HU209252B - Star-polymere-con jugate and process for producing them - Google Patents

Star-polymere-con jugate and process for producing them Download PDF

Info

Publication number
HU209252B
HU209252B HU874562A HU456287A HU209252B HU 209252 B HU209252 B HU 209252B HU 874562 A HU874562 A HU 874562A HU 456287 A HU456287 A HU 456287A HU 209252 B HU209252 B HU 209252B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
component
dendrimer
solution
generation
agent
Prior art date
Application number
HU874562A
Other languages
English (en)
Other versions
HUT55245A (en
Inventor
Donald A Tomalia
Donald A Kaplan
William J Kruper
Roberta C Cheng
Ian A Tomlinson
Michael J Fazio
David M Hedstrand
Original Assignee
Dow Chemical Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=25407923&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=HU209252(B) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Dow Chemical Co filed Critical Dow Chemical Co
Publication of HUT55245A publication Critical patent/HUT55245A/hu
Publication of HU209252B publication Critical patent/HU209252B/hu

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N25/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators, characterised by their forms, or by their non-active ingredients or by their methods of application, e.g. seed treatment or sequential application; Substances for reducing the noxious effect of the active ingredients to organisms other than pests
    • A01N25/08—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators, characterised by their forms, or by their non-active ingredients or by their methods of application, e.g. seed treatment or sequential application; Substances for reducing the noxious effect of the active ingredients to organisms other than pests containing solids as carriers or diluents
    • A01N25/10—Macromolecular compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/595—Polyamides, e.g. nylon
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6883—Polymer-drug antibody conjugates, e.g. mitomycin-dextran-Ab; DNA-polylysine-antibody complex or conjugate used for therapy
    • A61K47/6885—Polymer-drug antibody conjugates, e.g. mitomycin-dextran-Ab; DNA-polylysine-antibody complex or conjugate used for therapy the conjugate or the polymer being a starburst, a dendrimer, a cascade
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6949—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit inclusion complexes, e.g. clathrates, cavitates or fullerenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G69/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming a carboxylic amide link in the main chain of the macromolecule
    • C08G69/48—Polymers modified by chemical after-treatment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G73/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming a linkage containing nitrogen with or without oxygen or carbon in the main chain of the macromolecule, not provided for in groups C08G12/00 - C08G71/00
    • C08G73/02—Polyamines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G83/00—Macromolecular compounds not provided for in groups C08G2/00 - C08G81/00
    • C08G83/002—Dendritic macromolecules
    • C08G83/003—Dendrimers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08L—COMPOSITIONS OF MACROMOLECULAR COMPOUNDS
    • C08L101/00—Compositions of unspecified macromolecular compounds
    • C08L101/005—Dendritic macromolecules

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Polyamides (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
  • Macromolecular Compounds Obtained By Forming Nitrogen-Containing Linkages In General (AREA)
  • Luminescent Compositions (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

A találmány tárgya eljárás az (I) általános képletű csillagpolimer-konjugátumok előállítására. Az (I) általános képletben
P jelentése egymástól függetlenül szimmetrikus és elágazásokat tartalmazó dendrimer, amely adott esetben védőcsoporttal ellátott reakcióképes csoportokat tartalmaz;
x jelentése 1 vagy annál nagyobb egész szám;
M jelentése egymástól függetlenül azonos vagy eltérő hatóanyag, molekula, atom, ion vagy biológiai termék formájában, y értéke 1 vagy annál nagyobb egész szám; és a * jelzés azt jelenti, hogy az M hatóanyag a dendrimerhez van kapcsolva adott esetben egy kötést képző csoport segítségével.
A találmány szerinti eljárást úgy végzik, hogy P komponenst M komponenssel reagáltatják, célszerűen oldószer és puffer jelenlétében, szobahőmérséklet és az oldószer forráspontja közötti hőmérsékleten, adott esetben egy C kötést képző anyag, továbbá adott esetben egy T célra irányító anyag jelenlétében, P és M komponenst 0,1:1 és 1000:1 közötti arányban alkalmazva, és ahol kívánt esetben a P komponens által megkötött oldószert ultraszűréssel távolítják el az M komponenssel való reakciót megelőzően.
(P) * (M) x y (i)
HU 209 252
A leírás terjedelme: 60 oldal (ezen belül 22 lap ábra)
HU 209 252 Β
A találmány tárgya eljárás az (I) általános képletű polimer-konjugátumok előállítására. Az (I) általános képletben
P jelentése egymástól függetlenül sugárirányban szimmetrikus elágazásokat tartalmazó dendrimer, amely adott esetben védőcsoporttal ellátott reakcióképes csoportokat tartalmaz;
x jelentése 1 vagy annál nagyobb egész szám;
M jelentése egymástól függetlenül azonos vagy eltérő hatóanyag, molekula, atom, ion vagy biológiai termék formájában, y értéke 1 vagy annál nagyobb egész szám; és a * jelzés azt jelenti, hogy az M hatóanyag a dendrimerhez van kapcsolva adott esetben egy kötést képző csoport segítségével.
Az (I) általános képletű polimer-konjugátumokat úgy állítjuk elő, hogy P komponenst M komponenssel reagáltatunk, célszerűen oldószer és puffer jelenlétében, szobahőmérséklet és az oldószer forráspontja közötti hőmérsékleten, adott esetben egy C kötést képző anyag, továbbá adott esetben egy T célra irányító anyag jelenlétében, P és M komponenst 0,1:1 és 1000:1 közötti arányban alkalmazva, és ahol kívánt esetben a P komponens által megkötött oldószert ultraszűréssel távolítjuk el az M komponenssel való reakciót megelőzően.
A találmány szerint előállított sűrű csillagpolimerek („dense star polymers”, vagy „starburst polymer”, ezt az alábbiakban röviden „csillagpolimernek” jelöljük) gyógyászati anyagok vivőanyagaiként alkalmazhatóak.
A legutóbbi években dolgozták ki az úgynevezett „sűrű csillagpolimereket”. Úgy találták, hogy e csillagpolimerek mérete, alakja és sajátságai molekuláris szinten szabályozhatók, s így különleges felhasználási célokra alkalmassá tehetők. A csillagpolimerek lényeges előnye, hogy a hordozott anyagokat a polimer egységére vonatkoztatva nagy koncentrációban képesek kibocsátani (felszabadítani), e kibocsátás (felszabadulás) célzott üteme szabályozható, és/vagy a felszabadulás vagy alkalmazás többféle is lehet.
Legtágabb értelmezésében a találmány olyan csillagpolimer-konjugátumok előállítására (a továbbiakban esetenként: polimer-konjugátumokra) vonatkozik (a továbbiakban: a találmány szerinti konjugátumok), amelyek kívánt anyagokkal egyesítve csillagpolimert tartalmaznak; a találmány továbbá e konjugátumok előállítására, e konjugátumokat tartalmazó készítményekre és e készítmények előállítására is vonatkozik. A találmány körébe tartoznak e konjugátumok alkalmazásának módszerei is.
A találmány szerinti konjugátumok sokféle olyan célra alkalmazhatók, amelyek esetében a hatóanyag specifikus felszabadulása kívánatos; különösen alkalmasak biológiailag hatásos (bioaktív) anyagok kibocsátására. A találmány egyik előnyös megvalósítási módja szerint a találmány szerint előállított konjugátumok egy vagy több, biológiailag hatásos anyagot egy vagy több csillagpolimerrel egyesítve tartalmaznak.
A csillagpolimer-konjugátumok kedvező sajátságaik következtében lényeges előnyöket biztosítanak az ismert hordozókkal szemben. A csillagpolimerek molekuláris felépítését jellemzi a sugaras szimmetriájú, szabályos, dentrites (a fa elágazásához hasonló) elágazás. Az ilyen, radiálisán (sugarasan) szimmetrikus molekulákat „csillagtopológiás” („starburst topology”) molekuláknak nevezik. E polimereket olyan, módon állítják elő, amely biztosítja egy iniciátor-magrész körül a koncentrikusan elhelyezkedő kötődést. A csillagtopológiát úgy hozzák létre, hogy egy iniciátor-magrész körül koncentrikusan, dentritesen elhelyezkedő kapcsolatban rendezetten egyesítik az ismétlődő, szerves egységeket; s ezt úgy valósítják meg, hogy minden egyes kapcsolaton belül geometriailag progresszív módon, több molekulageneráció útján több ismétlődő egységet vezetnek be. Az így kapott, erősen funkcionalizált (több funkciós csoportot tartalmazó) molekulákat „dendrimereknek” nevezik: egyrészt, mert fa alakúan elágazók, másrészt mert oligomer jellegűek. így a „csillagoligomer” és a „csillagdendrimer” elnevezések a „csillagpolimer” fogalmában foglaltatnak. A topológiás polimerek - amelyek szabályozott méretű és alakú részeket tartalmaznak - olyan dendrimerek, amelyek reakcióképes végcsoportjaik útján kovalens kötésű hidakat képeznek, ezért a nevük „áthidalt dendrimerek”. A „csillagpolimer” fogalma a hídképző dendrimer megjelölést is magában foglalja.
A találmány megértését elősegítik az ábrák, amelyekhez az alábbi magyarázatokat fűzzük:
1. ábra: Csillagdendrimerek különböző generációi. 2A. ábra: Aszimmetrikus (egyenlőtlen) elágazásokat tartalmazó dendrimer.
2B. ábra: Szimmetrikusan elágazó dendrimer.
3. ábra: A dendrimer mérete az antitest méreteihez viszonyítva.
4. ábra: A 13C-spin-rács-relaxációs időket (Tj) mutatja különböző dendrimer-generációkba ágyazott aszpirin esetében (lásd az 1. példát).
5. ábra: A 2. ábra szerinti dinamikus elemzés eredményei.
6. ábra: 6.5 generációjú dendrimer befolyása a pszeudoefedrin dialízisének sebességére 9,5 pHérték mellett (lásd a 2. példát).
7. ábra: A dendrimer hidrolízisének befolyása a pszeudoefedrin permeabilitására (lásd a
3. példát).
8. ábra: A receptorterületre (receptorszakaszra) csillagpolimer (négy-generációs) jelenlétében felszabadult szalicilsav százalékos mennyiségének összehasonlítása 5,0, illetve 6,65 pH-érték mellett szalicilsavval mint kontrollal (lásd a 4. példát).
9. ábra: A (négy-generációs) csillagpolimer esetén a donorterületről (donorszakaszból) a receptorterületre 8,0 pH érték mellett kibocsátott szalicilsav százalékos mennyiségének öszszehasonlítása a szalicilsavtartalommal (lásd a 4. példát).
10. ábra: A donorterületről (négy-generációs) csillagpolimer jelenlétében kibocsátott szalicilsav
HU 209 252 Β százalékos mennyiségének összehasonlítása szalicilsavval mint kontrollal (lásd a 4. példát).
A csillagpolimereket az 1. ábra szemlélteti, ahol © jelöli az iniciátor-magrészt (ezen az ábrán a bal szélső rajzon látható, trifunkcionális iniciátor-magrész); Z jelenti a terminális csoportot (végcsoportot), amely balról a második rajzon látható, ezt csillagszerűen elágazó oligomemek nevezzük; A, B, C, D és E jelentik a csillagdendrimerek egyes molekuláris generációit (molekulagenerációit); és (A)n, (B)n, (C)„, (D)n és (E)n jelentik az áthidalt csillagdendrimereket.
A csillagdendrimerek unimolekuláris (egymolekulájú) kapcsolatok, amelyeknek három megkülönböztető felépítési (szerkezeti) sajátságuk van, ezek: (a) egy iniciátor-magrész; (b) belső rétegek („G” generációk), amelyek ismétlődő, az iniciátor-magrészhez sugarasan kapcsolódó egységekből állnak; és (c) a terminális funkciós csoportokat hordozó, külső felület (tehát a terminális funkciós csoportok, azaz funkciós végcsoportok), amelyek a legkülső generációhoz kötődnek. A csillagdendrimer molekula mérete és alakja, valamint a dendrimer molekulában jelenlévő funkciós csoportok az iniciátor-magrész, a generációk száma (azaz a kapcsolódó részek száma) és az egyes generációkban alkalmazott ismétlődő egységek megválasztása útján szabályozhatók. Mivel a dendrimerek bármelyik generáció elérése után könnyen izolálhatok, ezáltal lehetőség nyílik a kívánt tulajdonságokkal rendelkező dendrimerek előállítására.
A csillagdendrimer komponenseinek megválasztása befolyást gyakorol a dendrimerek sajátságaira. Az iniciátor-magrész típusa befolyásolhatja a dendrimer alakját, mert e magrész megválasztásával például gömb alakú, henger alakú, pálca alakú, ellipszoid vagy gomba alakú dendrimereket nyerhetünk. A generációk szekvenciális felépítése (tehát a generáció száma, valamint az ismétlődő egységek mérete és jellege) meghatározza a dendrimerek méreteit és belsejük jellegét.
Mivel a csillagdendrimerek olyan elágazó polimerek, amelyek az elágazások perifériáján eloszló funkciós csoportokat hordozó, dendrites elágazásokat tartalmaznak, ezért változatos sajátságokkal állíthatók elő. így például a 2A. ábrában szemléltetett makromolekulák, valamint az olyan csillagdendrimerek, amelyek például a 2B. ábrában láthatók, elágazásaik hosszának tulajdoníthatóan különböző tulajdonságokkal rendelkezhetnek. A 2A. ábrában bemutatott dendrimer típus (lásd például Denkwalter: 4289872 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírás) aszimmetrikus elágazásokat, külső (azaz felületi) csoportokat (ezek jele: Z’), belső egységeket (ezek jele: Z), és sokkal csekélyebb belső üres térséget tartalmaz. A 2B. ábrában szemléltetett, előnyös típusú dendrimer szimmetrikus (egyenlő szegmentumokat tartalmazó) elágazásokat, felületi csoportokat (ezek jele: Z’), két különböző belső egységet (ezek jele: X, illetve Z) és olyan üres belső térséget tartalmaz, amely a generáció (G) függvénye. A 2B. ábrában szemléltetett dendrimereket jellemzi, hogy elegendő számú generációt tartalmaznak ahhoz, hogy az üres térséget teljesen bezárják, s így túlnyomóan üreges belsőt tartalmaznak, amelyet tömör felület vesz körül. Azok a csillagdendrimerek, amelyek elegendő generációt tartalmaznak, az úgynevezett „sűrített szerkezetű csillagpolimerek”, amelyek esetében a dendrimer felülete elegendő terminális egységet tartalmaz ahhoz, hogy a dendrimer felülete tömör legyen, és ez a dendrimer belsejében lévő üreges térséget körülzárja. Ez a tömör állapot lehetőséget ad egy molekuláris szintű barrierre (gátra), amely felhasználható a dendrimer belseje irányában történő vagy a dendrimer belsejéből kifelé irányuló diffúzió szabályozására.
A dendrimerek felületének kémiai sajátságai előre meghatározott módon szabályozhatók úgy, hogy olyan ismétlődő egységet választunk, amely a kívánt kémiai funkciós csoportot tartalmazza, vagy úgy, hogy a felületi funkciós csoportok összességét vagy azok egy részét kémiailag módosítjuk, és így új felületi funkciós csoportokat hozunk létre. Ezek a felületek felhasználhatók specifikus helyek irányában való célzásra, vagy ellenállókká tehetők egyes szervekbe vagy sejtekbe például retikuloendoteliális sejtekbe - történő felvétellel szemben. A csillagdendrimerek egy másik alkalmazása abban áll, hogy a dendrimerek összeköthetők egymással, és így polidendrites egységek („áthidalt dendrimerek”) hozhatók létre, amelyek vivőanyagokként szintén alkalmazhatók.
Ezen túlmenően a dendrimerek úgy is előállíthatok, hogy egyes generációik az egységes elágazástól eltéréseket mutatnak, s így diszkontinuitások (azaz a dendrimeren belül egyes helyeken az egységes típusú elágazástól való eltérések) jönnek létre, s így a kapott dendrimer további, különböző sajátságokra tesz szert.
A találmány szerint előállított csillagpolimer-konjugátumokban alkalmazható csillagpolimerek ismert módon, például a 4587 329 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírásban közölt módszerrel állíthatók elő.
A dendrimerek igen egységes méretben és alakban állíthatók elő, és - ami nagyon lényeges - a dendrimer felszíni területének egységére vonatkoztatva nagyszámú funkciós csoportot tesznek lehetővé, továbbá az egységnyi molekulatérfogatra vonatkoztatva nagyobb számú funkciós csoportot tartalmaznak, mint egyéb, azonos molekulasúlyú, azonos magrészt tartalmazó és azonos monomer komponenseket tartalmazó, valamint azonos számú magrész-elágazást tartalmazó polimerek. A csillagpolimerek funkciós csoportjainak nagyobb száma (nagyobb sűrűsége) lehetővé teszi, hogy az egy dendrimerre vonatkoztatott hordozott anyag mennyisége nagyobb legyen, mint más polimerek esetében. Mivel a dendrimerek funkciós csoportjainak a száma a felületen és a dendrimer belsejében is szabályozható, ezzel lehetővé válik az egy dendrimerre vonatkoztatott biológiailag hatásos anyagmennyiség szabályzása. A jelen találmány egyik különösen előnyös megvalósítása értelmében a csillagpolimerek, előnyösen a csillagdendrimerek bioaktív anyagok (biológiailag hatásos anyagok) célzott hordozói, amelyek képesek arra, hogy a biológiailag hatásos anyagokat a cél3
HU 209 252 Β zott szervezetben, egy bizonyos célszervben vagy egy bizonyos meghatározott helyen felszabadítsák (kibocsássák).
Összehasonlítás tehető az alacsony generációs számú (azaz 1-7 generációs) csillagdendrimerek és a 5 klasszikus, gömb alakú micellák között, mert közös sajátságaik vannak, ezek: alakjuk, méretük és felületük.
/. táblázat -| q
Paraméter Szabályos klasszikus micellák Csillagdendrimerek
Alak gömb alakú gömb alakú
Méret (átmérő) 20-60 A 17-67 A
Felületi aggregációs szám 4-202 Z=6-192(Z jelenti a felületi csoportok számát) (2-7 generáció)
1 felszíni csoportra eső terület A2 (1Á = 10'1 nm; 1 Á2=10'2nm2) 130-80 Á2 127-75 A2
Az I. táblázatban feltüntetett alakot letapogató transzmissziós elektronmikroszkópiával (STEM) és a belső súrlódás (belső viszkozitás, η) mérésével igazoltuk. A méretet a belső viszkozitás és méretkizárásos kromatográfia (SEC) mérésekkel igazoltuk. A felületi aggregációs számot titrimetriával és nagy felbontású NMR spektroszkópiával igazoltuk. Az egy felszíni csoportra eső területet hidrodinamikai SEC mérésekkel számítottuk ki.
A poliamidoamin (a következőkben röviden: PAMAM) csillagdendrimerek első öt generációja olyan mikrotartomány, amelyek számos vonatkozásban (alakjukban, méretükben, felületi csoportjaik számában és az egy felszíni csoportra eső területben) igen közel állnak egymáshoz. Lényeges különbség azonban, hogy a PAMAM dendrimerek kovalensen kötöttek, és igen szilárdak a micellák dinamikusan egyensúlyi jellegéhez viszonyítva. Ez a különbség fontos előnyt jelent, a mikrotartományokat kapszulázási célokra alkalmazzuk.
Az első öt generáción túl következő, koncentrikus generációk a felület összefonódását (tömörülését) idézik elő. Ez a felületi tömörülés gátló jelleget kölcsönöz, és a II. táblázat szerint egy felszíni csoportra vonatkoztatva kisebb területet jelent.
//. táblázat
PAMAM dendrimerek sajátságai a generációk száma szerint
Generációk 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Z felületi csoportok száma# 3 6 12 24 48 96 192 384 768
Molekulatömeg 275 875 2411 5147 10619 21563 43541 87227 174779
Átmérő* (SEC-méréssel) 10,4 Á 15,8 Á 22 A 31 Á 40 A 53 A 67 A 76 A 88 A
1 dendrimer felszíni területe 366 A22 783 A2 1519 Á2 3018 Á2 5024 A2 8,820 A2 14,096 A2 18,136 A2 36,083 A2
Z csoportra eső felszíni terület 122 A2 131 A2 127 A2 126 A2 104 A2 92 A2 73 A2 47 A2 32 A2
A Z csoportok közötti távolság 12,4 Á 12,8 Á 12,7 λ 12,6 Á 11,5 A 10,8 A 9,8 A 7,75 A 6,28 A
Üres térfogat 311,6 Á3 1470,2 A3 4737,9 Á3 11427,0 Á3 - - - - -
* A hidrodinamikai átmérőket méretkizárásos kromatográfiával határoztuk meg, és ennek során a kalibrálást monodiszperz poli(etilén-oxid) standardokkal végeztük.
(Molekulatömeg = 1Q2) yégeztük így például az 5,0,6,0,7,0, 8,0 és 9,0 amin-végcso- 50 portos generációk a Z csoportra vonatkoztatva 104, 92,
73, 47, illetve 32 A2 értékben csökkenő felszíni területet jelentenek. Ez a jellemző sajátság megfelel egy átmenetnek a kevésbé tömör, micellaszerű felületről a tömörebb, kétrétegű/egyrétegű barrierszerű felületnek, amely például egyes liposzómák vagy LangmuirBlodgett típusú membránokkal kapcsolatos.
Ha ez a felületi tömörülés beáll, akkor a fizikai jellemzőkben és az alaktani sajátságokban változásoknak kell megfigyelhetőknek lenniük, ahogyan a generációk növekszenek a közepes (6-8) számú generációtól a magasabb számú 9 vagy 10 generációig. A 7,0,8,0 és 9,0 generációk esetében a letapogató transzmissziós elektron-mikrográfiákat úgy kaptuk, hogy minden egyes mintáról eltávolítottuk a metanol oldószert, és 55 így színtelen, halványsárga, szilárd filmeket kaptunk, amelyeket ozmium-tetroxiddal festettünk. Az előre jósolt morfológiai változás a G = 9,0 szinten jelent meg. A 9,0 generációban a mikrotartományok átmérője körülbelül 33 A, és ezeket körülveszi egy körülbelül 25 A 60 vastagságú, színtelen perem. Nyilvánvalóan a 25 A ki4
HU 209 252 Β terjedésű, külső, membránszerű barrier metanol oldószert tartott vissza, és így egy sötétre színeződött belső rész látható. így tehát a 9,0 generáció esetében a PAMAM csillagpolimer topológiai szempontból liposzómaszerűen viselkedik. Ez a polimer azonban nagyságrendileg kisebb, és erősen monodiszperz jellegű a liposzómával összehasonlítva. Ennek alapján a találmány szerinti dendrimerek felhasználhatók körülbelül 33 A vagy ennél nagyobb átmérőjű (körülbelül 18 000 A3 térfogatú) üres térséget kitöltő oldószer molekuláris kapszulázására. Ezek a micellaszerű méretű prototípusok látszólag úgy viselkednek, mint a kovalensen kötött liposzómák. Ez a viselkedési forma lehetővé teszi e prototípusok alkalmazását gyógyszerhatóanyag-kibocsátó szerekként, vagy nem-kelátképző radionuklidok hordozóiként csillagpolimer-antitest konjugátumokban, különböző emlős megbetegedések kezelésére.
A jelen találmány szerint előállított konjugátumokban alkalmazható dendrimerek például olyan csillagpolimerek, amelyeket a 4507 466, 4558 120, 4568737 és 4587329 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírásokban közöltek.
Közelebbről, a találmány szerinti csillagpolimerkonjugátum az (I) általános képlettel jellemezhető, ahol minden egyes P egy dendrimert jelent; x értéke 1, vagy annál nagyobb egész szám; és minden egyes M jelentése egy hordozott gyógyászati anyag egy egysége (például molekulája, atomja, ionja és/vagy más alapegysége), ezek az egységek származhatnak egyugyanazon hordozott gyógyászati anyagból vagy különböző hordozott gyógyászati anyagokból, és M előnyös jelentése biológiailag hatásos anyag egy egysége;
y értéke 1, vagy annál nagyobb egész szám; és * azt jelzi, hogy a hordozott gyógyászati anyag a dendrimerrel egyesítve van (asszociálva van).
Előnyösek azok az (I) általános képletű csillagpolimer-konjugátumok, amelyekben M valamilyen gyógyszerhatóanyagot, radionuklidot, kelátképzőt, kelátozott fémet, toxint, antitestet, antitest-fragmentumot, antigént, jelképzőt (jelgenerátort), jelvisszaverőt vagy jelfelvevőt jelent; különösen előnyösek azok, amelyekben x értéke 1, és y értéke 2 vagy annál nagyobb.
Az (I) általános képletű csillagpolimer-konjugátumok közé tartoznak azok is, ahol a csillagdendrimerek kovalensen kapcsolódnak egymáshoz, azaz az áthidalt csillagdendrimerek. Ez a kapcsolódás adott esetben kötőcsoportokkal történik, és így polidendrites kapcsolatok jönnek létre (azaz olyan esetben, ha x értéke 1-nél nagyobb). Ezek az áthidalt csillagdendrimerek felhasználhatók például hatóanyagok helyi (topikus) felszabadulásának a szabályozására vagy például besugárzással végzett savóshártya-irtás esetében.
E leírásban az „egyesített” kifejezést olyan értelemben használjuk, hogy a hordozott anyag(ok) lehetnek kapszulázva vagy megkötve a dendrimer magrészében, részben vagy teljesen diszpergálva a dendrimer egészében, vagy a dendrimerhez kapcsoltan vagy kötötten, vagy e lehetőségek kombinációjával asszociált állapotban. A hordozott anyag(ok) és a dendrimer(ek) egyesítése adott esetben kapcsoló részek és/vagy közbülső egységek útján történhet, amelyek megkönnyítik a csillagpolimer-konjugátumok előállítását vagy alkalmazását. E célra alkalmas kötőcsoportok az olyan csoportok, amelyek egy célzó (célba juttató) egységet (T) kapcsolnak a dendrimerhez (P) anélkül, hogy jelentősen csökkentenék akár a célba juttató egység, akár más hordozott anyagok (M) hatásosságát, amelyek a csillagpolimer-konjugátumban jelen vannak. Ezek a kötőcsoportok lehetnek lehasíthatók vagy le nem hasíthatok, és főként azért alkalmazzuk, hogy kiküszöböljük a dendrimer és a célba juttató egység közötti szterikus gátlást; a kötőcsoportok előnyösen stabilisak (azaz le nem hasíthatok). Mivel a csillagdendrimerek mérete, alakja és funkciós csoportjainak sűrűsége pontosan szabályozható, számos lehetőség adódik a hordozott anyagnak a dendrimerrel való egyesítésére. így például: (a) lehet kovalens, ionos, hidrofób vagy keláttípusú egyesítés a hordozott anyagok vagy egységek és a dendrimer felszínén vagy ahhoz közel elhelyezkedő, típusos funkciós csoportok között; (b) fennállhat kovalens, ionos, hidrofób vagy kelátszerű kapcsolat a hordozott anyagok és a dendrimer belsejében elhelyezkedő egységek között; (c) a dendrimer előállítható olyan belső résszel, amely túlnyomórészt üreges, s így lehetővé teszi a hordozott anyagoknak a belső részben (az üres térfogatban) történő fizikai bezárását, aminek során a hordozott anyag kibocsátása adott esetben úgy szabályozható, hogy a dendrimer felületét diffúziószabályozó egységekkel tömörítjük; vagy (d) alkalmazhatók a fentiekben említett lehetőségek különböző kombinációi.
Az alábbiakban „P”-vel jelölt dendrimerek például azok a sűrű csillagpolimerek, amelyeket a 4507 466, 4558120, 4568737 és 4587 329 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírásokban ismertettek.
A jelen találmányban alkalmazható, az alábbiakban „M”-mel jelölt gyógyászati anyag bármely anyag lehet, amely akár in vivő, akár in vitro körülmények között diagnosztikai célra vagy terápiás kezelésre alkalmazható, s amely a csillagdendrimerrel úgy egyesíthető, hogy ezáltal a dendrimer fizikai épsége észrevehetően nem sérül; ilyen gyógyszerhatóanyagok például az antibiotikumok, fájdalomcsillapítók, vérnyomáscsökkentők, kardiotóniás anyagok (a szív teljesítményét fokozó szerek), így: az acetaminofen, acilklovir, alkeran, amikacin, ampicillin, aszpirin, biszantrén, bleomicin, neokardiosztatin, klórambucil, klóramfenikol, citarabin, daunomicin, doxarubicin, fluoruracil, gentamicin, ibuprofen, kanamicin, meprobamát, metotrexát, novantron, nisztatin, onkovin, fenobarbitál, polimixin, probukol, prokarbabizin, rifampin, streptomicin, spektinomicin, szimmetrel, tioguanin, tobramicin, trimetoprim és a valban; valamint toxinok, így a diftéria-toxin, gelonin, exotoxin A, abrin, modekkin, ricin vagy ezek toxikus fragmentumai; fémionok, így az alkálifémek és alkáliföldfémek ionjai; radionuklidok, így az aktinidákból vagy lantanidákból vagy más hasonló átmeneti elemekből vagy egyéb elemekből képződő radionuklidok így a 67Cu, ’θΥ, lllIn, l31I, 186Re, 105Rh, 99mTe,
HU 209 252 Β 67Ga, 153Sm 159Gd, 175Yb’ 177Lu, 88Y, 166Ho, 115mIn, 109Pd, 82Rb, 194Ir, l40Ba, 149Pm, 199Au, I40La és 188Re; jelképzők (jelgenerátorok), például fluoreszkáló egységek; jelvisszaverők, így a Fe, Gd, Mn; kelátozott fémek, így a fentiekben említett fémek bármelyike, akár radioaktív, akár nem, ha kelátképzővel kötött állapotban vannak; valamint jelfelvevők, így például elektronsugár-opacifikáló anyagok; antitestek, például monoklón és anti-idiotípusú antitestek; antitest-fragmentumok; hormonok; biológiai válaszokat módosító anyagok, így az interleukinok, interferonok, vírusok és vírusok fragmentumai; diagnosztikai célra alkalmazott opacifikáló anyagok; és fluoreszkáló egységek. A hordozott gyógyászati anyagok közé tartoznak a „befogó” szerek is, így például a kelátképzők, antigének, antitestek és bármilyen egységek, amelyek terápiás vagy diagnosztikai hatóanyagok szelektív befogására képesek.
A hordozott gyógyászati anyagok előnyösen biológiailag hatásos vegyületek. A „bioaktív” („biológiailag hatásos”) kifejezést olyan hatásos entitás megjelölésére alkalmazzuk, mint például egy molekula, atom, ion és/vagy más entitás jelölésére, amely valamilyen célzott egység - például valamilyen fehérje, glikoprotein, lipoprotein, lipid, célsejt, célszerv vagy célorganizmus [például valamilyen mikroorganizmus vagy állati szervezet (beleértve az emlősök szervezetét vagy az emberi szervezetet is)], vagy egyéb célzott egység - kimutatására, azonosítására, gátlására, kezelésére, katalizálására, szabályozására, elölésére, fokozására vagy módosítására képes.
Az (I) általános képletű csillagpolimer-konjugátumokat általában úgy állítjuk elő, hogy a P-t M-mel alkalmas oldószerben reagáltatjuk olyan hőmérsékleten, amely megkönnyíti a hordozott anyag (M) egyesítését a csillagdendrimerrel (P).
E célra alkalmasak olyan oldószerek, amelyekben P és M legalább részben oldhatók, és amelyek a konjugátum képződésével szemben közömbösek. Ha P és M legalább részben elegyednek egymással, akkor nem feltétlenül szükséges oldószer használata. Kívánt esetben az alkalmas oldószerek keverékei is használhatók. Alkalmas oldószerek például a víz, metanol, etanol, kloroform, acetonitril, toluol, dimetil-szulfoxid és a dimetil-formamid.
Az (I) általános képletű csillagpolimer-konjugátumok képződésének reakciókörülményei az adott dendrimertől (P), a hordozott gyógyászati anyagtól (M) és a kapcsolat (kötés, *) jellegétől függenek. így például ha P egy metilén-karboxilát felületű poli(etilén-imin) (az alábbiakban rövidítve: PEI) csillagdendrimer, M valamilyen radionuklid - például ittrium, akkor a reakciót szobahőmérsékleten, vízben hajtjuk végre. Ezzel szemben, ha P egy észter-végcsoportot hordozó poliamidoamid (PAMAM) csillagdendrimer, M aszpirin, akkor a reakciót szobahőmérsékleten kloroformban játszatjuk le. Általában a hőmérséklet szobahőmérséklettől a reakcióelegy forráspontjáig terjedhet. A szükséges oldószer és reakció-hőmérséklet megválasztása a tapasztalt szakember számára önként adódik.
Az M:P arány a dendrimer méretétől és a hordozott anyag mennyiségétől függ. így például bármely ionos M-nek a P-hez viszonyított mólaránya általában 0,1:1től 1000:1-ig terjed, előnyösen 1:1 és 50:1 között, még előnyösebben 2:1 és 6:1 között van. Bármely gyógyszerhatóanyagnak vagy toxinnak (M) a P-hez viszonyított tömegaránya általában 0,1:1-től 5:1-ig, előnyösen 0,5:1-től 3:1-ig terjed.
Ha M radionuklid, akkor a csillagpolimer-konjugátum három úton állítható elő:
(1) P alkalmazható kelátképzőként; például a PEI vagy
PAMAM metilén-karboxilát felülete egy olyan fémet, mint az ittrium vagy az indium, kelétként köt meg.
(2) a P-hez kovalensen köthető valamilyen kelát: például egy amin-végződésű PEI csillagdendrimer 1(p-izotiocianato-benzil)-dietilén-triamin-pentaecetsavval reagáltatható, majd keláttá alakítható; vagy valamilyen komplex, például kelátozott ródiumklorid vihető reakcióba.
(3) Egy előzőleg kelátba vitt radionuklid egyesíthető P-vel hidrofób vagy ionos kölcsönhatás útján. Különösen előnyösek azok a csillagpolimer-konjugátumok, amelyek célbajuttató (célzó) egységet (a továbbiakban: „T”) tartalmaznak, és szerkezetük a (Π) általános képlettel fejezhető ki, amelyben mindegyik T célzóegységet jelent; e értéke 1, vagy annál nagyobb egész szám; és P, x, *, M és y jelentése a fentiekben meghatározott. A (II) általános képletű csillagpolimer-konjugátumok közül azok előnyösek, amelyekben M jelentése gyógyszerhatóanyag, radionuklid, kelátképző, kelátozott fém, toxin, jelképző, jelvisszaverő vagy jelfelvevő anyag. Előnyösek azok a konjugátumok is, ahol e értéke 1 vagy 2; valamint azok, amelyekben x értéke 1, és y értéke 2 vagy nagyobb. Különösen előnyösek azok a konjugátumok, amelyekben x értéke 1, e értéke 2, y értéke 2 vagy nagyobb, és M valamint T a polimerrel azonos vagy különböző kapcsoló egységek (kötőegységek) útján egyesítettek.
A (II) általános képletű csillagpolimer-konjugátumokat a találmány szerint úgy állítjuk elő, hogy: vagy T*P-t képezzük, és ehhez adjuk az M-et; vagy P*M-et képezzük, és ehhez adjuk a P-t. Mindkét reakciót olyan hőmérsékleteken hajtjuk végre, amelyek az adott konjugátum-komponenseket nem károsítják, és szükséges esetben alkalmas oldószert használunk. A pH-érték szabályozására pufferoldatokat alkalmazunk, vagy megfelelő savat vagy bázist adunk a reakcióelegyhez. A reakció körülményei a képződött kapcsolattól (*), a csillagdendrimertől (P), a hordozott gyógyászati anyagtól (M) és a célzóegységtől (T) függenek. így például, ha T valamilyen monoklón antitest, és M egy radionuklid, akkor a T*P kapcsolatot valamilyen funkciós csoport útján - például valamilyen izotiocianáttal - létesítjük vízben, adott esetben szerves társoldószer, így acetonitril vagy dimetil-formamid jelenlétében. A konjugálást általában 7-10, előnyösen 8,5-9,5 pH-értéken hajtjuk végre. Az így kapott konjugátumot ezután kelátképzésbe visszük a radionukliddal - például ittri6
HU 209 252 Β um-acetáttal - előnyösen szobahőmérsékleten. Eljárhatunk azonban úgy is, hogy P-t és M-et keláttá alakítjuk - általában vízben - a T-vel történő konjugálás előtt. A T-vel végbemenő konjugálást megfelelő pufferközegben végezzük.
A T: P arány előnyösen 1:1, különösen akkor, ha T valamilyen antitest vagy antitest-fragmentum. Az Μ: P arány a fentiekben meghatározott.
A csillagpolimer-konjugátumok célzására képes irányító egységek olyan anyagok (egységek), amelyek a találmány szerinti csillagpolimer-konjugátumokban alkalmazva lehetővé teszik, hogy a csillagpolimer-konjugátumnak legalább egy része a kívánt célegységen szabaduljon fel (például egy fehérjére, glikoproteinre, lipoproteinre, lipidre, célsejtre, célszervre, célzott szervezetre vagy más célzott egységre jusson.) Ilyen irányítóegységek például az antitestek, előnyösen a monoklón antitestek, antitestek fragmentumai, például Fab, Fab’, F(ab’)2 fragmentumok vagy bármely más antitest-fragmentum, amely a kívánt célspecifitással rendelkezik; ilyenek továbbá a hormonok, a biológiai választ módosító anyagok, epitópok; valamint a célra nézve specifikus funkciós csoportok.
A tálálmány szerinti előnyös csillagpolimer-konjugátumokban alkalmazható antitestek vagy antitestfragmentumok önmagában jól ismert módon állíthatók elő. Erősen specifikus monoklón antitestek létesíthetők ismert hibridizáló módszerekkel) [lásd például: Kohler és Milstein: Natúré 256, 495 (1975); és Eur. J. Immunoi. 6, 511 (1976)]. Az ilyen antitestek reakcióképessége általában nagyon specifikus.
Az antitestet mint irányítóegységet tartalmazó csillagpolimer-konjugátumokban bármilyen antigén vagy haptén elleni antitest alkalmazható. Jóllehet a szokásos poliklón antitestek is használhatók, a monoklón antitestek számos előnyt biztosítanak. Minden egyes monoklón antitest egyetlen epitópra erősen specifikus; továbbá valamennyi monoklón antitest nagy mennyiségben is előállítható. A jelen találmány céljára alkalmazható antitestek például tumorokra, baktériumokra, gombákra, vírusokra, parazitákra, mikoplazmára, differenciáló és más sejtmembrán-antigénekre, kórokozó felületi antigénekre, toxinokra, enzimekre, allergénekre, gyógyszerhatóanyagokra és más, biológiailag hatásos molekulákra irányulhatnak. Az antigének teljesebb felsorolása megtalálható a 4193 983 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírásban.
Kívánatos lehet több antitest vagy antitest-fragmentum kapcsolása a dendrimerrel és - különleges esetekben - különböző specifitású antitestek kapcsolása a dendrimerrel. így például megtervezhető olyan bifunkciós konjugátum, amely képes lokalizálódni és megkötődni egy daganaton, majd ezt követően megkötni a keringő citotoxikus, diagnosztikai vagy biosztatikus karakterű vegyületeket.
Irányítóegység hiányában (vagy kívánt esetben irányítóegység jelenlétében) - több funkciós csoportnak tulajdoníthatóan, amelyek a dendrimer felületén vagy annak közelében helyezkednek el - e funkciós csoportok nagy része vagy az összes funkciós csoportok anionosakká, kationosakká, hidrofóbakká vagy hidrofilekké változtathatók abból a célból, hogy hatásosan elősegítsék a csillagpolimer-konjugátumból való kibocsátást ellentétes töltésű, vagy hidrofób vagy hidrofil, összeegyeztethető, kívánt célegységre.
A (II) általános képletű vegyületeket a találmány szerint úgy is előállíthatjuk, hogy a P dendrimert védett formában alkalmazzuk; ezt az A) reakcióvázlat szemlélteti, amelyben
S*P jelenti a védett (védőcsoportot hordozó) dendrimert;
S*P*M jelenti az M-mel konjugált, védett dendrimert; P*M jelenti az M-mel konjugált dendrimert (a csillagpolimer-konjugátumot);
T*P*M jelenti a célbajuttató irányítóegységgel összekapcsolt csillagpolimer-konjugátumot.
A fenti célra olyan oldószereket alkalmazhatunk, amelyek a P*M csillagpolimer-konjugátumot nem érintik. Ha S jelentése például terc-butil-oxi-karbonilcsoport, akkor ez az S vizes savval eltávolítható.
Előnyösek azok a csillagpolimer-konjugátumok is, amelyekben a polimert közvetlenül vagy kapcsolóegységek (kötőegységek) útján egyesítjük; e csillagpolimer-konjugátumok szerkezetét a (III) általános képlet fejezi ki, ahol minden egyes C’ azonos vagy különböző kapcsolócsoportot (kötőcsoportot) jelent;
minden egyes C” azonos vagy különböző kapcsolócsoportot (kötőcsoportot) jelent;
g és k értéke egymástól függetlenül 1 vagy annál nagyobb egész szám;
f és h értéke egymástól függetlenül 0 vagy annál nagyobb egész szám;
- kovalens kötést jelent azokban az esetekben, amikor kötőcsoport van jelen; és
P, x, *, M, y, T és e jelentése a fentiekben meghatározott.
A (III) általános képletű csillagpolimer-konjugátumok közül előnyösek azok, amelyekben M valamilyen radionuklid, gyógyszerhatóanyag, toxin, jelképző, jelvisszaverő vagy jelfelvevő. Előnyösek azok a konjugátumok is, amelyekben x értéke 1. Különösen előnyösek azok a konjugátumok, amelyekben x, e, f, h, és y értéke 1, g értéke 1 vagy nagyobb, és k értéke 2 vagy nagyobb. Legelőnyösebbek azok a konjugátumok, amelyekben x, e, f, h, y és g értéke egyaránt 1, és k értéke 2 vagy nagyobb. Különösen előnyösek továbbá azok a csillagpolimer-konjugátumok, amelyekben M jelentése biológiailag hatásos anyag, például radionuklid, gyógyszerhatóanyag vagy toxin.
C”-vel jelölt kötőcsoportokként olyan csoportok alkalmazhatók, amelyek a hordozott gyógyászati anyagot a dendrimerhez kapcsolják anélkül, hogy a csillagpolimerkonjugátumban jelen lévő, hordozott gyógyászati anyag vagy célba juttató anyag hatásosságát csökkentenék. E kötőcsoportoknak stabilisaknak (azaz le nem hasíthatóknak) vagy lehasíthatóknak kell lenniük a hordozott gyógyászati anyag hatásmódjától függően; e csoportokat abból a célból alkalmazzuk, hogy a hordozott gyógyászati anyag és a polimer között a szterikus gátlást elkerüljük.
HU 209 252 Β
Legelőnyösebbek azok a konjugátumok, amelyekben a dendrimer közvetlenül vagy kötőcsoport útján valamilyen antitesthez vagy antitest-fragmentumhoz kapcsolódik. Ezekben az előnyös konjugátumokban továbbá a polimer adott esetben közvetlenül vagy kötőcsoport útján egy vagy több hordozott anyaggal előnyösen valamilyen radioizotóppal - lehet kapcsolatban. Az ilyen csillagpolimer-konjugátumok szerkezetét a (IV) általános képlet szemlélteti, amelyben minden egyes antitest olyan antitestet vagy antitestfragmentumot jelent, amely egy kívánt epitóppal kölcsönhatásba lépni képes;
- kovalens vagy ionos kötést jelent azokban az esetekben, amidőn kötőcsoport van jelen; és
R, x, *, Μ, T, e, y, C’, C”, g, k, f és h jelentése a fentiekben meghatározott.
Olyan csillagpolimer-dendrimerek (P) szintézise céljából, amelyek egy irányítóegység (T) megkötésére alkalmas funkciós csoportot (C’ vagy C”) tartalmaznak, a találmány szerint előnyösen úgy járunk el, hogy a reakcióképes funkciós csoportot mint szintetikus prekurzort védőcsoporttal látjuk el. Ez a védelem azért előnyös, mert lehetővé teszi igen értékes dendrimer vagy konjugátumok előállítását. Ez az eljárás lehetővé teszi a hordozott gyógyászati anyag (M) valamely egységének kémiai kötését a csillagdendrimer (P) terminális funkciós csoportjával olyan módszerekkel, amelyek következtében egyébként a kötő funkciós csoport is reakcióba lépne, és ez megakadályozná az irányítóegységgel való kapcsolódást. Ezt követően a védőcsoport eltávolítása vagy szintetikus konverziója a kívánt funkciós kötőcsoporttá lehetővé teszi, hogy a csillagpolimer-konjugátumot a célbajuttató irányítóegységgel összekapcsoljuk.
A „kötésre alkalmas funkciós csoportok” egyik előnyös tagja az anilin-egység. Ez a csoport azért előnyös, mert közvetlenül felhasználható az irányítóegység kötéséhez, vagy könnyen módosítható más funkciós csoportokká, amelyek alkalmasak az irányítóegységgel végbemenő reakcióhoz: ilyen például az izotiocianát-, izocianát-, szemitiokarbazid-, szemikarbazid-, brómacetamid-, jód-acetamid és maleimid-csoport. Kötésre alkalmas funkciós csoportként az anilin-egység azért is alkalmas, mert a csillagdendrimer szintézise során könnyen védhető; vagy prekurzorként alkalmazhatjuk a nitrocsoportot, amely a szintézis végén a kívánt aminocsoporttá alakítható.
Számos védőcsoport áll rendelkezésre, amelyek alkalmasak az anilino-amino funkciós csoport megvédésére a csillagdendrimer szintézise során (lásd T. W. Green: Protective Groups in Organic Synthesis, kiadó John Wiley and Són, New York, 1981); a védőcsoportok egy előnyös típusa a karbamátok, amint ez a B) reakcióvázlatból látható.
Számos karbamátot alkalmaztak az aminocsoport védelmére. A csillagdendrimer szintézise során legelőnyösebben alkalmazható karbamát a terc.-butil-karbamát, ahol R -C(CH3)3 csoportot jelent. E védőcsoport enyhén savas hidrolízissel eltávolítható. Előnyös továbbá a benzil-karbamát védőcsoport, amelyben R benzilcsoportot jelent; e védőcsoport előnyös, ha a dendrimer a savas hidrolízissel szemben érzékeny. Ez utóbbi védőcsoport katalitikus hidrogénezéssel távolítható el. Előnyös még a 9-(fluorenyl-metil)-karbamát védőcsoport is, amelyben R jelentése (a) képletű csoport.
Előnyös példaként említhető továbbá a ftaloil-védőcsoport, amint ez a C) reakcióvázlatból látható.
A dendrimer szintézise során egyéb, az irodalomból jól ismert védőcsoportok is használhatók. A fenti példák mindössze illusztratív jellegűek, de nem az egyedül alkalmazható védőcsoportok. Bármely védőcsoport alkalmazható, amely a reakciókörülmények között stabilis, és a csillagdendrimer integritásának változtatása nélkül eltávolítható.
A találmány szerint eljárhatunk úgy is, hogy egy aktív aril-halogenidet - például 4-nitro-fluor-benzolt reagáltatunk a konjugálásra kiszemelt anyag, például poli(etilén-imin) (PEI) csillagpolimer amincsoportjával, majd a nitrocsoportot katalitikus hidrogénezéssel anilincsoporttá alakítjuk a soron következő konjugálás céljára. Ez a módszer különösen hasznos olyan szerek, például poliaminok esetében, amelyek alkalmazás előtt további módosítást igényelnek, mivel a nitro-fenil funkciós csoport az összes, nem reduktív jellegű reakciókörülménnyel szemben közömbös. Az ismertebb bifunkcionális kapcsolószerek - így például az aktív észterek vagy a diizocianátok, amelyek sokféle reakciókörülmény között reakcióképesek, és ezért a konjugálásra már alkalmatlanná válhatnak - például az (V), (VI), (VII) képletű vegyületek, valamint a (VIII) képletű, diizocianát-típusú csoport.
A találmány értelmében nitrocsoporttal helyettesített aril-szulfonil-halogenideket is alkalmazhatunk, amelyek szulfonamidokká reagálnak. E vegyületek szerkezetét szemlélteti a (IX) általános képlet.
Az ismert eljárásokkal szemben - amelyek konjugálásra alkalmas amino-fenil-csoport bevezetését célozzák - ennek az eljárásnak az az előnye, hogy a szintézisnek kései lépésében hajtjuk végre. Gansow és munkatársai (lásd a 4472509 számú egyesült államokbeli szabadalmi bejelentést) eljárásuk során a nitro-fenil-csoportot egy hosszú szintetikus lépéssor első lépésében vezették be, és ezzel korlátozniuk kellett az alkalmazható kémiai módszereket.
Ez az eljárás egyszersmind olyan funkciós csoportot vezet be a kötés céljára, amely a molekula többi részétől világosan megkülönböztethető. Manabe és munkatársai közölték, hogy borostyánkősavanhidrid gyűrűjének a megmaradó aminokkal való nyitása olyan kapcsoló csoportot eredményezett, amelynek segítségével lehetővé vált a konjugálás valamilyen antitesttel. Ez a módszer azonban nem tette lehetővé a differenciálást a polimeren lévő nem kelátozott helyek között, mivel a kelátképző csoportok a kötőcsoporttal azonosak voltak.
A fenti eljárással amino-fenil funkciós csoport vezethető be olyan anyagba, amely aminocsoportot tartalmaz, s amelyet ezt követően biológiailag hatásos anyaggal, például monoklón antitesttel vagy enzimmel
HU 209 252 Β konjugálunk. Az anyag a biológiailag hatásos anyagon, például az antitesten lévő szénhidrátokhoz oxidatív kapcsolással konjugálható. Az amino-fenil-csoport átalakítható izotiocianát- vagy izocianátcsoporttá, amely alkalmas arra, hogy a biológiailag hatásos anyag lizin maradékainak az aminocsoportjaival reagáljon.
Ez az eljárás lehetővé teszi továbbá lantanidák közvetlen kelátozását csillagdendrimerekkel, előnyösen a PEI-acetát dendrimerrel. Ezzel ellentétben Denkwalter (lásd a 4289 872 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírást) megállapítása szerint a dendrimer felületén csak acetátok vannak. A találmány szerinti eljárás reakciója azt mutatja, hogy a PEI-acetát alkalmazása sokkal kedvezőbb, mint a PAMAM-é, azaz az imino-diacetátok felülete az egységnek csak egy része és a gerincrész, valamint az elágazás ugyanolyan lényeges. A PEI-acetát kelátképző sajátságai jobbak, mint a PAMAM-acetáté. A PEI-acetát szerkezetét az (1) képlet, a PAMAM-acetát szerkezetét a (2) képlet szemlélteti.
A (IV) általános képletű csillagpolimer-konjugátumok közül előnyösek azok, amelyekben M valamilyen radionuklid, gyógyszerhatóanyag, toxin, jelképző, jelvisszaverő vagy jelfelvevő egység. Előnyösek továbbá azok a konjugátumok, amelyekben x értéke 1. Különösen előnyösek azok a konjugátumok, amelyekben x, e, f, h, és y értéke egyaránt 1, g értéke 1 vagy nagyobb, és k értéke 2 vagy nagyobb. Legelőnyösebbek azok a konjugátumok, amelyekben x, e, f, h, y és g értéke egyaránt 1, és k értéke 2 vagy nagyobb. Különösen előnyösek továbbá azok a csillagpolimer-konjugátumok, amelyekben az „antitest” monoklón antitestet vagy annak valamilyen epitóp kötőfragmentumát jelenti; és különösen előnyösek azok a konjugátumok is, amelyekben M jelentése biológiailag hatásos anyag, például radionuklid, gyógyszerhatóanyag vagy toxin.
A csillagpolimer-konjugátumok számos különböző in vitro vagy in vivő diagnosztikai célra alkalmazhatók: például radioimmun-mérésekhez, elektronmikroszkópiában, enzimhez kötött immunoszorbens méréséhez, mágneses magrezonancia spektroszkópiához, kontraszt-leképzéshez, immunoszcintográfiához elemzési műveletek során; terápiás alkalmazás céljára antibiotikumok, radionuklidok, gyógyszerhatóanyagok vagy más olyan hatóanyagok hordozóiként, amelyek alkalmasak különböző kóros állapotok, például rák, autoimmun-betegségek, a központi idegrendszer megbetegedései, fertőző betegségek és szívbetegségek kezelésére; továbbá felhasználhatók kiinduló anyagokként egyéb hasznos szerek készítésére.
A jelen találmány továbbá azokra a csillagpolimerkonjugátum készítményekre is vonatkozik, amelyek a csillagpolimer-konjugátumokat megfelelő vivőanyagokkal összekeverve tartalmazzák. Adott esetben a csillagpolimer-konjugátum készítmények egyéb hatóanyagokat, adalékokat és/vagy hígítószereket is tartalmazhatnak.
A találmány szerinti csillagpolimer-konjugátumokban előnyösen olyan csillagpolimert alkalmazunk, amelynek legalább egy elágazása van (ezt az alábbiakban magrész-elágazásnak nevezzük), előnyösen azonban két vagy több elágazása van, amelyek a magrészből erednek, és ez az elágazás legalább egy végcsoportot hordoz, azzal a megkötéssel, hogy: 1. a végcsoportoknak a magrész elágazásaihoz viszonyított aránya
1-nél nagyobb, előnyösen 2 vagy nagyobb; 2. a végcsoportok (terminális csoportok) sűrűsége a polimer térfogategységére vonatkoztatva legalább 1,5-ször nagyobb, mint egy nyújtott, szokásos csillagpoliméré, amelynek azonos magrésze és monomer egységei vannak, és molekulatömege valamint a magrész-elágazásainak száma hasonló, és a nyújtott csillagpolimer minden egyes elágazása csak egyetlen végcsoportot hordoz; és 3. molekulatérfogata nem nagyobb, mint a fentebb említett, nyújtott, szokásos csillagpolimer molekulatérfogatának 80%-a a Corey-Pauling molekulamodellek alkalmazásával végzett méretmeghatározások szerint. A „sűrű” kifejezést a „csillagpolimer” vagy „dendrimer” kifejezéssel együtt olyan értelemben használjuk, hogy molekulatérfogata kisebb, mint egy azonos molekulatömegű, nyújtott, szokásos csillagpolimer polimeré. Összehasonlítás céljára olyan konvencionális csillagpolimert alkalmazunk, amelynek molekulatömege, magrésze és monomer-komponense azonosak, valamint a magrész elágazásainak száma is ugyanaz, mint a sűrű csillagpolimerben. A „nyújtott” megjelölést olyan értelemben használjuk, hogy a konvencionális csillagpolimer egyes ágai maximális hosszúságban megnyúltak (kinyújtottak), például olyan állapotban vannak, mint amidőn a csillagpolimer a számára ideális oldószerben tökéletesen szolvatálva van. Ezen túlmenően a sűrű csillagpolimer molekulában a végcsoportok száma nagyobb, mint a konvencionális csillagpolimer molekulában, bár a végcsoportok kémiai szerkezete azonos.
A találmány szerinti konjugátumokban alkalmazható dendrimerek ismert módon állíthatók elő. A fenti dendrimerek, a különböző reaktánsok és a magrészeket alkotó vegyületek, valamint ezek előállítási eljárása megtalálható a 4587 329 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírásban.
A jelen találmány szerinti konjugátumokban alkalmazott dendrimerek olyan végcsoportokat tartalmazhatnak, amelyek eléggé reakcióképesek addíciós vagy szubsztitúcíós reakciók lejátszatásához. Ilyen végcsoport például az amino-, hidroxil-, merkapto-, karboxil-, alkenil-, allil-, vinil-, amido-, halogén-, karbamido-, oxiranil-, aziridinil-, oxazolinil-, imidazolinil-, szulfonato-, foszfonato-, izocianato- és izotiocianato-csoport. A végcsoportok módosíthatók olyan módon, hogy biológiai szempontból közömbösekké váljanak, és így immunogenitástól mentessé tehetők, vagy elkerülhető a májba, lépbe vagy egyéb szervekbe történő nemspecifikus felvételük. A dendrimerek abban különböznek a konvencionális csillagpolimerektől vagy csillagosán elágazó polimerektől, hogy a dendrimerekben a molekula térfogategységére számítva a végcsoportok koncentrációja nagyobb, mint az olyan konvencionális, nyújtott csillagpolimerekben, amelyek ekvivalens számú és ekvivalens hosszúságú magrész-elágazást tartal9
HU 209 252 Β maznak. így például a dendrimerben a végcsoportok sűrűsége térfogategységenként általában legalább 1,5ször nagyobb, mint a konvencionális, nyújtott csillagpolimer végcsoportjainak a sűrűsége; előnyösen legalább 5-ször nagyobb, előnyösebben legalább 10-szer és legelőnyösebben legalább 15-50-szer nagyobb, mint amazoké. A sűrű csillagpolimerben a végcsoportok aránya a magrész elágazására vonatkoztatva előnyösen legalább 2, még előnyösebben legalább 3, legelőnyösebben 4-től 1024-ig terjed. Adott polimer-molekulatömeg esetére a sűrű csillagpolimer molekulatérfogata a konvencionális, nyújtott csillagpolimer molekulatérfogatának 70 térfogat%-ánál, még előnyösebben 1660 térfogat%-ánál, legelőnyösebben 7-50 térfogat%ánál is kisebb.
A jelen találmány szerinti konjugátumokban előnyösen alkalmazható dendrimerekre jellemző, hogy egy- vagy többértékű magrészt tartalmaznak, amely kovalensen kötődik a dentrites elágazásokhoz. Ez a rendezett elágazás szemléltethető a (3), (4) és (5) képletekkel, ahol G a generációk számát jelenti.
Egy dendrites elágazáson elhelyezkedő végcsoportok számának (#) az elágazás generációs számához viszonyított aránya matematikailag a következőképpen fejezhető ki:
Νθ végcsoportok száma dendrites elágazásonként # = ~ ahol G jelenti a generációk számát, és Nr jelenti az ismétlődő egység multiplicitását, amely legalább 2, például az aminok esetében. A dendrimerben lévő végcsoportok összes számát az alábbi képlet adja meg:
N Np végcsoportok száma dendrimerenként # =— ahol G és Nr jelentése a fentiekben meghatározott, és Nc jelenti a magrészt alkotó vegyület vegyértékét (amelyet gyakran magrész-funkcionalitásnak is neveznek). Ennek megfelelően a találmány szerinti dendrimereket komponens részeik feltüntetésével a (X) általános képlet szemlélteti, ahol a Magrész, Végcsoport, G és Nc jelentése a fentiekben meghatározott, és az Ismétlődő Egység vegyértéke (funkcionalitása) Nr + 1, ahol Nr jelentése a fentiekben meghatározott.
A jelen találmány céljaira előnyösen alkalmazható dendrimer egy olyan kopolimer dendrimer, amely polifunkciós monomer egységekből erősen elágazó (dendrites) elrendezéssel épül fel. Ezt a dendrimer molekulát egy polifunkciós iniciátor egységből (magrész-vegyületből), polifunkciós ismétlődő egységekből és olyan terminális egységekből hozzuk létre, amelyek az ismétlődő egységekkel azonosak, vagy azoktól különbözők lehetnek. A magrész-vegyületet az © (ZC)NC általános képlet ábrázolja, amelyben © jelenti a magrészt, Zc jelenti az © -hez kapcsolódó funkciós csoportokat, és Nc jelenti a magrész funkcionalitását (vegyértékét), amely előnyösen 2 vagy nagyobb, legelőnyösebben 3 vagy nagyobb. így tehát a dendrimer molekula tartalmaz egy polifunkciós magrészt©, amelyhez kapcsolódik Nc számú Zc funkciós csoport, amelyek mindegyike az első generáció ismétlődő egysége monofunkciós végéhez kapcsolódik (az ismétlődő egység X1 Y1 (Z’)Ni), és mindegyik Z ismétlődő első generációs egység kötődik a következő generáció ismétlődő egységének a monofunkciós végével a végső generáció eléréséig.
A dendrimer molekulában az ismétlődő egységek egyetlen generáción belül azonosak, azonban generációról generációra különbözők lehetnek. A X*Υ*(Ζ*)Νι ismétlődő egységben X1 jelenti az első generációs ismétlődő egység monofunkciós végét, Y1 jelenti az első generációt alkotó egységet, Z1 jelenti az első generációban ismétlődő egység polifunkciós fejrészének a funkciós csoportját, amely lehet a magrész-vegyület [I (ZC)NC] funkciós csoportjaival azonos vagy attól különböző, vagy más generációk ismétlődő egységével azonos vagy azoktól különböző; és N1 értéke 2 vagy nagyobb, legelőnyösebben 2, 3 vagy 4, ami az első generációban ismétlődő egység polifunkciós fejrészének multiplicitását jelenti. Általában az ismétlődő egységet a X'Y'(Z‘)Ni, általános képlet szemlélteti, amelyben „i” jelenti az adott generáció számát az első generációtól a t-1 generációig. így az előnyös dendrimer molekulában minden egyes első generációs Z1 ismétlődő egység kapcsolódik a második generációs X2 ismétlődő egységhez, és így tovább a generációkon át, úgy hogy minden egyes Z1 csoport az „i” számú generáció X’YXZ1)^ általános képletű ismétlődő egység esetében az „i+1” generációs számú ismétlődő egység (X1+1) végződéséhez kapcsolódik. Egy előnyös dendrimer molekula terminális része Χ'Υ'(Ζ%( általános képletű terminális egységeket tartalmaz, ahol t jelenti a végső generációt, és X1, Yl, Z‘ és N‘ lehetnek X1, Y‘, Z1 és N1 jelentésével azonosak vagy attól különbözők, azzal a kivétellel, hogy a Zl csoportokhoz következő generáció nem kapcsolódik, és N‘ 2-nél kevesebb, például zérus vagy 1 lehet. Ennek alapján az előnyös dendrimer szerkezetét a (XI) általános képlet szemlélteti, amelyben i értéke 1-től t-l-ig terjed, és a szimbólumok jelentése a fentiekben meghatározott. A π függvény definiált határai közötti összes értékeinek a szorzata. Ezért:
i-1 π Nn = (Ν’)(Ν2)(Ν3)...(Ν*~2) (N‘~') n= 1 az ismétlődő egységek száma, amely az i-edik generációja egy dendrites elágazásnak, és ha i értéke 1, akkor n°=l n= 1
Kopolimer dendrimerekben egy generációban az ismétlődő egység legalább egy másik generáció ismétlődő egységétől különbözik. Az előnyös dendrimerek igen szimmetrikusak, amint ezt a bemutatott szerkezeti képletek szemléltetik. Az előnyös dendrimerek funkcionalizált dendrimerekké alakíthatók át egy másik reagens segítségével. így például a végső generációban lévő hidroxilcsoportot savkloriddal reagáltatva olyan dendrimert kapunk, amely terminálisán észter funkciós csoportokat tartalmaz. Ezt a funkcionalizálást nem kell
HU 209 252 Β az elméletileg maximális mértékig végrehajtani - ami a rendelkezésre álló funkciós csoportok számától függ azaz egy funkcionalizált dendrimemek nem feltétlenül kell olyan nagy szimmetriával vagy pontosan definiált molekulaképlettel rendelkeznie, mint az előnyös dendrimemek.
Homopolimer dendrimerben az összes ΧΎ*(Ζ')Νί általános képletű ismétlődő egységek azonosak. Mivel az összes N1 értékek egyenlők (ezt Nr-ként definiáljuk), a szorzatfüggvény, amely az ismétlődő egységek számát megmutatja, egyszerű exponenciális alakot ölt. Ennek következtében a molekulaképlet a (XII) általános képlettel egyszerűbb formában fejezhető ki. E képletben i értéke l-től t-l-ig terjed.
Ez a forma mutatja a különböző i generációk közötti disztinkciót, amelyek mindegyike NcNr (Hl) számú, Χ*Υ'(Ζ')Νί általános képletű ismétlődő egységből áll. A generációkat egyetlen képletbe foglalva a (XIII) vagy (XIV) általános képlethez jutunk, ahol XrYr(Zr)Nr az ismétlődő egység, amelyet az összes „i” generációban alkalmazunk.
Ennek alapján, ha egy polimer vegyület szerkezete kifejezhető a fenti képletekkel, akkor ez a polimer csillagpolimer. Megfordítva, ha egy polimer vegyület szerkezetét egyik fenti képlet sem fejezi ki, akkor az nem csillagpolimer. Annak meghatározásához, hogy egy polimer csillagszerű-e vagy nem, nem szükséges annak ismerete, hogy milyen eljárással állították elő, csupán azt kell tudnunk, hogy szerkezete megegyezik-e valamelyik fenti általános képlettel. A fenti képletek megmutatják továbbá a generációkat (G), azaz a dendrimerek kötődési elrendeződését.
Nyilvánvaló, hogy több úton határozhátó meg az M anyagnak a P dendrimerhez viszonyított aránya, amely attól függ, hogy a P*M egyesítés hogyan és hol következik be. Ha ez az egyesítés egy belső kapszulázás, akkor az Μ: P tömegarány általában 10:1, előnyösen 8:1, még előnyösebben 5:1, legelőnyösebben 3:1. Ez az arány lehet alacsony is, például 0,5: l-től 0,1:1-ig is terjedhet. Amennyiben belső sztöchiometriát alkalmazunk, akkor a Μ: P tömegarány ugyanaz, mint a belső kapszulázás esetében. Ha a külső sztöchiometriát határozzuk meg, akkor az Μ: P mól/mól arányt az alábbi képletek adják meg:
M:P
(A)5NcNtNr G-‘ 1
(B) 3 NcNtN G-‘ 1
(C) 1 NcNtNr G-> 1
A fenti képletekben Nc jelenti a magrész multiplicitását, Nt jelenti a végcsoport multiplicitását, és Nr jelenti az elágazási kapcsolat multiplicitását. Az NcNtNr G-* szabja meg a Z csoportok számát. így például (A) alapján kapjuk az eredményt, ha a felületen fehérjék, enzimek vagy nagytöltésű molekulák helyezkednek el; a fenti (B) alapján kaphatjuk az eredményt, ha a felületen aszpirin vagy oktánsav van; és (C) alapján, ha a felületi észtercsoportokat karboxilcsoportokra vagy karboxilát-ionokká alakítjuk.
A területen jártas szakember nyilvánvalóan számos különböző méretű szerkezetet állíthat elő a dendrimer komponenseinek és a generációk számának megfelelő változtatásával. A 3. ábrában látható három különböző dendrimer sorozat méret szerinti összehasonlítása egy IgG antitesthez viszonyítva. A 3(B)’ ábrában bemutatott rajzsorozat mutatja a csillagpolimer poliamidoaminokat (PAMAM); AII mutatja a csillagpolimer-poliétereket (PE); és III mutatja a csillagpolimer poli(etilénimineket) (PEI). Az 1. ábrához hasonló módon mindhárom sorozat (I, Π és ΠΙ) a szélső bal oldali rajzon mutatja az iniciátor-magrészt, balról a következő rajz mutatja a csillagszerűen elágazó oligomert, a többi rajzok mutatják a csillagoligomereket és a megfelelő, áthidalt csillagdendrimereket. Látható, hogy a méretszerű rajzoknak ebben a sorozatában a dendrimerek méretei szorosan megközelítik, és valójában kisebbek, mint a 3 (A) ábrában bemutatott IgG antitest méretei. Az IgG antitestet mutatja a 3. ábra bal szélső rajza. A rajzban 1 mm 3,5 A hosszúságméretet jelent. A 3(A) ábrában a variábilis tartományt (A) mutatja; a konstans tartományt (B) mutatja; és a szénhidrát kötődési helyeit (C) jelzi. A 3. ábrán bemutatott megközelítő mérések szerint: (1) 35-40 Á, (2) 70 Á és (3) 60 Á. Ezek a méretsajátságok előnyösek például akkor, ha a hatóanyag célzott helye az érrendszer. Ennélfogva a 125 Á átmérőjű vagy ennél kisebb dendrimer egységek különösen előnyösek, mert lehetővé teszik a kilépést az érrendszerből a folyamatosan csatlakozó hajszálerekbe. Ezek a méretek jelentősek, mert csekélyek, ha összehasonlítjuk azzal az esettel, amikor a célba juttató (irányító) komponens valamilyen antitest (lásd a 3. ábrát). Összehasonlítható molekulatömegű, lineáris polimernek a forgási sugara (teljesen nyújtott alakjában) sokkal nagyobb lenne, mint az azonos molekulatömegű dendrimer. Várható lenne, hogy egy ilyen típusú, lineáris polimer károsan befolyásolná számos, elfogadott irányító komponens molekulafelismerő sajátságait. Kívánatos továbbá, hogy a konjugátumok molekulatérfogata a legkisebb legyen, hogy lehetségessé tegye a kapcsolódást például a Fab, Fab’ vagy más megfelelő antitest-fragmentumok és kis molekulatömegű dendrimerek között.
Kívánatosak olyan dendrimerek, amelyek alkalmasak radionuklidok vagy erősen paramágneses fémionok kibocsátására daganatok helyén, mivel képesek számos fémion kelátozására csekély térfogatban. Olyan antitestekhez vagy antitest-fragmentumokhoz kapcsolva, amelyek daganatok szempontjából specifikusak, antitestenként számos fém szabadítható fel, és ehhez az antitest egyetlen modifikációja is elegendő.
A jelen találmány egy másik jellemző vonása az irányító (célzó) egységek dendrimerekhez történő kötése. A találmány előnyös megvalósítási formái szerint - különösen akkor, ha kívánatos egy antitest alkalmazása irányítóegységként - a dendrimeren célszerűen alkalmazhatunk valamilyen reakcióképes funkciós csoportot, például karboxil-, szulfidril-, reakcióképes aldehid-, reakcióképes olefin-, izotiocianato-, izocianato-, amino-, reakcióképes aril-halogenid- vagy reakcióké11
HU 209 252 Β pes alkil-halogenid-csoportot. A reakcióképes funkciós csoportok ismert eljárásokkal vezethetők be a dendrimerbe, például az alábbi módokon:
(1) Heterofunkciós iniciátort alkalmazunk (kiindulóanyagként a dendrimer szintézisére), amely különböző reakcióképességű funkciós csoportokat biztosít. Ebben a heterofunkciós iniciátorban a funkciós csoportoknak legalább egyike kezdeményező helye a dendrimer képződésének, és a többi funkciós csoportoknak legalább egyike rendelkezésre áll egy irányítóegység kötéséhez, azonban dendrimer-szintézis kezdeményezésére nem alkalmas. így például a védőcsoporttal ellátott anilin lehetővé teszi a molekulán belüli NH2-csoportok további módosítását az anilin NH2-csoportjának reakciója nélkül.
Az a funkciós csoport, amely rendelkezésre áll az irányítóegység megkötéséhez, három forma egyikében része lehet az iniciátor molekulának, s ez a három forma az alábbi:
(a) Abban a formában, amelyben felhasználjuk az irányítóegység kapcsolásához. Ez akkor lehetséges, ha a dendrimer szintézise során alkalmazott lépések ezen a helyen nem váltanak ki reakciót.
(b) Ha az irányítóegység megkötésére alkalmazott funkciós csoport a dendrimer szintézise során alkalmazott lépések körülményei között reakcióba léphet, akkor védőcsoport alkalmazásával megvédhető, amely lehetővé teszi, hogy a csoport a szintetikus folyamatok során érintetlen marad, de könnyen eltávolítható olyan módszerrel, amely a makromolekula egyéb részeinek integritását nem érinti.
(b) Abban az esetben, ha nem áll rendelkezésre egyszerű védőcsoport az irányítóegység megkötésére alkalmas funkciós csoport számára, akkor olyan szintetikus prekurzort alkalmazhatunk, amely a dendrimer szintézise során alkalmazott folyamatokban nem reagál. A szintézis befejezése után e funkciós csoportnak könnyen átalakíthatónak kell lennie a kívánt kötőcsoporttá olyan módszerrel, amely a markomolekula egyéb részeinek integritását nem érinti.
(2) A kívánt reakcióképes funkciós csoportot (kovalensen) egy preformált dendrimerhez kapcsoljuk. Az alkalmazott reagensnek olyan funkciós csoportot kell tartalmaznia, amely a dendrimer terminális funkciós csoportjaival könnyen reagál. Az a funkciós csoport, amelyet végeredményképpen alkalmazni kívánunk az irányítóegység megkötésére, lehet végső alakjában, vagy védőcsoporttal ellátott funkciós csoport alakjában, vagy szintetikus prekurzor formájában. Az az alak, amelyben ezt a kötő funkciós csoportot alkalmazzuk, attól függ, hogy az alkalmazott szintetikus folyamat során integritását megőrzi-e, és a végső makromolekula képes-e épségét megtartani azon körülmények között, amelyek szükségesek, hogy e csoportot alkalmassá tegyük a kötésre. így például PEI esetében előnyösen alkalmazható a 4-nitro-fluor-benzol.
A fenti (1) szerint alkalmazott heterofunkciós iniciátorokra példaként megemlítjük a (6)-(15) képletű vegyületeket.
Számos különösen fontos kémiai szempontot kell figyelembe venni:
1. Poliamidoamid (PAMAM) csillagpolimerek kémiai sajátságai;
2. Poli(etilén-imin) (PEI) csillagpolimetek kémiai sajátságai;
3. PAMAM felülettel rendelkező PEI csillagpolimer vegyület tulajdonságai; és
4. Poliéteres (PE) csillagpolimerek kémiai sajátságai.
A dendrimer felületén elhelyezkedő funkciós csoportok módosításával további hasznos funkciós csoportokat kaphatunk, ilyenek például az alábbiak:
-opo3h2, -po3h2, -po3h<-”, -po3<-2’, -CO/-1’, -SO2H, -SO/1’, -SO3H, -SO/-1’, -NR'R2, -R5, -OH, -OR1, -NH2, perfluorozott alkil-, -CONHR1, -CO2H csoportok, valamint a (b)-(f) általános képletű csoportok, amelyekben
R jelentése alkil-, arilcsoport vagy hidrogénatom;
R1 jelentése alkil-, arilcsoport, hidrogénatom, vagy (g) általános képletű csoport;
R2 jelentése alkil- vagy arilcsoport, vagy (g) általános képletű csoport;
R3 jelentése -OH, -SH, -CO2H, -SO2H vagy -SO3H csoport;
R4 jelentése alkil-, aril-, alkoxi-, hidroxil-, merkapto-, karboxil-, nitrocsoport, hidrogén-, bróm-, klór-, jód- vagy fluoratom;
R5 alkilcsoportot jelent;
X jelentése oxigén- vagy kénatom, vagy NR csoport; és n értéke 1, 2 vagy 3 poliéterek; vagy más, immunoinszenzitiv egységek.
A funkciós csoport megválasztása attól a különleges végső alkalmazástól függ, amelyre a dendrimert tervezzük.
A jelen találmány további jellemző vonása a dendrimerek antitestekhez való kapcsolása. Az antitesteket vagy azok fragmentumait általában ismert módszerekkel kötjük a dendrimerhez, például úgy, hogy a dendrimeren lévő valamilyen funkciós csoport és az antitest vagy antitest-fragmentum valamilyen szerkezeti egysége, például szénhidrát-egysége, amino-, karboxil- vagy szulfhidrilcsoportja között kapcsolatot hozunk létre. Egyes esetekben a kapcsolásra alkalmazott kötőcsoportok távolságtartó (térkitöltő) csoportok is lehetnek egyrészt a dendrimer, másrészt az antitest vagy antitest-fragmentum között. A dendrimer és az antitest vagy antitest-fragmentum kapcsolását úgy kell végeznünk, hogy ez az antitest vagy antitest-fragmentum immunreakció-képességét jelentősen ne befolyásolja: azaz az antitestet vagy a fragmentumot az antitesten vagy a fragmentumon lévő olyan funkciós csoporttal kell a dendrimerhez kapcsolni, amely az antigén felismerésében nem játszik szerepet, és nem képezi kötőhelynek a részét.
A találmányt az alábbi nem korlátozó jellegű példákban részletesen ismertetjük. A betűjellel ellátott példák kiinduló anyagok előállítására vonatkoznak; a számozott példák termékek előállítását ismertetik.
HU 209 252 Β
A példa
2-Karboxamido-3-(4’-nitro-.fenil)-propionsavamid előállítása
2.4 g (8,13 mmól) (4-nitro-benzil)-malonsav-dietilészter és 35 ml metanol oldatát 50-55 °C-ra melegítjük, és keverés közben ezen az oldaton át 64 óra hoszszat vízmentes ammóniagázt buborékoltatunk, majd lehűtjük, a fehér, pehelyszerű csapadékot szűrjük, és 225 ml forró metanolból átkristályosítjuk. így 1,85 g (7,80 mmól, 96% hozam) termeléssel kapjuk a cím szerinti vegyületet, op.: 235,6 °C (bomlás közben).
A cím szerinti vegyület szerkezetét tömegspektrummal, valamint Ή-NMR és 13C-NMR színképpel igazoltuk.
Elemzés: C10H11N3O4
Számított: C 50,63; H4,69; N 17,72%;
Talált: C 50,75; H4,81; N 17,94%.
B példa
-Amino-2-( amino-metil)-3-(4’-nitro-fenil)-propán előállítása
2,0 g (8,43 mmól) 2-karboxamido-3-(4’-nitro-fenil)propionsavamidot nitrogénatmoszférában, keverés közben 35 ml száraz tetrahidrofuránban szuszpendálunk, majd ehhez a keverékhez injekciós fecskendő segítségével 106 ml (106 mmól) borán-tetrahidrofurán komplexet adunk. Ezután a reakcióelegyet 48 órán át visszafolyató hűtő alatt forraljuk, eközben a szuszpendált araidvegyület oldódik. Az oldatot lehűtjük, a tetrahidrofuránt (az alábbiakban rövidítve THF) forgóbepárlón vákuumban lepároljuk, és a visszamaradó nyersterméket a boránmaradékkal együtt 50 ml etanolban oldjuk, majd ezt az oldatot vízmentes hidrogén-klorid gázzal átöblítjük. Az így kapott oldatot egy órán át visszafolyató hűtő alatt forraljuk, utána az oldószert vákuumban lepároljuk, a nyers hidrokloridot (visszamaradó részt) 15 ml ionmentesített vízben oldjuk, és kétszer extraháljuk 50 ml diklór-metánnal. A vizes réteget jégfürdőben, argongáz alatt lehűtjük, és addig adagolunk hozzá 50%-os nátronlúgoldatot lassú ütemben, amíg a pH értéke 11,7-re beáll. A bázisos vizes oldatot négyszer extraháljuk 25 ml diklór-metánnal, majd az egyesített szerves kivonatot forgóbepárlón bepároljuk. így 1,45 g ámbraszínű, olajos maradékot kapunk, amelyet 50 ml éterrel alaposan eldolgozunk, és rövid szilikagélrétegen (Aldrich 62 fokozat) nyomás alatt szűrjük. Az oszlopot 100 ml éterrel átmossuk, és az egyesített szűrletet vákuumban bepároljuk. így 1,05 g (5,02 mmól) cím szerinti diamint kapunk tiszta olajszerű alakban; ennek dihidrokloridja 275-278 °C-on olvad (bomlás közben).
A kapott termék szerkezetét tömegspektrummal valamint 'H-NMR és 13C-NMR színképpel igazoltuk. Elemzés: C10H17N3O2Cl2
Számított: C 42,57 H6,07 N 14,89%;
Talált: C 43,00 H6,14 N 15,31%.
C példa l-Amino-2-(amino-metil)-3-(4’-amino-feml)-propán előállítása
1.5 g (7,24 mmól) (4-amino-benzil)-malonamidhoz egy lombikban, nitrogéngáz alatt, keverés közben kanültű segítségével 70 ml (70 mmól) borán-THF oldatot adunk, majd az oldatot visszafolyató hűtő alatt 40 órán át forraljuk. Utána a színtelen oldatot lehűtjük, és a THF feleslegét forgóbepárlón eltávolítjuk. így átlátszó, zselatinszerű maradékot kapunk, amelyhez óvatosan 50 ml metanolt adagolunk. Eközben erős gázfejlődés figyelhető meg. Ezután a szuszpenzión át száraz hidrogén-klorid gázt buborékoltatunk; oldat keletkezik, amelyet 1 percig forralunk, majd a metanolos hidrogén-kloridot forgóbepárlón lepároljuk, és a visszamaradó hidrokloridot ismételten a fenti oldási és forralási folyamatnak vetjük alá. Az így kapott hidrokloridot 10 ml vízben oldjuk, és jégfürdőben, argongáz alatt lehűtjük, majd lassú ütemben, keverés közben 50%-os nátronlúgoldatot adagolunk hozzá, amíg pH-értéke a 11-et el nem éri. A vizes fázist kétszer extraháljuk 100 ml kloroformmal, majd az egyesített kloroformos fázist rövid szilikagélrétegen szárítás nélkül szűrjük. Az oldószert forgóbepárlón vákuumban ledesztilláljuk, s így 0,90 g (5,02 mmól, 70%) hozammal kapjuk a cím szerinti vegyületet, amelynek Rrértéke (a kifejlesztést kloroform/metanol/konc. ammónia 2:2:1 arányú elegyével végezve) 0,65. A vegyület szerkezetét 'H-NMR és 13C-NMR spektroszkópiával igazoltuk, és az anyagot további tisztítás nélkül használtuk fel.
D példa
6-(4-Amino-benzil)-l ,4,8,11 -tetraaza-5,7-dioxo-undekán előállítása
2,03 g (8,43 mmól) (4-amino-benzil)-malonsav-dimetil-észter és 10 ml metanol oldatát 6,00 g (103,4 mmól) frissen desztillált etilén-diamin és 10 ml metanol elegyéhez csepegtetjük nitrogénatmoszférában, 2 óra alatt keverés közben. A tiszta oldatot 4 napig tovább keverjük: ekkor a vékonyréteg-kromatográfia (VRK) vizsgálat azt mutatja, hogy a kiinduló anyagként alkalmazott diésztér (Rrértéke 0,91) teljesen átalakult diamiddá (Rrértéke 0,42, ha a kromatogramot 20% ammónia és 80% etanol elegyével fejlesztjük ki). Az anyag ninhidrinnel erősen pozitív reakciót ad. A metanolt és a diamin feleslegét forgóbepárlón eltávolítjuk, és a kapott fehér, szilárd terméket másnapig 13,3 Pa nyomáson, 50 °C-on szárítjuk. így 2,45 g (8,36 mmól, 99%) nyersterméket kapunk. Analízis céljára egy nyerstermékből vett mintát kloroform és hexán elegyéből átkristályosítunk, op.: 160-161 °C. A termék Ή-NMR és I3C-NMR spektroszkópiai adatai összhangban vannak a várt szerkezettel.
E példa
Mezil-aziridin reakciója l-amino-2-(amino-metil)3-(4-nitro-fenil fpropánnal
400 mg (1,91 mmól) l-amino-2-(amino-metil)-3(4-nitro-fenil)-propánt (amelynek tisztasági foka 96%nál nagyobb) nitrogéngáz alatt 10,5 ml abs. etanolban oldunk, és keverés közben 950 mg (7,85 mmól) mezilaziridint adagolunk az oldathoz szilárd alakban, majd az elegyet 25 °C-on 14 órán át mágneses keverő vei keverjük. Ezalatt a lombik oldalára fehér, gumiszerű
HU 209 252 Β csapadék válik ki. Az etanolt dekantáljuk, és a maradékot alaposan átdolgozzuk további 15 ml etanollal az el nem reagált aziridin eltávolítása céljából. A gumiszerű terméket 13 Pa nyomáson 25 °C-on vákuumban szárítva 1,0 g (1,44 mmól, 75%) tetrakisz-metil-szulfonamidot kapunk (Rrértéke 20:80 arányú ammónia/etanol elegygyel kifejlesztve 0,74). A termék szerkezetét 'H-NMR és 13C-NMR spektroszkópiával igazoltuk.
F példa
2-(4-Nitro-benzil)-l,3-bisz['N,N-2-(amino-etil)]-7diamino-propán előállítása
650 mg (0,94 mmól) nyers metil-szulfonamidot ml nitrogénnel átöblített, 98%-os tömény kénsavban oldunk, az oldatot nitrogénatmoszférában tartjuk, és 27 percig erélyes keverés közben 143-146 °C-on melegítjük. Az elegy enyhén megsötétedik. Lehűtés után az oldatot keverés közben 60 ml éterhez öntjük, a fehér csapadékot szűrjük, és rögtön oldjuk 10 ml ionmentesített vízben. Az oldat pH-értékét argonatmoszférában hűtés közben 50%-os nátronlúg hozzáadásával 11-re állítjuk. Az így kapott oldathoz 90 ml etanolt elegyítünk, és a szervetlen sócsapadékot szűrjük. Az oldószert a nyers aminról vákuumban lepároljuk, és a viszszamaradó enyhén barnás olajszerű termékhez nitrogénatmoszférában 190 ml toluolt adunk. Az elegyből a vizet erélyes keverés közben azeotróp desztillációval (Dean-Stark feltét alkalmazásával) eltávolítjuk mindaddig, amíg a visszamaradó toluolos oldat enyhén sárga színűvé változik (az edényben 30-40 ml folyadék marad). A toluolos oldatot lehűtjük, és dekantáljuk a sötét, kezelhetetlen maradékról és sóról. Az oldatból az oldószert vákuumban eltávolítjuk, és az így kapott halványsárga, olajszerű terméket 27 Pa nyomáson 35 °C hőmérsékleten másnapig szárítjuk. így 210 mg (60%) terméket kapunk, amelynek szerkezetét tömegspektrummal, valamint Ή-NMR és 13C-NMR spektroszkópiával igazoltuk.
G példa
Anilinszármazékot tartalmazó, fél-generációs csillagpolimer előállítása (lásd a D reakcióvázlatot) 2,09 g (24 mmól) metil-akrilátot 15 ml metanolban oldunk. 1,1 g (3,8 mmól) 6-(4-amino-benzil)-l,4,8,lltetraaza-5,7-dioxo-undekánt) [tehát a D reakcióvázlatban szereplő (#1) képletű, D példa szerinti vegyületet] 10 ml metanolban oldunk, és lassú ütemben, 2 óra alatt, erélyes keverés közben a metil-akrilát oldathoz adagoljuk. A reakcióelegyet 48 órán át környezeti hőmérsékleten keverjük, majd az oldószert forgóbepárlón eltávolítjuk, közben a hőmérsékletet 40 °C alatt tartjuk, így halványsárga, olajszerű termék alakjában kapjuk a (#2) képletű észtert 2,6 g hozammal. E folyamat során az anilincsoport karboxietileződése nem figyelhető meg.
H példa
Anilinegységet tartalmazó, egy-generációs csillagpolimer előállítása (lásd az E reakcióvázlatot)
2,6 g (3,7 mmól) (#2) képletű észtert 100 ml metanolban oldva óvatosan 250 g (4,18 mól) etilén-diamin és 100 ml metanol elegy éhez adagolunk erélyes keverés közben olyan ütemben, hogy a hőmérséklet 40 °C fölé ne emelkedjék. Az adagolás befejezése után a reakcióelegyet fűtőköpeny segítségével 28 órán át 3540 °C hőmérsékleten keverjük; ekkor az infravörös színképi vizsgálat szerint észtercsoportok már nincsenek jelen. Az oldószert forgóbepárlón 60 °C-on eltávolítjuk, és a visszamaradó etilén-diamint toluol-metanoletilén-diamin ternér azeotróp alakjában ledesztilláljuk. Ezt követően a toluol maradékát metanolos azeotróp alakjában teljesen ledesztilláljuk. A metanol teljes eltávolítása után a (#3) képletű terméket 3,01 g hozammal üveges, sárga anyag alakjában kapjuk.
I példa
Anilinegységet tartalmazó, másfél-generációs csillagpolimer előállítása (lásd az E reakcióvázlatot)
2,7 g (3,6 mmól) (#3) képletű amint 7 ml metanolban oldva lassú ütemben 1 óra alatt, szobahőmérsékleten és keverés közben 3,8 g (44 mól) metil-akrilát és 15 ml elegyéhez adjuk. Az adagolás alatt az oldat enyhén melegszik. Az oldatot 16 órán át szobahőmérsékleten keverjük, majd az oldószert forgóbepárlón 40 ’Con eltávolítjuk, utána az oldószert tökéletesen eltávolítjuk, és a metil-akrilátot is ledesztilláljuk. így narancsszínű, olajszerű alakban kapjuk a (#4) képletű vegyületet 4,7 g hozammal.
J példa
Anilinegységet tartalmazó, fél-generációs csillagpolimer előállítása (lásd a G reakcióvázlatot)
0,42 g (2,3 mmól) (#5) képletű triamint (készítését lásd a C példában) 10 ml metanolban oldunk, és 1 óra alatt 1,98 g (23 mmól) metil-akrilát és 10 ml metanol elegyéhez csepegtetjük. Az elegyet szobahőmérsékleten 48 órán át keverjük, majd az oldószert forgóbepárlón eltávolítjuk, és közben a hőmérsékletet legfeljebb 40 °C-on tartjuk. A metil-akrilát feleslegét ismételt metanolos azeotróp desztillációval távolítjuk el. így
1,24 g hozammal kapjuk a (#6) képletű észtert narancsszínű olaj alakjában.
K példa
Anilinegységet tartalmazó, egy-generációs csillagpolimer előállítása (lásd a H reakcióvázlatot)
1,24 g (2,3 mmól) (#6) képletű észter és 50 ml metanol oldatát 2 óra alatt 73,4 g (1,22 mól) etilén-diamin és 100 ml metanol oldatához csepegtetjük erélyes keverés közben. Eközben enyhe hőfejlődés figyelhető meg. Az oldatot szobahőmérsékleten további 72 órán át keverjük, majd az oldószert forgóbepárlón 60 °C-on eltávolítjuk. Az etilén-diamin feleslegét toluol-metanol-etilén-diamin ternér azeotróp alakjában ledesztilláljuk, majd a visszamaradó toluolt metanolos azeotróppal eltávolítjuk, és a maradékot 48 órán át vákuumszivattyúval szívatva szárítjuk. így 1,86 g hozammal sárga-narancsszínű olaj alakjában kapjuk a (#7) képletű vegyületet.
HU 209 252 Β
L példa
Anilinegységet tartalmazó, másfél-generációs csillagpolimer előállítása (lásd a J reakcióvázlatot) 1,45 g (#7) képletű amint (mely nyomnyi mennyiségben metanolt tartalmaz) 100 ml metanolban oldva lassú ütemben, másfél óra alatt, keverés közben 5,80 g metil-akrilát és 20 ml metanol elegyéhez adagoljuk, majd az oldatot 24 órán át szobahőmérsékleten keverjük. Az oldószer eltávolítása után a metil-akrilát teljes feleslegét metanollal végzett azeotrópos desztillációval eltávolítjuk, és a maradékot 48 órán át vákuumszivattyúval szívatjuk. így 2,50 g (1,8 mmól) hozammal, narancsszínű olaj alakjában kapjuk a (#8) képletű vegyületet.
M példa
4,5-generációs dendrimer hidrolízise, és kalciumsó készítése
2,11 g (10,92 milliekvivalens) NH3-ból leszármaztatott 4,5-generációs (észter-végcsoportos) PAMAM terméket 25 ml metanolban oldunk, és ehhez az oldathoz 4,37 ml (10,92 milliekvivalens) 10%-os nátriumhidroxidoldatot adunk (az elegy pH-értéke 11,5-12). Szobahőmérsékleten 24 órán át állni hagyjuk, ekkor a pH értéke körülbelül 9,5. További 20 óra elmúltával az oldatot forgóbepárlón bepároljuk, a maradékhoz 50 ml toluolt adunk, és ismét lepároljuk. Az így kapott olajat 25 ml metanolban oldjuk, és 75 ml dietil-étert adunk hozzá. A gumiszerű csapadékról a folyadékot dekantáljuk, és a gumiszerű terméket forgóbepárlón vákuumban tartjuk. így finom, szürkésfehér port kapunk, amely további szárítással 2,16 g (98%) terméket szolgáltat. Az NMR és infravörös színkép tanulsága szerint észtercsoportokat nem tartalmaz.
A 4,5-generációs PAMAM-nátriumsót (észter-végcsoportos), NH3-ból leszármaztatott dialízissel alakítjuk kalciumsóvá: 1,03 g nátriumsót 100 ml vízben oldunk, és üreges-rostos dialíziscsövön vezetjük át percenként 3 ml sebességgel. A csővezetéket 5%-os kalcium-klorid oldatban tartjuk, és az eljárást megismételjük.
Az így kapott oldatot ismét dializáljuk, ezúttal vízzel szemben, és ezt még kétszer megismételjük.
Bepárlás útján 0,6 g nedves szilárd anyagot kapunk, amelyet metanollal felveszünk (nem teljesen oldható), és szárítás után 0,45 g szürkésfehér, kristályos terméket kapunk.
Elemzés: C369H592N9iO14iCa24 (relatív molekulatömeg 9526,3)
Számított: C 46,5; H6,32; N 13,38; Ca 10,10%
Talált: C 47,34; H7,00; N 13,55; Ca 8,83%.
N példa
Terminálisán karboxilátcsoportokat tartalmazó dendrimerek előállítása
Fél-generációs csillagpolimer poliamidoaminokat hidrolizálunk, s így terminális metil-észter-csoportjaikat terminális karboxilátcsoportokká alakítjuk. Az így kapott gömb alakú molekulák a kerületükön diszpergált negatív töltést hordoznak. A hidrolizált dendrimerek a fél-generációtól (3 karboxilátcsoport) a 6,5-generációig terjednek (192 karbolixátcsoport).
A termékeket Na+, K+, Cs+ vagy Rb+ só alakjában is képezhetjük.
O példa
N-( tere. -Butoxi-karbonil )-(4 -amino-benzil)-malonsav-dimetil-észter előállítása
11,62 g (49 mmól) (4-amino-benzil)-malonsav-dimetil-észtert 50 ml 60:40 arányú terc.-butanol-víz keverékben oldunk, és 19,79 g (90 mmól) di-(terc.-butoxi)-dikarbonát hozzáadása után a reakcióelegyet másnapig keverjük, majd a butanolt forgóbepárlón eltávolítjuk, és így a terméket vízben, sárga szuszpenzió alakjában kapjuk. Diklór-metánnal extraháljuk, magnéziumszulfáton szárítjuk, és bepároljuk. így 21,05 g sárga, olajszerű terméket kapunk, amely di-(terc.-butoxi)dikarbonáttal szennyezett. Izopropanol és víz 75:25 arányú elegyéből végzett átkristályosítás után 11,1 g (33 mmól, 67%) halványsárga, kristályos terméket kapunk, amelynek a szerkezetét 13C-NMR spektroszkópiával igazoltuk, és tisztaságát HPLC elemzéssel ellenőriztük (Spherisorb ODS-1, 0,05 M H3PO4 pH 3 és acetonitril 55:45 arányú keveréke). Az anyagot további tisztítás nélkül használtuk fel.
P példa
N-(terc.-Butoxi-karbonil)-6-(4-amino-benzil)1,4,8,ll-tetraaza-5,7-dioxo-undekán57 előállítása 8,82 g (26 mmól) O példa szerint előállított N(terc.-butoxi-karbonil)-(4-amino-benzil)-malonsav-dimetil-észter és 50 ml metanol oldatát 2 óra alatt nitrogénatmoszférában 188 g (3,13 mól) frissen desztillált etilén-diamin és 20 ml metanol oldatához csepegtetjük. Ezután az oldatot 24 órán át keverjük, majd az etiléndiamint és a metanolt forgóbepárlón ledesztilláljuk. A terméket metanolban oldjuk, és toluolt adunk hozzá, majd az oldószert forgóbepárlón eltávolítjuk. így fehér, szilárd, etilén-diaminnal szennyezett nyersterméket kapunk 10,70 g hozammal. Tisztítás céljából ezt a terméket két részre osztjuk. Az etilén-diamint toluollal azeotróposan eltávolítjuk - ehhez Soxhlet extraktort használunk, amelyet szulfonált ioncserélő gyöngyökkel töltünk az etilén-diamin megkötése céljából; ez barna olajszerű terméket eredményez, mert a termék részben bomlik. A visszamaradó terméket a toluolos oldat hűtésével fehér, szilárd alakban kapjuk, (megközelítőleg 2,3 g, 50%). E termék 10%-os metanolos oldatát gázkromatográfiával vizsgálva (Tenax 60/80 oszlop) a mintában etilén-diamin nem mutatható ki (mennyisége tehát 0,1 %-nál kevesebb). A másik termékfrakciót metanolban 10% töménységben oldjuk, és az etilén-diamint fordított ozmózissal, oldószerként metanolt alkalmazva tisztítjuk. (Membránként Filmtec FT-30-at alkalmazunk Amicon TC1R vékony csatornás szeparátorban, ekkor az etilén-diamin áthatol a membránon.) így a terméket fehér, szilárd alakban 2,7 g hozammal kapjuk, és a gázkromatográfiás vizsgálat szerint etilén-diamint kimutatható mennyiségben nem tartalmaz. A 13C-NMR spektrum adatai, valamint a
HU 209 252 Β
HPLC elemzés eredményei (Spherisorb ODS-1, 0,05 Μ H3PO4 pH3 és acetonitril 55:45 arányú elegye) á várt szerkezettel összhangban voltak. A terméket további tisztítás nélkül használtuk fel.
<2 példa
Fél-generációs cslllagdendrimer előállítása N(terc-butoxi-karbonil)-6-(4-amino-benzil)1, 4,8,11 -tetraaza-5,7-dioxo-undekánból
5,0 g (13 mmól) P példa szerint előállított N-(terc.butoxi-karbonil)-6-(4-amino-benzil)-1,4,8,11-tetraaza5,7-dioxo-undekánt 100 ml metanolban oldunk, 6,12 g (68 mmól) metil-akrilátot adunk hozzá, majd az oldatot szobahőmérsékleten 72 órán át keverjük. A reakciót HPLC elemzéssel figyeljük (Spherisorb ODS-1, acetonitril és 0,04 M ammónium-acetát 40:60 arányú elegye) a kívánt termék optimális hozama céljából. Ezután az oldatot 30% szilárd anyagtartalomig betöményítjük, és a maradékhoz 3,0 g (32 mmól) metil-akrilátot adunk. A reakcióelegyet szobahőmérsékleten addig keverjük, amíg a HPLC elemzés részlegesen alkilezett termékeket már nem mutat (24 óra). Az oldószert 30 °C-on forgóbeprálón eltávolítjuk, és a maradékot szivattyúval 24 órán át 133 Pa nyomáson szívatva szárítjuk. így 7,81 g hozammal jutunk a termékhez sárga, viszkózus olaj alakjában. A 13C-NMR spektrum eredményei a várt szerkezettel megegyeztek. A terméket további tisztítás nélkül használtuk fel.
R példa
Egy teljes generációjú csillagdendrimer előállítása N-( terc.-butoxi-karbonil)-6-(4-amino-benzilj
1,4,8,11-tetraaza-5,7-dioxo-undekánból
7,70 g (10,45 mmól) Q példa szerint előállított félgenerációs terméket 75 ml metanolban oldunk, és ezt az oldatot 2 óra alatt 400 ml (7,41 mól) etilén-diamin és 50 ml metanol elegyéhez csepegtetjük keverés közben. Ezután a reakcióelegyet szobahőmérsékleten 48 órán át keverjük, utána az etilén-diamint és a metanolt forgólepárlón eltávolítjuk. így 11,8 g sárga, olajszerű, etilén-diaminnal szennyezett terméket kapunk. E terméket 90 ml metanolban oldjuk, és az etilén-diamintól fordított ozmózissal mentesítjük (ehhez Filmtec FT30 membránt és Amicon TC1R vékonycsatornás szeparátort alkalmazunk, oldószer metanol). 48 óra után a gázkromatográfiás elemzés szerint (Tenax 60/80 oszlop) etilén-diamin már nincs jelen. Az oldószert forgóbepárlón lepároljuk, és a maradékot 24 órán át vákuumszivattyúval szárítjuk. így 6,72 g sárga, üvegszerű terméket kapunk, amely a HPLC elemzés (PLRP-S oszlop, acetonitril és 0,015 M nátronlúg keveréke, 1020%-os gradiens 20 perc alatt), valamint a 13C-NMR színkép alapján a várt szerkezetű.
példa
Másfél-generációs csillagpolimer előállítása N(terc.-butoxi-karbonil)-6-(4-amino-benzil)1, 4,8,11 -tetraaza-5,7-dioxo-undekánból
2,14 g (25 mmól) R példa szerint előállított egy-generációs terméket 12,5 ml metanolban oldunk, és ehhez az oldathoz 5 ml metanolban oldott 3,5 g (39 mmól) metil-akrilátot adunk. Az oldatot 48 órán át szobahőmérsékleten keverjük. A reakció előrehaladását HPLC elemzéssel figyeljük (Spherisorb ODS-1, acetonitril és 0,04 M ammónium-acetát 60:40 arányú elegye). Ezután további 3,5 g (39 mmól) metil-akrilátot adunk hozzá, és 72 órán át tovább keverjük. Az oldószert forgóbepárlón eltávolítjuk: így 3,9 g sárga, olajszerű terméket kapunk, amelyet másnapig vákuumszivattyúval szívatva szárítunk. A terméket tisztítás nélkül használjuk.
T példa
Két teljes generációs csillagpolimer előállítása N(terc.-butoxi-karbonil)-6-(4-amino-benzil)1,4,8,ll-tetraaza-5,7-dioxo-undekánból
3,9 g (2,5 mmól) S példa szerint előállított másfél-generációs termék és 50 ml metanol oldatát 2 óra alatt keverés közben 600 g (10 mól) etilén-diamin és 50 ml metanol elegyéhez csepegtetjük, majd az oldatot szobahőmérsékleten, nitrogénatmoszférában 96 órán át keverjük. Az etilén-diamint és metanolt forgóbepárlón eltávolítva
4,4 g, etilén-diaminnal szennyezett, sárga, üvegszerű, szilárd terméket kapunk. E termékből metanollal 10%-os oldatot készítünk, és fordított ozmózis útján megszabadítjuk az etilén-diamintól (membránként Filmtec FT-30at alkalmazunk Amicon TC1R vékonycsatomás szeparátorban); az etilén-diamintól való mentességet gázkromatográfiával vizsgáljuk (Tenax 60/80 oszlop). Az oldószer eltávolítása után 3,52 g sárga, üvegszerű terméket kapunk, amelynek 13C-NMR adatai és HPCL elemzése (PLRP-S oszlop, acetonitril és 0,015 M nátronlúg elegye 10-20%-os gradiens 20 perc alatt) a várt szerkezettel összhangban vannak.
U példa
Metilén-karboxilát-végcsoportot tartalmazó csillagdendrimer előállítása két-generációs csilagpolimer és bróm-ecetsav reakciójával
0,22 g (0,13 mmól) T példa szerinti előállított kétgenerációs terméket 15 ml ionmentesített vízben oldunk, és a hőmérsékletet 40,5 °C-ra állítjuk. Ezzel egy időben 0,48 g 3,35 mmól) bróm-ecetsavat és 0,13 g (3,3 mmól) lítium-hidroxidot 5 ml ionmentesített vízben oldunk, és az elegyhez adjuk. A reakcióelegy pHértékét pontosan 9-en tartjuk, ehhez pH-sztat eszközt alkalmazunk (titrálás 0,1 n nátronlúggal), és a reakciót éjszakán át 40,5 °C-on végezzük. A reakciót fordított fázisú HPLC elemzéssel figyeljük (Spherisorb ODS-1 oszlop, eluálószer 0,25 Μ H3PO4, pH 3 (NaOH) és acetonitril 85:15 arányú elegye); eszerint a szintézis túlnyomóan egyetlen komponenst eredményez.
V példa
Izotiocianát funkciós csoportot tartalmazó, két-generációs, metllén-karboxilát-végcsoportos csillagdendrimer előállítása ml oldatot, amely az U példa szerint előállított, két-generációs, metilén-karboxilát-végcsoportos csillagdendrímert 2,8 mM koncentrációban tartalmazza,
HU 209 252 Β ml vízzel hígítunk, és pH-értékét tömény sósavval 0,5-re állítjuk. Az elegyet szobahőmérsékleten 1 órán át állni hagyjuk, majd HPLC elemzést végzünk a butoxi-karbonil-csoport eltávolításának igazolására, és utána az elegy pH-értékét 50%-os nátronlúggal 7-re állítjuk. Ezután pH-sztat alkalmazásával (titrálás 0,1 n nátronlúggal) a pH értékét 7-en tartjuk, miközben 225 μΐ tiofoszfgént adunk az oldathoz. Az oldatot 15 percig szobahőmérsékleten állni hagyjuk, majd pHértékét n sósavoldattal 5-re állítjuk. Ezután az elegyet kétszer mossuk 20 ml kloroformmal, és utána vákuumban, forgóbepárlón betöményítjük. Az így kapott 0,91 g maradék az izotiocianát-termék és sók keveréke.
W példa
Két-generációs poli( etilén-imin)-metán-szidfonamid csillagpolimer előállítása
125 g N-mezil-aziridin és 50 ml etanol oldatához
25,0 g trisz(2-amino-etil)-amint adunk, és az oldatot szobahőmérsékleten 4 napig keverjük. Ezután a reakcióelegyhez szükség szerint adunk vizet az oldat homogenitásának a megtartására. Az oldószert vákuumban ledesztillálva 161 g két-generációs PEI-metánszulfonamid csillagpolimert kapunk sárga, üvegszerű termék alakjában.
X példa
Két-generációs poli(etilén-imin) csillagpolimer előállítása metán-szulfonamid hasításával
5,0 g W példa szerint előállított, kétgenerációs PEImetánszulfonamid csillagpolimert 20 ml 38%-os sósavval zárt üvegbombacsőben 16 órán át 160 °C hőmérsékleten melegítünk, majd jégfürdőben lehűtjük, és a csövet megnyitjuk. Az oldószert vákuumban ledesztilláljuk, a maradékot vízben oldjuk, és a pH-t 50%-os nátronlúggal 10-re vagy ennél magasabb értékre állítjuk. Az oldószert vákuumban ledesztilláljuk, a maradékhoz 150 ml toluolt adunk, és az elegyet Dean-Stark feltéttel visszafolyató hűtő alatt addig forraljuk, amíg vízgőzök már nem távoznak el. Ekkor az oldatból kiszűrjük a sókat, és a szűrletet vákuumban bepároljuk, így 1,9 g két-generációs PEI-csillagpolimert kapunk sárga, olajszerű termék alakjában.
Y példa
Három-generációs poli( etilén-iminj-metánszulfonamid csillagpolimer előállítása
10,1 g X példa szerint előállított két-generációs
PEI-csillagpolimert 100 ml etanolban oldunk, és 36,6 g N-mezil-aziridint adunk hozzá, majd az oldatot szobahőmérsékleten 1 héten át keverjük. Az oldathoz szükség szerint vizet adunk, hogy homogén maradjon. Az oldószert vákuumban ledesztillálva 45,3 g három-generációs PEI-metánszulfonamid csillagpolimert kapunk sárga, üvegszerű termék alakjában.
Z példa
Három-generációs poli( etilén-imin)-csillagpolimer előállítása metánszulfimamid hasításával 5,0 g Y példa szerint előállított, háromgenerációs
PEI-metánszulfonamid csillagpolimer metánszulfonamid-csoportjait ugyanúgy hasítjuk, mint ahogyan ezt a két-generációs termék előállítása során az X példában leírtuk. így 2,3 g három-generációs PEI csillagpolimert kapunk sárga, olajszerű termék alakjában.
AA példa
Három-generációs poli( etilén-imin)-csillagpolimer reakcióija 4-fluor-nitrobenzollal
1,06 g (l,2mmól) Z példa szerint előállított, háromgenerációs poli(etilén-imin)-csillagpolimert 12 ml abs. etanolban oldunk, 120 μΐ (1,2 mmól) 4-fluor-nitro-benzolt adunk hozzá, és a reakcióelegyet éjszakán visszafolyató hűtő alatt forraljuk, majd az oldószert forgóbepárlón eltávolítjuk, és a sárga, olajszerű maradékot vízben oldjuk. A vizes oldatot kloroformmal mossuk az el nem reagált 4-fluor-nitro-benzol eltávolítására. A víz eltávolítása után sötétsárga, olajszerű terméket kapunk, amelynek tömege 0,80 g. A13C-NMR színkép adatai a várt szerkezettel összhangban vannak. (Nem kíséreltük meg a sztatisztikus eloszlás jellegének a meghatározását.) A terméket további tisztítás nélkül használtuk.
BB példa
Három-generációs poli( etilén-iminj-csillagpolimer nitro-fenil-származékának a reakciója glikolonitrillel 0,80 g AA példa szerint előállított három-generációs poli(etilén-imin)-csillagpolimer nitro-fenil-száimazékot 20 ml ionmentesített vízben oldunk, és az oldathoz 2,80 g 50 tömeg%-os nátronlúgot adunk, miközben az oldatot nitrogénnel öblítjük, és a nitrogént nátronlúgot tartalmazó buborékolón vezetjük át. Az oldathoz szobahőmérsékleten 2,85 ml 70%-os vizes glikolonitrilt adunk. Néhány perc múlva sárga csapadék képződik. Két óra eltelte után a hőmérsékletet lassan forráspontig emeljük, és az oldatot nitrogénátvezetés közben 24 órán át visszafolyató hűtő alatt forraljuk. A víz eltávolítása után glikolsavval és nátronlúggal szennyezett, szilárd, sárga terméket kapunk, amelynek l3C-NMR színképe a várt szerkezettel összhangban van. A terméket további tisztítás nélkül használjuk.
CC példa
Három-generációs poli( etilén-imin)-csillagpolimer nitro-fenil-származékának hidrogénezése az aminofenil-metilén-karboxilát-végcsoportos termékké
1,70 g BB példa szerint előállított sárga, szilárd terméket 10 ml ionmentesített vízben oldunk. így megközelítőleg 11-es pH-értékű oldatot kapunk. Ehhez az oldathoz 200 mg 5%-os csontszenes palládiumot adunk egy üvegből készült Part-rázóberendezésben. A reakcióelegyet 275 kPa nyomású hidrogénnel szobahőmérsékleten 6 órán át rázatjuk, majd 0,5 m Millipore szűrőn szűrjük, és a szűrletből az oldószert vákuumban eltávolítjuk. A maradékot (25 g vízzel duzzasztott) Biogel P2 gyantán átvezetve gélszűrésnek vetjük alá. Sósavval savanyítva narancs-barna színű oldatot kapunk, amelyet éjszakán át nitrogénnel öblítünk. Az oldószert vákuumban eltávolítva 3,98 g hozammal, halványbarna szilárd termék alakjában kapjuk a sósa17
HU 209 252 Β vas sót, amely nátrium-kloriddal és glikolsavval van szennyezve; a termék elméleti mennyisége 1,15 g. E terméket további tisztítás nélkül használjuk.
DD példa
-(Izotiocianato-fenil)-m,etilén-karboxilát-végcsoportos, három-generációs poli(etilén-imin)-csillagpolimer előállítása
3,98 g CC példa szerint előállított terméket 15 ml ionmentesített vízben oldunk, és ebből az oldatból
2,5 ml térfogatú alikvot részt 10 ml vízzel hígítunk, majd az oldat pH-értékét nátronlúggal 7-re állítjuk. Ezután pH-sztat eszközt használunk (titrálás n nátronlúggal) a pH értékének fenntartására, miközben 200 μΐ tiofoszgént adunk hozzá. 10 perc elmúltával az elegy pH-értékét sósavval 4-re állítjuk. A vizet forgóbepárlón vákuumban eltávolítjuk (kismennyiségű n-butanolt adunk hozzá a habzás meggátlására), a maradékot diklór-metánnal mossuk, majd szárítjuk. így 0,95 g nyersterméket kapunk, amely 0,14 g izotiocianát-terméket és sókat tartalmaz. E terméket további tisztítás nélkül használjuk.
EE példa
Metilén-karboxilát-végcsoportos, két-generációs poliamidoamin-csillagpolimer előállítása
2,71 g (2,6 mmól) két-generációs poliamidoamincsillagpolimert és 4,39 g (31,6 mmól) bróm-ecetsavat 30 ml ionmentesített vízben oldunk, és az oldat pH-értékét pH-sztat alkalmazásával 5 n nátronlúggal 9,7-re állítjuk. A reakciót 30 percig ezen a pH-értéken tartjuk, a hőmérsékletet lassan 60 °C-ra emeljük, és állandó pH mellett 3 órán át 60 °C-on tartjuk. Ezután a pH-t 10,3ra növeljük, és a reakciót a pH-sztat alkalmazása mellett másnapig szobahőmérsékleten tartjuk, majd további 4 órán át visszafolyató hűtő alatt forraljuk. Az oldószert eltávolítjuk, a víz utolsó nyomait etanollal azeotróposan eltávolítjuk, s így 8,7 g, nátrium-bromiddal szennyezett, halványsárga, porszerű terméket kapunk. E termék 13C-NMR színképe a várt szerkezettel egyezik. (A termék némi szennyezést tartalmaz, ez kismértékű monoalkilezés következménye.)
FF példa
Metilén-karboxilát-végcsoportos, két-generációs poli(etilén-imin)-csillagpolimer előállítása (ammóniainiciátor-magrész)
2,73 g (6,7 mmól) X példa szerint előállított, kétgenerációs poli(etilén-imin)-csillagpolimert és 11,29 g (81 mmól) bróm-ecetsavat 30 ml ionmentesített vízben oldunk, és az elegy pH-értékét lassan 9,5-re növeljük, miközben a hőmérsékletet 30 °C alatt tartjuk. Ezután a hőmérsékletet lassú ütemben 55 °C-ra növeljük, és a reakcióelegy pH-értékét pH-sztat segítségével (titrálás 5 n nátronlúggal) 6 órán át 9,5-ön tartjuk. Ezután a pH-t 10,2-re növeljük, és a reakcióelegyet ugyanezen a pH-értéken másnapig tároljuk. Az oldószert forgóbepárlón ledesztilláljuk, a víz utolsó nyomait metanollal azeotróposan eltávolítjuk, s így 17,9 g, nátrium-bromiddal szennyezett sárga, porszerű terméket kapunk, amelynek ,3C-NMR színképe a várt szerkezettel egyezésben van. (A termék némi szennyezést tartalmaz, amely monoalkilezésből származó kismennyiségű anyag következménye.
GG példa
3,5,4,5,5,5 és 6,5 generációs PAMAM-csillagpolimerek előállítása
2,46 g három-generációs PAMAM-csillagpolimer 10 tömeg%-os metanolos oldatához 2,32 g metil-akrilátot adunk, és az elegyet szobahőmérsékleten 64 órán át állni hagyjuk, majd az oldószert és a metil-akrilát feleslegét eltávolítjuk. így 4,82 g terméket kapunk (ami megfelel az elméleti érték 105%-ának).
Magasabb, fél-generációs PAMAM-csillagpolimerek előállítása
A 4,5, 5,5 és 6,5 generációkat a fentebb leírtak szerint állítjuk elő, a reagáló anyagok koncentrációjában, mólarányában és a reakció időtartamában való jelentős különbségek nélkül.
HH példa
Négy-, öt- és hat-generációs PAMAM-csillagpolimer előállítása
2000 g frissen desztillált etilén-diaminhoz 15 tömeg%-os metanolos oldatban 5,4 g 4,5 generációs PAMAM csillagpolimert adunk, és az elegyet szobahőmérsékleten 48 órán át állni hagyjuk, majd a metanolt és az etilén-diamin feleslegének legnagyobb részét forgóbepárlón vízlégszivattyúval eltávolítjuk, s így összesen 8,07 g terméket kapunk. A gázkromatográfiás vizsgálat szerint e termék 34 tömeg% etilén-diamint tartalmaz. A termékből 5,94 g-ot 100 ml metanolban oldunk, és az etilén-diamin eltávolítása céljából ultraszűrésnek vetjük alá. A szűrést Amicon YM2 membránnal felszerelt Amicon TC1R vékonycsatomás, recirkuláló szeparátor alkalmazásával végezzük. Nyomószelep alkalmazásával 380 kPa nyomást tartunk fenn a membránon. A 100 ml szűrletet 15 ml-re töményítjük azáltal, hogy az oldószert a membránon át kényszeráramlásba visszük. A kezdeti töményítés után az áramlást állandó térfogatra állítjuk, reciklizált módon, 18 órán át. Ezután 60 ml metanolt viszünk át a membránon, hogy a modulusz-ban és az ehhez csatlakozó csővezetékben még meglévő terméket megkapjuk. Az így kapott elegyből az oldószert vákuumban eltávolítjuk, s így 2,53 g ötgenerációs PAMAM-csillagpolimerhez jutunk. A gázkromatográfiás elemzés szerint ez a termék 0,3% etilén-diamint tartalmaz.
A négy- és hat-generációs terméket a fentiek szerint állítjuk elő azzal a különbséggel, hogy az etilén-diaminnak a kiinduló anyaghoz viszonyított arányát változtatjuk. A négy-generációs termék előállításához ezt az arányt 200:1-nek vesszük, a hat-generációs termék előállítása során 730:1 arányt alkalmazunk.
1. példa
2-(Acetil-oxi)-benzoesav (aszpirin) beágyazása csillagdendrimerekbe
Annak igazolása céljából, hogy egy „vizsgálati mo18
HU 209 252 Β lekula” egy micella belsejébe zárva van-e, általánosan elfogadott módszer a 13C-spin rács-relaxációs időinek (T0 Összehasonlítása egyrészt a nem-micellás, másrészt a micellákat tartalmazó közegben. Micellás közegben a T, érték lényeges csökkenése arra utal, hogy a „vizsgálati molekula” a micellák belsejébe zárt állapotban van. Mivel a csillagdendrimerek micellák „kovalensen rögzített” analógjai, ezt a T, relaxációs idő módszert alkalmaztuk annak kiértékelésére, hogy különböző típusú gyógyszermolekulák milyen mértékben egyesülnek csillagpolimer poliamidoaminokkal. Az alábbi példákban meghatároztuk a 2-(acetil-oxi)-benzoesav (aszpirin) T, értékeit oldószerben (CDCl3-ban), és ezeket az értékeket összahasonlítottuk azokkal a T, értékekkel, amelyeket különböző aszpirin/dendrimer mólarányok alkalmazásával CDCl3-ban kaptunk.
Aszpirin zárványozása (inklúziója) különböző poliamidoamin csillagdendrimerekben, mint a generáció függvénye
Különböző, fél-generációs (ammónia iniciátorból képzett, észter-végcsoportos) poliamidoamin csillagdendrimereket (generációk száma 0,5-től 5,5-ig) CDCl3-ban 2-(acetil-oxi)-benzoesavval kombinálunk úgy, hogy a sav és a tercier amin aránya 1,0. Ha a 2-(acetil-oxi)-benzoesav Tj értékeit a hozzáadott csillagdendrimer generációjának függvényében ábrázoljuk (lásd a 4. ábrát, ahol © C-4-et, □ C-6-ot, és O C-5-öt jelez), akkor látható, hogy Tj minimumot ér el a 2,5 —>5,5 generációs tartományban a 2-(acetiloxi)-benzoesav 4-es, 5-ös és 6-os szénatomja esetében. Ez azt mutatja, hogy a 2-(acetil-oxi)-benzoesav a 2,5től 5,5-ig terjedő generációs tartományban asszociál a dendrimerekkel, valamint alátámasztja, hogy a 2,5 vagy magasabb generációs polimidoamin-dendrimerek vivőmolekulákként funkcionálnak.
2. példa
Pszeudoefedrin felszabadulása (kibocsátása) PAMAM-csillagdendrimerből
0,83 mg/ml pszeudoefedrint és 1,0 mg/ml PAMAMdendrimert [amelynek generációszám 6,5, végcsoportja metil-észter, és végcsoportjainak száma (Z) 192] ionmentesített desztillált vízben oldunk, és a donorfázis pHértékét nátronlúgoldattal 9,5-re állítjuk, majd az elegyet szobahőmérsékleten tartjuk körülbelül 12 órán át. Ezzel egy időben pszeudoefedrin-oldatot kontrollként ugyanígy kezelünk. A hatóanyag és a dendrimer oldatát 8 órán át 40 °C-on tartjuk, majd dinamikus dialízist végzünk. A dialízishez spectra/Por 7, MWCO 1,000 28,6 mm átmérőjű membránt alkalmazunk, spektrum-szeparációs cellákban (a cella féltérfogata 5 és 10 ml, a cella méretei: mindkét cella átmérője 38 mm, az 5 ml-es cella mélysége 10 mm, a 10 ml-es cella mélysége 20 mm).
Az így kapott mintákat HPLC eljárással elemezzük, amelyet pszeudoefedrin céljára az alábbiakban módosítunk:
Oszlop: uBondapakC-18
Mozgó fázis: 3,2 pH-értékű foszfátpuffer és acetonitril 80:20 arányú elegye
Áramlási sebesség: 0,3 ml/perc
Detektálás: 210 nm hullámhosszú UV fénnyel Retenciós idő: 13,3 perc
A dializáló membránt ionmentesített vízzel mossuk, és alkalmazás előtt legalább 12 órán át a receptorfázisban áztatjuk. A dializáló membránt a donor és a receptor rekesz közé helyezzük, és egy kis méretű mágneses keverővei keverünk. A donor és a receptor oldatok ismert térfogatát a megfelelő rekeszekbe viszszük, és megfigyeljük a pszeudoefedrin átmenetét a receptorrekeszbe az idő függvényeként. A bemerülési viszonyok fenntartása céljából minden 30 percben eltávolítjuk a teljes receptorfázist, és friss receptorfázissal helyettesítjük. A pszeudoefedrin mennyiségét a receptorfázisból vett mintában határozzuk meg. A kísérleteket szobahőmérsékleten (22 °C-on) végezzük. Receptorfázisként ionmentesített desztillált vizet alkalmazunk.
A dinamikus dialízis eredményei az 5. ábrában láthatók. Az 5. ábrában O jelenti az önmagában vett pszeudoefedrint (azaz a kontrollt), a © jelenti a pszeudoefedrint a dendrimerrel együtt, és O jelenti a pszeudoefedrint a dendrimerrel együtt 40 °C hőmérsékleten, 8 órával a dialízis előtt. Nyilvánvaló, hogy a
6,5 generációs dendrimer esetében O a donorrekeszben a pszeudoefedrin dialízisének sebessége csökken. Ha a donoroldatot 40 °C-on tartjuk, akkor látható, hogy a dialízis sebessége tovább csökken.
A kísérletet alacsonyabb koncentrációban ismételtük (a gyógyszermolekuláknak a végcsoportokhoz viszonyított arányát azonosnak tartottuk). 120 gg/ml
6,5 generációs dendrimer és 100 gg/ml pszeudoefedrint (azaz 122 gg/ml sót) alkalmaztunk.
A pszeudoefedrin mint kontroll dinamikus dialízise ennél az alacsonyabb koncentrációnál majdnem ugyanaz, mint a magasabb koncentrációnál. A 6. ábra összegezi ennek a kísérletnek az eredményeit: · jelenti a pszeudoefedrint önmagában (kontroll), és O jelenti a pszeudoefedrint a dendrimerrel együttesen.
3. példa
A 2. példában leírt eljárást ismételjük az alábbiakban leírt módosításokkal:
Receptorfázis: 7,4 pH-értékű foszfátpuffer Donorfázis: 7,4 pH-értékű foszfátpuffer, valamint a gyógyszerhatóanyag és a denrimer az alábbi arányokban:
1. G 6,5: gyógyszerhatóanyag = 1:192
2. G 5,5: gyógyszerhatóanyag = 1:96
3. G 4,5: gyógyszerhatóanyag = 1:48
4. G 6,5H: gyógyszerhatóanyag = 1:192
5. G 5,5H: gyógyszerhatóanyag = 1:96
6. G4,5H: gyógyszerhatóanyag = 1:48 (G a generációk számát jelenti)
A fenti donorfázisokat, amelyek egyrészt a pszeudoefedrint a polimerrel együttesen tartalmazzák, dinamikus dialízisnek vetjük alá. A „H” betű a dendrimer generációs szám után hidrolizált dendrimert jelent. A hidrolízist a M és N példákban leírt eljárással végezzük.
E kísérleteink eredményeit a 7. ábrában összegez19
HU 209 252 Β tűk, ahol a donor- és a receptorrekesz 7,4 pH-értékű foszfátpuffert tartalmazott. Az önmagában vett pszeudoefedrin (P) esetére három kísérlet átlaggörbéjét ábrázoltuk (ezt a kihúzott görbe mutatja), és a többi kísérletből egy típusos menetet ábrázoltunk. A 7. ábrában az alábbi jelek mutatják a dendrimer generációs számát.
III. táblázat
Jel A dendrimer generációszáma
d 5,5
• 65
3 45
Θ 5ΔΗ
O 6,5H
Φ 4,5H
Látható, hogy a pszeudoefedrin a (nem-hidrolizált) dendrimerrel 7,4 pH-értéken nem asszociál. A terminális funkciós csoportok karboxilátcsoportokká alakítása viszont drámai hatást gyakorol a dialízis sebességére (csökkenti). Úgy látszik, hogy a generációszám a dialízis sebességét nem befolyásolja.
4. példa
Szalicilsav és PAMAM-csillagpolimer kölcsönhatásának vizsgálata
Kiértékeltük szalicilsav és PAMAM-csillagdendrimer kölcsönhatásának a jellemzőit.
E kísérlethez ammóniából mint iniciátor-magrészből képzett dendrimereket használtunk, és az ismétlődő egységeket N-(2-amino-etil)-karbamidból derivatizáltuk. Ezekbe a vizsgálatokba mind a teljes generációszámú (terminális aminocsoportos), mind a fél-generációs (terminális észtercsoportokat tartalmazó) polimereket bevontuk. A teljes generációs polimerek esetében a szalicilsavnak a csilagdendrimerhez viszonyított aránya olyan volt, hogy megközelítőleg egy szalicilsav molekula esett egy terminális amincsoportra. A fél-generációs polimerek vizsgálata során ugyanezt az arányt alkalmaztuk, azonban a beállítást a magasabb molekulatömegű polimer figyelembevételével végeztük.
Kísérleteinket szobahőmérsékleten végeztük egyensúlyban lévő, sztatikus dializáló cellákkal. Valamennyi kísérletünkben sztatikus dializáló spektrumcellákat alkalmaztunk (a fél cellatérfogat 10 ml) SpectraPor 6 membránnal elkülönítve (elkülönített molekulatömeghatár 1000). A szalicilsav átvándorlását az idő függvényeként figyeltük meg úgy, hogy a megfelelő cellarekeszekből alikvotokat vettünk ki, és UV detektorral 296 nm hullámhossz mellett HPLC elemzést végeztünk Bondupak C-18 oszlop, eluáló mozgó fázis acetonitril és 0,1 M 3,2 pH-értékű foszfát-puffer 20:80 térf./térf. arányú elegye, áramlási sebesség 30 ml/óra).
ml, 1 mg/ml koncentrációban szalicilsavat és
2,5 mg/ml koncentrációban négy-generációs csillagpolimert tartalmazó oldat pH-értékét 6,65-re, illetve 5,0re állítjuk sósavoldattal, a dializáló cella donor rekeszébe helyeztük, és azonos térfogatú, azonos pH-értékű tisztított vizet helyeztünk a receptorrekeszbe. Megfigyeltük a szalicilsav átmenetét a receptorrekeszbe. Eredményeinket a 8. ábrában összegeztük, ahol · jelenti a szabad savat, O jelenti a savat a négy-generációs dendrimerrel együttesen 6,65 pH-érték mellett, és □ jelenti a savat a négy-generációs dendrimerrel együttesen 5,00 pH-érték mellett.
Mivel 6-os pH mellett a polimeren lévő amincsoportok kisebb mértékben ionizálnak, azért várható, hogy pH 5 mellett a szalicilsavval a kölcsönhatás nagyobb mértékű, és ennek következtében az alacsonyabb pH-érték esetében kevesebb anyag megy át. A
8. ábra eredményei azt mutatják, hogy sokkal kisebb százalékos mértékben megy át a szalicilsav a polimer jelenlétében mindkét pH-érték mellett, mint a kontrollként vett szalicilsavval végzett vizsgálat esetében. Megfigyelhető továbbá, hogy több szalicilsav vándorol át 6,65 pH-értéken, mint 5,0 pH-értéken, amint ez jósolható is. Ezek az adatok alátámasztják, hogy a szalicilsav és a csillagpolimer kölcsönhatása a pH értékével szabályozható. Az adatok továbbá tartós felszabadulás jellemzőire is utalnak, mivel a szalicilsav koncentrációi a polimer jelenlétében folyamatosan növekszenek, megközelítőleg 12 óra elmúltával is, amely a kontrollvizsgálat során egyensúlyi időpontként figyelhető meg.
Abból a célból, hogy a szalicilsav és a négy-generációs csillagpolimerek kölcsönhatásának jellemzőit részletesebben vizsgáljuk, 8,0 pH-értéken is kísérletet végeztünk. E vizsgálat során a fentiektől annyiban tértünk el, hogy a donorrekeszbe csak 1 mg/ml koncentrációjú, 8,0 pH-értékre beállított szalicilsavat, a receptorrekeszbe pedig 2,5 mg/ml koncentrációjú polimer oldatot helyeztünk. A szalicilsavnak a donorrekeszből való távozását a fentebb leírtak szerint figyeltük meg. Eredményeinket a 9. ábrában összegeztük. Ebben az ábrában -·- jelenti a szabad savat, és -Δ- jelenti a savat a négy-generációs dendrimerrel együttesen.
A 9. ábra azt mutatja, hogy abban az esetben, ha a donorrekeszben szalicilsav és a receptorrekeszben csillagpolimer van jelen, akkor az egyensúly jellemzői különböznek a kontrollként szalicilsavval végzett vizsgálat eredményeitől. A molekuláknak 8-as pH-érték melletti ionizációs jellemzői alapján megközelítőleg
6-7%-os kölcsönhatás várható; ezzel szemben a kölcsönhatás megfigyelt mértéke 4-5% körüli. Az asszociációnak ez az alacsonyabb megfigyelt értéke a kísérleti körülmények változásának vagy 1-nél kisebb ionizációs állandónak a következménye lehet.
E kísérletünk arra utal, hogy a rendszer folyamatos fázisából a polimer szabad szalicilsavat vesz fel, vagy távolít el. Az ilyen típusú hatás esetleg molekulák reakcióképességének a csökkentését eredményezheti, és esetleg a polimerekkel kapcsolatban kelátképző tulajdonságokat eredményezhet.
Kiértékeltük 6,65 pH mellett szalicilsav kölcsönhatásának jellemzőit 4,5 generációs, terminális észtercsoportokat tartalmazó csillagpolimerrel. A szalicilsavat 1 mg/ml koncentrációban 6,65 pH-η kombináltuk a
3,6 mg/ml koncentrációban vett, 4,5 generációs csillagpolimerrel. 10 ml oldatot helyeztünk a donorrekeszbe, és a fentebb leírtak szerint megfigyeltük a donorrekeszből történő átmenetet. Eredményeinket a 10. ábrá20
HU 209 252 Β bán összegeztük. Ebben az ábrában —•—jelöli a szabad savat, és -O- jelöli a savat a polimerrel együttesen.
Ilyen kísérleti körülmények között az várható, hogy töltés által kiváltott kölcsönhatás nem következik be, mivel a tercier aminocsoportok 6,65 pH érték mellett nem ionizáltak. A 10. ábra mutatja, hogy a szalicilsav átmenete a 4,5 generációs polimer jelenlétében a dialízis első 10 órája alatt lényegében ugyanaz, mint a szalicilsav-kontrollal végzett vizsgálat esetében.
Az e példában kapott adatokból a következő megfigyeléseket tehetjük:
(1) A teljes generációjú PAMAM-csillagpolimerek a szalicilsav számára vivőanyagként funkcionálnak.
(2) A teljes generációjú PAMAM-csillagpolimerek a szalicilsav tartós felszabadulását eredményezik.
(3) A teljes generációjú PAMAM-csillagpolimerek szalicilsavval szemben mutatott hordozó sajátságai a pH értékével szabályozhatók.
5. példa
Vasnak nátrium-propionát végcsoportos, hat-generációs poliamidoamin-csillagpolimerrel végbemenő többszörös kelátozásának a kimutatása
97,1 mg (2,45 mól) hat-generációs, nátrium-propionát végcsoportos poliamidoamint (iniciátor-mag ammónia) 1,5 ml ionmentesített vízben oldunk, majd az oldat pH-értékét 0,5 ml 0,5 n sósav hozzáadásával 6,3ra csökkentjük. Ezután hozzáadunk 0,5 ml 0,1 2 M koncentrációjú vas(III)-klorid-oldatot (0,051 mmól), így enyhén barna, zselatinszerű csapadék válik le. Az elegyet 60 °C-on 30 percig melegítjük, így homogén, narancsszínű oldatot kapunk. Az oldatot Biogel P2 akrilamid-gélen szűrjük (10 g, kétszer), és a narancsszínű csíkot (amely halogenidszennyezéstől mentes) elkülönítjük. Az oldószert vákuumban ledesztillálva narancsszínű film alakjában, 30 mg hozammal kapjuk a terméket, amelynek elemzési eredményei azt mutatják, hogy a csillagdendrimer 1 mólnyi mennyiségére számítva körülbelül 20 mól vas(III)-iont tartalmaz kelátozott formában.
IV. táblázat
Talált értékek Elméleti értékek
Na4Fe20H128SB Na5Fe2()H127SB NafiFcjoH^SB
Na 0,39, 0,24(0,31, 0,1%) 0,25 0,31 0,38
Fe3,14, 3,11 (3,12, 0,02%) 3,05 3,05 3,04
C 47,11 49,87 49,84 49,81
H7,33 7,31 7,30 7,29
N 14,81 14,49 14,48 14,47
0- 25,03 25,02 25,01
Molekulatö- meg 36632,23 36654,21 36375,18
SB = C1521H2467N379O573
Ezek az eredmények alátámasztják, hogy a csillagdendrimer egy molekulája 20±2 molekula vas(III)-iont tart kelátkötésben.
6. példa
Molekulánként l-nél több ródiumatomot tartalmazó csillagpolimer előállítása 0,18 g (0,087 mmól) észter-végcsoportos (ammóniából mint iniciátor magrészből kiinduló) 2,5-generációs PAMAM csillagpolimert és 0,09 g (0,3 mmól) ródium-triklorid-trihidrátot 15 ml dimetil-formamidban összekeverve 4 órán át 70 °C-on melegítünk. Az oldat színe karmazsinvörösre változik, és a ródium legnagyobb része feloldódik. Az el nem reagált ródiumvegyületet szűréssel elkülönítjük, és az oldatból az oldószert forgóbepárlón eltávolítjuk. Az így kapott olajszerű maradék kloroformban oldható. Az oldatot előbb vízzel mossuk, majd magnézium-szulfáton szárítjuk, s utána az oldószert lepároljuk. így 0,18 g vörös, olajszerű maradékot kapunk, amelynek Ή-NMR színképe CDCl3-ban csak minimális különbséget mutat a kelátkötésű és a nem kelátozott csillagpolimer között.
Ha a CDC13 oldat egy mintáját etanollal hígítjuk, és utána nátrium-[tetrahidrido-borát]-ot adunk hozzá, akkor ródiumtartalmú csapadékot kapunk. Mivel a ródium-triklorid-trihidrát mind kloroformban, mind a csillagpolimer kloroformos oldatában oldhatatlan, ez igazolja a kelátkötés létesülését.
7. példa
Csillagpolimerrel kelátozott palládiumot tartalmazó termék előállítása
1,1 g (0,24 mmól) észter-végcsoportos (ammóniából mint iniciátormagrészből kiinduló) 3,5-generációs PAMAM csillagpolimert keverés közben 50 ml acetonitrilben oldunk, 0,24 g (1,4 mmól) palládium-kloridot adunk hozzá, és az oldatot másnapig vízfürdőn 70-75 °C-on melegítjük. A csillagpolimer a palládium-kloridot megköti. Az oldószer eltávolítása után CDCl3-ban felvett ’H-NMR színképe azt mutatja, hogy a kelátkötés megtörtént. Ha a CDC13 oldat kis mintáját etanollal hígítjuk, nátrium-[tetrahidrido-borát] hozzáadása a palládiumot kicsapja. A kelátozott termék hozama 1,23 g, barna, olajszerű anyag.
8. példa
Ittrium két-generációs, metilén-karboxilát-végcsoportos poli(etilén-imin)-csillagpolimer általi többszörös kelátkötésének a kimutatása (átkelátozás ittrium-acetátból)
0,46 g (0,18 mmól) 52,5% anyagtartalmú (a többi része nátrium-bromid), FF példa szerint előállított, metilénkarboxilát-végcsoportos poli(etilén-imin)-csillagpolimert 4,5 ml deutérium-oxidban oldunk. Az oldat pH-értéke 11,5-12. Ehhez az oldathoz 0,5 ml-enként adagolunk egy olyan oldatot, amelyet úgy készítünk, hogy 0,15 g (0,5 mmól) ittrium-kloridot és 0,41 g (0,5 mmóí) nátrium-acetátot 1,5 ml deutérium-oxidban oldunk. így a dendrimer 1 molekulájára 2,9 atom ittrium jut. Eközben felvesszük a 13C-NMR színképet 75,5 MHz-en.
HU 209 252 Β
A 9 * * * 13C-NMR színkép az ittrium-acetát esetében két rezonanciát mutat: az egyik: 184,7 ppm a karboxil, szénatomhoz, a másik: 23,7 ppm a metil-szénatomhoz tartozik; ezzel szemben a nátrium-acetát esetében az első rezonancia 182,1, a másik 24,1 ppm; ecetsav esetében pedig 177,7, illetve 20,7 ppm (Sadtler. Standard 13C-NMR Színképek). E sávok helyzete megmutatja a csillagdendrimerrel végbemenő kelátképzés mértékét. A csillagdendrimemek a kelátozásra rámutató, leginformatívabb jele az a-CH2 (azaz a kelátkötésben részt vevő metilén-karboxilát csoport metilénje), amely a nem kelátozott dendrimerben 58,4 ppm-nél, a kelátozott dendrimerben 68,3 ppm-nél jelenik meg. Ittriummal végbemenő kelátkötés során a spin rács-relaxációs idő az a-CH2 esetében a várt módon 0,24±0,01s-ről 0,14±-0,01s-re rövidül, ami mutatja a kelátképzést.
0,5 ml ittrium-acetát oldatnak a csillagdendrimerhez való hozzáadása után az összes ittriumot kelátba kapcsolja a dendrimer, ezt igazolja, hogy az acetát szignálja a nátrium-acetát szignálja. Ugyanezt figyelhetjük meg az ittrium-acetát oldat második 0,5 ml-es alikvot részének a hozzáadása után. Az ittrium-acetát harmadik alikvotjának hozzáadása után a csillagpolimer már nem teljesen kelátozza az ittriumot, és megfigyelhető, hogy az acetátkarboxil rezonanciája 183,8 ppm-re tolódik el, ami jelzi, hogy az ittrium egy része az acetáttal van asszociálva. A dendrimeren lévő, kelátkötésben részt vevő CH2 csoportok integrált területe növekszik, s ez arra utal, hogy a harmadik mólekvivalens ittrium egy része még valóban kelátkötésbe lép a dendrimerrel. Mindezek az eredmények arra utalnak, hogy a dendrimer 1 molekulája 2-3 ittriumiont képes kelátkötésbe vinni.
9. példa
Ittrium kétgenerációs, metilén-karboxiliát-végcsoportos poliamidoamin-csillagpolimer általi többszörös kelátkötésének a kimutatása (átkelátozás ittrium-acetátból)
E vizsgálatunkban a 8. példában leírt kísérleti módszert alkalmaztuk.
0,40 g (0,12 mmól) 62,5% anyagtartalmú (a többi része nátrium-bromid), metilén-karboxilát-végcsoportos poliamidoamin-csillagpolimert 4-5 ml deutériumoxidban oldunk. Az oldat pH-értéke 11,5-12. Az oldathoz a kísérlet megkezdése előtt 6 n sósavat adva ezt a pH-értéket 9,4-re csökkentjük. Ezzel egy időben ittrium-acetát oldatot készítünk úgy, hogy 0,1125 g (0,37 mmól) ittrium-kloridot és 0,0915 g (1,1 mmól) nátrium-acetátot 1,5 ml deutérium-oxidban oldunk. így ennek az oldatnak minden egyes 0,5 ml térfogata 1 mólekvivalens fémet tartalmaz.
Az első két mólekvivalens ittrium-acetátot a poliamidoamin-csillagpolimer teljesen kelátkötésbe viszi. A harmadik mólekvivalens ittrium hozzáadásakor a termék kicsapódik, és így NMR-színkép nem készíthető. A csillagdendrimer kelátkötéséről a legtöbb információt a kelátozó nitrogénnel szomszédos két szénatom szolgáltatja: a nem-kelátozott dendrimerben ezeknek a szénatomoknak a kémiai eltolódása
59,1 ppm az a-CH2 esetében, és 53,7 ppm az első láncmetilén-szénatom esetében. Kelátozás során megfigyelhető, hogy ez a két rezonancia 60,8 ppm-re, illetve
55,1 ppm-re tolódik. Az átkelátozást mutatja, hogy a dendrimer 1 molekulája készségesen visz kelátkötésbe két fémiont, ezzel szemben a harmadik mólekvivalens fém ismeretlen törtrészének a kelátozása következtében a termék az oldatból kicsapódik.
10. példa két-generációs, metilén-karboxilát-végcsoportos poli(etilén-imin)-csillagpolimer általi többszörös kelátkötésének a kimutatása
Standard ittrium-klorid oldatot (3xl(E2 mólos, amely vivőanyag nélkül hozzáadott ^Y-t tartalmaz) és standard (6xl0~2 mólos) két-generációs, metilén-karboxilát-végcsoportos csillagpolimert tartalmazó oldatot készítünk, és ezeket HEPES-pufferoldatban, különböző fém/csillagpolimer arányokban reagáltatjuk. A komplex hozamát ioncserélő kromatográfiával, Sephadex G50 ioncserélő gyöngyök alkalmazásával állapítjuk meg; az eluálást ρΗ-10-en végezzük 10%-os nátrium-klorid oldat és ammóniaoldat 4:1 arányú elegyével. Ennek során a komplexben nem kötött fém az oszlopon marad, a komplexben lévő fém eluálható. A hozamokat az oszlopról eluált radioaktivitás mérésével határozzuk meg.
V. táblázat
2,5 generációs PEI-acetát kelátképzése ^Y-val
Y3+ térf. PEI térf. HEPES térf. M: L elra. Komplex % M:Lakt.
5 30 370 0,1 110 0,1
10 30 360 0,2 101 0,2
20 30 350 0,4 95 0,4
30 35 340 0,5 97 0,5
30 30 340 0,5 102 0,5
60 30 310 1,0 99 1,0
120 30 250 2,0 100 2,0
180 30 180 3,0 94 2,8
250 30 120 4,1 80 3,3
300 20 80 7,5 44 3,3
300 20 70 5,0 40 2,0
300 20 70 5,0 41 2,0
Az V. táblázatban az összes térfogatokat mikroliterben adtuk meg.
A kísérletek mérési pontossági határain belül ezek az eredmények azt mutatják, hogy a 2,5 generációs PEI-acetát csillagpolimer 1 molekulája 2-3 fématomot képes kelátkötésbe vinni, aminek során oldható komplex képződik.
11. példa
Három-generációs 4-( izotiocianato-fenil)-metilénkarboxilát-végcsoportos poli(etilén-imin)-csillagpolimer konjugálása monoklón IgG antitesttel 10 mg (50 pmól) DD példa szerinti izotiocianát22
HU 209 252 Β terméket 500 μΐ 3 mM koncentrációjú, radioaktív IHInkloriddal jelzett indium-klorid oldatban oldunk, és az oldat pH-értékét 660 μΐ n nátronlúggal 9-re állítjuk. Ezután a teljes IgG CC-46 monoklón antitest alikvot mennyiségeit a kelátkötésű csillagpolimer alikvot részeivel elegyítjük. Az így kapott elegyeket alaposan összerázzuk, majd 18 órán át állni hagyjuk. Ezután az elegyeket HPLC-vel elemezzük (ehhez Du Pont Zorbax Biosphere GF-250 oszlopot alkalmazunk, és az eluálást 0,25 M nátrium-acetáttal, pH 6 mellett végezzük), UV-fénnyel (254 nm), valamint a radioaktivitás kimutatásával detektálunk. Eredményeinket a VI. táblázatban összegeztük.
VI. táblázat
Csillagpolimer-IgG konjugátumok
1 2 3 4
IgG oldat (pl) 20 20 20 20
Kelátkötésű csil- lagpolimeroldat (pl) 5 20 50 100
Radiokativitás % az IgG-n 6 5 5 3
Konjugált IgG% 2 7 17 22
12. példa
Három-generációs 4-( izotioclanato-fenil)-metilénkarboxilát-végcsoportos poli(etilén-imin)-csillagpolimer konjugálása monoklón IgG antitesttel 4 mg (20 pmól) DD példa szerinti izotiocianát-terméket 200 pl (60 pmól) 3 mM indium-klorid oldattal elegyítünk. Az oldatból kivett 20 pl alikvot részt radioaktív luIn-kloriddal jelezzük, majd a pH-értékét 30 pl n nátronlúg és 10 pl 0,1 n sósav hozzáadásával 9-re állítjuk. Az indium-kelátot 150 pl teljes CC-49 IgG antitesttel (10 mg/ml) 50 mM HEPES-pufferoldatban
9,5 pH-η elegyítjük. Az elegyet 18 órán át szobahőmérsékleten tartjuk, majd az antitestet preparatív HPLC kromatográfiával elkülönítjük (Du Pont Zorbax Biosphere GF 250 oszlopot és eluálószerként 0,25 M nátrium-acetátot alkalmazunk, 6-os pH mellett), 254 nm hullámhosszúságú UV-fénnyel és a radioaktivitás kimutatásával detektálunk. Az elkülönített antitestet Amicon membránon betöményítjük, és PBS-pufferral cseréljük (foszfáttal pufferolt konyhasóoldat, pH 7,4, amely 0,12 M nátrium-kloridot, 2,7 mM kálium-kloridot és 10,0 mM foszfátot tartalmaz). A visszanyert antitest fajlagos aktivitása megközelítőleg 0,5 pCi/100 pg.
13. példa niIn-nel jelzett csillagpolimer-antitest konjugátum
In vivő lokalizálása
A 12. példa szerint előállított, jelzett csillagpolimer-antitest konjugátum használhatóságát úgy mutattuk ki, hogy megmértük e termék felvételét csecsemőmirigyétől megfosztott egérbe átültetett emberi daganatszövet által.
Csecsemőmirigyüktől megfosztott nőstény egereket szubkután úton LS-174T emberi vastagbél-karcinómasejtekkel oltottunk (állatonként körülbelül 4xl06 sejtet oltottunk be). Az oltás után 2 héttel végeztük a befecskendezést az állatok farokvénájába. Ezt követően 17 és 48 órával az állatokat leöltük (mindegyik időpontban öt állatot öltünk le), a daganatot és kiválasztott szöveteket kimetszettük és megmértük, majd radioaktivitásukat gamma-számlálóban mértük. 17 óra elmúltával a szövet 1 g-jára számítva a befecskendezett dózis 13,5%-a a tumorban lokalizálódon; 48 óra után a szövet 1 g-jára számítva a befecskendezett dózis 21,6%-a lokalizálódott a tumorban.
14. példa
Herbicid hatású vegyületnek csillagpolimer felszínére való kötése
Harmadik generációs PAMAM-ot (ahol iniciátor magrészként NH3 szerepel) (2,0 g, 0,8 mmól) 10 ml vízben feloldunk és ehhez 20 ml toluolt adunk. A kétfázisú rendszert ezután keverjük, majd jégfürdőn lehűtjük, majd ezt követően 2,4 g 2,4-D-nek [(2,4-diklórfenoxi)-ecetsav], 10 ml toluollal készült oldatát 30 perc alatt fenti elegyhez csepegtetjük. Amikor az adagolás csaknem befejeződött, 0,5 g (12,5 mmól, 50 tömeg%os) nátrium-hidroxid-oldatot adunk az elegyhez, majd ezt további 2 óra hosszat keverjük. Ezt követően a reakcióelegyet szárazra betöményítjük, a visszamaradó szilárd anyagot kloroform/metanol 1:1 arányú elegyével többször felvesszük és szűrjük. Az így kapott barnás színű, szilárd termék nem oldódik teljes mértékben kloroformban és úgy tűnik vízben oldhatatlan; aceton hozzáadásával az oldódást elősegíthetjük. A barnás színű, szilárd terméket 24 óra hosszat kloroformban kevertetjük, majd az oldatot leszűrjük (barnás színű, ragadós terméket kapunk). A szűrletet magnézium-szulfáttal szárítjuk, majd betöményítjük, így viszkózus, narancs színű olajos terméket kapunk, amely állás közben megszilárdul. 13C-NMR vizsgálatot végezve a spektrumból megállapítható, hogy a felületen a 2,4-D-vel parciális amidálás ment végbe, a herbicid hatású 2,4-D vegyület a csillagpolimer felületére kötődött.
15. példa
2,4-Diklór-fenoxi-ecetsav (2,4-D) bezárása csillagpolimer dendrimerekbe
Annak ellenőrzésére, hogy egy adott vizsgálati molekula bezáródott-e a micella belsejébe, összehasonlítást végzünk a bezárt és a be nem zárt vegyület szén13-spin rács relaxációs idő (T,) értékének meghatározásával. A micellában bezárt anyag esetében a érték lényeges csökkenése mutatkozik, ez igazolja a molekulának a micellába való bezárását. Minthogy a csillag dendrimerek a micelláknak kovalensen rögzített analógjai, a Tj relaxációs idő mérését felhasználhatjuk annak ellenőrzésére, hogy a herbicid típusú molekulák milyen mértékben kötődnek a csillag poli-amidoaminszármazékokhoz. Az alább következő példáknál meghatározzuk a 2,4-diklór-fenoxi-ecetsav (I) (2,4-D) Tt értékét oldószerben (CDC13), majd ezt követően a Tj
HU 209 252 Β értéket meghatározzuk CDC13 oldószerben különböző mólarányok [I: dendrimer) esetében.
A 2,4-D bezáródása különböző csillag poli-amidoamin dendrimerekbe a generációs szám fügvényében
Különféle fél-generációjú csillag poli-amido-amin dendrimereket (észter zárócsoport, NH3-ból felépítve) [generáció (Gén) - 0,5, 1,5, 2,5, 3,5, 4,5 és 5,5] 2,4diklór-fenoxi-ecetsavnak (I) CDCl3-al készült oldatával elegyítünk, ahol a sav: tercier-amin arány 1; 3,5 és a sav: dendrimer mólarány 1:86, a VII. táblázatban megadottak szerint. A VIII. táblázatban tüntetjük fel a
2,4-diklór-fenoxi-ecetsav különféle szénatomjainak T, relaxációs idejét, valamint a 3,5 generációs számmal rendelkező csillag PAMAM dendrimer Tj értékét; mindkét esetben a sav/amin arány 1:1; a 2,4-D-ből telített oldat készül.
VII. táblázat
Gén (A) sav/amin (B) sav/amin (C) sav/összes nitrogén (D) mólarány (sav/csillag- polimer)
0,5 1 - 1 1
1,5 1 1,33 0,57 6
2,5 1 (3,5)* 1,11 (3,8)* 0,53 (1,8)* 9 (34)*
3,5 1 (3,0)* 1,05 (3,2)* 0,51 (1,6)* 20 (67)*
4,5 1,02 0,51 42
5,5 1,01 0,50 86
olyan példákat jelöl, ahol a 2,4-D molekulának a dendrimer belsejébe való bezáródása a sztöchiometrikusnál nagyobb mennyiségű
VIII. táblázat
2,4-D/G=3[5 PAMAM csillagpolimer Tt értéke Bezárásos komplex: koncentráció hatás
Szén (A) 1:1 (sav/amin) (B) 2,4-D-vel telített
T, 13C“ T, 13C“
1 3,19+0,12 (152,73) 3,08+0,09 (152,30)
3 0,34+0,01 (128,64) 0,29+0,01 (129,62)
5 0,38+0,01 (127,41) 0,32+0,01 (127,34)
2 3,28+0,08 (125,79) 2,72+0,68 (125,99
4 4,58+0,16 (123,27) 3,95+0,07 (123,16)
6 0,31+0,01 (114,66) 0,28+0,01 (114,48)
CH2 0,16+0,01 (67,29) 0,146+0,003 (66,79)
C=O 1,24+0,07 (170,12) - -
**jelentése 13C kémiai eltolódás a kloroformhoz képest 76,9 ppm-nél.
A táblázatban szereplő adatok azt mutatják, hogy a
2,4-diklór-fenoxi-ecetsavból sztöchiometrikusnál nagyobb mennyiségeket használhatunk {[(I): Gén = 3,5 dendrimer)] = 67 } anélkül, hogy a T, értéke emelkedne bármely esetben a telített állapotban [lásd az (A) és (B) oszlopot a VIII. táblázatban]. Valójában a Tj relaxációs idő értéke a (B) oszlopban kismértékben csökken, ami arra utal, hogy sztöchiometrikusnál nagyobb mennyiségű 2,4-diklór-fenoxi-ecetsav zárható be a dendrimer belső részébe. így például a mólarány [(I): Gén = 2,5 dendrimer] esetében 34; ezzel szemben a mólarány [(I):Gen=3,5 dendrimer]-nél =67.
[Lásd a VII. táblázat (D) oszlopát].
16. példa
Fluoreszcein-tartalmú csillagpor polimer előállítása
0,996 g 5-karboxi-fluoreszcein és 0,202 g polietilén-imin csillagpolimert (Gén=2,0; amin zárócsoport, NH3-ból felépítve) elegyítünk 10 ml metilén-kloriddal és 5 ml metanollal, az elegyet 10 percig visszafolyató hűtő alkalmazásával forraljuk. Az elegyet leszűrjük, így 0,37 g oldhatatlan vörös színű port kapunk (ez főleg el nem reagált 5-karboxi-fluoreszcenből áll). A szűrletből 0,4 g ragyogó vörös színű, szilárd terméket különítünk el, amelynek lágyuláspontja 98-103 °C, és élénkvörös színű, habszerű olvadékot képez 175-180 °C hőmérsékleten; a termék NMR-spektruma (D2O) igazolja, hogy a dendrimer felszínén fluoreszcein van kötve.
17. példa
A 16. példában leírtak szerint járunk el, polietilénimin csillag polimert (Gén = 2,0; amin zárócsoport, NH3 -ból felépítve) fluoreszcein-izotiocianáttal reagáltatunk, így fényes vörös, irizáló szilárd terméket kapunk, amely alkalmas arra, hogy fluoreszkáló jelző reagensként alkalmazzuk.
18. példa
R(+)-Limonénnek poliamido-amin csillagpor dendrimerbe való bezárása
5-50 tömeg% PAMAM dendrimer (móltömeg mintegy 175000; generáció=9,0) metanolos oldatát cseppenként R(+)-limonénnek metanolos oldatához csepegtetjük mindaddig, amíg az oldat telítetté nem válik. Ezt követően az oldatot szobahőmérsékleten (mintegy 25 °C) kevertetjük több órán keresztül, majd az oldatot Büchi-féle rotációs bepárlón szobahőmérsékleten betöményítjük; így szilárd terméket kapunk. A kapott anyagot 80 °C feletti hőmérsékletre melegítve oldószerben oldhatatlan terméket kapunk; így olyan termékhez jutunk, amely a R(+)-limonént tartalmaz bezárt állapotban. Az így kapott termék lassú ütemben adja le (R+)-limonént, így a kapott anyagot illatosítószerként vagy dezodorálószerként használhatjuk fel.
19. példa
Poliamido-amin csillag dendrimerbe bezárt nehézfémsók
PAMAM csillag polimer dendrimerből vízzel készült 5-50 tömeg%-os oldatot (a dendrimer móltömege mintegy 350 000; generáció = 10,0) keverünk és ehhez az oldathoz ólom-acetát [Pb(C2H3O2)2] telített oldatát csepegtetjük. Az oldatot szobahőmérsékleten (mintegy 25 °C) több óra hosszat keverjük, majd Büchi-féle ro24
HU 209 252 Β tációs bepárlón az oldatot betöményítjük; így szilárd terméket kapunk. A kapott terméket transzmissziós elektronmikrográffal vizsgálva azt találjuk, hogy a fémsók a dendrimer belsejébe vannak bekapszulázva. A nehézfémsókat tartalmazó réteget alkalmazhatjuk pajzsként az elektromágneses sugarak abszorbciójához.
20. példa
Vízzel oldható fluoreszcein festék kapszulázása poliamido-amin csillagpolimer dendrimerben PAMAM csillag polimer dendrimerből (móltömeg mintegy 175 000; generáció = 9,0) víz és metanol segítségével 5-50 tömeg% koncentrációjú oldatot készítünk, az oldathoz keverés közben fluoreszcein-dinátriumsót (Acid Yellow 73, Cl. 45330; Uranine; előállító Aldrich, Chemical Co., Milwaukee, WI) adagolunk, amíg az oldat telítetté nem válik. Ezt követően az oldatot szobahőmérsékleten (mintegy 25 °C) több óra hosszat keverjük, majd szobahőmérsékleten az oldószert elpárologtatjuk; így színes, szilárd terméket kapunk. Ezt a bezárt festéket tartalmazó dendrimert referencia anyagként alkalmazhatjuk az ultraszűréshez használt membránok kalibrálására.
21. példa
Fluoreszkáló zárócsoportot tartalmazó dendrimerek előállítása
A) Amin zárócsoportot tartalmazó dendrimernek
N-dansil-aziridinnel való reakciója
1,5 g (Ι,όχΙΟ-3 mól) polietilén-imin (PEI) csillagpor polimert [G=3,0, zárócsoport (Z) 12 móltömeg= 920] 20 ml metanolban feloldunk. Az oldathoz keverés közben 0,884 g (3,84xl0-2 mól) N-dansil-aziridin (ICN Biomedicals, Costa Mesa, CA) tartalmú oldatot csepegtetünk mintegy 20 perc alatt. A eakcióelegyet ezután 1 éjszakán át szobahőmérsékleten tovább kevertetjük. Az oldószert vákuumban eltávolítva szilárd termékhez jutunk. A kapott anyagot NMR és infravörös vizsgálatnak alávetve azt tapasztaltuk, hogy a dendrimer felületére kovalens kötéssel dansilcsoportok [5-(dimetil-amino)-l-naftalinszulfonsav] kötődnek.
B) Zárócsoportként amincsoportot tartalmazó dendrimereknek dansil-kloriddal való reakciója 1,0 g (1,9x1 CT4 mól) poliamido-amin csillag polimert [ammóniából indítva, G=4,0, zárócsoport (Z) = 24, móltömeg = 5147] 30 ml vízben feloldunk, az oldatot egy háromnyakú lombikba visszük, ehhez 80 ml toluolt adunk, majd az elegyhez jeges hűtés közben 1,23 g (4,5xl0“3 mól) dansil-kloridot (5-dimetil-amino-l-naftalin-szulfonil-klorid, előállító Aldrich Chemical Co., Milwaukee WI) tartalmazó 40 ml toluolos oldatot csepegtetünk. Egyidejűleg a reakcióelegyhez 13,3 mól (10% felesleg) 10%-os nátrium-hidroxidoldatot adagolunk, így egy olajos gombolyagot kapunk. A kapott terméket vízzel mossuk, metanolban feloldjuk, majd dietil-éterrel lecsapjuk. így szilárd termékhez jutunk. Az NMR és infravörös vizsgálat szerint a dansilcsoportok a dendrimer felületén kovalens kötéssel kötődnek.
22. példa
Mangán-tartalmú PAMAM csillagpolimer előállítása
A 4587329 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás 1. példája szerint eljárva zárócsoportként észtercsoportot tartalmazó harmadik generációs poliamido-amin csillagpolimert állítunk elő. A csillag polimert 0,1 n nátrium-hidroxid-oldatban feloldva az észtercsoportokat hidrolizáljuk, így nátriumsót kapunk. 131 mg (0,496 mmól) nyers nátriumsót 1 ml
11,4 pH értékű vízben feloldunk, majd semlegesítjük; ehhez 0,5 n HCl-oldatot használunk, a pH-t 7,0 értékre állítjuk be. A semlegesített oldathoz 26 mg (2 ekv.) mennyiségű MnCl2x4 H2O-t adunk, majd az oldatot 2 napig 55 °C hőmérsékleten tartjuk. A kapott halványsárga színű oldatot tisztítjuk, ehhez Bio-Gel P2-vel töltött oszlopot (15,0 g, 150 mm magasság, 25 mm átmérő) használunk, vízzel eluálunk, majd a színes sávot tartalmazó oszloprészt elkülönítjük. A kapott termék kloridtól mentes (mint például nátrium-klorid) a vizsgálathoz ezüstnitrátot használunk. Az eluátumot szárazra bepároljuk, így tiszta gélt kapunk, amit nagyvákuumban szárítunk; 45 mg cím szerinti csillag polimer komplexet kapunk, amelynek összetétele a következő: [NaMn2H7][C69H105N19O33],
Elemanalízis fenti képletre:
Na Mn C Η N számított: 1,23; 5,88; 44,35; 5,66; 14,24;
talált: 1,42; 4,80; 43,33; 7,91; 14,72.
Fentiek szerint eljárva, de kiindulási anyagként egy hetedik generációs nátrium-karboxilát zárócsoportot tartalmazó poliamido-amin csillag polimert alkalmazva egy további mangán-tartalmú csillag polimert kapunk, amely a következő összetételt mutatja: [Na30H354] [Mn,0C3057H4965N763O,149],
Fenti képletre számított elemanalízis:
Mn C Η N számított: 0,759; 50,72; 7,41; 14,76; talált: 0,72; 46,34; 7,91; 14,72.
A fentiek szerint kapott komplexek relaxációját vízben mérjük, az eredményeket a IX. táblázat foglalja össze, összehasonlítás céljából a fenti mangán komplexek relaxációs értékeit két ismert komplexképző szernél mért értékkel hasonlítjuk össze; a relaxációs időket mágneses magrezonanciánál mért értékekből számítjuk. Az eredményeket a IX. táblázat foglalja össze.
IX. táblázat
Vegyület Relaxáció*
Rt Ra
MnCl2 5,2 >20
MnEDTA 2,9 -
MnDTPA 1,3 -
Mn2[PAMAM- A(2,5G) 3,63±0,02 16,35+0,78
* (mM sec)’1, 37 °C, 90 MHz fématomokra kapott értékek
HU 209 252 Β
23. példa
A 22. példában leírtak szerint eljárva állíthatjuk elő a csillag polimerek vas komplexeit. Az egyik megoldás szerint egy hatodik generációs poliamidoamin savas származékának nátriumsóját úgy állítjuk elő, hogy a poliamido-amin észterét (a 4587 329 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás szerint, feleslegben lévő reagenssel előállítva) 1 n nátrium-hidroxid-oldatban feloldjuk. Ezután 97 mg (2,4xl0-3 mmól) nátriumsót 2 ml vízben feloldunk, majd a 11,3 pH értékű oldatot 0,5 n sósavval semlegesítve a pH-t 7,0 értékre állítjuk be. Ehhez a semlegesített oldathoz FeCl3 (0,102 mól, pH= 1,4; 0,5 ml; 0,051 mmól; 21,6 ekv.) vizes oldatát adjuk. 4,9 pH értékű sötét, narancssárga színű oldatot kapunk, az oldatot 23 óra hosszat, 55 °C hőmérsékleten tartjuk. Ezt követően az oldatot szobahőmérsékletre lehűtjük majd kromatográfiát végzünk ehhez Biogel P2 oszlopot (175x25 mm), használunk. A naracssárga színű eluátumot vákuumban 50 °C hőmérsékleten szárazra betöményítjük; így 45 mg narancssárga színű szilárd terméket kapunk, amelynek összetétele: [Na5H127][Fe20(PAMAM-P(6,5G))]; a képletben a PAMAM-P megjelölés poliamido-amin csillag polimert jelöl, amelyben zárócsoportként propionát található. A naracssárga színű termék vas komplexet képez; a poliamido-amin csillagpor komplex képlete: Na5H 127Fe20(C 1521H2469N379O573)
A fenti képletre az elemanalízis adatai:
Na Fe C H N
számított: 0,31; 3,05; 49,84; 7,30; 14,48;
talált: 0,31; 3,12; 47,11; 7,33; 14,81.
A fentiek szerint eljárva állíthatunk elő további
acetát zárócsoportot tartalmazó poliamido-amin csillagpolimer-vas-komplexeket és acetát zárócsoportot tartalmazó polietilén-imin csillag polimereket, ahol kiindulási anyagként 2-6. generációs polimereket használunk. Az előállított komplexek relaxációs idejét mágneses magrezonancia vizsgálattal állapítjuk meg és ebből a megfelelő relaxációs értékeket kiszámítjuk. Az adatokat a X. táblázat foglalja össze.
Vegyület Relaxáció*
Re5CH50[PAMAMP(7,5G)] kb. 0,3** kb. 62**
(SPEI- [DTPA][Fe(DTPA)]2) l,04±0,050 l,70±0,02
* (mM sec) 37 °C, 90 MHz; fématomokra kapott értékek ** a komplexre kapott értékek
24. példa
A 22. példában leírtak szerint eljárva állíthatjuk elő a poliamido-amin és polietilén-imin csillag polimerek gadolínium komplexeit; (a polimerek előállítása a 23. példában megadottak szerint); a mért relaxációs idő és az ebből számított relaxáció értékek a XI. táblázatban vannak bemutatva. A gadolínium komplex előállításánál úgy járunk el, hogy 0,40 g (0,16 mmól) polietilén-imin csillag polimer nátrium-acetátját (második generáció, a 4587 329 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás 6. példája szerint előállítva, majd felesleges mennyiségű bróm-ecetsavval 9 pH-η és 40 °C hőmérsékleten reagáltatva) 5 ml vízben feloldjuk. Az oldat pH-ját 0,5 n sósavoldat segítségével 9,2re állítjuk,majd az oldathoz 3,2 ml GdCl3 vizes oldatot (0,31 mmól) adunk. Az oldat pH-értéket n nátriumhidroxid-oldattal 4,1-ről 8,3 értékre állítjuk, majd az oldatot 24 óra hosszat állni hagyjuk. Az oldatból az illékony komponenseket vákuumban eltávolítjuk, majd a maradékot chelex gyantán kétszer kromatografáljuk. Halványsárga színű szilárd terméket kapunk, ahol a Gd és N atomaránya 2:1. Elemanalízis mért értékek %-ban:
C 14,5; H 2,1; N3,6; Gd7,9, Br28,7.
Fentiek szerint eljárva állíthatunk elő további komplexeket, amelyek gadolíniumból és acetát zárócsoportot tartalmazó poliamido-amin csillag polimerből vagy acetát zárócsoportot tartalmazó polietilénimin csillag polimerből állnak (a polimerek 2-6. generációsak). A kapott komplexek relaxációs idejét mágneses magrezonancia segítségével mérjük majd a mért értékekből a megfelelő relaxációs értékeket számítással nyerjük; a kapott eredményeket a XI. táblázat foglalja össze.
X. táblázat
Vegyület Relaxáció*
Rí r2
FeCl3 8,4±0,l -
FeEDTA 1,7 -
FeDTPA 0,73 0,85
FeEHPG 0,95 1,1
Fe2(PEI-A(2,5G)] 0,40±0,02 0,88+0,03
Fe2[PAMAM-A(2,5G)] 0,77±0,01 -
Fe2[PAMAM-P(2,5G)] 0,135±0,004 0,42±0,02
Fe4[PAMAM-P(4,5G)] 0,038+0,006 l,01±0,05
Fe20[PAMAM-P(6,5G)] 0,047±0,007 0,50+0,07
XI. táblázat
Vegyület Relaxáció*
Rí
Gd(NO3)3 8,6±0,3
Gd Cl3(0,15M szalin) 8,7±0,l
GdEDTA 6,5
GdDTPA 3,9
GdDOTA kb. 4
Gd(PAMAM-A) 9,90±0,43
Gd2(PAMAM-A) 13,00+0,33
Gd(PEI-A) 8,85±0,19
HU 209 252 Β
Vegyület Relaxáció*
Ri
Gd2(PEl-A) 15,35+0,17
Gd2(PEI-A)+3PEI-A 8,0±0,19
Gd(DTPMP) 10,8±0,4
Gd2(PEI-A) +2EDTA kb. 6
* (mM sec) 37 °C, 90 MHz fématomokra kapott értékek
25. példa
Poliamido-amin csillagpoUmernek bradikinin Cvel képzett konjugátuma
4,7 mg bradikinin potenciátort (előállító: Sigma Chemical Company) 90 μΐ N-metil-pirroIidinonban (NMP) felveszünk, ahol az NMP 7,1 mg/ml N-hidroxibenzotriazolt (HOBT) tartalmaz; az elegyhez 33 μΐ frissen előállított diciklohexil-karbodiimid (DCC) (28 mg/ml NMP) oldatát adjuk. Az elegyet 4 óra hosszat szobahőmérsékleten tartjuk, majd ehhez 60 μΐ ötödik generációs (5G) PAMAM-nak NMP-oldatát (13,4 mg/ml) adjuk. A PAMAM-ot és bradikinint tartalmazó elegyet 72 óra hosszat szobahőmérsékleten tartjuk, majd 1,5 ml (17 mmól) ecetsavat adunk hozzá. Az elegyet centrifugáljuk, az oldatot a szilárd anyagról dekantáljuk, majd a szilárd anyagot 1,5 ml híg ecetsavval mossuk. Az oldatot és a mosóiét egyesítjük, majd szűrjük; a szűréshez 25 mm PTFE 0,45 μ fecskendőszűrőt használunk. Az el nem reagált pepiidet, HOBT-t és oldószert a konjugátumtól elválasztjuk, ehhez ultraszűrést végzünk két Centricon-10 mikrokoncentrátor segítségével. A konjugátumot 2 ml (17 mmól-os) ecetsavval, majd 2 ml PBS pufferral mossuk. A konjugátumot 450 μΐ retentátummal felvesszük, majd 750 μΐ friss PBS pufferral meghígítjuk.
A konjugátumot tartalmazó oldatból 4 alikvot részt kiveszünk, ezt tömény sósavval 0 °C hőmérsékleten mintegy 20 óra hosszat hidrolizáljuk; az elegyet ezután glutaminsavtartalomra vizsgáljuk. A glutaminsavat o-ftalaldehid/2-merkapto-etanol-származék formájában határozzuk meg, a művelethez reverz fázisú magasnyomású folyadékkromatográfiát végzünk, fluoreszkáló detektort alkalmazva. (Oszlop: Whatman Partisii 5CCS/C8, 10 cm; Gilson Spectra/Glo detektor; belső standardként tirozint használunk; eluálószerként 50 mmól nátrium-acetát és metanol szolgál; gradiens: 12-30% metanol 5 perc alatt, majd 1 percig 30%, majd a metanol-tartalmat mintegy 14 percig 80%-ra növeljük, majd 5 percig 80%-on tartjuk.) Az o-ftálaldehid-származékot oly módon állítjuk elő, hogy 25 μΐ aminosav-oldatot 50 μΐ fluor-aldehid™ o-ftál-aldehid reagens oldattal (előállító: Pierce), elegyítjük, az elegyet 1 percig kevertetjük, majd 0,05 ml PBS pufferral (sótartalmú foszfát puffer, 120 mmól nátrium-klorid, 2,7 mmól kálium-klorid, 10 mmól foszfát puffer só, pH 7,4) meghígítjuk. A konjugátum 25 μΐ alikvotjában 58 nmól glutamin savat találtunk. Ez megfelel 1,74 pmól, konjugátumhoz kötött bradikinin C-nek.
26. példa
PoUamido-amin csillagpolimer konjugátum képzése BOCPheLeuPhe-vel
4,1 mg N-terc-butoxi-karbonil-L-fenil-alanil-D-leucil-L-fenil-alanil-D-leucil-L-fenil-alanint (BOCPheLeuPheLeuPhe) (előállító: Sigma Chemical Company) 100 μΐ NMP-vel (amely 7,1 mg/ml HOBT-t tartalmaz) felveszünk, majd az elegyet 30 μΐ frissen készült DCCnek (36 mg/ml) NMP-vel készült oldatával elegyítjük. Az elegyet 90 percig szobahőmérsékleten tartjuk, majd 60 μΐ 5G PAMAM-nak NMP-vel (13,4 mg/ml) készült oldatát adjuk. Az elegyet 72 óráig szobahőmérsékleten tartjuk, majd a keletkezett konjugátumot a 24. példában leírtak szerint különítjük el. A konjugátumot 750 μΐ retentáttal vesszük fel.
A konjugátumból 4 alikvot részt koncentrált sósavval hidrolizálunk, a műveletet 115 °C hőmérsékleten, 20 óra hosszat végezzük; a kapott elegyet fenil-analin tartalomra vizsgáljuk. A fenil-alanin tartalmat o-ftálaldehid/2-merkapto-etanol-származék formájában határozzuk meg; a műveletet fordított fázisú, magasnyomású folyadékkromatográfia segítségével végezzük fluoreszkáló detektort alkalmazva (a magasnyomású kromatográfia körülményeit a 24. példában ismertettük; jelen esetben az eltérés annyi, hogy eluens gradiensként 20 percig 12-80% metanolt, majd 5 percig 80% metanolt használunk). Az o-ftálaldehid-származékot a 24. példában leírtak szerint állítjuk elő. A konjugátum 25 μΐ alikvot részében 26 nmól fenil-anilint találtunk. Ez megfelel 0,26 pmól, konjugátumhoz kötött BOCPheLeuPheLeuPhe-nek.
27. példa l,4,7-trisz-(karbometoxi-metil)-l,4,7,10-tetraazaciklododekánnak (DO3A metil-észter) metanolos oldatához 1,0 ekvivalens frissen előállított vízmentes nátrium-metoxidot adunk, majd az oldatot néhány óra hosszat keverjük. Ehhez az oldathoz 1 ekvivalens 10,11-epoxi-undekánsavat adunk, majd az oldatot visszafolyató hűtő alkalmazásával egy éjszakán át forraljuk. Az oldószert ezt követően vákuumban eltávolítjuk, így nyers l,4,7-trisz-(karbometoxi-metil)-10-[2’hidrox-10’-karboxi(decil)]-l,4,7,10-tetraazaciklododekánt kapunk. A kapott termékből 2-5 ekvivalenst dimetil-formamidban (DMF) feloldunk, majd az oldathoz azonos ekvivalens mennyiségű diciklohexil-karbodiimidet (DCC) és N-hidroxi-szukcinimidet adunk, majd az elegyet 1 éjszakán át kevertetjük. Az így kapott oldathoz 1 ekvivalens második generációjú PAMAMot adunk, majd a keverést 24 óráig tovább folytatjuk. A megfelelő DO3A metil-észter-konjugátumot vizes nátrium-hidroxid metanolos oldatával szelektíve hidrolizáljuk. A DO3A konjugátumot felesleges mennyiségű gadolínium(III)-acetáttal [Gd(OAc)3] (pufferral pH 6 értékre állítva) kezeljük, majd az elegyet felesleges mennyiségű dietilén-triamin-pentaecetsavval (DTPA) inkubáljuk; a konjugátumot ezután fordított fázisú, magasnyomású folyadékkromatográfia segítségével tisztítjuk; ily módon hidroxi-etil DO3A PAMAM csillag polimer konjugátumot kapunk, amely 2-5 ekvivalens
HU 209 252 Β gadolíniumot tartalmaz, ami felesleges mennyiségű DTPA-val sem távolítható el.
28. példa
Egy második generációjú PAMAM vizes oldatához, ahol a pH-t puffer segítségével 9,0 értékre állítottuk be, 2-5 ekvivalens l-[l-karboxi-3(4’-izotiocianáto-fenil)propil]-4,7,l0-trisz(karboxi-metil)-l,4,7,10-tetraazaciklododekánt adunk (e vegyületet a 0 353 450 számú közzétett európai szabadalmi bejelentésben állítottuk elő, közzététel napja: 1990. február 7.). Az oldatot 1 éjszakán át szobahőmérsékleten keverjük. Az oldathoz felesleges mennyiségű Gd(OAc)3-t adunk 6,0 pH értéken. Ily módon tiokarbamidhoz kapcsolódó DOTA PAMAM csillag polimert kapunk, amely 2-5 ekvivalens, belsőleg megkötött gadolíniumot tartalmaz, amely DTPA segítségével sem távolítható el.
29. példa
IgGIFITC I dendrimer konjugátum
A) Fluoreszcein-izotiocianáthoz kötött PAMAM dendrimer előállítása
Nyolcadik generációjú PAMAM dendrimer metanolos oldatából 2,2 ml-t kiveszünk, ezt vákuumban rotációs bepárlón beszárítjuk. Mintegy 300 mg (7,4 pmól) szárított dendrimert ebből gyorsan kiveszünk és 1 ml ionmentes vízben feloldunk; így dendrimer törzsoldatot készítünk. 60 mg/ml oldatot készítünk oly módon, hogy 200 μΐ dendrimer törzsoldatot 800 μΐ ionmentesített vízhez adunk. A 60 mg/ml koncentrációjú oldathoz 5 ml 0,1 mól 9 pH értékű foszfát puffért adunk, így 10 mg/ml végső dendrimer koncentrációjú oldatot készítünk. 3 ml végső dendrimer oldatot 3,5 gos edénybe viszünk (30 mg, 0,13 pmól).
mg fluoreszcein-izotiocianátot (FITC I, Molecular Probes), 1 ml dimetil-szulfoxidban oldunk fel elsötétített szobában. 200 pl (2,57 pmól) fluoreszcein-izotiocianát-oldatot adunk keverés közben a dendrimer-oldathoz. A reakció, elegyet fénytől védjük és 15-20 óra hosszat szobahőmérsékleten keverjük. Az oldat tiszta és sárgás színű marad.
A reakcióelegyet keverés után Centricon™ mikrokoncentrátor csövekbe helyezzük (molekulasúly levágás: 10000 daltonnál), ultracentrifugálást végzünk, így az el nem reagált FITC I-et eltávolítjuk. Az ultraszűrés közben 2 ml, 0,1 mól foszfát puffer (pH =9,0) hozzáadásával megkönnyítjük a tisztítást. Az ultraszűrést vékonyréteg kromatográfiás vizsgálattal követjük, ily módon ellenőrizzük, hogy az el nem reagált FITC I teljes mértékben el van távolítva. A vékonyréteg kromatográfiához 60 jelzésű szilikagél lemezt (Merck) használunk, oldószer rendszerként etil-acetát (100%) szolgál. A jelzett dendrimer a kiindulási ponton marad, a megmaradt FITC I egészen Rf=0,7-ig eluálódik. A tisztítás után mintegy 2 ml konjugált nyolcas generációjú PAMAM dendrimer-FITC I-et különítünk el.
B) Fluoreszcein-izotiocianáttal és IgG-vel konjugált PAMAM dendrimer
9,8 mg nyúltól származó immunglobulint (előállító IgG, Sigma Chemical Co.) 1 ml 30 mmól-os nátriumacetát és 150 mmól-os nátrium-klorid-puffer-oldat (pH=5,5) elegyében feloldunk. Az IgG-t tartalmazó oldathoz mérsékelt keverés közben 1,5 mg nátriumperjodátot adunk, a keverést mindaddig folytatjuk, amíg a perjodát fel nem oldódik. Az elegyet fénytől védjük és szobahőmérsékleten 15-18 óra hosszat enyhén keverjük. Ezt követően a reakcióelegyet két Centricon™ mikrokoncentrátor-csőbe helyezzük (a móltömeg 10000 daltonnál van levágva), majd az elegyet 20 mmól 6 pH értékű puffer oldattal ultraszűrésnek vetjük alá (4x2 ml). A tisztítás után mintegy 1-2 ml IgG dialdehid-oldatot kapunk.
Az A) lépésből származó jelzett dendrimer-FITC I oldatból (0,88 ml, 17,6 mg, 0,075 pmól) alikvot részt veszünk ki és ezt az IgG dialdehid-oldathoz csepegtetjük. (így a jelzett dendrimemek az antitesthez való aránya 1,15:1.) A jelzett dendrimer-oldat első cseppjének hozzáadásakor a reakcióelegyben csapadékképződés figyelhető meg. Az elegyhez további 3 ml 20 mmól-os foszfát-puffer-oldatot (pH=6,0) adunk, de ez sem szolubilizálja a csapadékot.
A keletkezett IgG/dendrimer-FITC I konjugátumot fénytől védjük, majd szobahőmérsékleten, 1 óra hoszszat keverjük. Ezen idő eltelte után az elegyhez 1,7 mg nátrium-ciano-bór-hidridet adunk, majd a reakcióelegyet szobahőmérsékleten, 1 éjszakán keresztül (15-20 óra) keverjük. Fluoreszkáló narancssárga színű oldatot kapunk némi csapadékkal. A reakcióelegyet - beleértve a csapadékot is - két Centricon™ mikrokoncentrátor-csőbe (a móltömeg elválasztás 100000 daltonnál van) visszük, majd ultraszűrést végzünk. A meg nem kötött dendrimer-FITC I eltávolítására 6x2 ml 20 mmól-os, 6 pH értékű foszfát-puffer-oldatot használunk fel. Az előállított IgG /dendrimer-FITC I konjugátumot elkülönítjük, barna színű üvegedénybe visszük és -10 °C hőmérsékleten tároljuk.
30. példa
IgG/dendrimer-dansil konjugátum előállítása
A) Nyolcadik generációjú PAMAM dendrimer-dansil konjugátum előállítása A 29A) példa szerint előállított dendrimer törzsoldatból 200 pl-t veszünk ki, ehhez 800 pl ionmentesített vizet adva 60 mg/ml koncentrációjú oldatot készítünk. Ehhez 5 ml 0,1 mól-os foszfát puffért (pH=9,0) adva 10 mg/ml végső dendrimer koncentrációjú oldatot készítünk.
13,9 mg dansil-kloridot (0,052 mmól, előállító Aldrich Chemical Co.) adunk 5 ml acetonhoz, az elegyet 5-10 percig rázzuk. (Az oldat sötétsárga színű és nyomokban szilárd anyagot tartalmaz.) A dansil-klorid-oldatot 30 másodperc alatt a dendrimer oldathoz adagoljuk, majd a reakcióelegyet tartalmazó lombikot 40 °C hőmérsékletű vízfürdőre helyezzük 90 percig. A felmelegedés alatt a reakcióelegyet időnként összerázzuk. A reakcióelegy kismértékben ködössé válik, a sötétsárga szín halványsárgára változik. 90 perc eltelte után a reakcióelegyet a vízfürdőről levesszük és hagyjuk szobahőmérsékletre lehűlni. Ezt követően a reakcióelegyet rotációs bepárlóra helyezzük, vákuumban 30-35 °C
HU 209 252 Β hőmérsékleten az acetont eltávolítjuk. A reakcióterméket két Centricon™ mikrokoncentrátor-csőbe visszük (a móltömeget 100000 daltonnál választjuk el), majd ultraszűrést végzünk, így a meg nem kötött dansil-kloridot eltávolítjuk. Az ultraszűrés során 10x2 ml foszfátpufferoldatot (0,1 mól, 9,0 pH) adunk az elegyhez.
Az ultraszűrés eredményességét vékonyréteg kromatográfiával ellenőrizzük, vizsgáljuk az el nem reagált dansil-klorid teljes eltávolítását. A vékonyréteg kromatográfiás vizsgálathoz 60-as szilikagél lapokat (Merck) használunk, oldószer rendszerként etil-acetát (100%) szolgál. (A kromatogramot ultraibolya fénnyel tesszük láthatóvá.) A jelzett dendrimer a kromatogram induláspontján marad, az el nem reagált dansil-klorid mintegy Rf=0,3 értékhez eluálódik. A tisztított elegyből mintegy 1-2 ml, 8,0 generációjú konjugált PAMAM dendrimer-dansilt különítünk el.
B) Dansillal és IgG-vel konjugált PAMAM dendrimer előállítása
9,8 mg nyúltól származó immunoglobulint (IgG, előállító Sigma Chemical Co.) 1 ml 30 mmól-os nátrium-acetát és 150 mmól-os nátrium-klorid-puffer-oldat (pH = 5,5) elegyében feloldunk. Az IgG-t tartalmazó oldathoz enyhe keverés közben 1,5 mg nátrium-perjodátot adunk, a keverést addig folytatjuk, amíg a perjodát fel nem oldódik. Az elegyet fénytől védjük és szobahőmérsékleten 15-18 óra hosszat óvatosan keverjük. A keverés befejezte után a reakcióelegyet két Centricon™ mikrokoncentrátor-csőbe visszük (a móltömeg elválasztás 100000 daltonnál van), és 20 mmólos 6 pH értékű foszfát-puffer-oldatba ultraszűrést végzünk (4x2 ml). A tisztítást követően mintegy 1,9 ml IgG-dialdehid-oldatot különítünk el.
Az A) lépésből származó jelzett dendrimer-dansiloldatból 1,25 ml-t (14,1 mg/ml) csepegtetünk a fenti IgG-dialdehid-oldathoz. (A jelzett dendrimemek az antitesthez viszonyított aránya 1,15:1.) Az első csepp jelzett dendrimer-oldat hozzáadásakor a reakcióelegyben csapadék képződik.
Az IgG/dendrimer-dansil konjugátumot fénytől védjük és szobahőmérsékleten 1 óra hosszat keverjük. Ezen idő eltelte után 1,7 mg nátrium-ciano-bór-hidridet adunk az elegyhez, majd 1 éjszakán át (15-20 óra) szobahőmérsékleten keverjük. A reakcióelegyet - beleértve a csapadékot is - két Centricon™ mikrokoncentrátor-csőbe visszük (100000 daltonnál végezve a móltömeg elválasztást) és ultraszűrést végzünk. A meg nem kötött dendrimer-dansil eltávolítására 6x2-2 ml térfogatú 20 mmól-os, 6 pH értékű foszfát-puffer-oldatot adunk az elegyhez. A keletkezett IgG/dendrimerdansil konjugátumot elkülönítjük és barna színű üvegedénybe visszük, majd -10 °C hőmérsékleten tároljuk.
31. példa
HRP-vel és IgG-vel konjugált PAMAM dendrimer előállítása
A) IgG-vel konjugált PAMAM dendrimer
9,6 mg nyúltól számlázó immunoglobulint (IgG, előállító Sigma Chemical Co.) 1 ml 30 mmól-os nátrium-acetát és 150 mmól-os nátrium-klorid-puffer-oldat (pH=5,5) elegyében feloldunk. Az IgG oldathoz
1,5 mg nátrium-perjodátot adunk enyhe keverés közben, amíg a perjodát fel nem oldódik. A reakcióelegyet fénytől védjük és szobahőmérsékleten 15-18 óra hosszat enyhén keverjük. A keverés befejezése után a reakcióelegyet két Centricon™ mikrokoncentrátorcsőbe visszük (a móltömeg elválasztás 100000 daltonnál van), majd 20 mmól-os foszfát-puffer-oldattal (pH=6,0) ultraszűrjük (4x2 ml). A tisztítási művelet után mintegy 1,5 ml IgG-dialdehid-oldatot különítünk el.
A 29. példa A) lépése szerint előállított dendrimer törzsoldatból 100 μΐ-t kiveszünk, ezt 100 μΐ ionmentesített vízhez adjuk, így 150 mg/ml koncentrációjú oldatot kapunk. 100 μΐ dendrimer oldatot 900 μΐ ionmentesített vízzel meghígítva 15 mg/ml végső koncentrációjú oldatot állítunk elő. Ebből a végső koncentrációjú dendrimer oldatból 1 ml-t csepegtetünk az IgG-dialdehid-oldathoz, majd az elegyet szobahőmérsékleten, 1 óra hosszat keverjük. Ekkor csapadék képződik. Az 1 órás keverés eltelte után 1,7 mg nátrium-ciano-bórhidridet adunk a reakcióelegyhez, majd az elegyet szobahőmérsékleten, 1 éjszakán át (15-20 óra hosszat) keverjük. A reakcióterméket - ideértve a csapadékot is két Centricon™ mikrokoncentrátor-csőbe visszük (a molekulatömeg elválasztás 100000 daltonnál van), majd ultraszűrést végzünk. Az esetleg jelen lévő, meg nem kötött dendrimer-IgG eltávolítására 4x2 ml, 20 mmól-os foszfát-puffer-oldatot (pH=6,0) adunk az ultraszűrésnek alávetett elegyhez. A keletkezett IgG/dendrimer konjugátumot elkülönítjük és 3,5 g-os üvegedénybe visszük.
B) PAMAM dendrimerllgG-HRP konjugátum előállítása
2,6 mg torma-peroxidázt (HRP, előállító Pierce) 0,5 ml ionmentesített vízben feloldunk, így HRP oldatot állítunk elő. 10,7 mg nátrium-perjodátot 5 ml 10 mmól-os nátrium-foszfát-oldatban (pH=7,0) oldunk fel. Mintegy 1,6 ml perjodát-oldatot adunk a HRP-oldathoz szobahőmérsékleten. Az enzimet tartalmazó reakcióelegyet fénytől védjük és szobahőmérsékleten 30 percig gyengén keverjük. Az oxidált HRP terméket két Centricon™ mikrokoncentrátor-csőbe viszszük (a móltömeg elválasztást 100000 daltonnál végezzük), majd ultraszűrést végzünk. A művelet során 4x2 ml, 30 mmól-os nátrium-acetát/150 mmól nátrium-klorid-puffer (pH = 5,5) elegyet adunk a rendszerhez.
Az oxidált enzim-oldatot keverés közben a PAMAM dendrimer-IgG konjugátum elegyhez adjuk. Noha reakcióelegyben a csapadék megmarad, az elegyet szobahőmérsékleten, 2 óra hosszat keverjük. A 2 óra eltelte után 2,1 mg nátrium-bórhidridet 1 ml ionmentesített vízben feloldunk, az így kapott oldatból 100 μΐ-t a PAMAM dendrimer-IgG-HRP elegyhez adunk. A reakcióelegyet 2-8 °C hőmérsékleten, 1 éjszakán át (15-20 óra hosszat) keverjük.
A reakció során keletkezett terméket - ideértve a csapadékot is - két Centricon™ mikrokoncentrátorcsőbe visszük (a molekula tömeg elválasztást
HU 209 252 Β
100000 daltonnái végezzük), majd ultraszűrést végzünk. A művelet során 4x2 ml térfogatú foszfát-pufferoldatot (20 mmól, pH= 6,0) adunk a rendszerhez. A keletkezett IgG/dendrimer/HRP konjugátumot elkülönítjük és 3,5 g-os üvegedényben tároljuk -10 °C hőmérsékleten.
52. példa
IgG/dansilezett PAMAM dendrimer/HRP kojugátum előállítása
A) HRP-oldat előállítása
2,6 mg torma-peroxidázt (HRP, előállító Pierce) 0,5 ml ionmentesített vízben feloldunk, így HRP-oldatot készítünk. 10,7 mg nátrium-perjodátot 5 ml nátrium-foszfát-oldatban (10 mmól, pH=7,0) feloldunk.
Mintegy 1,6 ml perjodát oldatot szobahőmérsékleten fenti HRP-oldathoz adunk. Az enzim-tartalmú reakcióelegyet fénytől védjük, és 30 percig szobahőmérsékleten, gyengén keverjük. Az oxidált HRP terméket két Centricon™ mikrokoncentrátor-csőbe visszük (a móltömeg elválasztást 10000 daltonnál végezzük), majd ultraszűrést végzünk. A művelet során 4x2 ml nátrium-acetát (30 mmól) nátrium-klorid-puffer-oldat (150 mmól, pH=5,5) elegyet adunk a rendszerhez. Az oxidált enzim-oldatot elkülönítjük és 3,5 g-os üvegedényben tároljuk.
B) Harmadik enerációs PAMAM dendrimer-dansiloldat előállítása ml, harmadik generációs PAMAM dendrimer (NH3 mag) metanolos oldatot (12,7 térfogat/térfogat%) állítunk elő, ezt rotációs bepárlón vákuumban beszárítjuk. Mintegy 40 mg (7,4 pmól) szárított dendrimert 5 ml 0,1 mól foszfonát-puffer-oldatban feloldunk (pH = 9,0).
mg (0,037 mmól) dansil-kloridot adunk 5 ml acetonhoz és 5-10 percig rázatjuk. Némi szilárd anyagot tartalmazó, sötét sárga színű oldatot kapunk. A dansil-klorid-oldatot mintegy 30 másodperc alatt a dendrimer oldathoz adjuk, majd a reakcióelegyet tartalmazó lombikot 40 °C hőmérsékletű vízfürdőn tartjuk 90 percig. A melegítés közben a reakcióelegyet időnként összerázzuk. Az oldat halványsárga színűre változik. 90 perc eltelte után a lombikot a vízfürdőről levesszük és hagyjuk szobahőmérsékletre lehűlni. Enyhén zavaros reakcióelegyet kapunk.
Az aceton eltávolítására a reakcióelegyet rotációs bepárlón 30-35 °C hőmérsékleten, vákuumban desztilláljuk. E művelet során az oldat feltisztul. A reakcióelegyet ezt követően két centrifugacsőbe visszük, majd 30 percig 5000 fordulat/perc sebességgel centrifugáljuk. A dendrimer-oldatot ezután két Centricon™ mikrokoncentrátor-csőbe visszük (a molekulatömeg elkülönítés 3000 daltonnái van), majd a meg nem kötött dansil-klorid eltávolítására ultraszűrést végzünk 4x2 ml-rel. Mintegy 1-2 ml dansilezett dendrimer terméket tartalmazó oldatot nyerünk.
C) IgG/dansil-harmadik generációs PAMAM dendrimer-oldat előállítása
6,9 mg, nyúltól származó immunoglobulint (IgG) 1 ml 50 mmól foszfát-puffer-oldatban (pH = 7,2) feloldunk. Az oldathoz 14,8 mg nátrium-perjodátot adunk, majd az elegyet a szilárd anyag feloldódásáig forgatjuk, kevergetjük. Az elegyet fénytől védjük, majd egy további 30 percig szobahőmérsékleten keverjük. Az oldatot két Centricon™ mikrokoncentrátor-csőbe viszszük (molekulatömeg elválasztás 3000 daltonnál), ezután ultraszűrést végzünk 4x2 ml 50 mmól foszfát-puffer-oldatot (pH=7,2) alkalmazva, ily módon az el nem reagált nátrium-perjodátot eltávolítjuk. Mintegy 1 ml dialdehidet tartalmazó oldatot kapunk, ezt a dansilezett dendrimer előállítására egy lombikba helyezzük.
A B) lépés szerint előállított jelzett dansil-dendrimer törzsoldatból egy alikvot részt kiveszünk és meghígítjuk oly mértékben, hogy a végső dendrimer koncentráció 3,0 mg/ml legyen. A meghígított, dansilezett dendrimert tartalmazó oldatból 100 μΐ-t kiveszünk, s ezt az IgG dialdehid-oldathoz adjuk és diszpérgáljuk. A jelzett dendrimemek az IgG-hez való aránya 1,2:1.
Az IgG/dansilezett dendrimer konjugátumot fénytől védjük és szobahőmérsékleten 1 óra hosszat keverjük. Ez idő eltelte után 1,4 mg nátrium-ciano-bórhidridet adunk a reakcióelegyhez és 1 éjszakán át (1520 óra) szobahőmérsékleten keverjük. Tiszta oldatot kapunk. Az oldatból 200 μΐ térfogatot veszünk ki elektroforézis céljára, a maradékot két Centricon™ mikrokoncentrátor-csőbe visszük (a móltömeg elválasztás 100000 daltonnál van) és ultraszűrést végzünk. A művelet során 4x2 ml 50 mmól foszfát-puffer-oldatot (pH = 7,2) adunk a rendszerhez; ily módon a meg nem kötött dansil-dendrimert eltávolítjuk.i Az ultraszűrés végén a cím szerinti konjugátumot kapjuk.
D) Harmadik generációs PAMAM dendrimer/dansilllgG-HRP konjugátum előállítása
650 μΐ (10,1 mg) C) rész szerint előállított IgG/dansil harmadik generációs PAMAM dendrimer-oldathoz
2,6 mg oxidált HRP-t adunk. Az IgG/dansil dendrimer/HRP konjugátumot fénytől védjük és szobahőmérsékleten 2 óra hosszat kevertetjük. 1 óra eltelte után
2,1 mg nátrium-bórhidridet 1 ml ionmentesített vízhez adunk, majd 100 μΐ bórhidrid-oldatot viszünk a PAMAM dendrimer-IgG-HRP elegyhez. A reakcióelegyet 1 éjszakán át (15-20 óra) 2-8 °C hőmérsékleten keverjük. Borostyánszínű, tiszta elegyet kapunk.
A reakcióterméket tartalmazó elegyet két Centricon™ mikrokoncentrátor-csőbe visszük (molekulatömeg elválasztás 100000 daltonnál) és ultraszűrést végzünk. Ehhez 4x2 ml, 20 mmól foszfát-puffer-oldatot (pH=6,0) használunk. Az IgG/dansil/dendrimer/HRP konjugátumot elkülönítjük és egy borostyánszínű üvegedénybe visszük, amiben is -10 °C hőmérsékleten tároljuk.
D) Harmadik generációs PAMAM dendrimer/dansilllgGIHRP konjugátum jellemzése Az IgG/dendrimer/HRP konjugátumból alikvot részt kiveszünk és HRP enzim jelenlétét vizsgáljuk; ehhez 3,3’,5,5’-tetrametil-benzidint (TMB) használunk. A HRP katalizálja a különféle vegyületeknek, így például a TMB hidrogén-peroxiddal végzett oxidációját, a művelet során a TMB-ről egy elektron megy át a hidrogén-peroxidra, aminek során színes termék kép30
HU 209 252 Β ződik. Egy elektron elvesztése kék színű terméket, két elektron elvesztése sárga színű terméket eredményez.
A HRP enzim jelenlétének igazolására az alábbi dendrim/dansil/IgG/HRP konjugátumokat állítjuk elő:
(1) 0,1 mg/ml IgG/dansil-harmadik generációs PAMAM dendrimer;
(2) 0,1 mg/ml IgG/dansil-harmadik generációs PAMAM dendrimer/HRP;
(3) 0,1 mg/ml IgG/nyolcadik generációs PAMAM dendrimer/HRP;
(4) meg nem kötött HRP-t tartalmazó IgG/nyolcadik generációs PAMAM dendrimer/HRP ultraszűrlete. TMB-t tartalmazó oldatot készítünk, ehhez TMBdihidrokloridot használunk. A fentiekben 1-4 alatt felsorolt oldatokból 200 μΐ-t kiveszünk, mindegyiket 200 pl TMB oldathoz adjuk. A HRP konjugátumokat tartalmazó oldatok (2. és 3.) azonnal zöld, majd sárga színűre változnak. A 4. jelzésű ultraszűrlet élénksárga színű lesz. Az 1. számú IgG/dendrimer színtelen marad. Mind a négy mintát szobahőmérsékleten, 30 percig inkubáljuk, majd 200 μΐ n kénsav-oldattal a reakciót leállítjuk. Az enzim konjugátumot tartalmazó oldatok (2. és 3.) sárga színe intenzívebbé válik. Az IgG/dendrimer (1.) tartalmú oldat halványzöld színű és ultraibolya fényben fluoreszkálást mutat.
A konjugátumokat tartalmazó oldatokból alikvot részt veszünk ki, ezeket poliakrilamid gél elektroforézis segítségével vizsgáljuk. Az elektroforézishez mintegy 1 mg/ml koncentrációjú mintákat készítünk, ez megfelel mintegy 10 pg elektroforézis mintának. A vizsgálatokhoz Amicon Gradipore™ (Hylinx) 5-50% T gélt használunk 0,05 mól nátrium-acetát-puffer-oldattal (0,025% nátrium-azid) (pH= 4,0) kombinálva. A gélen két órán keresztül konstans 200 V feszültséget vezetünk át. A csapadékot tartalmazó oldatokat az elektroforetikus vizsgálat előtt centrifugáljuk. A felülúszót használjuk az elektroforézishez. A következő mintákon végzünk elektroforézist:
(1) nyolcadik generációs PAMAM dendrimer;
(2) dansilezett nyolcadik generációs PAMAM dendrimer;
(3) nyolcadik generációs PAMAM dendrimer-FIT I;
(4) IgG (kontroll);
(5) IgG/dansil-nyolcadik generációs PAMAM dendrimer;
(6) IgG/nyolcadik generációs PAMAM dendrimerFIT I;
(7) IgG/nyolcadik generációs PAMAM dendrimer/HRP;
(8) HRP (kontroll);
(9) IgG/dansilezett harmadik generációs PAMAM dendrimer/HRP;
(10) nyitott;
(11) a 7. ismétlése;
(12) a 9. ismétlése.
A festés előtt a gélt UV fény alá helyezzük, a fluoreszcencia ellenőrzésére. Csak a 2., 3. és 6. minták fluoreszkálnak.
A TMB felvitele után, de festés előtt, ismét megvizsgáljuk a lemezt, a 7., 8., 9., 11. és 12. minták jelenléte jól észlelhető; az enzim jelenléte a gélen a magasabb molekulatömeg tartománynál észlelhető.
A gélt ezt követően 0,025%-os Coomassie Bluenak 5%-os ecetsavval és 7%-os metanollal készült oldatával festjük. A 10. mintára nem viszünk fel festéket. A 4. és 8. minták az alacsonyabb molekulatömeg tartományban helyezkednek el. Az összes többi minta a magasabb molekulasúlyú tartományban található, anélkül, hogy alacsonyabb molekulatömegű foltok lennének kimutathatók.
33. példa
Ötödik generációs PAMAM dendrimer!diklór-triazinil-fluoreszcen előállítása
300 μΐ (21,5% szilárd anyag, ammónium-mag) ötödik generációs PAMAM dendrimert adunk 700 μΐ ionizált vízhez, és ebben diszpergáljuk (64,5 mg,
2,24 pmól). A dendrimert további 4 ml ionmentesített vízzel hígítjuk, így 12,9 mg/ml koncentrációjú oldatot kapunk. 6,0 mg (11,3 pmól) diklór-triazinil-fluoreszcein-hidrokloridot (DTAF I, előállító Abbott Laboratories) 0,5 ml metanolban fénytől mentes körülmények között feloldunk, az oldathoz 2 csepp trietil-amint adunk. A DTAF I oldatot keverés közben 30 másodperc alatt a fenti dendrimer oldathoz csepegtetjük. A reakcióelegyet fénytől védjük, és szobahőmérsékleten 15-20 óra hosszat keverjük. A reakció lefutása alatt az oldat tiszta és narancsszínű marad. A keverés befejezte után a reakcióelegyet két Centricon™ mikrokoncentrátor-csőbe visszük (molekulatömeg elválasztás 10000 daltonnái). Az el nem reagált DTAF I eltávolodására ultraszűrést végzünk. A művelet során 15x2 ml 0,1 mól foszfát-puffer-oldatot (pH = 9,0) adunk a rendszerhez. Mintegy 3 ml konjugált ötödik generációs PAMAM dendrimer/DTAF I-et nyerünk.
34. példa
4,5 Generációs PAMAM dendrimer!amino-metilfluoreszcein előállítása ml 4,5 generációjú PAMAM dendrimert (4,2% szilárd anyag, 42 mg, 1,7 pmól) 3,5 g-os üvegedénybe viszünk.
Egy másik edénybe 6,6 mg (1,7 pmól) 4’-aminometil-fluoreszceint (AMF) 0,5 ml ionmentesített vízben feloldunk. Két csepp trietil-amin hozzáadásával a pH-t 9 értékre állítjuk.
Egy harmadik üvegedényben 63,8 mg l-etil-3-(3dimetil-amino-propil)-karbodiimidet (EDAC) 1 ml ionmentesített vízben feloldunk.
Az AMF-oldatot keverés közben szobahőmérsékleten mintegy 1-2 perc alatt fenti dendrimer-oldathoz adjuk. A kapott dendrimer-AMF-oldat pH-ját n sósavoldat segítségével 4,5-5,5 értékre állítjuk. Az oldat tiszta marad. Az elegy állandó keverése közben 200300 pl részletekben, 15-20 percenként mintegy 1 óra alatt fenti EDAC oldatot az elegyhez adjuk. A reakcióelegy pH-ját n sósav-oldat segítségével 4,5-5,5 érték között tartjuk. A reakcióelegyet fénytől védjük és szobahőmérsékleten 15-20 óra hosszat keverjük. Az oldat tiszta marad, színe narancssárga.
HU 209 252 Β
Keverés után a reakcióelegyet két Centricon™ mikrokoncentrátor-csőbe visszük (móltömeg elválasztás 10000 daltonnái), az el nem reagált AMF-et ultraszűréssel különítjük el. A művelet során 15x2 ml 9 pH értékű, 0,1 mólos foszfát-puffer-oldatot adunk a rendszerhez. Mintegy 2 ml, 4,5 generációjú konjugált PAMAM dendrimer/AMF-et kapunk.
35. példa
Harmadik generációs PAMAM/izatoin-anhidrid konjugátum előállítása g harmadik generációs PAMAM-ot metanolban feloldunk, az oldatot jeges fürdőn lehűtjük. Ehhez az oldathoz 0,01 g izatoin-anhidridet adunk. Az elegyet 2 óra hosszat keverjük, majd hagyjuk, hogy a fürdő szobahőmérsékletre felmelegedjen, ezután a keverést néhány napig folytatjuk. A metanolt ezután rotációs bepárlón eltávolítjuk, a terméket vízzel felvesszük. Az oldatot ezután Spectrapor 1-es membránnal dializáljuk. Az oldatot 38 ml térfogatra betöményítjük, a fluoreszcencia spektrumot felvesszük, 340 nm-nél végezve a besugárzást és 420 nm-nél a detektálást. A fluoreszkálás 10000-szeres hígítás után is észlelhető, erőssége lineáris a 100-as és 1000-es hígításokhoz képest.
36. példa
Negyedik generációs PAMAM dendrimer
DTPAlGd konjugátum előállítása
A) Negyedik generációs metil-észter zárócsoportot tartalmazó PAMAM dendrimer előállítása Metil-akrilát és etilén-diamin egymást követő reakciójával 3,5 generációs, metil-észter zárócsoportot tartalmazó PAMAM dendrimert állítunk elő. Ezt követően 1000 g desztillált etilén-diaminhoz mintegy 5 g harmadik generációs, metil-észter zárócsoportot tartalmazó PAMAM dendrimert adunk 15 tömeg%-os metanolos oldat formájában. Az oldatot szobahőmérsékleten 48 óra hosszat állni hagyjuk. A metanolt és az etiléndiamin feleslegét rotációs bepárlón vákuumban, 60 °C alatti hőmérsékleten elűzzük. Összesen mintegy 7,5 g terméket kapunk. A zárványokban megkötött etiléndiamin eltávolítására a terméket 100 ml metanolban feloldjuk és két Centricon™ mikrokoncentrátor-csőben ultraszűrést végzünk (molekulatömeg elválasztás 2000 daltonnái). Amikor az oldat nagy része áthaladt a membránon, további metanol adagokat adunk a rendszerhez és az ultraszűrést megismételjük. A visszatartott anyagot gömblombikba visszük, a szűrő feltétet metanollal többször átöblítjük és a visszatartott anyaggal elegyítjük. Az illó oldószert rotációs bepárló segítségével vákuum alatt eltávolítjuk. Mintegy 6 g negyedik generációs PAMAM terméket kapunk (móltömeg: 5147 dalton, 24 amino zárócsoport).
B) Negyedik generációs PAMAM dendrimer!DTPA anhidrid konjugátum előállítása PAMAM-oldatot (4 g, 7,6xlO~4 mól) 300 ml vízzel elegyítünk, az elegyet háromnyakú lombikban keverjük. A következő órában 29 g (72xl0~3 mól) szilárd N3-(2,6-dioxo-morfolino-etil)-N6-etoxi-karbonilmetil-3,6-diazaoktándisavat (DTPA anhidrid) adunk részletekben a fenti lombik tartalmához. Az adagolás során a pH-t 8,8-9,2 közötti éréken tartjuk n vizes nátrium-hidroxid-oldat segítségével. Az adagolás befejeződése után az oldatot egy további 30 percig keverjük. Az oldat pH-ját ioncserélő gyanta (H+ alak) hozzáadásával 7 értékre állítjuk, az így kapott szuszpenziót víz-szivattyú alkalmazásával leszűrjük, így eltávolítjuk az ioncserélő gyantát. A szűrletet két Centricon™ mikrokoncentrátor-csőbe visszük (a molekulatömeg elválasztás 5000 daltonnái van), majd ultraszűrést végzünk. A szűrletet összegyűjtjük és fagyasztva szárítjuk. Hozamként mintegy 12 g színtelen, pelyhes port kapunk. A termék egy poliamidoamid (24 záró aminocsoporttal), ahol minden zárócsoport egy amidkötésen keresztül kapcsolódik a DTPA karboxilcsoportjához.
C) Negyedik generációs PAMAM dendrimer/DTPA/Gd konjugátum előállítása g fentiekben ismertetett kelátképző szert 600 ml vízben feloldunk és ehhez 2,8 g Gd2O3-ot elegyítünk. A szuszpenziót 80 °C hőmérsékleten mintegy 90 percig kevertetjük. Ezután szobahőmérsékletre lehűtjük, az oldat pH-ját ioncserélő gyanta hozzáadásával 7 értékre állítjuk. Az így kapott szuszpenziót víz-szivattyú segítségével szűrjük, így az ioncserélő gyantát eltávolítjuk. A szűrletet két Centricon™ mikrokoncentrátor-csőbe visszük (molekulatömeg elválasztás 5000 daltonnái) és ultraszűrést végzünk. A szűrletet összegyűjtjük és fagyasztással szárítjuk. 12 g színtelen, pelyhes, liofílizált terméket kapunk; atomabszorpciós spektroszkópos analízissel a Gd-tartalom kimutatható.
37. példa
Harmadik generációs, amino zárócsoportot tartalmazó dendrimer! DPTAJGd konjugátum előállítása
A) Harmadik generációs, hidroxi zárócsoportot tartalmazó dendrimer előállítása
Egy harmadik generációs, hidroxi zárócsoportot tartalmazó dendrimert állítunk elő pentaeritritil-tetrabromidból és 4-hidroxi-metil-2,6,7-trioxabiciklo[2.2.2]oktánból [lásd Tomalia és munkatársai, a 4587329 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás 11. példáját]. A 4587329 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás 11. példájának
C) lépése szerint eljárva a második generációs, hidroxi zárócsoportot tartalmazó poliéter-dendrimert a megfelelő perbromiddá alakítjuk. Ezt követően e példa A) és B) lépése szerint eljárva a C) lépés szerinti brómozott származékot először 4-hidroxi-metil-2,6,7-trioxabiciklo[2.2.2]oktánnal reagáltatjuk, vízzel a védőcsoportot eltávolítva a keresett harmadik generációs dendrimert kapjuk.
B) Harmadik generációs, klorid zárócsoportot tartalmazó dendrimer előállítása
Keverővei, hűtővel és adagolótölcsérrel ellátott 500 ml-es háromnyakú lombikba 0,1 mól A) lépés szerint előállított harmadik generációs dendrimert és 15 mól frissen desztillált tionil-kloridot adunk olyan ütemben, hogy a hőmérséklet 45 °C alatt maradjon. Az adagolás befejeződése után az oldatot mintegy 50 °C hőmérsékletre felmelegítjük, majd 4 óra hosszat ezen a
HU 209 252 Β hőmérsékleten tartjuk. A tionil-klorid feleslegét vákuumban eltávolítjuk. Ezzel a módszerrel a hidroxilcsoportokat kloriddá alakítjuk.
C) Harmadik generációs, amino zárócsoportot tartalmazó dendrimer előállítása
A B) pont szerint előállított klorid zárócsoportot tartalmazó dendrimert nagyméretű poliolefinből készült lombikba visszük, majd nagy feleslegben ammónium-hidroxid-oldatot adunk hozzá. A lombikot lezárjuk, tartalmát néhány napig mintegy 55 ’C hőmérsékleten tartjuk. Az oldatból olaj maradék válik ki, amit kis térfogatú vízben újra feloldunk, a pH-t nátrium-hidrogén-karbonát segítségével 8 értékre állítjuk, ezután a keresett amin végterméket kloroformmal extraháljuk. A kloroformos extraktumot vízmentes magnéziumszulfáttal szárítjuk, szűrjük, majd betöményítjük, így olajos maradékot kapunk. Fenti módon eljárva a klorid zárócsoportot tartalmazó dendrimert amino zárócsoport tartalmú dendrimerré alakítjuk.
D) Harmadik generációs, amino zárócsoportot tartalmazó dendrimer előállítása
Egy másik megoldásként az A) rész szerinti hidroxi zárócsoportot tartalmazó dendrimert dimetil-formamidban feloldjuk, és hagyjuk felesleges mennyiségű metánszulfonil-kloriddal reagálni. A keletkező tozilésztert oly módon különítjük el, hogy a dimetil-formamidos oldatot vízzel hígítjuk, majd kloroformmal extraháljuk. A kloroformos extraktumokat híg nátriumhidrogén-karbonát-oldattal, majd vízzel mossuk, ezután vízmentes magnézium-szulfáttal szárítjuk. A szilárd anyagot szűréssel eltávolítjuk, a szűrletet szárazra betöményítjük. A keresett polimetánszulfonát-észter olajos maradékként marad vissza, ezt további tisztítás nélkül használjuk fel a következő lépéshez; a kapott észtert egy nagyméretű poliolefinből készült lombikba visszük, és nagy feleslegben ammónium-hidroxid-oldatot adunk hozzá. A lombikot lezárjuk, a tartalmát néhány napig mintegy 55 °C hőmérsékleten tartjuk. Az amino zárócsoportot tartalmazó dendrimert a C) részben leírtak szerint különítjük el.
E) Harmadik generációs, amino zárócsoportot tartalmazó dendrimerIDTPA konjugátum előállítása DTPA vegyes anhidridet állítunk elő oly módon, hogy dietilén-triamin-pentaecetsavat (DTPA) és klórhangyasavas-izobutil-észtert reagáltatunk. 1 mól anhidridet dimetil-formamidban feloldunk, az oldatot amin zárócsoportot tartalmazó dendrimernek [a C) vagy a D) rész szerint előállítva] ugyanezen oldószerrel készült oldatához adjuk. Az oldathoz 2,6-lutidint adunk a lúgos környezet fenntartására. Ily módon a dendrimer amino zárócsoportja és a DTPA karboxilcsoportja között kovalens kötés létesül.
F) Harmadik generációs, amino zárócsoportot tartalmazó dendrimerIDTPA konjugátum előállítása Másik megoldásként I mmól amin zárócsoportot tartalmazó dendrimert [a C) vagy D) rész szerint előállítva] 300 ml vízben feloldunk. 2 órán bélül részletekben 150 mmól, szilárd állapotú N3-(2,6-dioxomorfolino-etil)-N6-etoxi-karbonil-metil-3,6-diazaoktán-karbonsavat adunk az oldathoz; n nátrium-hidroxi-oldat hozzáadásával a pH-t 9,0 értéken tartjuk. Az oldatot egy további 30 percig keverjük, ezután az oldat pH-ját ioncserélő gyanta (H+) segítségével 7 értékre állítjuk, majd az ioncserélő gyanta eltávolítására az elegyet szűrjük, A szűrletet két Centricon™ mikrokoncentrátor-csőbe visszük (molekulatömeg elválasztás 5000 daltonnái) és ultraszűrést végzünk. A szűrletet összegyűjtük, és fagyasztva szárítjuk. A DTPA konjugált dendrimert színtelen, pelyhes por formájában kapjuk.
G) Harmadik generációs, amino zárócsoportot tartalmazó dendrimer! DTPAlGd konjugátum előállítása
Mintegy 10 g DTPA-val konjugált dendrimert 600 ml injekciós célra szánt vízzel feloldunk, az oldathoz 3 g Gd203-ot adunk. A kapott szuszpenziót 80 °C hőmérsékleten 90 percig keverjük. Lehűtés után az oldat pH-ját ioncserélő gyanta segítségével 7 értékre állítjuk. Az oldatot leszűrjük, így az ioncserélő gyantát eltávolítjuk, majd fentiek szerint ultraszűrést végzünk. A szűrletet összegyűjtjük és fagyasztva szárítjuk. Gd/DTPA-konjugált dendrimert kapunk színtelen, pelyhes liofilizátum formájában, AAs analízis segítségével a Gd-tartalom kimutatható.
38. példa
Nulla vegyértékű nikkelt tartalmazó dendrimerek előállítása g 1%-os vizes NiCl2 oldathoz 177 mg 0,5 generációs dietilén-triamin (DETA) magot tartalmazó csillagpolimer dendrimert adunk (nátriumsó formájában). Az oldat halványkék színű lesz. Ehhez az oldathoz 0,5 ml 28%-os vizes ammónium-hidroxid-oldatot adunk, ekkor az oldat sötétebb kék színűvé válik. Az oldathoz ezután 12 g 2,78 %-os vizes nátrium-hipofoszfit-oldatot adva, majd az elegyet forráshőmérsékletre melegítve a fémnikkel csapadék formájában válik le, felülúszóként kék színű oldatot kapunk. A felülúszót vákuumban betöményítve fém-tartalmú dendrimert kapunk fölös mennyiségű foszfit elegyével (0,6 g). A tisztítást ultraszűrés segítségével végezzük üreges szálszűrő egység alkalmazásával (előállító Dow Chemical Company).
(Fenti műveletet kontrollként megismételve azzal az eltéréssel, hogy az elegyhez nem adunk dendrimert, színtelen oldatot kapunk, amelyből forralás után a nikkel fém teljes mértékben kicsapódik.)
39. példa
Nulla vegyértékű nikkelt tartalmazó dendrimerek előállítása g 1%-os vizes NiCl2 oldathoz 270 mg 1,5 generációs lineáris polietilén-imin (PEI) magot tartalmazó csillagpolimer dendrimert adunk (nátrium-karboxilát formájában). Az oldat sötétebb zöld színt mutat, mint a csillagpolimert nem tartalmazó kontroll elegy. 0,5 ml koncentrált ammónium-hidroxid-oldat hozzáadása után a kontroll oldat színe kék, a csillag polimer tartalmú oldat még mindig zöld. 12 g 2,78%-os vizes nátrium-hipofoszfít-oldat hozzáadása után az oldatokat fel33
HU 209 252 Β forraljuk, a kontroll oldatból fekete színű fém nikkel csapódik le, színtelen oldatot kapunk. A csillagpolimer tartalmú oldatból hasonló körülmények között halványzöld színű szuszpenzió keletkezik. A halványzöld szuszpenzióból centrifugálás segítségével kis mennyiségű (50 mg) szilárd anyagot távolítunk el, a tiszta oldatot vákuumban betöményítve 500 mg halványzöld port kapunk. A fémtartalmú dendrimert és foszfitot tartalmazó vizes elegyet ultraszűrésnek vetjük alá, ehhez Amicon™ YM2 membránt használunk, az ultraszűrést mindaddig folytatjuk, amíg a szűrletben zöld szín már nem észlelhető. A zöld színű oldatot vákuumban betöményítve mintegy 100 mg sötétzöld üvegszerű anyagot kapunk.
40. példa
Epoxi-oktánnal módosított ötödik generációs PAMAM dendrimer előállítása
0,30 g ötödik generációs PAMAM dendrimert (2,7 mekv.) 10 ml metanolban feloldunk. Ehhez az oldathoz 0,5 g epoxi-oktánt (3,9 mmól, előállító Aldrich) adunk. Ezt követően az oldatot egy olajfürdő segítségével három napig 40 °C hőmérsékleten tartjuk. Az oldószert ezután vákuumban végzett desztillációval eltávolítjuk, a maradékot szobahőmérsékleten magas vákuumban betöményítjük, így 0,60 g (90% elméleti hozam) módosított dendrimert kapunk színtelen, olajos termék formájában. 13C- és ‘H-NMR-spektrum vizsgálatot végezve megállapítható, hogy a felületen epoxioktán kötések létesültek, ami igazolja az epoxi-oktándendrimer kapcsolódást.
Fenti eljárást megismételve 2,0, 3,0, 4,0, 6,0 és 7,0 generációs PAMAM dendrimer alkalmazásával a megfelelő konjugátumhoz jutunk.
41. példa
Abszizin savval módosított 4,5 generációs PAMAM dendrimer előállítása
4,5 generációjú PAMAM dendrimer vizes oldatát nátrium-hidroxid/metanol (1 mmól, 10 ml) segítségével hidrolizálunk, az elegy pH-ját nátrium-hidroxid/sósav alkalmazásával 11 értékre állítjuk. Az oldathoz nagy feleslegben szilárd abszizin savat adunk. Az oldatot szobahőmérsékleten ezután erélyesen keverjük. 1,
2,6 és 24 óra eltelte után 500 μΐ oldatot Eppendorf-féle csőben (1,5 ml mikrocentrifugáláshoz alkalmazott csőben) ily módon a fel nem oldódott abszizin savat eltávolítjuk, a centrifugálást percenként 15 000 fordulattal végezzük. Az abszizin sav koncentrációját a felülúszó abszorbció értékének mérése alapján állapítjuk meg (λ=260 nm, ε = 19 400),
Fenti műveletet megismételjük különféle generációjú PAMAM dendrimerek alkalmazásával; minél magasabb generációs számú dendrimert alkalmazunk, annál több abszizin sav oldódik. így az 5. és 6. generációjú dendrimerek esetében több sav oldódik fel, mint a 4. generációjú dendrimer oldatában. 7 pH értéknél mindössze 0,004 mól abszizin sav oldódik vízben, és β-CD oldatban, ezzel szemben a dendrimer oldatok 0,02-0,08 mól abszizin savat oldanak. A fél-generációs dendrimerek azonos mennyiségű savat oldanak, mint a teljes generációjú dendrimerek. Ebből arra következtetünk, hogy az abszizin sav a dendrimer belsejében van megkötve.
Fenti műveletet nifedipinnel megismételve (ε=8300 kloroformban), azt találjuk, hogy a nifedipin vízben igen lassan oldódik, de oldódás után igen gyorsan beépül a dendrimerbe.
Fenti példákat a találmány szerinti megoldás szemléltetésére és nem korlátozására mellékeljük. A szakember számára világos, hogy a találmány szerinti megoldás - figyelembe véve a fenti példákat - igen sokféleképpen valósítható meg.

Claims (61)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Eljárás az (I) általános képletű csillagpolimerkonjugátum előállítására - ahol az (I) általános képletben
    P jelentése egymástól függetlenül sugárirányban szimmetrikus és elágazásokat tartalmazó dendrimer, amely adott esetben védőcsoporttal ellátott reakcióképes csoportokat tartalmaz;
    x jelentése 1 vagy annál nagyobb egész szám;
    M jelentése egymástól függetlenül azonos vagy eltérő hatóanyag, molekula, atom, ion vagy biológiai termék formájában, y értéke 1 vagy annál nagyobb egész szám; és a * jelzés azt jelenti, hogy az M hatóanyag a dendrimerhez van kapcsolva adott esetben egy kötést képző csoport segítségével, azzal jellemezve, hogy P komponenst M komponenssel reagáltatunk, célszerűen oldószer és puffer jelenlétében, szobahőmérséklet és az oldószer forráspontja közötti hőmérsékleten, adott esetben egy C kötést képző anyag, továbbá adott esetben egy T célra irányító anyag jelenlétében, P és M komponenst 0,1; 1 és 1000:1 közötti arányban alkalmazva, és ahol kívánt esetben a P komponens által megkötött oldószert ultraszűréssel távolítjuk el az M komponenssel való reakciót megelőzően.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az eljáráshoz legalább egy T-vel jelölt célra irányító komponenst alkalmazunk (T)e* (P)/ (M)y képlet szerint, ahol T egy célra irányító anyagot jelöl,
    P, Μ, *, x és y jelentése az 1. igénypontban megadottal azonos, e jelentése 0 vagy ennél nagyobb szám, aholis úgy járunk el, hogy
    a) T komponenst először P komponenssel reagáltatjuk, majd ezt követően adjuk a reakcióelegyhez az M komponenst, vagy
    b) P komponenst először M komponenssel reagáltatjuk, majd ezt követően adjuk a reakcióelegyhez a T komponenst, célszerűen oldószer és a pH beállítására alkalmas puffer, sav vagy bázis jelenlétében.
  3. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az eljárásban; legalább egy, T-vel jelölt célra
    HU 209 252 Β irányító komponenst és legalább egy kötést képző anyagot alkalmazunk a [COe - (C’)f]g * (P)x * [(C”)h - (M)y]k képlet szerint, ahol a képletben
    C’ jelentése azonos vagy eltérő kötést képző anyag,
    C” jelentése azonos vagy eltérő kötést képző anyag, g és k értéke 1 vagy ennél nagyobb szám, f, e és h értéke 0 vagy ennél nagyobb szám,
    - jelentése kovalens kötés az esetben, ha kötést képző anyag van jelen,
    P, x, y jelentése az 1. igénypontban megadott,
    T jelentése célra irányító anyag,
    M jelentése azonos vagy eltérő hatóanyag, molekula, atom vagy ion formájában, célszerűen azonos gyógyszerhatóanyag, ahol is az aktív csoportokat tartalmazó P komponenst valamely kötést képző anyaggal, adott esetben védőcsoportot hordozó anilinnel reagáltatjuk.
  4. 4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy M hatóanyagként gyógyászati hatású hatóanyagot alkalmazunk.
  5. 5. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy M hatóanyagként valamilyen peszticidet, radionuklidot, kelátképző szert, kelátozott fémet, toxint, antitestet, antitest-fragmentumot, antigént, diagnosztikai anyagot, jelképzőt, jelvisszaverőt vagy jelfelvevő anyagot alkalmazunk.
  6. 6. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy legalább két különböző hordozott anyagot alkalmazunk, amelyek közül legalább az egyik egy T célra irányító anyag és a másik M komponens legalább egy biológiailag hatásos anyag.
  7. 7. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy célra irányító anyagként valamely célreceptorra specifikus anyagot alkalmazunk.
  8. 8. A 6. vagy 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy célra irányító anyagként poliklón antitestet vagy annak fragmentumát alkalmazzuk.
  9. 9. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy dendrimerként diszkontinuitásokat tartalmazó dendrimert alkalmazunk.
  10. 10. Az 1. igénypont szerinti eljárás olyan (1) általános képletű csillagpolimer-konjugátum előállítására, ahol x értéke 1 és y értéke 2 vagy ennél nagyobb szám, azzal jellemezve, hogy a megfelelően szubsztituált kiindulási anyagokat alkalmazzuk.
  11. 11. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az M-ként szereplő gyógyszerhatóanyagot vagy toxint P-hez viszonyítva 0,1:1-től 5:1-ig terjedő tömegarányban alkalmazzuk.
  12. 12. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a reakciót szobahőmérséklet és a reakcióelegy forráspontja közötti hőmérsékleten végezzük.
  13. 13. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy oldószerként vizet, metanolt, etanolt, kloroformot, acetonitrilt, toluolt, dimetil-szulfoxidot vagy dimetil-formamidot alkalmazunk.
  14. 14. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy legalábbb egy, gyógyászati szempontból elfogadható hígítószert alkalmazunk.
  15. 15. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy M-ként diagnoasztikai anyagot alkalmazunk.
  16. 16. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy kötést képző anyagként valamilyen kelátképző szert, antigént vagy antitestet alkalmazunk.
  17. 17. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy célra irányító anyagot is alkalmazunk.
  18. 18. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy célra irányító anyagként poliklón antitestet alkalmazunk.
  19. 19. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy reakcióképes egységeket tartalmazó P-t kötést képző anyagként anilinnel vagy ennek származékával reagáltatunk, ahol az NH2csoport adott esetben védőcsoportot hordoz.
  20. 20. A 19. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy kötést képző anyagként anilint alkalmazunk, ahol az NH2-csoport adott esetben védőcsoportot hordoz.
  21. 21. A 19. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy védőcsoportként egy (h) általános képletű csoportot - amelyben R jelentése terc-butil- vagy benzilcsoport -, valamint (a) vagy (i) képletű csoportot alkalmazunk.
  22. 22. A 19. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan P dendrimert alkalmazunk, amely egy (XV) általános képletű reakcióképes csoportot tartalmaz, ahol a (XV) általános képletben n értéke 1 vagy 2; és
    X jelentése fluor-, klór-, bróm- vagy jódatom, vagy
    -SO2C1 csoport, azzal a megkötéssel, hogyha n értéke 1, akkor a nitrocsoport para-helyzetben van.
  23. 23. A 22. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan P dendrimert alkalmazunk, amely reakcióképes csoportként 4-fluor-nitro-benzolt tartalmaz.
  24. 24. A 19. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy reakcióképes csoportokat tartalmazó P-t anilinnel reagáltatunk, ahol az NH2-csoportok (j) képletű N-ftálimid védőcsoportot hordoznak.
  25. 25. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan reakcióképes csoportokat tartalmazó P-t reagáltatunk, amelyekben lévő NH2-csoportok az alkalmazott körülményekkel szemben közömbös védőcsoportokat hordoznak.
  26. 26. Az 1. igénypont szerinti eljárás P helyében poli(etilén-imin)-t tartalmazó csillagpolimer előállítására, azzal jellemezve, hogy poli(etilén-imin)-metánszulfonamid-csillagpolimert sósavval reagáltatunk, majd a kapott P-t M-mel reagáltatjuk.
  27. 27. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az oldószert tartalmazó P csillagdendrimer polimerből az oldószert ultraszűréssel eltávolítjuk, majd az oldószermentes P-t M-mel reagáltatjuk.
  28. 28. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy M-ként lantanidot alkalmazunk, és ezt poli(etilén-imin)-acetáttal keláttá alakítjuk.
  29. 29. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy P komponensként poli(etilén-imin) csillagpolimer dendrimert alkalmazunk, amelynek felszínén me35
    HU 209 252 Β tilén-karboxilát csoportok vannak, továbbá M komponensként adott esetben radioaktív fém lantanidot és oldószerként vizet alkalmazunk.
  30. 30. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy P komponensként észter védőcsoportokat tartalmazó poli(amidamin) csillagpolimer dendrimert, M komponensként aszpirint és oldószerként kloroformot alkalmazunk.
  31. 31. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a műveletet oldószer nélkül végezzük olyan P és M komponensek alkalmazásával, amelyek legalább részben oldódnak egymásban.
  32. 32. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy valamely ionos M komponensnek a P komponenshez viszonyított mólaránya 0,1:1 és 1000:1 között van.
  33. 33. A 32. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az ionos M komponensnek a P komponenshez viszonyított mólaránya 1:1 és 50:1 között van.
  34. 34. A 33. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az ionos komponensnek a P komponenshez viszonyított mólaránya 2:1 és 6:1 között van.
  35. 35. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy M komponensként egy toxint alkalmazunk, és az M komponensnek a P komponenshez viszonyított tömegaránya 0,1:1 és 5:1 között van.
  36. 36. A 35. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy M komponensként egy toxint alkalmazunk, és az M komponensnek a P komponenshez viszonyított tömegaránya 0,5:1 és 3:1 között van.
  37. 37. Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy M komponensként egy gyógyszerhatóanyagot alkalmazunk, és az M komponensnek a P komponenshez viszonyított tömegaránya 0,1:1 és 5:1 között van.
  38. 38. A 37. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy M komponensként egy gyógyszerhatóanyagot alkalmazunk, és az M komponensnek a P komponenshez viszonyított tömegaránya 0,5:1 és 3:1 között van.
  39. 39. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy M komponensként egy jelabszorber anyagot, jelvisszaverő anyagot vagy jelképző anyagot alkalmazuk.
  40. 40. Az 39. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy jelabszorber anyagként egy kontrasztanyagot alkalmazunk.
  41. 41. A 40. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy kontrasztanyagként 1,4,7,10-tetraazaciklododekán-1,4,7,10-tetraecetsav -, 1,4,7,10-tetraazaciklododekán-N,N’,N”-triecetsav- vagy dietilén-triamin-pentaecetsav-származékot alkalmazunk.
  42. 42. A 40. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy kontrasztanyagként olyan anyagot alkalmazunk, amelyet egy α,B-telítetlen észter, egy a,B-telítetlen keton, egy a,B-telítetlen nitril, egy a,B-telítetlen karboxil származék, izocianát vagy epoxid reakciójával állítunk elő.
  43. 43. A 40. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy kontrasztanyagként Gd, Mn vagy Fe fémek ionjait alkalmazzuk.
  44. 44. A 43. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy fémionként P-vel kel átképzésben lévő fémiont alkalmazunk.
  45. 45. A 43. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy P komponensként hidroxi-etil-1,4,7trisz(karbometoxi-metil)-1,4,7,10-tetraazaciklododekán-PAMAM-ot alkalmazunk.
  46. 46. A 44. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy P komponensként 1,4,7,10-tetraazaciklododekán-1,4,7,10-tetraecetsav-PAMAM-ot alkalmazunk.
  47. 47. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy M komponensként radionuklidot alkalmazunk.
  48. 48. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy P komponensként poli(amid-amin)-t alkalmazunk.
  49. 49. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy P komponensként poli(etilén-imin)-t alkalmazunk.
  50. 50. A 39. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy jelabszorbensként elektronsugárt elnyelő anyagot alkalmazunk.
  51. 51. 39. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy jelvisszaverő anyagként paramágneses anyagot alkalmazunk.
  52. 52. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az eljáráshoz legalább egy T-vel jelölt célirányító komponenst alkalmazunk, és a művelet során
    a) először reagáltatjuk a T és P komponenseket, majd ezek reakciója után az elegyhez M komponenst adunk, vagy
    b) először a P és az M komponenst reagáltatjuk, majd ezt követően adjuk ezek reakciója után az elegyhez a T komponenst olyan hőmérsékleten, amely nem károsítja a reakcióban részt vevő komponenseket, és a műveletet adott esetben oldószer, valamint adott esetben a pH beállításához szükséges puffer, sav vagy bázis jelenlétében végezzük.
  53. 53. Az 52. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy T komponensként monoklonális antitestet vagy antitest fragmentet alkalmazunk.
  54. 54. Az 52. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy M komponensként radionuklidet alkalmazunk.
  55. 55. Az 52. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az a) eljárás szerint a T és a P komponensű összekötését funkcionális csoportokon keresztül végezzük, ahol funkcionális csoportként vizes közegben izocianátot alkalmazhatunk, vagy vizes közegként használhatunk szerves oldószert, így acetonitrilt vagy dimetil-formamidot tartalmazó vizet.
  56. 56. Az 52. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az eljárást 7 és 10 közötti pH-η végezzük.
  57. 57. Az 53. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemez ve, hogy a T komponensnek a P komponenshez viszonyított aránya 1:1 és az M komponensnek a P komponenshez viszonyított aránya a 33-39. igénypontokban megadottakkal azonos.
  58. 58. Az 52. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az eljárás során a P komponenst először védőcsoporttal látjuk el.
  59. 59. Az 58. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy védőcsoportként terc-butoxi-karbamátot,
    HU 209 252 Β izotiocianát-, izocianát-, szemitiokarbazid-, szemikarbazid-, bróm-acetamid-, jód-acetamid- vagy maleimidcsoportot alkalmazunk.
  60. 60. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy M komponensként radionuklidot, gyógyszerhatóanyagot, toxint, jelképző-, jelvisszaverő- vagy jelabszorbeáló-anyagot alkalmazunk.
  61. 61. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az eljáráshoz legalább egy gyógyászatilag
    5 megfelelő oldószert vagy vivőanyagot alkalmazunk.
    HU 209 252 Β
    Int. Cl.5: A 61 K 47/48 (I) (p)x * (M)y (T)e * (P)x* (M)y [(T)e - (C-)f]gM (P)x*[(C)h- (M)y]k [(Antitest^ - (C')f]g * (Ρ)χ *[(C)h - (M)y]R (II)
HU874562A 1986-08-18 1987-08-18 Star-polymere-con jugate and process for producing them HU209252B (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US89745586A 1986-08-18 1986-08-18

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HUT55245A HUT55245A (en) 1991-05-28
HU209252B true HU209252B (en) 1994-04-28

Family

ID=25407923

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9303379A HU220205B (hu) 1986-08-18 1987-08-18 Csillagpolimer-konjugátumok
HU874562A HU209252B (en) 1986-08-18 1987-08-18 Star-polymere-con jugate and process for producing them

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9303379A HU220205B (hu) 1986-08-18 1987-08-18 Csillagpolimer-konjugátumok

Country Status (21)

Country Link
EP (1) EP0271180B2 (hu)
JP (6) JPH0757736B2 (hu)
KR (1) KR970011151B1 (hu)
AT (1) ATE89743T1 (hu)
AU (2) AU609051B2 (hu)
BR (3) BR8707432A (hu)
DE (1) DE3786000T3 (hu)
DK (1) DK174053B1 (hu)
ES (1) ES2054678T5 (hu)
FI (2) FI103410B1 (hu)
GR (1) GR3024215T3 (hu)
HK (1) HK54396A (hu)
HU (2) HU220205B (hu)
IE (1) IE61356B1 (hu)
IL (1) IL83567A (hu)
MX (1) MX169992B (hu)
MY (1) MY102878A (hu)
NO (1) NO176306C (hu)
NZ (1) NZ221484A (hu)
WO (3) WO1988001179A1 (hu)
ZA (1) ZA876114B (hu)

Families Citing this family (85)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5560929A (en) * 1986-08-18 1996-10-01 The Dow Chemical Company Structured copolymers and their use as absorbents, gels and carriers of metal ions
US5914095A (en) * 1989-04-07 1999-06-22 Salutar, Inc. Polychelants containg amide bonds
WO1990014881A2 (en) * 1989-05-26 1990-12-13 Akzo N.V. Chelating agents for attaching metal ions to proteins
US5808003A (en) * 1989-05-26 1998-09-15 Perimmune Holdings, Inc. Polyaminocarboxylate chelators
US5292868A (en) * 1989-05-26 1994-03-08 Akzo N.V. Chelating agents for attaching metal ions to proteins
DE3930674A1 (de) * 1989-09-11 1991-03-21 Diagnostikforschung Inst Bifunktionelle chelatbildner zur komplexierung von tc- und re-isotopen, verfahren zu ihrer herstellung und darstellung von konjugaten daraus sowie deren verwendung in diagnostik und therapie
DE3938992A1 (de) 1989-11-21 1991-05-23 Schering Ag Kaskadenpolymer-gebundene komplexbildner, deren komplexe und konjugate, verfahren zu ihrer herstellung und diese enthaltende pharmazeutische mittel
GB9021671D0 (en) * 1990-10-05 1990-11-21 Unilever Plc Delivery of agents
AU642980B2 (en) * 1990-03-21 1993-11-04 Quest International B.V. Ultilization of enzymes
AU641736B2 (en) * 1990-03-21 1993-09-30 Quest International B.V. Delivery of agents
AU642979B2 (en) * 1990-03-21 1993-11-04 Quest International B.V. Utilization and delivery of enzymes
IL99234A (en) * 1990-08-27 1994-05-30 Michigan Molecular Inst Non-cross-linked multi-branch polymers and their preparation
GB9112536D0 (en) * 1991-06-11 1991-07-31 Celltech Ltd Chemical compounds
US5871713A (en) * 1991-12-04 1999-02-16 Guerbet S.A. Macromolecular polyamine iodine-containing compound, process for its preparation and its use as a contrast agent
JPH07506085A (ja) * 1991-12-04 1995-07-06 ゲルベ　エス．アー． 新規なヨード含有ポリアミン系巨大分子化合物，その調製法，およびその造影剤としての応用
FR2688508A1 (fr) * 1992-03-13 1993-09-17 Guerbet Sa Nouveau produit de contraste iode, son procede de preparation et son utilisation comme agent de contraste.
JPH07505915A (ja) * 1992-04-14 1995-06-29 コーネル　リサーチ　ファウンデーション、インコーポレーテッド 樹枝状巨大分子およびその製造法
US5387617A (en) * 1993-01-22 1995-02-07 The Dow Chemical Company Small cell foams and blends and a process for their preparation
US6121056A (en) * 1993-02-24 2000-09-19 Dade Behring Inc. Random detection of antigens with antibodies immobilized on soluble submicron particles
US5898005A (en) * 1993-02-24 1999-04-27 Dade Behring Inc. Rapid detection of analytes with receptors immobilized on soluble submicron particles
CA2133967A1 (en) * 1993-02-24 1994-09-01 Spencer H. Lin Immobilization of specific binding assay reagents
FR2703055B1 (fr) * 1993-03-22 1995-07-07 Guerbet Sa Nouveaux composés polyiodés, leur préparation et leur utilisation en tant que produits de contraste pour la radiologie .
US7097839B1 (en) 1993-10-26 2006-08-29 Thomas Jefferson University ST receptor binding compounds and methods of using the same
AU750411B2 (en) * 1994-03-07 2002-07-18 Dendritic Nanotechnologies, Inc. Bioactive and/or targeted dendrimer conjugates
IL128775A (en) * 1994-03-07 2001-05-20 Dow Chemical Co A preparation containing a dendritic polymer in a complex with at least one unit of biological reaction sub
GB9407812D0 (en) * 1994-04-20 1994-06-15 Nycomed Salutar Inc Compounds
NL9400880A (nl) * 1994-05-27 1996-01-02 Dsm Nv Samenstelling bestaande uit een dendrimeer en een in het dendrimeer opgesloten actieve stof, een werkwijze voor de bereiding van een dergelijke samenstelling en een werkwijze voor het vrijstellen van de actieve stof.
NL9401886A (nl) * 1994-05-27 1996-01-02 Dsm Nv Samenstelling bestaande uit een dendrimeer en een in het dendrimeer opgesloten actieve stof, een werkwijze voor de bereiding van een dergelijke samenstelling en een werkwijze voor het vrijgeven van de actieve stof.
AUPM623994A0 (en) 1994-06-15 1994-07-07 Biomolecular Research Institute Limited Antiviral dendrimers
WO1996019240A1 (en) * 1994-12-21 1996-06-27 Novartis Ag Oligonucleotide-dendrimer conjugates
FR2734268B1 (fr) * 1995-05-19 1997-07-04 Centre Nat Rech Scient Nouveaux dendrimeres fonctionnels a terminaisons phosphorees et leur procede de preparation
US6051429A (en) 1995-06-07 2000-04-18 Life Technologies, Inc. Peptide-enhanced cationic lipid transfections
US6083708A (en) * 1995-08-11 2000-07-04 Dade Behring Inc. Polypeptide: dendrimer complexes
US5658574A (en) * 1995-10-13 1997-08-19 Chesebrough-Pond's Usa Co., Division Of Conopco, Inc. Cleansing compositions with dendrimers as mildness agents
NL1001753C2 (nl) * 1995-11-28 1997-05-30 Dsm Nv Samenstelling omvattende een kunststof en een additief.
DE19625982A1 (de) * 1996-06-28 1998-01-02 Wella Ag Kosmetisches Mittel zur Haarbehandlung mit Dendrimeren
JP4233117B2 (ja) * 1997-01-13 2009-03-04 住友化学株式会社 樹枝状ポリマーのナノコンポジット
WO1998056427A1 (fr) * 1997-06-12 1998-12-17 Mitsubishi Chemical Corporation Agent de contrast
DE19728954C1 (de) * 1997-06-30 1999-04-22 Schering Ag Saccharid-Konjugate, diese enthaltende pharmazeutische Mittel, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung
FR2790642A1 (fr) * 1999-03-08 2000-09-15 Aventis Cropscience Sa Nouvelles compositions pesticides et/ou regulatrices de croissance
AU5522600A (en) * 1999-06-29 2001-01-22 Dako A/S Detection using dendrimers bearing labels and probes
AU6386000A (en) 1999-07-29 2001-02-19 Epix Pharmaceuticals, Inc. Targeting multimeric imaging agents through multilocus binding
FI19991705A (fi) * 1999-08-11 2001-02-12 Neste Chemicals Oy Antimikrobinen hyperhaaroittunut polymeerikoostumus
FR2797563A1 (fr) * 1999-08-18 2001-02-23 Rhodianyl Composes biocides et leur utilisation dans des polymeres thermoplastiques
JP2004524259A (ja) * 1999-12-10 2004-08-12 ローゼン、ジェラルド エム． 関節のｍｒｉ画像診断における造影増強剤としてポリニトロシル官能基を有するデンドリマーの利用
CA2404784A1 (en) 2000-04-07 2001-10-18 Shell Internationale Research Maatschappij B.V. Method for inhibiting the plugging of conduits by gas hydrates
US6471968B1 (en) * 2000-05-12 2002-10-29 Regents Of The University Of Michigan Multifunctional nanodevice platform
CU23011A1 (es) * 2000-11-03 2004-12-17 Ct Ingenieria Genetica Biotech Método de obtención de estructuras antigénicas quemétodo de obtención de estructuras antigénicas que potencian la reactividad cruzada específica y su potencian la reactividad cruzada específica y su uso en formulaciones uso en formulaciones
ATE397650T1 (de) 2001-06-14 2008-06-15 Shell Int Research Verfahren zum solubilisieren von asphaltenen in einem kohlenwasserstoffgemisch
TWI221406B (en) 2001-07-30 2004-10-01 Epix Medical Inc Systems and methods for targeted magnetic resonance imaging of the vascular system
GB0209022D0 (en) 2002-04-19 2002-05-29 Imp College Innovations Ltd Compounds
ATE318989T1 (de) 2002-09-03 2006-03-15 Shell Int Research Methode und zusammensetzungen zur inhibierung der hydrocarbonhydratbildung
EP1525890A1 (en) 2003-10-02 2005-04-27 Complex Biosystems GmbH Protein-Proteophore complexes
JP5268255B2 (ja) * 2003-11-21 2013-08-21 エイエヌピー テクノロジーズ， インコーポレイテッド 非対称分岐ポリマー抱合体およびマイクロアレイアッセイ
US7985424B2 (en) 2004-04-20 2011-07-26 Dendritic Nanotechnologies Inc. Dendritic polymers with enhanced amplification and interior functionality
EP1737899B1 (en) * 2004-04-20 2015-07-08 Dendritic Nanotechnologies, Inc. Dendritic polymers with enhanced amplification and interior functionality
JP5329755B2 (ja) 2004-08-13 2013-10-30 日本曹達株式会社 多分岐ポリマー
WO2006033766A2 (en) * 2004-08-25 2006-03-30 The Regents Of The University Of Michigan Dendrimer based compositions and methods of using the same
US20060099232A1 (en) 2004-11-08 2006-05-11 Fuji Photo Film Co., Ltd. Active oxygen eliminator and production method thereof
US8481632B2 (en) 2004-11-24 2013-07-09 Shell Oil Company Method for improving the flowability of a mixture that contains wax and other hydrocarbons
EP1877103A4 (en) * 2005-04-20 2010-11-03 Dendritic Nanotechnologies Inc DENDRITIC POLYMERS WITH ENHANCED INNER FUNCTIONALITY AND AMPLIFICATION
US7575687B2 (en) * 2005-08-16 2009-08-18 Ge Osmonics, Inc. Membranes and methods useful for caustic applications
EP2311900B1 (en) 2005-09-07 2015-03-11 Nippon Soda Co., Ltd. Star polymer and method for producing the same
ES2437581T3 (es) 2005-11-17 2014-01-13 Zogenix, Inc. Suministro de formulaciones viscosas por inyección sin aguja
US8247498B2 (en) 2006-07-11 2012-08-21 Nippon Soda Co., Ltd. Star polymer and method for producing the same
US20080020043A1 (en) * 2006-07-20 2008-01-24 Marc Gingras Dendrimer-Drug Conjugates
US8268347B1 (en) 2006-10-24 2012-09-18 Aradigm Corporation Dual action, inhaled formulations providing both an immediate and sustained release profile
US8658148B2 (en) 2007-06-22 2014-02-25 Genzyme Corporation Chemically modified dendrimers
WO2009028212A1 (ja) 2007-08-31 2009-03-05 Nippon Soda Co., Ltd. スターポリマーの製造方法
US8252834B2 (en) 2008-03-12 2012-08-28 The Regents Of The University Of Michigan Dendrimer conjugates
EP2756756B1 (en) 2008-04-28 2016-01-06 Zogenix, Inc. Novel formulations for treatment of migraine
WO2010039861A2 (en) 2008-09-30 2010-04-08 The Regents Of The University Of Michigan Dendrimer conjugates
US9017644B2 (en) 2008-11-07 2015-04-28 The Regents Of The University Of Michigan Methods of treating autoimmune disorders and/or inflammatory disorders
CA2777682C (en) 2009-10-13 2015-02-24 The Regents Of The University Of Michigan Dendrimer compositions and methods of synthesis
EP2493291B1 (en) * 2009-10-26 2019-05-22 Dendritic Nanotechnologies, Inc. Peham dendrimers for use in agriculture
WO2011059586A2 (en) 2009-10-30 2011-05-19 The Regents Of The University Of Michigan Multifunctional small molecules
EP2540311A4 (en) 2010-02-26 2016-07-06 Univ Nagasaki COMPOSITE BODY FOR RELEASING ANTIGENS OR MEDICAMENTS
WO2013085718A1 (en) 2011-12-08 2013-06-13 The Regents Of The University Of Michigan Multifunctional small molecules
US9921205B2 (en) 2012-11-13 2018-03-20 Chevron U.S.A. Inc. Method for determining the effectiveness of asphaltene dispersant additives for inhibiting or preventing asphaltene precipitation in a hydrocarbon-containing material subjected to elevated temperature and presssure conditions
GB201405660D0 (en) * 2014-03-28 2014-05-14 Gama Healthcare Ltd A liquid disinfecting composition
CA3008648C (en) * 2015-12-16 2023-01-10 Priostar Pty Ltd Dendrimer and formulations thereof
US10907473B2 (en) 2017-11-14 2021-02-02 Chevron U.S.A., Inc. Low volume in-line filtration methods for analyzing hydrocarbon-containing fluid to evaluate asphaltene content and behavior during production operations
CN109287624A (zh) * 2018-10-08 2019-02-01 威海晨源分子新材料有限公司 一种树枝状聚酰胺-胺在农药中的应用
JP2022517193A (ja) 2019-01-03 2022-03-07 アイオンパス， インク． イオンビームイメージングのための組成物および試薬
CN114292217A (zh) * 2021-12-31 2022-04-08 安源基因科技(上海)有限公司 生物活性交联剂、生物交联物、试剂盒及应用

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4289872A (en) * 1979-04-06 1981-09-15 Allied Corporation Macromolecular highly branched homogeneous compound based on lysine units
IL64277A0 (en) * 1981-11-11 1982-02-28 Basht Ltd Apparatus for removal of integrated circuits from circuit boards
US4472509A (en) * 1982-06-07 1984-09-18 Gansow Otto A Metal chelate conjugated monoclonal antibodies
CA1225930A (en) * 1982-06-07 1987-08-25 Otto A. Gansow Metal chelate conjugated monoclonal antibodies
US4507466A (en) * 1983-01-07 1985-03-26 The Dow Chemical Corporation Dense star polymers having core, core branches, terminal groups
US4631337A (en) * 1983-01-07 1986-12-23 The Dow Chemical Company Hydrolytically-stable dense star polyamine
US4558120A (en) * 1983-01-07 1985-12-10 The Dow Chemical Company Dense star polymer
US4606907A (en) * 1984-07-02 1986-08-19 The Dow Chemical Company Bone seeking Tc-99m complexes of phosphonate derivatives of polyamidoamines
US4599400A (en) * 1984-12-18 1986-07-08 The Dow Chemical Company Star/comb-branched polyamide
US4694064A (en) * 1986-02-28 1987-09-15 The Dow Chemical Company Rod-shaped dendrimer

Also Published As

Publication number Publication date
JPH06219966A (ja) 1994-08-09
IL83567A0 (en) 1988-01-31
FI981807A0 (fi) 1998-08-24
HU9303379D0 (en) 1994-03-28
KR970011151B1 (ko) 1997-07-07
ATE89743T1 (de) 1993-06-15
JPS63501878A (ja) 1988-07-28
EP0271180A1 (en) 1988-06-15
JPH07108860B2 (ja) 1995-11-22
FI981807A (fi) 1998-08-24
JPH072840B2 (ja) 1995-01-18
NO176306B (no) 1994-12-05
NO881639L (no) 1988-06-15
FI105693B (fi) 2000-09-29
AU8139191A (en) 1991-10-03
ES2054678T3 (es) 1994-08-16
AU7715987A (en) 1988-03-03
JPH06220190A (ja) 1994-08-09
IL83567A (en) 1992-02-16
DK205388D0 (da) 1988-04-14
DK205388A (da) 1988-06-14
NO881639D0 (no) 1988-04-15
DE3786000T2 (de) 1993-09-02
BR8707432A (pt) 1988-11-01
JPH0757736B2 (ja) 1995-06-21
DK174053B1 (da) 2002-05-13
AU638153B2 (en) 1993-06-17
HK54396A (en) 1996-04-03
WO1988001179A1 (en) 1988-02-25
BR8707431A (pt) 1988-11-01
FI881768A0 (fi) 1988-04-15
DE3786000D1 (de) 1993-07-01
JP2771404B2 (ja) 1998-07-02
FI881768A (fi) 1988-04-15
MX169992B (es) 1993-08-04
NZ221484A (en) 1991-01-29
WO1988001178A1 (en) 1988-02-25
ES2054678T5 (es) 1997-09-16
KR880701564A (ko) 1988-11-03
DE3786000T3 (de) 1997-08-21
JPS63502350A (ja) 1988-09-08
FI103410B (fi) 1999-06-30
IE872210L (en) 1988-02-18
EP0271180B1 (en) 1993-05-26
HUT55245A (en) 1991-05-28
JPH069778A (ja) 1994-01-18
JPS63501876A (ja) 1988-07-28
FI103410B1 (fi) 1999-06-30
GR3024215T3 (en) 1997-10-31
HU220205B (hu) 2001-11-28
JPH0757735B2 (ja) 1995-06-21
MY102878A (en) 1993-03-31
NO176306C (no) 1995-03-15
JP2848218B2 (ja) 1999-01-20
IE61356B1 (en) 1994-11-02
ZA876114B (en) 1989-04-26
AU609051B2 (en) 1991-04-26
WO1988001180A1 (en) 1988-02-25
BR8707433A (pt) 1988-11-01
EP0271180B2 (en) 1997-06-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU209252B (en) Star-polymere-con jugate and process for producing them
US5527524A (en) Dense star polymer conjugates
US6312679B1 (en) Dense star polymer conjugates as dyes
US5338532A (en) Starburst conjugates
US5714166A (en) Bioactive and/or targeted dendrimer conjugates
Medina et al. Dendrimers as carriers for delivery of chemotherapeutic agents
WO1997006833A9 (en) Hyper comb-branched polymer conjugates
Sampathkumar et al. Dendrimers in cancer treatment and diagnosis
CA2788736C (en) Polyanionic multivalent macromolecules for intracellular targeting of proliferation and protein synthesis
EP0844891A1 (en) Hyper comb-branched polymer conjugates
CA1316456C (en) Starburst conjugates
AU768662B2 (en) Bioactive and/or targeted dendrimer conjugates

Legal Events

Date Code Title Description
HPC4 Succession in title of patentee

Owner name: DENDRITIC NANOTECHNOLOGIES, INC., US