HU209865B - Method for determinating the presence of hiv - Google Patents

Abstract

A találmány tárgya eljárás, melynek során humán biológiai folyadékban vagy sejtekben meghatározzák az aktivált RNáz L-nek mint a HÍV - azaz az immunelégtelenséget okozó vírus - fertőzések markerének jelenlétét oly módon, hogy mérik egy 28S rRNS-ből és 18S rRNS-ből származó, előre kijelölt hasítási termék mennyiségét, valamint - kívánt esetben - egy bioaktív 2'-5' A oligomer koncentrációját. A humán biológiai folyadék célszerűen vér vagy vérfrakció. HU 209 865 B A leírás terjedelme: 12 oldal (ezen belül 2 lap ábra)

Description

A találmány tárgya eljárás, melynek során humán biológiai folyadékban vagy sejtekben meghatározzák az aktivált RNáz L-nek mint a HÍV - azaz az immunelégtelenséget okozó vírus - fertőzések markerének jelenlétét oly módon, hogy mérik egy 28S rRNS-ből és 18S rRNS-ből származó, előre kijelölt hasítási termék mennyiségét, valamint - kívánt esetben - egy bioaktív 2'-5' A oligomer koncentrációját. A humán biológiai folyadék célszerűen vér vagy vérfrakció.

HU 209 865 B

A leírás terjedelme: 12 oldal (ezen belül 2 lap ábra)

HU 209 865 Β

A találmány tárgya eljárás, melynek során humán biológiai folyadékban vagy sejtekben meghatározzuk az aktivált RNáz L-nek mint a HÍV - azaz az immunelégtelenséget okozó vírus - fertőzések markerének jelenlétét oly módon, hogy mérjük a 28S rRNS-ből és a 18S rRNS-ből származó specifikus hasítási termék mennyiségét, valamint kívánt esetben a bioaktív 2'-5' A oligomerek koncentrációját. A humán biológiai folyadék célszerűen vér vagy egy vérfrakció.

A riboszomális RNS-nek specifikus helyein történik az RNáz L általi hasítása, miáltal előre meghatározott, azaz specifikus hasítási termékek keletkeznek.

Az AIDS (szerzett immunelégtelenségen alapuló tünetegyüttes) a 20. században a társadalom egészségét fenyegető egyik legnagyobb veszély. Az AIDS gyorsan olyan mértékben jelentkezett, hogy soha nem látott arányú járványügyi problémává vált, mivel biológiailag változékony természetű, bonyolult módon terjed át egyik egyénről a másikra és „lappangási” periódusa megakadályozza még jelenlétének gyors kimutatását is. Már eddig is jelentős forrásokat fordítottak a diagnosztikai lehetőségek javítására, de ennek ellenére a rendelkezésre álló technikák még mindig meglehetősen távol esnek azoktól a szükséges követelményektől, amelyek kielégítése esetén a probléma szilárd kézben való tartása - a népesség bármelyik rétegében - remélhető. Az előbbiekkel kapcsolatban hivatkozunk a következő irodalmi helyekre:

- „Tapasztalatok a THTLV-HI. Antitest Meghatározásával, a Screenelés modernizálásával, a Laboratóriumi és Járványügyi Összefüggésekkel kapcsolatban”/Proceedings of Workshop, amelyet a Gyógyszerek és Biológiai Anyagok Központja - CDB -, az Élelmiszer- és Gyógyszerellenőrzési Hatóság - FDA -, a Nemzeti Egészségügyi Intézet - NIH - és a Betegség Ellenőrző Központok - CDC - támogatásával 1985. július 31-n a NIH-ben - Bethesda, Maryland - tartottak;

- S. Budiansky, Natúré, Vol. 316, p. 96, 1985. július 11.

Az emberi immunelégtelenséget okozó vírus (HÍV) jelölésére több különböző kifejezés ismeretes: LAV annak az AIDS vírusnak a jelölése, amelyet a Pasteur Intézetben (Párizs, Franciaország) különítettek el és HTLV III. névvel jelölik azt a HÍV vírust (humán T-sejt limfotróp vírus), amelyet a NIH-ben (Bethesda, Maryland, Amerikai Egyesült Államok) izoláltak. A leírás szövegében a HÍV vírusra gyakran általános alakban fogunk hivatkozni vagy azt HTLVIII-nak, LAV-nak vagy HIV-nek fogjuk nevezni anélkül, hogy különbséget kívánnánk tenni közöttük. Továbbá: a „HÍV” kifejezés a leírásban magában foglal bármilyen és minden más olyan vírust is, amely öszszefüggésben állhat az AIDS fellépésével, függetlenül attól, hogy már elkülönítették-e vagy sem. Az egyesszámban alkalmazott HÍV jelölés bármilyen HÍV típusra vonatkozik, a genomiális jellegtől függetlenül. Hasonlóképpen általános alakban fogunk hivatkozni az AIDS tünetegyüttesre, amely ily módon magában foglalja a (fent definiált) HÍV által kiváltott tünetegyüttest, az ARC-t vagy az AIDS-szel rokon komplex megbetegedéseket, a limfadenopátia tünetegyüttesét (LAS) és a lényegében hasonló klinikai eseteket, amelyeket más vírusok okoznak.

A jelenlegi terápiás megfontolásokra két megközelítés valamelyike jellemző: immunológiai eszközöket alkalmaznak (vakcina előállítása) vagy közvetlenül támadják magát a vírust (vírusellenes terápia). Míg a vakcina-gyártás kezdetben rendkívül ígéretesnek tűnt legalábbis elméletben -, a vírus összetételére vonatkozóan újabban szerzett ismeretek jelentősen aláásták ezt a perspektívát. A vírus ugyanis láthatóan könnyen mutáción megy át vagy megváltoztatja alapvető biokémiai szerkezetét, úgy, hogy a kritikus vírus antigén „determinánsok” - amelyek szükségesek ahhoz, hogy a vakcinák hatásosak legyenek - könnyen mutáción vagy változáson mennek át. Újabban pl. azt találták, hogy a Kaliforniában, Marylandben és Nagy-Britanniában izolált HTLV-III. izolátumok lényegesen eltérnek egymástól, ha tüzetes elemzésnek vetjük alá genomra jellemző tartalmukat. Ezeknek a vizsgálatoknak az eredményeként az a következtetés vonható le, hogy a HÍV elleni vakcinálás nem fog olyan kiterjedt, tartós előnyöket eredményezni, mint azok az alapvetően előnyös/tartós eredmények voltak, amelyek történelmileg a legtöbb más vakcinára (ilyen pl. a polio-vírus, kanyaróvírus elleni vakcina) jellemzők.

A második - vagy közvetlen antivirális - megközelítés jegyében más tudósok több vegyületet - pl. AZT-t, ΗΡΑ-23-at, suramit, ribavirint, interferont, fascamet-et stb. - próbáltak ki. Ezeket a vegyületeket a laboratóriumi vagy klinikai vizsgálatok szakaszában alkalmazták, de a terápiás siker mindmáig csak korlátozottan mutatható ki vagy minősíthető ekként. Valójában csaknem minden esetben, egybeeső módon, az bizonyítható, hogy ezek a vegyületek erősen toxikusak és/vagy súlyos mellékhatásokat váltanak ki (1. pl. a M. Clark által készített összefoglalót: Newsweek, p. 71., 1985. augusztus 5.; 1. ugyancsak C. Wallis cikkét: Time, p. 40-47., 1985. augusztus 12.). Ezen gyógyszerek közül valójában egyik sem új és egyik sem irányítható szelektíve az alapvető rendellenesség, nevezetesen a HÍV egyes sejtekben való szaporodása ellen. A HPA-23 pl. egy nehézfém-kombináció (ez az arzén nemi betegségek kezelésére az 1920-as években vagy a „penicillin előtti korszakban” való felhasználására emlékeztet); a suramin ténylegesen egy antiparazita szer (az álomkór ellen) és a fascamet egy herpes vírus elleni vegyület. A két utóbbi vegyület gátolhat egy, a HIV-vel összefüggő, reverz transzkriptáznak nevezett enzimet, de kevés bizonyíték áll rendelkezésre olyan vonatkozásban, hogy egy ilyen enzim-gátlás ténylegesen bármilyen jelentős terápiás javulást eredményezne vagy megelőzné ill. gyógyítaná a betegséget. Az AZT eredményezhet kismértékű élettartam-hosszabbodást az AIDS-ben szenvedők esetében, de erősen toxikus és nem küszöböli ki a HIV-t (R. Yarchoan et al., Láncét, p. 575, 1986, március 15.; R. E. Chaisson et al., New England Journal of Medicine, Vol. 315, p. 1611, 1986).

HU 209 865 Β

Az AIDS az immunrendszer fokozatos leépülését követi, amelyet az emberi immunelégtelenség vírusa, a HÍV által történő fertőzés vált ki. A betegség korai fázisában a sejtek által közvetített immunitás a T (csecsemőmirigyből származó) sejtek mennyiségének csökkenése révén károsodik, amely sejtek az ún. T4 antigén - ez a T sejtek egy alegysége, amely főként a T sejtek hatását elősegítő és indukáló sejtekből áll - kifejezésében működnek közre. A T4 sejtek hiánya többféle hiányossághoz vezethet a sejtek által közvetített immunitásban, ideértve az NK (természetes pusztító sejt), a LAK (limfokin által aktivált ölő sejt) és a citolitikus T sejtek számának csökkenését. Az AIDS-szel B-sejt (csontszövet eredetű) hiányok is együtt járnak.

Az AIDS egy láthatóan progrediáló betegség, bár az egyik fázisból a másikba való átmenet sebessége változhat. Ezekhez a fázisokhoz osztályozó jegyeket rendeltek. Mint ez a vírusnak megfelelő, a keringésben részt vevő antitestek jelenléte alapján megítélhető (M. G. Samgadharan et al., Science Vol. 224, p. 506., 1984), léteznek HIV-fertőzött - olykor szeropozitívnak nevezett - tünetmentes egyének is. Ha más markerrel nem rendelkeznek, ezeket a Walter Reed osztályozás (R. R. Redfield et al., New EnGand Journal of Medicine Vol. 314, p. 131., 1986) szerint WR1 fázisú betegeknek minősülnek. Ugyancsak nevezik őket pre-ARCben (ARC = az AIDS-szel rokon komplex betegség) szenvedő betegeknek is, bár néhány ilyen egyén esetében esetleg soha nem fejlődik ki az ARC tünetegyüttes. Egyes ilyen betegek esetében limfadenopátia (WR2) alakulhat ki és T4 sejt hiány mutatkozik (WR3). Ezt követően csökken a limfociták azon képessége, hogy antigén-stimulált szaporodáson menjenek át és (gamma) interferon termelést mutassanak és ezek a WR4 betegek kezdik elveszíteni tartós bőr-túlérzékenységüket. A WR5 fázisú betegek rendszerint anergiás típusúak. Hajlamosak a herpes zoster fertőzésekre, az orális kandidiázisra (szájpenész) vagy az ARC tünetek kifejlesztésére, amelyek közé tartozik a tartós láz, éjjeli izzadás, fáradtság, hasmenés és/vagy súlyvesztés. Az ARC-nek ezt a szakaszát rendszerint az immun-állapot fokozódó romlása is jellemzi. WR6 fázisú betegeknek tekintjük végül azokat a személyeket, akik eseti fertőzéseket szenvednek el; ez olyan fertőzések esetében következik be, amelyek a „teljes virágában lévő” vagy valódi AIDS-ben szenvedőktől származnak. Ebbe a betegek 50%-a 12 hónapon belül belehal (H. W. Murray et al., New England Journal of Medicine Vol. 310, p. 883, 1984).

A találmányt a továbbiakban a mellékelt rajzokra való hivatkozással írjuk le, amelyeken

- az 1. ábra egy poliakrilamid gélelektroforézis lemez fényképe; ez 7 csíkot és mindegyik csík hosszában sávokat vagy zónákat - a csík mentén - mutat be, és

- a 2. ábra a 2-5' oligoadenilát/RNáz L mechanizmust ábrázolja.

Vizsgálataink során találtunk egy inhibitor anyagot, amelyet a HIV-vel fertőzött sejtek adnak le spontán, vagy valamely hatás eredményeként. Úgy tűnik, hogy ez az inhibitor fizikailag kapcsolódik a RNáz L enzimhez, a 2 -5'-oIigoadenilát/RNáz L mechanizmus végtermékéhez és ennek hatására a teljes immunrendszer hibásan kezd működni és lehetővé teszi a HÍV ellenőrizhetetlen mértékben való elszaporodását.

A találmány tárgya tehát eljárás HÍV fertőzés kimutatására oly módon, hogy egy humán biológiai folyadékban vagy sejtekben meghatározzuk az aktivált RNáz L jelenlétét a 28S rRNS-ből és a 18S rRNS-ből származó specifikus hasítási termékek mennyiségének, valamint kívánt esetben a bioaktív 2'-5'A oligomerek koncentrációjának mérésével.

Carter és munkatársai [Láncét (1987) 1287. oldal] röviden ismertetik az RNáz L aktivitásának vizsgálatát, mely vizsgálatot az alábbiakban részletesen is leírunk.

RNáz L aktivitás vizsgálata

Ficoll-Hypaque centrifugálással (Suhadolnik et al., 1983) perifériás vér mononukleáris sejteket (PMBC) izolálunk.

Glicerin-pufferben L929 és HL929 sejtekből cito plazma kivonatot állítunk elő (Wrescher et al., 1983). Az extraktumokban a protein koncentráció ΙΟΙ 5 μg/μl.

Bioaktív 2-5A szintetáz izolálása PBMC kivonatból.

2-5A-t izoláljuk a PMBC extraktum etanolos frakciójából (100 μg protein; végkoncentráció = 70% etanol). A 2-5A-t tartalmazó etanolos extraktumot liofilizáljuk és újból feloldjuk vízben (20 μΐ). A 2-5A koncentrációját az etanolos extraktumban (core)-cellulóz vizsgálattal határozzuk meg, RNáz L forrásként L929 sejt extraktumot alkalmazva (Silverman 1985).

Az RNáz L aktivitásának vizsgálatát az alábbiak szerint végezzük.

Wreschner és munkatársai (1981a) által leírt módszert alkalmazzuk az rRNS hasítására. HL929 sejtek extraktumait (150 μg protein vizsgálatonként) inkubáljuk PBMC extraktumok (100 μg protein vizsgálatonként) jelenlétében 37 °C-on 60 percig (20 μΐ végtérfogatban lxlO^-8 M p₃A₃). Az összes RNS-t extraháljuk, denaturáljuk és agaróz gél elektroforézissel (Kariko et al., 1987) analizáljuk. Az etidium-bromiddal szennyezett RNS sávokat UV-fénnyel tesszük láthatóvá. Az RNáz L aktivitást a specifikus hasítási termékek (SCP) képződésével 2-5A jelenlétében vagy távollétében határozzuk meg és denzitometriás leképezéssel kvantitatívvá tesszük.

A leírásban eljárásokat ismertetünk az RNáz L aktiválására és/vagy az RNáz L-t gátlóanyag eltávolítására vagy inaktiválására, valamint módszereket, amelyek segítségével az RNáz L inhibitor anyag(ok) vagy az ilyen inhibitorok termelését irányító vírusok inaktiválhatók, terápiás jelleggel. Eljárásokat írunk le az ilyen vírusoknak megfelelő antitestek in vivő és in vitro előállítására egyaránt; ennek során antigénként egy specifikus RNáz L inhibitor vagy a 2'-5' A/RNáz L mechanizmus biokémiai intermedierjeinek vírus által vezérelt inhibitorai alkalmazhatók.

Egy kétszálas RNS-t tartalmazó gyógyászati készítmény alkalmas az RNáz L aktiválására, ill. az RNáz L egy specifikus inhibitorának egy a 2'-5' A/RNáz L

HU 209 865 Β mechanizmus biokémia intermedierjei vírus által vezérelt inhibitorai eltávolítására vagy inaktiválására emberben és állatban egyaránt. Erre az jellemző, hogy egy kétszálas RNS-t - előnyösen egy hibás kétszálas RNSt, amelyre vonatkozóan az alábbiakban közlünk magyarázatot - és egy limfokint (pl. egy interferont) vagy valamely más, specifikus vírusellenes anyagot kombinálunk, amelynek hatását megkönnyíti a kétszálas RNS-től függő RNS mechanizmus feltárása és helyreállítása.

A készítmény előnyösen a kétszálas RNS-t és az interferont a 0,01-1000 mg kétszálas RNS - 0,1— 100,000 IRU interferon arányban tartalmazza.

Ismertetünk egy eljárást humán biológiai folyadék vagy sejtek ellenállóvá tételére vírusfertőzésekkel szemben, fokozva ezek ellenállását vagy a HÍV fertőzés hatásainak csökkentése révén. Erre az eljárásra az jellemző, hogy az ilyen biológiai folyadékokat vagy sejteket olyan mennyiségű kétszálas RNS-sel keverünk össze vagy hozunk érintkezésbe, amely hatásos pl. a HÍV gátlása, ill. az RNáz L aktiválása szempontjából. A biológiai folyadék emberi vér vagy ennek egy frakciója lehet, amelyet pl. vérátömlesztésnél vagy dialízishez használnak fel. A sejtek származhatnak egy átültetésre javasolt bőrszövetből vagy egy átültethető szervből.

Továbbá ismertetünk egy olyan eljárást is, amely az RNáz L képződését gátló anyagok egy olyan berendezésből való eltávolítására (vagy ebben való inaktiválására) irányul, amely parenterális folyadékok kezelésére szolgál, illetőleg a berendezésből esetleg származó HÍV fertőzés hatásának enyhítését teszi lehetővé. Ez az eljárás abból áll, hogy az említett berendezést egy olyan készítménnyel hozzuk érintkezésbe, amely a kétszálas RNS-ből hatásos HIV-gátló, RNáz L aktiváló mennyiséget tartalmaz.

Leírjuk a gyógyászati készítmények előállítására irányuló eljárásokat is, amelyek HIV-vel fertőzött egyének (ideértve az AIDS-ben szenvedőket is) kezelésére használhatók fel és amelyek hatása azon alapul, hogy elnyomnak vagy kiküszöbölnek egy HlV-specifikus RNáz L inhibitort vagy a 2'-5'A/RN-áz L mechanizmus biokémiai intermedierjei vírus által vezérelt inhibitorait és/vagy aktiválják az RNáz L-t. A készítmények egy kétszálas RNS-t és egy gyógyászati szempontból elfogadható vivőanyagot vagy hígítót tartalmaznak, használati utasítások kíséretében, amelyek arra vonatkoznak, hogy hogyan kell a készítményt alkalmazni retrovírusok által okozott betegségekben, T-sejt limfotróp vírusok által kiváltott betegségekben (pl. az AIDS-ben) vagy más olyan humán vírusok által okozott fertőzések kezelésére, amelyek szaporodását befolyásolja a latens RNáz L aktiválása.

így a következőkben, példa segítségével, a találmány alábbi tárgyait mutatjuk be:

- gyógyászati eljárás humán vírusok, közelebbről a HÍV gátlására, a normál sejtekre kifejtett jelentős toxicitás nélkül;

- eljárások annak megakadályozására, késleltetésére vagy megelőzésére, hogy valaki HIV-vel fertőződjék;

- eljárások az AIDS-szel rokon komplex betegség és az AIDS-szel összefüggő tünetek fellépésének megelőzésére vagy kezelésére;

- eljárások humán biológiai folyadékok, sejtek és szöveti termékek kezelésére annak érdekében, hogy megelőzzük vagy megállítsuk a HIV-vel való fertőződést vagy szennyeződést és

- eljárások a HIV-vel összefüggő fajlagos károsodások korrigálására, ideértve az interferonreceptorok mennyiségének csökkenését az immunrendszerben, a sejtek felületén.

Valamennyi ilyen eljárás azon alapul, hogy az említett betegségek annak következtében lépnek fel, hogy csökken az intracelluláris 2'-5'A szintetáz mennyisége, inaktiválódik az RNáz L és csökken vagy megszűnik az intracelluláris kétszálas RNS-ek képződése az immunrendszer kiválasztott sejtjeiben.

Ugyancsak tárgyaljuk az ilyen eljárások keretében felhasználható gyógyszerkészítményeket.

A kétszálas RNS alkalmazása oly módon történik, hogy ezáltal korrigáljunk specifikus, a HÍV fertőzésekkel összefüggő károsodásokat, ideértve az RNáz L és a kétszálas RNS-től függő enzimek (pl. a protein kináz) mennyiségének csökkenését különböző kritikus sejteken az immunrendszeren belül, az intracelluláris 2'5'A szintetáz mennyiségének csökkenését különböző kritikus sejtekben az immun/testvédelmi rendszer keretében és az intracelluláris kétszálas RNS mennyiségének csökkenését (vagy ennek teljes eltűnését) és a bioaktív 2'-5'A oligomerek mennyiségének csökkenését vagy ennek eltűnését különböző kritikus sejtekben az immun-/testvédelmi rendszer keretében.

Az AIDS-ben a sejt „első védelmi vonalában” (2'5' oligoadenilát mechanizmus) zavarok lépnek fel.

Különböző vizsgálatok arra mutatnak, hogy a 2'-5' oligoadenilát mechanizmusban (amelyet az orvosi irodalom „interferon 2-5' mechanizmusként is említ) működési zavarok jelentkeznek az AIDS-ben. Ez a mechanizmus szerves része a test fertőzések ellen irányuló védelmi rendszerének. Az AIDS-ben és különböző, ezt megelőző állapotokban - amilyen pl. az ARC vagy a LAS (limfadenopátiás tünetegyüttes) - a mechanizmus körébe tartozó enzimek és faktorok „bekapcsoltak” vagy aktiváltak, de az AIDS vírus még szaporodik. Az interferon szint pl, jellegzetesen emelkedett és a 2'-5'A szintetáz enzim ugyancsak nagyobb mennyiségben van jelen. Ezeknek a szint-emelkedéseknek a mechanizmusa, és közelebbről a - legalábbis részben működőképes - mechanizmusnak az eredménytelensége a HÍV (legalább bizonyos mértékű) gátlásában az itt leírt vizsgálatok elvégzése előtt teljesen megoldhatatlan feladatnak bizonyult.

Vizsgálataink segítségével azonosítottunk egy - a HÍV fertőzéssel együttjáró - inhibitort, amely létezik és kimutattuk, hogy ez az inhibitor blokkolja az antivirális védelmi mechanizmust és így hozzájárul a „teljes virágában levő” AIDS kialakulásához.

Az 1. ábra az RNáz L mennyiségét jellemzi ARC/AIDS-ben szenvedő betegekben, akik gyorsan megszabadultak a perifériás vérben jelenlevő HÍV terhe4

HU 209 865 Β léstől kétszálas RNS-sel (AMPLIGEN^R, HEM Research, Inc., Rockville, Maryland, Amerikai Egyesült Államok) végzett kezelés során. Az aktivált RNáz L jelenlétét vagy hiányát a betegek perifériás vér mononukleáris sejtjeiből (PBMC) származó citoplazma kivonatokban azon az alapon határozzuk meg, hogy a kivonatok képesek-e specifikus hasítási termékek (SCP) képzésére 28S és 18S rRNS-ből kiindulva. Ennek során a következő helyeken leüt eljárásokat alkalmazzuk:

- K. Kariko és J. Ludwig, Biochem. Biophys. Research Communication, Vol. 128, p. 695, 1985;

- D. H. Wreschner et al., Nucleic Acid Research, Vol. 9, p. 1571, 1981.

A két - 28S-sel, ill. 18S-sel jelölt - molekula-féleséget tartalmazó riboszomális RNS a vírus (HÍV vírus) RNS-hez hasonlóan viselkedik, amennyiben aktivált RNáz L-lel való hasításra érzékeny, az inaktív RNáz L-lel azonban nem reagál. Az aktivált RNáz L-t az jellemzi, hogy molekulaszerkezetéhez kötve döntő többségében 2'-5'A oligomereket és kismennyiségű (vagy nulla mennyiségű) kötött inhibitort tartalmaz. Ezeknek a vizsgálatoknak az eredményeit az 1. ábrán mutatjuk be, amely egy poliakrilamid gélelektroforézis lemez fényképe. Az 1. táblázatban azokat az adatokat összegezzük, amelyeket AMPLIGEN terápiában részesülő 10 beteg vizsgálata alapján szereztünk.

HL929 (RNáz L negatív) sejtek kivonatait - amelyeket a riboszomális RNS forrásaként használunk fel - 1 órán át inkubáltuk egészséges kontroll személyektől származó PBMC citoplazma kivonatokkal (2 sáv), vagy ilyenek nélkül (1 sáv), ill. (kódszámmal jelzett (AMPLIGEN terápiában még nem részesült, ARC-ben, ill. AIDS-ben szenvedő betegekből származó PBMC kivonatokkal (a 3, ill. a 4 sáv a 3., ill. 7. betegtől származó, kezelés előtti mintáknak felel meg). Az 1, 3 és 4 sáv - a gél SCP területén, ill. területein megjelenő sávok alapján - úgy ítélhető meg, hogy nem szolgáltat bizonyítékot aktivált RNáz L jelenlétére. A HL929 sejteket a Budapesti Szerződés rendelkezései figyelembe vételével helyeztük letétbe, az ATCC-nél.

A terápia megkezdése előtt az ARC-ben vagy AIDS-ben szenvedő betegek kivonatai nem bizonyultak aktiválhatónak (SCP = O) még abban az esetben sem, amikor exogén bioaktív oligoadenilátokat (2'5'-ρ₃Α₃, 10^_8M) adagoltunk (a vonatkozó géleket nem mutatjuk be). Ez arra mutat, hogy az AMPLIGEN-nel való kezelés előtt nem áll rendelkezésre funkcionális RNáz L molekula a betegek limfocitáiban. Ezzel szemben az AMPLIGEN terápiával egyidejűleg in vivő az RNáz L folyamatos aktiválódása volt megfigyelhető a 3. sz. ARC-s betegben (5 sáv a terápia 8. hetében és 6 sáv a terápia 16. hetében), a 7. sz. AIDS-es betegben (7 sáv a terápia 8. hetében) és az 1. táblázatban említett különböző betegek esetében (a gélt nem mutatjuk be). A nyilak az RNáz L specifikus hasítási termékei (SCP) helyzetét jelzik. Csak az 5. sz. beteg esetében maradt el a kétszálas RNS terápia RNáz L aktiváló hatása. Ennek az eredménye volt valószínűleg az, hogy a beteg egy második eseti fertőzés folytán meghalt.

1. eset. - Normál egyének biológiai mechanizmusát - ideértve azokat is, akik HÍV fertőzésen estek át - a 2. ábrán mutatjuk be.

2. eset. - Ez az AIDS-ben és az ezt megelőző betegségekben szenvedőkre jellemző, ideértve a LAS-t, az ARC-t, a tünetmentes HÍV szeropozitív egyéneket, akik a betegség előrehaladása folytán az AIDS-ig jutnak el stb. (1. a 2. ábrát). - Az (A), (B) és (C) lépések funkcionálási intenzitása a normál szint fölötti, mivel az RNáz L-t az inhibitor megköti [a (D) lépés nem működik] és nem tudja befejezni a reakcióutat. Ezért a „feedback” kontroll hiánya miatt a mechanizmus nem tud megfelelően teljesen lefutni és a HÍV szaporodik, annak ellenére, hogy az interferon, a 2-5A szintetáz és a bioaktív 2-5 oligomerek (ezek közül különösen aktívak a 2-5A trimerjei és tetramerjei) magas koncentrációkban vannak jelen.

Kísérleti adatok. - Először azt figyeltük meg, hogy az nem kezelt egyének limfocitáiban az AIDS teljes klinikai spektruma alatt jelentős koncentrációkban 25Ά oligomerek vannak jelen. A normál egyénektől eltérően azonban (az 1. ábra szerinti poliakrilamid gél 2 sávja) a nem kezelt, ARC-ben és AIDS-ben szenvedő betegek esetében az RNáz L inaktívnak bizonyult. Továbbá azt figyeltük meg, hogy ha ARC/AJDS-ben szenvedő betegekből kinyertünk inaktív RNáz L preparátumokat és először (a vizsgálat előtt) alaposan mossuk ezeket, ideértve triklórecetsav (TCA) alkalmazását is, az RNáz L készítmény visszanyeri funkcióképességét, azaz katalizálja a makromolekuláris RNS specifikus bontását (a géleken: SCP) és aktívnak minősíthető. Az aktivitás helyreállítására irányuló kísérletsorozattal tisztáztuk, hogy egy RNáz L inhibitort eluáltunk vagy szabadítottunk fel, amely, ha visszavittük a rendszerbe, ismét megakadályozta az RNáz L reakcióba lépését, azaz gátolta azt.

A jelenleg rendelkezésre álló bizonyítékok arra mutatnak, hogy a sejtben levő RNáz L állapota (aktív, ill. inaktív) fontos prognosztikai paramétert képvisel a HÍV esetében és hogy a kétszálas RNS-ekkel végzett specifikus kezelés visszafordíthatja ezeket a HlV-specifikus károsodásokat. Különböző személyek széles klinikai spektrumát - kezdve a tünetmentes HÍV hordozóktól (pl. ilyen az 1. táblázat szerinti 8. sz. beteg) a betegség korai fázisában levőkön át (amilyen pl. az ARC vagy a LAS: 2., 3., 9., 10., 1. és 4. sz. beteg) a „teljes virágában levő” AIDS-ben szenvedőkig - kétszálas RNS-sel kezeltük annak meghatározására, hogy az inhibitor kiszorítható-e az RNáz L-ből. Azt vártuk, hogy egy ilyen molekuláris esemény a HÍV terhelés csökkenését és jelentős klinikai javulást eredményez.

(Kb. 60 kg tömegű) betegeket hetenként kétszer 50-250 mg specifikus - AMPLIGEN-nek nevezett kétszálas RNS-sel kezeltünk. Ismeretes, hogy a 2'-5' oligo-A-szintetáz a kétszálas RNS-től függő enzim, és úgy gondoltuk, hogy az inhibitort ez képes kiszorítani az RNáz L-ből, ha mesterséges (szintetikus) kétszálas RNS készítmény alkalmazásával a sejten belül növeljük a specifikus bioaktív 2'-5' oligomerek koncentrációját.

HU 209 865 Β

Az 1. táblázat azt igazolja, hogy az össze nem illő kétszálas RNS tényleges a kezelt betegek szérumában a HÍV szint lényeges csökkenésére vezetett.

Ha az 1. táblázat utolsó oszlopát („Virológia”) összehasonlítjuk az 1. ábrával, kitűnik, hogy az RNáz L 5 aktiválása egyértelműen összefügg a HÍV terhelés csökkenésével és ez klinikai javuláshoz vezet. Megfelelően alkalmazható az összeillő kétszálas RNS és az adagolás megfelelően alacsony lehet az olyan negatív reakciók elkerülésére, mint amelyeket a poli

I.-poli C, egy kétszálas RNS (Lampson) kiválthat. Ha magasabb dózisok alkalmazása célszerű, nagyobb szükség van nem összeillő kétszálas RNS alkalmazására.

1. táblázat

AMPL1GEN terápiában részesülő betegek klinikai és virológiái jellemzői

A beteg száma	Diagnózis	Tünetek és észleletek a felvételnél	Vizsgálati idő, hét	Gyógyszer-toxicitás
2.	Fari ARC	ált. limfadenopátia, fáradtság, éjjeli izzadás, anergiás, vírustenyésztés pozitív	16	0
3.	Mors LAS	limfadenopátia, tünetmentes, anergiás, vírustenyésztés pozitív	16	0
8.	Fowl	fáradtság; kanyaróra és candida bőrpróbára negatív, vírustenyésztés pozitív	12	0
9.	Towl LAS	limfadenopátia, tünetmentes, candida és trichophyton bőrpróbára negatív, vírustenyésztés és p24 szérumpozitív	16	0
10.	Polg ARC	Fáradtság, szájpenész, anergiás; nem reagál AZT-re, suraminra és HPA 23-ra; vírustenyésztés és p24 szérum pozitív	16	0
1.	Tuja ARC	fáradtság, megnagyobbodott fiiltőmirigy, krónikus nyelési nehézségek (szigorúan folyadék-diétán); általános limfadenopátia, máj- és lép-megnagyobbodás, vírustenyészet pozitív	16	0
4.	Semp ARC	limfadenopátia, fáradtság, anergia, vírustenyészet pozitív	15	0
5.	Bror AIDS (poszt-PCP)	fáradtság, krónikus köhögés, anergia, vírustenyészet és p24 szérum pozitív	7	0
6.	Edwd AIDS (KS)	fáradtság, KS bőrelváltozások, anergiás vírustenyészet pozitív	16	0
7.	Glbm AIDS (poszt-PCP + KS)	fáradtság, KS bőrelváltozások, anergiás, lépmegnagyobbodás, vírustenyészet és p24 szérum pozitív	16	0

A beteg száma	Klinikai tünetek a terápia alatt	Virológia
2.	megnövekedett energia-szint és javult teljesítménnyel jellemezhető állapot, a 4. héten eltűnt az adenopátis, az éjjeli izzadás megszűnt, a reaktív bőr próbák negatívak	a tenyészet és a vírus-mRNS mennyisége a 2. és a 4. héten csökken, és nincs kimutatható vírus a 8. és 12. héten
3,	reaktív bőr próba pozitív a 6. héten	a 2., 4. és 8. héten nem tenyészthető ki a vírus, vírus-mRNS negatív
8.	megnövekedett energia-szint és javult teljesítménnyel jellemezhető állapot jelentős súlynövekedés, a 2. héten kanyaróra és candidára reaktív bőrpróba	a tenyészet negatív a 2. héten, enyhén pozitív a 4. héten, pozitív a 8. héten és csökkent a 12. héten
9.	az adenopátia megszűnt, reaktív bőr próba a trichophytonra a 2. héten és candidára a 4. héten	csökkent mennyiségű tenyészet a 2. héten, pozitív a 4. és 8. héten, 10-szeres csökkenés a szérum p24-ben a 10. héten; pozitív vírus tenyészet nyomokban a 12. héten
10.	megnövekedett energia-szint és javult teljesítménnyel jellemezhető állapot, a szájpenész megszűnt, reaktív bőr próba a mumpszra a 2. héten és a candidára a 16. héten	a tenyészet és az mRNS mennyisége a 2. és a 4. héten csökken; vírus mRNS negatív a 6. és a 8. héten; a szérum p24 2,5-szeres csökkenése a 8. hétre

HU 209 865 Β

A beteg száma	Klinikai tünetek a terápia alatt	Virológia
1.	megnövekedett energia-szint és javult teljesítménnyel jellemezhető állapot; a ftiltőmirigyek, nyirokmirigyek, máj és lép visszanyeri normál méretét; normál étrend mellett 17 fontot hízott és jelenleg tünetmentes	a tenyészthető vírus mennyisége fokozatosan csökken a 2., 4. és 8. héten; vírus mRNS negatív a 4. és a 8. héten; a 12. héten tenyésztéssel nyomokban vírus-pozitív
4.	megnövekedett energia-szint és javult teljesítménnyel jellemezhető állapot, reaktív bőr próba a mumpszra és a candidára a 4. héten	a 2., 4., 8. és 12. héten a vírus nem tenyészthető ki és mRNS-negatív
5.	reaktív bőr próba a mumpszra; a 7. héten a második pneumocisztás tüdőgyulladásban meghal	a tenyészet erősen pozitív a 2. és a 4. héten és a szérum p24 nem mutat jelentős változást
6.	megnövekedett energia-szint és javult teljesítménnyel jellemezhető állapot, reaktív bőr próba mumpszra a 6. héten	a tenyésztés negatív eredményt ad a 2. és a 6. héten, pozitív a 4. héten és enyhén pozitív a 12. héten; vírus mRNS negatív a 7. héten
7.	megnövekedett energia-szint és javult teljesítménnyel jellemezhető állapot, a lép-megnagyobbodás csökkenése, reaktív bőr próba mumpszra a 4. héten	a tenyészet mennyisége a 8. héten csökkent; vírus mRNS negatív a 3., 4. és a 8. héten

Előnyösen olyan kétszálas RNS-t alkalmaztunk, amely szükségszerűen emelt intracelluláris 2'-5^/A oligomer koncentrációt eredményez az RNáz L inhibitor kiszorításához anélkül, hogy a gazdaszervezetre nézve toxikus lenne, pl. annak következtében, hogy biológiailag gyorsabban hozzáférhető, szerkezete alkalmas arra, hogy aktiválja a 2'-5'A oligomer termelést mellékhatások kiváltása nélkül, vagy azzal összefüggésben, hogy a beadást követően felezési ideje aránylag rövid.

Az össze nem illő kétszálas RNS a makromolekuláris RNS egy ismert alakja (1. a 4 024 222 és a 4 130 641 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírást), amelyben a kettős spirál destabilizálódása megakadályozza a bázispárképződést. Az össze nem illő kétszálas RNS jól ismert interferon-indukáló tulajdonságai révén is. Ezek egy olyan mechanizmusra utalnak, amely önmagában nem áll kapcsolatban az interferon indukcióval (1. pl. az 1983. augusztus 15-én benyújtott, 83 305 426.5 sz. európai szabadalmi bejelentést, amelynek címe: , A kétszálas RNS-ek ráksejtekre kifejtett szaporodást gátló hatása”).

Az össze nem illő kétszálas RNS egyik jellegzetes, a gyógyászatban alkalmazható kiviteli alakja a poliriboinozinsav és a poliribocitidil/uridilsav komplexei által alkotott kétszálas szintetikus RNS, pl. az rI_n.r(C_x, U vagy G)_n, ahol x értéke 4-29, pl. az rI_n.r(C₁₂U)_n, amelyre a leírásban AMPLIGEN néven hivatkozunk. Tanulmányoztunk számos össze nem illő kétszálas RNS molekulát, amelyek az AMPLIGEN-hez hasonlóan viselkednek. A hibás (össze nem illő) kétszálas RNS-ek más természetes és/vagy szintetikus kétszálas RNS alakokkal szemben gyógyászati előnyének kulcsa az, hogy az össze nem illő kétszálas RNS-ek toxicitása emberben és állatban kisebb. A 3 666 646 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban pl. (szabadalmas: Lampson et al.) olyan korábbi kétszálas RNS komplexeket írnak le, amelyek képesek különböző, interferon-szerű hatások kiváltására. Az ilyen vegyületek toxicitása azonban kizárt bármilyen klinikai alkalmazást a rák vagy hasonló betegségek gyógyítására.

Részletesen ismertetjük a különböző interferonok, interferon indukálószerek és a kétszálas RNS-ek ismert tulajdonságait a tárgyra vonatkozó, legújabb megjelent kézikönyvekben (1. pl. a feltaláló által írt fejezetet az Anticancer and Interferon Agents c. kiadványban p. 301—

319., kiadó R. M. Ottenbrite és G. B. Butler; Marcell Dekker, New York, 1984; 1. ugyancsak: Handbook of Experimental Pharmacology on Interferons, kiadó P. E. Come és W. A. Carter; Springer Verlag, New York és Heidelberg, 1984: az 535-555. oldal részletesen leírja a kétszálas RNS-ek ismert tulajdonságait).

Az össze nem illő kétszálas RNS-ről, pl. az AMPLIGEN-ről jelenleg tudjuk, hogy terápiás aktivitást mutat egyes humán tumorok, különösen a veserák ellen. A kétszálas RNS-ek, bár általában úgy tekintik ezeket, mint egyszerű „interferon indukálószereket”, aktívak egyes olyan humán daganatok ellen, amelyek teljesen rezisztensek magával az interferonnal szemben. Ezt részletesen ismerteti 83 305 426.5 sz. európai szabadalmi bejelentésünk.

Egy másik szabadalmi bejelentésben (1. az 1986. augusztus 26-án benyújtott, „A vírusokkal összefüggő következmények módosítása kétszálas RNS-ek segítségével” c. európai szabadalmi bejelentést) a feltaláló leírja, hogy az emberi sejt tenyészetben a kétszálas RNS-ek gátolják az AIDS vírust. A kétszálas RNS-ek prototípusaként itt AMPLIGEN-t alkalmaznak.

Az „össze nem illő” kétszálas RNS kifejezés olyan vegyületeket jelöl, amelyekben az ellentett szálak között a hidrogén kötés (bázis-felfűzés) viszonylag sértetlen, azaz átlagosan 1 bázispámál kevesebb bomlott szét minden 29 egymásutáni bázis-maradék közül. Ennek megfelelően kell értenünk az „össze nem illő” kétszálas RNS kifejezést.

A kétszálas RNS egy poliinozinát/policitidilát komplex lehet, amely meghatározott arányban uracil vagy guanidin bázisokat tartalmaz, pl. az (5 ilyen bázis közül 1) - (30 ilyen bázis közül 1) intervallumban: poliI.poli(C4-29 x nagyobb U vagy G).

HU 209 865 Β

A kétszálas RNS lehet poliI.poliC,U képletű, amelyben a C/U arány kb. 13:1 és az ülepítési együttható (a polil-é és a poli-C,U-é egyaránt) 9-nél kisebb és egymás között 2 egységnél kevesebbel tér el, előnyösen kb. 0,5-7,5 között.

A kétszálas RNS az rI_n.(C₁₂U)_n általános képlettel írható le. A kétszálas RNS más, megfelelő példáit a következőkben tárgyaljuk.

A készítmény a kétszálas RNS-ből és egy, a HÍV gátlását elősegítő anyagból áll, amilyen egy limfokin, pl. egy interferon vagy egy interleukin, pl. az IL-2. A

2. táblázat különböző kombinációkat tüntet fel. Az AIDS-ben szenvedő betegek sejtjeiben - ideértve a T, NK, LAK, B és monocita sejteket - az RNáz L hiba vagy más hasonló kétszálas RNS-től függő enzim hibája mutatható ki (1. a 2. táblázatot).

Mint a leírás különböző helyein kifejtettük, a kétszálas RNS „biológiai bázisnak” tekinthető több, a HÍV-vei összefüggő károsodás kezelésében és javításában. A következő 2. táblázatban 7 specifikus HÍV eredetű meghibásodást vagy károsodást mutatunk be és megadjuk a megfelelő, potenciálisan gyógyhatású, kétszálas RNS-ből és egy vagy több más gyógyszerből álló kombinációkat.

2. táblázat

A kétszálas RNS mint „biológiai alap” több, az AIDS által okozott károsodás korrekciójához

Az AIDS által okozott károsodás	A kétszálas RNS-sel előállítható lehetséges gyógyszerkészítmények
1. Akut HÍV fertőzés	kétszálas RNS/AZT
2. Krónikus HÍV fertőzés	kétszálas RNS/ribavirin
3. T, NK vagy LAK károsodás	kétszálas RNS/IL-2 kétszálas RNS/retinoidok kétszálas RNS/csecsemőmirigy-peptidek
4. B sejt károsodás	kétszálas RNS/IFN (gamma)
5. Monocita károsodás	kétszálas RNS/IFN (gamma)
6. Kaposi-szarkóma	kétszálas RNS/IFN (alfa) kétszálas RNS/IFN (gamma) kétszálas RNS/IL-2
7. CNS károsodások	kétszálas RNS/ribavirin kétszálas RNS/AZT

A találmány szerint kitüntetett össze nem illő (hibás) RNS-ek kopolinukleotid alapúak. Ezeket olyan poli(C_xU) és po!i(C_x,G) általános képletű vegyületek közül választjuk ki, amelyekben x értéke 4-29 közötti egész szám. Ezek a poliriboinozinsavak és a poliribocitidilsavak komplexeinek hibás analógjai, amelyeket úgy állítunk elő, hogy az rI_n.rC_n-t módosítjuk, páratlan (uracil vagy guanin) bázisoknak a poliribocitidilát (rC_n) ágba hosszirányban való beépítésével. Egy másik megoldás szerint a kétszálas RNS a poli(I).poli(C) összetételű kétszálas RNS-ből állítható elő, a poliriboinozinsav (rl_n) ribozil-gerincének módosításával, pl. 2'O-metil-ribozil-maradékok beiktatásával. Az rIn.rC_nnek ezeket a hibás analógjait - amelyek közül kitüntetettek az rI_n.r(C₁₂,U)_n általános képletű Ampligen - a 4 130 641 sz., valamint a 4 024 222 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás ismerteti (szabadalmas Carter és Ts’o) és ezeket a leírásokat a hivatkozás révén a jelen leírás részeivé tesszük. Az ezekben leírt kétszálas RNS-ek általában megfelelők a találmány szerinti eljárással kimutatott betegség kezelésére.

Az előnyösen alkalmazható hibás kétszálas RNS-re néhány jellegzetes példa:

poli(I).poli(C₄,U) poli(I).poli(C₇,U) poli(I).poli(C₁₃,U) poli(I).poli(C₂₂,U) poli(I).poli(C₂₀,G) poli(I).poli(C₂₉,G) és poli(I).poli(C_p) 23G>p

A gyógyszerkészítmények az össze nem illő kétszálas RNS-t, és kívánt esetben egy interferont vagy más immunmodulátort (limfokint) tartalmaznak, egy gyógyászati szempontból elfogadható vivőanyaggal vagy hígítóval együtt. Ezek közé tartoznak azok is, amelyek parenterális bevitelre alkalmasak, egy megfelelő hordozóanyag hozzáadásával kikészítve.

így pl. szükség szerint parenterális oldatok, szuszpenziók és diszperziók állíthatók elő, az ismert gyógyszerkészítési technikák szerint, oldószerként/hígítószerként steril vagy pirogénmentes vízzel, amely kívánt esetben fiziológiailag elfogadható sókat is tartalmaz.

A hibás kétszálas RNS-ből bevitt mennyiség előnyösen elégséges kell, hogy legyen ahhoz, hogy közvetlenül a bevitelt követően az infúzióhoz képest egy disztális pontban a szisztémás vérkeringésben 0,01 mikrogramm/ml - 1000 mikrogramm/ml kétszálas RNS csúcskoncentrációt érjünk el. Ha egyidejűleg interferont is adagolunk, ezt előnyösen olyan mennyiségben adagoljuk, hogy 0,1-100,000 IRU/ml testfolyadék szintet kapjunk. A bevitelre kerülő mennyiség általában függ a betegség súlyosságától, közelebbről a rendelkezésre álló intracelluláris bioaktív kétszálas RNS, a 2'5' oligo-A molekulák vagy a 2'-5'A szintetáz koncentrációjától és az RNáz L gátlásának relatív szintjétől. Az itt használt értelemben a „testfolyadék” kifejezés a szérumot, vitaminokat stb. tartalmazó folyadék, amely a szervezetben cirkulál és a szövetek számára fürdőt képez. A betegek várható testfolyadék térfogatai a gyakorló orvos számára természetesen ismertek. Ezeket rutinszerűen hozzáférhető diagramok és táblázatok alakjában teszik hozzáférhetővé. Az átlagos testfolyadék térfogat kb. 5-6 liter.

A találmányt a kétszálas RNS alkalmazására vonatkozó példák következő leírásával illusztráljuk.

Hibás kétszálas RNS-t - pl. AMPLIGEN-t - vizes oldat alakjában készítünk ki oly módon, hogy különböző humán sejtekhez hozzáadva 0,01 mikrogramm 250 mikrogramm/ml (a sejteket körülvevő) folyadék átmeneti koncentrációkat érjünk el. Számos különböző sejtet alkalmazunk, amelyek potenciális célpontnak számítanak a HIV-vel való fertőzés céljából.

HU 209 865 Β

A következőkben egy jellegzetes kísérletet írunk le H-9 sejtekkel, azaz egy humán limfoid sejttel, amely akut vagy krónikus módon HIV-vel fertőzött lehet. A sejteket standard körülmények között tenyésztjük (1. pl.: Mitsuya et al., Science, Vol. 226, p. 172, 1984) és több héten át elemezzük HÍV enzimek vagy a HIV-re specifikus fehérjék kimutatására. Különböző koncentrációjú AMPLIGEN-t adagolunk a vírust megelőzően, a fertőzés után vagy egyidejűleg, az ily módon szimulált klinikai körülmények között. Ami a legfontosabb: gondos elemzésnek vetjük alá a sejtszámot, a morfológiát stb., annak meghatározására, hogy a kétszálas hibás RNS különböző aspecifikus hatásokat fejt-e ki a limfoid sejtek növekedésére, amint ezt Mitsuya más inhibitorok vonatkozásában leírta. A kísérlet alatt különböző időpontokban sejteket izolálunk és HPLC elemzéssel vizsgáljuk a 2'5Ά oligomerek mennyiségét, a Lee et al. (Biochemistry, Vol. 24, p. 551, 1985) által leírt eljárások alkalmazásával. Egyes A oligomerekről ismert, hogy ha a természetben jelen vannak, a sejteknek vírusrezisztenciát kölcsönöznek, de korábban nem írták le, hogy a vizsgált (az ember által szintetizált) vegyület pontosan, szelektíve beindíthatja ezt a természetes reakciót, és így erősítheti a vírusok ellen védő természetes mechanizmust általában, és különösen a HIVvel szemben (sőt ez még előre sem volt látható).

3. táblázat

Az AMPLIGEN hatása a HÍVfertőzőképességére

A. kísérlet
Nap	HTLV pozitív sejtek	A reverz transzkriptáz
mennyisége
%	gyógyszer- rel	enélkül
gyógyszer- rel	enélkül
4.	0	50	1,412	24 287
9.	7	90	144 632	1 243 300
B. kísérlet
0.	0	353	323
7.	0	0	400	1 200
10.	0	5	800	2 261
14.	2.	80 fölött	1100	112 247
17.	5	90 fölött	1200	1 560 000

Az A. kísérletet olyan körülmények között végeztük, hogy a vírus mennyisége (fertőző egységekben kifejezve) 25-ször akkora, mint a célsejtek mennyisége, míg a B. kísérletet úgy végeztük, hogy a ( -9 sejteknek nevezett) célsejtek mennyisége tízszer akkora, mint a vírusé. A pozitív sejtek %-os mennyisége olyan sejtekre vonatkozik, amelyek p24-gyel és pl9cel jelölt HÍV markereket fejeznek ki, amint ezt immunfluoreszcencia segítségével meghatároztuk. A reverz transzkriptáz egy vírus-eredetű enzimre vonatkozik, amelyet a sejt-felülúszóban a poli rA/dT jelű standard templát segítségével határozunk meg. Egyidejűleg sejtszámlálást végzünk, amelynek eredménye az, hogy a sejtek normál növekedési sebességgel szaporodtak az AMPLIGEN minden vizsgált koncentrációja (max. 300 mikrogramm/ml) mellett. Az A. és B. kísérletben az AMPLIGEN-t (50 mikrogramm/ml) az 1. napon adagoljuk. A HPLC elemzés arra mutat (az A. vagy a B. kísérletben egyaránt a 3-7. napon), hogy jellegzetes eltolódás következik be a 2'-5'-oligomer profilban, úgyhogy a magasabb molekulasúlyú (kevésbé vírusellenes) oligomerek eltolódtak az alacsonyabb molekulasúlyú (leginkább vírusellenes) oligomerek javára; ez a HÍV szelektív és intenzív elnyomásához vezet. Az RNáz L aktivitás egyidejű mérése (1. az 1. ábrát) arra mutat, hogy az RNáz L bioaktivitása kétszálas RNS-sel végzett kezelési sorozat eredményeként helyreáll.

Hasonló kísérleteket végeztünk különböző más humán sejtekkel, amelyek in vivő potenciális HÍV célpontok. Ezek a kísérletek kiterjedtek más sejtekre is, amelyekről funkcionális meghatározás alapján megállapítottuk, hogy ezek NK (természetes ölő), T-segítő, T-szupresszor sejtek, monomukleáris sejtek stb. A hibás RNS különböző koncentrációi minden esetben képesek arra, hogy szelektíve megállítsák és/vagy megelőzzék a HÍV szaporodását anélkül, hogy befolyásolnák a normál sejtszaporodást és érést (1. a 2. táblázatot is). A T sejtek tenyészetben való szaporodását - mint ez a sejtbiológia területén jártas szakember számára jól ismert - IL-2 faktor standard hozzáadásával tartjuk fenn. A HTV-nek a hibás kétszálas RNS által való szelektív elnyomása minden esetben együtt jár a 2 -5'-oligomer profil specifikus eltolódásával vagy intenzitásának növekedésével, amint ez HPLC elemzéssel meghatározható.

A szóbanforgó biokémiai mechanizmus keretében a kétszálas RNS lefelé irányulóan vagy disztálisan működik a veszélyeztetett (aktív HÍV fertőzésnek kitett, ill. ki nem tett) egyének biokémiai károsodásához képest. így helyreállítja a szervezetnek azt a képességét, hogy normális antivirális válaszreakciót mutasson.

A sejtek nagyon hatékonyan veszik fel a kétszálas RNS-t, így nincs szükség arra, hogy a kétszálas RNS egy intakt IFN receptorhoz kötődjék. Ezenkívül a kétszálas RNS bioaktív fragmentumok alakjában is rendelkezésre áll. így meggyorsítható az intracelluláris felvétel és elosztás. A kétszálas RNS ennélfogva rendelkezik azzal a képességgel, hogy könnyen átlépjen a vér/agy korláton, amely egyes egyénekben a HÍV maradék tárolóhelye lehet.

A találmány szerint alkalmazható kétszálas RNS jellegzetesen olyan molekulasúlyú, amint a 4 024 222 és a 4 130 641 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmak példái ezt leírják. Ugyancsak hatékony lehet azonban a sokkal alacsonyabb molekulasúlyú kétszálas RNS, amely a szülő molekula fragmentumaiként állítható elő. Ez a korábban leírt tipikus kétszálas RNS anyagok molekulaméretének pl. 1/2—1 /10-edét teheti ki.

A kétszálas RNS aktiválja a 2'-5'A polimerázokat és elősegíti az aktív antivirális oligonukleotidok szinte9

HU 209 865 B tizált mennyiségének 500-szoros növekedését ahhoz az esethez képest, amikor a szintézis egyedül interferon jelenlétében megy végbe. (A kétszálas RNS 250 nanomól 2'-5'-oligo-A-t eredményez l,6xl0⁸ sejtben, míg 200 egység/ml mennyiségű IFN csak 0,5 nanomól 2'- 5 5'-oligo-A-t eredményez.)

Hasonló jelenségek figyelhetők meg olyan egyének NK sejtjeiben, akik ki vannak téve az AIDS-szel való fertőzésnek, vagy akik valódi AIDS-es betegek. Hasonló a helyzet az NK (természetes ölő) sejt szintjei esetében, 10 AIDS/ARC-ben szenvedő betegekben. Sokkal kevesebbet tudunk azonban az NK regulációjának mechanizmusáról. Az AIDS/ARC-ben szenvedő betegekre és a „veszélyeztetett” csoportok egészséges tagjaira gyakran gyenge immunellenőrző képesség jellemző (ez a funkci- 15 onális NK sejtekkel és a T limfocitákkal függ össze) és ezek az egyének interferonokkal nem reaktiválhatók. Az AMPLIGEN a beteg blokkhoz képest disztálisan hat és képes aktiválni a citotoxikus limfocitákat.

Claims (3)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Eljárás humán immunelégtelenséget okozó vírus (HÍV) jelenlétének kimutatására humán biológiai folyadékban vagy sejtekben, azzal jellemezve, hogy meghatározzuk az aktivált RNáz L - mely a HÍV fertőzések markere - jelenlétét egy 28S rRNS-ből és 18s rRNS-ből származó, előre kijelölt hasítási termék mennyiségének, valamint - kívánt esetben egy bioaktív 2'-5'A oligomer koncentrációjának, mérésével.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy biológiai folyadékként vért vagy egy vérfrakciót alkalmazunk.
3. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a humán immunelégtelenséget okozó vírus jelenlétének kimutatását perifériás vér mononukleáris sejtjeiből származó citoplazma kivonatban végezzük.

   HU 209 865 Β Int. Cl.⁵: G 01 N 33/569

   1. Ábra

   1 2 3 4 5 6 7

   HU 209 865 B Int. Cl.⁵: G 01 N 33/569 lépés B lépés C lépés