HU221629B1 - Béta-amiloid fehérje képződést gátló peptidek, eljárás előállításukra és ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények - Google Patents

Béta-amiloid fehérje képződést gátló peptidek, eljárás előállításukra és ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények Download PDF

Info

Publication number
HU221629B1
HU221629B1 HU9600832A HU9600832A HU221629B1 HU 221629 B1 HU221629 B1 HU 221629B1 HU 9600832 A HU9600832 A HU 9600832A HU 9600832 A HU9600832 A HU 9600832A HU 221629 B1 HU221629 B1 HU 221629B1
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
formula
group
amino
amyloid
compound
Prior art date
Application number
HU9600832A
Other languages
English (en)
Other versions
HU9600832D0 (en
HUT74004A (en
Inventor
Michael R. Angelastro
Barbara Cordell
Viviane Dorsselaer
Jeffrey N. Higaki
Norton P. Peet
Daniel Schirlin
Original Assignee
Merrell Pharmaceuticals Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Merrell Pharmaceuticals Inc. filed Critical Merrell Pharmaceuticals Inc.
Publication of HU9600832D0 publication Critical patent/HU9600832D0/hu
Publication of HUT74004A publication Critical patent/HUT74004A/hu
Publication of HU221629B1 publication Critical patent/HU221629B1/hu

Links

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07DHETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D295/00Heterocyclic compounds containing polymethylene-imine rings with at least five ring members, 3-azabicyclo [3.2.2] nonane, piperazine, morpholine or thiomorpholine rings, having only hydrogen atoms directly attached to the ring carbon atoms
    • C07D295/16Heterocyclic compounds containing polymethylene-imine rings with at least five ring members, 3-azabicyclo [3.2.2] nonane, piperazine, morpholine or thiomorpholine rings, having only hydrogen atoms directly attached to the ring carbon atoms acylated on ring nitrogen atoms
    • C07D295/20Heterocyclic compounds containing polymethylene-imine rings with at least five ring members, 3-azabicyclo [3.2.2] nonane, piperazine, morpholine or thiomorpholine rings, having only hydrogen atoms directly attached to the ring carbon atoms acylated on ring nitrogen atoms by radicals derived from carbonic acid, or sulfur or nitrogen analogues thereof
    • C07D295/215Radicals derived from nitrogen analogues of carbonic acid
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07CACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C237/00Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by amino groups
    • C07C237/02Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by amino groups having the carbon atoms of the carboxamide groups bound to acyclic carbon atoms of the carbon skeleton
    • C07C237/22Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by amino groups having the carbon atoms of the carboxamide groups bound to acyclic carbon atoms of the carbon skeleton having nitrogen atoms of amino groups bound to the carbon skeleton of the acid part, further acylated
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07CACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C271/00Derivatives of carbamic acids, i.e. compounds containing any of the groups, the nitrogen atom not being part of nitro or nitroso groups
    • C07C271/06Esters of carbamic acids
    • C07C271/08Esters of carbamic acids having oxygen atoms of carbamate groups bound to acyclic carbon atoms
    • C07C271/10Esters of carbamic acids having oxygen atoms of carbamate groups bound to acyclic carbon atoms with the nitrogen atoms of the carbamate groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms
    • C07C271/22Esters of carbamic acids having oxygen atoms of carbamate groups bound to acyclic carbon atoms with the nitrogen atoms of the carbamate groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms to carbon atoms of hydrocarbon radicals substituted by carboxyl groups
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07CACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C279/00Derivatives of guanidine, i.e. compounds containing the group, the singly-bound nitrogen atoms not being part of nitro or nitroso groups
    • C07C279/18Derivatives of guanidine, i.e. compounds containing the group, the singly-bound nitrogen atoms not being part of nitro or nitroso groups having nitrogen atoms of guanidine groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07FACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F5/00Compounds containing elements of Groups 3 or 13 of the Periodic Table
    • C07F5/02Boron compounds
    • C07F5/025Boronic and borinic acid compounds
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07FACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F7/00Compounds containing elements of Groups 4 or 14 of the Periodic Table
    • C07F7/02Silicon compounds
    • C07F7/08Compounds having one or more C—Si linkages
    • C07F7/0803Compounds with Si-C or Si-Si linkages
    • C07F7/081Compounds with Si-C or Si-Si linkages comprising at least one atom selected from the elements N, O, halogen, S, Se or Te
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07CACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C2601/00Systems containing only non-condensed rings
    • C07C2601/06Systems containing only non-condensed rings with a five-membered ring
    • C07C2601/08Systems containing only non-condensed rings with a five-membered ring the ring being saturated
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07CACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C2601/00Systems containing only non-condensed rings
    • C07C2601/12Systems containing only non-condensed rings with a six-membered ring
    • C07C2601/14The ring being saturated

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Nitrogen Condensed Heterocyclic Rings (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)

Abstract

A találmány olyan Ka–P2a–NH–CH(Ra)–C(?O)–Xa (IB) általános képletűvegyületekre, azok hidrátjaira, sztereoizo- merjeire és gyógyászatilagelfogadható sóira vonatkozik, ahol ha Xa jelentése hidrogénatom, akkorRa jelentése CH2Si(1–6 szénatomos alkil)2-(2–6 szénatomos alkenil)-csoport, CH2Si(1–6 szénatomos alkil)2-fenil-csoport vagy NHC(?O)-fenil-csoporttal szubsztituált benzilcsoport; vagy ha Xa jelentéseCF2C(?O)-fenetil-csoport, akkor Ra jelentése 1–7 szénatomosalkilcsoport, de terc-butil-metil-cso- porttól eltérő; vagy ha Xajelentése CF2C(?O)NHCH2Si(1–6 szénatomos alkil)3-csoport, akkor Rajelentése benzilcsoport, P2a jelentése Leu, Ala, Ile, Val, Nva, Nlevagy terc-leucin aminosavmaradék; Ka jelentése benzil-oxi-karbonil-csoport. A találmány tárgya még az (IB) képletű vegyületekelőállítására szolgáló eljárás, gyógyszerként történő alkalmazása ésezeket a vegyületeket tartalmazó gyógyszerkészítmények. A találmányszerinti vegyületek gátolják vagy megelőzik az amiloidfehérjelerakódásokat az agyban, ezáltal alkalmasak az Alzheimer-kór ésaz időskori Down-kór kezelésére. ŕ

Description

A találmány új (IB) általános képletű vegyületekre, ezek előállítási eljárására, valamint a vegyületeket hatóanyagként tartalmazó, az amiloid fehéije agybani lerakódásának gátlására vagy megelőzésére szolgáló gyógyszerkészítményekre vonatkozik. A találmány tárgya közelebbről az Alzheimer-kór kezelésére alkalmazható (IB) általános képletű peptidek.
Úgy becsülik, hogy az USA-ban a 65 éven felüli lakosság több mint 5%-át, a 85 éven felüli lakosság több mint 15%-át érinti az Alzheimer-kór. [Cross, A. J., Eur. J. Pharmacol., 82, 77-80 (1982); Terry, R. D. et al., Ann. Neurol., 14, 497-506 (1983)]. Feltételezik, hogy az idősek hosszú távú ápolásra történő elhelyezésének fő oka ebben a betegségben keresendő, és a szakszerű ellátást biztosító idősek otthonában elhaláloző embereknek körülbelül 65%-a szenved a betegségben.
Az Alzheimer-kórral együtt járó biokémiai és metabolikus jelenségekről ismerünk bizonyos tényeket Az Alzheimer-kóros agyban megfigyelt két morfológiai és hisztopatológiai elváltozás a neurofibrilláris csomósodások (elváltozások, neurofibrillary tangles, NFT) és az amiloid lerakódások. Intraneuronális neurofibrilláris elváltozások (csomósodások) jelen vannak más degeneratív betegségek esetén is, de úgy tűnik, hogy amiloid lerakódások jelenléte mind az intraneuronális terekben (neuritikus plakkok), mind az azokat körülvevő mikroérrendszerben (vaszkuláris plakkok), jellemző az Alzheimer-kórra. Úgy látszik, hogy ezek közül a neuritikus plakkok (neuritic plaques), vannak túlsúlyban [Price, D. L., et al., Drug Development Research, 5, 59-68 (1985)]. Plakkok találhatók azoknál a Down-kóros idős betegeknél is, akiknél fellép az Alzheimer-kór.
Alzheimer-kóros betegek plakkokban gazdag agyát használták fel forrásként egy körülbelül 4(2 kD „mag” („core”) polipeptid, az amiloid plakkmagfehéije [amyloid plaque core protein (APCP)] kivonására. Ezt a peptidet a β-proteinnek nevezték el a Glenner, G., et al., Biochem. Biophys. Commun., 120, 885-890 (1984) közlemény szerint. Meghatározták az aminoterminus aminosavszekvenciáját [Glenner, G., et al., Biochem Biophys. Rés. Commun., 122, 1131-1135 (1984); Masters, C. L., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 4245-4259 (1985)]. A két kutatócsoport azonos aminosavszekvenciát közölt azzal az eltéréssel, hogy Glenner és munkatársai az Alzheimer-kóros cerebrovaszkuláris amiloid 11. helyzetében glutamincsoportot ismertet, míg Master et al., glutaminsavról számol be a 11. helyzetben. Az előbbi szerzők tehát arról számolnak be, hogy a cerebrovaszkuláris amiloidnak homogén aminoterminusa van, míg az utóbbi szerzők heterogén aminoterminusokat ismertetnek. Mindkét kutatócsoport kimutatta, hogy ugyanaz a peptid található a Down-kóros felnőttek amiloid plakkmagjaiban és vaszkuláris amiloidjában, és leúják, hogy all. helyzetben glutaminsav található. Wong. C. W. és munkatársai [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 82, 8729-8732 (1985)] kimutatták, hogy egy szintetikus peptid, amely homológ volt a Masters (lásd fent) által leirt β-amiloid magfehéije első tíz aminosavjával, képes volt antitesteket termeim egerekben, és ezeket az antitesteket fel lehetett használni nemcsak az amiloiddal borított agyi véredények, hanem a neuritikus plakkok megfestésére is. Ezeket az eredményeket megerősítették Allsop, D. és munkatársai is a Neuroscience Letters, 68, 252-256 (1986) közleményükben, akik a 8-17 aminosavaknak megfelelő szintetikus peptiddel szembeni antitesteket használták. Ezek szerint az Alzheimer-kórban szenvedő betegek agyának különféle helyein talált plakkfehéije általában hasonlónak tűnik az immunreaktivitás tekintetében. Nagymértékben oldhatatlan, amit az mutat, hogy nem tudták oldhatóvá tenni sok közönségesen használt denaturálószerben, úgy mint detergensekben és kaotrop szerekben [Masters, lásd fent, Allsop, D., et al., lásd fent].
A betegséggel együtt járó amiloid depozitumoknak hat olyan ismert példája van, amelyben az amiloid prekurzorfehérjéből termelődik: primer amiloidózis esetén a prekurzor egy immunglobulin könnyű lánc; szekunder amiloidózis esetén a prekurzor amiloid A fehéije; amiloidózis esetén prealbumin vagy annak egy variánsa; a pajzsmirigy velőkarcinómája esetén egy prokalcitonin fragmens; és öröklődő agyvérzés esetén gamma-nyom (gamma-trace)-fragmens [lásd például Glenner, G., New England Journal of Medicine, 302, 1283 (1980); Sletton, K., et al., Biochem. J., 195, 561 (1981); Benditt, et al., FEBS Lett., 19, 169 (1971); Sletton K., et al., Eur. J. Biochem., 41, 117 (1974); Sletton, K„ J. Exp. Med., 143, 993 (1976)]. Az előbbiekben részleges felsorolást; adtunk, és számos további referencia van arra nézve, hogy prokalcitonin fragmens prekurzor a pajzsmirigykarcinóma amiloidja tekintetében.
Betegségekkel együtt járó amiloid lerakódások (depozitumok) más ismert példáinak analógiájára feltételezik, hogy az Alzheimer-kórral együtt járó β-amiloid magfehéije prekurzorfehérjéből keletkezik. Kang, J. és munkatársai [Natúré, 325, 733-736 (1987)] ismertetnek egy olyan fehéijét, amely egy nagyobb fehérjeszerkezeten belül tartalmazza a β-amiloid magfehérjeszekvenciát. Ennek a fehéijének a szekvenciáját egy olyan cDNS-klón szekvenciájából vezették le, amely kiónt humán fetális agyszővet cDNS-könyvtárából izoláltak, és amely 695 aminosavcsoportból áll, ahol a βamiloid magfehéije aminoterminusa az 597 helyzetben kezdődik. Egy második olyan prekurzorfehérjét, amely a β-amiloid-szekvenciát tartalmazza, Ponté és munkatársai [Natúré, 331, 525-527 (1988)] által izolált cDNS-klónból jósoltak meg. A Ponté és munkatársai által izolált cDNS-klón olyan prekurzorfehéijét kódolt, amely azzal azonos, amelyet Kang és munkatársai azonosítottak, azzal a különbséggel, hogy tartalmaz egy további 57 aminosavból álló szekvenciát, amely a β-amiloid magfehéije-szekvenciától felfelé van inszertálva. Az 57 aminosavból álló inszertált szekvencia tartalmaz egy funkcionális domént, amely erősen homológ egy sor olyan proteázinhibitorral, amelyeket Kunitz-tipusú szerin proteáz inhibitorokként ismerünk. Mások olyan további amiloid prekurzorfehéijét jellemeztek [lásd Kitaguchi, et al., Natúré, 331, 530-532 (1988)], amely 770 aminosavat tartalmaz. A Kitaguchi által azonosított prekurzor azzal a különbséggel egyezik meg a Ponté és munkatársai által izolált prekurzorral, hogy to2
HU 221 629 Bl vábbi 19 aminosavat tartalmaz az 57 aminosavból álló proteázinhibitor doménnal szomszédosán. Nem ismeretes, hogy ez a további 19 aminosav kölcsönöz-e bármilyen funkcionalitást a molekulának. A különféle amiloid prekurzorfehéijék, amelyeket a cDNS-klónokból 5 azonosítottak, alternatív message splicing eredményeként keletkeznek egy egyedülálló amiloid prekurzorgén transzkripciója során.
Kimutatták, hogy az amiloid prekurzorfehéijék a normális sejtmetabolizmus révén keletkeznek a β-ami- 10 lóid magfehéije termelése érdekében [Haas, et al., Natúré, 359, 322-325 (1992); Shoji, et al., Science, 258, 126-129 (1992); Seubert, et al., Natúré, 359, 325-327 (1992)]. Nincs tisztázva azonban, hogy az Alzheimerkórban szenvedő betegekben nagyobb mennyiségű β- 15 amiloid magfehéije termelődik-e, bár kimutatták, hogy a Down-szindrómás betegek, akiknél invariábilisan kifejlődik az Alzheimer-kór, kétszeres mennyiségű βamiloid prekurzorfehéijét fejeznek ki [Neve, et al., Neuron, 1, 669-677 (1988)]. Úgy vélik, hogy az amiloid 20 plakkok kifejlődése az Alzheimer-kóros agyban a βamiloid fehérje túltermelődésének és/vagy csökkent mértékű eltávozásának, vagy komplexszé alakulásának az eredménye. Ennélfogva, ha megteremthetjük annak eszközét, hogy beavatkozzunk a plakk-képzódés folya- 25 matába azáltal, hogy megelőzzük vagy gátoljuk az amiloid plakk magfehérje termelődésében prekurzor anyag keletkezését, egy ilyen eszköz eljárást képezhet az Alzheimer-kór progressziójának kezelésére vagy javítására. Mindeddig azonban a β-amiloid magfehérje terme- 30 lődéséhez szükséges amiloid prekurzorfehéije képződése nem volt kielégítő mértékben ismert ahhoz, hogy hatékony terápiás beavatkozást tegyen lehetővé abba a folyamatba, amely amiloid lerakódásokra vezet.
Számos közlemény ismertet olyan vélelmezett pro- 35 teinázokat, amelyeket felelősnek tekintenek a β-amiloid fehérje és/vagy az Alzheimer-kór patológiája előidézéséért. Ezek a vélelmezett proteinázok az enzimek osztályainak széles spektrumát ölelik fel, például a szerin, a cisztein és a metalloproteinázokat. Számos β- 40 amiloid-termelő proteinázt izoláltak és jellemeztek már. Néhány ismertetett jelölt a következő: multikatalitikus proteináz [FEBS 304, 57-60 (1992) és FEBS Lett. 257, 388-392 (1989)], hízósejtkináz [J. Bioi. Chem. 265, 3836-3843 (1990)], metalloendopeptidáz 45 24.15, Biochem. Biophys. Rés. Commun., 185, 746-752 (1992)], kalciumaktivált semleges proteinázok (calpain) [J. Neurosci., 10, 2400-2411 (1990)], kalciumaktivált szerin proteináz [Biochem., Biophys. Rés. Commun. 174, 790-796 (1991)], és prolil-endopep- 50 tidáz [FEBS Lett. 160, 131-134 (1990)]. Nem mutatták még ki ezen β-amiloid-termelő proteinázjelöltek mindegyikének a fiziológiai jelentőségét, például azt, hogy az enzimaktivitás gátlása blokkolt β-amiloid fehéijetermeléssel jár együtt. 55
Számos proteináz esetén számoltak be arról, hogy az megváltozik az Alzheimer-kóros agyszövetben. így például kimutatták, hogy az α-1-tripszin-szerű immunoreaktivitás megnövekszik az Alzheimer-kóros agyban [Biochem. Biophys. Rés. Commun. 193(2), 579-594 60 (1993)], három különböző metalloproteinázról ismertették, hogy aktivitása megemelkedik az Alzheimer-kóros agyban [J. Neurochem. 58, 983 -992 (1992)], megfigyelték multikatalitikus proteinázok megváltozását [Neurosc. Rés. Comm. 8(3), 185-190 (1991)], beszámoltak abnormis katepszin D és B immunreaktivitásról [Neurosc. Lett. 130, 195-198 (1991) és Proc. Natl.
Acad. Sco. 87, 3861-3865 (1990)], továbbá különféleképpen mutatták ki kalciumaktivált neutrális proteináz (calpain) aktivitásának változását Alzheimer-kóros agyszövetben, kimutatták csökkenését [Neurobio. of
Aging, 11, 425-431 (1990)], növekedését [Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 90, 2628-2632 (1993)] vagy változatlanságát [J. Neurol. Sci, 102, 220-234 (1991).
Az előbbiek bemutatásul szolgálnak arra, hogy bár hatalmas mennyiségű munkáról számolnak be ezen a területen, nincs általános egyetértés a proteinázok azon osztálya tekintetében, amelyek hatékonyak az Alzheimer-kór kezelésében, vagy a tekintetben, hogy ezen proteinázok megváltoznak-e, ha Alzheimer-kóros agyszövettel lépnek kontaktusba.
A találmány tárgyát új (IB) képletű vegyületek és ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények képezik, melyek a β-amiloid magfehéije-képződésének és az amiloid plakkok képződésének gátlására alkalmazha- l tők Alzheimer-típusú dementiában szenvedő betegek esetén. A találmány szerinti gyógyszerkészítmény tehát az Alzheimer-kór progressziójának kezelésére ; | vagy javítására, például az Alzheimer-típusú öregkori ? * elbutulás és az időskori Down-szindróma kezelésére í j . i használható. f
A találmány tárgya továbbá az (IB) képletű vegyüle- f tek előállítása és e vegyületek alkalmazása olyan állapo- | tok kezelésére, amelyek reagálnak a betegben végbeme- | nő β-amiloid magfehérje-termelődés gátlására vagy I megelőzésére. í
A találmány tárgyát képezik tehát az (IB) általános képletű vegyületek, azok hidrátjai, sztereoizomeijei és gyógyszerészetileg elfogadható sói, ahol az általános képletben ha Xa jelentése hidrogénatom, akkor Ra jelentése CH2Si(l-6 szénatomos alkíl)2-(2—6 szénatomos alkenil)-csoport, CH2Si(l-6 szénatomos alkil)2-fenil-csoport vagy NHC(=O)-fenil-csoporttal szubsztituált benzilcsoport; vagy ha Xa jelentése CF2C(=O)-fenetil-csoport, akkor Ra jelentése 1 -7 szénatomos alkilcsoport, de terc-butil-metil-csoporttól eltérő; vagy ha Xa jelentése CF2C(=O)NHCH2Si(l-6 szénatomos alkil)3-csoport, akkor Ra jelentése benzilcsoport,
P2 a jelentése Leu, Alá, Ile, Val, Nva, Nle vagy tercleucin aminosavmaradék;
Ka jelentése benzil-oxi-kaibonil-csoport.
A találmány tárgya továbbá eljárás az (IB) általános képletű vegyületek előállítására oly módon, hogy L valamely Ka-P2a általános képletű csoportot, melyben Ka és P2a jelentése a fentiekben megadott, valamely R
H2N-CH(Ra)-C(=O)Xa általános képletű vegyülettel
- melyben Ra és Xa jelentése a fentiekben megadott kapcsolunk, vagy
HU 221 629 BI valamely Ka-P2a általános képletű csoportot, melyben Ka és P2a jelentése a fentiekben megadott, valamely H2N-CH(Ra)-CH(OH)Xa általános képletű vegyülettel - melyben Ra és Xa jelentése a fentiekben megadott - kapcsolunk, és az így kapott vegyületet oxidáljuk.
A leírásban az 1-6 szénatomos alkil- vagy 1-7 szénatomos alkilcsoportok jelentése egyenes vagy elágazó láncú alkilcsoport, így például metilcsoport, etilcsoport, propilcsoport, izopropilcsoport, butilcsoport, izobutilcsoport, terc-butil-csoport, pentilcsoport, izopentilcsoport, szek-pentil-csoport, hexilcsoport, izohexilcsoport. Hasonlóképpen a 2-6 szénatomos alkiléncsoportok jelentése 2-6 szénatomot tartalmazó kétértékű csoport, amely egyenes vagy elágazó láncú lehet. Valamennyi 1-7 szénatomos csoport előnyösen 1-6 szénatomos és előnyöseb- 15 ben 1-4 szénatomos csoport Minden 1-6 szénatomos csoport előnyösen 1-4 szénatomos és előnyösebben 1-2 szénatomos csoport.
Az (IB) általános képletű vegyületek lehetnek szabad formában vagy só formában, például savaddíciós só vagy anionos só formájában. Egy ilyen vegyületet átalakíthatunk sójává vagy bázissá, ismert módon, egyiket a másikba. Előnyös sók a trifluor-acetát, a hidrokloridsók, a nátrium-, kálium- vagy ammóniumsók, bár a találmány tárgyköre kiteljed minden olyan sóra, melyet 25 a peptidkémiában ismert módon felhasználunk.
A „sztereoizomer” definíció általános definíció az egyes molekulák mindazon izomerjeire vonatkozóan, amelyek csak atomjaik térbeli orientációjában különböznek. A leírás szerinti definíció magában foglalja a 30 tükörképi izomereket (enantiomereket), a geometriai (cisz/transz) izomereket, továbbá az egynél több királis centrumot tartalmazó molekulák azon izometjeit, amelyek egymásnak nem tükörképei (diasztereo-izomereket). Aminosavak esetén a D/L vagy R/S megjelölése- 35 két alkalmazhatjuk, amint azt a IUPAC-IUB Joint Commission on Biochemical Nomenclature, Eur. J. Biochem. 138,9-37 (1984) közlemény ismerteti. A természetes aminosavak a glicin kivételével tartalmaznak királis szénatomot. Eltérő specifikus jelölés hiányában az 40 előnyös vegyületek az L-konfigurációjú optikailag aktív aminosavak; az (IB) általános képletű vegyületeket felépítő aminosavak azonban akár D- akár L-konfigurációjúak lehetnek, vagy lehetnek a D- és L-izomerek elegyei, beleértve a racém elegyeket. A későbbiekben sze- 45 replő 1. táblázatban foglaljuk össze a vegyületekben előforduló α-aminosavak elfogadott rövidítését.
A leírásban az ,Alzheimer-kór” az Alzheimer-típusú senilis dementiát is jelenti.
A „hidrát” definíció azt jelenti, hogy a találmány 50 szerinti vegyületekben lévő ketocsoport dihidroxi-metilén-csoport formájában is lehet. A találmány szerinti vegyületek normális fiziológiai körülmények között várhatóan hidratált formában vannak.
A „dezaminocsoport” jelentése a-aminosavcsoport 55 az ahhoz csatlakozó aminocsoport nélkül. Előnyös dezaminocsoportot képeznek a Val, Ala alfa-aminosavak a megfelelő terminális aminocsoportjuk nélkül.
A „szubsztituált benzilcsoport” azt jelenti, hogy a benzilcsoport a fenilrészén hozzáférhető szénatomo- 60 kon, vagyis méta-, orto- és/vagy para-helyzetben szubsztituálva van, és előnyösen a szubsztituens para-helyzetben van.
Minden α-aminosavnak van egy jellegzetes „R-cso5 portja”, ahol az R-csoport az az oldallánc vagy maradék, amely az a-aminosav α-szénatomjához kapcsolódik. Például az R-csoport oldallánc glicin esetén hidrogénatom, alanin esetén metilcsoport, valin esetén izopropilcsoport. Az α-aminosavak specifikus R-csoport10 jait vagy oldalláncait ismerteti például A. L. Lehninger „Biochemistry” [Lehninger A. L., Biochemistry, 2nd Edition, Chapter 4, „The Aminoacid Building Blocks of Proteins”, pp. 71. (1978)], szakirodalmi hivatkozási helyen.
A természetes aminosavak a glicin kivételével tartalmaznak királis szénatomot. Eltérő specifikus jelölés hiányában az előnyös vegyületek az L-konfigurációjú optikailag aktív aminosavak; a találmány szerinti (Π3) általános képletű vegyületeket felépítő aminosavak azonban 20 akár D-, akár L-konfigurációjúak lehetnek, vagy lehetnek a D- és L-izomerek elegyei, beleértve a racém elegyeket. Az I. táblázatban foglaljuk össze a vegyületekben előforduló α-aminosavak elfogadott rövidítését:
I. táblázat
A találmány szerinti vegyületekben előforduló aminosavak nevének rövidítése
Aminosav Jele
alanin Ala
izoleucin Ile
leucin Leu
valin Val
norvalin Nva
norleucin Nle
Az A reakcióvázlat általános szintézisutat mutat be az (IB) általános képletű vegyületek előállítására.
A Ka-P2a csoportot az (1) általános képletű aminosavszármazék szabad aminocsoportjához kapcsolhatjuk. Az (1) általános képletben Ra és Xa jelentése a fentiekben megadott. A P2a csoportot - melynek jelentése szintén a fenti - a jól ismert peptidkapcsolási eljárásokkal kapcsolhatjuk a védőcsoportot nem tartalmazó szabad aminovegyülethez.
Általában úgy hosszabbítjuk meg a peptideket, hogy eltávolítjuk a C-terminális maradék a-aminocsoportjának a védőcsoportját, és peptidkötéssel hozzákapcsoljuk a következő, megfelelően védett aminosavakat az ismertetett eljárások alkalmazásával. Ezt a védócsoport-eltávolítási és -kapcsolási eljárást addig ismételjük meg, amíg megkapjuk a kívánt szekvenciát. Ezt a kapcsolást elvégezhetjük a peptidet alkotó aminosavakkal lépésenként, amint azt az A reakcióvázlattal bemutatjuk, vagy fragmensek (két vagy több aminosav) kondenzációjával, vagy e két eljárás kombinációjával, továbbá szilárd fázisú peptidszintézissel, amely eljárást eredetileg Merrifield a J. Am. Chem. Soc., 85, 2149-2154
HU 221 629 Bl (1963) közleményében ismertetett, és amely közlemény a leírás tekintetében referenciaként szerepel. Ha szilárd fázisú szintézismódszert alkalmazunk, a C-terminális karbonsavat (karboxilcsoportot) oldhatatlan hordozóhoz (rendszerint polisztirolhoz) kapcsoljuk. Ezek az oldhatatlan hordozók olyan csoportot tartalmaznak, amely reakcióba lép az aldehidcsoporttal, és olyan kötést hoz létre, amely stabil a lánchosszabbítás körülményei között, de később könnyen hasítható. E hordozókra példák a következők: klór- vagy bróm-metil-gyanta, hidroxi-metil-gyanta és amino-metil-gyanta. E gyanták közül sok kapható a kereskedelmi forgalomban úgy, hogy már tartalmazza a kívánt C-terminális aminosavat. Azon (IB) általános képletű vegyületek esetén, melyekben X* jelentése hidrogénatom, kapcsolóvegyületet is alkalmazhatunk az A reakcióvázlat szerinti reakciókban abból a célból, hogy hozzákössünk egy gyantát az olyan (1) általános képletű aminosavszármazékok aldehid funkciós csoportjához, amelyekben X* jelentése hidrogénatom. Alkalmas kapcsolószerek például az Ll, L2 vagy L3 képletű vegyületek.
Alternatív módon a találmány szerinti vegyületeket automata peptidszintetizátor alkalmazásával is előállíthatjuk. Az előbbieken felül további peptidszintézist ismertetnek a következő művekben: Stewart és Young, „Solid Phase Peptide Synthesis” 2. kiadás, Pierce Chemical Co., Rockford, IL (1984); Gross, Meienhofer, Udenfriend (szerkesztők), „The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology”, 1., 2., 3., 5. és 9. kötet, Academic Press, New York, 1980-1987; Bodanszky, „Peptide Chemistry: A Practical Textbook”, Springer Verlag, New York (1988); valamint Bodanszky és munkatársai „The Practice of Peptide Synthesis” Springer Verlag, New York (1984), amely műveket a leírásban referenciaként szerepeltetünk.
Két aminosav, egy aminosav és egy peptid, vagy két peptidfragmens közötti kapcsolást standard kapcsolási eljárásokkal végezhetünk, úgymint az azidmódszerrel, vegyes szénsavanhidrid (izobutil-klór-formiát)módszerrel, karbodiimid (diciklohexil-karbodiimid, diizopropil-karbodiimid vagy vízoldható karbodiimid)módszerrel, aktív észter (p-nitro-fenil-észter, N-hidroxi-szucinimid-észter)-módszerrel, Woodward K reagens módszerrel, karbonil-diimidazol-módszerrel, foszfortartalmú reagens, úgymint BOP-C1 alkalmazásával vagy oxidációs-redukciós módszerekkel. E módszerek közül néhánynak (különösen a karbodiimid-módszernek) növelhetjük a hatékonyságát 1-hidroxi-benzotriazol hozzáadásával. Ezeket a kapcsolási reakciókat elvégezhetjük akár oldatban (folyadékfázisban) akár szilárd fázisban.
A peptideket felépítő aminosavak funkciós csoportjait védeni kell a kapcsolási reakciók során annak érdekében, hogy elkerüljük nemkívánatos kötések kialakulását. Az alkalmazható védőcsoportokat ismertetik a kővetkező művek: Greene „Protective Groups in Organic Chemistry”, John Wiley & Sons, New York (1981), valamint „The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology”, Vol. 3, Academic Press, New York (1981), amely közleményeket a leírásban referenciaként tekintünk.
A C-tenninális csoport α-karboxilcsoportját általában egy ilyen észterrel védjük, amelyet lehasíthatunk, hogy megkapjuk a karbonsavat. Alkalmazható védőcsoportok lehetnek: 1. alkil-észterek úgymint a metil- és a terc-butil-észter, 2. aril-észterek, úgymint a benzil- és a szubsztituált benzil-észterek vagy 3. olyan észterek, amelyeket kíméletes bázisos kezeléssel vagy enyhe reduktív kezeléssel hasíthatunk, úgymint triklór-etil- és fenacil-észterek.
Minden aminosav α-aminocsoportját védenünk kell. Erre bármely ismert védőcsoportot felhasználhatunk, A védőcsoportokra példák: 1. acil típusú védőcsoportok, úgymint formilcsoport, trifluor-acetil-csoport, ftalilcsoport és p-toluolszulfonilcsoport; 2. aromás karbarnát típusú védőcsoportok, úgymint a benzil-oxi-karbonil-csoport (Cbz vagy Z) és a szubsztituált benziloxi-karbonil-csoportok, 1 -(p-bifenil)-1 -(metil-etoxi)karbonil-csoport és a 9-fluorenil-metil-oxi-karbonilcsoport (Fmoc); 3. alifás karbamát típusú csoportok, úgymint a terc-butoxi-karbonil-csoport (Boc), etoxikarbonil-csoport, diizopropil-metoxi-karbonil-csoport, valamint az allil-oxi-karbonil-csoport; 4. ciklusos alkilkarbamát típusú csoportok, úgymint a ciklopentil-oxikarbonil-csoport és az adamantil-oxi-karbonil-csoport; 5. alkil típusú csoportok, úgymint a trifenil-metil-csoport és a benzilcsoport; 6. trialkil-szilán-csoportok, úgymint a trimetil-szilán-csoport; valamint 7. tiolcsoportot tartalmazó típusúak, úgymint a fenil-tio-karbonil-csoport és a ditia-szukcinoil-csoport. Előnyös a-aminovédő csoport a Boc vagy Fmoc csoport, előnyös közülük a Fmoc. A kereskedelmi forgalomban számos olyan aminosavszármazék kapható, amely peptidszintézis céljaira alkalmasan védve van.
Az α-aminovédő csoportot a következő aminosav kapcsolását megelőzően eltávolítjuk Ha Boc védőcsoportot alkalmazunk, választhatunk a trifluor-ecetsavval (tisztán vagy diklór-metános oldatban) vagy a dioxános sósavoldattal végzett hasítás között. A keletkezett ammóniumsót ezután semlegesítjük vagy a kapcsolást megelőzően, vagy in situ bázisos oldatokkal, úgymint vizes pufforokkal vagy pedig diklór-metánnal vagy dimetil-formamiddal készült tercier amin-oldatokkal. Ha Fmoc csoportot alkalmazunk, a választható reagensek közé tartozik a dietil-formamidban lévő piperidin vagy szubsztituált piperidin, de bármilyen szekunder aminoldatot vagy vizes bázisos oldatot használhatunk. A védőcsoport-eltávolítást 0 °C és szobahőmérséklet között végezzük.
Bármely olyan aminosavat, amelynek oldalláncbeli funkciós csoportja van, védenünk kell a peptidek előállítása során ha bármelyik felsorolt eljárást alkalmazzuk. A szakember számára ismert, hogy ezen oldalláncbeli megfelelő védőcsoportok megválasztása és alkalmazása függ az aminosavtól és a pepiidben jelen lévő más védőcsoportoktól. Az ilyen védőcsoportok megválasztásának szempontja az, hogy azokat nem szabad eltávolítani az α-aminocsoport védőcsoportjának eltávolítása és kapcsolása során.
Ha például Boc csoportot használunk a-aminovédő csoportként, a következő oldallánci védőcsoportok alkal5
HU 221 629 Bl masak: p-toluolszulfonilcsoportot (tozilcsoportot) használhatunk aminosavak amino-oldalláncának védelmére, így a Lys és az Arg esetén; p-metil-benzil-csoportot, acetamido-metil-csoportoL benzilcsoportot (Bzl) vagy tercbutil-szulfonil-csoportot használhatunk az aminosavak szulfidtartalmú oldalláncának védelmére, úgymint a risztéin esetói; továbbá benzil (Bzl)-éter-csoportot használhatunk az aminosavak hidroxicsoportot tartalmazó oldalláncainak védelmére, úgymint a Ser vagy a Thr esetén.
Ha Fmoc csoportot választunk az a-aminovédelemre, rendszerint elfogadhatók a terc-butil-alapú védőcsoportok. Például Boc csoportot használhatunk a lizin, terc-butil-éter-csoportot a szerin és a treonin, valamint terc-butil-észter-csoportot a glutaminsav esetén.
Ha a peptidlánc meghosszabbítását befejeztük, az összes védőcsoportot eltávolítjuk. Ha oldalfázisú szintézist alkalmazunk, a védőcsoportot bármely módon eltávolíthatjuk, amilyet a védőcsoport megválasztása megszab. Ezek az eljárások a szakember számára jól ismertek.
Ha szilárd fázisú szintézist alkalmazunk, a peptidet rendszerint a védőcsoportok eltávolításával egyidejűleg hasítjuk le a gyantáról. Ha a Boc-védelem sémáját alkalmazzuk a szintézis során, a pepiidnek a gyantáról való lehasítására előnyös eljárás olyan vízmentes HF-dal végzett kezelés, amely HF adalékanyagokat, úgymint dimetil-szulfoxidot, anizolt, tioanizolt vagy p-krezolt tartalmaz, és a kezelést 0 °C-on végezzük. A peptidet lehasíthatjuk más savas reagensekkel is, úgymint trifluor-metánszulfonsav/trifluor-ecetsav elegyével. Ha a Fmoc-védelem sémáját alkalmazzuk, az N-terminális Fmoc csoportot a korábban ismertetett reagensekkel hasítjuk le. A többi védőcsoportot és a peptidet a gyantáról trifluor-ecetsav és különféle adalékok, úgymint anizol, stb. oldatával hasítjuk le.
Azokat az (I) általános képletű peptideket, amelyekben X jelentése hidrogénatom, vizes sav/formaldehid rendszerrel hasíthatjuk le a kapcsolódó vegyületről és a gyantáról.
Az (I) általános képletű vegyületeket alternatív módon előállíthatjuk a szakember számára ismert standard kémiai reakciókkal analóg módon úgy is, amint azt a B reakcióvázlattal szemléltetjük.
A B reakcióvázlat alternatív általános szintézisvázlatot mutat be az (IB) általános képletű vegyületek előállítására.
A P2 a csoportot, melynek jelentése a fenti, az előbbiekben leirt A reakcióvázlatnak megfelelően kapcsolhatjuk a (2) általános képletű amino-alkohol-származékok - melyekben R1 és X» jelentése a fenti - szabad aminocsoportjához, így a (3) általános képletű peptidoalkoholokat kapjuk.
A (3) általános képletű peptido-alkoholok alkohol funkciós csoportját ezután a szakember számára ismert eljárásokkal és műveletekkel oxidáljuk, úgymint Swem-oxidációval oxalil-klorid és dimetil-szulfoxid alkalmazásával, és így kapjuk az (IB) általános képletű vegyületeket.
Az A és B reakcióvázlat szerinti kiindulási anyagok a szakember számára könnyen hozzáférhetőek. Például a P2® aminosav, a kereskedelemben kapható, továbbá az (Ll) képletű kapcsoló (linker)-vegyületet a J. Am. Chem. Soc. 114, 3157-3159 (1992) közlemény ismerteti. A 0363284 számú európai szabadalmi bejelentés (1990. április 11.) leírja továbbá azokat a Ka-P2a általános képletű szubsztituált aminosavakat, melyekben Ka jelentése acetilcsoport, szukcinilcsoport, benzoilcsoport, terc-butil-oxi-karbonil-csoport, karbobenzil-oxicsoport, tozilcsoport, danzilcsoport, izovalerilcsoport, metoxi-szukcinil-csoport, 1-adamantán-szulfonil-csoport, 1-adamantán-acetil-csoport, 2-karbox-benzoil-csoport, fenil-acetil-csoport, terc-butil-acetil-csoport, bisz[(l-naftil)-metil]-acetil-csoport vagy -A-Rz általános képletű csoport, ahol A jelentése (a), (b), (c) vagy (d) képletű csoport; és Rz jelentése olyan 6, 10 vagy 12 szénatomos arilcsoport, amely alkalmas módon szubsztituálva van 1-3 szubsztituenssel, amely szubsztituensek jelentése egymástól függetlenül fluor-, klór-, bróm-, jódatom, trifluor-metil-csoport, hidroxicsoport, 1-6 szénatomos alkilcsoport, 1-6 szénatomos alkoxicsoport, karboxicsoport, alkil-karbonil-amino-csoport, melyben az alkilcsoport 1-6 szénatomot tartalmaz, 5-tetrazolilcsoport, és 1-15 szénatomot tartalmazó acil-szulfonamido-csoport, azaz acil-amino-szulfonil-csoport és szulfonil-amino-karbonil-csoport, azzal a feltétellel, hogy ha az acil-szulfonamido-csoport arilcsoportot tartalmaz, ez az arilcsoport még egy szubsztituenssel szubsztituálva lehet, ahol ennek a szubsztituensnek a jelentése fluor-, klór-, bróm-, jódatom és nitrocsoport; továbbá K jelentése olyan más terminális aminovédő csoport, amely ezekkel funkcionálisan ekvivalens.
Az (1) általános képletű kiindulási aminovegyületek a szakember számára könnyen hozzáférhetőek. A következőkben példaképpen megadunk olyan közleményeket, amelyek bizonyos (I) általános képletű védett aminosavakat írnak le. Olyan (1) általános képletű vegyületeket ismertetnek tehát, ahol
X jelentése hidrogénatom és R jelentése benzilcsoport: a 0363284 számú európai és a WO 84/00365 számon nyilvánosságra hozott PCT szabadalmi bejelentések;
X jelentése hidrogénatom és R jelentése CH2Si(CH3)3 képletű csoport: a 0363284 számú európai szabadalmi bejelentés, és e bejelentés 12. példája. A 13. és 14. példákban leírt vegyűleteknél csak a szililcsoporton lévő szubsztituensek különbözőek;
X jelentése hidrogénatom és R jelentése szubsztituált benzilcsoport: a PCT/US91/09741 számú szabadalmi bejelentés;
X jelentése CF3 és CHF2 csoport, és R jelentése benzilcsoport vagy NHC(NH)NH2 csoporttal szubsztituált benzilcsoport: a 0195212 számú európai szabadalmi bejelentésben (nyilvánosságra hozatala 1986. szeptember 24., feltalálók: Michel Jung és társai);
X jelentése CF2CH2NHC(=O)R] általános képletű csoport és R jelentése benzilcsoport, intermedierként ismertetve az OPI0275101 számú európai szabadalmi bejelentésben (benyújtva 1988. január 14-én, feltalálók: Dániel Schirlin és társai); a CFHCH2NHC(=O)Rj általános képletű csoportot tartalmazó monofluorszármazék hasonló eljárásokkal állítható elő úgy, hogy bróm6
HU 221 629 Bl (fluor-ecetsav)-etil-észtert használnak bróm-(difluorecetsav)-etil-észter helyett;
X jelentése CF2C(O)W általános képletű csoport, melyben W jelentése NHCH2Si(alkil)3 általános képletű csoport, továbbá R jelentése benzilcsoport, CH2Si(CH3)3 vagy szubsztituált benzilcsoport: aPCT/US91/09741 számú szabadalmi bejelentés (feltalálók: Dániel Schirlin et al., benyújtva: 1991. december 20-án), és ha R jelentése (CH^-naftil-csoport, hasonló eljárásokat alkalmazhatnak ismert kiindulási vegyületek használatával;
X jelentése CF2C(O)W általános képletű csoport, ahol W jelentése NHRj vagy Rj csoport és R jelentése benzilcsoport, CH2Si(CH3)3 vagy szubsztituált benzilcsoport: a PCT/US91/09741 számú szabadalmi bejelentés (feltalálók: Dániel Schirlin és társai, benyújtva 1991. december 20-án), és ha R jelentése (CH2)m-naftil-csoport, hasonló eljárásokat alkalmazhatnak ismert kiindulási vegyületek használatával;
X jelentése C(O)Rt csoport és R jelentése benzilcsoport, CH2Si(CH3)3, (CH2)m-naftil- vagy szubsztituált benzilcsoport: a 4,820,691 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás (benyújtva: 1989. április 11-én); és a transz-4-(amino-metil-ciklohexán)-karbonsavbenzil-észter kapcsolódó vegyületnek a megfelelő savból végzett előállítását az olyan (I) általános képletű vegyületek szintézise érdekében, melyekben X jelentése hidrogénatom a J. Am. Chem. Soc., 114, 3156-3157 (1992) közlemény.
A leírás szempontjából valamennyi előbbi közlemény referenciaként tekintendő.
A következő példák tipikus szintéziseket mutatnak be. A példák csak a találmány bemutatását szolgálják anélkül, hogy az oltalmi kört bármilyen módon korlátoznák. A példákban megadott jelölések jelentése a következő: gramm; „mmol” millimól; „ml” milliliter, „lp” fonáspont; „°C” Celsius-fok; „pl” mikroliter; „pg” mikrogramm; „pM” mikromól; ,JZ” vagy „Cbz” jelentése karbobenzil-oxi-csoport; „THF” tetrahidroíurán; „DCU” Ν,Ν-diklór-uretán; „Eq” ekvivalens; ,Atg” gramm atom.
1. példa (ref.)
2-[N-(Benzil-oxi-karbonil)-L-valil]-amino-4,4-difluor-l,7-difenil-3,5-dioxo-heptán előállítása [(69) képletű vegyület]
A) lépés: N-(Benzil-oxi-karbonil)-L-valil-L-fenilalanin, N, O-dimetil-hidroxamát
0,920 g (4,5 mmol) N,N’-diciklohexil-karbodiimidet adunk 0,220 g (0,55 mmol) CBz(L)-Val-PheOH és 0,93 g (0,61 mmol) hidroxi-(benzotriazol) 12 ml metilén-kloriddal készített oldatához. Az elegyet 0 °Con 1 órán át keverjük. A reakcióelegyhez 0,59 g (0,61 mmol) N,O-dimetil-hidroxil-amin.HCl-t és 0,61 g (0,61 mmol) N-metil-morfolint adunk és 12 órán keresztül keveijük 25 ’C-on. Az elegyet szüljük, metilén-kloriddal mossuk és a szűrletet vákuumban besűrítjük, így megkapjuk a nyersamidot olaj alakban. A nyersmaradékot flashkromatográfiával tisztítjuk [szilikagél, 2:8 (etil-acetát):ciklohexán], 0,250 g címbeli vegyületet kapunk.
B) lépés: N-(Benzil-oxi-karbonil)-L-valil-L-fenilalaninal
Az előzőekben készített hidroxamátból 0,220 g-ot (5 mmol) adunk 10 ml dietil-éterben oldott 0,19 g (0,49 mmol) lítium-aluminium-hidridhez, 0 ’C-on inért atmoszférában. Az elegyet 30 percig keverjük, szobahőmérsékletre hagyjuk felmelegedni, és 1 órán át keverjük. A fázisokat elválasztjuk, és a szerves fázist mossuk 10 ml telített nátrium-karbonát-oldattal, majd telített nátrium-klorid-oldattal, magnézium-szulfáton szárítjuk, szüljük és vákuumban besűrítjük. így kapjuk a címbeli vegyületet: 0,179 g CBz(L)-Val-Phe-H-t, melyet további tisztítás nélkül használunk fel.
C) lépés: 2-[N-(Benzil-oxi-karbonil)-valil]-amino4,4-difluor-l,7-difenil-3-hidroxi-5-oxo-heptán
0,019 g (0,1 ekv.) titán-tetrakloridot adunk 0,196 g (3 mAtg) aktivált cinknek 3 ml vízmentes THF-nal készített szuszpenziójához, 0 ’C-on. Nitrogéngáz alatt 30 percig keveijük, és hozzáadunk 0,42 g (1,1 mmol) CBz(L)-Val-Phe-H-t, 0,218 g (1,0 mmol) l-klór-1,1difluor-2-oxo-4-fenil-butánt 4 ml vízmentes THF-ban. Hagyjuk felmelegedni a reakcióelegyet szobahőmérsékletre, és 12 órán át keveijük. 2 ml telített ammónium-klorid-oldatot adunk hozzá. Kétszer extraháljuk 4 ml dietil-éterrel, és a szerves tézist sóoldattal mossuk, majd vízmentes magnézium-szulfáton szárítjuk. A szerves fázist vákuumban besűrítjük. A nyersmaradékot flashkromatográfiával tisztítjuk [szilikagél, 3:7(etil-acetát): ciklohexán], így 0,381 g címbeli alkoholt kapunk.
D) lépés: 2-[N-(Benzil-oxi-karbonil)-L-valil]-amino-4,4-difluor-l,7-difenil-3,5-dioxo-heptán
0,331 g (4,26 mmol) dimetil-szulfoxidot adunk 0,269 g (2,13 mmol) oxalil-klorid-oldatboz, melyet 2 ml vízmentes metilén-kloriddal készítettünk -55 ’Con nitrogéngáz alatt. 10 percig keveijük az elegyet -55 °C-on, és hozzáadunk a fent készített alkoholból 0,3 g-ot (0,53 mmol) 2 ml vízmentes metilén-kloridban oldva. A reakcióelegyet 2 órán át keveijük ezen a hőmérsékleten, majd hagyjuk felmelegedni -20 ’C-ra. 0,321 g (1,68 mmol) trietil-amint adunk hozzá, és hagyjuk szobahőmérsékletre felmelegedni. Néhány percig még keveijük az elegyet. 10 ml etil-acetáttal felhígítjuk. A szerves fázist 3x3 ml 0,1 mol/1 sósavval és telített vizes ammónium-klorid-oldattal mossuk. A szerves fázist vízmentes magnézium-szulfáton szárítjuk, szűrjük és besűrítjük vákuumban, így 0,22 g nyersterméket kapunk. A nyersanyagot kristályosítással tisztítjuk, és 0,102 g címbeli vegyületet kapunk.
Elemanalízis-adatok:
számított: C: 67,95%, H: 6,24%, N: 4,95%; talált: C: 66,99%, H: 6,15%, N: 5,30%.
2. példa (ref.)
4-[N-(Fenil-propionil)-L-valil]-amino-2,2-difluor3-oxo-5-fenil-N-benzil-pentánamid előállítása [(70) képletű vegyület]
A) lépés: N-(Benzil-oxi-karbonil)-fenil-alaninal
4,19 g CBz(L)-Phe-H aldehidet kapunk úgy, hogy 15,00 g (50 mmol) CBz(L)-Phe-OH-t redukálunk, utá7
HU 221 629 Bl na az az eljárás következik, melyet az 1. példában leírtunk [A) és B) lépés].
B) lépés: 4-(Benzil-oxi-karbonil)-amino-2,2-difluor-3-hidroxi-5-fenil-pentánsav-etil-észter
4,19 g (14,8 mmol) CBz-(L)-Phe-H-t és 6,30 g (31 mmol) etil-bróm-difluor-acetátot 40 ml száraz THF-ban hozzáadjuk egy olyan refluxáló szuszpenzióhoz, mely 2,0 g (31 mAtg) aktivált cinkforgácsot tartalmaz 10 ml száraz THF-ban, és az elegyet gyenge reflux alatt tartjuk. Az oldatot 12 órán keresztül keveijük szobahőmérsékleten. Az elegyhez 100 ml etil-acetátot, 20 ml sóoldatot, 20 ml kálium-hidrogén-szulfátot adunk. A vizes fázist 3x60 ml etil-acetáttal extraháljuk, az extraktumot magnézium-szulfáton szárítjuk és vákuumban besűrítjük. A nyersmaradékot flashkromatográfiával tisztítjuk (szilikagél, 3:7 etil-acetát: ciklohexán) és 3,70 g címbeli vegyületet kapunk.
C) lépés: 4-(Benzil-oxi-karbonil)-amino-2,2-difluor-3-hidroxi-5-fenil-N-benzil-pentánamid
1,93 g (18 mmol) benzil-amint 10 ml THF-ban oldunk. Az oldatot hozzáadjuk egy olyan oldathoz, mely 1,42 g (3,5 mmol) etil-észtert tartalmaz 10 ml THFban. Az elegyet 12 órán át keveijük. 100 ml etil-acetátot adunk hozzá, 2x100 ml 0,1 mol/1 vizes sósavval, majd 100 ml vízzel és 100 ml sóoldattal mossuk. Vízmentes magnézium-szulfáton szárítjuk. A nyersterméket flashkromatográfiával tisztítjuk (szilikagél, 2:8 etil-acetát:ciklohexán), így 1,16 g címbeli vegyületet kapunk.
D) lépés: 4-Amino-2,2-difluor-3-hidroxi-5-fenil-Nbenzil-pentánamid
Az előző lépésben készített amid 0,81 g-ját (1,70 mmol) 0,28 g 10%-os palládium/aktív szén katalizátor 75 ml absz. etanolos szuszpenziójához adjuk. 12 órán át keveijük az elegyet hidrogéngáz atmoszférában atmoszferikus nyomáson. A katalizátort leszűijük, etanollal mossuk, és a szűrletet vákuumban besűrítjük, így 0,5 g címbeli amint kapunk, amely védőcsoportot nem tartalmaz.
E) lépés: 4-[N-(Fenil-propionil)-L-valil]-amino2.2- difluor-3-hidroxi-5-fenil-N-benzil-pentánamid
0,165 g (0,80 mmol) N,N’-diciklohexil-karbodiimidet adunk 0,199 g (0,80 mmol) hidrocinnamoilVal-OH [3-(fenil-propionil)-Val-OH] 15 ml vízmentes acetonitrillel készült oldatához. Az elegyet 1 órán át keveijük 0 °C-on. Az előbb készített aminból 0,210 got (0,80 mmol) adunk a reakcióelegyhez, és 12 órán át keveijük 25 °C-on. Az elegyet szüljük, etil-acetáttal mossuk és a szűrletet vákuumban besűrítjük, és megkapjuk a nyersamidot olaj alakban. A nyersmaradékot flashkromatográfiával tisztítjuk (szilikagél, 2:8 etilacetát: ciklohexán), így 0,16 g címbeli vegyületet kapunk.
F) lépés: 4-[N-(Fenil-propionil)-L-valil]-amino2.2- difluor-3-oxo-5-fenil-N-benzil-pentánamid
A fentiekben készített alkoholból 0,145 g-ot (0,25 mmol) 10 ml metilén-kloriddal és 0,055 g (0,75 mmol) terc-butil-alkohollal elegyítünk, és ezt az elegyet hozzáadjuk 0,318 g (0,75 mmol) Dess-Martinreagens metilén-kloridos szuszpenziójához. 12 órán keresztül keveijük az elegyet szobahőmérsékleten, majd vákuumban besűrítjük. A nyersmaradékot flashkromatográfiával tisztítjuk (szilikagél, 3:7 etil-acetát :ciklobexán), így 0,063 g címbeli vegyületet kapunk. Elemanalízis-adatok a képletre:
számított: C: 68,19%, H: 6,26%, N: 7,45%;
talált: C: 67,90%, H: 6,30%, N : 7,33%.
3. példa (ref.)
2-[N-(Benzil-oxi-karbonil)-L-valil]-amino-3-(trimetil-szilil)-propanal előállítása [(75) képletű vegyület]
A) lépés: 2-[(Benzil-oxi-karbonil)-amino]-3-(trimetil-szilil)-propánsav-metil-észter
5,58 g (25 mmol) N-(benzil-oxi-karbonil)-glicin-metil-észtert feloldunk 70 ml száraz THF-ban. Ezt az oldatot cseppenként hozzáadjuk -78 °C-on 8,76 ml (62,5 mmol) lítium-diizopropil-amin és 9,43 ml (62,5 mmol) tetrametil-etilén-diamin 100 ml száraz THF-nal készített oldatához, nitrogénatmoszférában. Miután az adagolás befejeződött, az oldatot 2 órán át keveijük -78 °C-on, majd 15 percig -30 °C-on, és lehűtjük -78 °C-ra. 39 ml száraz hexametil-foszfor-amidban oldunk 5,36 g (25 mmol) jód-metil-trimetil-szilánt és cseppenként adagoljuk a kapott szirupos elegyhez. Miután az adagolást befejeztük, a reakcióelegyet felmelegítjük -50 °C-ra, 1 óráig ezen a hőmérsékleten tartjuk és lehűtjük -78 °C-ra, éppen a hidrolízis előtt. A reakcióelegyet kioltjuk víz és ammónium-klorid hozzáadásával és felhígítjuk éterrel. A szerves réteget 1 mol/1 káliumhidrogén-szulfát-oldattal, majd kétszer vízzel mossuk, és nátrium-szulfáton szárítjuk. Az oldószert elpároljuk és a nyert 8,03 g maradékot flashkromatográfiával tisztítjuk (szilikagél, etil-acetát/petroléter: 2/8). 4,30 g címbeli vegyületet kapunk (56%-os hozam, színtelen olaj). Rf=0,51 (etil-acetát/petroléter: 2/8).
B) lépés: 2-Amino-3-(trimetil-szilil)-propánsav-metil-észter-hidroklorid
Az előbbi A lépésből származó termék 0,309 g-ját (1 mmol) 30 ml etanolban oldjuk és az oldatot 1,5 ml sósavval telített száraz dietil-éteiben keveijük szobahőmérsékleten 24 órán át, hidrogénatmoszférában, 0,03 g 10%-os palládium/aktív szén katalizátor jelenlétében. A hidrogénatmoszférát nitrogénatmoszférára cseréljük, és a katalizátort kiszűijük. Az elegyet vákuumban besűrítjük, így megkapjuk a címbeli vegyületet szilárd alakban, ezt úgy ahogy van felhasználjuk a következő lépésben.
C) lépés: 2-[N-(Benzil-oxi-karbonil)-L-vatil]-amino-3-(trimetil-szilil)-propánsav-metil-észter 0,311 g (1,24 mmol)N-(benzil-oxi-karbonil)-L-valint, 1,167 g (1,24 mmol) 1-hidroxi-benzotriazolhidrátot és 0,255 g (1,24 mmol) N,N’-diciklohexil-karbodiimidet feloldunk 20 ml metilén-kloridban és 3 ml dimetil-formamidban. Keverés közben az oldathoz 0 °C-on egymás után hozzáadunk 0,262 g-ot (1,24 mmol) az előbbi B lépésben nyert aminból és 0,136 ml (1,24 mmol) N-metil-morfolint. A hűtőfurdót eltávolítjuk, és a reakcióelegyet szobahőmérsékleten 17 órán át keverjük. Ezután szűrjük a reakcióele8
HU 221 629 Bl gyet, és a szűrletet vákuumban bepároljuk. A 0,476 g maradékot flashkromatográfiával tisztítjuk (szilikagél, petroléter/etil-acetát:8/2; Rf=0,14), így kapjuk a címbeli vegyületet (0,316 g-ot, 77%-os hozam a két lépésre).
D) lépés: 2-[N-(Benzil-oxi-karbonil)-L-valil]-amino-3-(trimetil-szilil)-propanal
Hexánnal készitett 1 mol/1 diizobutil-alumíniumhidrid-oldat 1,55 ml-ét cseppenként hozzáadjuk az előbbi C) lépésben kapott észter oldatához [0,316 g (0,77 mmol) észtert 7,5 ml vízmentes éterben és 3,5 ml vízmentes toluolban oldottunk] -78 °C-on, nitrogénatmoszférában. Az oldatot -78 °C-on 45 percig keverjük, és lassan hidrolizáljuk telített, vizes ammóniumklorid-oldattal. A vizes réteget kétszer extraháljuk (2 χ 20 ml) éterrel, és a szerves fázist szukcesszíve mossuk 10 ml 1 mol/1 kálium-hidrogén-szulfáttal és 20 ml vízzel. Az egyesített szerves fázisokat nátrium-szulfáton szárítjuk, szűrjük és az oldószert vákuumban eltávolítjuk. 0,260 g szilárd maradékot kapunk, melyet flashkromatográfiával tisztítunk (szilikagél, petroléter/etil-acetát :75/25, Rf=0,25), így megkapjuk a címbeli vegyületet 53%-os hozammal (0,15 g).
Az anyagot diklór-metán/pentánból kristályosítjuk, és 0,077 g fehér, gyapotszerű szilárd anyagot kapunk. Elemanalízis-eredmények a Cj^o^C^Si képletre: számított: C: 60,29%, H: 7,99%, N: 7,40%; talált: C: 60,23%, H: 8,10%, N: 7,42%.
4. példa
4-[N-(Benzil-oxi-karbonil)-L-valil]-amino-2,2-difluor-3-oxo-4-fenil-N-(trimetil-szilil-metil)-pentánamid előállítása [(71) képletű vegyület] 4-(Benzil-oxi-karbonil)-amino-2,2-difluor-3-hidroxi-5-fenil-pentánsav-etil-észtert állítunk elő a 2. példa B) lépésében leírtak szerint.
A) lépés: 4-(Benzil-oxi-karbonil)-amino-2,2-difltíor-3-hidroxi-5-fenil-N-(trimetil-szilii-metil)-pentánamid
A fent említett difluor-alkohol 0,25 g-ját (0,61 mmol) hozzáadjuk 2,5 ml THF-ban lévő 0,81 ml (6,10 mmol) trimetil-szilil-metil-aminhoz. Az elegyet 12 órán át keveijük és visszafolyató hűtő alatt melegítjük. Vákuumban besűrítjük, majd felhígítjuk 5 ml vizes kálium-hidrogén-szulfát-oldattal és 3 χ 5 ml dietil-éterrel extraháljuk. A szerves fázist 2x15 ml vízzel mossuk, majd nátrium-szulfáton szárítjuk. A nyersmaradékot flashkromatográfiával tisztítjuk (szilikagél, 25:75 etil-acetát:ciklohexán), így 0,212 g címbeli vegyületet kapunk.
B) lépés: 4-Amino-2,2-difluor-3-hidroxi-5-fenil-N(trimetil-szilil-metil)-pentánamid
0,10 g (0,22 mmol) fentiekben készített amidot egy olyan szuszpenzióhoz adunk, mely 10 ml abszolút etanolban 0,1 g 10%-os palládium/aktív szén katalizátort tartalmaz. Az elegyet 12 órán át atmoszferikus hidrogénnyomás alatt keveijük. A katalizátort kiszűijük, etanollal mossuk és vákuumban besűrítjük, így 0,71 g címbeli amint kapunk, amely védőcsoportot nem tartalmaz.
C) lépés: 4-[N-(Benzil-oxi-karbonil)-L-valil]-amino-2,2-difluor-3-hidroxi-5-fenil-N-(trimetil-szililmetil)-pentánamid
0,055 g (0,22 mmol) CBz(L)-Val-OH és 0,03 g (0,22 mmol) hidroxi-benzotriazol 10 ml dimetil-formamiddal készült oldatához 0,045 g (0,22 mmol) N,N’-diciklohexil-karbodiimidet adunk. Az elegyet 30 percig keveijük 0 °C-on. A reakcióelegyhez a fent készített aminból 0,073 g-ot (0,22 mmol) adunk és 25 °C-on 12 órán át keveijük a reakcióelegyet. Vizet és sóoldatot adunk hozzá, majd etil-acetáttal extraháljuk, vízzel mossuk, nátrium-szulfáton szárítjuk, és besűrítjük. 5 ml acetonitrillel hígítjuk, és leválasztjuk a DCU-t. Szüljük és a szűrletet vákuumban besűrítjük, és megkapjuk a nyersamidot. A nyersmaradékot flashkromatográfiával tisztítjuk (szilikagél, 35:65 etil-acetát:petroléter), így kapunk 0,40 g címbeli vegyületet.
D) lépés: 4-[N-(Benzü-oxi-karbonil)-L-valil]-amino-2,2-difluor-3-oxo-5-fenil-N-(trimetil-szilil-metil)-pentánamid
0,031 g (0,44 mmol) dimetil-szulfoxidot 1 ml vízmentes metilén-kloridban hozzáadjuk 1 ml metilén-kloridban oldott 0,02 ml (0,22 mmol) oxalil-kloridhoz -60 °C-on. Az elegyet 5 percig -60 °C-on keveijük, és hozzáadjuk a fent készített alkohol 0,041 g-ját (0,07 mmol), melyet 2 ml metilén-kloriddal elegyítettünk. A reakcióelegyet 1 órán át keveijük ezen a hőmérsékleten. 0,09 ml (0,65 mmol) trietil-amint adunk hoz- f zá, és hagyjuk felmelegedni szobahőmérsékletre. Az * elegyet még néhány percig keveijük, majd 10 ml meri- J lén-kloriddal felhígítjuk. A szerves fázist 3x10 ml I mol/1 kálium-hidrogén-szulfáttal és 2 χ 10 ml vízzel j mossuk. A szerves fázist nátrium-szulfáton szárítjuk, fc szűqük és vákuumban besűrítjük, így megkapjuk a | nyersvegyületet. A nyersmaradékot flashkromatográfiá- j val tisztítjuk (etil-acetát: petroléter 25:75, Rf= 0,2), így i nyerünk 0,015 g címbeli vegyületet.
Elemanalízis-eredmények a C31H33N3O5F2.0,25 H2O képletre:
számított: C: 58,93%, H: 6,71%, N: 7,36%;
talált: C: 58,74%, H: 6,72%, N: 7,16%.
5. példa
2-[N-(Benzil-oxi-karbonil)-L-valil]-amino-3-(fenildimetil-szilil)-propanal előállítása [(76) képletű vegyület]
A) lépés: 2-(Terc-butoxi-karbonil)-amino-3-(fenildimetil-szilil)-propánsav-metil-észter
A címbeli észtert 28%-os hozammal állítjuk elő N(terc-butoxi-karbonil)-glicin-metil-észterből és jód-metil-fenil-dimetil-szilánból (81%-os hozammal készítjük a kereskedelemben kapható klór-metil-fenil-dimetil-szilánból) ezt követi a 3. példa A) lépésében leírt eljárás.
Rf=0,23 (szilikagél, etil-acetát/petroléter: 1/9).
B) lépés: 2-Amino-3-(fenil-dimetil-szilán)-propán- ...
sav-metil-észter
Az előbbi A) lépésben kapott 0,92 g (2,73 mmol) ve- 8 gyületet 30 ml hangyasavban oldjuk, az oldatot 2 órán keresztül szobahőmérsékleten tartjuk. Miután a hangya- ' savat vákuumban eltávolítottuk, a maradékot feloldjuk
HU 221 629 BI ml etil-acetátban, 20 ml 1 mol/1 nátrium-karbonáttal extraháljuk és kétszer mossuk vízzel, a vizes fázist még egyszer extraháljuk 20 ml etil-acetáttal. Az egyesített szerves fázisokat nátrium-szulfáton szárítjuk, az oldószert bepároljuk és megkapjuk a címbeli vegyületet (0,64 g-ot) 98%-os hozammal.
C) lépés: 2-[N-(Benzil-oxi-karbonil)-L-valil]-amino-3-(fenil-dimetil-szilil)-propánsav-metil-észter
A címbeli vegyületet az előbbi B) lépésben előállított aminból és N-(benzil-oxi-karbonil)-L-valinból kapjuk a 3. példa C) lépésében leírt kapcsolási módszert alkalmazva, de l-etil-3-(3-dimetil-amino-propil)-karbodiimid-hidrokloridot használunk N,N’-diciklohexil-karbodiimid helyett (74% hozam).
Rf=0,19 (szilikagél, etil-acetát/petroléter: 2/8).
D) lépés: 2-[N-(Benzil-oxi-karbonil)-L-valil]-amino-3-ffeml-ditnetil-szilil)-propanal
A címbeli aldehidet 33%-os hozammal nyerjük az előbbi C lépésben kapott észtéiből, a 3. példa D) lépésében leírt redukciós eljárás szerint.
Rf=0,17 (szilikagél, etil-acetát/petroléter:2/8). Elemanalízis-eredmények a C24H32N2O4Si képletre: számított: C: 65,42%, H: 7,32%, N: 6,36%; talált: C: 65,33%, H: 7,10%, N: 6,26%.
6. példa
2-[N-(Benzil-oxi-karbonil)-L-valil]-amino-3-(vimldimetil-szilil)-propanal [(77) képletű vegyület]
A) lépés: 2-(Terc-butoxi-karbonil)-amino-3-(vinildimetil-szilil)-propánsav-metil-észter
A címben lévő észtert 51%-os hozammal állítjuk elő N-(terc-butoxi-karbonil)-glicin-metil-észterből és jód-metil-vinil-dimetil-szilánból, a 3. példa A) lépésében megadott eljárást követve.
Rf=0,35 (szilikagél, etil-acetát/petroléter: 1/9).
B) lépés: 2-Amino-3-(vmil-dimetil-szilil)-propánsav-metil-észter
A címbeli amint az előbbi A) lépésben előállított származékból kapjuk az 5. példa B) lépésében megadott védőcsoport-eltávolítási eljárással (kvantitatív hozam).
C) lépés: 2-[N-(Benzil-oxi-karbonil)-L-valil]-amino-3-(vinil-dimetil-szilil)-propánsav-metil-észter
A címbeli vegyületet 68%-os kitermeléssel állítjuk elő az előbbi B) lépésben kapott aminból és N-(benziloxi-karbonil)-L-valinból az 5. példa C) lépésében ismertetett kapcsolási módszert alkalmazva.
Rf-0,22 (szilikagél, etil-acetát/petroléter: 2/8).
MS: MH+=421, MNH4+=438.
D) lépés: 3-[N-(Benzil-oxi-karbonil)-L-valil]-amino-3-(vinil-dimetil-szilil)-propanal
A címben adott aldehidet megkapjuk az előbbi C) lépésben előállított észterből a 3. példa D) lépésében ismertetett redukciós eljárás szerint.
7. példa
N-(Benzil-oxi-karbonil)-L-valil-4-(fenil-karbonilamino)-L-fenil-alaninal előállítása [(83) képletű vegyület]
A) lépés: N-(Benzil-oxi-karbonil)-L-valil-4-nitroL-fenil-alamn-metil-észter
4,80 g (10 mmol) Z-L-valin-anhidrid 50 ml vízmentes diklór-metános oldatához 2,24 g (10 mmol) 4-nitroL-fenil-alanin-metil-észtert adunk. Az elegyet szobahőmérsékleten 1 éjjelen át keveijük. Az oldószert vákuumban eltávolítjuk, és a maradékot flashkromatográfíával tisztítjuk (szilikagél, etil-acetát/ciklohexán 4:6) és 2,10 g (56%-os hozam) címbeli vegyületet kapunk. Rf=0,32 (etil-acetát/ciklohexán 1:1)
B) lépés: N-(Benzil-oxi-karbonil)-L-valil-4-(fenilkarbonil-ammo)-L-fenil-alanin-metil-észter
0,91 g (2 mmol) N-(benzil-oxi-karbonil)-L-valil-4nitro-L-fenil-alanin-metil-észter, valamint 1,56 g (7 mmol) ón(ü)-klorid-dihidrát 50 ml abszolút etanolos oldatát és 5 ml Ν,Ν-dimetil-fonnamidot 4 órán át hevítünk reflux hőmérsékleten. Az elegyet lehűtjük, és vízzel hígítjuk, nátrium-hidrogén-kaibonáttal semlegesítjük, etil-acetáttal háromszor extraháljuk (3x50 ml). A szerves fázist magnézium-szulfáton szárítjuk. Szűrés és az oldószer bepárlása után a maradékot 20 ml vízmentes diklór-metánban felvesszük és 0 °C-ra hűtjük. 0,202 g (2 mmol) trietil-amint, utána 0,281 g (2 mmol) benzoil-kloridot adunk hozzá. Az elegyet szobahőmérsékleten 1 éjjelen át keveijük. Az oldószert eltávolítjuk vákuumban, és a maradékot flashkromatográfíával tisztítjuk (szilikagél, diklór-metán/metanol 98:2) és 0,500 g (50%-os hozam) címbeli vegyületet kapunk.
C) lépés: N-(Benzil-oxi-karbonil)-L-valil-4-(femlkarbonil-amino)-L-fenil-alanin
0,500 g (0,94 mmol) N-(benzil-oxi-karbonil)-Lvalil-4-(fenil-karbonil-ammo)-L-fenil-alanin-metil-észtert 30 ml dioxánban oldunk. Az oldathoz 0,084 g (2 mmol) lítium-hidroxid-monohidrátot adunk 10 ml vízben oldva. A reakcióelegyet szobahőmérsékleten keveijük 1 éjjelen át. Az elegyet 20 ml vízben felvesszük és kétszer mossuk etil-acetáttal (2 χ 20 ml). A szerves tézist pH«2 értékig 1 mol/1 sósavval megsavanyítjuk, és etil-acetáttal háromszor extraháljuk. A szerves tézist vízmentes magnézium-szulfáton szárítjuk. Az elegyet szűrjük, az oldószert vákuumban eltávolítjuk, így 0,400 g címbeli vegyületet kapunk fehér, szilárd anyagként (82%-os hozam).
MS:[MH]+=518 [MNH4]+=535
D) lépés: N-(Benzil-oxi-karbonil)-L-valil-4-(fenilkarbonil-amino)-L-fenil-alanin-N,O-dimetil-hidroxamát
0,390 g (0,75 mmol) N-(benzil-oxi-karbonil)-Lvalil-4-(fenil-karbonil-amin)-L-fenil-alanint feloldunk 5 ml vízmentes Ν,Ν-dimetil-formamidban és 15 ml vízmentes diklór-metánban. Az oldathoz 0 °C-on 0,155 g (0,75 mmol) Ν,Ν’-diciklohexil-karbodiimidet és 0,115 g (0,75 mmol) hidroxi-benzotriazolt adunk. 10 percig tartó keverés után 0,073 g (0,75 mmol) N,Odimetil-hidroxamát-klórhidrátot és 0,076 g (0,75 mmol) N-metil-morfolint adunk hozzá. A reakcióelegyet szobahőmérsékleten 1 éjjelen át keveijük, az oldószert vákuumban eltávolítjuk, és a maradékot etil-acetátban felvesszük, majd szűqük. A szűrletet bepároljuk, és a maradékot flashkromatográfíával tisztítjuk (szilikagél, diklór-metán/metanol 98:2), így kapunk 0,230 g (53%-os hozam) címbeli vegyületet.
HU 221 629 Bl
Rf=0,59 (CH2Cl2/MeOH 9:1)
MS: [MH]+=561 [MNH]+=578
E) lépés: N-(Benzil-oxi-karbonil)-L-valil-4-(fenilkarboml-amino)-L-fenil-alaninal
0,230 g (0,41 mmol) N-(benzil-oxi-karbonil)-Lvalil-4-(fenil-karbonil-amino)-L-fenil-alanin-N,Odimetil-hidroxamátot 10 ml vízmentes dietil-éterben és 5 ml vízmentes THF-ban oldunk. Az oldathoz 0 °C-on 0,017 g (0,45 mmol) lítium-alumínium-hidridet adunk. A reakcióelegyet 0 °C-on 1 órán át keverjük. 5 ml 1 mol/l-es kálium-hidrogénszulfát-oldatot adunk hozzá, és az elegyet háromszor extraháljuk etil-acetáttal (3 χ 15 ml). A szerves fázist 1 mol/1 sósavval, vízzel és sóoldattal mossuk és vízmentes magnézium-szulfáton szárítjuk. Miután az oldószert vákuumban eltávolítottuk, a maradékot flashkromatográfíával tisztítjuk (szilikagél, diklór-metán/metanol 98:2), 0,050 g (25%-os hozam) címbeli vegyületet kapunk.
Rf=0,43 (CH2Cl2/MeOH 9:1)
MS: [MH]+=502 [MNH4]+=519
8. példa
4-[N-(Benzil-oxi-karbonil)-L-terc-leucil]-amino2,2-difluor-3-oxo-5-fenil-N-(trimetil-szilil-metil)pentánamid előállítása [(88) képletű vegyület]
A) lépés: 4-[N-(Benzil-oxi-karbonil)-L-terc-leucil]-amino-2,2-difluor-3-hidroxi-5-fenil-N-(trimetil-szilil-metil)-pentánamid
A 4. példa B) lépésében leírt amin 0,222 g-ját (0,5 mmol) (trifluor-ecetsavas sójaként állítottuk elő), 115 μΐ (1,05 mmol) N-metil-morfolin és 0,56 g (1,1 mmol) karbobenzoxi-L-terc-leucil-anhidrid (előzetesen in situ állítjuk elő a savból és Ν,Ν’-diciklohexilkarbodiimidből 3 ml dimetil-fonnamidban) elegyét 1 éjjelen át keveijük szobahőmérsékleten. Az elegyet etilacetáttal hígítjuk, kétszer mossuk vízzel és a vizes fázist vákuumban besűrítjük. A nyersmaradékot flashkromatográfiával tisztítjuk (szilikagél, etil-acetát/petroléter 3:7) így 0,15 g címbeli alkoholt kapunk (52% hozam). Rf=0,69 (etil-acetát/petroléter 4:6).
B) lépés: 4-[N-(Benzil-axi-karbonil)-L-terc-leucil]-amino-2,2-difluor-3-oxo-5-fenil-N-(trimetil-szilil-metil)-pentánamid
A címbeli ketont az előbbi A) lépésben kapott alkoholból készítjük 69%-os hozammal, a Swem-féle oxidációs eljárást alkalmazva, melyet a 4. példa D) lépésében leírtunk.
1^=0,30 (etil-acetát/petroléter 3:7)
Elemanalízis-adatok a C29H39F2N3O5Si.0,5H2O képletre: számított: C: 59,57%, H: 6,90%, N: 7,19%;
talált: C: 59,65%, H: 6,89%, N: 7,00%.
9. példa
6-[N-(Benzil-oxi-karbonil)-L-valil]-amino-4,4-difluor-l-fenil-7-metil-3,5-dioxo-oktán előállítása [(89) képletű vegyület]
A) lépés: Benzil-oxi-karbonil-L-valil-valinal
A címbeli aldehidet 43%-os hozammal állítjuk elő N-(benzil-oxi-karbonil)-L-valil-L-valin-etil-észterből, a 3. példa D) lépésében leírt redukciós módszenei.
Rf=0,25 (szilikagél, etil-acetát/petroléter 3:7)
MS: MH+=335, MNH4+=352.
B) lépés: 6-[N-(Benzil-oxi-karbonil)-L-valil]-amino-4,4-difluor-l-fenil-7-metil-8-hidroxi-3-oxo-oktán
A címbeli difluor-alkoholt 39%-os hozammal kapjuk az előbbi A lépésben előállított aldehidből és 1klór-l,l-difluor-2-oxo-4-fenil-butánból, az 1. példa C) lépésében leírt eljárást követve.
Rf=0,43 (szilikagél, etil-acetát:petroléter 3:7). MS:MH+=519, MNR,+=536.
Elemanalízis-adatok a C2gH36F2N2O5 képletre: számított: C: 64,85%, H: 7,00%, N: 5,40%; talált: C: 65,11%, H: 7,25%, N: 5,27%.
C) lépés: 6-[N-(Benzil-oxi-karbonil)-L-valil]-amino-4,4-difluor-l-fenil-7-metiI-3,5-dioxo-oktán
A címbeli diketont megkapjuk az előbbi B) lépésben előállított alkoholból, Swem-oxidációval, melyet a 4. példa D) pontjában írtunk le (34%-os hozam). Rf=0,31 (szilikagél, etil-acetát/petroléter 2:8) MS:MH+=517, MNH4 +=534.
Elemanalízis-adatok a C^H^^Os képletre: számított: C: 65,10%, H: 6,63%, N: 5,42%; talált: C: 65,22%, H: 6,90%, N: 5,05%.
10. példa
A találmány szerinti vegyületek azon aktivitását, hogy megelőzik vagy csökkentik a β-amiloid plakkok akkumulációját, és így a vegyületek alkalmazhatóságát az Alzheimer-típusú senilis dementia kezelésére, és más olyan állapotok kezelésére, amelyekről ismertek, hogy β-amiloid plakk-képződéssel járnak - ilyen a Down-szindróma - számos olyan in vitro és in vivő kísérlettel mutathatjuk be, amellyel a β-amiloid plakkok képződését modellezzük. így például a találmány szerinti vegyületeknek azt a képességét, hogy megelőzik vagy csökkentik a β-amiloid plakkok akkumulációját, számos celluláris és sejtmentes in vitro eljárással mutathatjuk ki, amelyeket az 1-3. meghatározásokként a következőkben ismertetünk. Ezek a mérések azon a tényen alapulnak, hogy a natív β-ΑΡΡ-t minden sejt kifejezi és processzálja 11-12 KDa C-terminális fragmensek és β-amiloid termelésére. A β-ΑΡΡ expresszió endogén szintjét kívánt esetben növelni lehet úgy, hogy βΑΡΡ cDNS-szekvenciákat, például β-ΑΡΡ(751)-ί transzfektálunk a sejtekbe standardmódszerek alkalmazásával.
Az alábbiakban ismertetésre kerülő in vitro vizsgálatok alkalmazásával meghatároztuk néhány, találmány szerinti vegyületnek a katepszin D enzim gátlására vonatkozó ICjo-értékétí és az eredményeket a következő táblázatban foglaltuk össze.
ic50
4. példa szerinti vegyület 2,1 χ 10~s
7. példa szerinti vegyület 5,0 χ 10-4
8. példa szerinti vegyület 3,8 χ 10~8
Az IC50-értékeket tehát in vitro körülmények között mértük, oly módon, hogy borjúlépből nyert, a kereskedelemben kapható enzimet és hemoglobinszubsztrátot használtunk.
HU 221 629 Bl
In vitro vizsgálatok
1. meghatározás: Immunlecsapás
Sejtek: CHO-K1 [kínaihörcsög-petefészek (Chinese Hamster Ovaiy); ATCC-eredetű] sejtvonalat stabilan transzfektálunk, hogy nagy mennyiségű β-ΑΡΡ-695-öt fejezzünk ki, és ez „CP-6-36” elnevezéssel szolgál inhibitorok szkrinelésére. Más emlős tenyésztett sejtvonalakat is használhatunk és használtunk már. Például az SKN-MC (ATCC eredetű) humánidegsejt-sejtvonal jó eredményeket ad azonos meghatározási körülmények között. A β-ΑΡΡ-695-tel végzett transzfekciő nem feltétele a βΑΦ-ίβπηβΙέβηβ^ csupán megnöveli a βΑ4 szignált. Kísérleti célra való előkészítés során a CP-6-36 sejteket kis sejtsűrűséggel 10 cm-es (Petri)-csészékbe oltjuk és 2-4 napon át tenyésztjük egybefüggő monolayerré (~1,5 χ 10~7 sejt/csésze) 37 °C (5% CO2 inkubátorban; a tápoldat összetétele DMEM 21/Coon’s F12 (1:1)+10% FBS fetális borjúsavó)+50 U/ml penicillin+50 pg/ml sztreptomicin.
Kezelés: Minden vegyületet kezdeti lépésként CP6-36 sejteken szűrünk 200 μΜ dózisban. A vizsgálatot megelőzően mindegyik vizsgálandó vegyületből 20 mM törzsoldatot készítünk oldószerként sejtkultúratisztaságú DMSO-t használva. Mindegyik 20 mM törzsoldatot ezután 100-szorosára hígítjuk olyan szérummentes EMEM-médiumban, amely nem tartalmaz tisztein és metionin aminosavakat („Cys-/Met-EMEM”), így a tápoldatban (médiumban) a vegyület végső koncentrációja 200 μΜ lesz. A kísérlet kezdetén a sejteket „kiéheztetjük” ciszteinre és metioninra úgy, hogy a sejtmonolayereket 3-szor mossuk 3 ml/Petri-csésze Cys-/MetEMEM-mel, majd inkubáljuk (37 °C/5% CO2) csészékként 3 ml azonos médiummal 15 percen át. Ezt a médiumot leszívatjuk a csészékről, majd az egyes vegyületeket 200 μΜ koncentrációban tartalmazó tápoldatokat adunk a tenyészethez csészékként 3 ml mennyiségben. Ezeket a lemezeket (Petri-csészéket) és egy „kontroll”csészét (3 ml/csésze Cys-/Met-EMEM, amely 1% DMSO-t tartalmaz, de vegyületet nem tartalmaz), a fentiek szerint 15 percig inkubáljuk. Ezt a tápoldatot (médiumot) leszívatjuk, majd mindegyik csészéhez további, az előző lépésben használt médiumot adunk, amely ezúttal ~150 pCi/ml 35S-transz jelzőt (35S-jelzett ciszteint és metionint) tartalmaz. A sejteket a fentiek szerint 4 órán át inkubáljuk.
A tenyészet összegyűjtése: A 4 órás jelzési periódus végén a sejteket megfigyeljük mikroszkóp alatt általános megjelenésük szempontjából, valamint a vegyületek összes (gross) toxikus hatásának ellenőrzése céljából, ami után a sejteket tartalmazó csészéket jégre helyezzük. A kondicionált közeget mindegyik csészéből 15 ml-es, kónuszos, csavarmentes kupakú csövekbe visszük át, 10 percen át centrifugáljuk 2000 rpm-en, és egy sorozat hasonló csőbe visszük át, így minden pelletált sejt visszamarad. A jelzett sejtmonolayereket ezután háromszor mossuk 2 ml/csésze foszfátpufferes sóoldattal (PBS), majd 1 ml olyan puffért adunk mindegyik csészéhez, amely elősegíti a sejtek roncsolását (lízisét) (5% Triton X-114; 20 mM trisz, pH=7,5; 300 mM NaCl; proteázinhibitorok), és ezt követően percig jégen inkubáljuk ezeket a mintákat. A sejtlizátumokat lekaparjuk a csészékről, és 1,5 ml-es mikrofügacsövekbe visszük át. A lizátumokat ezután 4 percig nagyfrekvenciás hanggal kezeljük jégen, nagy sebességgel centrifugáljuk 10 percen át egy mikrocentrifugában (mikrofügában) majd 15 ml-es kónuszos, csavaros fedelű csövekbe visszük át, így visszamarad a sejtmaradványok pelletje.
Immunlecsapás: Az immunlecsapásra való előkészítés során az előbbiek szerint összegyűjtött lizátumokat 5 ml 1 xRIPA-pufferban (10 mM trisz, pH=80; 150 mM NaCl; 0,125% NaN3; 1% Triton X-100; 1% dezoxikolát; 0,1 SDS) oldjuk; a kondicionált médium (tápoldat)-mintákkal hígítás nélkül végzünk immunlecsapást. Mind a kondicionált médiumokat, mind a lizátumokat először előderitjük úgy, hogy minden mintához 5 μΐ normál nyúlszérumot adunk, a mintákat szobahőmérsékleten rázzuk (himbáljuk), majd RIPA-pufferral készült, 100 μΐ 10%-ós protein A-Sepharose (PÁS) oldatot adunk hozzájuk, és szobahőmérsékleten 1,5 órán át rázzuk (himbáljuk) azokat. A mintákat ezután 3000 rpm-en centrifugáljuk, és a felülúszókat új 15 ml-es csövekbe visszük át. Az előderített lizátumokkal ezután immunlecsapást végzünk úgy, hogy mindegyik csőhöz 30 μΐ olyan antitestet adunk, amely felismeri a β-ΑΡΡ kaiboxiterminusát, a mintákat szobahőmérsékleten 10 percig rázzuk, ezután hozzáadunk 100 μΐ 10%-os PAS-t és szobahőmérsékleten 1,5 órán át rázzuk a mintákat. Az előderített médiummintákkal azonos módon végzünk immunlecsapást, azonban a karboxiterminusra irányuló antitest helyett 45 μΐ olyan antitestet használunk, amely a βΑ4-βί ismeri fel. Ezután minden mintát 1 percig centrifugálunk 3000 rpm-en, így pelletáljuk a PAS-antitest-komplexeket, és a kapott pelletet alaposan mossuk; négyszer nagy sótartalmú pufferral (50 mmol/1 trisz, pH=7,5; 500 mmol/1 NaCl; 5 mM EDTA; 0,5% Nonidet P-40), majd kétszer 10 mmol/l-es trisz pufferral (pH=7,5).
Gélelektroforézis: A kimosott pelleteket 5 percen át forraljuk 50 μΐ 2xLaemmli géltöltő (gél loading) pufféiban. Ezeket a mintákat, valamint a molekulatömegmarkereket rátöltjük egy 16,5%-os SDS-poliakrilamid gélre trisz/Tricine rezervoár pufferokkal. Elektroforézist végzünk 90V-on -18-20 órán át, 20% metanol/20% ecetsav elegyben rögzítjük, majd szűrőpapíron szárítjuk a mintákat 65 °C-on, 2 órán át. Autoradiográfiával tesszük láthatóvá az eredményt.
Analízis: Az eredményeket az autoradiogram analízisével kapjuk meg. Pozitív hatóanyag egy olyan vegyület, amely gátolja a 4 kDa βΑ4 fehérjesávot a kontrolimintához viszonyítva, ezen felül némelyik növelheti a 9-12 kDa C-terminális fehéijesávok szintjét a kontrolimintához viszonyítva. A pA4-gátlást vagy a C-terminális sávok növelését a sávok denzitometriás értékelésével határozhatjuk meg mennyiségileg úgy, hogy a mérést kontrollsávokra vonatkoztatva normalizáljuk. Negatív hatóanyag az olyan vegyület, amely nem okoz változást a 4kDa βΑ4 vagy 9-12 kDa C-terminális fehéijesávok hozamában a kontrollminta sávjához viszonyítva.
HU 221 629 Bl
További vizsgálat: Ha megállapítottuk, hogy egy vegyület aktív (vagyis a gélanalízissel kimutattuk a 4 kDa βΑ4 lényeges gátlását az azt kísérő C-terminális fragmensnövekedéssel), akkor dózis-válasz kísérletet végzünk, hogy meghatározzuk azt a legkisebb dózist, ami a fenti hatás megnyilvánulásához szükséges. Tipikusan 12,5-300 mol/1 dózistartományt vizsgálunk, és e dózisváltoztatástól eltekintve a kísérletet ugyanúgy folytatjuk le, amint azt az előbbiekben ismertettük. Ha egy vegyületnél csak gyenge hatást tapasztaltunk vagy egyáltalán nem találtunk hatást, a kísérletet nagyobb dózisokkal, tipikusan 400 pmol/l dózissal megismételjük. Ha egy vegyületet toxikusnak találtunk (vagyis a sejtek nem látszanak egészségesnek mikroszkópos megfigyeléssel, vagy úgy találjuk, hogy a lizátumok nem jelződtek jól a gélanalízis után), a vegyületet kisebb dózisokkal, például 25, 50 és 100 pmol/l dózisokkal újra teszteljük, hogy megállapítsuk a vegyület hatását nem toxikus dózisok esetén.
2. meghatározás: Radioimmunoassay
Médiumok készítése és Sepak-koncentrálása RIA céljára:
Tenyésztett emlőssejtek, úgymint kínaihörcsögpetefészek- (CHO) sejtek vagy humán neuron SK-N-MC sejtek β-amiloidot termelnek, és ezt a peptidet a tápközegbe választják ki. Ha a sejteket a β-amiloid-képződés potenciális inhibitoraival kezeljük, a kezelt sejtek tápközegében nem mutathatunk ki oldható β-amiloidot. Úgy mint az 1. meghatározásnál, az inhibitorvegyületek változó dózisait tesztelhetjük, 200 μΜ dózissal kezdve. A CHO-sejtek esetén mind a vad típusúak, mind a βΑΡΡ-695-tel transzfektáltak esetén 10 cm-es lemezeket inkubálunk 2 ml szérummentes EMEM-ben 4-6 órán át, 37 °C-on a vizsgálandó inhibitor vegyület jelenlétében vagy távollétében. A tápoldatot eltávolítjuk és 10 percen át centrifugáljuk 1500 rpm-en (Sorvall RT 6000 B), hogy eltávolítsunk minden sejtet/sejtmaradványt. A tápoldatot vagy azonnal felhasználjuk vagy -20 °C-on tároljuk.
A Sepak C18 lépést azért végezzük el, hogy eltóvolítsuk a sókat és más nemkívánatos szennyezőket, továbbá töményítsük a β-amiloid peptideket. 2 ml tópoldatmintát bocsátunk át egy Cl 8 Sepak tölteten, és a töltetet (cartridge) 2 ml 5%-os CH3CN-ben (0,1%-os TFA-ban) mossuk. Az átbocsátott anyagot és az 5%-os CH3CN mosófolyadékot eldobjuk. A töltetet 2 ml 25%os CH3CN-nel (0,1 %-os TFA-ban), majd 2 ml 50%-os CH3CN-nel (0,1%-os TFA-ban) eluáljuk. Mindkét eluátumot összegyűjtjük és gyorsbepárlóban (speedvac) szárítjuk, majd 125 μ1-250 μΐ 10% izopropanolt tartalmazó vízzel felvesszük RIA-meghatározás céljára. A 25%-os CH3CN frakció tartalmazza a tápoldatból származó fenolvörös legnagyobb részét, de nem tartalmaz β-anúloid peptidet. Az 50%-os CH3CN-nel kapott frakció tartalmazza a β-amiloid peptideket.
I25I-jelzett β-amiloid 1-40 előállítása és HPLC tisztítása:
pg szintetikus β-amiloid 1-40-et jelzünk 1 mCi 125I-dal klóramin T módszerrel. A reakciót szobahőmérsékleten végezzük. Eppendorf-csőben 10 pl 125I-ot (1 mCi NaOH-oldatban) adunk 10 pl β-amiloid 1-40hez (1 ml/ml 20%-os izopropanolban) és 80 pl Na-foszfátot pH=7,4 értéken, és a komponenseket összekeverjük. A reakciót 30 pl klóramin T (1 mg/ml, 0,1 mol/1 foszfátban, pH=7,4) hozzáadásával indítjuk meg, az elegyet összekeverjük, és 1 percig inkubáljuk. A reakciót 50 pl Na-metabiszulfit (2 mg/ml, 0,1 mol/1 foszfát, pH=7,4) adagolásával állítjuk le.
A reakcióelegyet (280 μΐ) azonos térfogatú vízzel felhígítjuk, és Sepak C18 tölteten engedjük át, hogy elválasszuk a jelzett peptidet. A Sepak töltetet kétszer mossuk 5%-os CH3CN-nel (1-1 ml), majd háromszor eluáljuk 50%-os CH3CN-nel (1-1 ml), és újból kétszer mossuk 95%-os CH3CN-ben (1-1 ml). Majdnem az összes jelzett peptid eluálódik az első 50%-os CH3CNnel végzett elúció során. Ezt az eluátumot -70 °C-on toroljuk, és HPLC-vel tisztítjuk a RIA-meghatározás követelményeinek megfelelően.
A jelzett peptidet fordított bázisú HPLC-vel tisztítjuk C8 oszlopon (cartridge-on) (4,6 mmx 3 cm, Brownlee). Az oszlopot 0,1%-os TFA-ban lévő 5%-45% CH3CN lineáris gradienselúcióval működtetjük 30 percig 0,5 ml/min áramlási sebességgel. 0,5 ml-es frakciókat gyűjtünk és számláljuk azokat. A jelzett peptidet tartalmazó csúcsfrakciót -20 °C-on tároljuk, és 3 napon belül felhasználjuk RIA-meghatározásra.
Radioimmunoassay: A RIA-mérésekben a következő pufferokat használjuk: 1. RIA-puffer, összetétele 0,lM Na-foszfát, pH=7,4, amely 0,1% BSA-t és 0,1% Triton-X-100-at tartalmaz; 2. mintapuffer: 10% izopropanol vízben; 3. tracer puffer: 0,2M Na-foszfát, pH=7,4, amely 0,1% BSA-t és 0,1% Triton-X-100-at tartalmaz. A β-amiloid-specifíkus antitesteket hígításokban használjuk, ahol a jelzett peptidnek körülbelül 30%-a van megkötve a versengő ligandum távollétében. Az antitesthígításokat RIA-pufferral készítjük. A RIA-ban felhasznált antitestek három különböző szérumot foglalnak magukban, amelyeket humán βamiloid 1-40 szintetikus peptiddel szemben termeltünk (BA#1, BA#2 és 6514). A BA#l-et 1/900, a BA#2-t 1/1600 és a 6514-et 1/2500 hígításban használjuk. A HPLC-vel tisztított jelzett peptidet tracer puffetban oldjuk úgy, hogy 50 μΐ-nek 7000 és 9000 cpm közötti legyen az aktivitása. Teljes kiszorítást végzünk nagy koncentrációjú (2,5 μτηοΐ/ΐ) β-amiloid 1-40 jelenlétében. A β-amiloid 1-40 standardokat mintapufferral készítjük. A meghatározási térfogat 200 μΐ. A komponenseket a következő sorrendben adagoljuk:
100 μΐ Ab (antitest) RIA-pufferban 50 μΐ ismeretlen minta vagy standard, vagy TD mintapufferban μΐ jelzett peptid (7000-9000 cpm tracer pufferban).
A mintákat összekeveijük és egy éjjelen át 4 °C-on inkubáljuk. A kötött aktivitásnak (count) a szabad aktivitástól való elválasztása céljából a meghatározást polietilénglikollal (PEG) állítjuk le. Mindegyik mérőcsőhöz 50 μΐ normál nyúlszérumot adunk, majd 800 μΐ PEG-et (Mw 6000-8000, 15,8% RIA pufferban). A mintákat 10 percig inkubáljuk 4°-on, majd 3200 rpm-en 20 percen
HU 221 629 Bl át inkubáljuk (Sorvall, RT600 B). A felülúszót leszívatjuk, és a pellet aktivitását gamma-számlálóval méljük.
Értékelés: Az antitestmegkötésből származó eredményeket a jelzett β-amiloid tracer kiszorítása alapján értelmezzük. Pozitív az az eredmény, amely esetén nem figyelhető meg a tracer kiszorítása, vagyis a médium nem tartalmaz kiválasztott (szekretált) β-amiloidot, ami azt jelzi, hogy a vizsgált vegyület hatékonyan gátolja a β-amiloid-termelést. Negatív az az eredmény, amelyben megfigyelhető a tracer kiszorítása antitestkötés miatt, és ekvivalens a kezeletlen kontrollsejtekkel.
Enzimimmunoassay-t (ELISA, enzimhez kötött immunoszendvics assay) ugyancsak alkalmazhatunk az aktív vegyületek azonosítására. β-Amiloid fehérjét termelő emlőssejteket (úgymint CHO CP-6 vagy SK.-NMC sejteket) tenyésztünk, majd az 1. meghatárosban leírt vegyületekkel kezelünk azzal a különbséggel, hogy a sejtfehérje radioaktív jelzését elhagyjuk. A kezelt sejtkultúrákból kondicionált médiumot gyűjtünk, és kis fordulatszámon végzett centrifügálással megtisztítjuk a sejtmaradványoktól. A kondicionált médiumot ezután 96 mérőhelyes ELISA mérőlapon vizsgáljuk βamiloid-specifíkus antitestek alkalmazásával. Egy βamiloid antitest befogóreagensként szolgál a médiummintában jelen lévő β-amiloid számára, egy második β-amiloid-specifikus antitest, amely egy eltérő epitópot ismer fel a β-amiloid fehéijék, a detektorkomplex egy komponenseként szolgál. A második β-amiloid antitestet biotinnal konjugáljuk, amit streptavidinnal lehet kimutatni. Egy harmadik antitestet - ami torma-peroxidázhoz van kapcsolva - használunk fel a β-amiloid: antitest :streptavidin komplex kimutatására. Orto-feniléndiamin-szubsztrát, valamint H2O2 és citrát-foszfát pH=5,0 hozzáadásával biztosítjuk a peroxidázaktivitást, amit mennyiségileg úgy határozunk meg, hogy méijük az elegy kolorimetriás változását OD 490 nm értéken. Tipikus esetben minden tápközeg (médium)mintából háromszoros hígitási sorozatot készítünk a 96 mérőhelyes lemezen, valamint egy standard, szintetikus β-amiloid 1-40 fehéijéét. Pozitív eredményt akkor kapunk, ha csekély reaktivitást figyelünk meg vagy nem tapasztalunk reaktivitást (vagyis abszorbanciát OD 490 nm-nél), tehát nincs jelen β-amiloid fehéije a tápközegmintában, a vizsgált vegyület gátló hatása következtében. Részlegesen aktív inhibitorok mutatnak némi abszorbanciát OD 490 nm-nél, de ez nem ekvivalens a kezeletlen sejtekből nyert kontroll médiummintákéval. Pontos mennyiségi meghatározást végezhetünk, ha a mintákkal nyert adatokat a standardéval összehasonlítjuk.
In vivő vizsgálatok
A találmány szerinti vegyületek azon aktivitását, hogy megelőzik vagy csökkentik a β-amiloid plakkok felhalmozódását, kimutathatjuk, a β-amiloid plakk akkumuláció transzgenikus modelljeiben (például transzgenikus egérben vagy transzgenikus patkányban), valamint kutyamodellben, amelyben természetes, a βamiloid plakk-képződésre genetikailag hajlamos kutyákat használunk fel. Olyan transzgenikus egereket, amelyek felülmúlják a humán β-ΑΡΡ (751) vagy β-ΑΡΡ (770) kifejezését a neuronsejtekben, és az Alzheimerkórral összefüggő hisztopatológiát mutatnak, például a PCT/US91/04447 számú szabadalmi bejelentés ismertet. Ilyen állatmodellekben a β-amiloid plakk-képződéssel együtt járó bisztopatológia és/vagy szimptómák, úgymint az emlékezetvesztés csökkenése használható fel annak bemutatására, hogy a vegyületek képesek kezelni az olyan terápiás állapotokat, amelyek a βamiloid plakkok képződéséből származnak, úgymint az Alzheimer-kórt és a Down-szindrómával együtt járó emlékezetgyengülést.
Minthogy a hisztopatológia a transzgenikus egérben gyakoribb az állat idősebb korában, két hónapos egereket kívánatos felhasználnunk. A két hónapos állatokban minimális a patológiás elváltozás, amely az idővel növekedik az inhibitorszer távollétében. Az egerek egy csoportja (n= 12) csak vehikulumot kap; egy második csoport (n=12) kis dózisú szert, egy harmadik csoport (n=12) mérsékelt dózist; és a negyedik csoport (n=12) nagy dózist. A dózist az előbbi meghatározások alapján határoztuk meg a testtömeg, a vegyület felezési ideje, stb. figyelembevételével. Ideális esetben az egereket több hónapon át kezeljük. A vegyületeket beadhatjuk injekcióban, orális úton, nyújtott hatású implantátumban, stb. amint azt a vegyületprofil megszabja. A kezelés értékelését immunhisztokémiai eljárások alkalmazásával végezzük: β-amiloid immunreaktív depozitumok gyakoriságát határozzuk meg az agy 4 coronalis középső (midline) szekciójában úgy, hogy a bemetszéseket olyan személy teszi meg, aki nem ismeri a kísérleti kezelést. A patológiás elváltozás egy másik megnyilvánulását, az Alz50 immunreaktivitást, ugyancsak meghatározzuk az előfordulás gyakoriságára nézve, azonos számú agyszövetdarabot használva fel minden egérből. A gyógyszerhatás pozitív eredménye, ha e két patológiás marker egyáltalán nem vagy kisebb gyakorisággal fordul elő. Pszichológiai és/vagy viselkedési megfelelés, ami egyedülálló a β-amiloid transzgenikus egérre nézve, szintén felhasználható a gyógyszerbatás kimutatására.
A szakirodalomban beszámoltak arról, hogy bizonyos kutyafajtáknál ugyancsak előfordultak β-amiloidfelhalmozódások [Giaccone et al., Neuroscience Letters, 114, 178-183 (1990)], továbbá idős, nem humán főemlősöknél szintén kimutattak β-amiloid patológiás jelenséget, valamint az emlékezet romlását [Cork et al., American Journal of Pathology, 137, 1383-1392 (1990); Podlisny et al., American Journal of Pathology, 138, 1423-1425 (1991)]. A kutyákkal és a nem humán főemlősökkel végzett vizsgálatok némileg eltérő kísérleti tervezés szerint folytak le úgy, hogy a gyógyszert hosszabb időn át adagolták.
Valamely (IB) általános képletű vegyület vagy egynél több (IB) általános képletű vegyület elegyének bármely hatékony mennyiségét beadhatjuk a páciensnek abból a célból, hogy megelőzzük β-amiloid plakkok abnormis lerakódását, és olyan betegséget vagy állapotot kezeljünk, amely velejárója a β-amiloid plakk abnormis lerakódásának, mint amilyen az Alzheimer-típusú
HU 221 629 Bl senilis dementia vagy a Down-szindróma. A β-amiloid plakk abnormis lerakódásának megelőzésére, és az Alzheimer-típusú senilis dementia vagy a Downszindróma kezelésére alkalmas specifikus dózisok olyan faktoroktól függenek, mint a páciens tömege, típusa és kora, valamint a betegség vagy állapot súlyossága, mindezen faktorok szokásosan ismertek a beteget kezelő orvos számára, aki figyelembe veszi azokat. A vegyületeket általában 0,2-20 mg/testtömeg-kg, előnyösen 0,5-5 mg/testtömeg-kg dózisban adjuk be. A vegyületeket beadhatjuk egyszeri vagy többszörös dózisegységekben, amelyek 25 mg-250 mg (I) általános képletű vegyületet tartalmaznak.
Orális adagolás céljára a vegyületeket szilárd vagy folyékony készítményekké formulálhatjuk, igy kapszulákká, pilulákká, tablettákká, pasztillákká, porokká, oldatokká, szuszpenziókká vagy emulziókká. A szilárd egységdózis lehet kapszula, amely szokásos zselatin típusú leheL és amely tartalmaz például lubrikánsokat és inért töltőanyagokat, úgymint laktózt, szacharózt vagy kukoricakeményítőt. Egy másik kivitelben az (I) általános képletű vegyületeket szokásos tabletta-alapanyagokkal, úgymint laktózzal, szacharózzal és kukoricakeményítőval, kötőanyagokkal, úgymint akácmézgával, kukoricakeményítővel vagy zselatinnal, szétesést elősegítő szerekkel, úgymint burgonyakeményítővel vagy alginsawal, továbbá lubrikánsokkal, úgymint sztearinsawal vagy magnézium-sztearáttal együtt tablettázhatjuk.
Parenterális adagolási módban a vegyületeket beadhatjuk oldataik vagy szuszpenzióik injektálható dózisaiként, amikor is a vegyületeket fiziológiailag elfogadható hígítószerben oldjuk vagy szuszpendáljuk gyógyszerészeti vivőanyaggal együtt, amely lehet steril folyadék, úgymint a víz, alkoholok, olajok és más elfogadható szerves oldószerek, felületaktív anyagok, más gyógyszerészetileg elfogadható adjuvánsokkal vagy azok nélkül. A találmány szerinti készítményekben felhasználható olajokra példák az ásványi, állati, növényi vagy szintetikus eredetű olajok, például a földimogyoró-olaj, szójaolaj, és ásványi olaj. Előnyös folyékony hordozóanyagok, különösen injektálható oldatok céljaira, általában a víz, sóoldat, vizes szacharóz és hasonló cukoroldatok, az etanol és glikolok, úgymint a propilénglikol vagy polietilénglikol vagy a 2-pirrolidon.
A vegyületeket beadhatjuk depó injekció vagy olyan cerebrális implantátum formájában, amely úgy van formuláivá, hogy lehetővé teszi a hatóanyag elnyújtott felszabadulását A hatóanyagot pelletekké vagy kicsiny hengerekké préselhetjük, és beültethetjük szubkután, intramuszkulárisan, intracerebrálisan depó injekciók vagy implantátumok formájában. Az implantátumokhoz inért anyagot, úgymint biológiailag lebontható polimereket vagy szintetikus szilikonokat, például Silastic®-t, a Dow Corning Corp. által gyártott szilikongumit alkalmazhatunk.
A találmány szerinti vegyületeket beadhatjuk topikálisan is. Ezt úgy végezhetjük, hogy egyszerűen oldatot készítünk a beadandó vegyületbŐl, előnyösen olyan oldószerrel, amelyről ismert, hogy elősegíti a transzdermális abszorpciót, úgymint etanollal vagy dimetil-szulfoxiddal (DMSO) excipienssel vagy anélkül. Topikális adagolást előnyösen tapasszal végzünk, amely lehet akár rezervoár és porózus membrán típusú, akár szilárd mátrixváltozat.
Alkalmas transzdermális eszközöket ismertetnek a 3 742 951, a 3 797 494, a 3 996 934 és a 4 031 894 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírások. Ezek az eszközök általában tartalmaznak egy tartó (támasztó)-elemet, amely az eszköz valamelyik felszínét képezi, egy hatóanyagot átengedő adheziv réteget, amely a másik felszínt képezi, továbbá legalább egy rezervoárt (tárolóelemet), amely a hatóanyagot tartalmazza a két felszíni felület között. Alternatív módon a hatóanyagot számos mikrokapszula is tartalmazhatja, amely a permeábilis adheziv rétegen szét van oszlatva. A hatóanyag mindkét esetben folyamatosan szállítódik a rezervoárból vagy a mikrokapszulákból egy membránon át a hatóanyagot átengedő tapadórétegbe, amely a befogadó szervezet bőrével vagy nyálkahártyájával kontaktusban van. Ha a hatóanyag a bőrön keresztül abszorbeálódik, a hatóanyag szabályozott és előre meghatározott áramát adagoljuk a szervezetbe. Mikrokapszulák esetén a kapszulázószer membránként is funkcionálhat.
Egy másik eszközben, amely szintén transzdermális adagolásra szolgál a találmány értelmében, a gyógyszerhatóanyagot egy mátrix tartalmazza, amelyből a kivánt mennyiség fokozatos, állandó és szabályozott sebességgel szállítódik. A mátrix diffúzió vagy mikropórusos áramlás révén permeábilis a vegyület felszabadulásával szemben. A felszabadulás sebességmeghatározó. Egy ilyen rendszert, amely nem igényel membránt, a 3 291 636 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás ismertet Ezekben a rendszerekben legalább két típusú felszabadulás lehetséges. A felszabadulás akkor megy végbe diffúzió révén, ha a mátrix nem porózus. A gyógyszerészetileg hatékony vegyület feloldódik magában a mátrixban és azon keresztül diffundál. Mikropórusos áramlás útján akkor megy végbe a felszabadulás, ha a gyógyszerhatóanyag egy folyékony fázis révén szállítódik a mátrix pórusaiba.
Amint az számos olyan vegyületcsoportra igaz, amelyek általában alkalmasak bármely adott farmakológiai hatás elérésére és terápiás végfelhasználásuk van, az osztályok bizonyos alcsoportjai és bizonyos specifikus tagjai előnyösek átfogó terápiás indexük és biokémiai, valamint farmakológiai profiljuk folytán.
Előnyösek azok a vegyületek, amelyeknél az 1-6 szénatomos alkilcsoport jelentése előnyösen 1-3 szénatomos alkiléncsoport és előnyösebben metilén- vagy etiléncsoport, a legelőnyösebben elágazó láncú etiléncsoport és a KP2 molekularész előnyösen valint vagy alantot tartalmaz.

Claims (8)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. A Ka-P2 a-NH-CH(Ra)-C(=O)-Xa (IB) általános képletű vegyületek, azok hidrátjai, sztereoizomeijei és gyógyszerészetileg elfogadható sói, ahol az (IB) általános képletben:
    ha Xa jelentése hidrogénatom, akkor Ra jelentése CH2Si(l-6 szénatomos alkil)2-(2-6 szénatomos alkenil)-csoport, CH2Si(l-6 szénatomos alkil)2-fenil-cso15
    HU 221 629 Β1 port vagy NHC(=O)-fenil-csoporttal szubsztituált benzilcsoport; vagy ha Xa jelentése CF2C(=O)-fenetil-csoport, akkor Ra jelentése 1-7 szénatomos alkilcsoport, de terc-butil-metil-csoporttól eltérő; vagy 5 ha Xa jelentése CF2C(=O)NHCH2Si(l-6 szénatomos alkil)3-csoport, akkor Ra jelentése benzilcsoport,
    P2 a jelentése Leu, Alá, Ile, Val, Nva, Nle vagy tercleucin aminosavmaradék;
    Ka jelentése benzil-oxi-karbonil-csoport. 10
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti olyan (IB) általános képletű vegyületek, azok hidrátjai, sztereoizomeijei vagy gyógyszerészetileg elfogadható sói, melyekben Xa jelentése CF2C(=O)NHCH2Si(l-6 szénatomos alkil)3csoport, a többi szubsztituens jelentése az 1. igénypont- 15 bán megadott.
  3. 3. A 2. igénypont szerinti olyan (IB) általános képletű vegyületek, azok hidrátjai, sztereoizomeijei és gyógyszerészetileg elfogadható sói, melyekben Xa jelentése CF2C(=O)NHCH2Si(CH3)3-csoport, a többi szubszti- 20 tuens jelentése az 1. igénypontban megadott.
  4. 4. Az 1. igénypont szerinti (IB) általános képletnek megfelelő 4-[N-(benzil-oxi-karbonil)-L-(terc-leucil)]amino-2,2-difluor-3-oxo-5-fenil-N-(trimetil-szilil-metil)-pentánamid. 25
  5. 5. Az 1. igénypont szerinti (IB) általános képletnek megfelelő 2-[(benzil-oxi-karbonil)-L-valil]-amino-4,4difluor-l-fenil-7-metil-3,5-dioxo-oktán.
  6. 6. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti vegyület gyógyszerként való alkalmazásra. 30
  7. 7. Gyógyszerkészítmény, amely hatóanyagként az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti vegyületet, valamint egy gyógyszerészetileg elfogadható hordozóanyagot, és kívánt esetben adalék anyagokat tartalmaz.
  8. 9. Eljárás az (IB) általános képletű vegyületek, hidrátjaik, sztereoizomeijeik és gyógyszerészetileg elfogadható sóik előállítására, ahol az (IB) általános képletben ha Xa jelentése hidrogénatom, akkor Ra jelentése CH2Si(l-6 szénatomos alkil)2-(2-6 szénatomos alkenil)-csoport, CH2Si(l-6 szénatomos alkil)2-fenil-csoport vagy NHC(=O)-fenil-csoporttal szubsztituált benzilcsoport, vagy ha Xa jelentése CF2(=O)-fenetil-csoport, akkor Ra jelentése 1-7 szénatomos alkilcsoport, vagy ha Xa jelentése CF2C(=O)NHCH2Si(l-6 szénatomos alkil)3-csoport, akkor Ra jelentése benzilcsoport,
    P2 a jelentése Leu, Alá, Ile, Val, Nva, Nle vagy tercleucin aminosavmaradék,
    Ka jelentése benzil-oxi-karbonil-csoport, azzal jellemezve, hogy valamely Ka-P2a általános képletű csoportot, melyben Ka, P2a jelentése a tárgyi körben megadott, valamely N2H-CH(Ra)-C(=O)Xa általános képletű vegyülettel, amelyben Ra, Xa jelentése a tárgyi körben megadott, kapcsolunk, és kívánt esetben a kapott (IB) képletű vegyületet gyógyszerészetileg elfogadható sóvá alakítjuk, vagy valamely Ka-P2a általános képletű csoportot, amelyben Ka, P2a jelentése a tárgyi körben megadott, valamely H2N-CH(Ra)-CH(OH)Xa általános képletű vegyülettel, melyben Ra, Xa jelentése a tárgyi kőiben megadott, kapcsolunk, majd az igy kapott vegyületet oxidáljuk, és kívánt esetben a kapott (IB) képletű vegyületet gyógyszerészetileg elfogadható sóvá alakítjuk.
HU9600832A 1993-10-01 1994-09-20 Béta-amiloid fehérje képződést gátló peptidek, eljárás előállításukra és ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények HU221629B1 (hu)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP93402398 1993-10-01
PCT/US1994/010679 WO1995009838A1 (en) 1993-10-01 1994-09-20 INHIBITORS OF β-AMYLOID PROTEIN PRODUCTION

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HU9600832D0 HU9600832D0 (en) 1996-05-28
HUT74004A HUT74004A (en) 1996-10-28
HU221629B1 true HU221629B1 (hu) 2002-12-28

Family

ID=8214751

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9600832A HU221629B1 (hu) 1993-10-01 1994-09-20 Béta-amiloid fehérje képződést gátló peptidek, eljárás előállításukra és ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények

Country Status (19)

Country Link
EP (1) EP0721449B1 (hu)
JP (1) JPH09505281A (hu)
KR (1) KR100316865B1 (hu)
CN (1) CN1078886C (hu)
AT (1) ATE211129T1 (hu)
AU (1) AU687449B2 (hu)
CA (1) CA2171882C (hu)
DE (1) DE69429527T2 (hu)
DK (1) DK0721449T3 (hu)
ES (1) ES2170104T3 (hu)
FI (1) FI961438A0 (hu)
HU (1) HU221629B1 (hu)
IL (1) IL111078A (hu)
NO (1) NO308029B1 (hu)
NZ (1) NZ274074A (hu)
PT (1) PT721449E (hu)
TW (1) TW264480B (hu)
WO (1) WO1995009838A1 (hu)
ZA (1) ZA947529B (hu)

Families Citing this family (53)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0763055B1 (en) * 1994-06-02 1999-11-03 Merrell Pharmaceuticals Inc. Perfluoroalkyl ketone inhibitors of elastase and processes for making the same
NZ287604A (en) * 1994-06-02 1998-12-23 Merrell Pharma Inc Acylated enol derivatives as prodrugs of elastase inhibitors
US5804560A (en) * 1995-01-06 1998-09-08 Sibia Neurosciences, Inc. Peptide and peptide analog protease inhibitors
US5691368A (en) * 1995-01-11 1997-11-25 Hoechst Marion Roussel, Inc. Substituted oxazolidine calpain and/or cathepsin B inhibitors
US5849711A (en) * 1995-06-06 1998-12-15 Athena Neurosciences, Inc. Cathepsin and methods and compositions for inhibition thereof
US5783434A (en) * 1995-06-06 1998-07-21 Tung; Jay S. Cathepsin and methods and compositions for inhibition thereof
JPH11506923A (ja) * 1995-06-06 1999-06-22 アセナ ニューロサイエンシーズ,インコーポレイテッド 新しいカテプシンならびにその阻害のための方法および組成物
US6172044B1 (en) 1995-12-01 2001-01-09 Aventis Pharmaceuticals Inc. Acylated enol derivative of α-ketoesters and α-ketoamides
CA2191924A1 (en) 1995-12-05 1997-06-06 Kevin Felsenstein 5-amino-6-cyclohexyl-4-hydroxy-hexanamide derivatives as inhibitors of .beta.-amyloid protein production
US5703129A (en) * 1996-09-30 1997-12-30 Bristol-Myers Squibb Company 5-amino-6-cyclohexyl-4-hydroxy-hexanamide derivatives as inhibitors of β-amyloid protein production
US6211235B1 (en) 1996-11-22 2001-04-03 Elan Pharmaceuticals, Inc. Compounds for inhibiting β-amyloid peptide release and/or its synthesis
US6191166B1 (en) 1997-11-21 2001-02-20 Elan Pharmaceuticals, Inc. Methods and compounds for inhibiting β-amyloid peptide release and/or its synthesis
US6153652A (en) 1996-11-22 2000-11-28 Elan Pharmaceuticals, Inc. N-(aryl/heteroaryl/alkylacetyl) amino acid amides, pharmaceutical compositions comprising same, and methods for inhibiting β-amyloid peptide release and/or its synthesis by use of such compounds
US6642261B2 (en) 1997-11-21 2003-11-04 Athena Neurosciences, Inc. N-(aryl/heteroarylacety) amino acid esters, pharmaceutical compositions comprising same, and methods for inhibiting β-amyloid peptide release and/or its synthesis by use of such compounds
US6117901A (en) * 1996-11-22 2000-09-12 Athena Neurosciences, Inc. N-(aryl/heteroarylacetyl) amino acid esters, pharmaceutical compositions comprising same, and methods for use
EP0942923A2 (en) * 1996-11-22 1999-09-22 Elan Pharmaceuticals, Inc. N-(ARYL/HETEROARYL) AMINO ACID DERIVATIVES, PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS COMPRISING SAME, AND METHODS FOR INHIBITING $g(b)-AMYLOID PEPTIDE RELEASE AND/OR ITS SYNTHESIS BY USE OF SUCH COMPOUNDS
US6096782A (en) * 1996-11-22 2000-08-01 Athena Neurosciences, Inc. N-(aryl/heteroaryl) amino acid derivatives pharmaceutical compositions comprising same and methods for inhibiting β-amyloid peptide release and/or its synthesis by use of such compounds
AR016751A1 (es) * 1996-11-22 2001-08-01 Athena Neurosciences Inc Metodo para inhibir la liberacion del peptido beta-amiloide en una celula, composicion farmaceutica y compuestos utiles en dicho metodo
US6207710B1 (en) 1996-11-22 2001-03-27 Elan Pharmaceuticals, Inc. Compounds for inhibiting β-amyloid peptide release and/or its synthesis
DE19648793A1 (de) 1996-11-26 1998-05-28 Basf Ag Neue Benzamide und deren Anwendung
US6683075B1 (en) 1996-12-23 2004-01-27 Athena Neurosciences, Inc. Cycloalkyl, lactam, lactone and related compounds, pharmaceutical compositions comprising same, and methods for inhibiting β-amyloid peptide release and/or its synthesis by use
US6635632B1 (en) 1996-12-23 2003-10-21 Athena Neurosciences, Inc. Cycloalkyl, lactam, lactone and related compounds, pharmaceutical compositions comprising same, and methods for inhibiting β-amyloid peptide release and/or its synthesis by use of such compounds
US6506782B1 (en) 1998-02-27 2003-01-14 Athena Neurosciences, Inc. Heterocyclic compounds, pharmaceutical compositions comprising same, and methods for inhibiting β-amyloid peptide release and/or its synthesis by use of such compounds
US6958330B1 (en) 1998-06-22 2005-10-25 Elan Pharmaceuticals, Inc. Polycyclic α-amino-ε-caprolactams and related compounds
US6509331B1 (en) 1998-06-22 2003-01-21 Elan Pharmaceuticals, Inc. Deoxyamino acid compounds, pharmaceutical compositions comprising same, and methods for inhibiting β-amyloid peptide release and/or its synthesis by use of such compounds
US6552013B1 (en) 1998-06-22 2003-04-22 Elan Pharmaceuticals, Inc. Deoxyamino acid compounds, pharmaceutical compositions comprising same, and methods for inhibiting β-amyloid peptide release and/or its synthesis by use of such compounds
US6774125B2 (en) 1998-06-22 2004-08-10 Elan Pharmaceuticals, Inc. Deoxyamino acid compounds, pharmaceutical compositions comprising same, and methods for inhibiting β-amyloid peptide release and/or its synthesis by use of such compounds
US6569851B1 (en) 1998-06-22 2003-05-27 Elan Pharmaceutials, Inc. Cycloalkyl, lactam, lactone and related compounds, pharmaceutical compositions comprising same, and methods for inhibiting β-amyloid peptide release and/or its synthesis by use of such compounds
US6528505B1 (en) 1998-06-22 2003-03-04 Elan Pharmaceuticals, Inc. Cyclic amino acid compounds pharmaceutical compositions comprising same and methods for inhibiting β-amyloid peptide release and/or its synthesis by use of such compounds
US6737038B1 (en) 1998-11-12 2004-05-18 Bristol-Myers Squibb Company Use of small molecule radioligands to discover inhibitors of amyloid-beta peptide production and for diagnostic imaging
WO2000051998A1 (en) * 1999-03-02 2000-09-08 Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals, Inc. Compounds useful as reversible inhibitors of cathepsin s
US6420364B1 (en) 1999-09-13 2002-07-16 Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals, Inc. Compound useful as reversible inhibitors of cysteine proteases
AU2001261728A1 (en) 2000-05-17 2001-11-26 Bristol-Myers Squibb Pharma Company Use of small molecule radioligands for diagnostic imaging
US7423177B2 (en) 2001-03-05 2008-09-09 Transtech Pharma, Inc. Carboxamide derivatives as therapeutic agents
US6613801B2 (en) 2000-05-30 2003-09-02 Transtech Pharma, Inc. Method for the synthesis of compounds of formula I and their uses thereof
EP1268450A1 (en) 2000-06-01 2003-01-02 Bristol-Myers Squibb Pharma Company Lactams substituted by cyclic succinates as inhibitors of a-beta protein production
US6432944B1 (en) 2000-07-06 2002-08-13 Bristol-Myers Squibb Company Benzodiazepinone β-amyloid inhibitors: arylacetamidoalanyl derivatives
AU2002245590B2 (en) 2001-03-05 2006-06-29 Transtech Pharma, Inc. Benzimidazole derivatives as therapeutic agents
EP2324830A1 (en) 2002-03-05 2011-05-25 TransTech Pharma Inc. Process for the preparation of a monocyclic azole derivative that inhibits the interaction of ligands with rage
US7576206B2 (en) 2003-08-14 2009-08-18 Cephalon, Inc. Proteasome inhibitors and methods of using the same
US7223745B2 (en) 2003-08-14 2007-05-29 Cephalon, Inc. Proteasome inhibitors and methods of using the same
US7468383B2 (en) 2005-02-11 2008-12-23 Cephalon, Inc. Proteasome inhibitors and methods of using the same
KR100851035B1 (ko) 2005-08-23 2008-08-11 대한민국 GCP-Ⅱ를 유효성분으로 함유하는 β-아밀로이드의 뇌내축적 예방 및 치료용 약학적 조성물과 치료제 스크리닝용조성물 및 이를 이용한 스크리닝 방법
TWI517850B (zh) 2009-09-30 2016-01-21 Vtv治療有限責任公司 經取代之咪唑衍生物及其使用方法
WO2011087822A1 (en) 2009-12-22 2011-07-21 Cephalon, Inc. Proteasome inhibitors and processes for their preparation, purification and use
US9717710B2 (en) 2012-10-05 2017-08-01 Vtv Therapeutics Llc Treatment of mild and moderate Alzheimer's disease
CN108276435B (zh) * 2015-12-30 2020-04-14 南京中硼联康医疗科技有限公司 用于制备和β淀粉样蛋白特异性结合的化合物的中间体的制备方法
UA124672C2 (uk) 2016-06-21 2021-10-27 Оріон Офтальмолоджі Ллс Гетероциклічні похідні пролінаміду
JP7164521B2 (ja) 2016-06-21 2022-11-01 オリオン・オフサルモロジー・エルエルシー 炭素環式プロリンアミド誘導体
US11376200B2 (en) * 2018-02-02 2022-07-05 Agilent Technologies, Inc. Methods and kits for using blocked 2-AA for glycan analysis
WO2019190822A1 (en) 2018-03-28 2019-10-03 Vtv Therapeutics Llc Crystalline forms of [3-(4- {2-butyl-1-[4-(4-chloro-phenoxy)-phenyl]-1h-imidazol-4-yl} -phenoxy)-propyl]-diethyl-amine
WO2019190823A1 (en) 2018-03-28 2019-10-03 Vtv Therapeutics Llc Pharmaceutically acceptable salts of [3-(4- {2-butyl-1-[4-(4-chlorophenoxy)-phenyl]-1h-imidazol-4-yl} -phenoxy)-propyl]-diethyl-amine
CA3110582A1 (en) 2018-10-10 2020-04-16 Vtv Therapeutics Llc Metabolites of [3-(4-{2-butyl-1-[4-(4-chloro-phenoxy)-phenyl]-1h-imidazol-4-yl}-phenoxy)-propyl]-diethyl-amine

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5142056A (en) * 1989-05-23 1992-08-25 Abbott Laboratories Retroviral protease inhibiting compounds
AU600226B2 (en) * 1985-02-04 1990-08-09 Merrell Pharmaceuticals Inc. Novel peptidase inhibitors
CA2021660A1 (en) * 1989-07-26 1991-01-27 Philippe Bey Peptidase inhibitors
EP0572547A1 (en) * 1991-02-22 1993-12-08 The Du Pont Merck Pharmaceutical Company SUBSTITUTED $g(a)-AMINOALDEHYDES AND DERIVATIVES
CA2071621C (en) * 1991-06-19 1996-08-06 Ahihiko Hosoda Aldehyde derivatives

Also Published As

Publication number Publication date
JPH09505281A (ja) 1997-05-27
CA2171882A1 (en) 1995-04-13
ES2170104T3 (es) 2002-08-01
PT721449E (pt) 2002-06-28
FI961438A (fi) 1996-03-29
EP0721449B1 (en) 2001-12-19
KR960704839A (ko) 1996-10-09
NO308029B1 (no) 2000-07-10
NO961326L (no) 1996-04-01
IL111078A0 (en) 1994-11-28
AU687449B2 (en) 1998-02-26
DE69429527D1 (de) 2002-01-31
ZA947529B (en) 1995-05-29
HU9600832D0 (en) 1996-05-28
CN1132504A (zh) 1996-10-02
NO961326D0 (no) 1996-04-01
CA2171882C (en) 2001-12-04
DK0721449T3 (da) 2002-04-22
ATE211129T1 (de) 2002-01-15
FI961438A0 (fi) 1996-03-29
KR100316865B1 (ko) 2002-11-29
EP0721449A1 (en) 1996-07-17
TW264480B (hu) 1995-12-01
HUT74004A (en) 1996-10-28
IL111078A (en) 1999-03-12
NZ274074A (en) 1997-11-24
AU7799894A (en) 1995-05-01
DE69429527T2 (de) 2002-07-18
CN1078886C (zh) 2002-02-06
WO1995009838A1 (en) 1995-04-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU221629B1 (hu) Béta-amiloid fehérje képződést gátló peptidek, eljárás előállításukra és ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények
JP4157601B2 (ja) 置換オキサゾリジンカルパインおよび/またはカテプシンb阻害剤
US20110144170A1 (en) Fc RECEPTOR MODULATING COMPOUNDS AND COMPOSITIONS
JPH09500087A (ja) カルパイン活性の増大に関連した健康障害の抑制及び処置におけるカルパイン阻害剤の使用法
WO2004076478A1 (ja) βセクレターゼ阻害活性を有するペプチド誘導体
US6541453B2 (en) Peptide derivatives
NZ264143A (en) Use of an aspartyl protease inhibitor to inhibit beta-amyloid peptide production
US7238774B2 (en) Statine derivatives for the treatment of Alzheimer's disease III
JP2001519769A (ja) N―(アリール/ヘテロアリール)アミノ酸誘導体、その医薬組成物および該化合物を用いたβ―アミロイドペプチドの放出および/またはその合成を阻害する方法
KR20000048577A (ko) 인다논으로 26s 및 20s 프로테아좀을 억제하는 방법
JPH04211095A (ja) 新規ジペプチド、その製造方法及び薬剤におけるレニン阻害剤としてのその使用
JPH11506923A (ja) 新しいカテプシンならびにその阻害のための方法および組成物
KR20000016700A (ko) 뎁시 펩티드 및 이를 유효 성분으로 하는 의약
CA2140931A1 (en) Non-peptidic surrogates of the ldv sequence and their use in the treatment of inflammation, autoimmune disease and tumour progression
US6087336A (en) Peptide derivatives useful in treating autoimmune diseases
WO1993005011A1 (en) Novel immunosuppressants
JP2002505339A (ja) システイン活性依存性酵素のインヒビターとして有用なチアジアゾール化合物類
US5977074A (en) Inhibitors of β-amyloid protein production
US5817757A (en) Inhibitors of peptide binding to MHO class II proteins
US20020187934A1 (en) Peptide derivatives
US20060281686A1 (en) Aza-peptides
US20230279052A1 (en) Prodrugs of mitochondria-targeting oligopeptides
JP6952320B2 (ja) 新規nk3受容体アゴニスト
JP2934905B2 (ja) 新規リポペプタイド及び抗腫瘍剤
US20190127419A1 (en) Neuropeptide s receptor (npsr) agonists

Legal Events

Date Code Title Description
DGB9 Succession in title of applicant

Owner name: MERRELL PHARMACEUTICALS INC., US

GB9A Succession in title

Owner name: AVENTIS INC., US

Free format text: FORMER OWNER(S): SCOIS NOVA INC., US; MERRELL PHARMACEUTICALS INC., US; MERRELL DOW PHARMACEUTICALSINC., US; MERRELL PHARMACEUTICALS INC., US

MM4A Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees