HU211581A9 - Plasmodium falciparum merozoite antigen-peptide - Google Patents

Plasmodium falciparum merozoite antigen-peptide Download PDF

Info

Publication number
HU211581A9
HU211581A9 HU95P/P00264P HU9500264P HU211581A9 HU 211581 A9 HU211581 A9 HU 211581A9 HU 9500264 P HU9500264 P HU 9500264P HU 211581 A9 HU211581 A9 HU 211581A9
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
polypeptide
polypeptides
dna
falciparum
formula
Prior art date
Application number
HU95P/P00264P
Other languages
English (en)
Inventor
Reiner Gentz
Ulrich Certa
Bela Takacs
Original Assignee
Hoffmann La Roche
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hoffmann La Roche filed Critical Hoffmann La Roche
Publication of HU211581A9 publication Critical patent/HU211581A9/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/44—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from protozoa
    • C07K14/445—Plasmodium
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A61P33/02—Antiprotozoals, e.g. for leishmaniasis, trichomoniasis, toxoplasmosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/40—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Description

Találmányunk a P. falciparum KI izolátumának fő merozoita felületi antigénje 190 kD (1 kD-1000 dalton) előtermékéből leszármaztatható aminosav szekvenciával rendelkező polipeptidekre vonatkozik. Ezek a polipeptidek P. falciparum különböző izolátumaival szemben immunválasz kiváltására képesek.
Találmányunk tárgya különösen (I) általános képletű szintetikus polipeptidek (mely képletben A jelentése valamely affinitáspeptidmaradék vagy e csoport hiányozhat;
B jelentése (II) képletű csoport, vagy annak fragmense, vagy (ΠΙ) képletű csoport, vagy annak fragmense, vagy e szekvenciák vagy fragmensek valamely kombinációja, azzal a feltétellel, hogy a fent említett fragmensek a P. falciparum fő merozoita felületi antigénje 190 kD előterméke legalább egy epitópját jelentik vagy tartalmazzák, és
C jelentése valamely peptidrnaradék vagy e csoport hiányozhat) azzal jellemezve, hogy a polipeptid P. falcinarum különböző izolátumaival szemben immunválasz kiváltására képes.
Találmányunk tárgya továbbá
- a fent meghatározott polipeptidet tartalmazó immunogén kompozíciók és vakcinák;
- a fenti polipeptideket kódoló DNS-fragmensek
- a fenti DNS-szekvenciát tartalmazó replikálható mikróbás vektorok;
- a fenti vektorokkal transzformált mikroorganizmusok
- eljárás a fenti polipeptidek és mikroorganizmusok. valamint a fenti antitestekkel szemben irányított antitestek előállítására; továbbá
- a fenti polipeptidek felhasználása emlősök maláriával szemben történő immunizálására alkalmas immunogén kompozíciók előállítására.
A maláriát emberen négy Plasmodium species éspedig a P. falciparum. P. vivax, P. ovale és P. malariac - idézi elő. Az Egészségügyi Világszervezet (WHO) 1986. évi jelentése szerint világviszonylatban közel 100 millió maláriás fertőzés fordult elő. Ezek közül kb. 1 millió - főként kisgyermekeknél - előforduló P. falciparumos fertőzés halálos kimenetelű volt. A gyógyszerekkel szemben ellenálló paraziták és gyomirtószermaradékok által közvetített moszkitóvektorok feltűnése a malária további terjedését okozza. így az indiai egészségügyi hatóságok 1962-ben 100 000 és 1980-ban már 3 millió, főként P. vivax által okozott maláriás megbetegedésekről számoltak be [lásd; Bruce-Chwatt, Essential Malariology, 2. kiadás, Heinemann, London (1985)].
Az újabb műszaki eredmények reményt adtak arra, hogy rövid időn belül a malária növekvő elterjedését megakadályozó maláriaellenes vakcina előállítására nyílik majd lehetőség. Elsősorban maláriavakcinák kifejlesztésére irányuló új módszerek alkalmazhatók, pl. a gének klónozása, monoklonális antitestek felhasználása antigének azonosítására, továbbá szintetikus peptidekkel történő immunizálás. Másodsorban P. falciparum hosszú időn ál készített tenyészetei emberi vörös vérsejtekben [Trager et al., Science 193, 673-675 (1976)] segítségével a paraziták életciklusainak valamennyi szakasza laboratóriumban tenyészthető [Ponnudurai et al., Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 76, 812-818 (1982); Mazier et al., Science 227, 440-442 (1985)].
A P. falciparum életciklusának egy részét emberi vörös vérsejtekben tölti el. Egy merozoita a gazdasejtbe behatol, megnagyobbodik, később több magosztódáson megy át, majd egy skizontot képez. A skizont megérése során sok merozoita keletkezik, amelyek a véráramba bekerülve rövid idő elteltével újabb eritrocitákba hatolnak be.
A merozoiták és skizontok felületén egy fehérjét találtak, amely malária ellen vakcinaként aktív lehet. A szintetizált fehérje látszólagos molekulatömege 190 000-200 000 D (Perrin et al., Clin. exp. immunoi. 41, 91-96 (1980); Holder et al., J. Exp. Med. /56, 1528-1538 (1982); Hall et al., Mól. Biochem Párásítói. 7, 247-265 (1983) és Mól. Biochem. Párásítói. //, 61-80 (1984)]. A fehérje elnevezése GP185, pl90, 195-kD fehérje vagy polimorf skizon antigén (PSA). Megállapították továbbá, hogy a merozoitáknak új vérsejtekben történő behatolásakor a fehérje nagy része veszendőbe megy [Holder et al., supra; Hall et al.. supra (1983)].
A p 190 analógjai minden ismert Plasmodium speciesben jelen vannak. Valamennyi teszt igazolta, hogy p!90 ellen irányított antitestek a paraziták behatolását in vitro megakadályozzák [Epstein et al., J. Immunoi. 127. 212-217 (1981); Perrin et al„ J. Exp. Med. 160, 441-451 (1984); Boyle et al., Infect. Immun. 38, 94102 (1982)]. A pl90 fehérje Saimiri majmokba történő befecskendezéskor maláriával szemben részleges védelmet biztosít [Hall et al., supra (1984); Perrin et al., supra (1984)]. Három különböző parazita izolátumból a pl90 fehérjét kódoló gént izolálták és szekvenciáját meghatározták; ezek a thaiföldi Ki izolátum [Mackay et al., EMBO J. 4, 3823-3829 (1985)], a malajziai CAMP izolátum [Weber et al., Nucleic Acids Rés. 14, 3311-3323 (1986)] és a nyugat-afrikai Wellcome izolátum (Holder et al„ Natúré 317, 270-273 (1985)]. A fenti allelek szekvenciájának összehasonlítása azt mutatta, hogy a különböző izolátumok között bizonyos mértékű polimorfia áll fenn. Az egyes allelek aminovégcsoportjának tartományában talált tripeptid-ismétlődések minden vizsgált esetben eltértek.
Vakcinák kifejlesztéséhez a pl90 polipeptiden a legtöbb vagy előnyösen valamennyi izolátumban jelenlevő epitópok megtalálása szükséges abból a célból, hogy nagyszámú parazita variánssal szemben védelem alakulhasson ki.
A találmányunk szerinti polipeptidek a P. falciparum fő merozoita felüléti antigénje 190 kD előtermékéből leszármaztatható aminosavszekvenciát és legalább egy, kúlönöző izolátum okban (pl. KI, CAMP és Wellcome izolátum) előforduló epitópot tartalmaznak.
A polipeptidek egy affinitás peptidmaradékot tartalmazhatnak. Az ilyen affinitáspeptidmaradékok affinitás kromatográfiás gyantához szelektíven kötődő aminosav1
HU 211 581 A9 szekvenciát tartalmaznak. Az előnyös affinizáspolipeptidmaradékok két vagy több szomszédos hisztinmaradékot tartalmaznak. Különösen előnyös affinitáspeptid maradékok a MetHisHisAlaProGlySerGly, MetHisHisAlaProGlySer és MetHisHisAlaPro peptidmaradékok. A két vagy több szomszédos hisztinmaradékot magábanfoglaló affinitáspeptidmaradékot tartalmazó polipeptidek nitrilotriecetsav-nikkelkelátgyantákhoz szelektíven kötődnek és ezért a két vagy több szomszédos hisztint nem tartalmazó fehérjéktől affinitáskromatográfia segítségével elválaszthatók.
Előnyös polipeptidek az alábbiak: (IV) képletű (pl90-l); (V) képletű (pl90-2a); (VI) képletű (pl902b); (VII) képletű (pl90-3).
Találmányunk továbbá a fenti polipeptidek homológjaira és olyan polipeptidekre vonatkozik, amelyek a fenti polipeptidekből aminosavhefyettesítésekkel származtathatók le, azzal a feltétellel, hogy a fent említett polipeptidek valamely gazdaszervezetben P. falciparum különböző izolátornál ellen - vagy legalább P. falciparum KI, CAMP, MAD-20 és Wellcome izolátum ellen - immunválasz kiváltására még képesek. Ezek a polipeptidek emlősöknek malária ellen történő immunizálására alkalmazhatók.
Egy polipeptid aminosavszekvenciájában végrehajtott bizonyos helyettesítések a biológiai aktivitást nem befolyásolják. Ilyen aminosavhelyettesítések példáit Doolittle a „The Proteins Neurath, H. és Hill, R. L., Eds.. Academic Press, New York (1979) irodalmi helyen írta le. A leggyakoribb aminosavhelyettesítések az alábbiak: Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu és vice versa.
A fenti (I) általános képletben csak a B-szekvencia felel meg a P. falciparum 190 kD-fehérje egy részének. Az A- és C-szekvencia vagy hiányzik, vagy a fentiekben meghatározott valamely aminosavszekvenciát jelent. Ezek továbbá bármely olyan aminosavszekvenciából felépíthetők, amely a polipeptidnek emlősök malária ellen történő immunizálása során vakcinaként történő felhasználásánál nem okoz hátrányokat. így A a MetHisHisAlaProGlySerGly aminosavszekvencia valamely részszekvenciáját vagy meghosszabbított szekvenciáját jelentheti, azzal a feltétellel, hogy ez a szekvencia legalább két szomszédos hisztidint tartalmaz. Ez az A-szekvencia egy affinitáspeptid, amely a találmányunk szerinti peptidek tisztítására a 2F. és G. példában leírt gyanták és módszerek segítségével alkalmazható.
Hasonlóképpen, C jelentése például a (VIII) képletű szekvencia vagy ValAspLeuGInProSerLeuAspSerCys. Ez a peptidmaradék továbbá a találmányunk szerinti polipeptidek felhasználását nem befolyásoló aminosavszekvenciából építhető fel. így C specifikus szekvenciái olyan kifejező vektorból származtathatók le, amelyekbe a P. falciparum specifikus B-szekvenciája be van klónozva. A és C jelentését műszaki szempontok határozzák meg és ezért e csoportok tág határokon és tartományokon belül változtathatók.
A találmányunk szerinti polipeptidek kovalensen egy hordozóanyaghoz kapcsolhatók vagy azon adszorbeálhatók. Hordozóanyagként természetes vagy szintetikus polimervegyületek alkalmazhatók, pl. egy vagy több aminosav (pl. polilizin) vagy cukrok (pl. poliszacharidok) kopolimerjei. További hordozóanyagként természetes vagy szintetikus polipeptidek alkalmazhatók(pl. KLH = „keyhole limpet hemocyanin”), szérumproteinek (pl. gammaglobulinok és szérumalbuminok) és toxoidok (pl. diftéria és tetanusz toxoidok). További megzelelő hordozóanyagok a szakember által jólismertek.
A találmányunk szerinti polipeptideket önmagában ismert módon kapcsolhatjuk kovalens kötéssel a hordozóanyagokhoz, pl. közvetlenül, a polipeptid szabad karboxil-, amino- vagy hidroxilcsoportjai és a hordozóanyag megfelelő csoportjai közötti peptid- vagy észterkötés kialakításával, vagy közvetett módon szokásos bifunkcionális reagensek felhasználásával; e célra pl. karbodiimidek, előnyösen 1,3-diciklohexilkarbodiimid vagy l-etil-3-(3-dimetiIaminopropil)-karbodiimid, 2,7dialkáok, mint pl. glutáraldehid [Avrameas, Immunochem. ő, 43-52 (1969)] vagy m-maleinido-benzoil-Nhidroxi-szukcinimid-észter (MBS) alkalmazhatók.
A hordozóanyag és a rajta megkötött polipeptidek a nem-megkötött polipeptidektől és a kapcsoló reagens adott esetben jelenlevő fölöslegétől önmagukban ismert módszerekkel (pl. dialízis vagy oszlopkromatográfia) tisztíthatők meg.
A találmányunk szerinti peptidek a peptidszintézis önmagukban ismert módszereivel, folyékony vagy szilárdfázisú szintézissel [lásd pl. Merrifield módszere: I. Am. Chem. Soc. 85, 2149-2154 (1963)] vagy az irodalomból ismert más módszerekkel állíthatók elő.
A szilárdfázisú szintézist a szintetizálandó peptid C-terminális aminosavjával kezdjük el, amelyet védett formában megfelelő hordozóanyaghoz kapcsolunk. A kiindulási anyagot oly módon állíthatjuk elő, hogy egy aminocsoportján védett aminosavat benzil-észter-hídon keresztül valamely klórmetilezett vagy hidroximetilezett hordozóanyaghoz kötünk, vagy egy benzhidrilamin (BHA) vagy metilbenzhidrilamin (MBHA) hordozóanyagon amidkötést létesítünk. Ezek a hordozóanyagok kereskedelmi forgalomban beszerezhetők és előállításuk, valamint felhasználásuk jól ismert.
Az aminosavak védőcsoportjainak találmányunk során történő felvitele és eltávolítása pl. az alábbi irodalmi helyről ismert: „The Peptides”, Vol. 2 [kiadó: E. Gross és J. Meienhofer, Academic Press, New York, 1-284 (1979)]. Védőcsoportként előnyösen pl. a tercier butoxikarbonilcsoport (Boc), benzilcsoport (Bzl), 2-klór-benziloxikarbonil-csoport (2 Cl-Z), diklór-benzilcsoport (Dcb) és 3,4-dimetil-benzil-csoport (Dmb) jöhet tekintetbe.
A hordozóhoz kötött C-terminális aminosav a-amino-védőcsoportjának eltávolítása után a védeU aminosavakat a kívánt sorrendben lépésenként kapcsoljuk. A teljes peptid ily módon szintetizálható. Eljárhatunk oly módon is, hogy kis peptideket építünk fel, amelyeket a kívánt pepiiddé kapcsolunk össze. A kapcsoló reagensek az irodalomból ismertek; a diciklohexilkarbodiimid (DCC) különösen előnyösnek bizonyult.
HU 211 581 A9
Valamennyi védett aminosavat vagy peptidet a szilárd fázisú szintézis reaktorba fölöslegben adagolunk, és a kapcsolási reakciót dimetil-formamidban (DMF) vagy metilén-kloridban (CH2CI2) vagy ezek elegyében végezzük el. Nem teljes kapcsolás esetén a kapcsolási reakciót megismételjük, mielőtt az N-terminális-aaminosav-védőcsoportot a következő aminosav kapcsolása céljából eltávolítanánk. Mindegyik kapcsolási lépés kitermelése nyomon követhető, előnyösen a ninhidrines módszerrel. A kapcsolási reakciók és mosási lépések automatizálhatók.
A peptid a hordozóanyagról a peptidkémiából jól ismert módszerekkel hasítható le. így pl. fluor-hidrogénnel (FH) p-krezol és dimetil-szulfid jelenlétében, 0 'C-on 1 órán át reagáltatjuk, majd adott esetben p-krezol jelenlétében 0 'C-on 2 órán át második fluor-hidrogénes reagáltatást végezhetünk el.
A klór-metilezett vagy hidroxi-metilezett hordozóanyagról történő peptidlehasítás után szabad C-terminust tartalmazó peptideket nyerünk. A benzhidrilaminvagy metilbenzhidrilamin-hordozóanyagokról történő peptidlehasítás eredményeként amidéit C-végcsoportot tartalmazó peptideket kapunk.
A találmányunk szerinti polipeptideket ezenkívül DNS-rekombinációs módszerekkel is előállíthatjuk [Manniatis et al.. ,,Molecular Cloning - A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory (1982)]. így pl. valamely, a találmányunk szerinti polipeptidet kódoló DNS fragmenst szokásos kémiai módszerekkel szintetizálunk, pl. a foszfotriészteres módszerrel [lásd pl. Narang et al., Meth. Enzymol. 68, 90-108 (1579)], vagy a foszfodiészteres módszerrel [Brown et al., Meth. Enzymol. 68, 109-151 (1979)]. Mindkét módszer során először hosszabb oligonukleotideket szintetizálunk, majd ezeket a meghatározott módon egymáshoz kapcsoljuk és ily módon a kívánt DNS-fragmenst nyerjük. A DNS-fragmens nukleotid szekvevciája a természetes polipeptidet a Plasmodium parazitába kódoló nukleotid szekvenciával azonos vagy attól eltérő lehet, Minthogy a genetikus kód degenerált, lehetőség van arra, hogy egy részben vagy teljesen eltérő nukleotidszekvencia ugyanazt a polipeptidet kódolja. Adott esetben a nukleotidszekvencia számára a gazdaszervezet által a polipeptid kifejezésére felhasznált kodonok választhatók előnyösen ki Grosjean et al., Gene 18, 199-209 (1982). Ennek során azonban ügyelni kell arra, hogy a kapott DNS-fragmens ne tartalmazzon a kifejezési vektor felépítését megnehezítő (pl. nemkívánatos restrikciós enzimhelyek beiktatását eredményező) vagy a DNS-fragmensek kifejezését kedvezőtlenül befolyásoló részszekvenciákat.
A DNS rekombinációs technológiában alkalmazott másik eljárás egy során találmányunk szerinti polipeptidet kódoló DNS-fragmenst valamely P. falciparum izolátum genom DNS-éből izolálhatjuk. Ennek során a genóm DNS-t megfelelő restrikciós endonukleázzal (pl. EcoRI) részlegesen emésztjük. Az emésztett DNS-t 0,7%-os agarózgélen szétválasztjuk, és az 1,5—8xl03 bázispár nagyságú fragmenseket izolálhatjuk. Az izolált fragmensekel megfelelő vektoron (pl. lambdavektor gtll; ATCC-37194; beszerezhető továbbá mint Protoclone GT* Lambda GTII, Genofit SA, Genf) a gyártó cég előírásai szerint kiónozhatjuk. A rekombináns DNS-fágok in vitro csomagolhatók (Gigapack®, Vector Cloning Systems, San Diego), és a kapott fágot megfelelő gazdaszervezetbe (pl. E.coli Y1O88; ATCC-37195) visszük be. Mintegy 100 000 rekombináns fágot radioaktív jelzett komplementer oligonukleotid mintákkal történő hibridizálással P. falciparum specifikus DNS jelenlétére vizsgálunk. Mintaként P. falciparum különböző izolátumainak ismert nukleotid szekvenciái szolgálhatnak. A komplementer oligonukleotid mintákat a fentiekben leírt módon kémiailag szintetizálhatjuk.
A fenti oligonukleotid minták példáiként a (IX) képletnek megfelelő szekvenciájú oligonukleotid 1 (35-mer) és a (X) képletnek megfelelő szekvenciájú oligonukleotid 2 (33-mer) említhető meg: ezek a P. falciparum KI izolátuma (Mackay et al., supra) nukleotid szekvenciájából származtathatók le.
Egy adott oligonukleotid mintával hibridizálható rekombináns fágok ismert módon izolálhatók. A fágokat magasra nőni hagyjuk, és a DNS-t izoláljuk. A P. falciparum fragmenst izolálhatjuk és megfelelő vektorban (pl. pUC19 plazmid, Pharmacia) alklónozhatjuk. A kapott rekombináns plazmidot tovább alklónozva a találmányunk szerinti polipeptid B részét kódoló DNSfragmenst nyerjük.
A fentemlített alklónozási eljárás során a két fenti módszer valamelyikével előállított DNS-fragmenst replikálható mikróbás vektorba építünk be.
Találmányunk tárgya továbbá reprikálható mikrobás vektor, amely valamely fent ismertetett DNS-fragmenst tartalmaz. Az ilyen vektorok pl. DNS-mintaként diagnosztikai teszteknél alkalmazhatók. A génmintatechnológiát Klausner és tsai áttekintő cikkben (Bio/Technology, 1983. augusztus, 471-478. oldal) ismertették. A fent említett technológia alkalmazásával a szakember a feni leírt DNS-fragmens alapú DNS mintákat minden további nélkül képes előállítani, és a találmányunk szerint klónozóvektorként alkalmazható vektor kiválasztása ugyancsak a szakember kötelező tudásához tartozik.
A találmányunk szerinti polipeptideknek a gazdaszervezetben történő előállításához a P. falciparum izolátumból leszármaztatható nukleotid szekvenciát magábanfoglaló DNS-fragmensek egy startkodont (pl. ATG) és egy lerminátor kodont (TAA, TAG vagy TGA) kell tartalmaznia. Amennyiben ezek a szignálok az eredeti DNS-fragmensen nincsenen jelen, úgy a fent említett DNS-fragmensbe a szakember által ismert módszerekkel beilleszthetők. Egy ilyen eljárás során a DNS-fragmenst az említett szignálokat oly módon tartalmazó vektorba építjük be, hogy a startkodon és a terminátor kodon a találmányunk szerinti polipeptid B alszekvenciáját kódoló szekvenciával sorozatban van. A startkodon és a polipeptid B-szekvenciáját kódoló szekvencia közölt egy vagy több nukleotidtriplett lehet jelen. Ezek a nukleotidek a startkodonnal együtt a találmányunk szerinti polipeptid A részszekvenciáját képezik. Hasonlóképpen, a B részszekvenciát és a ter4
HU 211 581 A9 minátor kodont kódoló szekvencia között egy vagy több nukleotidtriplett lehet jelen. Ezek a nukleotidek kódolják a találmányunk szerinti polipeptid C részszekvenciáját. A találmányunk szerinti (I) képletű polipeptidet kódoló DNS-fragmens a szakember számára ismert módszerekkel állítható elő.
Találmányunk tárgya továbbá a fenti DNS-frekvenciák.
A pl90-a, pl9O-2a, pl90-2b vagy pl9O-3 polipeptideket kódoló előnyös DNS-szekvenciák a (XI), (XII), (XIII) illetve (XIV) képletnek felelnek meg.
A polipeptideknek valamely gazdaszervezetben történő kifejezéséhez a polipeptidet kódoló DNS-szekvenciát egy kifejező kontrollszekvenciával működőképesen össze kell kapcsolni. A megfelelő kifejező kontrollszekvenciák a szakember által jól ismertek (186 089 sz.európai közrebocsátást irat, megjelent 1986. július 2-án). A szakember ezekből a kifejező kontrollszekvenciákból a találmányunk szerinti polipeptidek kifejezésére legalkalmasabb szekvenciákat minden további nélkül ki tudja választani.
Előnyös az a kifejező kontrollszekvencia, amely a pDS6/RBSll, SphI-His,His-ban jelen van. Ez a kifejező vektor a pD56/RBSII, 3A+5A és pDS8/RBSII,SphI kifejező vektorokból vezethető le. A pDS6/RBSII, 3A+5A kifejező vektort a Deutsche Sammlung von Mikroorganismen (DSM) intézetnél a Budapesti Szerződés előírásainak megfelelően egy E.coli M15(pDS6/RBSII, 3A+5A; pDMI, 1) minta formájában 1985. október 3-án DSM 3518 számon letétbe helyeztük. A pDS8/RBSII.SphI kifejező vektort a DSM intézetnél 1986. augusztus 6-án, ugyancsak a Budapesti Szerződésnek megfelelően, DSM 3809 számon egy E.coli M15(pDSB/RBSII,SphI;pDMI,l) minta formájában helyeztük letétbe. A pDS6/RBSII,Sh I-His,His kifejező vektort az 1. példában ismertettük. A P. falciparum izolátumából leszármaztatható nukleotid szekvenciája DNS-fragmensek a fenti kifejező vektorba történő beillesztése után a találmányunk szerinti valamely polipeptid kifejezésére képes új replikálható vektor keletkezik. Az ilyen vektorok felépítését a 2., 3. és
4. példában írjuk le. A találmányunk szerinti vektorok közül előnyös a pGCl, pGC2a, pGC2b és pGC3 vektor.
A találmányunk szerinti polipeptideket kifejező DNS szekvenciát tartalmazó kifejező vektort a fent említett polipeptid kifejezésére képes megfelelő gazdaszervezetbe a szakember által ismert módszerekkel építhetjük be. Az ily módon kapott transzformált szervezetet nagymennyiségű polipeptid előállítását biztosító körülmények között tenyésztjük. A rekombináns polipeptideket ezután ismert módszerekkel izolálhatjuk és tisztíthatjuk.
Találmányunk a fenti transzformált szervezetekre is kiterjed.
A találmányunk szerint felhasznált gazdaszervezet kiválasztása a szakember által ismert számos tényezőtől függ. Ide tartozik pl. a kiválasztott kifejező vektorral szemben mutatott kompatibilitás, a rekombináns polipeplidnek a gazdaszervezetre kifejtett toxikus hatása, a kívánt polipeptid izolálhatósága, a kifejezés jellemző adatai, a biológiai biztonság és a gyártási költségek. A fenti általános keretekbe gram-negatfv és grampozitív baktériumok tartoznak, különösen a gazdaszervezetként igen alkalmas E. coli és B. subtilis törzsek. Gazdaszervezetként igen előnyösen alkalmazható törzs a E.coli M15 (Villarejo et al., J. Bacteriol. 720, 466474 (1974) DZ291]. További előnyös gazdaszervezetek az alábbiak: E. coli 294 (ATCC-31446), E. coli RR1 (ATCC-31343) és E. coli W3110 (ATCC-27325).
A találmányunk szerinti polipeptidek kifejezésére képes transzformánsok előállítása után a találmányunk szerinti eljárást különbözőféleképpen hajthatjuk végre. Az eljárás kiválasztása a kifejező vektor felépítésétől és a gazdaszervezet növekedési tulajdonságaitól függ. A transzformált szervezeteket általában nagymennyiségű sejt termelésének kedvező körülmények között tenyésztjük. Nagymennyiségű sejt képződése után a DNS-ben jelenlevő kontroli-szekvenciákat megfelelő induktorok vagy derepresszorok vagy hőmérsékletváltozás segítségével aktiváljuk, és ennek a kódolandó szekvencia transzkripciója és transzlációja a következménye. A jelen találmány esetében a találmányunk szerinti polipeptidet kódoló DNS-fragmens kifejezését a lac-represszor gátolja. Nagymennyiségű sejt összegyűlése esetén a kontrollszekvenciát izopropil-3-D-tiogalaktopiranozid (IPTG) hozzáadásával dereprimáljuk. A rekombinált sejtekből előállított polipeptideket a sejtekből ismert módszerekkel, a sejtek lizálásával nyerhetjük ki. A sejtek felnyitásának módja az alkalmazott gazdasejttől függ. Megfelelő sejtorganizmusok felhasználása esetén a találmányunk szerinti polipeptideket a transzformánsokon keresztül közvetlenül a tápközegbe választhatjuk ki.
Ha a találmányunk szerinti polipeptideket valamely mikrobás gazdaszervezetben állítjuk elő, úgy az N-terminuson levő metionin-maradék a startkodon ATG által a DNS-re kódolt AUG transzlációs startszignál mRNS-ből származtatható le. Ez az AUG kódolja a metionin aminosavat. Ezt a metionin-maradékot bizonyos kifejező rendszerekben poszt-transzlációsan eltávolítjuk. Az N-terminális metionin jelenléte vagy távolléte azonban a legtöbb rekombináns polipeptid biológiai aktivitását nem befolyásolja [Winnacker: „Gene und Klone”, 255. oldal, Verlag Chemie (VCH), Weinheim(1985)].
A találmányunk szerinti polipeptideket ismert módszerekkel tisztíthatjuk. így pl. az alábbi eljárások alkalmazhatók: különböző sebességek mellett végzett centrifugálás, ammónium-szulfátos kicsapás, dialízis (normál nyomáson vagy vákuumban), preparatív izoelektrofókuszolás, preparatív gél-elektroforézis, vagy különböző kromatográfiás módszerek (mint pl. gélszűrés, nagy teljesítőképességű folyadékkromatográfia, HPLC), ioncserélő kromatográfia, fordítottfázisú kromatográfia és affinitáskromatográfia (pl. Sepharose Blau CL-6B. hordozóhoz kötött, a polipeptid ellen irányított monoklonális antitesteken vagy fémkelátgyantákon). További részleteket a jelen szabadalmi leírásban ismertetünk.
HU 211 581 A9
A találmányunk szerinti polipeptidek előnyös tisztítási módszere a fémkelátgyantákon végzett affinitáskromatográfiás tisztítás [Sulkowsky: Trends in Biotechn. 3, 1-7 (1985)]. Ennek során a szomszédos hisztidin-maradékok nitrilo-triecetsav-nikkelgyantákon (NTA-gyanták) mutatott szelektív kötődését használjuk ki. Ez előnyös (NTA) gyanták nitrilo-triecetsav-származékokból - éspedig N-(3-amino-l-karboxipropil)imino-diecetsavból vagy N-(5-amino-l-karboxipentil)imino-diecetsavból állnak. Ezek az NTA-származékok egy bifunkcionális reagens mint távolságtartó („spacer”) segítségével valamely hordozóhoz kapcsolódnak. A jelen találmány esetében az NTA-származékok előnyösen a -O-CH2-CH(OH)-CH2- vagy -O-CO- csoportokon - mint távolságtartókon - keresztül kapcsolódnak a hordozó mátrixhoz. Hordozóanyagként előnyösen térhálósított dextránok, Agaróz (pl. Sepharose* ) és poliakrilamidok alkalmazhatók. A [Sepharose® CL6B]-O-CH2-CH(OH)-CH2-NH-(CH2)4-CH(COOH)N(CH2COOH)2Ni2+ képletű NTA-gyanta előállítását a 2F. példában ismertetjük.
A találmányunk szerinti polipeptidek multimerek (pl. dimerek, trimerek vagy tetramerek) alakjában lehetnek jelen vagy fúziós polipeptidek részét képezhetik. A multimerek olyan esetekben keletkeznek, amikor a polipeptideket prokarióta gazdaszervezetekben állítjuk elő. pl ciszteinmaradékok közötti biszulfid hidakon keresztül (lásd 9. ábra). A fúziós peptidek rekombináns DNS technológiával állíthatók elő. Ennek során a találmányunk szerinti polipeptideket kódoló DNS fragmenseket egy további DNS-szekvenciával kapcsoljuk. Ezt a további DNS szekvenciát nagyszámú prokarióta vagy eukarióta polipeptidet kódoló DNS szekvenciák közül választhatjuk ki. A kombinált DNS szekvenciák által kódolt fúziós polipeptideknek megfelelő gazdaszervezetben történő kifejezése után a fúziós polipeptideket affinitáskromatográfiával, a fent említett prokarióta vagy eukarióta polipeptidekre specifikus ligand felhasználásával tisztíthatjuk.
A fenti polipeptidek példájaként valamely, egy találmányunk szerinti polipeptidet és egy β-galaktozidáz-akúvitású polipeptidet tartalmazó fúziós polipeptidel említünk meg. Ezek a fúziós fehérjék a Rüther és tsai által leírt módon [EMBO J„ 2, 1791-1794 (1983)] állíthatók elő és tisztíthatók.
A fúziós polipeptidek további példáiként a két vagy több, találmányunk szerinti polipeptidet tartalmazó polipeptideket említjük meg. Ezek egyik példája a pl90-3 jelzésű polipeptid. E polipeptid aminosavszekvenciája a pl90-l és pl90-2a polipeptidek aminosavszekvenciájában levő B-alszekvenciát tartalmazza. Találmányunk keretein belül a fúziós polipeptid aminosavszekvenciája közvetlenül egy peptidkötésen vagy másik kovalens kötésen vagy pentidfragmensen keresztül egy vagy több aminosavhoz kapcsolódhat. Egy ilyen peptidfragmens, már műszaki okokból is, a fúziós polipeptidet kódoló kifejező vektor felépítése során illeszthető be.
Találmányunk tárgya továbbá immunogén kompozíció, amely valamely találmányunk szerinti polipeplidet és gyógyászatilag alkalmas adjuvánst tartalmaz. Ezel az immunogén kompozíciók a P. falciparum fő merozoita felületi génjének pl90 előtermékére irányított antitestekkel indukálhatók. Minthogy ezek az antigének a maláriát okozó élősdiek iummunológiailag reaktív determinánsai, a találmányunk szerinti polipeptidek és immunogén készítmények emlősöknek maláriával szemben történő megvédésére vakcinaként alkalmazhatók. A „gyógyászatilag alkalmas adjuváns kifejezésen a humángyógyászatban felhasznált standard összetételek vagy állatvakcinák készítésénél használatos tipikus adjuvánsok értendők.
Állatvakcinák készítésére az alábbi vakcinák alkalmazhatók: Freund-féle teljes vagy hiányos adjuváns (ezek a humángyógyászatban és szarvasmarha kezelése esetén nem alkalmasak), adjuváns 65 (mogyoróolajat, mannit-monooleint és alumin-monosztearátot tartalmaz), ásványi gélek (pl. alumínium-hidroxid, alumínium-foszfát és kálitimsó), felületaktív anyagok (pl. hexadecilamin, oktadecilamin, lizolecitin, dimetildioktadecil-ammónium-bromid, Ν,Ν-dioktadecilN\N’-bisz(2-hidroxietil)-propándiamin, metoxi-hexadecil-glicerin és Pluronic poliolok, polianionok, mini pl. pirán, dextránszulfát, polilC, poliakrilsav és Carbopol), aminosavak és peptidek, pl. muramildipeptid, dimetilglicin. tuflsin, továbbá olajemulziók. A találmányunk szerinti polipeptidek továbbá liposzómákba vagy más mikrohordozóanyagokba történő beépítés után. vagy poliszacharidokra, más fehérjékre vagy más polimerekre történő kapcsolás után, vagy Quil-A-val kombinálva adagolhatók; [aholis „Iscoms = immunstimuláló komplex, Morein és tsai, Natúré 308, 457460(1984)].
Találmányunk tárgya továbbá eljárás emlősök maláriával szemben történő immunizálására oly módon, hogy az emlősöket immunizáló hatást kifejtő mennyiségű találmányunk szerinti polipeptiddel vagy immunogén kompozícióval kezeljük.
Az adagolás módja, az antigén dózis, a befecskendezések gyakorisága a szakember által ismert módon optimalizálható tényezők. Az első befecskendezés után, általában néhány hét elteltével, egy vagy több emlékeztető oltást adunk be, amelynek következtében a malária parazita merozoita formájával szembeni antitestek magas lilerszámmal képződnek.
A találmányunk szerinti polipeptideket és immunogén kompozíciókat gazdaszervezetekben a P falciparum fő merozoita felületi antigénje ellen irányított antitestek képzésére használhatjuk. Antitestek termelésére az alábbi gazdaszervezetek bizonyultak alkalmasnak: majom, nyúl, ló, kecske, tengerimalac, patkány, egér, tehén, birka. A termelt antiszérum a P. falciparum fent említett felületi antigénjével szelektíven reagáló vagy ahhoz kötődő antitesteket termel. Az antiszérumot közvetlenül felhasználhatjuk vagy a specifikus antitesteket ismert módszerekkel (pl. ammónium-szulfátos kicsapás) izolálhatjuk. Az antiszérumot vagy specifikus antitesteket önmagában ismert módon diagnosztikai vagy tisztítási célokra (pl. affinitáskromatografálás) alkalmazhatjuk.
HU 211 581 A9
Találmányunk további részleteit az alábbi példákban ismertetjük, a példák a találmány jobb megértésére szolgálnak. Különösen az ábrákra hivatkozunk, amelyek az alábbi rövidítéseket és szimbólumokat tartalmazzák:
A „B. Ε, Η, P, S, Sa, Se, X és Xb” jelölések a BamHl, EcoRl, HindllI” Pstl, Sphl, Sáli, Seal, Xhol illetve Xbal restrikciós enzimek hasítási helyeit jelölik.
Az 1., 3. és 5. ábrában
jelentése a bla, lacl és neo gének promotorai;
jelentése a bla, cat, neo és lacl gének riboszómás kötődési helyei;
[T. .1...
jelentése a t„ és TI terminátorok;
jelentése a szabályozható PN25X/n promotor/operátor elem:
»··*·· · jelentése a RBSII. Sphl és RBSII3A+5A riboszómás kötődési hely;
—» jelentése a fenti riboszómás kötődési helyek ellenőrzése alatt levő kódoló tartomány;
jelentése a DNS-replikációhoz szükséges tartomány (repl.);
jelentése a dihidrofolátreduktázt (dhrf), klóramfenikol-acetiltranszferázt (cat), beta-laktamázt (bla), lacrepresszort (lacl) vagy neomicinfoszfotranszferázt (neo) kódoló tartomány.
Azt ábrák jelentése a következő:
1. ábra
A pDSB/RBSIl.Sphl plazmid sematikus ábrázolása.
2. ábra
A pDSB/RBSII,SphI plazmid Xhol/Xbal-fragmensének nukleotid szekvenciája; ez a plazmid a szabályozható Pn25^/o promotor/operátor elemet, a RBSII,Sphl riboszómás kötődési helyet, a dhfr-gént, a to terminátort, a cat-gént és a TI terminátort tartalmazza. Az 1. ábrán megadott restrikciós enzimhasítási helyeket bevonalkáztuk, és a dihidrofolát-reduktázt kódoló RBSII.Sphl ellenőrzése alatt levő tartományt aláhúztuk. Ezenkívül a pDSB/RBSII,SphI pBR322 részét sematikusan ábrázoltuk, mimellett a megadott számok a pBR322 [Sutcliffe, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Bioi. 43, 77-90 (1979)] nukleotid szekvenciára vonatkoznak.
3. ábra
A pDS6/RBSII,3A+5A plazmid sematikus ábrázolása.
4. ábra
A szabályozható Pn25^/o promotor/operátor elemet, a RBSII,3A+5A riboszómás kötődési helyet, a to terminátort, a cat-gént és a terminátor Tl-t tartalmazó pDS6/RBSI13A+5A plazmid Xhol/Xbal-fragmense. A 3. ábrán megadott restrikciós enzim hasítási helyeket bevonalkáztuk és a RBSII,3A+5A ellenőrzése alatt levő tartományokat aláhúztuk. Ezenkívül a pD56/RBSII,3A+5A pBR322 részét sematikusan ábrázoltuk, mimellett a megadott számok a pBR322 (Sutcliffe, supra) nukleotid szekvenciára vonatkoznak.
5. ábra
A pDMI, 1 plazmid sematikus ábrázolása.
6. ábra
A pDMI plazmid DNS szekvenciája. Az 5. ábrán megadott restrikciós endonukleáz hasítási helyek fölé vonalat húztunk, és a neomicin-foszfotranszferáz (neo) és lac-represszorl (lacl) kódoló tartományokat aláhúztuk.
7. ábra pl90-1 tisztítása NTA-nikkelkelátoszlopon. Az UV felvételt készítő készülék (280 nm) nyomát folyamatos vagy pontozott vonal formájában adjuk meg. ApH-gradienst „nyitott” jelöléssel (o) és az ammónium-szulfát gradienst zárt jelöléssel (o) ábrázoljuk. A puffercserét nagy betűkkel jelezzük. A = a nyers extraktum felvitele. B = 0,1 M Tris/HCl (pH 7,5), 0,2 M NaCl segítségével történő mosás. C = mosás, 0,1 M Tris/HCl (pH 6,0), 0,2 M NaCl. D = mosás, 0,1 M Tris/HCl (pH 6,0), 1 M (NH4)2SO4. E = mosás, 0,1 M Tris/HCl (pH 4,5), 1 M (NH2)4SO4. F = pl90-1 gradiens eluálása, 0,1 M Tris/H Cl (pH 4.5), 0,2 M NaCl segítségével.
8. ábra
A tisztított p!90-l analitikai SDS-poliakrilamid gél-elektroforézise (SDS-PAGE). A 3-6. nyom azt mutatja, hogy a polipeptid homogén formában van jelen. Az 1. nyom egy E. coli M15 (pGCl.pDMI, l)-lizátumot mutat, amelyből a 190-1 tisztítottuk. A 2. nyom molekulatömeg markírozó keveréket (Biorad) mutat. A foszforiláz b-markerfehérje (Mr = 92’500), szarvasmarhaszérum albumin (Mr = 66’200), tojásalbumin
HU 211 581 A9 (Mr = 45’000), karboanhidráz (Μ, = 31Ό000), szójabab-tripszin-inhibitor (Mr = 21’500) és lizozim (Mr = 14’400) elektroforetikus mobilitását az Μ,-értékek (x 1O1) segítségével adjuk meg. A 3-6. nyom 0,25, 0,5. 1,0 illetve 2,0 gg p 190- 1-t tartalmaz.
9. ábra
Tisztított p 190-3 analitikai SDS-PAGE redukáló (2. és 3. nyom) és nem redukáló (4. és 5. nyom) körülmények között. A polipeptid homogén formában van jelen (lásd 2. és 3. nyom). A 4. és 5. nyom azt mutatja, hogy az E. coli lizátuma a polipeptid multimerjeit tartalmazza, amelyek a pl90-3-ban cisztein oldalláncok között levő diszulfid hidak képződése által keletkeznek. A 2. és 4. nyom 5 pg, míg a 3. és 5. nyom 10 pg fehérjét tartalmaz. Az 1. nyom egy molekulatömeg marker-keverék (Pharmacia). A markerfehérje (foszforiláz b M, = 94’000), szarvasmarhaalbumin (Mr = 67’000), tojásalbumin (M, = 43’000), karboanhidráz (Mr = 30’000), szójabab-tripszin-inhibitor (Mr = 20Ί00) és a-laktalbumin Mr = 14’400) elektroforetikus mobilitását az Mr-értékek (x 103) segítségével adjuk meg.
10. ábra
A p 190-1, pl90-2b és pl90-3 Westem-Blot és fehérje analízise. Az A-részben a pGCl. pGC2b vagy pGC3 által transzformált E. coli M15 (pDMI.l). baktériumos lizátumának Western-Blot-ját mutatjuk be, amelyet nyúl anti-190 szérummal analizáltunk. A Brészben azonos mintákat mutattunk be, azonban az analízist endémikus tartományból származó egyesített humán szérummal végeztük. A nyúl szérum mindhárom antigénnel reagál, míg a humán antiszérum csak azokkal a sávokkal, amelyeknek a nagysága a pl90-1 és pl90-3 polipeptideknek megfelel. Az antigén-antitest komplexeket torma-peroxidáz-reakció felhasználásával tettük láthatóvá. A C-részen ugyanazon minta Coomassie-Blau által megfestett géljét mutatjuk be. ST = molekulatömeg standard. A nagyságokat kilodalton (1000 Dalton) molekulatömegben adjuk meg
11. ábra pGCl, pGC2b vagy pGC3 (1., 2. és 3. nyom) által transzformált E. coli baktérium lizátjait SDS-poliakrilamid-gélen szétválasztjuk és mikrocellulózra visszük át. A Western-Blot vizsgálatát ezután pl90-3 ellen irányított nyúlszérum felhasználásával végezzük el. Az antigén/antitest komplexeket torma-peroxidáz reakcióval tettük láthatóvá. A pl90-3 ellen irányított nyúl antiszérum - a várakozásnak megfelelően - mindhárom antigénnel (p 190-1, pl9O-2b és pl9O-3) reagált.
1. példa pDS6/RBS!I, Sphí, His-His plazm id fel épílése
A. Elv
A DNS-fragmenst egy kémiailag szintetizált oligonukleotid adapter felhasználásával a pDSB/RBSll,Sphl vektor RSBII.Sphl szekvenciája mögé illesztjük be. Ez a fragmens két szomszédos hisztidint tartalmazó affinitáspeptidet kódol. Ezt az affinitáspeptidet tartalmazó polipeptidet a szomszédos hisztidinmaradékokra specifikus affinitáskromatográfia-gyantán történő szelektív kötéssel tisztíthatjuk.
B. A szintetikus oligonukleotid előállítása
Az (1) és (2) szintetikus oligonukleotidok szekvenciáját a (XV) képlet ábrázolja.
Az (1) és (2) szintetikus oligonukleotidek előállítása során hordozóanyagként szabályozott pórusnagyságú üveget (CPG) alkalmazunk [Sproat et al., Tetrahedr. Lett., 24, 5771-5774 (1983); Adams et al., J. Amer. Chem. Soc., 105, 661-663 (1983)]. A liofilizált oligonukleotideket vízben 1 órán át 4 ’C-on oldjuk, majd a DNS koncentrációt 100 mMól/ml értékre állítjuk be. Minden oligonukleotid 100 pmól-os mennyiségét 1 μΐ pP]-ATP (2 pMol, 5000 Ci/mMol) 1 egység T4 polinukleoiid kinázzal (Gibco-BRL, Basel) 10 μΐ 50 mM trisz/HCl-ben (pH 8,5), 10 mM MgCl2 felhasználásával 10 percen át 37 ’C-on kezeljük. A reakciót 1 μ 15 mM ATP hozzáadása után a minták 65 ’C-on 7 percen át történő hevítése útján leállítjuk.
C. pDS6/RBS!l,SphI-His,His felépítése pg pDSB/RBSII.Sphl-t a gyártó cég (GibcoBRL) útmutatásai szerint SphI-el emésztünk. Az enzimet a minta 65 'C-on 7 percen át történő hevítésével inaktiváljuk, és a DNS-t 2,5 térfogat etanol hozzáadásával, 0,3 M kálium-acetát jelenlétében kicsapjuk. A csapadékot 2 percen át vákuumban szárítjuk, majd T4 ligáz pufferben (50 mM Tris/HCl (pH 7,8), 10 mM MgCL, 10 mM DTT, 500 μΜ ATP) oldjuk. Ezután az (1) és (2) oligonukleotidek (lásd fent) hibridizálásával készített 50 pmól foszforilezett oligonukleotid lx ligáz-pufferrel készített oldatát adjuk hozzá, és a mintái 25 μΙ végtérfogatra állítjuk be. A ligálást 3 órán át 22 ’C-on 1 μΙ DNS-ligáz (1 Weiss-egység, Boehringer Mannheim) felhasználásával végezzük el. A reakciót oly módon állítjuk le, hogy a mintát 7 percen át 65 ’C-on inkubáljuk. A DNS-t kicsapjuk, szárítjuk, majd restrikciós pufferben (50 mM Tris/HCl (pH 8), 10 mM MgCl2, 50 mM NaCl) oldjuk. Ezután 20 egység BamHi-t és 10 egység Xbal-t adunk hozzá, majd a mintákat 1 órán át 37 ’C-on inkubáljuk. Az emésztést oly módon állítjuk le, hogy a mintákat 65 ’C-on 7 percen át hevítjük. Ezután lOx gél-mintapuffert (100 mM Tris/HCl (pH 8), 0.5% bróm-fenolkék, 0,5% xilén-cianol, 10 mM EDTA. 50 % glicerin) adunk hozzá, és a DNSfragmenseket 6%-os poliakrilamid gélen elválasztjuk. A gélt etidium-bromiddal (1 pg/ml) 5 percen át megfestjük, és a DNS-t 300 nM UV-fény alatt láthatóvá tesszük. Markir-DNS-gént HaelII segítségével emésztett DNS fágokat alkalmazunk (Gibco-BRL, Basel). A P1S25X/0 szabályozható promotort, RBSIOLSphl riboszómás kötőhelyet, hibridizált adaptort, bla-gént és replikációs eredetet tartalmazó DNS-sávokat (vektor DNS) a gélről szikével levágjuk, és 1.5 ml-cs Eppendorf-reagens csövecskékbe visszük át.
A DNS-sávokat tartalmazó akrilamid gél darabkát pipettaheggyel finom granulátummá aprítjuk. Ezután
HU 211 581 A9
200 μΙ lx TE-puffert (lOmM Tris/HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA) adunk hozzá, majd a mintát egy éjjelen át 4 ’C-on Eppendorf-minirázógépen rázatjuk. A mintát 15 percen át percenkénti 12 000 fordulat mellett centrifugáljuk, a felülúszót új Eppendorf-csövecskébe visszük át, és a DNS-t 0,3 M kálium-acetát jelenlétében 2,5 térfogat etanollal kicsapjuk. Ezután a DNS-t vákuumban szárítjuk, és 10 μ TE-pufferben oldjuk.
pg pDS6/RBSH,3A+5A nlazmidot Xbal és BamHI segítségével a gyártó cég által (BRL-Gibco, Basel) javasolt módon emésztünk. Az enzim inaktiválásáa (7 perc, 65 ’C) után a DNS-t a fent leírt módon kicsapjuk. A csapadékot 2 egység borjúvékonybélfoszfatázt (CIP, Boehringer Mannheim) tartalmazó 20 μΙ 50 mM Tris/HCl-ben (pH 8) oldjuk és egy órán át 37 “C-on inkubáljuk. A reakció leállítása céljából a mintákat 7 percen át 65 “C-on hevítjük. Ezután gélmintapuffert adunk hozzá, és a DNS-t 6%-os poliakrilamidgélen elektroforetikusan szétválasztjuk. A to-terminátort, catgént és a TI-terminátort tartalmazó polilinkert a fentiekben leírtak szerint izoláljuk.
A DNS vektort és az izolált fragmenst (0,5-0,5 pl) 30 μΐ térfogatban 2 egység T4-DNS ligázzal ligázpufferben 3 órán át 22 “C-on ligáljuk. A ligálást oly módon állítjuk le, hogy a mintákat 7 percen át 65 “C-on hevítjük. A transzformálást Morrison által leírt módon végezzük el [Methods Enzymol. 68, 326-331 (1979)], amelynek során gazdaszervezetként E. coli Ml5-t tartalmazó pDNIJ plazmidot alkalmazunk. A sejteket 100 μg/ml ampicillint és 25 μg/ml kanamicint tartalmazó LB-agar lemezeken szélesztjük. A lemezeket egy éjjelen át 37 C-on inkubáljuk.
A kontroll-ligációk - a várakozásnak megfelelően transzformánsokat nem tartalmaznak. A DNS-vektort és a fragmenst tartalmazó ligálások kb. 100 telepet adnak. Az egyes telepeket fogpiszkálóval leszedjük és 100 pg/ml ampicillint, valamint 25 pg/ml kanamicint tartalmazó 10 ml LB-táptalajbán tenyésztjük. A DNSplazmidot Bimbóim és tsai módszerével [Nucleic Acids Rés. 7. 1513-1523 (1979)] extraháljuk. A kapott DNS-csapadékot 200 pl TE-pufferben oldjuk.
D. pDS6/RBSII,SphI-His,His szekvencia analízise
Annak megállapítása céljából, hogy a Sphl-BamHladaptor a pDS6/RBSII,SphI-His,His plazmidba beépült-e, a kétszálú DNS-t a [y-32P)-ATP-el jelzett starter felhasználásával szekvenciáljuk. A startszekvencia a pDS8B/RBSII,SphI 199-218 helyzeteiben levő nukleotidokat tartalmazza, és ezért az SphI-hasítási hely ATG-je előtt 6 nukleotiddal fejeződik be. 15 μ] izolált DNS-t (0,3 pmól) etanollal kicsapunk és 80%-os etanollal egyszer mosunk. A csapadékot két percen át vákuumban szárítjuk, majd 8 pl 1/4 TE-pufferben oldjuk. Ezután [γ-32Ρ]ATP végjelzett starter szekvenciát (2 pmól) adunk hozzá, a mintákat 5 percen át 95 “Con hevítjük, majd 5 percen át 42 °C hőmérsékletű vízfürdőbe merítjük. Ezután a szekvenciáláshoz a Sangerés tsai féle dideoxilánc felszakításos módszert alkalmazzuk [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467(1977)].
A szekvenciaadatok azt mutatják, hogy az adaptor a pDS6/RBSIl,SphI-His,His plazmidba a kívánt módon beépült.
2. példa
A. Elv
A Hpal-HaelII fragmenst (527 bázispár hosszúságú) a P. falciparum KI izolátumának p-190 génjét tartalmazó klónből (Mackay et al. supra) izoláljuk. Egy BamHI összekötő darabokat e fragmens tompa végén ligáljuk, A BamHI segítségével történő emésztés után a fragmenst Bam Hl által előzetesen linearizált pDS6/RBSII,SphI-His,His-ba integráljuk.
B Az 1. fragmens előkészítése
A P. falciparum KI izolátumának pl90 génjét tartalmazó kiónt (6 pg) 15 egység Hpal és 25 egység HaelII által 40 pl pufferben [6 mM NaCl. 6 mM Tris/HCl (pH 7,6), 6 mM MgCIJ 1 órán át 37 C-on emésztjük. Ezután 4,5 μΐ lOx gél-mintapuffert [100 mM Tris/HCl (pH 8), 0,5% brómfenolkék, 0,5% xiléncianol, 10 mM EDTA, 50% glicerin) adunk hozzá, majd a DNS-fragmenseket 6%-os poliakrilamid-gélen lx TBE-ben [89 mM Tris/HCl (pH 8,0), 89 mM bórsav, 2 mM EDTA) mint gélelektroforézis pufferben 3 órán át 250 V mellett szétválasztjuk. A gélt 5 percen át Ethidiumbromiddal (1 pg/ml) megfestjük és a DNS-t 300 nM UV fénnyel láthatóvá tesszük. Markerként HaelII (Gibco-BRL, Bázel) által emésztett DNS fágokat alkalmazunk. A kívánt szekvenciájú DNS-sávokat (527 bázispár hosszúságú) a gélből kivágjuk és a fentiekben leírt módon tisztítjuk.
A fragmenshez 10 pmól foszforilezett BamHI öszszekötő darabot (CCGGATCCGG) adunk, és 5 egység T4-DNS ligázzal 3 órán át 22 “C-on inkubáljuk. A reakciót oly módon állítjuk le, hogy a mintát 7 órán át 65 “C-on hevítjük. A DNS etanolos kicsapása után a csapadékot restrikciós pufferben újraszuszpendáljuk, és 20 egység BamHI segítségével 2 órán át 37 ’C-on 30 pl össztérfogatban emésztjük. Az enzim inaktiválása (7 perc, 65 ’C) után gél-mintapuffert adunk hozzá, és a fragmenst elektroforézís után a fentiekben leírt módon izoláljuk. A kapott DNS csapadékot 30 pl TE pufferben újraszuszpendáljuk.
C. A pDS6/RBSIl,Sphl-His,His plazmid előállítása pg pDS6/RBSII,SphI-His,His plazmidot 30 pl restrikciós pufferben 20 egység BamHI segítségével 37 ’C-on 2 órán át emésztünk. A restrikciós enzim inaktiválása után (7 percen, 65 ’C) a DNS-t a fentiekben leírt módon kicsapjuk. A csapadékot 2 egység borjúvékonybélfoszfatázt (CIP Hoehringer, Mannheim) tartalmazó 20 pl 50 mM Tris/HCl-ben (pH 8) oldjuk és 1 órán át 37 ’C-on inkubáljuk. A reakciót oly módon állítjuk le, hogy a mintát 7 peren át 65 ’C-on hevítjük. Ezután gél-mintapuffert adunk hozzá, a DNS-t 6%-os poliakrilamid gélen elektroforetikusan szétválasztjuk, majd UV-fénnyel láthatóvá tesszük, a DNS-vektort a gélből kivágjuk, és a fentiekben leírt módon izoláljuk. A kapott DNS csapadékot 20 pl TE-pufferben újraszuszpendáljuk.
HU 211 581 A9
D. pGCJ plazmid felépítése μΐ DNS vektort és az izolált 1. fragmens felét 30 μΐ térfogatban 2 egység T4-DNS ligázzal 22 °C-on 3 órán át ligációs pufferben ligálunk. Egyidejűleg 1. DNS fragmens nélkül kontroll-ligálást végzünk el. A reakciókat oly módon állítjuk le, hogy a mintákat 7 percen át 65 ’C-on hevítjük. A transzformálást Morrison által leírt módon (supra) végezzük el, pDmll plazmidot tartalmazó E. coli Ml 5 felhasználásával. A sejteket 100 pg/ml ampicillint és 25 μg/ml kanamicint tartalmazó LB-agarlemezeken tenyésztjük. A lemezeket egy éjjelen át 37 'C-on inkubáljuk.
A kontroll-ligációk során - a várakozásnak megfelelően transzformánsokat nem kaptunk. A DNS vektort és az 1. fragmenst tartalmazó ligáció kb. 200 telepet ad. Az egyes telepeket fogpiszkálóval leszedjük és a fentiekben leírt módon analizáljuk. A DNS plazmidokat (5-5 μΐ) restrikciós pufferben BamHI felhasználásával emésztjük, az 1. fragmens kivágása céljából. Az összes plazmidot linearizáltuk, azonban fragmenst nem tudtunk kioldani. Ez arra utal, hogy a felépítés alatt egy BamHI hasítási hely elveszett (lásd az alábbiakban).
A plazmidokat a fent leírt módon pDMI, 1 plazmidot tartalmazó E. coli Ml5-ben transzformáljuk. Az egyes telepeket leszedjük, majd 100 ug/ml ampicillint és 25 pg/ml kanamicint tartalmazó 3 ml LB-táptalaj bán 600 nM (ODW0) - 0,6 optikai sűrűségig tenyésztjük. A tenyészetből egy 500 μΐ-es mintát elválasztunk (nem indukált kontroli-minta) és a maradék IPTG-hez 1 mM végkoncentráció eléréséig hozzáadjuk. Az inkubálást 3 órán át 37 ’C-on rázogatás közben folytatjuk (indukált minták). Az indukált és nem indukált tenyészetek 500500 μΐ-es mintáit 3 percen át percenkénti 12 000 fordulat mellett centrifugáljuk. A felülúszót eltávolítjuk, és a sejtcsapadékot SDS-gél-mintapufferben [0,1 M Tris/HCl (pH 6,8), 3% β-merkapto-etanol, 20% glicerin. 0.1% brómfenolkék, 3% SDS] újraszuszpendáljuk. A mintákat 5 percen át főzzük, jégre helyezzük, majd 12,5%-os SDS pohakrilamid-gélen (Laemmli. Natúré 227. 680-685 (1970)] 3 órán át 50 mA mellett szétválasztjuk. Ágéit szobahőmérsékleten 1 órán ál Coomassieblau segítségével megfestjük, majd 10% metanolt tartalmazó 10%-os ecetsavban 60 'C-on 3 órán át színtelenítjük. A megelemzett telepek fele az IPTG indukció után 24 kD molekulatömeg mellett erős sávot mutat. A telepek másik fele további új sávokat nem mutat.
E. PgCI szekvencia analízise
A DNS plazmid nukleotid szekvenciáját [γ-·,2Ρ] ATP-vel jelzett starter-szekvencia felhasználásával határozzuk meg. Egy starter szekvencia a pD58/RBSII,SphI 199-218 helyzeteiben levő nukleotideket tartalmaz, és ezért az Sphl restrikciós hasítási hely ATG-je előtt 6 nukleotiddel ér véget. A másik starterszekvencia a pDSB/RBSII,SphI 928-896 nukleotidjeit tartalmazza. A fenti módon a BamHI restrikciós enzim hasítási helyekbe integrált fragmensek mindkét oldalról szekvenciálhatók. A szekvencia adatok azt mutatják, hogy pl90 fragmens a BamHI hasítási helybe integrálódott, éspedig az RBSII.Sphl ATG-jével sorozatban, azonban a BamHI restrikciós hasítási rely e fragmens végén törölve lett.
F. A gyanta előkészítése, a szomszédos hisztidin maradékokat tartalmazó polipeptidek tisztításához 41,7 g bróm-ecetsavat 150 ml 2 n nátrium-hidroxidban oldunk és 0 ’C-ra hűtjük. Ezután keverés közben 42 g N£-Z-L-lizin 225 ml 2 n nátrium-hidroxid-oldattal kénezett oldatát 0 °C-on lassan becsepegtetjük. A hűtést 2 óra múlva leállítjuk, és az elegyet egy éjjelen át továbbkeverjük. A reakcióelegyet 2 órán át 50 ’C-on tartjuk, majd 450 ml 1 n sósavat adunk hozzá. Az elegy lehűlése után a kiváló kristályokat szűrjük. A terméket 1 n nátrium-hidroxidban oldjuk, majd azonos mennyiségű 1 n sósav hozzáadásával ismét lecsapjuk, és szűrjük. Fehér kristályok alakjában 40 g N-(5-benziloxikarbonilamino-l-karboxipentil)-imino-diecetsavat kapunk, op.: 172-174 ’C (bomlás). [<X]D = +9,9° (c = 1; 0,1 π NaOH).
7,9 g ily módon kapott lizinszármazékot 49 ml 1 n nátrium-hidroxidban oldunk, majd 5%-os palládium/szén hozzáadása után szobahőmérsékleten és normál nyomáson hidráljuk. A katalizátort szűrjük, és a szűrletet bepároljuk. 6,2 g N-(5-amino-1-karboxipentil)-imino-diecetsavat kapunk.
100 ml Sepharose® CL-6B-I (Pharmacia) 2x kb. 500 ml vízzel mosunk, majd 4 óra alatt 30 ’C-on 16 ml 4 n nátrium-hidroxiddal és 8,22 ml epibrómhidrinnel reagáltatjuk. A reakcióelegy össztérfogata 200 ml. Az aktivált Sepharose-t leszűrjük, vízzel semlegesre mossuk. és a reakciólombikba visszavisszük. 6,2 g N-(5amino-l-karboxipentil)-imino-diecetsaval 50 ml vízben oldunk, majd az oldatot és 10,6 g szilárd nátriumkarbonátot az aktivált Sepharose-hoz adunk. Az elegyet 60 ’C-on egy éjjelen ál lassan keverjük. A képződő [Sepharose® CL-6B]-O-GH2-CH(OH)-CH2-NH(CH2)4-CH(COOH)-N(CH2COOH)2 képletű NTA kelálgyantát egymásután 500 ml vízzel, 100 ml vizes 2 tömeg%-os NiSO4 6H2O oldattal, 200 ml vízzel, 200 ml 0,2 M ecetsavval (0,2 M Na Cl-t és 0,1 tömeg/térfogat % Tween 20-t tartalmaz), és 200 ml vízzel mossuk. A kapott [Sepharose® CL-6B]-O-CH2-CH(OH)CH2-NH-(CH2)4-CH(COOH)-N(CH2COO)2-Ni2+ képletű kelátgyanta nikkelion koncentrációja kb. 7,1 mikromól/ml.
G. A p!90-l polipeptid tisztítása
Az E. coli M15(pGCI, pDMI.l) tenyészetét 12 órán át 37 C-on erős rázogatás közben 100 pg/rnl ampicillint és 25 μg/ml kanamicint tartalmazó LB táptalajban tenyésztjük. A pl 90-1 polipeptid kifejezését 600 nm (OD60o) hullámhossz mellett 0,7 optikai sűrűségnél IPTG hozzáadásával (végkoncentráció 1 mM) indukáljuk. További 6 órás inkubálás után a sejteket centrifugálással learatjuk
A learatott sejteket (46,5 g) 7 M guanidin-hidrokloridban (140 ml) 4 ’C-on 1 óra alatt feltörjük. Az oldható fehérjéket percenkénti 10 000 fordulat mellett 4 ’Con 15 percen át végzett centrifugálással az oldhatatlan
HU 211 581 A9 részecskéktől elválasztjuk. A felülúszót 0,1 M tris/HCI (pH 7,5), 0,2 M NaCl pufferrel 5x hígítjuk, a fentiekben leírt módon centrifugáljuk, és ily módon nyers extraktumot kapunk.
A nyers extraktumot a fentiekben leírt NTA-nikkelkelát oszlopra (Sepharose CL-6B, nitrilo-triecetsav ligand, oszlopátmérő 5,0 cm, hossz 5,5 cm, átfolyási sebesség 500 ml/óra) visszük fel. A gyantát 0,1 M Tris/HCI (pH 7,5), 0,2 M NaCl pufferrel kiegyensúlyozzuk. A gyenge nikkelkelátmegkötő kapacitású vagy a p 190-1 polipeptidnél kevésbé hidrofób tulajdonságokkal rendelkező fehérje szennyezéseket az oszlopról kimossuk. Ezt a mosási műveletet előbb 0,1 M Tris/HCI (pH 7,5), 0,2 M NaCl pufferrel, majd 0,1 M Tris/HCI (pH 6,0), 0,2 M NaCl pufferrel (az alacsony affmitású nikkel-fehérje-komplexek megbontása), ezután 0.1 M Tris/HCI (pH 6,0), 1 M (NH4)2SO4 pufferrel (hidrofób kötések indukálása), végül 0,1 M Tris/HCI (pH 4,5) 1 M (NH4)2SO4 pufferrel (a nem hidrofób kölcsönhatásokon keresztül kötődő nikkel-kelát-fehéije komplex eluálása) végezzük el. A pl90-l eluálását az (NH4)2SO4 koncentráció csökkentésével végezzük el (lásd 7. ábra). A pl 90-1 kitermelés 66 mg, tisztaság kb. 90%.
Az NTA oszlopról összegyűjtött frakciókat 15-szörös mennyiségű vízzel hígítjuk, majd a pH-t 6,0-ra állítjuk be. és a frakciókat Fractogel TSK CM-65O(M) oszlopon (Merck, átmérő 1,6 cm, hosszúság 6,7 cm, átfolyási sebesség 1,5 ml/perc, kiegyensúlyozó puffer 50 mM nátrium-foszfát. pH 6,0) abszorbeáljuk. Apl90-l fehérjét 00,6 M NaCl lineáris gradiens szerint 2 órán át eluáljuk. A pl90-1 polipeptidet tartalmazó frakciókat egyesítjük és liofilizáljuk. (Kitermelés kb. 50 mg, tisztaság kb. 95 ’).
A magas molekulatömegű fehérjék nyomainak eltávolítását preparatív HPLC segítségével [Nucleosil 300S-C18 oszlop. (Macherey és Nagel): átmérő 0,4 cm, hosszúság 33 cm. átfolyási sebesség 1 ml/perc, kiegyensúlyozó puffer 0.1% trifluor-ecetsav, eluálás 070% acetonitril gradiens] vagy gélszűréssel [Sephacry1® S-200 (Pharmacia), átmérő 2,6 cm, hosszúság 81 cm. átfolyási sebesség 40 ml/óra, puffer 1% hangyasav) végezzük el. A tisztított pl90-l fehérjét liofilizálás után sómentes poralakjában nyerjük.
3. példa
A. Elv
A 407 bázispár hosszúságú Alul-BamHI fragmenst a P. falciparum KI izolátuma pl90 génjét tartalmazó kiónból (Mackay és tsai, supra) izoláljuk. Egy BamHI összekötő darabot a fragmens tompa végére illesztünk. BamHI által történő emésztés után a fragmenst előzetesen BamHI által linearizált pDS6/RBSII,SphI-His,His kifejező vektorba integrálunk.
B. A 2. fragmens előállítása
A P. falciparum KI izolátuma pl90 génjét tartalmazó kiónt (6 pg) 30 egység Alul és 15 egység BamHI segítségével restrikciós pufferben emésztünk. A fragmensek izolálása és egy BamHI összekötő darab (CGGATCCG) rákapcsolása után a fragmenst a fentiekben leírt módon tisztítjuk. A kapott DNS csapadékot 30 pl TE-pufferben újraszuszpendáljuk.
C. A pDS6/RBSlI,Sphl-His,His plazmid előkészítése
A kifejező vektor előkészítését a 2C. példában ismertettük.
D. A pGC2 plazmid felépítése
A ligálást, transzformálást és DNS analízist a 2D. példában leírtak szerint végezzük el. 4 plazmidban BamHI segítségével történő emésztéssel egy várt nagyságú (410 bázispár) fragmens vágható ki. A többi plazmidot csak linearizáltuk.
E. pGC2 szekvencia analízise
A DNS plazmidot a fentiekben leírt módon szekvenciájuk. Két különböző plazmidtípus jelenlétét figyeltük meg. A pGC2a plazmidban a 2. fragmens a várakozásnak megfelelően helyes orientációban, a RBSÍI.Sphl riboszómás kötési helye ATG-jével sorozatban integrálódott és mindkét végén BamHI restrikciós enzimhasftó helyeket tartalmaz. A másik típusú plazmid jelölése PGC2b, és a maláriaspecifikus szekvencia előtt egy kis törlést tartalmaz. E törlés ellenére azonban a teljes pl90 génszekvencia és a szomszédos hisztidinmaradékokat tartalmazó affinitáspeptid ebbe a plazmidba integrálódott. A teljes celluláris fehérjék SDS-poliakrilamid-gélen végzett analízise azt mutatja, hogy valamennyi klón, amely a pl90 szekvenciákat helyes orientációban és az RBSII.Sphl ATG-jével sorozatban tartalmazza, egy kb. 20 kD molekulatömegű kifejezetten látható fehérjét fejez ki. A RBSII.Sphl és a pl90 szekvencia között kis törlést tartalmazó plazmid (lásd fent) kb. ötször több polipeptidet fejez ki, mint a törlést nem tartalmazó plazmid. A pGC2a plazmidból levezetett polipeptidek jelölése pl90-2a, és a PGC2b polipeptidből levezetett polipeptidek jelölése pl9O-2b.
Mint már említettük, a kis törlést tartalmazó PGC2b plazmidot egy törlési mutáció által véletlenül kaptuk. A szakember egy pGC2b típusú plazmidot a pGC2a plazmidból is előállítani képes oly módon, hogy a plazmidot célzott mutagenézisnek veti alá [Morinaga et al., Bio/Technology 7, 636-639 (1984)] olyan kis szintetikus oligonukleotid-szekvencia felhasználásával, amely a kívánt törléssel szomszédos nukleotidszekvenciát tartalmazza, azonban amelyből a törlendő nukleotidok hiányoznak.
F. pl90-2b polipeptid tisztítása
A pl9O-2b polipeptid tisztítását a pl90-l polipeptidhez hasonlóan végezzük el (lásd 2. példa). 16,6 g E. coli sejtet 50 ml 7 M guanidin-hidrokloridban feltörünk, és a nyers extraktumot NTA nikkelkelál oszlopra (átmérő 2,6 cm, hosszúság 8,8 cm, átfolyási sebesség 160 ml/óra) visszük fel. Kitermelés 14 mg pl90-2b, tisztaság kb. 90%.
Az NTA-oszlopról nyert, egyesített frakciókat vízzel 15-szörösre hígítjuk, a pH-t 7,5-re állítjuk be, majd Fractogel TSK DEAE-650® oszlopon (átmérő 1,6 cm, hosszúság 8,8 cm, átfolyási sebesség 120 ml/óra, kiegyensúlyozó puffer 2,5 mM Tris/HCI (pH 7,5) adszorbeáljuk. A pl90-2b fehérjét 0-0,6 M NaCl lineáris gradiens szerint 3 órán át eluáljuk. A pl90-2b fehérjéi
HU 211 581 A9 tartalmazó frakciókat egyesítjük és liofilizáljuk. Kitermelés 9 mg, tisztaság >95%.
Az ezután következő tisztítást a 2. példában leírt módon preparatív HTLC segítségével végezzük el, RP18 oszlopon (Macherey és Nagel, átmérő 10 mm, hosszúság 250 mm, átfolyási sebesség 5 ml/perc, eluálás acetonitril gradienssel, mintaoldal 2-5 mg DEAEpool). Kitermelés kb. 5 mg.
A pl90-2a polipeptidet a korábbiakkal azonos módon tisztíthatjuk.
4. példa
A. Eh
A pl90 génből levezetett szekvenciát tartalmazó BamHI-fragmenst (3. fragmens) mindkét BamHI restrikciós hasítóhelyet tartalmazó pGC2a plazmidból izoláljuk. Ezt a fragmenst BamHI által emésztett pGCl vektorba integráljuk és ily módon a pGC3 plazmid keletkezik, amely egy fúziós polipeptid kifejezésére képes.
B. A 3. fragmens előkészítése pg pGC2a plazmidot 20 pl restrikciós pufferben 15 egység BamHI-vel 1 órán át 37 “C-on emésztünk. Az enzimet hevítéssel inaktiváljuk (7 perc, 65 °C). majd a fragmenst a fentiekben leírt módon izoláljuk, és 20 pl TE-pufferben újraszuszpendáljuk.
C. A pGCl plazmid előkészítése pg pGCl plazmidot 15 egység BamHI-vel emésztünk. A DNS-t kicsapjuk, a borjúvékonybélfoszfatázzal a fentiekben leírt módon kezeljük. A hnearizált DNS plazmidot 6%-os preparatív poliakrilamid gélen (lásd fent) tisztítjuk, és 10 pl TE-pufferben újraszuszpendáljuk.
D. pGC3 felépítése
A BamHI által linearizált PGCl plazmidot (= DNS vektor) 10 pl izolált 3. fragmenssel ligáljuk (2 egység T4DNS-ligáz, ligációs puffer, 3 óra. 22 ’C, 30 pl össztérfogat). A 3. DNS fragmens nélkül végzett kontroll-ligálást párhuzamosan hajtjuk végre. A ligációkat a minták 65 ”C-on 7 percen át történő hevítésével leállítjuk. A transzformációkat Morrison (supra) által leírt módon hajtjuk végre A DNS vektort és 3. fragmenst tartalmazó ligálás kb. 50 telepet ad. A telepek elemzését a fenti módon végezzük el. A DNS plazmidokat BamHI által emésztjük. Az elemzett plazmidok közül 10 mintegy 400 bázispár hosszúságú BamHI fragmenst tartalmaz.
E. A pGC3 plazmid szekvencia analízise és a pl903 plazmid kifejezése plazmid DNS szekvenciáját a fentiekben leírt módon meghatározzuk. Egy plazmid helyes orientációban tartalmazza a BamHI fragmenst. A szekvencia analízis azt mutatja, hogy a 3. fragmens és az 1. fragmens azonos transzlációs leolvasással fúzionált. A plazmid jelölése pGC3. A SDS-PAGE felhasználásával indukált tenyészetek elemzése azt mutatja, hogy a PGC3-t tartalmazó kiónok egy kb. 40 000 dalion molekulatömegű polipeptidet termelnek. A részletek a 9. ábrán láthatók.
F. A p 190-3 polipeptid tisztítása p-190-3 polipeptidet tartalmazó baktériumüledéket
0,01 M Hepes-ben (pH 7,8, 0,01 MgSO4, 0,15 M NaCl, 10% glicerin), 4x10'° sejt/ml koncentrációban újraszuszpendálunk. Ezután 1 pg/ml Dnase-l-tés 100 egység/ml proteáz inhibitort (Trasylol®, Bayer) adunk hozzá és a baktériumsejteket présben kb. 1,379x10* Pa (20 000 font/négyzet inch) nyomáson feltörjük. A sejtek feltörését kontraszt mikroszkópon ellenőrizzük; értéke 98% felett van.
A nyers lizátumot percenkénti 2000 fordulat mellett (480 x g) 15 percen át végzett, percenkénti 8000 fordulat mellett (8000 x g) 15 percen át végrehajtott, percenkénti 15 000 fordulat mellett (20 000 x g) 15 percen át végzett és percenkénti 42 000 fordulat mellett (150 000 x g) 60 percen át végrehajtott differenciál centrifugálással nyerjük. A pl90-3 polipeptid eloszlását a különböző frakciókban SDS (SDS-PAGE) jelenlétében végzett poliakrilamid gélelektroforézissel, s immunobiot technikával határozzuk meg.
A pl90-3 polipeptid több mint 80%-a a percenkénti 8000 és 5000 fordulattal végzett centrifugálás üledékében helyezkedik el. A percenkénti 2000 fordulatszámú centrifugálásnál nyert üledék baktériumtörmeléket, a percénkénti 42 000 fordulattal végzett centrifugálás üledéke baktériummembránokat és a percenkénti 42 000 fordulattal végzett centrifugálás felülúszója baktériumos citoplazmatikus fehéijéket tartalmaz. A percenkénti 8000 és 15 000 fordulatszámmal végzett centrifugálás üledékét 10% glicerin, 5 mM EDTA-t és 5 nM DTT-t tartalmazó 25 mM imidazol-hidrokloridban (pH 7,5) mágneses keverővei történő keverés közben újraszuszpendáljuk. Azonos pufferben azonos térfogatú 6 N karbamidot készítünk és a szuszpenzióhoz adjuk. A szuszpenziót percenkénti 15 000 fordulat mellett (20 000 x g) 15 percen át centrifugáljuk. Ez az extrakciós lépés néhány baktériumos szennyezést szolubilizál, míg a pl90-3 a csapadékban marad. A csapadékot 9 M karbamidban, amelyet 25 mM imidazol-hidrokloridban (pH 7.5), 10% glicerinben, 5 mM EDTAés 5 mM DTT jelenlétében állítottunk elő, újraszuszpendáljuk. Az oldatot percenkénti 42 000 fordulat mellett (150 000 x g) 60 percen át centrifugáljuk, és előzetesen
M karbamiddal és 25 mM imidazol-hidrokloriddal (pH 7,5) kiegyensúlyozott kromatofokuszáló oszlopra (PBE 94, Pharmacia) visszük fel. A meg nem kötött anyagot az oszlopról kiegyensúlyozó pufferrel kimossuk, és a pl90-3 polipeptidet vízzel 1:8 arányban hígított és 9 M karbamidot tartalmazó polipuffer 74-HC1 oldattal (Pharmacia) eluáljuk (pH 4,0). Apl90-3 polipeptid eloszlását az oszlopról nyert frakcióban SDSPAGE segítségével meghatározzuk. Apl90-3 polipeptidet tartalmazó frakciókat egyesítjük, és 65%-os ammónium-szulfát-oldattal kicsapjuk. A keveréket 2 órán át jégen inkubáljuk, és a csapadékot percenkénti
000 fordulat (12 000 x g) mellett végzett 15 perces centrifugálással összegyűjtünk. A csapadékot 4 M guanidinium-hidrokloridot tartalmazó nátriumfoszfát-pufferben (pH 6,8) szolubilizáljuk. Az oldatot 4 M guanidin-hidrokloridot tartalmazó 1 mM nátrium-foszfál12
HU 211 581 A9 puffenel (pH 6,8) szemben 4 órán át dializáljuk. A dializátumot percenkénti 42 000 fordulat mellett 60 percen át centrifugáljuk, és a maradékot 4 M guanidinhidrokloridot tartalmazó 1 mM nátrium-foszfát-pufferrel (pH 6,8) egyensúlyba hozott hidroxíapatit oszlopra (HA-ultragél, LKB) visszük fel. A meg nem kötött anyagot az oszlopról kiegyensúlyozó pufferrel kimossuk, és a pl90-3 polipeptidet 4 M guanidin-hidrokloridot tartalmazó kálium-foszfát pufferrel (pH 6,8) 0-0,4 M lineáris gradiens szerint 0,2 ml/perc átfolyási sebességgel eluáljuk. Apl90-3 eloszlását az oszlopról nyert frakciókban SDS-PAGE segítségével határozzuk meg. Minthogy a guanidin-hidroklorid SDS-el oldhatatlan csapadékot képez, minden frakció aliquot részét előbb triklór-ecetsavval (TCA) kicsapjuk (10% végkoncentráció). A csapadékokat Eppendorf-centrifugában 3 percen át centrifugáljuk, a csapadékokat acetonban történő újraszuszpendálással TCA-mentesre mossuk, majd ismét centrifugáljuk.
A pl9O-3 polipeptidet tartalmazó, a HA ultragél oszlopról nyert frakciókat egyesítjük, és 65%-os telített ammónium-szulfáttal a fentiekben leírt módon lecsapjuk. A kicsapott fehérjéket centrifugáljuk, és a felülúszót 0,9%-os konyhasó-oldatban újraszuszpendáljuk. Minthogy a pl 90-3 polipeptid - az ammóniumszulfáttal ellentétben - konyhasó-oldatban nem oldódik, az ammónium-szulfát további centrifugálással a felülúszóban elválasztható és a csapadékból tiszta p 190-3 nyerhető. Az immunobiot [Western-Blot, Towbin et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 76,4350-4354 (1979)] azt mutatja, hogy a pl90-3 nem csupán nyúlpoliklonáris antiautentikus pl90 antiszérummal, hanem monoklonális egér anti-pl90-l és anti-pl90-2 antitestekkel is reagál.
Apl90-3 polipeptidet preparatív SDS-PAGE segítségével tovább tisztíthatjuk [Takacs, Immunoi. Methods 1. 81-105 (1979)]. Egy ilyen tisztítás eredményét a 9. ábrán tüntetjük fel. A tisztított pl90-3 redukáló körülmények (próbaminta, 5% β-merkapto-etanol nélkül) végzett SDS-PAGE analízise azt mutatja, hogy 13-merkapto-etanol távollétében a pl90-3 gyorsan dimereket, primereket és tetramereket képez. Ez az oka annak, hogy a pl90-3 a legtöbb vizes pufferben nem oldódik.
A konyhasóval mosott, ammónium-szulfáttal lecsapott, a fentiekben leírt 190-3 üledéket antiszérum gyártására immunogén anyagként alkalmazzuk. A csapadékot konyhasó-oldatban üveg-teflon homogenizátor segítségével újraszuszpendáljuk. A szuszpenziót teljes Freund-féle adjuvánssal (CFA) összekeverjük vagy alumínium-hidroxidon adszorbeáljuk, az injekciókhoz történő felhasználás előtt.
5. példa p!90-l, p!90-2b ésp!90-3 immunogenitási adatai
A pGCI, pGC2b vagy pGC3 által transzformált E. coli M15 egyes telepeit 100 gg ampicillint és 25 pg kanamícínt tartalmazó LB-táptalajt magábanfoglaló csövecskékre visszük át és erős rázogatás közben 12 órán át 37 C-cn tenyésztjük. A tenyészeteket 600 nm (ODeoo) hullámhossz mellett 0,7 optikai sűrűségnél ITPG-vei (végkoncentráció ImM) indukáljuk. A sejteket 6 órás inkubálás után centriftigálással összegyűjtjük. A 40 μΐ táptalajból izolált sejteket 3% nátrium-dodecil-szulfátot (SDS), 3% β-merkapto-etanolt, 20% glicerint és 125 mM Tris/HCl-t (pH 6,8) tartalmazó mintapufferben újraszuszpendáljuk. A mintákat 5 percen át főzzük, jégen lehűtjük és 30 másodpercen át 12 000 x g mellett centrifugáljuk. A mintákat SDS-poliakrilamidgélen Laemmli szerint (supra) 3 órán át 30 mA mellett elektroforetikus úton szétválasztjuk (12% akrilamid, akrilamid/bisz-akrilamid arány 30:0,8). A polipeptideket az SDS-poliakrilamidgélről Westemblot módszerrel (Towbin és tsai, supra) nitrocellulózszűrőpapírra visszük át. A szűrőt 10 percen át 1 x TBS-el mossuk [15 mM Tris/HCl (pH 7,4), 150 mM Na Cl], majd 30 percen át 1 x TBS-ben (5% zsírmentes tejpor) inkubáljuk. A szűrőt 2 órán át nyúl-anti-pl90antiszérummal (1:1000 hígítás, lx TBS-ben, 5% zsírmentes tejpor) inkubáljuk. A meg nem kötött antitesteket lx TBS-el végzett ötszöri mosással eltávolítjuk. A szűrőt ekkor egy második antitesttel [kecske-anti-nyúl, torma-peroxidázon (Biorad) megkötött, 1:1000 hígítás 1 x TBS-ben, 5% zsírmentes tej] egy órán át inkubáljuk. A szűrőt az inkubálás után I x TBS-el ötször mossuk, majd 50 ml 1 x TBS-hez adjuk és 10 ml 4-klór-naftolt (Sigma, 4 mg/ml, metanolban) adagolunk be. Ezután 50 μΐ hidrogén-peroxidot adunk hozzá, majd az antiszérummal reakcióba lépett sávokat láthatóvá tesszük. A 10. ábrán levő 1-3 nyom azt mutatja, hogy a természetes parazita pl90 fehérje által termelt nyúlszérum minden nyomban specifikusan egyetlen sávval reagál. Ez a sáv ugyanolyan messzire vándorol mint egy erős sáv egy SDS-poliakrilidgélen, amelyet párhuzamosan azonos mintával készítettünk és Coomassie brilliant blau R-250 segítségével megfestettünk (10. ábra, C rész). A rekombináns polipeptidek molekulatömege a várt érték. Egy második Western blotban endémiás területről származó egyesített humán maláriaszérumokat alkalmazunk. Ugyanezek a sávok ismét erős szignált adnak, még a szérum 1:2000 hígításában is (10. ábra, E-rész), és ez arra utal, hogy a p 190-1 (1. nyom) és a p 190-3 (3. nyom) a P. falciparum fő merozoita felületi antigénje 190 kD előtermékének fontos epitopja. A pl90-2b polipeptid - a pl90-1 és pl90-3 polipeptiddel ellentétben - endémiás területről származó humán maláriaszérumokkal nem reagál (10. ábra, B-rész, 2. nyom). Ez an-a vezethető vissza, hogy a pl90-2b által jelölt epitop a pl90 polipeptid membránjának közelébén helyezkedik el, és ezért nincs az emberi immunrendszernek kitéve. A natív pl90 elleni nyúlszérumok ezzel az epitoppal reagálnak. Ez azzal magyarázható, hogy az állatokat hajtogatlan pl90-el immunizáltuk, és nem pedig azzal, hogy ez az epitop erről a polipeptidről hiányzik.
A Western-blot eredményeit ELISA teszt segítségével nyúl-anti-pl90-szérum segítségével igazoljuk (I. táblázat). A negatív szarvasmarhaszérumalbumin E. coli lizátum O. D. (optikai sűrűség) mérésének eredménye 0,01 és 0,02. A pozitív kontroll - azaz a parazi13
HU 211 581 A9 tából izolált natív pl90 fehérje - 0,13 értéket ad. Az E. coli M15 (pGCl; pDMI.l) és E. coli M15 (pGC2b; pDMI,l) baktériumos lizátjainak értéke 0,15 és 0,13. Ezek az értékek a natív pl90 fehéije (pozitív kontroll) által adott értékkel (0,13) összehasonlíthatók. A fentiekből arra lehet következtetni, hogy a pl90-1 és pl 902b rekombináns polipeptidek a pl90 fehérje egyes fontos epitopjai.
/. táblázat
Minta O. D. (optikai surűség)4S0
Szarvasmarhaszérumalbumin 0,01
E. coli M15/pMF-l 0,02
Natív pl90 fehérje 0,13
E. coli Μ15 (pGCl ;pDMI, 1) 0,15
E. coli Μ15 (pGC2b;pDMI, 1) 0,13
Az antigéneket az anti-pl90 nyúlszérum (hígítás 1:2000) felhasználásával mutatjuk ki. A lemezek bevonásához 10 ng BSA-t és pl90-t alkalmazunk. A baktériumos lizátumok összfehérjetartalma kb. 1 pg. Az optimális bevonatkoncentráciő meghatározásához minden mintához hígítási görbét készítünk.
Egy további kísérletben Balb/c egereket két, egyhónapos időközben beadott, kb. 50-50 pg pl90-I-et vagy 200-200 pg pl90-2b-t tartalmazó szubkutáns injekcióval immunizálunk. Az első injekciót teljes Freund-féle adjuvánsban készítjük el. Egy harmadik injekciót (50 pg antigén teljes Freund-féle adjuvánsban) a második injekció után egy hónappal (pl 90-1) vagy két héttel (pl90-2b) adunk be. Három nap (pl90-l illetve négy nap (pl90-2b) múlva a szérumot levesszük és az EL1SA teszt segítségével a tisztított pl90-l, pl90-2b vagy pl90-3 polipeptiddel mutatott reakcióra vizsgáljuk, vagy különböző, vérstádium fixált P. falciparum izolátumok felhasználásával közvetett immunofluoreszcencia-meghatározásnak vetjük alá.
Az ELISA teszthez a lemezeket antigénnel vonjuk be (1 pg/ml, 0,14 M NaCl) és szarvasmarhaszérumalbuminnal (10 mg/ml 0,1 M borát, 0,14 M NaCl, pH 8,4)] blokkoljuk. Szérummintákat (10-szeres hígítás) 2 órán át hozzáadunk. A lemezeket borát/konyhasó pufferrel mossuk és alkálikus foszfatázzal történő mosás után a nyúl-anti-egér Ig-n (Sigma) mutatott antitestkötődést a gyártó cég előírásai szerint meghatározzuk. A II. táblázat adataiból látható, hogy a pl90-1 és pl90-2b Balb/c egéren immunogén, az antiszérum pl90-1-el szemben a pl90-2b-el szignifikáns keresztreakciót nem mutat (vagy fordítva), és az anti-pl90-1, valamint az anti-pl90-2b a ρ 190-3-al reagál.
II. táblázat
Polipeptid
Szérum pl 90-1 pl90-2b pl 90-3
Anti pl90-1 10J (0,28) 102 (0,22) 106 (0,37)
Anti pl90-2b >102 (0,11) 106 (1,6) 106
(0,25)
Ali. táblázatban az egér-anli-p 190-1 és-anti-pl902b-nek a ρ 190-1, pI90-2b és pl90-3 polipeptidekre kifejtett ELISA literét mutatjuk be. A számok e titer optikai sűrűségének felelnek meg. A <0,1 optikai sűrűségeket negatívnak tekintettük.
Az immunofluoreszcencia teszthez a parazita aszinkron tenyészetei P. falciparum fertőzött eritrocitáinak csepp-készítményeit készítjük elő. A levegőn szárított tárgylemezt (12 csepp tárgylemezenként) -20 ’Con tároljuk. A tárgylemezeket közvetlenül felhasználás előtt acetonnal fixáljuk. A parazitákat 20 percen át 37 °C-on teszt-szérumokkal kezeljük. A tárgylemezt PBSel mossuk, fluoreszceinnel konjugált kecske-anti-egérIG-antiszérumot adunk hozzá és a mintákat további 20 percen át inkubáljuk. A tárgylemezt mossuk, 50%-os glicerint (PBS-eben) rétegezünk föléje és egy fedőlemez ráhelyezése után UV-fényben vizsgáljuk. Az alábbi P. falciparum izolátumokat vizsgáljuk: KI, MAD-20, FCH-5, Ro-33, Ro-58. Valamennyi izolátum pl90-l-el vagy pl90-2b-el immunizált egérszérummal szemben pozitiven elszíneződött (szérumhígítás 1:100).

Claims (21)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. (I) képletű polipeptid (mely képletben
    A jelentése valamely affinitáspeptidmaradék vagy e csoport hiányozhat;
    B jelentése (II) képletű csoport, vagy annak fragmense, vagy (III) képletű csoport, vagy annak fragmense, vagy e szekvenciák vagy fragmensek valamely kombinációja, azzal a feltétellel, hogy a fent említett fragmensek a P. falciparum fő merozoita felületi antigénje 190kD előterméke legalább egy epitopját jelentik vagy tartalmazzák, és
    C jelentése valamely peptidmaradék vagy e csoport hiányozhat) azzal jellemezve, hogy a polipeptid P. falciparum különböző izolátumaival szemben immunválasz kiváltására képes.
  2. 2. (I) képletű polipeptid (mely képletben
    A jelentése valamely affinitáspeptidmaradék vagy e csoport hiányozhat;
    B jelentése (III) képletű csoport vagy annak fragmense, mimellett ez a fragmens a P. falciparum fő merozoita felületi antigénje 190kD előterméke legalább egy epitopját jelenti vagy tartalmazza; és
    C jelentése valamely peptidmaradék vagy e csoport hiányozhat) azzal jellemezve, hogy a polipeptid P. falciparum különböző izolátumaival szemben immunválasz kiváltására képes.
  3. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti polipeptid, azzal jellemezve, hogy az A affinitáspeptidmaradék két vagy több szomszédos hisztidinmaradékot tartalmaz.
  4. 4. A 3. igénypont szerinti polipeptid, azzal jellemezve, hogy az A affinitáspeptidmaradék
    MetHisHisAlaProGlySerGly,
    MetHisHisAlaProGlySer vagy
    MetHisHisAlaProGlySer vagy MetHisHisAlaPro.
  5. 5. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti polipeptid, azzal jellemezve, hogy a C peptidmaradék a (VIII) vagy
    HU 211 581 A9
    ValAspLeuGlnProSerLeuAspSerCys képletnek felel meg.
  6. 6. A (IV) képletű aminosavszekvenciával rendelkező polipeptid.
  7. 7. Az (V) képletű aminosavszekvenciával rendelkező polipeptid.
  8. 8. A (VI) képletű aminosavszekvenciával rendelkező polipeptid.
  9. 9. A (VII) képletű aminosavszekvenciával rendelkező polipeptid.
  10. 10. Az 1-9. igénypontok bármelyike szerinti, valamely hordozóanyagon adszorbeált vagy ahhoz kovalensen kötött polipeptid.
  11. 11. Az 1-9. igénypontok bármelyike szerinti polipeptidet kódoló DNS fragmens.
  12. 12. A 11. igénypont szerinti DNS fragmenst tartalmazó replikálható mikrobás vektor.
  13. 13. A 12. igénypont szerinti replikálható vektor, azzal jellemezve, hogy a DNS fragmens működőképesen egy kifejező kontroll szekvenciához van kötve.
  14. 14. A 12. vagy 13. igénypont szerinti vektorral transzformált mikroorganizmus.
  15. 15. Az 1-10. igénypontok bármelyike szerinti polipeptid. emlősöknek maláriával szemben történő immunizálására
  16. 16. Eljárás az 1-9. igénypontok bármelyike szerinti polipeptidek előállítására, azzal jellemezve, hogy a 12. vagy 13. igénypont szerinti vektorral transzformált mikroorganizmusokat a kódolt polipeptid kifejezését lehetővé tevő körülmények között tenyésztünk.
  17. 17. Eljárás a 14. igénypont szerinti mikroorganizmusok előállítására, azzal jellemezve, hogy valamely mikroorganizmust a 12. vagy 13. igénypont szerinti vektorral önmagában ismert módon transzformálunk.
  18. 18. Eljárás a P. falciparum fő merozoita felületi antigénje 190 kD előtermékének konzervált epitopja ellen irányított antitestek előállítására, azzal jellemezve, hogy valamely, az 1-10. igénypontok bármelyike szerinti polipeptidet a polipeptiddel szemben immunválasz kiváltására képes megfelelő gazdaszervezetbe befecskendezünk, és a képződő antitesteket önmagában ismert módon izoláljuk.
  19. 19. P. falciparum fő merozoita felületi antigénje pl90 előtermékével szemben specifikus antitesteknek valamely gazdaszervezetben történő kiváltására képes immunogén kompozíció, amely valamely, az 1-10. igénypontok bármelyike szerinti polipeptidet és gyógyászatilag alkalmas adjuvánst tartalmaz.
  20. 20. A 19. igénypont szerinti kompozíció, mint vakcina.
  21. 21. Az 1-9. igénypontok bármelyike szerinti polipeptidek felhasználása emlősöknek maláriával szemben történő immunizálására szolgáló immunogén kompozíció előállítására.
HU95P/P00264P 1987-03-19 1995-06-20 Plasmodium falciparum merozoite antigen-peptide HU211581A9 (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB878706599A GB8706599D0 (en) 1987-03-19 1987-03-19 Plasmodium falciparum merozoite antigen peptides

Publications (1)

Publication Number Publication Date
HU211581A9 true HU211581A9 (en) 1995-12-28

Family

ID=10614280

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU95P/P00264P HU211581A9 (en) 1987-03-19 1995-06-20 Plasmodium falciparum merozoite antigen-peptide

Country Status (17)

Country Link
US (1) US5238836A (hu)
EP (1) EP0283829B1 (hu)
JP (1) JP2567024B2 (hu)
AT (1) ATE92526T1 (hu)
AU (1) AU613344B2 (hu)
DE (1) DE3882755D1 (hu)
DK (1) DK84388A (hu)
ES (1) ES2058156T3 (hu)
GB (1) GB8706599D0 (hu)
HU (1) HU211581A9 (hu)
IE (1) IE62252B1 (hu)
IL (1) IL85724A (hu)
MY (1) MY103217A (hu)
NZ (1) NZ223860A (hu)
PH (1) PH25320A (hu)
PT (1) PT87022B (hu)
ZA (1) ZA881775B (hu)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5225534A (en) * 1987-09-08 1993-07-06 Hoffmann-La Roche Inc. Recombinant malarial polypeptides
EP0309746A1 (de) * 1987-09-08 1989-04-05 F. Hoffmann-La Roche Ag Antimalaria-Vakzine
GB9002512D0 (en) * 1990-02-05 1990-04-04 3I Res Expl Ltd Polypeptides and dna encoding same
AUPO517897A0 (en) * 1997-02-19 1997-04-11 Csl Limited Chelating immunostimulating complexes
ZA981370B (en) * 1997-02-20 1998-09-07 Cerberus Developments Bv Method and apparatus for continuous flow isoelectric focusing for purifying biological substances
EP1754717A1 (en) * 2005-08-19 2007-02-21 Université de Lausanne Antigenic peptides and their use

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK79985A (da) * 1984-02-22 1985-08-23 Wellcome Found Kloning af dna for protozoelle antigener og dets anvendelse
US4569794A (en) * 1984-12-05 1986-02-11 Eli Lilly And Company Process for purifying proteins and compounds useful in such process
EP0254862A1 (en) * 1986-06-26 1988-02-03 BEHRINGWERKE Aktiengesellschaft Vaccines against protozoan parasites
US4735799A (en) * 1987-01-14 1988-04-05 Patarroyo Manuel E Malaria vaccine
CA1340522C (en) * 1987-03-10 1999-05-04 Heinz Dobeli Fusion proteins containing neighbouring histidines for improved purification

Also Published As

Publication number Publication date
US5238836A (en) 1993-08-24
DK84388A (da) 1988-09-20
PH25320A (en) 1991-04-30
ES2058156T3 (es) 1994-11-01
DK84388D0 (da) 1988-02-18
PT87022A (pt) 1988-04-01
IL85724A0 (en) 1988-08-31
AU1307788A (en) 1988-09-22
MY103217A (en) 1993-05-29
GB8706599D0 (en) 1987-04-23
IL85724A (en) 1994-11-28
NZ223860A (en) 1991-05-28
AU613344B2 (en) 1991-08-01
ATE92526T1 (de) 1993-08-15
IE62252B1 (en) 1995-01-11
PT87022B (pt) 1992-06-30
JP2567024B2 (ja) 1996-12-25
ZA881775B (en) 1988-09-19
JPS63275599A (ja) 1988-11-14
IE880809L (en) 1988-09-19
DE3882755D1 (de) 1993-09-09
EP0283829B1 (de) 1993-08-04
EP0283829A1 (de) 1988-09-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP0191748B1 (en) Malaria vaccine
AU639588B2 (en) Malaria vaccine comprising an immunogenic polypeptide
JP3023997B2 (ja) 組み換えコクシジウム症ワクチン−５−７アイメリア表面抗原
US5824788A (en) Cloning of gene encoding the GP28.5 protein of toxoplasma gondii; peptide fragments of said protein and their applications
HU211581A9 (en) Plasmodium falciparum merozoite antigen-peptide
HU217420B (hu) Új immunogén polipeptidek, ezeket tartalmazó vakcina, és eljárás a fenti anyagok előállítására és felhasználására
US5395614A (en) Protective Plasmodium falciparum hybrid proteins which contain part-sequences of the malaria antigens HRPII and SERP, the preparation and use thereof
PT96132A (pt) Processo de preparacao de polipeptidos de vectores e de vacinas contra a malaria
US7910330B2 (en) Efficient expression of Plasmodium apical membrane antigen in yeast cells
CA2006587C (en) Membrane proteins and peptides of haemophilus influenzae type b
US5573943A (en) Cloning and expression of a rhoptry associated protein of P. falciparum
JPH01503514A (ja) 免疫原性ポリペプチドとその精製法
JPS63503512A (ja) 新規ワクチン
IE910966A1 (en) Plasmodium Sporozoite Antigen
PT93951A (pt) Processo de preparacao de polipeptidos imunogenicos e de uma vacina compreendendo estes polipeptidos
WO1989006971A1 (en) Conserved rotavirus gene segments and use in immunization and neutralization
AU645831B2 (en) Cloning and expression of a rhoptry associated protein of P.falciparum