,N’-diciklohexil-karbodiimid helyett (74% hozam).

Rf=0,19 (szilikagél, etil-acetát/petroléter: 2/8).

D) lépés: 2-[N-(Benzil-oxi-karbonil)-L-valil]-amino-3-ffeml-ditnetil-szilil)-propanal

A címbeli aldehidet 33%-os hozammal nyerjük az előbbi C lépésben kapott észtéiből, a 3. példa D) lépésében leírt redukciós eljárás szerint.

R_f=0,17 (szilikagél, etil-acetát/petroléter:2/8). Elemanalízis-eredmények a C₂₄H₃₂N₂O₄Si képletre: számított: C: 65,42%, H: 7,32%, N: 6,36%; talált: C: 65,33%, H: 7,10%, N: 6,26%.

6. példa

2-[N-(Benzil-oxi-karbonil)-L-valil]-amino-3-(vimldimetil-szilil)-propanal [(77) képletű vegyület]

A) lépés: 2-(Terc-butoxi-karbonil)-amino-3-(vinildimetil-szilil)-propánsav-metil-észter

A címben lévő észtert 51%-os hozammal állítjuk elő N-(terc-butoxi-karbonil)-glicin-metil-észterből és jód-metil-vinil-dimetil-szilánból, a 3. példa A) lépésében megadott eljárást követve.

Rf=0,35 (szilikagél, etil-acetát/petroléter: 1/9).

B) lépés: 2-Amino-3-(vmil-dimetil-szilil)-propánsav-metil-észter

A címbeli amint az előbbi A) lépésben előállított származékból kapjuk az 5. példa B) lépésében megadott védőcsoport-eltávolítási eljárással (kvantitatív hozam).

C) lépés: 2-[N-(Benzil-oxi-karbonil)-L-valil]-amino-3-(vinil-dimetil-szilil)-propánsav-metil-észter

A címbeli vegyületet 68%-os kitermeléssel állítjuk elő az előbbi B) lépésben kapott aminból és N-(benziloxi-karbonil)-L-valinból az 5. példa C) lépésében ismertetett kapcsolási módszert alkalmazva.

Rf-0,22 (szilikagél, etil-acetát/petroléter: 2/8).

MS: MH⁺=421, MNH₄+=438.

D) lépés: 3-[N-(Benzil-oxi-karbonil)-L-valil]-amino-3-(vinil-dimetil-szilil)-propanal

A címben adott aldehidet megkapjuk az előbbi C) lépésben előállított észterből a 3. példa D) lépésében ismertetett redukciós eljárás szerint.

7. példa

N-(Benzil-oxi-karbonil)-L-valil-4-(fenil-karbonilamino)-L-fenil-alaninal előállítása [(83) képletű vegyület]

A) lépés: N-(Benzil-oxi-karbonil)-L-valil-4-nitroL-fenil-alamn-metil-észter

4,80 g (10 mmol) Z-L-valin-anhidrid 50 ml vízmentes diklór-metános oldatához 2,24 g (10 mmol) 4-nitroL-fenil-alanin-metil-észtert adunk. Az elegyet szobahőmérsékleten 1 éjjelen át keveijük. Az oldószert vákuumban eltávolítjuk, és a maradékot flashkromatográfíával tisztítjuk (szilikagél, etil-acetát/ciklohexán 4:6) és 2,10 g (56%-os hozam) címbeli vegyületet kapunk. Rf=0,32 (etil-acetát/ciklohexán 1:1)

B) lépés: N-(Benzil-oxi-karbonil)-L-valil-4-(fenilkarbonil-ammo)-L-fenil-alanin-metil-észter

0,91 g (2 mmol) N-(benzil-oxi-karbonil)-L-valil-4nitro-L-fenil-alanin-metil-észter, valamint 1,56 g (7 mmol) ón(ü)-klorid-dihidrát 50 ml abszolút etanolos oldatát és 5 ml Ν,Ν-dimetil-fonnamidot 4 órán át hevítünk reflux hőmérsékleten. Az elegyet lehűtjük, és vízzel hígítjuk, nátrium-hidrogén-kaibonáttal semlegesítjük, etil-acetáttal háromszor extraháljuk (3x50 ml). A szerves fázist magnézium-szulfáton szárítjuk. Szűrés és az oldószer bepárlása után a maradékot 20 ml vízmentes diklór-metánban felvesszük és 0 °C-ra hűtjük. 0,202 g (2 mmol) trietil-amint, utána 0,281 g (2 mmol) benzoil-kloridot adunk hozzá. Az elegyet szobahőmérsékleten 1 éjjelen át keveijük. Az oldószert eltávolítjuk vákuumban, és a maradékot flashkromatográfíával tisztítjuk (szilikagél, diklór-metán/metanol 98:2) és 0,500 g (50%-os hozam) címbeli vegyületet kapunk.

C) lépés: N-(Benzil-oxi-karbonil)-L-valil-4-(femlkarbonil-amino)-L-fenil-alanin

0,500 g (0,94 mmol) N-(benzil-oxi-karbonil)-Lvalil-4-(fenil-karbonil-ammo)-L-fenil-alanin-metil-észtert 30 ml dioxánban oldunk. Az oldathoz 0,084 g (2 mmol) lítium-hidroxid-monohidrátot adunk 10 ml vízben oldva. A reakcióelegyet szobahőmérsékleten keveijük 1 éjjelen át. Az elegyet 20 ml vízben felvesszük és kétszer mossuk etil-acetáttal (2 χ 20 ml). A szerves tézist pH«2 értékig 1 mol/1 sósavval megsavanyítjuk, és etil-acetáttal háromszor extraháljuk. A szerves tézist vízmentes magnézium-szulfáton szárítjuk. Az elegyet szűrjük, az oldószert vákuumban eltávolítjuk, így 0,400 g címbeli vegyületet kapunk fehér, szilárd anyagként (82%-os hozam).

MS:[MH]⁺=518 [MNH₄]+=535

D) lépés: N-(Benzil-oxi-karbonil)-L-valil-4-(fenilkarbonil-amino)-L-fenil-alanin-N,O-dimetil-hidroxamát

0,390 g (0,75 mmol) N-(benzil-oxi-karbonil)-Lvalil-4-(fenil-karbonil-amin)-L-fenil-alanint feloldunk 5 ml vízmentes Ν,Ν-dimetil-formamidban és 15 ml vízmentes diklór-metánban. Az oldathoz 0 °C-on 0,155 g (0,75 mmol) Ν,Ν’-diciklohexil-karbodiimidet és 0,115 g (0,75 mmol) hidroxi-benzotriazolt adunk. 10 percig tartó keverés után 0,073 g (0,75 mmol) N,Odimetil-hidroxamát-klórhidrátot és 0,076 g (0,75 mmol) N-metil-morfolint adunk hozzá. A reakcióelegyet szobahőmérsékleten 1 éjjelen át keveijük, az oldószert vákuumban eltávolítjuk, és a maradékot etil-acetátban felvesszük, majd szűqük. A szűrletet bepároljuk, és a maradékot flashkromatográfíával tisztítjuk (szilikagél, diklór-metán/metanol 98:2), így kapunk 0,230 g (53%-os hozam) címbeli vegyületet.

HU 221 629 Bl

R_f=0,59 (CH₂Cl₂/MeOH 9:1)

MS: [MH]+=561 [MNH]+=578

E) lépés: N-(Benzil-oxi-karbonil)-L-valil-4-(fenilkarboml-amino)-L-fenil-alaninal

0,230 g (0,41 mmol) N-(benzil-oxi-karbonil)-Lvalil-4-(fenil-karbonil-amino)-L-fenil-alanin-N,Odimetil-hidroxamátot 10 ml vízmentes dietil-éterben és 5 ml vízmentes THF-ban oldunk. Az oldathoz 0 °C-on 0,017 g (0,45 mmol) lítium-alumínium-hidridet adunk. A reakcióelegyet 0 °C-on 1 órán át keverjük. 5 ml 1 mol/l-es kálium-hidrogénszulfát-oldatot adunk hozzá, és az elegyet háromszor extraháljuk etil-acetáttal (3 χ 15 ml). A szerves fázist 1 mol/1 sósavval, vízzel és sóoldattal mossuk és vízmentes magnézium-szulfáton szárítjuk. Miután az oldószert vákuumban eltávolítottuk, a maradékot flashkromatográfíával tisztítjuk (szilikagél, diklór-metán/metanol 98:2), 0,050 g (25%-os hozam) címbeli vegyületet kapunk.

Rf=0,43 (CH₂Cl₂/MeOH 9:1)

MS: [MH]+=502 [MNH₄]⁺=519

8. példa

4-[N-(Benzil-oxi-karbonil)-L-terc-leucil]-amino2,2-difluor-3-oxo-5-fenil-N-(trimetil-szilil-metil)pentánamid előállítása [(88) képletű vegyület]

A) lépés: 4-[N-(Benzil-oxi-karbonil)-L-terc-leucil]-amino-2,2-difluor-3-hidroxi-5-fenil-N-(trimetil-szilil-metil)-pentánamid

A 4. példa B) lépésében leírt amin 0,222 g-ját (0,5 mmol) (trifluor-ecetsavas sójaként állítottuk elő), 115 μΐ (1,05 mmol) N-metil-morfolin és 0,56 g (1,1 mmol) karbobenzoxi-L-terc-leucil-anhidrid (előzetesen in situ állítjuk elő a savból és Ν,Ν’-diciklohexilkarbodiimidből 3 ml dimetil-fonnamidban) elegyét 1 éjjelen át keveijük szobahőmérsékleten. Az elegyet etilacetáttal hígítjuk, kétszer mossuk vízzel és a vizes fázist vákuumban besűrítjük. A nyersmaradékot flashkromatográfiával tisztítjuk (szilikagél, etil-acetát/petroléter 3:7) így 0,15 g címbeli alkoholt kapunk (52% hozam). Rf=0,69 (etil-acetát/petroléter 4:6).

B) lépés: 4-[N-(Benzil-axi-karbonil)-L-terc-leucil]-amino-2,2-difluor-3-oxo-5-fenil-N-(trimetil-szilil-metil)-pentánamid

A címbeli ketont az előbbi A) lépésben kapott alkoholból készítjük 69%-os hozammal, a Swem-féle oxidációs eljárást alkalmazva, melyet a 4. példa D) lépésében leírtunk.

1^=0,30 (etil-acetát/petroléter 3:7)

Elemanalízis-adatok a C29H₃₉F₂N₃O₅Si.0,5H₂O képletre: számított: C: 59,57%, H: 6,90%, N: 7,19%;

talált: C: 59,65%, H: 6,89%, N: 7,00%.

9. példa

6-[N-(Benzil-oxi-karbonil)-L-valil]-amino-4,4-difluor-l-fenil-7-metil-3,5-dioxo-oktán előállítása [(89) képletű vegyület]

A) lépés: Benzil-oxi-karbonil-L-valil-valinal

A címbeli aldehidet 43%-os hozammal állítjuk elő N-(benzil-oxi-karbonil)-L-valil-L-valin-etil-észterből, a 3. példa D) lépésében leírt redukciós módszenei.

Rf=0,25 (szilikagél, etil-acetát/petroléter 3:7)

MS: MH+=335, MNH₄+=352.

B) lépés: 6-[N-(Benzil-oxi-karbonil)-L-valil]-amino-4,4-difluor-l-fenil-7-metil-8-hidroxi-3-oxo-oktán

A címbeli difluor-alkoholt 39%-os hozammal kapjuk az előbbi A lépésben előállított aldehidből és 1klór-l,l-difluor-2-oxo-4-fenil-butánból, az 1. példa C) lépésében leírt eljárást követve.

Rf=0,43 (szilikagél, etil-acetát:petroléter 3:7). MS:MH⁺=519, MNR,+=536.

Elemanalízis-adatok a C_2gH₃₆F₂N₂O₅ képletre: számított: C: 64,85%, H: 7,00%, N: 5,40%; talált: C: 65,11%, H: 7,25%, N: 5,27%.

C) lépés: 6-[N-(Benzil-oxi-karbonil)-L-valil]-amino-4,4-difluor-l-fenil-7-metiI-3,5-dioxo-oktán

A címbeli diketont megkapjuk az előbbi B) lépésben előállított alkoholból, Swem-oxidációval, melyet a 4. példa D) pontjában írtunk le (34%-os hozam). Rf=0,31 (szilikagél, etil-acetát/petroléter 2:8) MS:MH+=517, MNH₄ ⁺=534.

Elemanalízis-adatok a C^H^^Os képletre: számított: C: 65,10%, H: 6,63%, N: 5,42%; talált: C: 65,22%, H: 6,90%, N: 5,05%.

10. példa

A találmány szerinti vegyületek azon aktivitását, hogy megelőzik vagy csökkentik a β-amiloid plakkok akkumulációját, és így a vegyületek alkalmazhatóságát az Alzheimer-típusú senilis dementia kezelésére, és más olyan állapotok kezelésére, amelyekről ismertek, hogy β-amiloid plakk-képződéssel járnak - ilyen a Down-szindróma - számos olyan in vitro és in vivő kísérlettel mutathatjuk be, amellyel a β-amiloid plakkok képződését modellezzük. így például a találmány szerinti vegyületeknek azt a képességét, hogy megelőzik vagy csökkentik a β-amiloid plakkok akkumulációját, számos celluláris és sejtmentes in vitro eljárással mutathatjuk ki, amelyeket az 1-3. meghatározásokként a következőkben ismertetünk. Ezek a mérések azon a tényen alapulnak, hogy a natív β-ΑΡΡ-t minden sejt kifejezi és processzálja 11-12 KDa C-terminális fragmensek és β-amiloid termelésére. A β-ΑΡΡ expresszió endogén szintjét kívánt esetben növelni lehet úgy, hogy βΑΡΡ cDNS-szekvenciákat, például β-ΑΡΡ(751)-ί transzfektálunk a sejtekbe standardmódszerek alkalmazásával.

Az alábbiakban ismertetésre kerülő in vitro vizsgálatok alkalmazásával meghatároztuk néhány, találmány szerinti vegyületnek a katepszin D enzim gátlására vonatkozó ICjo-értékétí és az eredményeket a következő táblázatban foglaltuk össze.

ic₅₀

4. példa szerinti vegyület 2,1 χ 10~^s

7. példa szerinti vegyület 5,0 χ 10^-4

8. példa szerinti vegyület 3,8 χ 10~⁸

Az IC₅₀-értékeket tehát in vitro körülmények között mértük, oly módon, hogy borjúlépből nyert, a kereskedelemben kapható enzimet és hemoglobinszubsztrátot használtunk.

HU 221 629 Bl

In vitro vizsgálatok

1. meghatározás: Immunlecsapás

Sejtek: CHO-K1 [kínaihörcsög-petefészek (Chinese Hamster Ovaiy); ATCC-eredetű] sejtvonalat stabilan transzfektálunk, hogy nagy mennyiségű β-ΑΡΡ-695-öt fejezzünk ki, és ez „CP-6-36” elnevezéssel szolgál inhibitorok szkrinelésére. Más emlős tenyésztett sejtvonalakat is használhatunk és használtunk már. Például az SKN-MC (ATCC eredetű) humánidegsejt-sejtvonal jó eredményeket ad azonos meghatározási körülmények között. A β-ΑΡΡ-695-tel végzett transzfekciő nem feltétele a βΑΦ-ίβπηβΙέβηβ^ csupán megnöveli a βΑ4 szignált. Kísérleti célra való előkészítés során a CP-6-36 sejteket kis sejtsűrűséggel 10 cm-es (Petri)-csészékbe oltjuk és 2-4 napon át tenyésztjük egybefüggő monolayerré (~1,5 χ 10~⁷ sejt/csésze) 37 °C (5% CO₂ inkubátorban; a tápoldat összetétele DMEM 21/Coon’s F12 (1:1)+10% FBS fetális borjúsavó)+50 U/ml penicillin+50 pg/ml sztreptomicin.

Kezelés: Minden vegyületet kezdeti lépésként CP6-36 sejteken szűrünk 200 μΜ dózisban. A vizsgálatot megelőzően mindegyik vizsgálandó vegyületből 20 mM törzsoldatot készítünk oldószerként sejtkultúratisztaságú DMSO-t használva. Mindegyik 20 mM törzsoldatot ezután 100-szorosára hígítjuk olyan szérummentes EMEM-médiumban, amely nem tartalmaz tisztein és metionin aminosavakat („Cys-/Met-EMEM”), így a tápoldatban (médiumban) a vegyület végső koncentrációja 200 μΜ lesz. A kísérlet kezdetén a sejteket „kiéheztetjük” ciszteinre és metioninra úgy, hogy a sejtmonolayereket 3-szor mossuk 3 ml/Petri-csésze Cys-/MetEMEM-mel, majd inkubáljuk (37 °C/5% CO₂) csészékként 3 ml azonos médiummal 15 percen át. Ezt a médiumot leszívatjuk a csészékről, majd az egyes vegyületeket 200 μΜ koncentrációban tartalmazó tápoldatokat adunk a tenyészethez csészékként 3 ml mennyiségben. Ezeket a lemezeket (Petri-csészéket) és egy „kontroll”csészét (3 ml/csésze Cys-/Met-EMEM, amely 1% DMSO-t tartalmaz, de vegyületet nem tartalmaz), a fentiek szerint 15 percig inkubáljuk. Ezt a tápoldatot (médiumot) leszívatjuk, majd mindegyik csészéhez további, az előző lépésben használt médiumot adunk, amely ezúttal ~150 pCi/ml ³⁵S-transz jelzőt (³⁵S-jelzett ciszteint és metionint) tartalmaz. A sejteket a fentiek szerint 4 órán át inkubáljuk.

A tenyészet összegyűjtése: A 4 órás jelzési periódus végén a sejteket megfigyeljük mikroszkóp alatt általános megjelenésük szempontjából, valamint a vegyületek összes (gross) toxikus hatásának ellenőrzése céljából, ami után a sejteket tartalmazó csészéket jégre helyezzük. A kondicionált közeget mindegyik csészéből 15 ml-es, kónuszos, csavarmentes kupakú csövekbe visszük át, 10 percen át centrifugáljuk 2000 rpm-en, és egy sorozat hasonló csőbe visszük át, így minden pelletált sejt visszamarad. A jelzett sejtmonolayereket ezután háromszor mossuk 2 ml/csésze foszfátpufferes sóoldattal (PBS), majd 1 ml olyan puffért adunk mindegyik csészéhez, amely elősegíti a sejtek roncsolását (lízisét) (5% Triton X-114; 20 mM trisz, pH=7,5; 300 mM NaCl; proteázinhibitorok), és ezt követően percig jégen inkubáljuk ezeket a mintákat. A sejtlizátumokat lekaparjuk a csészékről, és 1,5 ml-es mikrofügacsövekbe visszük át. A lizátumokat ezután 4 percig nagyfrekvenciás hanggal kezeljük jégen, nagy sebességgel centrifugáljuk 10 percen át egy mikrocentrifugában (mikrofügában) majd 15 ml-es kónuszos, csavaros fedelű csövekbe visszük át, így visszamarad a sejtmaradványok pelletje.

Immunlecsapás: Az immunlecsapásra való előkészítés során az előbbiek szerint összegyűjtött lizátumokat 5 ml 1 xRIPA-pufferban (10 mM trisz, pH=80; 150 mM NaCl; 0,125% NaN₃; 1% Triton X-100; 1% dezoxikolát; 0,1 SDS) oldjuk; a kondicionált médium (tápoldat)-mintákkal hígítás nélkül végzünk immunlecsapást. Mind a kondicionált médiumokat, mind a lizátumokat először előderitjük úgy, hogy minden mintához 5 μΐ normál nyúlszérumot adunk, a mintákat szobahőmérsékleten rázzuk (himbáljuk), majd RIPA-pufferral készült, 100 μΐ 10%-ós protein A-Sepharose (PÁS) oldatot adunk hozzájuk, és szobahőmérsékleten 1,5 órán át rázzuk (himbáljuk) azokat. A mintákat ezután 3000 rpm-en centrifugáljuk, és a felülúszókat új 15 ml-es csövekbe visszük át. Az előderített lizátumokkal ezután immunlecsapást végzünk úgy, hogy mindegyik csőhöz 30 μΐ olyan antitestet adunk, amely felismeri a β-ΑΡΡ kaiboxiterminusát, a mintákat szobahőmérsékleten 10 percig rázzuk, ezután hozzáadunk 100 μΐ 10%-os PAS-t és szobahőmérsékleten 1,5 órán át rázzuk a mintákat. Az előderített médiummintákkal azonos módon végzünk immunlecsapást, azonban a karboxiterminusra irányuló antitest helyett 45 μΐ olyan antitestet használunk, amely a βΑ4-βί ismeri fel. Ezután minden mintát 1 percig centrifugálunk 3000 rpm-en, így pelletáljuk a PAS-antitest-komplexeket, és a kapott pelletet alaposan mossuk; négyszer nagy sótartalmú pufferral (50 mmol/1 trisz, pH=7,5; 500 mmol/1 NaCl; 5 mM EDTA; 0,5% Nonidet P-40), majd kétszer 10 mmol/l-es trisz pufferral (pH=7,5).

Gélelektroforézis: A kimosott pelleteket 5 percen át forraljuk 50 μΐ 2xLaemmli géltöltő (gél loading) pufféiban. Ezeket a mintákat, valamint a molekulatömegmarkereket rátöltjük egy 16,5%-os SDS-poliakrilamid gélre trisz/Tricine rezervoár pufferokkal. Elektroforézist végzünk 90V-on -18-20 órán át, 20% metanol/20% ecetsav elegyben rögzítjük, majd szűrőpapíron szárítjuk a mintákat 65 °C-on, 2 órán át. Autoradiográfiával tesszük láthatóvá az eredményt.

Analízis: Az eredményeket az autoradiogram analízisével kapjuk meg. Pozitív hatóanyag egy olyan vegyület, amely gátolja a 4 kDa βΑ4 fehérjesávot a kontrolimintához viszonyítva, ezen felül némelyik növelheti a 9-12 kDa C-terminális fehéijesávok szintjét a kontrolimintához viszonyítva. A pA4-gátlást vagy a C-terminális sávok növelését a sávok denzitometriás értékelésével határozhatjuk meg mennyiségileg úgy, hogy a mérést kontrollsávokra vonatkoztatva normalizáljuk. Negatív hatóanyag az olyan vegyület, amely nem okoz változást a 4kDa βΑ4 vagy 9-12 kDa C-terminális fehéijesávok hozamában a kontrollminta sávjához viszonyítva.

HU 221 629 Bl

További vizsgálat: Ha megállapítottuk, hogy egy vegyület aktív (vagyis a gélanalízissel kimutattuk a 4 kDa βΑ4 lényeges gátlását az azt kísérő C-terminális fragmensnövekedéssel), akkor dózis-válasz kísérletet végzünk, hogy meghatározzuk azt a legkisebb dózist, ami a fenti hatás megnyilvánulásához szükséges. Tipikusan 12,5-300 mol/1 dózistartományt vizsgálunk, és e dózisváltoztatástól eltekintve a kísérletet ugyanúgy folytatjuk le, amint azt az előbbiekben ismertettük. Ha egy vegyületnél csak gyenge hatást tapasztaltunk vagy egyáltalán nem találtunk hatást, a kísérletet nagyobb dózisokkal, tipikusan 400 pmol/l dózissal megismételjük. Ha egy vegyületet toxikusnak találtunk (vagyis a sejtek nem látszanak egészségesnek mikroszkópos megfigyeléssel, vagy úgy találjuk, hogy a lizátumok nem jelződtek jól a gélanalízis után), a vegyületet kisebb dózisokkal, például 25, 50 és 100 pmol/l dózisokkal újra teszteljük, hogy megállapítsuk a vegyület hatását nem toxikus dózisok esetén.

2. meghatározás: Radioimmunoassay

Médiumok készítése és Sepak-koncentrálása RIA céljára:

Tenyésztett emlőssejtek, úgymint kínaihörcsögpetefészek- (CHO) sejtek vagy humán neuron SK-N-MC sejtek β-amiloidot termelnek, és ezt a peptidet a tápközegbe választják ki. Ha a sejteket a β-amiloid-képződés potenciális inhibitoraival kezeljük, a kezelt sejtek tápközegében nem mutathatunk ki oldható β-amiloidot. Úgy mint az 1. meghatározásnál, az inhibitorvegyületek változó dózisait tesztelhetjük, 200 μΜ dózissal kezdve. A CHO-sejtek esetén mind a vad típusúak, mind a βΑΡΡ-695-tel transzfektáltak esetén 10 cm-es lemezeket inkubálunk 2 ml szérummentes EMEM-ben 4-6 órán át, 37 °C-on a vizsgálandó inhibitor vegyület jelenlétében vagy távollétében. A tápoldatot eltávolítjuk és 10 percen át centrifugáljuk 1500 rpm-en (Sorvall RT 6000 B), hogy eltávolítsunk minden sejtet/sejtmaradványt. A tápoldatot vagy azonnal felhasználjuk vagy -20 °C-on tároljuk.

A Sepak C18 lépést azért végezzük el, hogy eltóvolítsuk a sókat és más nemkívánatos szennyezőket, továbbá töményítsük a β-amiloid peptideket. 2 ml tópoldatmintát bocsátunk át egy Cl 8 Sepak tölteten, és a töltetet (cartridge) 2 ml 5%-os CH₃CN-ben (0,1%-os TFA-ban) mossuk. Az átbocsátott anyagot és az 5%-os CH₃CN mosófolyadékot eldobjuk. A töltetet 2 ml 25%os CH₃CN-nel (0,1 %-os TFA-ban), majd 2 ml 50%-os CH₃CN-nel (0,1%-os TFA-ban) eluáljuk. Mindkét eluátumot összegyűjtjük és gyorsbepárlóban (speedvac) szárítjuk, majd 125 μ1-250 μΐ 10% izopropanolt tartalmazó vízzel felvesszük RIA-meghatározás céljára. A 25%-os CH₃CN frakció tartalmazza a tápoldatból származó fenolvörös legnagyobb részét, de nem tartalmaz β-anúloid peptidet. Az 50%-os CH₃CN-nel kapott frakció tartalmazza a β-amiloid peptideket.

^I25I-jelzett β-amiloid 1-40 előállítása és HPLC tisztítása:

pg szintetikus β-amiloid 1-40-et jelzünk 1 mCi ¹²⁵I-dal klóramin T módszerrel. A reakciót szobahőmérsékleten végezzük. Eppendorf-csőben 10 pl ¹²⁵I-ot (1 mCi NaOH-oldatban) adunk 10 pl β-amiloid 1-40hez (1 ml/ml 20%-os izopropanolban) és 80 pl Na-foszfátot pH=7,4 értéken, és a komponenseket összekeverjük. A reakciót 30 pl klóramin T (1 mg/ml, 0,1 mol/1 foszfátban, pH=7,4) hozzáadásával indítjuk meg, az elegyet összekeverjük, és 1 percig inkubáljuk. A reakciót 50 pl Na-metabiszulfit (2 mg/ml, 0,1 mol/1 foszfát, pH=7,4) adagolásával állítjuk le.

A reakcióelegyet (280 μΐ) azonos térfogatú vízzel felhígítjuk, és Sepak C18 tölteten engedjük át, hogy elválasszuk a jelzett peptidet. A Sepak töltetet kétszer mossuk 5%-os CH₃CN-nel (1-1 ml), majd háromszor eluáljuk 50%-os CH₃CN-nel (1-1 ml), és újból kétszer mossuk 95%-os CH₃CN-ben (1-1 ml). Majdnem az összes jelzett peptid eluálódik az első 50%-os CH₃CNnel végzett elúció során. Ezt az eluátumot -70 °C-on toroljuk, és HPLC-vel tisztítjuk a RIA-meghatározás követelményeinek megfelelően.

A jelzett peptidet fordított bázisú HPLC-vel tisztítjuk C8 oszlopon (cartridge-on) (4,6 mmx 3 cm, Brownlee). Az oszlopot 0,1%-os TFA-ban lévő 5%-45% CH₃CN lineáris gradienselúcióval működtetjük 30 percig 0,5 ml/min áramlási sebességgel. 0,5 ml-es frakciókat gyűjtünk és számláljuk azokat. A jelzett peptidet tartalmazó csúcsfrakciót -20 °C-on tároljuk, és 3 napon belül felhasználjuk RIA-meghatározásra.

Radioimmunoassay: A RIA-mérésekben a következő pufferokat használjuk: 1. RIA-puffer, összetétele 0,lM Na-foszfát, pH=7,4, amely 0,1% BSA-t és 0,1% Triton-X-100-at tartalmaz; 2. mintapuffer: 10% izopropanol vízben; 3. tracer puffer: 0,2M Na-foszfát, pH=7,4, amely 0,1% BSA-t és 0,1% Triton-X-100-at tartalmaz. A β-amiloid-specifíkus antitesteket hígításokban használjuk, ahol a jelzett peptidnek körülbelül 30%-a van megkötve a versengő ligandum távollétében. Az antitesthígításokat RIA-pufferral készítjük. A RIA-ban felhasznált antitestek három különböző szérumot foglalnak magukban, amelyeket humán βamiloid 1-40 szintetikus peptiddel szemben termeltünk (BA#1, BA#2 és 6514). A BA#l-et 1/900, a BA#2-t 1/1600 és a 6514-et 1/2500 hígításban használjuk. A HPLC-vel tisztított jelzett peptidet tracer puffetban oldjuk úgy, hogy 50 μΐ-nek 7000 és 9000 cpm közötti legyen az aktivitása. Teljes kiszorítást végzünk nagy koncentrációjú (2,5 μτηοΐ/ΐ) β-amiloid 1-40 jelenlétében. A β-amiloid 1-40 standardokat mintapufferral készítjük. A meghatározási térfogat 200 μΐ. A komponenseket a következő sorrendben adagoljuk:

100 μΐ Ab (antitest) RIA-pufferban 50 μΐ ismeretlen minta vagy standard, vagy TD mintapufferban μΐ jelzett peptid (7000-9000 cpm tracer pufferban).

A mintákat összekeveijük és egy éjjelen át 4 °C-on inkubáljuk. A kötött aktivitásnak (count) a szabad aktivitástól való elválasztása céljából a meghatározást polietilénglikollal (PEG) állítjuk le. Mindegyik mérőcsőhöz 50 μΐ normál nyúlszérumot adunk, majd 800 μΐ PEG-et (M_w 6000-8000, 15,8% RIA pufferban). A mintákat 10 percig inkubáljuk 4°-on, majd 3200 rpm-en 20 percen

HU 221 629 Bl át inkubáljuk (Sorvall, RT600 B). A felülúszót leszívatjuk, és a pellet aktivitását gamma-számlálóval méljük.

Értékelés: Az antitestmegkötésből származó eredményeket a jelzett β-amiloid tracer kiszorítása alapján értelmezzük. Pozitív az az eredmény, amely esetén nem figyelhető meg a tracer kiszorítása, vagyis a médium nem tartalmaz kiválasztott (szekretált) β-amiloidot, ami azt jelzi, hogy a vizsgált vegyület hatékonyan gátolja a β-amiloid-termelést. Negatív az az eredmény, amelyben megfigyelhető a tracer kiszorítása antitestkötés miatt, és ekvivalens a kezeletlen kontrollsejtekkel.

Enzimimmunoassay-t (ELISA, enzimhez kötött immunoszendvics assay) ugyancsak alkalmazhatunk az aktív vegyületek azonosítására. β-Amiloid fehérjét termelő emlőssejteket (úgymint CHO CP-6 vagy SK.-NMC sejteket) tenyésztünk, majd az 1. meghatárosban leírt vegyületekkel kezelünk azzal a különbséggel, hogy a sejtfehérje radioaktív jelzését elhagyjuk. A kezelt sejtkultúrákból kondicionált médiumot gyűjtünk, és kis fordulatszámon végzett centrifügálással megtisztítjuk a sejtmaradványoktól. A kondicionált médiumot ezután 96 mérőhelyes ELISA mérőlapon vizsgáljuk βamiloid-specifíkus antitestek alkalmazásával. Egy βamiloid antitest befogóreagensként szolgál a médiummintában jelen lévő β-amiloid számára, egy második β-amiloid-specifikus antitest, amely egy eltérő epitópot ismer fel a β-amiloid fehéijék, a detektorkomplex egy komponenseként szolgál. A második β-amiloid antitestet biotinnal konjugáljuk, amit streptavidinnal lehet kimutatni. Egy harmadik antitestet - ami torma-peroxidázhoz van kapcsolva - használunk fel a β-amiloid: antitest :streptavidin komplex kimutatására. Orto-feniléndiamin-szubsztrát, valamint H₂O₂ és citrát-foszfát pH=5,0 hozzáadásával biztosítjuk a peroxidázaktivitást, amit mennyiségileg úgy határozunk meg, hogy méijük az elegy kolorimetriás változását OD 490 nm értéken. Tipikus esetben minden tápközeg (médium)mintából háromszoros hígitási sorozatot készítünk a 96 mérőhelyes lemezen, valamint egy standard, szintetikus β-amiloid 1-40 fehéijéét. Pozitív eredményt akkor kapunk, ha csekély reaktivitást figyelünk meg vagy nem tapasztalunk reaktivitást (vagyis abszorbanciát OD 490 nm-nél), tehát nincs jelen β-amiloid fehéije a tápközegmintában, a vizsgált vegyület gátló hatása következtében. Részlegesen aktív inhibitorok mutatnak némi abszorbanciát OD 490 nm-nél, de ez nem ekvivalens a kezeletlen sejtekből nyert kontroll médiummintákéval. Pontos mennyiségi meghatározást végezhetünk, ha a mintákkal nyert adatokat a standardéval összehasonlítjuk.

In vivő vizsgálatok

A találmány szerinti vegyületek azon aktivitását, hogy megelőzik vagy csökkentik a β-amiloid plakkok felhalmozódását, kimutathatjuk, a β-amiloid plakk akkumuláció transzgenikus modelljeiben (például transzgenikus egérben vagy transzgenikus patkányban), valamint kutyamodellben, amelyben természetes, a βamiloid plakk-képződésre genetikailag hajlamos kutyákat használunk fel. Olyan transzgenikus egereket, amelyek felülmúlják a humán β-ΑΡΡ (751) vagy β-ΑΡΡ (770) kifejezését a neuronsejtekben, és az Alzheimerkórral összefüggő hisztopatológiát mutatnak, például a PCT/US91/04447 számú szabadalmi bejelentés ismertet. Ilyen állatmodellekben a β-amiloid plakk-képződéssel együtt járó bisztopatológia és/vagy szimptómák, úgymint az emlékezetvesztés csökkenése használható fel annak bemutatására, hogy a vegyületek képesek kezelni az olyan terápiás állapotokat, amelyek a βamiloid plakkok képződéséből származnak, úgymint az Alzheimer-kórt és a Down-szindrómával együtt járó emlékezetgyengülést.

Minthogy a hisztopatológia a transzgenikus egérben gyakoribb az állat idősebb korában, két hónapos egereket kívánatos felhasználnunk. A két hónapos állatokban minimális a patológiás elváltozás, amely az idővel növekedik az inhibitorszer távollétében. Az egerek egy csoportja (n= 12) csak vehikulumot kap; egy második csoport (n=12) kis dózisú szert, egy harmadik csoport (n=12) mérsékelt dózist; és a negyedik csoport (n=12) nagy dózist. A dózist az előbbi meghatározások alapján határoztuk meg a testtömeg, a vegyület felezési ideje, stb. figyelembevételével. Ideális esetben az egereket több hónapon át kezeljük. A vegyületeket beadhatjuk injekcióban, orális úton, nyújtott hatású implantátumban, stb. amint azt a vegyületprofil megszabja. A kezelés értékelését immunhisztokémiai eljárások alkalmazásával végezzük: β-amiloid immunreaktív depozitumok gyakoriságát határozzuk meg az agy 4 coronalis középső (midline) szekciójában úgy, hogy a bemetszéseket olyan személy teszi meg, aki nem ismeri a kísérleti kezelést. A patológiás elváltozás egy másik megnyilvánulását, az Alz50 immunreaktivitást, ugyancsak meghatározzuk az előfordulás gyakoriságára nézve, azonos számú agyszövetdarabot használva fel minden egérből. A gyógyszerhatás pozitív eredménye, ha e két patológiás marker egyáltalán nem vagy kisebb gyakorisággal fordul elő. Pszichológiai és/vagy viselkedési megfelelés, ami egyedülálló a β-amiloid transzgenikus egérre nézve, szintén felhasználható a gyógyszerbatás kimutatására.

A szakirodalomban beszámoltak arról, hogy bizonyos kutyafajtáknál ugyancsak előfordultak β-amiloidfelhalmozódások [Giaccone et al., Neuroscience Letters, 114, 178-183 (1990)], továbbá idős, nem humán főemlősöknél szintén kimutattak β-amiloid patológiás jelenséget, valamint az emlékezet romlását [Cork et al., American Journal of Pathology, 137, 1383-1392 (1990); Podlisny et al., American Journal of Pathology, 138, 1423-1425 (1991)]. A kutyákkal és a nem humán főemlősökkel végzett vizsgálatok némileg eltérő kísérleti tervezés szerint folytak le úgy, hogy a gyógyszert hosszabb időn át adagolták.

Valamely (IB) általános képletű vegyület vagy egynél több (IB) általános képletű vegyület elegyének bármely hatékony mennyiségét beadhatjuk a páciensnek abból a célból, hogy megelőzzük β-amiloid plakkok abnormis lerakódását, és olyan betegséget vagy állapotot kezeljünk, amely velejárója a β-amiloid plakk abnormis lerakódásának, mint amilyen az Alzheimer-típusú

HU 221 629 Bl senilis dementia vagy a Down-szindróma. A β-amiloid plakk abnormis lerakódásának megelőzésére, és az Alzheimer-típusú senilis dementia vagy a Downszindróma kezelésére alkalmas specifikus dózisok olyan faktoroktól függenek, mint a páciens tömege, típusa és kora, valamint a betegség vagy állapot súlyossága, mindezen faktorok szokásosan ismertek a beteget kezelő orvos számára, aki figyelembe veszi azokat. A vegyületeket általában 0,2-20 mg/testtömeg-kg, előnyösen 0,5-5 mg/testtömeg-kg dózisban adjuk be. A vegyületeket beadhatjuk egyszeri vagy többszörös dózisegységekben, amelyek 25 mg-250 mg (I) általános képletű vegyületet tartalmaznak.

Orális adagolás céljára a vegyületeket szilárd vagy folyékony készítményekké formulálhatjuk, igy kapszulákká, pilulákká, tablettákká, pasztillákká, porokká, oldatokká, szuszpenziókká vagy emulziókká. A szilárd egységdózis lehet kapszula, amely szokásos zselatin típusú leheL és amely tartalmaz például lubrikánsokat és inért töltőanyagokat, úgymint laktózt, szacharózt vagy kukoricakeményítőt. Egy másik kivitelben az (I) általános képletű vegyületeket szokásos tabletta-alapanyagokkal, úgymint laktózzal, szacharózzal és kukoricakeményítőval, kötőanyagokkal, úgymint akácmézgával, kukoricakeményítővel vagy zselatinnal, szétesést elősegítő szerekkel, úgymint burgonyakeményítővel vagy alginsawal, továbbá lubrikánsokkal, úgymint sztearinsawal vagy magnézium-sztearáttal együtt tablettázhatjuk.

Parenterális adagolási módban a vegyületeket beadhatjuk oldataik vagy szuszpenzióik injektálható dózisaiként, amikor is a vegyületeket fiziológiailag elfogadható hígítószerben oldjuk vagy szuszpendáljuk gyógyszerészeti vivőanyaggal együtt, amely lehet steril folyadék, úgymint a víz, alkoholok, olajok és más elfogadható szerves oldószerek, felületaktív anyagok, más gyógyszerészetileg elfogadható adjuvánsokkal vagy azok nélkül. A találmány szerinti készítményekben felhasználható olajokra példák az ásványi, állati, növényi vagy szintetikus eredetű olajok, például a földimogyoró-olaj, szójaolaj, és ásványi olaj. Előnyös folyékony hordozóanyagok, különösen injektálható oldatok céljaira, általában a víz, sóoldat, vizes szacharóz és hasonló cukoroldatok, az etanol és glikolok, úgymint a propilénglikol vagy polietilénglikol vagy a 2-pirrolidon.

A vegyületeket beadhatjuk depó injekció vagy olyan cerebrális implantátum formájában, amely úgy van formuláivá, hogy lehetővé teszi a hatóanyag elnyújtott felszabadulását A hatóanyagot pelletekké vagy kicsiny hengerekké préselhetjük, és beültethetjük szubkután, intramuszkulárisan, intracerebrálisan depó injekciók vagy implantátumok formájában. Az implantátumokhoz inért anyagot, úgymint biológiailag lebontható polimereket vagy szintetikus szilikonokat, például Silastic®-t, a Dow Corning Corp. által gyártott szilikongumit alkalmazhatunk.

A találmány szerinti vegyületeket beadhatjuk topikálisan is. Ezt úgy végezhetjük, hogy egyszerűen oldatot készítünk a beadandó vegyületbŐl, előnyösen olyan oldószerrel, amelyről ismert, hogy elősegíti a transzdermális abszorpciót, úgymint etanollal vagy dimetil-szulfoxiddal (DMSO) excipienssel vagy anélkül. Topikális adagolást előnyösen tapasszal végzünk, amely lehet akár rezervoár és porózus membrán típusú, akár szilárd mátrixváltozat.

Alkalmas transzdermális eszközöket ismertetnek a 3 742 951, a 3 797 494, a 3 996 934 és a 4 031 894 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírások. Ezek az eszközök általában tartalmaznak egy tartó (támasztó)-elemet, amely az eszköz valamelyik felszínét képezi, egy hatóanyagot átengedő adheziv réteget, amely a másik felszínt képezi, továbbá legalább egy rezervoárt (tárolóelemet), amely a hatóanyagot tartalmazza a két felszíni felület között. Alternatív módon a hatóanyagot számos mikrokapszula is tartalmazhatja, amely a permeábilis adheziv rétegen szét van oszlatva. A hatóanyag mindkét esetben folyamatosan szállítódik a rezervoárból vagy a mikrokapszulákból egy membránon át a hatóanyagot átengedő tapadórétegbe, amely a befogadó szervezet bőrével vagy nyálkahártyájával kontaktusban van. Ha a hatóanyag a bőrön keresztül abszorbeálódik, a hatóanyag szabályozott és előre meghatározott áramát adagoljuk a szervezetbe. Mikrokapszulák esetén a kapszulázószer membránként is funkcionálhat.

Egy másik eszközben, amely szintén transzdermális adagolásra szolgál a találmány értelmében, a gyógyszerhatóanyagot egy mátrix tartalmazza, amelyből a kivánt mennyiség fokozatos, állandó és szabályozott sebességgel szállítódik. A mátrix diffúzió vagy mikropórusos áramlás révén permeábilis a vegyület felszabadulásával szemben. A felszabadulás sebességmeghatározó. Egy ilyen rendszert, amely nem igényel membránt, a 3 291 636 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás ismertet Ezekben a rendszerekben legalább két típusú felszabadulás lehetséges. A felszabadulás akkor megy végbe diffúzió révén, ha a mátrix nem porózus. A gyógyszerészetileg hatékony vegyület feloldódik magában a mátrixban és azon keresztül diffundál. Mikropórusos áramlás útján akkor megy végbe a felszabadulás, ha a gyógyszerhatóanyag egy folyékony fázis révén szállítódik a mátrix pórusaiba.

Amint az számos olyan vegyületcsoportra igaz, amelyek általában alkalmasak bármely adott farmakológiai hatás elérésére és terápiás végfelhasználásuk van, az osztályok bizonyos alcsoportjai és bizonyos specifikus tagjai előnyösek átfogó terápiás indexük és biokémiai, valamint farmakológiai profiljuk folytán.

Előnyösek azok a vegyületek, amelyeknél az 1-6 szénatomos alkilcsoport jelentése előnyösen 1-3 szénatomos alkiléncsoport és előnyösebben metilén- vagy etiléncsoport, a legelőnyösebben elágazó láncú etiléncsoport és a KP₂ molekularész előnyösen valint vagy alantot tartalmaz.

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. A K^a-P₂ ^a-NH-CH(R^a)-C(=O)-X^a (IB) általános képletű vegyületek, azok hidrátjai, sztereoizomeijei és gyógyszerészetileg elfogadható sói, ahol az (IB) általános képletben:

ha X^a jelentése hidrogénatom, akkor R^a jelentése CH₂Si(l-6 szénatomos alkil)₂-(2-6 szénatomos alkenil)-csoport, CH₂Si(l-6 szénatomos alkil)₂-fenil-cso15

HU 221 629 Β1 port vagy NHC(=O)-fenil-csoporttal szubsztituált benzilcsoport; vagy ha X^a jelentése CF₂C(=O)-fenetil-csoport, akkor R^ajelentése 1-7 szénatomos alkilcsoport, de terc-butil-metil-csoporttól eltérő; vagy 5 ha X^a jelentése CF₂C(=O)NHCH₂Si(l-6 szénatomos alkil)₃-csoport, akkor R^a jelentése benzilcsoport,

P₂ ^a jelentése Leu, Alá, Ile, Val, Nva, Nle vagy tercleucin aminosavmaradék;

K^a jelentése benzil-oxi-karbonil-csoport. 10
2. Az 1. igénypont szerinti olyan (IB) általános képletű vegyületek, azok hidrátjai, sztereoizomeijei vagy gyógyszerészetileg elfogadható sói, melyekben X^a jelentése CF₂C(=O)NHCH₂Si(l-6 szénatomos alkil)₃csoport, a többi szubsztituens jelentése az 1. igénypont- 15 bán megadott.
3. A 2. igénypont szerinti olyan (IB) általános képletű vegyületek, azok hidrátjai, sztereoizomeijei és gyógyszerészetileg elfogadható sói, melyekben X^a jelentése CF₂C(=O)NHCH₂Si(CH₃)₃-csoport, a többi szubszti- 20 tuens jelentése az 1. igénypontban megadott.
4. Az 1. igénypont szerinti (IB) általános képletnek megfelelő 4-[N-(benzil-oxi-karbonil)-L-(terc-leucil)]amino-2,2-difluor-3-oxo-5-fenil-N-(trimetil-szilil-metil)-pentánamid. 25
5. Az 1. igénypont szerinti (IB) általános képletnek megfelelő 2-[(benzil-oxi-karbonil)-L-valil]-amino-4,4difluor-l-fenil-7-metil-3,5-dioxo-oktán.
6. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti vegyület gyógyszerként való alkalmazásra. 30
7. Gyógyszerkészítmény, amely hatóanyagként az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti vegyületet, valamint egy gyógyszerészetileg elfogadható hordozóanyagot, és kívánt esetben adalék anyagokat tartalmaz.
9. Eljárás az (IB) általános képletű vegyületek, hidrátjaik, sztereoizomeijeik és gyógyszerészetileg elfogadható sóik előállítására, ahol az (IB) általános képletben ha X^a jelentése hidrogénatom, akkor R^a jelentése CH₂Si(l-6 szénatomos alkil)₂-(2-6 szénatomos alkenil)-csoport, CH₂Si(l-6 szénatomos alkil)₂-fenil-csoport vagy NHC(=O)-fenil-csoporttal szubsztituált benzilcsoport, vagy ha X^a jelentése CF₂(=O)-fenetil-csoport, akkor R^ajelentése 1-7 szénatomos alkilcsoport, vagy ha X^a jelentése CF₂C(=O)NHCH₂Si(l-6 szénatomos alkil)₃-csoport, akkor R^a jelentése benzilcsoport,

P₂ ^a jelentése Leu, Alá, Ile, Val, Nva, Nle vagy tercleucin aminosavmaradék,

K^a jelentése benzil-oxi-karbonil-csoport, azzal jellemezve, hogy valamely K^a-P2^a általános képletű csoportot, melyben K^a, P2^a jelentése a tárgyi körben megadott, valamely N₂H-CH(R^a)-C(=O)X^a általános képletű vegyülettel, amelyben R^a, X^a jelentése a tárgyi körben megadott, kapcsolunk, és kívánt esetben a kapott (IB) képletű vegyületet gyógyszerészetileg elfogadható sóvá alakítjuk, vagy valamely K^a-P2^a általános képletű csoportot, amelyben K^a, P2^a jelentése a tárgyi körben megadott, valamely H₂N-CH(R^a)-CH(OH)X^a általános képletű vegyülettel, melyben R^a, X^a jelentése a tárgyi kőiben megadott, kapcsolunk, majd az igy kapott vegyületet oxidáljuk, és kívánt esetben a kapott (IB) képletű vegyületet gyógyszerészetileg elfogadható sóvá alakítjuk.