HU206519B - Process for producing recombinant deoxy-ribonucleinic acid expressive vectors for producing penicillium chrysogenum isopenicillin n synthetase and determining deoxy-ribonucleinic acids - Google Patents

Process for producing recombinant deoxy-ribonucleinic acid expressive vectors for producing penicillium chrysogenum isopenicillin n synthetase and determining deoxy-ribonucleinic acids Download PDF

Info

Publication number
HU206519B
HU206519B HU864856A HU485686A HU206519B HU 206519 B HU206519 B HU 206519B HU 864856 A HU864856 A HU 864856A HU 485686 A HU485686 A HU 485686A HU 206519 B HU206519 B HU 206519B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
plasmid
dna
isopenicillin
synthetase
ala
Prior art date
Application number
HU864856A
Other languages
English (en)
Other versions
HUT44801A (en
Inventor
Lucinda Gavle Carr
Thomas Dominick Ingolia
Stephen Wyatt Queener
Paul Luther Skatrud
Original Assignee
Lilly Co Eli
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Lilly Co Eli filed Critical Lilly Co Eli
Publication of HUT44801A publication Critical patent/HUT44801A/hu
Publication of HU206519B publication Critical patent/HU206519B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/93—Ligases (6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/67—General methods for enhancing the expression
    • C12N15/69—Increasing the copy number of the vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome

Description

A találmány olyan dezoxi-ribonukleinsav szekvenciára vonatkozik, amely a Penicillium chrysogenum izopenicillin N szintetáz aktivitást kódolja. Az izopenicillin N szintetáz enzim azt a reakciót katalizálja, amelynek során a delta-(L-a-amino-adipi!)-L-ciszteinil-D-valinból izopenicillin N keletkezik. A reakció fontos antibiotikumok, például a Penicillium chrysogenum, Cephalosporium acremonium, továbbá a Streptomyces clavuligerus által bioszintetizált penicillinek bioszintézisében kritikus lépés; szerepet játszik továbbá a
C. acremonium cefalosporinjainak és a S. clavuligerus 7a-metoxi-cefalosporinjainak bioszintézisében is.
Az izopenicillin N szintetáz aktivitást meghatározó, új dezoxi-ribonukleinsav szekvenciát a Penicillium chrysogenum törzsből izoláltuk, és az aktivitást kifejező rekombináns dezoxi-ribonukleinsav expressziós vektorok előállítására használtuk fel. A leírásban ismertetett bizonyos vektorok E. coli sejtekben magas aktivitást eredményezően fejezi ki az izopenicillin N szintetázt, más vektorok pedig Cephalosporium acremonium és Penicillium chrysogenum törzsekben fejezi ki a szekvenciát.
Az E. coli sejtekben keletkező izopenicillin N szintetáz azt a reakciót katalizálja, amelynek során a delta(L-a-amino-adipil)-L-ciszteinil-D-valinból izopenicillin N jön létre, A találmány szerinti vektorokkal transzformált E. coli sejtek nyers extraktumaiban mindenféle előzetes aktivációs kezelés nélkül izopenicillin N szintetáz aktivitást mértünk. így a találmány szerinti E. coli vektorok alkalmasak nagy mennyiségű aktív izopenicillin N szintetáz enzim előállítására. Az izopenicillin N szintetáz enzimet nemcsak izopenicillin N előállítására használhatjuk fel, hanem a delta-(L-ct-amino-adipil)-L-ciszteinil-D-valinból különböző tripeptidek kondenzációjára is, ami után új antibiotikumokat kaphatunk.
A találmány szerinti Cephalosporium vektorokat törzsek termelőképességének fokozására használhatjuk. A Cephalosporium gazdasági szempontból fontos mikroorganizmus, a penicillin és a cefalosporin antibiotikumok előállítására használatos. A találmány szerinti kifejező dezoxi-ribonukleinsav vektorokkal transzformálva Cephalosporium sejteket, a transzformánsokban in vivő nagyobb izopenicillin N szintetáz aktivitást mérünk.
Hasonlóképpen, a találmány szerinti Penicillium vektorokat is felhasználhatjuk törzsek termelőképességének fokozására. A Penicillium gazdasági szempontból fontos mikroorganizmus, amit a penicillin antibiotikumok előállítására használnak. A találmány szerinti rekombináns dezoxi-ribonukleinsav expressziós vektorokkal transzformálva a sejteket, a transzformánsokban in vivő nagyobb izopenicillin N szintetáz aktivitást mérünk. Mivel a transzformánsok izopenicillin N szintetáz aktivitása magasabb, mint nem-transzformált partnereiké, a transzformánsok az izopenicillin N antibiotikumot gyorsabban és hatékonyabban termelik, így antibiotikumok termelésére jobban használhatók, mint nem-transzformált szülőtörzseik.
Az izopenicillin N szintetáz enzimet meghatározó dezoxi-ribonukleinsavakat úgy módosítjuk, hogy a velük készített expressziós vektorok növeljék más mikroorganizmusokkal, például Streptomyces clavuligerusszal végzett fermentációk hozamát is. Bár a találmány szerinti, izopenicillin N szintetázt meghatározó dezoxiribonukleinsavat Penicillium chrysogenum sejtekből izoláltuk, felhasználhatók olyan vektorok készítésére is, amelyek az izopenicillin N szintetáz aktivitást kifejezik több gazdasejtben, például E. coli és Cephalosporin acremonium vektorokkal transzformált sejtjeiben. Az összes penicillint és cefalosporint termelő mikroorganizmus a delta-(L-a-amino-adipiI)-L-ciszteinil-Dvalint és az izopenicillin N-t használja fel prekurzorként. Ezért a találmány szerinti, izopenicillin N szintetázt meghatározó dezoxi-ribonukleinsav felhasználható olyan vektorok előállítására, amelyek fokozzák az összes nemű cefalosporin és penicillin antibiotikumokat termelő törzsekkel végzett fermentáció hatékonyságát és hozamát.
A találmány szerinti, izopenicillin N szintetáz enzimet meghatározó dezoxi-ribonukleinsavakat Penicillium chrysogenum össz-dezoxi-ribonukleinsavából származik, a szekvenciát az izopenicillin N szintetázt meghatározó genomiális dezoxi-ribonukleinsav transzkripciós és transzlációs aktivációs szekvenciájával együtt izoláltuk. A találmány vonatkozik ezeknek az új transzkripciós és transzlációs aktivációs szekvenciáknak a használatára is, ezekkel géneket fejezhetünk ki P. chrysogenum és Cephalosporium acremonium sejtekben.
A találmány vonatkozik az izopenicillin N szintetáz gén szabályozó szignáljaira is, amelyek a gén kódoló régiójának kódoló szálján helyezkedik el a 3’-végen. Ez a 3’ szabályozó szekvencia meghatározza a transzkripciós terminációs helyet, és a gén mRNS poliadenilezésének és képződésének szignáljait. Ezen szignálok helyes pozícióban való elhelyezkedése a kódoló szál 3’-végén a vektorban leírt, adott tennék expresszióját fokozza.
A továbbiakban részletesen ismertetjük a találmányt. A leírás jobb érthetősége érdekében bizonyos fogalmakat az alábbiakban definiálunk.
Antibiotikum: egy mikroorganizmus által termelt anyag, amely önmagában vagy némi kémiai módosítást követően más mikroorganizmus vagy eukarióta sejtek növekedését gátolja, esetleg megöli azokat.
Antibiotikum bioszintetikus gén:olyan dezoxi-ribonukieinsav szegmens, amely egy primer metabolit antibiotikummá való alakításakor szerepet játszó enzimes reakció enzimét határozza meg.
Antibiotikum termelő mikroorganizmus:bármely mikroorganizmus, például - nem limitáló jelleggel - Streptomyces, Bacillus, Monospora, Cephalosporium, Podospora, Penicillium vagy Nocardia, amely egy antibiotikumot termel, vagy tartalmaz géneket, amelyek kifejeződésekor antibiotikum bioszintetizálódhat.
HU 206519 Β
Antibiotikum rezisztenciát meghatározó gén:olyan dezoxi-ribonukleinsav szegmens, amely egy antibiotikummal szembeni rezisztenciát biztosító aktivitást kódol.
ApR: ampicillin rezisztenciát meghatározó gén.
bGH: szarvasmarha növekedési hormon-származékot meghatározó dezoxi-ribonukleinsav.
Bifunkcionális klónozó (Shuttle) vektor:olyan rekombináns dezoxi-ribonukleinsav klónozó vektor, amely replikálódik és/vagy beépül két különböző'fajú mikroorganizmusban.
Ceph dezoxi-ribonukleinsav:Cephalosporium acremoniumból származó dezoxi-ribonukleinsav.
Ceph őri: olyan Cephalosporium acremonium mitokondriális dezoxi-ribonukleinsav, amely egy rekombináns dezoxi-ribonukleinsav vektor extrakromoszómális fennmaradását biztosítja.
cIPS: a Cephalosporium acremonium izopenicillin N szintetázát meghatározó dezoxiribonukleinsav.
cIPSp: A Cephalosporium acremonium izopenicillin N szintetáz (IPS) génjének transzkripciós és transzlációs aktivációs szekvenciája.
cIPSt: a Cephalosporium acremonium izopenicillin N szintetáz génjének transzkripciós terminációs és mRNS poliadenilező és szintézist elindító szignálja.
Klónozás: egy dezoxi-ribonukleinsav szegmens beépítésének folyamata egy rekombináns dezoxi-ribonukleinsav klónozó vektorba.
cos: a lambda fág kohézív (ragadós) végei.
Funkcionális polipeptid: kinyerhető, biológiailag aktív, heterológ (idegen eredetű) vagy homológ (saját) polipeptid vagy prekurzor, kinyerhető, biológiailag aktív polipeptid, amely áll egy heterológ polipeptidből és egy homológ polipeptid részéből vagy egészéből; vagy egy olyan kinyerhető, biológiailag inaktív fúziós polipeptid, amely áll egy heterológ polipeptid részből és egy biológiailag inaktiváló, homológ polipeptid szekvenciából, amely specifikusan lehasítható.
Genom génkönyvtárrekombináns dezoxi-ribonukleinsav klónozó vektorok sorozata, amelyekbe dezoxi-ribonukleinsav szegmenseket építettünk be, és amelyek egy adott mikroorganizmus gyakorlatilag teljes klónozott genomját reprezentálják.
HmR: higromicin B antibiotikummal szembeni rezisztenciát meghatározó gén.
Hibridizáció: két homológ, egyszálú dezoxi-ribonukleinsav molekula összekapcsolása kétszálú dezoxi-ribonukleinsav molekula létrehozására, amely vagy teljesen vagy nem teljesen azonos bázisokból áll.
IPS: izopenicillin N szintetáz enzim.
Izopenicillin N szintetáz: egy enzim, más nevén cikláz,
kan: amely katalizálja a delta-(L-a-aminoadipil)-L-ciszteinil-D-valin izopenicillin N-né alakulását. kanamicin rezisztenciát meghatározó
KmR: gén. kanamicin rezisztenciát meghatározó
lacPO: gén. az E. coli lac operonjának promotere és
mel: operátor szekvenciája, a tirozináz gén.
mRNS: hírvivő (messenger) ribonukleinsav.
Operon: egy genetikai egységként működő gének
őri: és kapcsolt szabályozó részek összessége. Tagjai az operátor gén, strukturgén és regulátor gén. E. coli sejtekben funkcionáló replikációs
origó.
Pen dezoxi-ribonukleinsav:Penicillium chrysogenum sejtekből származó dezoxi-ribonukleinsav.
PGK: a Saccharomyces cerevisiae foszfoglicerát kináz gén transzkripciós és transzlációs aktivációs szekvenciája.
pIPS: a Penicillium chrysogenum izopenicillin
N szintetáz enzimét kódoló dezoxi-ribonukleinsav.
pIPSp: a Penicillium chrysogenum izopenicillin
N szintetáz génjének transzkripciós és transzlációs aktivációs szekvenciája.
pIPSt: a Penicillium chrysogenum izopenicillin
N szintetáz génjének transzkripciós terminációs és mRNS poliadenilációs és szintéziskezdő szignáljai.
Rekombináns dezoxi-ribonukleinsav klónozó vektor bármely autonóm replikálódó vagy integrálódó szekvencia, ideértve, de nem limitálóan, a következőket: plazmidok, amelyekbe egy vagy több dezoxi-ribonukleinsav szekvenciát lehet, vagy építettünk be.
Rekombináns dezoxi-ribonukleinsav kifejező vektor bármely autonóm replikálódó vagy beépülő szekvencia, ideértve, de nem limitálóan, a plazmidokat, amelyek egy kutatási vagy gazdasági szempontból fontos polipeptidet vagy ribonukleinsavat meghatározó dezoxi-ribonukleinsav szegmens kifejeződését meghatározó transzkripciós és transzlációs aktivációs szekvenciát hordoznak, megfelelő pozícióban.
Rekombináns dezoxi-ribonukleinsav vektor bármely rekombináns dezoxi-ribonukleinsav klónozó vagy expressziós vektor.
Restrikciós ffagmens: bármely, egy vagy több enzim hatására képződő lineáris dezoxi-ribonukleinsav molekula.
HU 206519 Β rRNS; riboszómális ribonukleinsav.
Érzékeny gazdasejt:olyan sejt, amely nem képes növekedni egy adott antibiotikum jelenlétében anélkül, hogy az adott antibiotikummal szembeni rezisztenciát biztosító dezoxi-ribonukleinsav szegmenssel nem rendelkezne.
TcR: tetraciklinnel szembeni rezisztenciát meghatározó gén.
Transzkripciós aktivációs szekvencia:olyan dezoxi-ribonukleinsav szekvencia, amely a dezoxi-ribonukleinsav átírását (transzkripcióját) kezdeményezi.
Transzfektáns:recipiens gazdasejt, amelyet fág dezoxiribonukleinsavval fertőztünk,
Transzformáns:recipiens gazdasejt, amelyet transzformáltunk.
Transzformáció:dezoxi-ribonukleinsav bejuttatása recipiens gazdasejtbe, amelynek következtében változik a genotípus, és a recipiens sejt változását eredményezi.
Transzlációs aktivációs szekvencia:olyan dezoxi-ribonukleinsav szekvencia, amely mRNS-sé transzlatálva irányítja a hírvivő ribonukleinsav proteinné való transzlációját.
trp: az E.' coli triptofán operonjának transzkripciós és transzlációs aktivációs szekvenciája.
Az 1-17. ábrákon restrikciós és funkcionális térképeket adunk meg, ezzel jellemezzük a leírásban megfelelő rekombináns dezoxi-ribonukleinsav vektorokat. A restrikciós helyek elhelyezkedése a térképen aranyos a tényleges elhelyezkedéssel, de a megfigyelt távolságok az egyes restrikciós helyek között változhatnak a számított értéket alapul véve. A restrikciós helyekkel kapcsolatos információk nem teljesek, azaz egy adott vektoron a megadotthoz képest több restrikciós helyet is találhatunk.
1. ábra: a pIT335 plazmid restrikciós és funkcionális térképe.
2. ábra: a pLC2 plazmid restrikciós és funkcionális térképe.
3. ábra: a pCZIOó plazmid restrikciós és funkcionális térképe.
4. ábra: a pLC3 plazmid restrikciós és funkcionális térképe.
5. ábra: a pPS44 plazmid restrikciós és funkcionális térképe.
6. ábra: a ρΓΤ221 plazmid restrikciós és funkcionális térképe.
7. ábra: a pSPS19 plazmid restrikciós és funkcionális térképe.
8. ábra: a pPS21 A jelű plazmid restrikciós és funkcionális térképe.
9. ábra: a pPS28 plazmid restrikciós és funkcionális térképe.
10. ábra: a pPS29 plazmid restrikciós és funkcionális térképe.
11. ábra; a pPS45A.l plazmid restrikciós és funkcionális térképe.
12. ábra: a pS45B.l jelű plazmid restrikciós és funkcionális térképe.
13. ábra: a pPS42A.l plazmid restrikciós és funkcionális térképe.
14. ábra: a pPS42B.l jelű plazmid restrikciós és funkcionális térképe.
15. ábra: a pPS39 plazmid restrikciós és funkcionális térképe.
16. ábra: a pPS41 plazmid restrikciós és funkcionális térképe.
17. ábra: a pPS40 plazmid restrikciós és funkcionális térképe.
A találmány a Penicillíum chrysogenum sejtek izopenicillin N szintetáz aktivitást meghatározó szekvenciát hordozó rekombináns dezoxi-ribonukleinsav klónozó és expressziós vektorokra vonatkoznak. A P. chrysogenum izopenicillin N szintetáz enzimét meghatározó dezoxi-ribonukleinsav szekvenciát az alábbiakban adjuk meg, együtt azzal a dezoxi-ribonukleinsav szakasszal, amely a P. chrysogenum genom 3’-kódoló végén helyezkedik el, A megadott szekvencia csak a „sense” vagy kódoló szál nukleotid szekvenciáját adja meg a kétszálú dezoxi-ribonukleinsav molekulából, a nukleotid-sorrend 5’—3’ irányú. A nukleotid szekvenciát számozzuk; a számok a dezoxi-ribonukleinsav szekvencia felett látszanak. A dezoxi-ribonukleinsav szekvencia alatt közvetlenül az izopenicillin N szintetáz aminosav-sorrendjét adjuk meg balról jobbra, azaz az amino-terminális végtől a karboxilterminális végig haladva. Az adott nukleotid triplett által meghatározott aminosavak a dezoxi-ribonukleinsav szekvencia alatt látszanak. Az aminosavakat szintén számozzuk; az aminosavak számai az aminosavakat jelző betűk alatt vannak.
A Penicillíum Chrysogenum Izopenicillin N szintetáz enzimet meghatározó dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciát és a megfelelő aminosav-szekvenciát az alábbiakban adjuk meg:
20
5'-ATG GCT TCC ACC CCC AAG GCC
MET ALA SER THR PRO 5 LYS ALA ASN
50 60 70
CTG TTC GGC GAC AAT ATG GAG GAG
LEU PHE GLY ASP ASN MET GLU GLU
40
AAT GTC CCC AAG ATC GAC GTG TCG CCC
VAL PRO LYS ILE ASP VAL SER 15 PRO
10
80 90
AAG ATG AAG GTT GCC CGC GCG ATT
LYS MET LYS VAL ALA ARG ALA ILE
HU 206 519 Β
100 110 120 130 140
GAC GCT GCC TCG CGC GAC ACC GGC TTC TTC TAC GCG GTC AAC CAC GGT ASP ALA ALA SER ARG ASP THR GLY PHE PHE TYR ALA VAL ASN HIS GLY
40 45
150 160 170 180 190
GTG GAT GTG AAG CGA CTC TCG AAC AAG ACC AGG GAG TTC CAC TTT TCT VAL ASP VAL LYS ARG LEU SER ASN LYS THR ARG GLU PHE HIS PHE SER
55 60
200 210 220 230 240
ATC ACA GAC GAA GAG AAG TGG GAC CTC GCG ATT CGC GCC TAC AAC AAG
ILE THR ASP 65 GLU GLU LYS 70 TRP ASP LEU ALA ILE ARG 75 ALA TYR ASN LYS 80
250 260 270 280
GAG CAC CAG GAC CAG ATC CGT GCC GGA TAC TAC CTG TCC ATT CCG GAG
GLU HIS GLN ASP GLN ILE ARG ALA GLY TYR TYR LEU SER ILE PRO GLU
85 90 95
290 300 310 320 330
AAA AAG GCC GTG GAA TCC TTC TGC TC CTG AAC CCC AAC TTC AAG CCC
LYS LYS ALA VAL GLU SER PHE CYS TYR LEU ASN PRO ASN PHE LYS PRO
100 105 110
340 350 360 370 380
GAC CAC CCT CTC ATC CAG TCG AAG ACT CCC ACT CAC CAG GTC AAC GTG
ASP HIS PRO LEU ILE GLN SER LYS THE PRO THR HIS GLU VAL ASN VAL
115 120 125
390 400 410 420 430
TGG CCG GAC GAG AAG AAG CAT CCG GGC TTC CGC GAG TTC GCC GAG CAA
TRP PRO ASP GLU LYS LYS HIS PRO GLY PHE ARG GLU PHE ALA GLU GLN
130 135 140
440 450 460 470 480
TAC TAC TGG GAT GTG TTC GGG CTC TCG TCT GCC TTG CTG CGA GCG TAT
TYR TYR TRP ASP VAL PHE GLY LEU SER SER ALA LEU LEU ARG GLY TYR
145 150 155 160
490 500 510 520
GCT CTG GCG CTG GGC AAG GAG GAG GAC TTC TTT AGC CGC CAC TTC AAG
ALA LEU ALA LEU GLY LYS GLU GLU ASP PHE PHE SER ARG HIS PHE LYS
165 170 175
530 540 550 560 570
AAG GAA GAC GCG CTC TCC TCG GTT GTT CTG ATT CGT TAC CCG TAC CTG
LYS GLU ASP ALA LEU SER SER VAL VAL LEU ILE ARG TYR PRO TYR LEU
180 185 190
580 590 600 610 620
AAC CCC ATC CCA CCT GCC GCC ATT AAG ACG GCG GAG GAC GGC ACC AAA
ASN PRO ILE PRO PRO ALA ALA ILE LYS THR ALA GLU ASP GLY THR LYS
195 200 205
630 640 650 660 670
TTG AGT TTC GAA TGG CAT GAG GAC GTG TCG CTC ATT ACC GTC CTG TAC
LEU SER PHE GLU TRP HIS GLU ASP VAL SER LEU ILE THR VAL LEU TYR
210 215 220
HU 206 519 Β
680
690
700
710
720
CAG TCA GAC GTG GCG AAC CTG CAG GTG GAG ATG CCC CAG GGT TAC CTC
GLN SER ASP VAL ALA ASN LEU GLN VAL GLU MET PRO GLN GLY TYR LEU
225 230 235 240
730 740 750 760
GAT ATC GAG GCG GAC GAC AAC GCC TAC CTG GTC AAT TGC GGC AGC TAC
ASP ILE GLU ALA ASP ASP ASN ALA TYR LEU VAL ASN CYS GLY SER TYR
245 250 255
770 780 790 800 810
ATG GCA CAC ATC ACC AAC AAC TAC TAC CCC GCT CCC ATC CAC CGG GTC
MET ALA HIS ILE THR ASN ASN TYR TYR PRO ALA PRO ILE HIS ARG VAL
260 265 270
820 830 840 850 860
AAG TGG GTG AAC GAG GAG CGC CAA TCC CTC CCG TTC TTC GTC AAT CTG
LYS TRP VAL ASN GLU GLU ARG GLN SER LEU PRO PHE PHE VAL ASN LEU
275 280 285
870 880 890 900 910
GGA TTT AAT GAT ACC GTC CAG CCG TGG GAT CCT AGC AAG GAA GAC GGC
GLY PHE ASN ASP THR VAL GLN PRO TRP ASP PRO SER LYS GLU ASP GLY
290 295 300
920 930 940 950 960
AAG ACC GAT CAG CGG CCA ATC TCG TAC GGC GAC TAT CTG CAG AAC GGA
LYS THR ASP GLN ARG PRO ILE SER TYR GLY ASP TYR LEU GLN ASN GLY
305 310 315 320
970 980 990 1000
TTA GTT AGT CTA ATC AAC AAG AAC GGC CAG ACA TGA AAG GGC CCA TGG
LEU VAL SER LEU ILE ASN LYS ASN GLY GLN THR
325 330
1010 1020 1030 1040 1050
ATG GGA CCG GGA TGG AAA TCC CGG ACT CTG AGC TAA ACC GAG TCG AGA
1060 1070 1080 1090 1100
AAA AAA AGG GAG GAG CCG CCA CCA TGC CGC CAC CTT CGT CTA CCT AAT
1110 1120 1130 1140 1150
TAT CCA TAG CCG AAG GGT AGA TAG ACC TAG TCG TCG AAT AGT TAT TAT
1160 1170 1180 1190 1200
TTT CAC CAT CCA TGC CAA AAT GGT TAA CGT GCA TCG TTC CTA TGT GAC
1210 1220 1230 1240
CAC GTA GAC CAT GCC AGT GAT TCC ATG GCT GCC TGG CCC GGT CCA GTA
1250 1260 1270 1280 1290
GAA GAC TGA ACC TCT TCG AGA TAA CAA GAT TTT TCT TAT TGT TGT AGC
1300 130 1320 1330 1340
AGG ATG GGT GGG GTC ACC TCG TTT TCT TCA GCT CTG GCT CCT GAA GAT
1350 1360 1370 1380 1390
TTG CCT GGT AGT GAG CTG TTT TAG GAA CCA CCT GCA TTG AAC TAA ATT
1400 1410 1420
AGT ACG AAT CAG CAG AAG GAC CAC GGT T-3'
HU
A fenti szekvenciákban:
A dezoxi-adenil-csoport,
G dezoxi-guanil-csoport,
C dezoxi-citidil-csoport,
T timidilcsoport,
ALA alanin,
ARG arginin,
ASN aszparagin,
ASP aszparaginsav,
CYS cisztein,
GLN glutamin,
GLU glutaminsav,
GLY glicin,
GIS hisztidin,
ILE izoleucin,
LEU leucin,
LYS lizin,
MET metionin,
PHE fenil-alanin,
PRO prolin,
SER szerin,
THR treonin,
TRP triptofán,
TYR tirozin,
VAL valin.
A témában jártas szakember felismeri, hogy az előzőekben megadott dezoxi-ribonukleinsav szekvencia a jelen szabadalmi leírás fontos része. A fenti szekvenciát ismert módon, teljesen védett dezoxi-ribonukleotid építőkövekből a módosított foszfo-triészter módszerrel ismert módon szintetizálhatjuk. Ezek a szintetikus módszerek jól ismertek az irodalomban, és lényegében Itakura és munkatársai szerint kivitelezhetők [Science, 198, 1056 (1977); Crea és munkatársai, Proc. Nat. Acad. Sci., USA, 75, 5765 (1978)]. A fentieken kívül különösen előnyös módszert ismertet a dezoxi-ribonukleinsav szintézisére Hsiung és munkatársai [Nucleic Acid Research, 11,3227 (1983) és Narang és munkatársai, Methods in Enzymology, 68,90 (1980)]. A fentiekben ismertetett manuális módszereken kívül használhatunk automatikus dezoxi-ribonukleinsav szintetizálókat is a dezoxi-ribonukleinsav szekvencia szintézisére, mint például az alábbi modelleket: Systec 1450A vagy ABS 380A.
A genetikai kód degeneráltsága miatt, ami azt jelenti, hogy a legtöbb aminosavat és stop szignált egynél több kódon határoz! meg, a fentiekben megadott izopenicillin N szintetáz aminosav szekvencia különböző dezoxi-ribonukleinsav szekvenciákkal írható le. Mivel ezek az egymástól különböző dezoxi-ribonukleinsav szekvenciák hasonló aminosavakból álló proteint határoznak meg, a találmány vonatkozik ezekre a változó szekvenciákra is.
Mindezeken felül, létezhet olyan izopenicillin N szintetázt meghatározó dezoxi-ribonukleinsav genetikai variáns is, amely szintén a találmány oltalmi köréhez tartozik. Ezek a genetikai variánsok gyakorlatilag azonos dezoxi-ribonukleinsav és aminosav szekvenciát határoznak meg, mint a találmány szerintiek, és a protein hasonló, esetleg azonos aktivitású, de a találmány
206 519 B 2 szerinti vegyietektől valamilyen mértékben különböznek. Ezek a genetikai variánsok ekvivalensnek számítanak a találmány szerinti szekvenciákkal.
A találmány szerinti, izopenicillin N szintetáz aktivi5 tást meghatározó dezoxi-ribonukleinsavat a Penicillium chrysogenum sejtjeiből izoláltuk. Előállítottuk a P. chrysogenum teljes genomiális dezoxi-ribonukleinsavából a genomiális génkönyvtárat, és vizsgáltuk ezt a ρΓΓ335 plazmidon levő Cephalosporium acremonium izopenicillin N szintetáz génnel való szekvencia homológiát; a plazmid az alábbi helyen szerezhető be: Northern Régiónál Research Laboratories, Agricultural Research Service, U. S. Department of Agriculture, Peoria, Illinois, 61604. A törzs a törzsgyűjteményben NRRL B-15960 sorszámon szerepel. A ρΓΓ335 plazmid restrikciós és funkcionális térképét a mellékelt 1. ábrán adjuk meg.
A genomiális génbankot hordozó vektorok közül több homológiát mutatott a C. acremonium izopenicillin N szintetáz génnel, a dezoxi-ribonukleinsav szekve20 nálása is arra mutatott, hogy a vektorok közül legalább egy tartalmazza a P. chrysogenum izopenicillin N szintetáz gént. A vektor egy származékát pLC2 jellel jelöltük, ez tartalmazza a Penicillium chrysogenum izopenicillin N szintetáz gén teljes szekvenciáját. A plazmi25 dót E. coli K12 JM109 jelű sejtekbe transzformáltuk, és az E. coli K12 JM109/pLC2 transzformánsokat az alábbi tőrzsgyűjteményben letétbe helyeztük: American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, 20852. A törzs az alábbi sorszámot kapta: ATCC
53334. A pLC2 plazmid restrikciós és funkcionális térképét a mellékelt 2. ábrán mutatjuk be.
A pLC2 plazmidot az E. coli K12 JM109/pLC2 törzsből az 1. példában megadottak szerint izoláljuk. A pLC2 plazmidot használjuk kiindulási anyagként a pLC3 jellel jelzett plazmid előállítására, ez E. coli sejtekben nagy mennyiségű izopenicillin N szintetázt expresszál. A pLC3 plazmid előállítására a pLC2 plazmid 1,6 kb nagyságú NcoI-BglII restrikciós fragmensét ligáljuk a pCZ106 plazmid 8,7 kb nagyságú Ncol-Ncol és 1,6 kb nagyságú NcoI-BamHI restrikciós fragmenseihez.
A pCZ106 plazmid tartalmaz egy úgynevezett runaway replikont, tartalmazza a trp transzkripciós és transzlációs aktivációs szekvenciát és operátort, ezeken kívül egy olyan dezoxi-ribonukleinsav szekvenciát, amely szarvasmarha növekedési hormon-származékot kódol. A pCZ106 plazmidban levő runaway típusú replikont a 4487835 és 4499189 és a 4495287 számú amerikai szabadalmi leírásokból ismerhetjük meg. Lényegében arról van szó, hogy alacsony hőmérsékleten, 25 °C körül a runaway replikont hordozó plazmid E. coli sejtenként 10-15 példányszámban van jelen, azonban, ha a hőmérsékletet 37 ’C-ra növeljük, úgy a példányszám E. coli gazdasejtenként 1000-re emelkedik. Az E. coli K12 RV308/pCZ106 gazdasejteket, amelyekből a pCZ106 plazmidot izoláljuk, az alábbi törzsgyűjteményben helyeztük letétbe: Northern Régiónál Research Laboratories, Peoria, Illinois; a törzs az alábbi sorszámon szerepel: NRRL B—15959. A pCZIOó plazmid restrikciós és funkcionális térképét a leíráshoz mellékelt 3. ábrán mutatjuk be.
HU 206 519 Β
A pLC3 plazmid tartalmazza a runaway replikont, a trp transzkripciós és transzlációs aktivációs szekvenciát a pCZ106 plazmidból, és a pLC2 plazmidból pedig az izopenicillin N szintetáz proteint kódoló gént. A pLC2 plazmid 1,6 kb nagyságú Ncol-Bglll restrikciós fragmense tartalmazza az izopenicillin N szintetáz proteint kódoló teljes szekvenciát, tartalmazza az Ncol restrikciós enzim által felismerhető szekvenciát, amely az alábbi:
5'-CCATGG-3' r t t r / r
3'-GGTACC-5', ez a szekvencia tartalmazza az alábbi kodont:
5'-ATG-3' r r t
3'-TAC-5', amely az izopenicillin N szintetáz enzim amino-terminális metioninját határozza meg. A pLC2 plazmid 1,6 kb nagyságú Ncol-Bglll restrikciós fragmense tartalmaz továbbá két Ncol restrikciós helyet, közelítőleg 500 bázispámyi és 300 bázispámyi távolságra (5’-irányban) a BgUI végtől. A fentiekből következik, hogy a kívánatos fragmens izolálásához részleges Ncol emésztést kell végeznünk.
A pLC3 plazmid előállításakor a trp transzkripciós és transzlációs aktivációs szekvenciát úgy helyezik el, hogy az irányítsa az izopenicillin N színtetázt kódoló dezoxi-ribonukleinsav kifejeződését. A pLC3 plazmid restrikciós és funkcionális térképét a leíráshoz mellékelt 4. ábrán mutatjuk be.
A pLC3 plazmid előállítását a 2. példában részletesen ismertetjük.
°C hőmérsékleten a pLC3 plazmidot hordozó E. coli K12 RV308 (NRRL B-15624) sejtek nagy menynyiségű izopenicillin N színtetázt expresszálnak, az enzim mennyisége eléri a teljes sejtfehérje 10%-át. Az E. coli K12 RV308/pLC3 transzformánsok nyers sejtextraktuma katalizálja a delta-(L-a-amino-adipil)-Lciszteinil-D-valin átalakulását izopenicillin N-né, ugyanakkor a nem transzformált E. coli K12 RV308 sejtek extraktumai ezt az átalakulást nem katalizálják. Az átalakítási reakció mérési módszerét a 3. példában adjuk meg.
A pLC3 plazmid segítségével hatékonyan tudunk előállítani nagy mennyiségű izopenicillin N színtetázt E. coli sejtekben. Mivel a pLC3 plazmiddal transzformált E. coli sejtek a sejt összproteinjére számolva 10%-os mennyiségben termelik az izopenicillin N szintetázt, továbbá, mivel az E. coli sejtek tenyésztése kevésbé komplikált, mint az izopenicillin N színtetázt természetes módon termelő mikroorganizmusoké, az E. coli/pLC3 transzformánsokat hatékonyabban és gazdaságosabban használhatjuk fel rekombináns izopenicillin N szintetáz előállítására, mint a nem rekombináns vagy „természetes” izopenicillin N szintetáz termelőket. A találmány szerinti E. coli K12/pLC3 transzformánsok azzal, hogy nagy mennyiségű izopenicillin N színtetázt termelnek, lehetővé teszik a Penicillium chrysogenum genomon kódolt izopenicillin N szintetáz gyakorlatilag tiszta alakban való izolálását.
Az izopenicillin N színtetázt felhasználhatjuk izopenicillin N előállítására delta-(L-a-amino-adipil)-Lciszteinil-D-valinból sejtmentes rendszerben, ahogy azt a 3. példában ismertetjük. Az izopenicillin N antibiotikumot nemcsak antibiotikumként használhatjuk, de kiindulási anyagként is olyan fontos antibiotikumok előállítására, mint a penicillin N, cefalexin és más, a 4307 192 számú amerikai szabadalmi leírásban ismertetett cefalosporinok előállításakor is. Az izopenicillin N szintetáz talán legfontosabb felhasználása a delta-(L(x-amino-adipil)-L-ciszteinil-D-valintól különböző tripeptidek gyűrűzárása új β-laktám-származékokká.
A penicillint termelő mikroorganizmusok sejtmentes extraktumait felhasználhatjuk nem természetes (a természetben nem képződő) β-laktám antibiotikumok szintézisére. A találmány szerinti E. coli kifejező vektorok egy olcsó és hatékony módszert kínálnak az izopenicillin N szintetáz előállítására, az enzimet felhasználhatjuk in vitro olyan tripeptidek kondenzálására, amelyek a természetben nem fordulnak elő, és amikor a gyűrűzárás után új antibiotikumokat vagy antibiotikum-vázakat kaphatunk.
A nem természetes tripeptidek mint szubsztrátok kutatását kiegészíthetjük olyan mutáns izopenicillin N szintetázok kutatásával, amelyek elfogadják szubsztrátként a nem természetes tripeptideket. A találmány szerinti módszer biztosítja a mutáns izopenicillin N szintetáz utáni kutatás kiindulási anyagát. Az E. coli a legjobb gazdasejt a mutációs klónozó kísérletekhez, a találmány szerinti E. coli expressziós vektorok pedig könnyen mutagenizálhatók a szakemberek körében jól ismert módszerekkel, például sugárkezeléssel (X-sugárzás vagy ultraibolya fénnyel való kezelés), vagy kémiai mutagenezissel (például etil-metán-szulfonát, nitrozo-guanidin vagy metil-metán-szulfonát), de végezhetünk helyspecifikus mutagenezist is, amikor olyan mutáns enzimekhez jutunk, amelyek felismerik szubsztrátként a nem természetes tripeptideket, és katalizálják ezen nem természetes tripeptidek kondenzálódását nem természetes β-laktámokká.
Más E. coli expressziós vektorokat is előállíthatunk a találmány oltalmi köréhez tartozó eljárással úgy, hogy először hozzákapcsoljuk a pKC309 jelű plazmid
1.8 kb nagyságú XmnI restrikciós fragmensét a pCZIOó plazmid 6,8 kb nagyságú BstEII-KpnI restrikciós fragmenséhez, amikor megkapjuk a pIT344 és ρΓΤ344.1 jelű plazmidokat, amelyek egymástól csak az XmnI restrikciós fragmens orientációjában különböznek egymástól. A pKC309 plazmidot a Northern Régiónál Research Center törzsgyűjteményében helyeztük letétbe NRRL B-15 827 sorszámon. A pKC309 plazmid
6.8 kb nagyságú, és a plazmid XmnI emésztése után három tompa végű ffagmenshez jutunk, ezek mérete 1,6, 1,8 és 3,6 kb. ApKC3O9 plazmid 1,8 kb nagyságú XmnI restrikciós fragmense apramicinnel szembeni rezisztenciát biztosító gént hordoz. A pCZIOó plazmid 10,9 kb nagyságú, a plazmid BstEII és Kpnl emésztését követően három fragmenshez jutunk, ezek mérete
-¾
HU
6,8 kb, 0,9 kb és 3,2 kb. A pCZ106 plazmid 6,8 kb nagyságú BstEII-KpnI restrikciós fragmense tartalmazza a trp transzkripciós és transzlációs aktivációs szekvenciát és az úgynevezett „runaway” replikont. A
6,8 kb nagyságú BstEII-KpnI restrikciós fragmenst először T4 dezoxi-ribonukleinsav polimerázzal kell kezelnünk nukleotidok távollétében a 3’-KpnI átfedő szekvencia eltávolítására, majd ezután T4 dezoxi-ribonukleinsav polimerázzal nukleotidok jelenlétében, amikor tompa végű molekulát kapunk; ezt a pKC309 plazmid 1,8 kb nagyságú XmnI restrikciós fragmensével ligáljuk, amikor megkapjuk a pIT344 és ρΓΓ344.1 jelű plazmidokat.
A ρΓΓ344 és ρΓΓ344.1 jelű plazmidok 8,4 kb nagyságúak, ha ezeket Ncol és BamHI restrikciós enzimekkel kezeljük, úgy 7,8 és 0,6 kb nagyságú fragmensekhez jutunk. A ρΓΓ344 és pIT344.1 plazmidok 7,8 kb nagyságú NcoI-BamHI restrikciós fragmensek hozzákapcsoljuk a pLC2 plazmid Penicillium chrysogenum izopenicillin N szintetáz gént hordozó 1,6 kb nagyságú NcoI-BglII restrikciós fragmenséhez, úgy sorrendben a ρΓΓ345 és ρΓΓ345.1 jelű plazmidokhoz jutunk. A pIT345 és ρΓΓ345.1 plazmidok mindegyike hordoz egy „runaway” replikont, apramicin rezisztencia gént és hordozza a trp transzkripciós és transzlációs aktivációs szekvenciát, amely úgy helyezkedik el, hogy irányítja a Penicillium chrysogenum izopenicillin N szintetáz génjének expresszióját. Az E. coli K12/pIT345 és E. coli K12/pIT345.1 transzformánsok 100 pg/ml apramicinre rezisztensek, és a 37 °C hőmérsékleten 4-6 órán át tenyésztett sejtek teljes proteinjének 10%-át elérő mennyiségű izopenicillin N szintetázt expresszálnak.
A találmányt nem limitáljuk a példákban megadott egyes vektorokra. A találmány szerinti dezoxi-ribonukleinsavak kódolják a Penicillium chrysogenum izopenicillin N szintetáz enzimet és felhasználhatók más Pehicillin törzsekből származó homológ dezoxi-ribonukleinsav szekvenciák izolálására, olyanokéra, amelyek genetikai szempontból variánsnak tekinthető izopenicillin N szintetázt határoznak meg. Ezért a találmány vonatkozik olyan dezoxi-ribonukleinsavakra is, amelyek izopenicillin N szintetáz aktivitást határoznak meg, és homológok a pLC2 plazmidon meghatározott izopenicillin N szintetáz szekvenciával. A találmány szerinti dezoxi-ribonukleinsavakat felhasználhatjuk olyan expressziós vektorok előállítására, amelyek képessé tesznek bármely gazdasejtet izopenicillin N szintetáz expresszálására, olyan gazdasejteket, amelyekben az expressziós vektor replikálódik és beépül, vagy amelyekben a transzkripciós és transzlációs aktivációs szekvencia alkalmas az izopenicillin N szintetáz aktivitás kifejezésére.
Bár a leírásban megadott E. coli expressziós vektorok „runaway” replikont használnak E. coli sejtekben, a találmány vonatkozik bármely olyan E. coli expressziós plazmidra vagy vektorra, amely E. coliban izopenicillin N szintetáz enzim expresszióját határozza meg. így a találmány vonatkozik mindazon expressziós vektorokra, amelyek izopenicillin N szintetázt expresszálnak, és amelyek E. coli sejtekben funkcionális
206519 B 2 replikont használnak fel replikációjukhoz; így például az alábbi plazmidokból származó replikonokat: pBR322, pACYC184, F, ColV-K94, RÍ, R6-5 vagy R100. A találmányt nem limitáljuk kizárólag plazmid vektorokra, vonatkozik az eljárás olyan expressziós vektorokra is, amelyek izopenicillin N szintetáz aktivitást expresszálnak, és a gazdasejtben való fennmaradásukhoz és replikációjukhoz integrálódó vagy vírus replikációs origót használnak fel.
A találmányt nem limitáljuk egyes transzkripciós és transzlációs aktivációs szekvenciákra, amelyek irányítják az izopenicillin N szintetáz aktivitást kódoló dezoxi-ribonukleinsav expresszálódását. A találmány értelmében használhatunk bármely olyan transzkripciós és transzlációs aktivációs szekvenciát az izopenicillin N szintetáz kifejezésére, amely E. coli sejtekben működik. Számtalan E. coli sejtekben funkcionális transzkripciós és transzlációs aktivációs szekvenciát ismerünk, és ezek alkalmasak E. coli sejtekben az izopeni20 cillin N szintetáz expresszálásának irányítására. Ilyen transzkripciós és transzlációs aktivációs szekvenciák például - nem limitálóan - a következők: lpp, lac, trp, tac, lambdapL, továbbá LambdapR transzkripciós és transzlációs aktivációs szekvencia.
A fentiekben megadott különböző E. coli transzkripciós és transzlációs aktivációs szekvenciákon kívül más mikroorganizmusokból származó transzkripciós és transzlációs aktivációs szekvenciákat kapcsolhatunk a találmány szerinti, izopenicillin N szintetázt kódoló dezoxi-ribonukleinsavhoz olyan vektorok előállítására, amelyek azokban a sejtekben, amelyekben az aktivációs szekvencia működik, kifejezik az izopenicillin N szintetázt. Bár az E. coli a legjobb gazdasejt az izopenicillin N szintetáz termelésére és a termelést követő tisztítás utáni in vitro felhasználásra, használhatunk E. coli sejteken kívül más izopenicillin N szintetáz aktivitást expresszáló gazdasejteket is, különösen abból a célból, hogy növeljük az adott mikroorganizmus β-laktám antibiotikum-termelő képességét.
Több mikroorganizmus termel β-laktám típusú antibiotikumokat. Az alábbi, I. táblázatban - a teljesség igénye nélkül - β-laktám antibiotikumot termelő mikroorganizmusokat adunk meg.
I. táblázat β-laktám antibiotikumokat termelő mikroorganizmusok
Mikroorganizmus Antibiotikum
Agrobacterium különböző β-laktámok
Cephalosporium penicillinek és
acremonium cefalosporinok
Chromobacterium különböző β-Iaktámok
Gluconobacter különböző β-laktámok
Nocardia, lactamdurans cefamicin C
uniformis nocardicin
HU 206 519 Β
Mikroorganizmus Antibiotikum
Penicillium
chrysogenum különböző penicillinek és más βlak tárnok
Serratia különböző β-laktámok
Streptomyces antibioticus kiavulánsav
argenteolus aszparenomicin A, MM 4550 és MM 13 902
Streptomyces, cattleya tienamicin
chartreusis SF 1623 és cefamicin Aés B
cinnamonensis cefamicin Aés B
clavuligerus PA-32 413-1, cefamicin C, A16886A, penicillinek, cefalosporinok, kiavulánsav, továbbá más klavámok
fimbriatus cefamicin Aés B
flavovirens MM 4550 és MM 13902
flavus MM 4550 és MM 13902
fulvoviridis MM 4550 és MM 13902
griseus cefamicin A és B, és karpetímicin Aés B
halstedi cefamicin Aés B
heteromorphus C2081X és cefamicin Aés B
hygroscopicus dezacetoxi-cefalosporin C
lipmanii cefamicin, penicillin N, 7-metoxicefalosporin C, A16 884, MM4550, MM139O2
olivaceus epitienamicín F, MM 4550 és MM 13902
panayensis C2081X és cefamicin A és B
pluracidomycetícus pluracidomicin A
rochei cefamicin Aés B
sioyaensis MM 4550 és MM 13902
sp. OA-6129 OA-6129A
sp. KC-6643 karpetímicin A
tokunomensis aszparenomicin A
viridochromogenes cefamicin A és B
Wadayamensis WS-3442-D
Az előzőekben felsorolt β-laktám típusú antibiotikumokat termelő mikroorganizmusokat antibiotikum termelés céljából használja a gyógyszeripar. Ezen mikroorganizmusok antibiotikum termelő képességét növelhetjük és hatékonyabbá tehetjük azzal, hogy ha a fermentáció során növeljük az antibiotikum bioszintézisben résztvevő enzimek sejten belüli koncentrációját. A találmány szerinti izopenicillin N szintetázt meghatározó dezoxi-ribonukleinsavakat felhasználhatjuk olyan expressziós vektorok előállítására, amelyeket a megfelelő gazdasejtbe transzformálva növekszik az izopenicillin N szintetáz intracelluláris koncentrációja, és így növekszik a sejt antibiotikum termelő képessége, természetesen akkor, ha a sejt által termelt β-laktám antibiotikum az izopenicillin N szintetáz enzimet felhasználja egy köztes reakcióban.
Annak a vektornak, amely növeli egy adott gazdasejt sejten belüli izopenicillin N szintetáz aktivitását a vektor sejtbe juttatását követően, az alábbi elemekkel kell, hogy rendelkezzen:
1. a találmány szerinti, izopenicillin N szintetáz aktivitást meghatározó dezoxi-ribonukleinsav szekvencia;
2. olyan transzkripciós és transzlációs aktivációs szekvencia, amely nemcsak funkcionál az adott transzformált gazdasejtben, de úgy is van elhelyezve, megfelelő orientációban és pozícióban, hogy irányítsa az izopenicillin N szintetázt kódoló dezoxi-ribonukleinsav expresszióját; végül
3. a gazdasejtben a vektort fenntartó replikációs vagy integrációs funkciók.
A fent leírt vektor természetesen tartalmazhat antibiotikum rezisztenciát meghatározó gént vagy egyes más elemeket, amelyek lehetővé teszik a vektort tartalmazó sejtek szelekcióját, ezek a szelektálást biztosító elemek azonban nem szükségesek akkor, ha a vektor a gazdasejt kromoszómális dezoxi-ribonukleinsavába beépül.
A találmány szerinti plazmidok nagy része felhasználható a β-laktám típusú antibiotikumokat termelő sejtek sejten belüli izopenicillin N szintetáz aktivitásának növelésére. A pLC2 plazmád tartalmazza a Penicillium chrysogenum intakt izopenicillin N szintetáz génjét, így a P. chrysogenum transzformációja után a pLC2 kromoszómába való beépülését követően megnövekszik az izopenicillin N szintetázt kódoló gének száma, és ezzel növekszik az enzim sejten belüli koncentrációja. A Penicillium chrysogenum izopenicillin N szintetáz génje működik Cephalosporium acremonium sejtekben is. Ezért, a C. acremonium transzformációját követően a pLC2 plazmid kromoszómális integrációja után növekszik az izopenicillin N szintetáz gének száma, és ezáltal növekszik az enzim sejten belüli koncentrációja.
A pLC2 plazmidot könnyen módosíthatjuk úgy, hogy a Penicillium chrysogenum izopenicillin N szintetáz enzimet meghatározó dezoxi-ribonukleinsav szegmens előtt levő szakaszt kicseréljük homológ Cephalosporium acremonium transzkripciós és transzlációs aktivációs szekvenciára. A C. acremonium izopenicillin N szintetáz génjének transzkripciós és transzlációs aktivációs szekvenciáját a ρΓΤ335 plazmid 0,85 kb nagyságú Ncol restrikciós ffagmenséből izolálhatjuk. Ha a 0,85 kb nagyságú Ncol restrikciós fragmenst megfelelő orientációba beépítjük a P. chrysogenum izopenicillin N szintetáz gén kódoló szakaszának 5’-végére a pLC2 plazmidba, úgy a pPS44 jellel jelzett plazmádhoz jutunk, ami így homológ C. acremonium aktivációs szekvenciát fog tartalmazni, mégpedig olyan pozícióban, hogy irányítani képes a P. chrysogenum izopenicillin N szintetáz génjének expresszióját. A pPS44 plazmid restrikciós és funkcionális térképét a leíráshoz mellékelt 5. ábrán adjuk meg, a pPS44 plazmid előállítását pedig részletesen ismertetjük a 4. példában.
HU 206519 Β
A Cephalosporium, acremonium transzkripciós és transzlációs aktivációs szekvenciája működik Penicillium chrysogenum sejtben. Ezért a pPS44 plazmid növelni fogja az izopenicillin N szintetáz sejten belüli koncentrációját akkor, ha P. chrysogenum vagy C. acremonium sejtekbe transzformáljuk. A pPS44 plazmid nem tartalmaz P. chrysogenum vagy C. acremonium sejtekben használható szelektálható markert, de ilyen markert könnyen bejuttathatunk [Ingolia és munkatársai, amerikai közzétételi irat, T/40705 sz. nyilvánosságra hozott magyar szabadalmi leírás]. Az itt ismertetett pPS29 jelű plazmid tartalmazza a C. acremonium izopenicillin N szintetáz génjének transzkripciós és transzlációs aktivációs szekvenciáját, mégpedig olyan helyzetben, hogy az irányítja a higromicin rezisztenciát meghatározó gén expresszióját.
A pPS29 plazmidon levő higromicin rezisztencia gén felhasználható szelektálható markerként mind a Cephalosporium acremonium, mind pedig a Penicillium chrysogenum sejtekben, ahogy azt az EP-A177 243 sorszámú, 1986. április 9-i elsőbbségű európai szabadalmi leírásban olvashatjuk. Ez a szelektálható marker izolálható a pPS29 plazmidból, annak 2,3 kb nagyságú HindlII restrikciós fragmensén található. A pPS29 plazmid előállítását részletesen ismertetjük az 5. példában, a plazmid restrikciós és funkcionális térképét pedig a leíráshoz mellékelt 10. ábrán mutatjuk be.
A pPS29 plazmid 2,3 kb nagyságú HindlII restrikciós fragmensét izoláljuk, és beépítjük a pPS44 plazmid részleges HindlII emésztéssel kapott fragmenséhez, amikor egy sor olyan plazmidhoz jutunk, amely nem csak a Cephalosporium acremonium izopenicillin N szintetáz génjének aktivációs szekvenciáját tartalmazza olyan elhelyezkedésben, hogy irányítani képes a Penicillium chrysogenum izopenicillin N szintetáz gén expresszálását, de tartalmaznak a pPS29 plazmidból származó higromicin rezisztencia gént is.
Mivel a pPS44 plazmid két HindlII restrikciós helyet tartalmaz, ezek egyike alkalmas a pPS29 plazmid higromicin rezisztenciát meghatározó ffagmensének beépítésére; továbbá, mivel a pPS29 plazmid HindlII restrikciós fragmense beépíthető a pPS44 plazmid bármelyik HindlII helyére, két orientációban, a beépítést követően négy plazmidhoz jutunk. Ezt a négy plazmidot pPS45A.l, pPS45A.2, pPS45B.l és pPS45B.2·jellel jelöljük. Ezek a plazmidok mind Penicillium chrysogenum, mind pedig Cephalosporium acremonium sejtekben kifejezik az izopenicillin N szintetázt és a higromicin rezisztenciát. A pPS45A.l és a pPS45B.l plazmidok restrikciós és funkcionális térképét a leíráshoz mellékelt 11., illetve 12. ábrán adjuk meg. A pPS45A.2 és pPS45B.2 plazmidok a velük rokon pPS45A.l és pPS45B.l plazmidoktól csak abban különböznek, hogy a beépített pPS29 plazmidból származó 2,3 kb nagyságú HindlII restrikciós fragmens orientációja más. A pPS45A.l, pPS45A.2, pPS45B.l és a pPS45B.2 plazmidok előállítását részletesen ismertetjük a 6. példában.
A pLC2 plazmidot is módosíthatjuk úgy, hogy hordozza a pPS29 plazmid higromicin rezisztenciát meghatározó génjét. A pLC2 plazmid két HindlII restrikciós helyet tartalmaz, mindkettő alkalmas a pPS29 plazmid 2,3 kb nagyságú Hindin restrikciós fragmensének beépítésére. Ha a pPS29 plazmid 2,3 kb nagyságú HindlII restrikciós fragmensét beépítjük a hasított, azaz HindlII enzimmel emésztett pLC2 plazmidba, úgy négy hibrid plazmidhoz jutunk. Ezeket pPS42A.l, pPS42A.2, pPS42B.l és pPS42B.2 jellel jelöljük. A pPS42A.l és a pPS42B.l plazmidok restrikciós és funkcionális térképét a 13., illetve 14. ábrán adjuk meg. A négy plazmid előállítását részletesen ismertetjük a későbbiekben, a 7. példában.
Mivel a pLC2 plazmid tartalmaz egy 0,9 kb nagyságú genomiális dezoxi-ribonukleinsav szekvenciát, ami a Penicillium chrysogenum genomban izopenicillin N szintetázt meghatározó dezoxi-ribonukleinsav szakasztól 5’-irányban helyezkedik el, ezért a pLC2 plazmid szükségszerűen tartalmazza az izopenicillin N szintetázt meghatározó dezoxi-ribonukleinsav szakasz transzkripciós és transzlációs aktivációs szekvenciáját. A legtöbb transzkripciós és transzlációs aktivációs szekvencia az aktiválandó dezoxi-ribonukleinsav szakasztól 5’-irányban helyezkedik el, bár egyes riboszómális ribonukleinsavat meghatározó dezoxi-ribonukleinsav szekvenciákat olyan transzkripciós aktivációs szekvenciák aktiválnak, amelyek a kódoló szakasztól nem 5’-irányban helyezkednek el.
A Penicillium chrysogenum pLC2 plazmidon levő transzkripciós és transzlációs aktivációs szekvenciája helyesen helyezkedik el olyan értelemben, hogy képes irányítani az izopenicillin N szintetázt kifejező dezoxiribonukleinsav expresszióját, mivel a pLC2 plazmid előállításakor a transzkripciós és transzlációs aktivációs szekvenciából dezoxi-ribonukleinsav szakaszok nem hasadtak ki, illetve nem épültek be az izopenicillin N szintetáz aktivitást meghatározó dezoxi-ribonukleinsav 5’-végén. Mivel a pLC2 plazmidon levő Penicillium chrysogenum transzkripciós és transzlációs aktivációs szekvencia felhasználható sok dezoxi-ribonukleinsav szekvencia expresszálására, az aktivációs szekvencia fontos részét képviseli a jelen szabadalmi leírásnak. A P. chrysogenum izopenicillin N szintetáz génjének aktivációs szekvenciája az ismereteink szerint azon a 820 bázispárból álló EcoRI-NcoI restrikciós fragmensen helyezkedik el, amely az izopenicillin N szintetáz aktivitást meghatározó pLC2 plazmidban levő dezoxi-ribonukleinsav szakasz szomszédságában helyezkedik el 5’-irányban. Bármely olyan restrikciós fragmens, amely tartalmazza a fent említett, 820 bázispárból álló EcoRI-NcoI restrikciós fragmenst, szükségszerűen tartalmazza a találmány szerinti P. chrysogenum transzkripciós és transzlációs aktivációs szekvenciákat.
Szekvenálási adatok léteznek a pLC2 plazmidon levő Penicillium chrysogenum transzkripciós és transzlációs aktivációs szekvenciáról. Az alábbiakban megadott szekvencia annak a dezoxi-ribonukleinsav szakasznak a nukleotid sorrendje, amely a pLC2 plazmidon levő izopenicillin N szintetáz aktivitást meghatározó dezoxi-ribonukleinsav szakasztól 5'-irányban he11
HU 206 519 Β lyezkedik el. Az aktivációs szekvenciát képviselő, 820 bázispárból álló EcoRI-NcoI restrikciós fragmens szekvenciájának csak egy része ismert, ahogy azt a szekvenciában „XXXXXXXXXX” jelzi. Annak érdekében, hogy tisztázzuk azt, hogy hogyan helyezkedik el az aktivációs szekvencia a pLC2 plazmidban, a restrikciós fragmenst egyszálú végekkel adjuk meg, mintha EcoRI és Ncol enzimekkel hasítottunk volna.
A Penicillium chrysogenum pLC2 plazmidon levő transzkripciós és transzlációs aktivációs szekvenciájá5 nak részleges dezoxi-ribonukleinsav szekvenciája <—600 bp10
5'-AATTC XXXXXXXXXX ATTCGTAGCA TCTGGGTTGC AGCGTATAAT I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I 1 I I I I
3'-G XXXXXXXXXX TAAGCATCGT AGACCCAACG TCGCATATTA
GTCTCCAGTT GTCTCGCATA AACACCCCGC CCCCGCTCAG GCACACAGGA
CAGAGGTCAA CAGAGCGTAT TTGTGGGGCG GGGGCGAGTC CGTGTGTCCT
100 110 120 130
AGAGAGCTCA GGTCGTTTCC ATTGCGTCCA TACTCTTCAC TCATTGTCAT IIIIIIIIII IIIII I I I I I I 1 I I II I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I TCTCTCGAGT CCAGCAAAGG TAACGCAGGT ATGAGAAGTG AGTAACAGTA
140 150 160 170 180
CTGCAGGAGA ACTTCCCCTG TCCCTTTGCC AAGCCCTCTC TTCGTCGTTG IIIIIIIIII IIII I I I I I I I I I I I I! I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I GACGTCCTCT TGAAGGGGAC AGGGAAACGG TTCGGGAGAG AAGCAGCAAC
190 200 210
TCCACGCCTT CAAGTTTTCA CCATTATTTT TCTAGACAC-3'
I11III11II I 1 1 II II I I I I I II II I I I I I I I I II I I 1 AGGTGGGGAA GTTCAAAAGT GGTAATAAAA AGATCTGTGGTAC- 5' —»Az izopenicillin N szintetázt meghatározó szakasz kezdete. „TAC” komplementer az 5’-ATG-3’ triplettel, ez határozza meg az izopenicillin N szintetáz amino-terminális metioninját.
A Penicillium chrysogenum transzkripciós és transzlációs aktivációs szekvenciáját felhasználhatjuk bármely dezoxi-ribonukleinsav szekvencia expresszálására, ahogy azt a pPS39 plazmid szemlélteti. A pPS39 plazmid a pPS28 plazmid egy származéka, ahogy azt az 5. példában megadjuk, előállítására úgy járunk el, hogy a Cephalosporium acremonium higromicin rezisztenciát meghatározó génjének kifejezéséhez használt transzkripciós és transzlációs aktivációs szekvenciát kicseréljük a találmány szerinti P. chrysogenum transzkripciós és transzlációs aktivációs szekvenciára.
A pPS39 plazmid előállítására egy köztes, pPS38 jellel jelölt plazmidot használunk. A pPS38 plazmid előállítására izoláljuk a pLC2 plazmid 0,83 kb nagyságú BamHI-NcoI restrikciós fragmensét, ez tartalmazza az izopenicillin N szintetáz gén aktivációs szekvenciáját. A 0,83 kb nagyságú BamHI-NcoI fragmens egyszálú részeihez BamHI és Ncol kompatibilis linkereket kapcsolunk, a kapott fragmenst BamHI enzimmel emésztjük, és a kapott pLC2-származék fragmenst (0,84 kb nagyságú BamHI restrikciós fragmens) hozzákapcsoljuk a BamHI enzimmel emésztett pUC8 fragmenshez. A ligálás után két plazmidot kapunk, ezeket pPS38 és pPS38.1 jellel jelöljük. A két plazmid csak a beépült BamHI restrikciós fragmens orientációjában különbözik egymástól. A pUC8 plazmidot az alábbi helyen szerezzük be: Pharmacia P-L Biochemicals, 800 Centennial Ave., Piscataway, N. J. 08 854.
A pPS38 plazmidot BamHI restrikciós enzimmel hasítjuk, és izoláljuk a transzkripciós és transzlációs aktivációs szekvenciát hordozó, 0,84 kb nagyságú
BamHI restrikciós fragmenst, majd hozzákapcsoljuk a BamHI enzimmel hasított pPS28 plazmidhoz. A ligációs reakció után két plazmidot kapunk, ezeket pPS39 és pPS39.1 sorszámmal jelöljük. A pPS38 plazmid 0,84 kb nagyságú BamHI restrikciós fragmensének és a pPS28 plazmid 5,8 kb nagyságú BamHI restrikciós fragmensének ligálása után kapott pPS39 plazmid megfelelő orientációban tartalmazza az izopenicillin N szintetáz gén transzkripciós és transzlációs aktivációs szekvenciáját ahhoz, hogy irányítsa a higromicin re50 zisztenciát meghatározó gén expresszióját. A pPS38 plazmid előállításakor használt linkerek biztosítják, hogy a pPS39 plazmidban a higromicin rezisztenciát biztosító gén megfelelő leolvasási fázisban maradjon.
A pPS39.1 jelű plazmid a pPS39 plazmiddal analóg;
a különbség köztük az, hogy az aktivációs szekvencia ellenkező orientációjú, és ezért nem irányítja a higromicin rezisztenciát meghatározó gén kifejeződését. A pPS39.1 plazmid negatív kontrollként használható fel a transzformációs kísérletekben, azonkívül klónozó vek60 torként használható. A pPS39 és pPS39.1 plazmidok
HU 206519 Β előállítását a 8. példában részletesen ismertetjük; a pPS39 plazmid restrikciós és funkcionális térképét pedig a leíráshoz mellékelt 15. ábrán adjuk meg.
A Penicillium chrysogenum transzkripciós és transzlációs aktivációs szekvenciáját felhasználhatjuk P. chrysogenum sejtekben bármilyen dezoxi-ribonukleinsav expresszálására, ahogy azt az előzőekben ismertetett expressziós vektorok kapcsán jeleztük. így a találmány vonatkozik a pLC2 plazmid 0,82 kb nagyságú EcoRI-NcoI restrikciós fragmensén belül elhelyezkedő P. chrysogenum transzkripciós és transzlációs aktivációs szekvenciájának használatára, hasznos anyagot kódoló bármely dezoxi-ribonukleinsav expressziójának irányításával. A P. chrysogenum aktivációs szekvenciáját felhasználhatjuk Cephalosporium acremonium géntermékének expresszáltatására is.
A találmány szerinti eljárás azon alapszik, hogy olyan intakt, funkcionális Penicillium chrysogenum dezoxi-ribonukleinsav szekvenciát klónoztunk, amely nemcsak az izopenicillin N szintetáz aminosav szekvenciáját határozza meg, de az izopenicillin N szintetáz P. chrysogenum sejtekben való expresszálásához szükséges irányító funkciójú transzkripciós és transzlációs aktivációs szekvenciát is. A találmány szerinti izopenicillin N szintetáz gén tartalmazza továbbá azt a kódoló szekvenciához képest 3'-irányban elhelyezkedő szekvenciát is, amely felelős a transzkripció terminálásáért, és amely biztosítja a mRNS poliadenilezését és szintézisét végrehajtó folyamathoz szükséges szignálokért. A transzkripció terminálásáért, a hírvivő ribonukleinsav poliadenilezéséért és a hírvivő ribonukleinsav szintéziséért felelős szekvenciák általában a kódoló régió stop kodonjától 3 ’-irányban helyezkednek el, körülbelül 500 bázispámyi távolságon belül. így az a 0,65 kb nagyságú BamHI-BglII restrikciós fragmens, amely tartalmazza az izopenicillin N szintetáz karboxilterminális részét kódoló dezoxi-ribonukleinsavat, és attól 3’-irányban elhelyezkedő szekvenciákat, tartalmazza továbbá a transzkripciós terminációért és az mRNS poliadenilezéséért és szintéziséért felelős jeleket.
A találmány szerinti pPS40 jelű plazmid tartalmazza a Penicillium chrysogenum izopenicillin N szintetáz gén transzkripciós és transzlációs aktivációs szekvenciáját, ezután a higromicin antibiotikummal szembeni rezisztenciáért felelős gént, majd a transzkripciós terminációs kodont és a Penicillium chrysogenum izopenicillin N szintetáz génjének mRNS poliadenilezéséért és szintéziséért felelős szignálokat. A pPS40 plazmid előállítására a pLC2 plazmid 0,65 kb nagyságú BamHI-BglII restrikciós fragmensét beépítjük a pUC8 plazmid BamHI enzimmel emésztett fragmensébe, ami után megkapjuk a 16. ábrán jellemzett pPS41 plazmidot.
A pPS41 plazmidot EcoRI és HindlII restrikciós endonukleázokkal hasítjuk, és izoláljuk az izopenicillin N szintetáz gén transzkripciós terminációs és mRNS poliadenilációs és szintézist irányító szignálokat tartalmazó 0,68 kb nagyságú EcoRI-HindlII fragmenst. Ezután Hindin és EcoRI restrikciós endonukleázokkal emésztjük a pPS39 plazmidot, majd a plazmid HindlIIEcoRI fragmensét ligáljuk a pPS41 plazmid 0,68 kb nagyságú HindHI-EcoRI restrikciós fragmensével, ami után megkapjuk a pPS4O plazmidot. A pPS40 plazmid előállítását részletesen ismertetjük a 9. példában, a plazmid restrikciós és funkcionális térképét a leíráshoz mellékelt 17. ábrán adjuk meg.
A találmány szerinti eljárás során a Penicillium chrysogenum izopenicillin N szintetáz génjét klónoztuk, és több olyan használható vektort állítottunk elő, amelyekben a gén egyes elemei működnek, a transzkripciós és transzlációs aktivációs szekvencia, a kódoló szakasz, a transzkripció terminációjáért felelős kodon, és az mRNS poliadenilezését és szintézisét szabályozó jelek. Ezen elemek mindegyike használható, és felhasználhatók hasznos expressziós vektorok előállítására.
Az aktivációs szekvencia beépíthető egy rekombináns dezoxi-ribonukleinsav vektorba, bármely olyan dezoxi-ribonukleinsav expresszálásának irányítására, amely felhasználható vegyület bioszintézisét határozza meg, ez lehet például izopenicillin N szintetáz, vagy higromicin rezisztenciát biztosító enzim. Bár részletesen nem specifikáljuk a leírásban, a találmány szerinti aktivációs szekvencia felhasználható a Cephalosporin acremonium izopenicillin N szintetáz génjének szabályozására, e gént Ingolia és munkatársai izolálták [lásd a 725 870 számú amerikai közzétételi iratot, elsőbbsége: 1985. április 22.; Attomey Docket No. X-6722]. A találmány szerinti aktivációs szekvencia nemcsak Penicillium chrysogenum sejtekben használható, ezekből a sejtekből származik a szekvencia, de működik más fajokban is, például C. acremonium sejtekben.
Egy adott dezoxi-ribonukleinsav szekvencia expresszálódását egy rekombináns dezoxi-ribonukleinsav vektorról fokozhatjuk úgy, hogy a kifejezendő kódoló régió kódoló száljának 3’-végénél transzkripciós terminációs kodont és olyan szignálokat építünk be, amelyek meghatározzák az mRNS poliadenilezését és szintézisét. A találmány szerinti eljárás során transzkripciós terminációs és mRNS poliadenilezésért és szintézisért felelős szignálokat hordozó szekvenciákat állítunk elő, ezeket egy rekombináns dezoxi-ribonukleinsav vektor expresszálásának fokozására használhatjuk fel.
A találmány szerinti eljárás során előállított szekvenciák tartalmazzák a Penicillium chrysogenum izopenicillin N szintetáz génjét, és az eljárással előállítunk több olyan expressziós vektort, amelyek irányítják ennek a génnek a kifejeződését E. coli, P. chrysogenum és Cephalosporium acremonium sejtekben. Az E. coli sejtekkel kivitelezett izopenicillin N szintetáz enzim-termelés lehetővé teszi a termék nagymértékű expresszálását, és az enzim könnyű izolálását úgy, hogy az enzimet in vitro használhatjuk fel új tripeptidek kondenzálására új antibiotikum alapvázak előállítása céljából. A találmány szerinti expressziós vektorokkal C. acremonium és P. chrysogenum sejteket transzformálva, az izopenicillin N szintetáz C. acremonium és P. chrysogenum sejtekben való kifejezésének irányításával a transzformált sejtekben az izopenicillin N szintetáz koncentrációja növekszik, és így több antibiotikum termelődik.
A továbbiakban tovább szemléltetjük és részletesen ismertetjük a találmány szerinti eljárást, a következő példák azonban a találmány oltalmi körét nem szűkítik.
HU 206 519 Β
1. példa
Az E. coli K12 JMlQ9!pLC2 tenyésztése és a pLC2 plazmid izolálása
a) Az E. coli KI2 JMlO9!pLC2 sejtek tenyésztése
Az alábbi törzsgyűjteményből kértük az E. coli K12 JM109/pLC2 törzs fagyasztva szárított tenyészetét: American Type Culture Collection, Rockville, Maryland. A törzs sorszáma; ATCC 53 334. A liofilezett tenyészet közvetlenül használható az alábbiakban megadott tenyésztéskor.
alábbi összetételű L-táptalajt készítünk úgy, hogy az ml-enként 50 pg ampicillint tartalmazzon:
g tripton, g nátrium-klorid és 5 g élesztőkivonat 1 1 vízben.
A táptalajt beoltjuk az E. coli K12 JM109/pLC2 törzzsel, és 37 °C hőmérsékleten rázatógépen tenyésztjük addig, míg az optikai denzitás 590 nm-en (O.D.390) eléri az 1 abszorpciós egységet. Ekkor 150 mg kloramfenikolt adunk a tenyészethez. A tenyésztést ezután 16 órán át folytatjuk. A kloramfenikol adagolásával gátoljuk a protein szintézist, így nem folytatódik a sejtek osztódása, de a plazmid replikációja tovább megy,
b) A pLC2 plazmid izolálása
Az 1. példa a) pontjában megadottak szerint előállított tenyészetet Sorvall GSA rotorban (DuPont Co., Instrument Products, Biomedical Division, Newtown, CN 06470) centrifugáljuk 5 percen át 4 °C hőmérsékleten, percenként 6000-et forduló rotorban. A kapott felülúszót elöntjük, és a sejteket 40 ml alábbi összetételű TES pufferral mossuk:
mM trisz-hidrogén-klorid, pH - 7,5, mM nátrium-klorid és mM etilén-diamin-tetraecetsav.
Ezután újra összegyűjtjük a sejteket. A felülúszót kiöntjük, és a sejteket szárazjég és etanol fürdőben fagyasztjuk, majd felolvasztjuk. A felolvasztott sejteket 10 ml alábbi összetételű elegyben szuszpendáljuk:
25% szacharóz és mM etilén-diamin-tetraecetsav.
Ezután keverés közben az alábbi oldatokat adjuk hozzá:
ml, 5 mg/ml töménységű lizozim-oldat, ml, 0,25 mólos etilén-diamin-tetraecetsav-oldat, pH - 8,0, továbbá
100 pl, 100 mg/ml koncentrációjú ribonukleáz A. Az elegyet 15 percen át jégfürdőben inkubáljuk. A lizizozimmal kezelt sejteket tartalmazó szuszpenzióhoz 3 ml lizáló oldatot adunk. Ennek összetétele a következő:
ml 10%-os Triton-X 100, ml 0,25 mólos etilén-diamin-tetraecetsav-oldat, pH - 8,0, ml 1 mólos trisz-hidrogén-klorid, pH - 8,0, és ml víz.
A szuszpenziót keverjük, és ezután további 15 percen át inkubáljuk jégfürdőben. A lizált sejteket szárazjég és etanol elegyében fagyasztjuk, és újra felolvasztjuk.
A sejttörmelékeket centrifugálással eltávolítjuk, a centrifugálist percenként 25000-et forduló rotorban végezzük 40 percen át. A rotor száma: SW27 (Beckman, 7360 N. Lincoln Ave., Lincolnwood, IL 60646). Ezután fenollal, amit előzőleg pufferoltunk, extraháljuk az oldatot. 30,44 g cézium-kloridot adagolunk, majd 1 ml, 5 mg/ml koncentrációjú etidium-bromid-oldatot, végül az oldat térfogatát 40 ml-re egészítjük ki, és VTi50 ultracentrifuga csőbe (Beckman) dekantáljuk. A centrifuga csöveket lezárjuk, és az oldatot VTÍ50 rotorban centrifugáljuk, percenként 42000-es fordulatszámmal, 16 órán át. A kapott plazmidcsíkot ultraibolya fényben vizsgáljuk, elkülönítjük, és Ti75 centrifuga csövekbe és rotorba (Beckman) helyezzük. A centrifugálást 16 órán át végezzük, percenként 50 OOO-et forduló rotorban. A térfogat-korrekciókat TES pufferral végezzük, amely ml-enként 0,761 g cézium-kloridot tartalmaz. Ismét izoláljuk a plazmid-csíkot, sóval telített izopropanollal extraháljuk az etidium-bromid eltávolítására, végül TES pufferral 1:3 arányban hígítjuk. Az oldathoz ezután 2 térfogat etanolt adagolunk, majd egy éjszakán át -20 °C hőmérsékleten inkubáljuk. Centrifugálással kiülepítjük a plazmid dezoxi-ribonukleinsavat az oldatból, a centrifugálást Sorvall SS34 rotorban végezzük, 15 percen át, percenkénti 10000-es fordulatszámmal.
Az eljárás során 1 mg pLC2 dezoxi-ribonukleinsavat kapunk, ezt 1 ml alábbi összetételű TE pufferben szuszpendáljuk:
mM trisz-hidrogén-klorid, pH - 8,0, mM etilén-diamin-tetraecetsav.
Az oldatot -20 °C hőmérsékleten tároljuk. A pLC2 plazmid restrikciós és funkcionális térképét a leíráshoz mellékelt 2. ábrán mutatjuk be.
2. példa
A pLC3 plazmid előállítása
a) Az E. coli ΚΓ2 RV308/pCZl06 tenyésztése és a pCZIOó plazmid izolálása
Az E. coli K12 RV308/pCZ106 liofilezett tenyészetét NRRL B-15 959 sorszámon kapjuk, az alábbi törzsgyűjteményből: Northern Régiónál Research Laboratories, Peoria, Illinois. A liofilezett tenyészettel 1 1, 50 pg/ml kanamicint tartalmazó L-táptalajt oltunk, a tenyészetet 25 °C hőmérsékleten inkubáljuk rázógépen mindaddig, míg az O.D.joQ-érték 0,5 és 1,0 abszorpciós egységet ér el. Ennek az értéknek az elérésekor 37 °C-ra növeljük a tenyésztés hőmérsékletét, és 26 órán át folytatjuk az inkubációt. Ahogy azt az előzőekben közöltük, az úgynevezett runaway replikon hőmérsékletre érzékeny, és 37 °C-on elveszti a példányszámot szabályozó rendszerét. A 37 °C-on végzett, 26 órás inkubáció során nem szabályozott replikáció következik be.
2-6 órás, 37 °C hőmérsékleten kivitelezett inkubáció után összegyűjtjük a sejteket, és az 1. példa b) pontjában megadottakat megismételve, izoláljuk a pCZIOó plazmid dezoxi-ribonukleinsavat. 5 mg pCZIOő plazmid dezoxi-ribonukleinsavat kapunk, ezt 5 ml TE pufferben szuszpendáljuk.
HU 206 519 Β
A pCZ106 plazmid restrikciós és funkcionális térképét a leíráshoz mellékelt 3. ábrán adjuk meg.
b) A pCZ106 plazmid emésztése Ncol és BamHl restrikciós enzimekkel, és a pCZIOóplazmid 8,7 kb nagyságú Ncol-Ncol és az 1,6 kb nagyságú NcoIBamHI restrikciós fragmensének izolálása A 2. példa a) pontjában megadottak szerint előállított 25 pg (25 pl) pCZIOó plazmid dezoxi-ribonukleinsavat oldunk 10 pl alábbi összetételű 10X BamHl restrikciós pufferban:
mM nátrium-klorid,
60,0 mM trisz-hidrogén-klorid, pH - 7,9,
60,0 mM magnézium-klorid,
1,0 mg/ml borjúszérum albumin,
5,0 pl (50 egység) BamHl restrikciós enzim, pl (50 egység) Ncol restrikciós enzim, és pl víz.
Ha másként nem jelezzük, a restrikciós és ligáz enzimeket az alábbi helyről szereztük be:
New England Biolabs, 32 Tozer Road, Beverly, MA 01915.
Az egység-definíciókra vonatkozóan lásd az előállító egység definícióit.
A reakcióelegyet 4 órán át 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk, ezután a reakció teljessé válik.
Az NcoI-BamHI reakcióelegyet 1% agarózt tartalmazó gélen elektroforézisnek vetjük alá, az elválasztást addig végezzük, míg az 1,6 kb nagyságú NcoI-BamHI és a 8,7 kb nagyságú Ncol-Ncol fragmensek világosan elkülönülnek az egyéb emésztési terméktől, a 0,3 kb nagyságú restrikciós ffagmenstől. Az elektroforetizált dezoxi-ribonukleinsav megfigyelését úgy végezzük, hogy a gélt 0,5 pg/ml töménységű etidium-bromid-oldattal festjük, és a fested gélt hosszúhullámú ultraibolya fényben vizsgáljuk. A kívánt fragmens lokalizálása után az adott fragmens előtt megvágjuk a gélt, és mindegyik vágásba egy kis darab Schleicher és Schuell NA-45 DEAE membránt (Keene, NH 03 431) helyezünk. Tovább végezzük az elektroforézist, a dezoxi-ribonukleinsav ekkor nem kovalensen kötődik a DEAE membránhoz. Miután a kívánt fragmens hozzákapcsolódott a membránhoz, eltávolítjuk azokat, és kis sókoncentrációjú pufferban szuszpendáljuk. A puffer összetétele a következő:
100 mM kálium-klorid,
0,1 mM etilén-diamin-tetraecetsav és mM trisz-hidrogén-klorid, pH - 8,0.
Mindegyik membránt ezután egy kis térfogatú edénybe helyezzük, és nagy sókoncentrációjú pufferral mossuk. Ennek a puffemak az összetétele a következő:
M nátrium-klorid,
0,1 M etilén-diamin-tetraecetsav,
20,0 mM trisz-hidrogén-klorid, pH - 8,0.
A dezoxi-ribonukleinsavnak a DEAE papírról való leoldása érdekében 1 órán át 65 ’C hőmérsékleten inkubálunk. Az inkubáció után a puffért összegyűjtjük, és a membránt nagy mennyiségű sót tartalmazó pufferral öblítjük. Összegyűjtjük a mosóoldatot, egyesítjük az inkubációs pufferral, és ezután összegyűjtjük az adott dezoxi-ribonukleinsav fragmenseket.
A nagy sókoncentrációjú dezoxi-ribonukleinsavoldat nátrium-klorid koncentrációját 0,25 mólosra állítjuk be, ezután 2 térfogat hideg, vízmentes etanolt adagolunk. A kapott oldatokat összekeverjük, és 1020 percen át -70 ’C hőmérsékleten tároljuk. Lehűtést követően percenként 15 000-et forduló rotorban centrifugáljuk 15 percen át. A maradék só eltávolítására újra kicsapjuk az oldatot, a dezoxi-ribonukleinsav csapadékot etanollal mossuk, vízmentesítjük, és 20 pl TE pufferban oldjuk. Ezt követően 5,0-5,0 pg pC2106 plazmidból származó, 1,6 kb nagyságú NcoI-BamHI és 8,7 kb nagyságú Ncol-Ncol restrikciós fragmenst kapunk. A tisztított fragmenseket külön-külön 25 pl TE pufferban oldjuk, és -20 ’C hőmérsékleten tároljuk.
c) A pLC2 plazmid emésztése Ncol és Bglll enzimekkel, és az Izopenicillin N szintetázt kódoló, 1,6 kb nagyságú NcoI-BgUI restrikciós fragmens izolálása 25 pg (25 pl), az 1. példa b) pontja szerint előállított pLC2 plazmid dezoxi-ribonukleinsavat oldunk 10 pl 10X BamHl puffer és 60 pl víz elegyében, A pLC2 plazmid dezoxi-ribonukleinsav-oldathoz 5 pl (50 egység) Bglll restrikciós enzimet adunk, majd a reakcióelegyet 2 órán át 37 ’C hőmérsékleten inkubáljuk. Ezután 5 pl (50 egység) Ncol restrikciós enzimet adunk a reakcióelegyhez, és 5 percen át 37 ’C hőmérsékleten inkubálunk. 5 perc múlva az Ncol emésztést leállítjuk úgy, hogy a reakcióelegyet 10 percen át 70 ’C hőmérsékleten tartjuk. így részleges Ncol emésztés történik. A kapott NcoI-BglII fragmenseket 1% agarózt tartalmazó gélre juttatjuk, és a 2. példa b) pontja szerint eljárva izoláljuk az 1,6 kb nagyságú NcoI-BglII restrikciós fragmenst.
A fentiek szerint eljárva 5 pg kívánt fragmenst kapunk, amit 25 pl TE pufferban szuszpendálunk, és -20 ’C hőmérsékleten tárolunk.
d) A pLC3 plazmid előállítása
A 2. példa b) pontja szerint előállított pCZ106 plazmidból származó termék 5 pl-ét (1,6 kb nagyságú NcoI-BamHI fragmens) és 24 pl-ét (8,7 kb nagyságú Ncol-Ncol restrikciós fragmens) összekapcsoljuk 5 pl oldatban levő, a 2. példa c) pontja szerint előállított, pLC2 plazmidból származó tiszta, 1,6 kb nagyságú NcoI-BglII restrikciós fragmenssel, ami után megkapjuk a pLC3 plazmidot. A reakcióelegy térfogata 30 pl, tartalmazza a fenti dezoxi-ribonukleinsav fragmenseket, és 1,1 pl (100 egység) T4 dezoxi-ribonukleinsav ligáz enzimet, 3 pl alábbi összetételű 10X ligációs puffért és 13,4 pl vizet:
0,5 M trisz-hidrogén-klorid, pH - 7,8,
100,0 mM magnézium-klorid,
20,0 mM ditio-treitol,
10,0 mM adenoz’in-trifoszfát, és
1,0 mg/ml borjúszérum albumin.
A reakcióelegyet 2 órán át 15 ’C hőmérsékleten inkubáljuk, ezután a reakció teljessé válik. A ligáit dezoxi-ribonukleinsavban benne van az előállítani kívánt pLC3 dezoxi-ribonukleinsav.
A pLC3 plazmid restrikciós és funkcionális térképét a leíráshoz mellékelt 4. ábrán adjuk meg.
HU 206 519 Β
3. példa
Az E. coli ΚΓ2 RV308!pLC3 törzs előállítása és az
E. coli sejtek által termelt izopenicillin N szintetáz mérése
a) Az E. coli KI2 RV308!pLC3 előállítása ml tenyészetben L-táptalajban szaporítjuk az E. coli K12 RV308 (NRRL B-15 624) jelű törzset. A tenyésztést addig végezzük, míg a tenyészet optikai denzitása (590 nm) 0,5 lesz. Ezután jégfürdőben 10 percen át hűtjük a tenyészetet, majd centrifugálással összegyűjtjük a sejteket. 25 ml hideg, 100 mmólos kalcium-klorid-oldatban szuszpendáljuk a sejteket, és 25 percen át jégfürdőben inkubáljuk. Ezután centrifugálással ismét összegyűjtjük a sejteket, és reszuszpendáljuk 2,5 ml hideg, 100 mmól kalcium-kloridot tartalmazó oldatban, ezután egy éjszakán át jégfürdőben inkubáljuk.
200 μΐ sejtszuszpenziót keverünk a 2. példa d) pontjában megadottak szerint ligáit dezoxi-ribonukleinsavval, és 20 percen át jégfürdőben inkubáljuk a szuszpenziót. Ezután centrifugálással összegyűjtjük a sejteket. Az üledéket 1 ml L-táptalajban szuszpendáljuk, és a szuszpenziót 1 órán át 25 °C hőmérsékleten inkubáljuk. A tenyészet alikvot mintáit L-agarra szélesztjük (az L-agar összetétele azonos az L-táptalajéval, de 15 g/1 agart tartalmaz). A szilárd halmazállapotú táptalajokba előzőleg 50 pg/ml kanamicint mértünk. A tenyészeteket 25 °C hőmérsékleten inkubáljuk. Az E. coli K12 RV308/pLC3 transzformánsokat kanamicin rezisztenciájuk alapján választjuk ki, a transzformánsokból izolált plazmid dezoxi-ribonukleinsavat pedig restrikciós enzimes analízissel vizsgáljuk. Az E. coli K12 RV308/pLC3 transzformánsokból a plazmid dezoxi-ribonukleinsavat a 2. példa a) pontjában megadottak szerint izoláljuk, de kisebb mennyiségű sejtből indulunk ki, és a cézium-kloridos gradiens centrifugálást elhagyjuk.
b) Az E. coli ΚΓ2 RV308lpLC3 tenyésztése az izopenicillin N szintetáz aktivitás expresszálására
A 3. példa a) pontja szerint előállított E. coli K12 RV3O8/pLC3 transzformánsok közül több izolátumot külön-külön tenyésztünk 5 ml, 50 pg/ml kanamicint tartalmazó L-táptalajon, a tenyészeteket rázógépen tenyésztjük 25 °C hőmérsékleten addig, míg 590 nm-en mért optikai denzitásuk 0,2 abszorpciós egység lesz. Ezután 37 °C hőmérsékleten folytatjuk a tenyésztést, 6 órán át.
A 37 °C hőmérsékleten történő 6 órás tenyésztés után 1-1 ml tenyészetet összegyűjtünk, és a sejteket centrifugálással elkülönítjük. Az üledéket egyenként
1-1 ml 10 mmólos nátrium-klorid-oldattal mossuk, és ezután 1,0 ml alábbi összetételű IPS extrakciós pufferban szuszpendáljuk:
0,05 M trisz-hidrogén-klorid, pH - 8,0,
0,01 M kálium-klorid,
0,01 M magnézium-szulfát.
A sejteket ultrahanggal feltárjuk (Sonifier Cell Disruptor, Model W185, Heat Systems-Ultrasonics, Inc., Plainview, Long Island, NY). A feltárást mikrocsőben végezzük, hatszor 5 másodperces kezeléssel. A kezelések közben 60 másodperces szüneteket tartunk, a feltárandó szuszpenziót jég és etanol elegyéből készült fürdőben tartjuk a feltárás során. A kezelést követően a sejttörmelékek eltávolítására centrifugáljuk a szuszpenziót, és ezután közvetlenül használjuk mérésre.
c) Az izopenicillin N szintetáz aktivitás mérése
A mérést Shen és munkatársai módszerének módosított változatával végezzük [J. of Antibiotics, 37(9), 1044-1048 (1984)].
Az izopenicillin N szintetáz mérését 500 μΐ térfogatú reakcióelegyben végezzük. A reakció indításakor 1,0 ml 1,4 mM delta-(L-a-amino-adipil)-L-ciszteinilD-valint és 3,75 mM ditio-treitolt tartalmazó oldatot reagáltatunk szobahőmérsékleten, 30-60 percen át a dimer tripeptidek monomer alakká alakítására. Mindegyik mérőcsőbe 50 ml törzsoldatot mérünk az alábbiakból (a mérőcsövek sterilek, üvegből készültek, méretűk 13x100 mm):
500 mM trisz-hidrogén-klorid, pH - 7,4,
100 mM kálium-klorid,
100 mM magnézium-szulfát,
2,0 mM vas-szulfát, és 6,7 mM aszkorbinsav.
Ezután különböző mennyiségű, vízzel 150 μΐ-re hígított extraktumot adagolunk. A mérőcsövekbe ezután 100-100 μΐ tripeptid-oldatot mérünk, a tripeptid adagolásával a reakció elkezdődik. Mindegyik csövet vortexeljük, a szubsztrát adagolása után. A csöveket percenként 250-et forduló rázógépre helyezzük, és 25 °C hőmérsékleten inkubáljuk. A reakcióidő 45 perc.
A 45 perc leteltét követően 100-100 μΐ térfogatú, párhuzamos mintát veszünk, és biológiai értékmérő lemezen levő lyukakba adagoljuk. A minta hátramaradó részéhez 100 egység penicillináz A enzimet adunk. A penicillináz A-t a Riker’s Laboratories, Inc. cégtől szereztük be. Az enzimet 100 000 egységet tartalmazó ampullákban forgalmazzák, a készítményt 5,0 ml vízzel rehidratáljuk. 5 μΐ (100 egység) újra hidratált penícillináz A-t adunk a reakcióelegyhez, 5 percen át szobahőmérsékleten reagáltatunk, és ezután 100-100 μΐ penicillináz A-val kezelt elegyet mérünk a biológiai értékmérő lemez lyukaiba. A penicillináz A enzimmel való kezelést azért végezzük, hogy bizonyítsuk azt, mely szerint a biológiai értékmérő lemezeken esetleg látható gátlási zónák a penicillin jelenlétének tulajdoníthatók, nem pedig cefalosporin vagy más szennyező anyagoknak.
A penicillin N standard görbét úgy készítjük, hogy az értékmérő lemez lyukaiba 0,5, 1,0, 2,0, 5,0, 10,0 és 20,0 pg penicillin N antibiotikumot mérünk. A penicillináz A enzim aktivitását úgy bizonyítjuk, hogy 5 μΐ enzimkészítményt adagolunk 200 μΐ, 0,2 pg/ml penicillin N-t tartalmazó oldathoz.
A biológiai értékmérő lemezekben KI31 nutrient agar van, ennek előállítására 30,5 g BBL Antibiotic Médium 11 jelű táptalajt (Becton Dickinson and Company, Cockeysville, MD) oldunk 1 1 ionmentes vízben, az oldatot felforraljuk, 70 °C hőmérsékletre hűtjük, 35 percen át 121 °C hőmérsékleten autoklávozzuk. A lemezeket 4 ml, frissen készült, egy éjszakán át te16
HU 206 519 Β nyészfett Micrococcus luteus (ATCC 9341) tenyészeten oltjuk, 700 ml térfogatú agarmennyiségenként. Az M. 'luteus növekszik a K544 jelű táptalajon, ennek
összetétele a következő:
pepton (Difco) 5,0 g
élesztőkivonat (Difco) 1,5 g
nátrium-klorid 3,5 g
dikálium-foszfát (vízmentes) 3.7 g
kálium-dihidrogén-foszfát 1,3 g
húskivonat (Difco) 1,5 g
ionmentes víz 11.
A táptalajt felforraljuk, 25 ’ C hőmérsékletre hűtjük,
ezután pH-ját 7,0-ra állítjuk be, 1 normál hidrogén-klorid vagy 1 normál nátrium-hidroxid-oldattal, majd 20 percen át 121 ’C hőmérsékleten sterilezzük. A beoltott agart 100x15 mm nagyságú lemezekre öntjük (15 ml). A lyukakat 5 ml-es pipettával vájjuk ki, a lyukak 10 mm átmérőjűek.
A lemezek elkészítése után a mintákat a lyukakba mérjük, majd ezután a lemezeket 18 órán át 37 ’C hőmérsékleten inkubáljuk. A mérési eredményeket úgy határozzuk meg, hogy a lyukak körül látható átlátszó zóna átmérőjét megmérjük, az átlátszó zóna azért jelentkezik, mivel az M. luteus nem növekszik, ha penicillin van jelen.
A mérési eredmények azt jelzik, hogy az E. coli K12 RV308/pLC3 transzformánsok izopenicillin N szintetáz aktivitással rendelkeznek.
4. példa
A pPS44 plazmid előállítása
a) A plT335 plazmid dezoxi-ribonukleinsav emésztése
Ncol enzimmel, és a Cephalosporium acremonium transzkripciós és transzlációs aktivációs szekvenciát meghatározó, 0,85 kb nagyságú fragmens izolálása
Az 1. példában megadott módon előállítunk 50 μΐ (megfelel 50 pg-nak) ρΓΓ335 plazmid dezoxi-ribonukleinsavat, majd keverés közben hozzáadunk 10 μΐ 10X BamHI puffért, 5 μΐ (50 egység) Ncol restrikciós enzimet és 35 μΐ vizet. A reakcióelegyet 4 órán át 37 ’C hőmérsékleten inkubáljuk. Ezután az elegy nátriumklorid végkoncentrációját 0,25 mólosra állítjuk be, kétszeres térfogatú, vízmentes etanollal hígítjuk, 10 percen át szárazjég és etanol elegyében hűtjük, végül a kicsapódott dezoxi-ribonukleinsav elkülönítésére centrifugáljuk.
Az Ncol restrikciós endonukieázzal emésztett pIT335 plazmid dezoxi-ribonukleinsavat tartalmazó oldatot 1% agarózt tartalmazó gélen elektroforetizáljuk. Az izopenicillin N szintetázt meghatározó gén Cephalosporium acremonium transzkripciós és transzlációs aktivációs szekvenciáját tartalmazó, 0,85 kb nagyságú restrikciós fragmenst izoláljuk a gélről, és a 2. példa b) pontjában megadottak szerint tisztítjuk.
A fentiek szerint eljárva 4 pg előállítani kívánt fragmenshez jutunk, ezt 10 μΐ TE pufferban szuszpendáljuk.
b) A pLC2 plazmid részleges emésztése Ncol restrikciós endonukieázzal μΐ 10X BamHI puffer és 80 μΐ víz elegyében 25 pg pLC2 plazmid dezoxi-ribonukleinsavat oldunk. A pLC2 plazmid dezoxi-ribonukleinsavat tartalmazó oldathoz 10 μΐ (100 egység) Ncol restrikciós enzimet adunk, és a reakcióelegyet 3 percen át 37 ’C hőmérsékleten inkubáljuk. A reakció leállítására pufferezett fenollal extrahálunk. A rövid reakcióidő alatt a pLC2 plazmid dezoxi-ribonukleinsav részlegesen hasad Ncol restrikciós endonukleáz emésztés során. A reakcióelegyet 1 % agarózt tartalmazó gélre juttatjuk, és elektroforézist végzünk addig, míg a pLC2 lineáris plazmid dezoxi-ribonukleinsavnak megfelelő csík elválik a nem hasadt plazmid és más reakciótermékek csíkjaitól. A lineáris pLC2 plazmid dezoxiribonukleinsavat a 2. példa b) pontjában megadottak szerint izoláljuk.
A fentiek szerint eljárva 5 pg lineáris plazmid dezoxi-ribonukleinsavat kapunk, ezt 10 μΐ TE pufferban szuszpendáljuk.
c) A pPS44 plazmid előállítása
A ρΓΓ335 plazmid 0,85 kb nagyságú Ncol restrikciós ffagmensét tartalmazó oldat 2 μΐ-ét összekeverjük 4 μΐ, a 4. példa b) pontja szerint előállított pLC2 plazmid dezoxi-ribonukleinsav Ncol részlegesen emésztett fragmensét tartalmazó oldattal. Az elegyhez 3 μΐ 10X ligáz puffért, 19 μΐ vizet és 2 μΐ T4 dezoxi-ribonukleinsav ligázt adunk, és a kapott reakcióelegyet 2 órán át 16 ’C hőmérsékleten inkubáljuk. Ligálást követően megkapjuk a pPS44 plazmid dezoxi-ribonukleinsavat. A pPS44 plazmid restrikciós és funkcionális térképét a leíráshoz mellékelt 5. ábrán adjuk meg.
A ligáit dezoxi-ribonukleinsavval az alábbiak szerint E. coli K12 JA221 sejteket transzformálunk.
d) Az E. coli K12 JA221lpPS44 törzs előállítása, és a pPS44 plazmid dezoxi-ribonukleinsav izolálása L-táptalajban (50 ml) E. coli K12 JA221 (NRRL
B-15211) sejteket tenyésztünk addig, míg a tenyészet 590 nm-en mért optikai denzitása 0,2 lesz. 10 percen át jégfürdőben hűtjük a tenyészetet, és a sejteket centrifugálással összegyűjtjük. 25 ml hideg, 100 mM kalciumkloridot tartalmazó oldatban szuszpendáljuk a sejteket, és 25 percen át jégfürdőben inkubáljuk. Ismét összegyűjtjük a sejteket, a centrifugálás után kapott üledéket pedig 25 ml hideg, 100 mM kalcium-kloridot tartalmazó vizes oldatban szuszpendáljuk, és egy éjszakán át jégfürdőben inkubáljuk. 200 μΐ így kapott sejtszuszpenziót összekeverünk a 4, példa c) pontjában megadottak szerint előállított, ligáit dezoxi-ribonukleinsavval, majd 20 percen át jégfürdőben inkubáljuk, ezután 2 percen át 40 ’C hőmérsékleten, majd 10 percen át szobahőmérsékleten folytatjuk az inkubációt. 3 ml friss L-táptalajt adunk a sejtszuszpenzióhoz, és ezután 2 órán át 37 ’C hőmérsékleten rázógépen tenyésztünk.
A pLC2 plazmidnak három Ncol helye van. A pPS44 plazmid csak úgy jöhet létre, hogy a ρΓΓ335 plazmid 0,85 kb nagyságú Ncol restrikciós fragmense beépül a pLC2 plazmid egy adott Ncol helyére, és a fragmensnek megfelelő orientációban kell elhelyezkednie.
A pPS44 plazmidot PstI restrikciós analízissel tudjuk
HU 206 519 Β azonosítani, mivel a pLC2 plazmid 0,85 kb nagyságú Ncol restrikciós fragmense tartalmaz egy PstI restrikciós helyet. A pPS44 plazmidot PstI enzimmel emésztve, az alábbi restrikciós fragmenseket kapjuk: 5,3 kb, 1,3 kb, 0,76 kb, 0,29 kb és 0,25 kb.
5. példa
Λ pPS28 és a pPS29 plazmldok előállítása
a) A köztes pPSl9 plazmid előállítása
Az EP-A-177 243 számú európai szabadalmi leírásban Cephalosporium acremonium sejtek vektorairól és transzformációjáról olvashatunk. Az EP-A-177243 számú európai szabadalmi leírás 1-6. előállítási receptje és az 1-6. példája bemutatja a pIT221 plazmid előállítását. A ρΓΓ221 plazmid restrikciós és funkcionális térképét a jelen leíráshoz mellékelt 6. ábrán mutatjuk be.
pg pIT221 dezoxi-ribonukleinsavat 5 μϊ alábbi összetételű 10X Xmal pufferban oldunk:
250 mM nátrium-klorid, mM trisz-hidrogén-klorid, pH - 7,5, mM magnézium-klorid, mM 2-merkapto-etanol, és mg/ml borjúszérum albumin.
Az elegyhez 43 μϊ vizet és 2 μϊ (10 egység) Xmal restrikciós enzimet adunk. A reakcióelegyet 4 órán át 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk. A reakciót fenolos extrakcióval állítjuk le. Ezután kloroformmal extraháljuk az Xmal reakcióelegyet, majd nátrium-klorid végkoncentrációját 025 mólosra állítjuk be, két térfogat vízmentes etanollal hígítjuk, 10 percen át szárazjég és etanol elegyében hűtjük, végül kicsapjuk, és az Xmal enzimmel hasított ρΓΓ221 plazmid dezoxi-ribonukleinsavat centrifugálással elkülönítjük.
A ρΓΓ221 plazmid Xmal enzimmel hasított dezoxiribonukleinsavát 100 μϊ IX ligációs pufferban oldjuk, a puffer 500 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav ligáz enzimet tartalmaz. 12 °C hőmérsékleten 16 órán át inkubáljuk a reakcióelegyet, majd a 4. példa d) pontjában megadottak szerint eljárva E. coli K12 JA221 sejteket transzformálunk. Az ampicillin antibiotikumra rezisztens, pPS19 plazmidot tartalmazó transzformánsokat a bennük levő plazmid dezoxi-ribonukleinsav restrikciós enzimes analízisével azonosítjuk. A pPS 19 plazmid abban különbözik a pIT221 plazmidtól, hogy az előzőben nincs meg a pIT221 plazmidon jelen levő 0,3 kb nagyságú Xmal restrikciós fragmens.
ApPS19 plazmid dezoxi-ribonukleinsavat az 1. példában megadottak szerint izoláljuk.
A pPS19 plazmid restrikciós és funkcionális térképét a leíráshoz mellékelt 7. ábrán adjuk meg.
b) A pPS23 és pPS23.1 köztes plazmldok előállítása (i) a pUC8 plazmid emésztése BamHI restrikciós endonukleázzal
A Pharmacia P-L Biochemicals-tól vásárolt pUC8 plazmid 5 pg-ját 5 μ! 10X BamHI restrikciós puffer és 40 pl víz elegyében oldjuk. A dezoxi-ribonukleinsavoldathoz 5 μϊ (50 egység) BamHI restrikciós enzimet adagolunk, és a reakcióelegyet 2 órán át 37 °C szobahőmérsékleten inkubáljuk. A reakció leállítására fenollal extrahálunk, majd az extrakciót kloroformmal megismételjük. A BamHI enzimmel emésztett pUC8 plazmid dezoxi-ribonukleinsavat kicsapjuk úgy, hogy az oldat nátrium-klorid végkoncentrációját 0,25 mólosra állítjuk be, 2 térfogat etanolt adagolunk, majd 10 percen át -70 °C hőmérsékleten tartjuk. A BamHI restrikciós endonukleázzal emésztett pUC8 plazmid dezoxiribonukleinsavat centrifugálással összegyűjtjük, és 5 pl vízben oldjuk.
(ii) A plT35 plazmid 0,85 kb nagyságú Ncol restrikciós fragmensének izolálása pg pIT335 plazmid dezoxi-ribonukleinsavat oldunk 5 pl 10X BamHI puffer és 40 pl víz elegyében. A dezoxi-ribonukleinsav-oldathoz 5 pl (50 egység) Ncol restrikciós enzimet adagolunk, és a kapott reakcióelegyet 2 órán át 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk. Ezután 1 % agarózt tartalmazó gélre juttatjuk az elegyet, és az IPS gén transzkripciós és transzlációs aktivációs szekvenciáját hordozó, 0,85 kb nagyságú Ncol restrikciós fragmenst a 2. példa b) pontjában megadottak szerint izoláljuk.
A kapott 1 pg dezoxi-ribonukleinsavat 5 pl vízben feloldjuk.
(iii) A pPS23 plazmid előállítására használt linker előállítása
Az alábbi linker molekula egyes szálait automatikus dezoxi-ribonukleinsav szintetizátorral előállítjuk:
5'-CATGAAGAAG-3' t t t / t t
3'-TTCTTCCTAG-5'.
A linker egyes száljainak 75 pmólnyi mennyiségét 22,5 pl víz és 2,5 pl ligáz puffer elegyében feloldjuk. Az egyszálú dezoxi-ribonukleinsavakat tartalmazó oldathoz 1 μϊ (10 egység) T4 dezoxi-ribonukleinsav kinázt adunk (Bethesda Research Laboratories), majd 10 percen át 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk az elegyet. A kinázos reakciót követően 70 °C hőmérsékleten tartjuk az elegyet, 15 percen át. Az egyszálú dezoxi-ribonukleinsav molekulák összekapcsolására, és a linker előállítására elegyítjük a két reakcióelegyet, és 2 órán át szobahőmérsékleten, majd egy éjszakán át 4 °C hőmérsékleten inkubáljuk.
(ív) A pPS23 és a pPS23.1 plazmidok előállítása pl, 0,85 kb nagyságú, ρΓΓ335 plazmidból származó Ncol restrikciós fragmens és 10 pl összekapcsolt linker elegyéhez 1 pl BamHI restrikciós endonukleázzal emésztett pUC8 plazmid dezoxi-ribonukleinsavat adunk. Az elegyhez ezután 4 pl 10X ligáz puffért, 2 pl (500 egység) T4 dezoxi-ribonukleinsav ligázt és 29 pl vizet adagolunk, a kapott reakcióelegyet pedig egy éjszakán át 4 °C hőmérsékleten inkubáljuk. A ligáit dezoxi-ribonukleinsav keverék tartalmazza a pPS23 és pPS23.1 plazmidokat.
A Pharmacia P-L Biochemicals-tól kapható E. coli K12 JM109 törzs L-táptalajjal készült 50 ml térfogatú tenyészetét növesztjük addig, míg az 590 nm-en mért optikai denzitás 0,5 abszorpciós egységet ér el. 10 percen át jégfürdőben hűtjük a tenyészetet, és a sejteket
HU 206519 Β centrifugálással összegyűjtjük. Az üledéket 25 ml hideg, 100 mmólos kalcium-klorid-oldatban szuszpendáljuk, és 25 percen át jégfürdőben inkubáljuk. Ismét centrifugálunk, és az összegyűjtött sejteket 2,5 ml hideg, 100 mmólos kalcium-klorid-oldatban szuszpendáljuk, és jégfürdőben egy éjszakán át tovább inkubáljuk.
200 μΐ sejtszuszpenziót a fentiek szerint előállított dezoxi-ribonukleinsavval keverünk, és 20 percen át jégfürdőben inkubálunk. Az inkubációs idő leteltével a sejteket 42 °C hőmérsékletű vízfürdőbe helyezzük 2 órára, majd további 10 percen át jégfürdőben inkubálunk. Centrifugálással összegyűjtjük a sejteket, és 1 ml L-táptalajban szuszpendáljuk, a szuszpenziót 2 órán át 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk. A sejttenyészet alikvot mintáit L-agarlemezekre szélesztjük (az L-agar összetétele azonos az L-táptalajéval, de 15 g/1 agart is tartalmaz). A táptalajba 100 pg/ml ampicillint, 40 pg/ml X-gal-t és 40 pg IPTG/ml-t adagoltunk. Egy éjszakán át 37 °C hőmérsékleten tenyésztünk. Az inszert nélküli plazmidokat tartalmazó telepeket, mint például az E. coli K12 JM109/pUC8 sejteket kék színűnek látjuk a lemezeken. Az inszertet hordozó plazmidokat tartalmazó telepek, mint például az E. coli K12 JM109/pPS23 sejtek színe fehér. Több fehér színű telepet szelektálunk, és a bennük levő plazmidokat restrikciós analízissel vizsgáljuk, az IPS aktivációs szekvenciát tartalmazó, 0,85 kb nagyságú BamHI restrikciós fragmens jelenlétére.
Az E. coli K12 JMlO9/pPS23 és az E. coli K12 JM109/pPS23.1 sejtekből a plazmid dezoxi-ribonukleinsavat a 2. példa a) pontjában megadottak szerint izoláljuk.
c) A pPS2ÍA köztes plazmid előállítása pg pPS23 plazmid dezoxi-ribonukleinsavat 15 pl 10X BamHI restrikciós puffer és 125 pl víz elegyében feloldunk. A dezoxi-ribonukleinsav-oldathoz 10 pl (100 egység) BamHI restrikciós enzimet adunk, és 2 órán át 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk az elegyet. A pPS23 plazmid dezoxi-ribonukleinsavat tartalmazó elegyet 1% agarózt tartalmazó gélre juttatjuk, és az IPS gén aktivációs szekvenciáját hordozó, 0,86 kb nagyságú BamHI restrikciós fragmenst a 2. példa b) pontjában megadottak szerint izoláljuk. A kapott 5 pg mennyiségű fragmenst 10 pl vízben oldjuk.
pg pPS19 plazmid dezoxi-ribonukleinsavat 10 pl 10X BamHI restrikciós puffer és 85 pl víz elegyében oldunk. A pPS 19 plazmid dezoxi-ribonukleinsav-oldathoz ezután 5 pl (50 egység) BamHI restrikciós enzimet adunk, és 2 órán át 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk a reakcióelegyet. A pPS19 plazmid dezoxi-ribonukleinsav BamHI enzimes emésztése után kapott fragmenseket tartalmazó reakcióelegyet pufferezett fenollal, majd kétszer kloroformmal extraháljuk. Ezután kicsapjuk a dezoxi-ribonukleinsavat, centrifugálással összegyűjtjük, és 10 pl vízben szuszpendáljuk.
pl 10X ligáz pufferből, 2 pl T4 dezoxi-ribonukleinsav ligázból és 23 pl vízből készült elegyhez 1 pl, 0,86 kb nagyságú BamHI restrikciós fragmenst tartalmazó oldatot, és 1 pl BamHI enzimmel emésztett pPS19 dezoxi-ribonukleinsavat adunk. A reakcióelegyet egy éjszakán át 15 ’C hőmérsékleten inkubáljuk. A ligáit dezoxi-ribonukleinsav tartalmazza az előállítandó pPS21A plazmidot.
A ligáit dezoxi-ribonukleinsavval E. coli K12 C600 sejteket transzformálunk, a törzset az alábbi törzsgyűjteményből kaptuk: ATCC 33 525 sorszámon: American Type Culture Collection, Rockville, MD 20852. A transzformációt az 5. példa b) pontjának d) részében megadottak szerint végezzük. A transzformált sejteket 100 pg/ml ampicillint tartalmazó L-agaron tenyésztjük, és a tenyészeteket 37 °C hőmérsékleten tartjuk egy éjszakán át.
A transzformációs lemezekről különálló telepeket izolálunk, ezeket tenyésztjük, és plazmid dezoxi-ribonukleinsavat izolálunk belőlük. A plazmid dezoxi-ribonukleinsavat restrikciós enzim analízissel vizsgáljuk. A pPS21A plazmidból BamHI enzimmel való emésztést követően 7,62 kb és 0,86 kb nagyságú fragmenseket kapunk, PstI emésztést követcfen pedig 5,15 kb, 1,85 kb, 0,99 kb és 0,49 kb nagyságú fragmensekhez jutunk.
A pPS21 A plazmid restrikciós és funkcionális térképét a leíráshoz mellékelt 8. ábrán adjuk meg.
d) a pPS28 és a pPS29 plazmidok előállítása pl 10X PstI reakcióelegyben 20 pl pPS21A dezoxi-ribonukleinsavat oldunk. A puffer összetétele a következő:
1,0 M nátrium-klorid,
100,0 mM trisz-hidrogén-klorid, pH - 7,5,
100,0 mM magnézium-klorid,
1,0 mg/ml borjúszérum albumin.
A reakcióelegyhez 88 pl vizet adunk, majd 2 pl (150 egység) PstI restrikciós enzimet. 4 percen át 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk az elegyet, majd a reakció leállítására 10 percen át 70 °C hőmérsékleten folytatjuk az inkubálást. A PstI enzimmel részlegesen emésztett pPS21A plazmid dezoxi-ribonukleinsavat agaróz gélen elektroforézisnek vetjük alá, a gélt megfestjük. Az alábbi nagyságú fragmenseket figyelhetjük meg: 8,5 kb (a linearizált plazmid), 8,0 kb, 7,5 kb, 7,0 kb, 6,6 kb, 6,1 kb, 5,2 kb, 3,3 kb, 2,3 kb, 1,9 kb,
1,5 kb, 1,0 kb és 0,5 kb. A 6,6 kb és a 6,1 kb nagyságú PstI restrikciós fragmenseket izoláljuk, a 2. példa b) pontjában megadottak szerint eljárva.
Egyenként 05-0,5 pg-nyi fragmenshez jutunk.
A 6,6 kb nagyságú PstI restrikciós fragmenst 3 pl 10X ligáz puffer és 25 pl víz elegyében feloldjuk. Az oldathoz 2 pl T4 dezoxi-ribonukleinsav ligáz enzimet adunk, a reakcióelegyet egy éjszakán át 15 °C hőmérsékleten inkubáljuk. A ligáit dezoxi-ribonukleinsav tartalmazza az előállítandó pPS28 dezoxi-ribonukleinsavat, ezzel a fentiekben megadott módon E. coli K12 C600 sejteket transzformálunk. A 6,1 kb nagyságú PstI restrikciós fragmenst ligálással körré zárjuk, ami után megkapjuk a pPS29 plazmidot. Ezzel szintén E. coli K12 C600 sejteket transzformálunk.
A pPS28 és a pPS29 plazmidok restrikciós és funkcionális térképét a leíráshoz mellékelt 9., illetve 10. ábrán adjuk meg.
HU 206 519 Β
6. példa
A pPS45A.l, pPS45A.2, pPS45B.l és pPS45B.2 plazmidok előállítása μΐ 10X HindHI restrikciós puffer és 85 pl víz elegyében 20 pg pPS29 plazmid dezoxi-ribonukleinsavat oldunk. A restrikciós puffer összetétele a következő:
0,5 M nátrium-klorid,
M trisz-hidrogén-klorid, pH - 8,0,
0,1 M magnézium-klorid és
1,0 mg/ml borjúszérum albumin.
A dezoxi-ribonukleinsav-oldathoz 5 pl (50 egység) Hindii! restrikciós enzimet adunk, és a kapott reakcióelegyet 2 órán át 37 ’C hőmérsékleten inkubáljuk. A Hindill enzimmel emésztett pPS29 plazmid dezoxi-ribonukleinsavat 1% agarózt tartalmazó gélen addig elektroforetizáljuk, míg a 3,2 kb nagyságú, 2,3 kb nagyságú, 0,69 kb nagyságú Hindill restrikciós fragmensek világosan elkülönülnek a gélen. A 2,3 kb nagyságú Hindill restrikciós fragmenst a 2. példa b) pontjában megadottak szerint eljárva izoláljuk. így 5 pg
2,3 kb nagyságú Hindill restrikciós dezoxi-ribonukleinsav fragmenshez jutunk, amit 10 pl vízben szuszpendálunk.
pg pPS44 plazmid dezoxi-ribonukleinsavat oldunk 10 pl 10X HindHI restrikciós puffer és 80 pl víz elegyében.
A dezoxi-ribonukleinsav-oldathoz 10 pl (100 egység) Hindin enzimet adunk, és a kapott reakcióelegyet 5 percen át 37 ’C hőmérsékleten inkubáljuk. A reakció leállítására fenollal extrahálunk, majd 1% agarózt tartalmazó gélen elektroforézist végzünk addig, míg a lineáris, egy helyen hasított pPS44 dezoxi-ribonukleinsav elkülönül a nem hasított plazmidtól és a teljesen emésztett termékektől. A lineáris, egy helyen hasított dezoxi-ribonukleinsavat a 2. példa b) pontjában megadottak szerint izoláljuk a gélről.
A kapott 1 pg mennyiségű, előállítandó fragmenst 2 pl TE pufferban szuszpendáljuk.
A pPS29 plazmid 2,3 kb nagyságú Hindill restrikciós fragmensét tartalmazó oldat 2 pl-ét és 2 pl Hindill enzimmel részlegesen emésztett pPS44 plazmid dezoxi-ribonukleinsav-oldatot keverünk 3 pl 10X ligáz puffénál és 21 pl vízzel. Az elegyhez 2 pl T4 dezoxiribonukleinsav ligázt adunk, és 2 órán át 16 ’C hőmérsékleten inkubáljuk az elegyet. Az összekapcsolt dezoxi-ribonukleinsav keverék tartalmazza a pPS45A.l, pPS45A.2, pPS45B.l és a pPS45B.2 plazmidokat.
A ligáit dezoxi-ribonukleinsavval a 4. példa d) pontjában megadottak szerint eljárva E. coli K12 JA221 sejteket transzformálunk. A transzformált sejteket 100 pg/ml ampicillint tartalmazó L-agarra szélesztjük. Az ampicillinre rezisztens transzformánsokból plazmid dezoxi-ribonukleinsavat izolálunk, és restrikciós enzimes analízist végzünk az alábbi transzformánsok azonosítására: E. coli K12 JA221/pPS45A.l, E. coli K12 JA221/pPS45A.2, E. coli K12 JA221/pPS45B.l és E. coli K12 JA221/pPS45B.2.
A pPS45A.l és pPS45A.2 plazmidok csak abban különböznek a pPS45B.l és pPS45B,2 plazmidoktól, hogy a pPS29 plazmid 2,3 kb nagyságú Hindill restrikciós fragmense különböző helyekre épült be. Mivel a pPS44 plazmidból két Hindill restrikciós enzim által felismerhető hely van, a lineáris, Hindin enzimmel egy helyen hasított pPS44 plazmid valójában két különböző molekulává alakul, amelyek abban különböznek egymástól, hogy a Hindii! enzim hol hasította a dezoxi-ribonukleinsavat. Fentiek miatt a pPS29 plazmid
2,3 kb nagyságú Hindin restrikciós fragmensének kapcsolása a lineáris, egy helyen hasított, Hindin emésztett pPS44 plazmiddal két típusú terméket eredményez, amelyek a 2,3 kb nagyságú fragmens beépülés! helyében különböznek egymástól.
A pPS45A.l és a pPS45B.l abban különbözik a pPS45A.2 és a pPS45B.2 plazmid-pároktól, hogy a pPS29 plazmid 2,3 kb nagyságú Hindill restrikciós fragmense különböző orientációban épült be.
A pPS45A.l és a pPS45B.l plazmidok restrikciós és funkcionális térképét a leíráshoz mellékelt 11. és 12. ábrán adjuk meg.
7. példa a pPS42A.l, pPS42A.2, pPS42B.l éspPS42B.2 plazmidok előállítása pg pLC2 plazmid dezoxi-ribonukleinsavat oldunk 10 pl 10X Hindill restrikciós pufferban és 80 pl vízben. A dezoxi-ribonukleinsav-oldathoz 10 pl (100 egység) Hindill restrikciós enzimet adunk, és 5 percen át 37 ’C hőmérsékleten inkubáljuk a reakcióelegyet. A reakció leállítására fenollal extrahálunk, a reakcióelegyet ezután 1% agarózt tartalmazó gélen elektroforetizáljuk addig, míg a pLC2 plazmid dezoxi-ribonukleinsavából képződött lineáris, egyszer hasadt fragmens elkülönül a nem hasított plazmidtól, és a teljes emésztés során kapott termékektől. Az egyszer hasadt lineáris dezoxi-ribonukieinsavat a 2. példa b) pontjában megadottak szerint izoláljuk a gélről.
A kapott 1 pg mennyiségű fragmenst 2 plTE pufferban oldjuk.
A 6. példában megadottak szerint előállított, pPS29 plazmidból származó, 2,3 kb nagyságú Hindin restrikciós fragmens oldatának 2 pl-ét és 2 pl Hindin enzimmel részlegesen emésztett pLC2 dezoxi-ribonukleinsavat 3 pl 10X ligáz pufferral és 21 pl vízzel keverünk. A reakcióelegyhez ezután 2 pl T4 dezoxi-ribonukleinsav ligázt adunk, és a reakcióelegyet 2 órán át 16 ’C hőmérsékleten inkubáljuk, A ligáit dezoxi-ribonukleinsavak keverékében jelen van a pPS42A.l, pPS42A.2, pPS42B.l és pPS42B.2 plazmid.
A ligáit dezoxi-ribonukleinsavval a 4. példa d) pontjában megadottak szerint eljárva, E. coli K12 JA221 sejteket transzformálunk. A transzformált sejteket 100 pg/ml ampicillint tartalmazó L-agarra szélesztjük. Az ampicillin rezisztens transzformánsokban levő plazmidokat restrikciós analízissel vizsgáljuk, az alábbi transzformánsok azonosítására: E. coli K12 JA221/pPS42A.l, E. coli K12 JA221/pPS42A.2, E. coli K12 JA221/pPS42B.l és E. coli K12 JA221/pPS42B 2.
A pPS42A.l és pPS42A.2 plazmidok abban külön20
HU 206519 Β böznek a pPS42B.l és pPS42B.2 jelű plazmidoktól, hogy a pPS29 plazmidból származó, 2,3 kb nagyságú HindlII restrikciós fragmens különböző helyekre épült be. Mivel a pLC2 plazmid két HindlII restrikciós enzim által felismerhető helyet tartalmaz, a lineáris, egy helyen hasadt, HindlII enzimmel emésztett pLC2 plazmid valójában két különböző típusú molekulát képez, amelyek a HindlII enzim hasítási helyében különböznek egymástól. Ennek következtében a pPS29 plazmid
2,3 kb nagyságú HindlII restrikciós fragmensének ligálása a lineáris, egy helyen hasított, HindlII endonukleázzal kezelt pLC2 plazmiddal a 2,3 kb nagyságú ffagmens beépülési helyében különböző, két típusú plazmidot eredményez.
A pPS42A.l és pPS42B.l a pPS42A.2, illetve pPS42B.2 plazmid-pároktól abban különbözik, hogy a
2,3 kb nagyságú pPS29 Hindin restrikciós fragmens más irányítottságú.
A pPS42A.l és pPS42B.l plazmidok restrikciós és funkcionális térképét a leíráshoz mellékelt 13. és 14. ábrákon adjuk meg.
8. példa
A pPS39 és pPS39.l plazmidok előállítása
a) A pPS38 és pPS38.1 köztes plazmidok előállítása (i) A BamHI emésztett pUC8 előállítása
A Pharmacia P-L Biochemicals-tól vásárolt pUC8 plazmid 5 gg-ját 5 μΐ 10X BamHI restrikciós puffer és 40 μΐ víz elegyében oldjuk. A dezoxi-ribonukleinsavoldathoz 5 μΐ (50 egység) BamHI restrikciós enzimet adunk, és a kapott reakcióelegyet 2 órán át 37 ’C hőmérsékleten inkubáljuk. A reakció leállítására pufferezett fenollal extrahálunk, majd az extrakciót kloroformmal megismételjük. A BamHI enzimmel hasított pUC8 plazmid dezoxi-ribonukleinsavat kicsapjuk úgy, hogy a reakcióelegy nátrium-klorid koncentrációját 0,25 mólra állítjuk be, 2 térfogat etanolt adunk hozzá, és 10 percen át -70 ’C hőmérsékleten tartjuk. A BamHI enzimmel emésztett pUC8 plazmid dezoxi-ribonukleinsavat centrifugálással összegyűjtjük, és 5 μΐ vízben oldjuk.
(ii) A pLC2 plazmid 0,83 kb nagyságú NcoI-BamHI restrikciós fragmensének izolálása μΐ 10X BamHI puffer és 40 μΐ víz elegyében 10 pg pLC2 plazmid dezoxi-ribonukleinsavat oldunk. A dezoxi-ribonukleinsav-oldathoz 2,5-2,5 gl (25 egység) BamHI és Ncol restrikciós endonukleázt adunk, majd 2 órán át 37 ’C hőmérsékleten inkubáljuk a reakcióelegyet. A reakció lezajlása után az elegyet 1% agarózt tartalmazó gélre juttatjuk, és a 2. példa b) pontjában megadottakat megismételve, izoláljuk az izopenicillin N szintetáz gén transzkripciós és transzlációs aktivációs szekvenciáját hordozó, 0,83 kb nagyságú NcoI-BamHI restrikciós fragmenst.
A kapott 1 gg mennyiségű fragmenst 5 μΐ vízben oldjuk.
(iii) A pPS38 plazmid előállításához használt linker készítése
Automata dezoxi-ribonukleinsav szintetizátorral előállítjuk az alábbi linker egyes szálait:
5'-CATGAAGAAG-3'
Z t f t f t
3'-TTCTTCCTAG-5'.
A linker egyes szálainak 75 pmólnyi mennyiségét egyenként 22$ μΐ víz és 2,5 μΐ ligáz puffer elegyében oldjuk. Az egyszálú dezoxi-ribonukleinsav molekulákat tartalmazó oldat mindegyikéhez 10 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav kináz enzimet (Bethesda Research Laboratories) adunk, és a reakcióelegyet 10 percen át 37 ’C hőmérsékleten inkubáljuk. A kináz reakció lezajlása után 15 percen át 70 ’C hőmérsékleten folytatjuk az inkubációt. Az egyszálú dezoxi-ribonukleinsavak összekapcsolására összeöntjük a két reakcióelegyet, és 10 percen át 65 ’C hőmérsékleten, 2 órán át szobahőmérsékleten, majd egy éjszakán át 4 ’C hőmérsékleten tartjuk.
(iv) A pPS38 és pPS38.1 előállítása
A pLC2 plazmid 0,83 kb nagyságú NcoI-BamHI restrikciós fragmensének 4 μΐ mennyiségű oldatát az alábbi elegyhez adjuk:
μΐ fentiek szerint előállított, összekapcsolt linker molekulát tartalmazó oldat, μΐ 10X ligáz puffer, μΐ víz és μΐ T4 dezoxi-ribonukleinsav ligáz.
A reakcióelegyet egy éjszakán át 4 ’C hőmérsékleten inkubáljuk. A ligáit dezoxi-ribonukleinsavat kicsapjuk, a kivált csapadékot 10 μΐ 10X BamHI puffer és 85 μΐ víz elegyében szuszpendáljuk. A dezoxi-ribonukleinsav-oldathoz 5 μΐ (50 egység) BamHI restrikciós enzim-oldatot adunk, és a kapott reakcióelegyet 2 órán át 37 ’C hőmérsékleten inkubáljuk. A reakció leállítására pufferezett fenollal extrahálunk, az extrakciót kloroformmal megismételjük, és a nem ligáit linker molekulák eltávolítására a dezoxi-ribonukleinsavat többször kicsapjuk.
A dezoxi-ribonukleinsavat 3 μΐ 10X ligáz puffer és 24 μΐ víz elegyében szuszpendáljuk. A dezoxi-ribonukleinsav oldatához 1 μΐ BamHI endonukleázzal emésztett pUC8 plazmid dezoxi-ribonukleinsavat és 2 μΐ (500 egység) T4 dezoxi-ribonukleinsav ligáz enzimet adunk, a kapott reakcióelegyet egy éjszakán át 4 ’C hőmérsékleten inkubáljuk. A ligáit dezoxi-ribonukleinsav tartalmazza az előállítani kívánt pPS38 és pPS38.1 plazmidokat.
A Pharmacia P-L Biochemicals-tól beszerzett E. coli K12 JM109 törzset 50 ml L-táptalajban növesztjük addig, míg az 590 nm-en mért optikai denzitás 0,5 abszorpciós egységet ér el. 10 percen át jégfürdőben hűtjük a tenyészetet, majd centrifugálással összegyűjtjük a sejteket. 25 ml hideg, 100 mmólos kalcium-klorid-oldatban szuszpendáljuk a sejteket, és 25 percen át inkubáljuk jégfürdőben. Centrifugálással ismét összegyűjtjük a sejteket, és az üledéket 2$ ml hideg, 100 mmólos kalcium-klorid-oldatban szuszpendáljuk, a szuszpenziót jégfürdőben inkubáljuk egy éjszakán át.
200 μΐ setjszuszpenziót keverünk a fentiek szerint előállított, ligáit dezoxi-ribonukleinsavval, és 20 percen át jégfürdőben inkubáljuk. Az inkubációs idő vé21
HU 206 519 Β gén a sejteket tartalmazó szuszpenziót 2 percre 42 °C hőmérsékletű vízfürdőbe helyezzük, ezután további 10 percen át jégfürdőben tartjuk, Centrifugálással öszszegyűjtjük a sejteket, és 1 ml L-táptalajban szuszpendáljuk, a szuszpenziót 2 órán át 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk.
A sejtszuszpenzió alikvot mintáit L-agarból (15 g/1 agart tartalmazó L-táptalaj) szélesztjük, a táptalaj 100 μg ampicillint, 40 gg X-gal-t és 40 pg IPTG-t tartalmaz ml-enként. A lemezeket egy éjszakán át 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk. Az inszertet nem tartalmazó plazmidot hordozó telepek, például az E. coli K12 JM109/pUC8 a lemezeken kék színűek. Az inszertet tartalmazó plazmidot hordozó telepek, például az E. coli KI2 JM109/pPS38 fehér színűek. Több fehér színű telepet kiválasztunk, és a plazmid dezoxi-ribonukleinsavakat restrikciós analízisnek vetjük alá az izopenicillin N szintetáz gén aktivációs szekvenciáját hordozó 0,84 kb nagyságú BamHI restrikciós fragmens jelenlétének bizonyítására.
Az E. coli K12 JMlO9/pPS38 és az E. coli K12 JM109/pPS38.1 sejtekből kapott plazmid dezoxi-ribonukleinsavat a 2. példa a) pontjában megadottak szerint izoláljuk.
b) A pPS38 plazmid 0,84 kb nagyságú BamHI restrikciós fragmensének izolálása pl 10X BamHI reakciós puffer és 125 pl víz elegyében 50 pg pPS38 plazmid dezoxi-ribonukleinsavat oldunk. A dezoxi-ribonukleinsav-oldathoz 10 pl (100 egység) BamHI restrikciós enzim-oldatot adunk, és a kapott reakcióelegyet 2 órán át 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk. A BamHI enzimmel emésztett pPS38 dezoxi-ribonukleinsavat 1% agarózt tartalmazó gélre juttatjuk, és az izopenicillin N szintetáz gén aktivációs szekvenciáját tartalmazó, 0,84 kb nagyságú BamHI restrikciós fragmenst a 2. példa b) pontjában megadottak szerint izoláljuk.
pg mennyiségű fragmens dezoxi-ribonukleinsavat kapunk, ezt 10 pl vízben szuszpendáljuk,
c) A pPS28plazmid dezoxi-ribonukleinsav emésztése
BamHI restrikciós endonukleázzal
Az 5. példában megadottak szerint előállított pPS28 plazmid dezoxi-ribonukleinsav 5 pg-ját 10 pl 10X BamHI restrikciós puffer és 85 pl víz elegyében oldjuk. A pPS28 plazmid dezoxi-ribonukleinsav-oldathoz 5 pl (50 egység) BamHI restrikciós enzim-oldatot adunk, és a reakcióelegyet 2 órán át 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk, A pPS28 plazmid dezoxi-ribonukleinsav BamHI emésztett fragmenseit tartalmazó reakcióelegyet először pufferezett fenollal, majd kétszer kloroformmal extraháljuk. A dezoxi-ribonukleinsavat ezután kicsapjuk, centrifugálással összegyűjtjük, és 10 pl vízben feloldjuk.
d) A pPS39 és pPS39.l plazmidok előállítása pl 0,84 kb nagyságú BamHI restrikciós fragmenst tartalmazó oldatot adunk az alábbi elegyhez:
pl BamHI enzimmel emésztett pPS28 plazmid dezoxi-ribonukleinsav-oldat, pl 10X ligáz puffer, pl T4 dezoxi-ribonukleinsav ligáz és pl víz.
A reakcióelegyet egy éjszakán át 15 °C hőmérsékleten inkubáljuk. A ligáit dezoxi-ribonukleinsav keverék tartalmazza a pPS39 és pPS39.1 plazmidokat.
A ligáit dezoxi-ribonukleinsavval E. coli K12 C600 sejteket transzformálunk. A törzset ATCC 33 525 sorszámon az alábbi törzsgyűjteményben találjuk meg: American Type Culture Collection, Rockville, MD 20 852. A transzformációt a 8. példa a) pontjában megadott (iv) pont szerint végezzük. A transzformált sejteket 100 pg/ml ampicillint tartalmazó L-agarra szélesztjük, és a lemezeket egy éjszakán át 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk.
A transzformációs lemezekről különálló telepeket izolálunk, ezeket tenyésztjük, és belőlük plazmid dezoxi-ribonukleinsavat izolálunk. A plazmid dezoxi-ribonukleinsavakat restrikciós enzimes analízissel vizsgáljuk. Az egyéb ligációs termékektől a pPS39 és pPS39.1 plazmidokat úgy tudjuk megkülönböztetni, hogy BamHI restrikciós endonukleázos emésztést követően mindkét plazmidból 0,84 kb és 5,8 kb nagyságú restrikciós fragmenseket kapunk. A pPS39 és pPS39.1 plazmidokat egymástól úgy különböztethetjük meg, hogy PstI restrikciós enzimmel hasítjuk őket, amikor is a pPS39 plazmidból 5,15 kb nagyságú, 1,02 kb nagyságú és 0,43 kb nagyságú fragmenseket kapunk, ugyanakkor a pPS39.1 plazmidból 5,15 kb nagyságú, 1,07 kb nagyságú és 0,38 kb nagyságú fragmenseket detektálunk.
9. példa
A pPS40 plazmid előállítása a) A pPS4l plazmid előállítása pg pUC8 plazmid dezoxi-ribonukleinsavat feloldunk 2 pl 10X BamHI restrikciós puffer és 16 pl víz elegyében. A pUC8 dezoxi-ribonukleinsav-oldathoz 2 pl (20 egység) BamHI restrikciós enzimet adunk, és a kapott reakcióelegyet 2 órán át 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk. A pUC8 plazmid dezoxi-ribonukleinsav BamHI enzimmel emésztett fragmenseit tartalmazó reakcióelegyet fenollal extraháljuk, majd az extrakciót kloroformmal megismételjük. A BamHI enzimmel emésztett pUC8 plazmid dezoxi-ribonukleinsavat ezután kicsapjuk, centrifugálással összegyűjtjük, és 5 pl vízben felszuszpendáljuk.
pg pLC2 plazmid dezoxi-ribonukleinsavat 10 pl 10X BamHI restrikciós puffer és 80 pl víz elegyében oldunk. A pLC2 plazmid dezoxi-ribonukleinsav-oldatához 5-5 pl (50 egység) BglII és BamHI restrikciós enzimet adunk, és a kapott reakcióelegyet 2 órán át 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk. Ezután 1% agarózt tartalmazó gélen elektroforézist végzünk mindaddig, míg az egyéb reakciótermékektől a 0,65 kb nagyságú BamHI-Bgin restrikciós fragmens elkülönül. Az izopenicillin N szintetáz gén transzkripciós terminációs és mRNS poliadenilezési és szintézis szignáljait tartalmazó, 0,65 kb nagyságú BamHI-BglII restrikciós fragmenst a 2. példa b) pontjában megadottak szerint izoláljuk.
A kapott 2 pg mennyiségű fragmenst 5 pl vízben szuszpendáljuk.
HU 206519 Β pl, BamHI enzimmel emésztett pUC8 plazmid dezoxi-ribonukleinsavat adunk az alábbi összetételű elegyhez:
μΐ pLC2 plazmidból származó, 0,65 kb nagyságú BamHI-BglII restrikciós fragmenst tartalmazó oldat, pl 10X ligáz puffer, μΐ víz és μΐ T4 dezoxi-ribonukleinsav ligáz.
A kapott reakcióelegyet egy éjszakán át 15 ’C hőmérsékleten inkubáljuk. A BglII és BamHI túlnyúló szekvenciák alkalmasak az összekapcsolásra, ligálás után XhoII restrikciós helyet hoznak létre, ligálás után azonban sem a BamHI, sem a BglII restrikciós enzimek nem hasítják a kapcsolás helyén a dezoxi-ribonukleinsav molekulát. A ligáit dezoxi-ribonukleinsav tartalmazza a pPS41 plazmidot, az eleggyel NRRL B15440 sorszámon letétbe helyezett E. coli K12 RR1 delta M15 törzset transzformálunk. A transzformációt az 5. példa b) pontjában ismertetett (iv) pont szerint végezzük.
A transzformált sejteket 100 pg ampicillint, 40 gg X-gal-t és 40 pg IPTG-t tartalmazó (ml-enként) Lagarlemezekre szélesztjük. A nem kék színű transzformánsokat tenyésztjük, a tenyészetekből plazmid dezoxi-ribonukleinsavat izolálunk, és ezeket az E. coli K12 RR1 delta M15/pPS41 transzformánsok azonosítására restrikciós enzimekkel analizáljuk.
Mivel a fragmens két orientációban épülhet be, azonban csak az egyik hozza létre a kívánt plazmidot, és mivel a kívánt orientáció esetén a beépült dezoxi-ribonukleinsav a pPS41 plazmidból egy 0,68 kb nagyságú EcoRI-HindHI restrikciós fragmensen hasad ki, az E. coli K12 RR1 delta Ml5/pPS41 transzformánsokat a bennük levő plazmid dezoxi-ribonukleinsav azonosítására EcoRI és Hindin restrikciós endonukleázokkal analizáljuk.
ApPS41 plazmid restrikciós és funkcionális térképét a leíráshoz mellékelt 16. ábrán adjuk meg. b) A pPS40 plazmid előállítása pg pPS39 plazmid dezoxi-ribonukleinsavat oldunk 2 μΐ 10X Hindin restrikciós puffer és 17 pl víz elegyében. A pPS39 dezoxi-ribonukleinsav oldatához 1 pl (10 egység) Hindin restrikciós enzimet adunk, és a kapott reakcióelegyet 2 órán át inkubáljuk 37 °C hőmérsékleten. A HindlII enzimmel emésztett pPS39 plazmid dezoxi-ribonukleinsavat ezután kicsapjuk, centrifugálással összegyűjtjük, és 2 μΐ 10X EcoRI puffer és 17 pl víz elegyében szuszpendáljuk. Az EcoRI puffer összetétele a következő:
1,0 M trisz-hidrogén-klorid, pH - 7,5,
0,5 M nátrium-klorid,
50,0 mM magnézium-klorid és 1,0 mg/ml borjúszérum albumin.
A HindlII enzimmel hasított pPS39 plazmid dezoxiribonukleinsav-oldathoz 1 pl (10 egység) EcoRI restrikciós enzimet adunk, és a kapott reakcióelegyet 2 órán át inkubáljuk 37 ’C hőmérsékleten. A reakció leállítására fenollal extraháljuk az elegyet, az extrakciót ezután kloroformmal megismételjük. A kapott pPS39 plazmid dezoxi-ribonukleinsavból származó EcoRI-Hindni fragmenseket 10 pl vízben szuszpendáljuk.
μΐ 10X HindlII restrikciós puffer és 85 pl víz elegyében 25 pg pPS41 plazmid dezoxi-ribonukleinsavat oldunk fel. A dezoxi-ribonukleinsav-oldathoz 5 pl (50 egység) Hindin restrikciós endonukleázt adunk, és a kapott reakcióelegyet 2 órán át 37 ’C hőmérsékleten inkubáljuk. A Hindffi endonukleázzal emésztett pPS41 plazmid dezoxi-ribonukleinsavat ezután kicsapjuk, centrifugálással összegyűjtjük, és 10 pl 10X EcoRI puffer és 85 pl víz elegyében feloldjuk. A dezoxi-ribonukleinsav-oldathoz 5 pl (50 egység) EcoRI restrikciós enzim-oldatot adunk, a kapott reakcióelegyet pedig 37 ’C hőmérsékleten 2 órán át inkubáljuk.
Az EcoRI-HindlH fragmenseket tartalmazó, pPS41 plazmid dezoxi-ribonukleinsavból kapott elegyet 1% agarózt tartalmazó gélen addig elektroforetizáljuk, amíg a Penicillium chrysogenum izopenicillin N szintetáz génjének transzkripciós terminációs és mRNS poliadenilációs és szintézis szignáljait tartalmazó, 0,68 kb nagyságú EcoRI-HindHI restrikciós fragmens világosan elkülönül az egyéb reakciótermékektől. A 0,68 kb nagyságú restrikciós fragmenst a 2. példa b) pontjában megadottak szerint izoláljuk. A kapott 2 pg mennyiségű fragmenst 5 pl vízben feloldjuk.
pl, a pPS41 plazmidból származó, 0,68 kb nagyságú EcoRI-HindHI restrikciós fragmenst tartalmazó oldatot keverünk 5 pl HindlH-EcoRI-emésztett pPS39 plazmid dezoxi-ribonukleinsav-oldattal. Az elegyhez 3 pl 10X ligáz puffért, 17 pl vizet és 2 pl T4 dezoxi-ribonukleinsav ligázt adunk, és a kapott reakcióelegyet 2 órán át 16 ’C hőmérsékleten inkubáljuk.
A ligáit dezoxi-ribonukleinsav tartalmazza az előállítani kívánt pPS40 plazmidot. A ligáit dezoxi-ribonukleinsavval E. coli K12 JA221 sejteket transzformálunk, a 4. példa d) pontjában megadottak szerint eljárva. Az E. coli K12 JA221/pPS40 transzformánsokat ampicillin rezisztens fenotípusuk és a bennük levő plazmid dezoxi-ribonukleinsav restrikciós enzimes analízise alapján azonosítjuk. A pPS4O plazmid azonos a pPS39 plazmiddal, kivéve abban, hogy a pPS40 plazmid tartalmazza a pPS41 plazmid 0,68 kb nagyságú EcoRIHindHI restrikciós ffagmensét, míg a pPS39 plazmid rendelkezik egy 0,356 kb nagyságú EcoRI-HindHI restrikciós fragmenssel, és egy 0,685 kb nagyságú Hindin fragmenssel.
A pPS40 plazmid restrikciós és funkcionális térképét a leíráshoz mellékelt 17. ábrán adjuk meg.
10. példa
A Cephalosporium acremonium és a Penicillium chrysogenum genetikai transzformációja Az alábbiakban ismertetett transzformációs eljárást az EP-A-177 243 sorszámú európai szabadalmi leírás tárgyalja.
Ez az eljárás specifikusan a Cephalosporium acremonium transzformációjára vonatkozik olyan vektorokkal, amelyek higromicin rezisztencia gént tartalmaznak. Az eljárás adaptálható a Penicillium chryso23
HU 206 519 Β genum sejtekre, és a transzformáció során használhatunk olyan vektorokat, amelyek nem tartalmaznak higromicin rezisztenciát meghatározó gént, amikor is a folyamatot úgy módosítjuk, hogy a transzformációs lemezek higromicint tartalmazó agarral való felületrétegezését elhagyjuk.
A Penicillium sokkal rezisztensebb higromicinre, mint a Cephalosporium. Ezért, ha a transzformánsokat higromicin rezisztens fenotípusuk alapján akarjuk azonosítani, nagy mennyiségű higromicint kell adagolnunk. Azonban, mivel a Penicillium természetes rezisztenciáját annak tulajdonítják, hogy a higromicin antibiotikum nem jut át a Penicillium sejtek sejtmembránján, a transzformációs lemezekbe permeabilizáló vegyületeket, például dimetilszulfoxidot vagy alameticint adagolhatunk. A Penicillium chrysogenum higromicinnel szembeni érzékenységének növelésére különösen előnyös permeabilizáló vegyületként van számon tartva a ficinnel hasított polimixin Bből keletkező nonapeptid. Ezenkívül izolálhatunk mutagenizáló ágensekkel kis mennyiségű higromicinre érzékeny mutáns Penicillium chrysogenum törzseket, amelyeket azután a találmány szerinti higromicin rezisztenciát meghatározó vektorok használatakor gazdasejtként alkalmazhatunk.
Ha Penicillium chrysogenum vagy Cephalosporium acremonium sejtekben szelektálható markert a vektor nem tartalmaz, úgy a transzformánsokat azonosíthatjuk úgy, hogy a regenerálás után kapott telepeket a transzformációra használt dezoxi-ribonukleinsav jelenlétére vizsgáljuk. Ilyen vizsgálati módszer lehet a hibridizáció és a restrikciós enzimes analízis. A pLC2 plazmid nem hordoz Penicillium chrysogenum vagy Cephalosporium acremonium sejtekben szelekciót megengedő markereket, így a pLC2 vagy pPS44 plazmiddal transzformált Penicillium chrysogenum vagy Cephalosporium acremonium transzformánsokat dezoxi-ribonukleinsavuk analízisével kell azonosítanunk.
A pPS39, pPS40, pPS42A.l, pPS42B.l, pPS42A.2, pPS42B,2, pPS45A.l, pPS45B.l, pPS45A.2 és a pPS45B.2 plazmidok viszont tartalmaznak szelektálható markert, a higromicin rezisztenciát meghatározó gént, így a fenti plazmidokkal transzformált Penicillium chrysogenum vagy Cephalosporium acremonium transzformánsokat mind higromicin rezisztens fenotípusuk, mind pedig dezoxi-ribonukleinsavuk analízise után azonosíthatjuk.
a) A Cephalosporium acremonium törzsek
A transzformációra legelőnyösebb Cephalosporium törzset ATCC 11 550 sorszámon találjuk meg az American Type Culture Collection, Rockville, Maryland törzsgyűjteményben. Az ATCC 11550 sorszámú törzsből mutációval kapott bármely más törzs, vagy más Cephalosporium törzsek, szelektált vagy cefalosporin C antibiotikum termelés fokozása érdekében izolált egyedek szintén alkalmasak a találmány szerinti vektorokkal való transzformációra.
b) A sejttenyészet inokulumának előállítása
A Cephalosporium acremonium sejtek hatékony genetikai transzformálásához el kell távolítanunk a sejtfalat megfelelően stabil protoplasztok előállítására. Protoplasztok előállításakor előnyös egységes inokulumból kiindulnunk. Egyébként nem reprodukálható a sejttenyészetek előállítása, és időveszteséget jelent a C. acremonium protoplasztok előállításakor a nem megfelelő állapotban levő kiindulási sejttömeg.
c) A tenyésztéshez szükséges egységes inokulum előállítása ml steril sóoldattal hígítunk fagyasztva szárított vagy folyékony nitrogénben tárolt, és szobahőmérsékleten felolvasztott spórákat (109 spóra/1,5 ml tároló táptalaj; ennek összetétele:
5% laktóz,
10% glicerin és
0,1% Tween 80).
0,1 ml spóraszuszpenzióval 20 ml TrypticaseRSoy Agar-t tartalmazó ferde agarokat (50 darab) oltunk (BBL™, Division of Becton, Dickinson and Company, Cockeysville, Maryland 21030). Oltás előtt a ferde agar táptalajokat addig szárítjuk, míg a felületen nem látunk nedvességet. A beoltott ferde agarokat 4 napon át 25 °C hőmérsékleten inkubáljuk. A ferde agarok felületét benövő micéliumhoz 10 ml fentiekben megadott összetételű tároló oldatot adunk. A spórák szuszpendálására vortexeljük a ferde agarokat, és az egyes táptalajokról származó spóraszuszpenziókat összegyűjtjük, és 10-10 ml térfogatú mintákat -80 °C hőmérsékleten lefagyasztunk. A fagyasztott spóraszuszpenzió lassan veszít életképességéből, és -80 °C hőmérsékleten csak három hónapon át tárolható.
d) A sejtek növesztése protoplasztok előállítására
A 10. példa c) pontjában megadottak szerint előállított fagyasztott spóraszuszpenzió 10 ml-ével 106 ml vizes, 500 ml térfogatú lombikban sterilezett táptalajt oltunk. A sejteket centrifugálással kapjuk, a centrifugálást 10 percen át percenként 260-at forduló rotorban végezzük, és közvetlenül a vizes táptalajban szuszpendáljuk a spórákat. A vizes táptalajt az alábbiak szerint állítjuk elő:
100 ml A-oldatot öntünk 500 ml térfogatú lombikba; a lombikot ismert módon lezárjuk, és 125 °C hőmérsékleten 20 percen át autoklávozzuk. 2 ml B-oIdatot és 4 ml C-oldatot adunk ezután az így előállított, steril elegyhez a vizes táptalaj elkészítésére.
Az A-oldat összetétele a kővetkező:
szacharóz 36 g/1
L-aszparagin 7,5 g/1
kálium-dihidrogén-foszfát 15 g/1
dikálium-hidrogén-foszfát 21 g/1
nátrium-szulfát 0,75 g/1
magnézium-szulfátx7H2O 0,18 g/1
kalcium-klorid 0,06 g/1 és
sóoldat 1 ml/I.
A táptalaj pH-ját nem kell beállítanunk.
A sóoldat összetétele a következő:
Fe(NH4)(SO4)26H2O 15 g/1
mangán-szulfátx4H2O 3 g/1
cink-szulfátx7H2O 3 g/1 és
réz-szulfátx5H2O 0,8 g/1.
HU 206519 Β
A B-oldat összetétele a következő:
glükóz 108 g/1.
Az oldatot 30 percen át sterilezzük, 121 ’C hőmérsékleten.
A C-oldat összetétele a következő: szacharóz 25 g/1 kukoricalekvár (4 tömeg% nitrogén) 12,5 ml ammónium-acetát 5,5 g/1 kalcium-karbonát 5 g/1.
Az elegy pH-ját kálium-hidroxid-oldattal 6,5-re állítjuk be, majd 20 percen át 121 ’C hőmérsékleten sterilezzük.
Az oltás előtt a sejtszuszpenzió felülúszóját különítjük el, mivel a laktóz és a glicerin befolyásolja a sejtek növekedését. A szuszpendált sejtekkel beoltott táptalajokat vízfürdőbe helyezzük, és rázás közben (285 fordulat/perc, 2,5 cm átmérőjű kör mentén) 24 órán át inkubáljuk 29-30 ’C hőmérsékleten. A 2930 ’C tenyésztési hőmérséklet különösen előnyös transzformálható protoplasztok előállításakor, de tenyészthetünk 25 ’C hőmérsékleten is. A témában jártasak felismerik, hogy a 29-30 ’C-os tenyésztés eltér a Cephalosporium acremonium antibiotikum termelés céljából végzett tenyésztésétől, amikor az előnyös hőmérséklet 25 ’C.
e) A Cephalosporium protoplasztok előállítása órás tenyészetből szűréssel elkülönítjük a sejteket (a szűrést Whatman -1 papíron végezzük Buchner tölcsérben). A sejteket Mcllvaine-pufferban (pH - 7,1) szuszpendáljuk. A puffer összetétele a következő:
0,1 M citromsav és
0,2 M dinátrium-hidrogén-foszfát.
A pufferhoz 0,01 M végkoncentrációig ditio-treitolt adunk. A sejtekhez annyi puffért adunk, hogy 20 ml sejtszuszpenzióban 1 g (szűrés utáni tömeg) sejt legyen. A sejtszuszpenziót körkörös mozgású vízfürdőben rázatjuk, 50 ml térfogatú lombikban, 29-30 ’C hőmérsékleten, 90 percen át. A rázólap percenként 140-et fordul 2,5 cm átmérőjű kör mentén. A ditio-treitollal kezelt sejteket vízzel mossuk, és enzimes oldatban szuszpendáljuk. Az enzimes oldat 25 mg/ml β-glukuronidáz-enzimet tartalmaz, Mcllvaine-pufferban, pH 6,35. A puffért 0,8 M nátrium-kloriddal és 0,02 M magnézium-szulfáttal egészítettük ki.
Az enzimet a Sigma Chemical Company-tól vásároltuk. A sejt végkoncentráció 1 g kezelt sejt/10 ml enzimes oldat. Vízfürdőbe helyezzük a sejtszuszpenziót, és percenként 120-at forduló (2,5 cm átmérőjű kör mentén) rázógépen inkubáljuk 3 órán át, 29-30 ’C hőmérsékleten. A protoplaszt szuszpenziót 4 térfogat mosóoldattal hígítjuk, ennek összetétele a következő:
0,8 M nátrium-klorid és 0,02 M magnézium-szulfát.
A szuszpenziót két réteg szűrőpapíron szűrjük. A protoplasztokat tartalmazó szűrletet szobahőmérsékleten centrifugáljuk 5 percen át, percenként 2600-at forduló rotorban. Dekantáljuk a felülúszót, és a leülepedett protoplasztokat 10 ml mosóoldatban szuszpendáljuk. Kétszer ismételjük a mosást, majd annyi 0,8 mólos nátrium-klorid-oldatban szuszpendáljuk a protoplasztokat, hogy azok hemocitométerrel meghatározott száma ml-enként 2-3xl08 legyen,
f) Transzformáció
Mindegyik transzformáláshoz felhasználandó plazmádhoz 1 ml Cephalosporium protoplaszt szuszpenziót készítünk 0,8 mólos nátrium-klorid-oldatban. A protoplasztok száma 2-3xl08/ml. A nátrium-klorid-oldathoz előzőleg 0,05 ml frissen desztillált dimetil-szulfoxidot adunk, és kalcium-klorid koncentrációját 80 mmólosra állítjuk be. A protoplaszt szuszpenzióhoz 20 pg transzformáló plazmidot és polietilén-glikol 4000-et (Baker, több mint 20 tömeg vízben) adunk. A reakcióelegy össztérfogata 10 ml. 10 percen át szobahőmérsékleten inkubáljuk az elegyet, majd 5 percen át percenként 700-at forduló rotorban centrifugáljuk. A centrifugálást percenként 2500-at forduló rotorban 10 percen át megismételjük. A protoplasztokból álló üledéket 1 ml 0,8 mólos nátrium-klorid-oldatban szuszpendáljuk. 0,1 ml térfogatú mintákat 10,8% szacharózt tartalmazó Trypticase-Soy agarra (BBL) szélesztünk. A szacharózra ozmotikus stabilizálás céljából van szükség.
órán át 15 ’C hőmérsékleten inkubáljuk a tenyészeteket, majd 0,41 tömeg% agart tartalmazó lágy agárral rétegezzük 42 ’C hőmérsékleten. A lágyagar 0,8 M nátrium-kloridot és a petri csészében levő össztáptalajra számítva 100 pg/ml higromicin koncentrációt kialakító mennyiségű antibiotikum van. A felülrétegezéshez használt agar megszilárdulása után a petri csészéket 25 ’C hőmérsékleten inkubáljuk magas páratartalmú inkubátorban. Bár a transzformációt követő 3. napon megfelelő nagyságú transzformáns telepek figyelhetők meg, a lassabban növök továbbtenyésztésre alkalmas nagyságukat csak a 60. napon érik el. A stabil transzformánsoktól az abortívak könnyen megkülönböztethetők, mivel az utóbbiak 100 pg/ml higromicint tartalmazó friss táptalajra oltva nem növekednek.

Claims (19)

1. Eljárás a Penicillium chrysogenum izopenicillin N szintetázt kódoló operon transzkripciós és transzlációs aktiváló szakasz, strukturgén, transzkripciós és transzlációs terminációs szakasz legalább egyikét tartalmazó rekombináns dezoxi-ribonukleinsav vektor előállítására, azzaljellemezve, hogy az E. coli K12 JM109/pLC2 törzset tenyésztjük, izoláljuk a plazmid dezoxi-ribonukleinsavat, majd a kívánt szekvenciát tartalmazó ffagmenst kinyerjük, és a fragmens felhasználásával ismert rekombináns módszereket alkalmazva vektort szerkesztünk.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzaljellemezve, hogy egy plazmidot szerkesztünk.
3. A 2. igénypont szerinti eljárás a pPS44 plazmid előállítására, azzaljellemezve, hogy a ρΓΓ335 plazmid 0,85 kb nagyságú Ncol restrikciós fragmensét és a pLC2 plazmid Ncol endonukleázzal végzett részleges emésztés után kapott fragmensek összekapcsoljuk és a megfelelő szerkezetű plazmidot kiválasztjuk.
HU 206 519 Β
4. A 2. igénypont szerinti eljárás a pPS45A,l, pPS45A.2, pPS45B.l és pPS45B.2 plazmidok előállítására, azzaljellemezve, hogy a pPS29 plazmid 2,3 kb nagyságú Hindin restrikciós fragmensét és a pPS44 plazmid részleges HindlU emésztéssel kapott fragmenseit összekapcsoljuk, és a megfelelő szerkezetű plazmidot kiválasztjuk.
5. A 2. igénypont szerinti eljárás a pPS42A.l, PPS42A.2, pPS42B.l és pPS42B.2 plazmidok előállítására, azzaljellemezve, hogy a pPS29 plazmid 2,3 kb nagyságú HindUI restrikciós fragmensét és a pLC2 plazmid részleges HindHI emésztéssel kapott fragmensét összekapcsoljuk, és a megfelelő szerkezetű plazmidot kiválasztjuk.
6. A 2. igénypont szerinti eljárás a pPS38 és pPS38.1 plazmidok előállítására, azzaljellemezve, hogy összekapcsoljuk a pLC2 plazmid BamHI linkemel kiegészített, 0,83 kb nagyságú NcoI-BamHI restrikciós fragmensét és a BamHI emésztett lineáris pUC8 plazmidot, és a megfelelő szerkezetű plazmidot kiválasztjuk.
7. A 2. igénypont szerinti eljárás a pPS39 és pPS39.1 plazmidok előállítására, azzaljellemezve, hogy a pPS38 plazmid 0,84 kb nagyságú BamHI restrikciós fragmensét összekapcsoljuk a pPS28 plazmid BamHI endonukleázzal történő kezelés után kapott fragmensekkel, és a megfelelő szerkezetű plazmidot kiválasztjuk.
8. A 2. igénypont szerinti eljárás a pPS41 plazmid előállítására, azzaljellemezve, hogy összekapcsoljuk a pLC2 plazmid 0,65 kb nagyságú BamHl-BglII restrikciós fragmensét és a pUC8 plazmid BamHI fragmensét, és a megfelelő szerkezetű plazmidot kinyerjük.
9. A 2. igénypont szerinti eljárás a pPS40 plazmid előállítására, azzaljellemezve, hogy összekapcsoljuk a pPS41 plazmid 0,68 kb nagyságú EcoRI-Hindffl restrikciós fragmensét és a pPS39 plazmid EcoRI-Hindin fragmensét, és a megfelelő szerkezetű plazmidot kinyerjük.
10. A 2. igénypont szerinti eljárás a pLC3 plazmid előállítására, azzaljellemezve, hogy a pLC2 plazmid
1,6 kb nagyságú NcoI-BglII restrikciós fragmensét és a pCZ106 plazmid 8,7 kb nagyságú Ncol-Ncol és 1,6 kb nagyságú NcoI-BamHI restrikciós fragmensét összekapcsoljuk, és a megfelelő szerkezetű plazmidot kinyerjük.
11. Eljárás a Penicillium chrysogenum izopenicillin N szintetáz enzimét meghatározó dezoxi-ribonukieinsav szekvenciát hordozó dezoxi-ribonukleinsav molekula előállítására, azzaljellemezve, hogy a pLC2 plazmidot Ncol és BglH restrikciós enzimekkel emésztjük, és izoláljuk az 1,6 kb nagyságú NcoI-BglII restrikciós fragmenst.
12. A 11. igénypont szerinti eljárás, azzaljellemezve, hogy az amino-terminális végtől a karboxil-terminális végig haladva alábbi aminosav szekvenciát kódoló dezoxi-ribonukleinsav szekvenciát izoláljuk:
MET ALA SER THR PRO LYS ALA ASN VAL PRO LYS ILE ASP VAL SER PRO LEU PHE GLY ASP ASN MET GLU GLU LYS MET LYS VAL ALA ARG ALA ILE ASP ALA ALA SER ARG ASP THR GLY PHE PHE TYR ALA VAL ASN HIS GLY VAL ASP
VAL LYS ARG LEU SER ASN LYS THR ARG GLU PHE HIS PHE SER ILE THR ASP GLU GLU LYS TRP ASP LEU ALA ILE ARG ALA TYR ASN LYS GLU HIS GLN ASP GLN ILE ARG ALA GLY TYR TYR LEU SER ILE PRO GLU LYS LYS ALA VAL GLU SER PHE CYS TYR LEU ASN PRO ASN PHE LYS PRO ASP HIS PRO LEU ILE GLN SER LYS THR PRO THR HIS GLU VAL ASN VAL TRP PRO ASP GLU LYS LYS HIS PRO GLY PHE ARG GLU PHE ALA GLU GLN TYR TYR TRP ASP VAL PHE GLY LEU SER SER ALA LEU LEU ARG GLY TYR ALA LEU ALA LEU GLY LYS GLU GLU ASP PHE PHE SER ARG HIS PHE LYS LYS GLU ASP ALA LEU SER SER VAL VAL LEU ILE ARG TYR PRO TYR LEU ASN PRO ELE PRO PRO ALA ALA ILE LYS THR ALA GLU ASP GLY THR LYS LEU SER PHE GLU TRP HIS GLU ASP VAL SER LEU ILE THR VAL LEU TYR GLN SER ASP VAL ALA ASN LEU GLN VAL GLU MET PRO GLN GLY TYR LEU ASP ILE GLU ALA ASP ASP ASN ALA TYR LEU VAL ASN CYS GLY SER TYR MET ALA HIS ILE THR ASN ASN TYR TYR PRO ALA PRO ILE HIS ARG VAL LYS TRP VAL ASN GLU GLU ARG GLN SER LEU PRO PHE PHE VAL ASN LEU GLY PHE ASN ASP THR VAL GLN PRO TRP ASP PRO SER LYS GLU ASP GLY LYS THR ASP GLN ARG PRO ILE SER TYR GLY ASP TYR LEU GLN ASN GLY LEU VAL SER LEU ELE ASN LYS ASN GLY GLN THR, ahol:
ALA alanin, ARG arginin, ASN aszparagin, ASP aszparaginsav, CYS cisztein, GLN glutamin, GLU glutaminsav, GLY glicin, HIS hisztidin, ILE izoleucin, LEU leucin, LYS lizin, MET metionin, PHE fenilalanin, PRO prolin, SER szerin, THR treonin, TRP triptofán, TYR tirozin és VAL valin.
13. A 11. és 12. igénypont bármelyike szerinti eljárás, azzaljellemezve, hogy olyan dezoxi-ribonukleinsavat izolálunk, mely kódoló száljának szekvenciája az alábbi:
5’-ATG GCT TCC ACC CCC AAG GCC AAT GTC CCC AAG ATC GAC GTG TCG CCC CTG TTC GGC GAC AAT ATG GAG GAG AAG ATG AAG GTT GCC CGC GCG ATT GAC GCT GCC TCG CGC GAC ACC GGC TTC TTC TAC GCG GTC AAC CAC CGT GTG GAT GTG AAG CGA CTC TCG AAC
HU 206519 Β
AAG ACC AGG GAG TTC CAC TTT TCT ATC ACA GAC GAA GAG AAG TGG GAC CTC GCG ATT CGC GCC TAC AAC AAG GAG CAC CAG GAC CAG ATC CGT GCC GGA TAC TAC CTG TCC ATT CCG GAG AAA AAG GCC GTG GAA TCC TTC TGC TAC CTG AAC CCC AAC TTC AAG CCC GAC CAC CCT CTC ATC CAG TCG AAG ACT CCC ACT CAC GAG GTC AAC GTG IGG CCG GAC GAG AAG AAG CAT CCG GGC TTC CGC GAG TTC GCC GAG CAA IAC TAC TGG GAT GTG TTC GGG CTC TCG TCT GCC TTG CTG CGA GGC TAT GCT CTG GCG CTG GGC AAG GAG GAG GAC TTC TTT AGC CGC CAC TTC AAG AAG GAA GAC GCG CTC TCC TCG GTT GTT CTG ATT CGT TAC CCG TAC CTG AAC CCC ATC CCA CCT GCC GCC ATT AAG ACG GCG GAG GAC GGC ACC AAA TTG AGT TTC GAA TGG CAT GAG GAC GTG TCG CTC ATT ACC GTC CTG TAC CAG TCA GAC GTG GCG AAC CTG CAG TGT GAG ATG CCC CAG GGT TAC CTC GAT ATC GAG GCG GAC GAC AAC GCC TAC CTG GTC AAT TGC GGC AGC TAC ATG GCA CAC ATC ACC AAC AAC TAC TAC CCC GCT CCC ATC CAC CGG GTC AAG TGG GTG AAC GAG GAG CGC CAA TCC CTC CCG TTC TTC GTC AAT CTG GGA TTT AAT GAT ACC GTC CAG CCG TGG GAT CCT AGC AAG GAA GAC GGC AAG ACC GAT CAG CGG CCA ATC TCG TAC GGC GAC TAT CTG CAG AAC GGA TTA GTT AGT CTA ATC AAC AAG AAC GGC CAG ACA-3 ahol
A dezoxi-adenil-csoport,
G dezoxi-guanil-csoport,
C dezoxi-citidil-csoport és
T timidilcsoport.
14. Eljárás a Penicillium chrysogenum izopenicillin N szintetáz génjének transzkripciós és transzlációs aktivációs szekvenciáját hordozó dezoxi-ribonukleinsav molekula előállítására, azzaljellemezve, hogy Ncol és BamHI restrikciós enzimekkel emésztjük a pLC2 plazmid dezoxi-ribonukleinsavat, és izoláljuk a 0,83 kb nagyságú NcoI-BamHI restrikciós fragmenst, vagy
BamHI restrikciós endonukleázzal hasítjuk a pPS38 plazmid dezoxi-ribonukleinsavat, és izoláljuk a 0,84 kb nagyságú BamHI restrikciós fragmenst.
15. Eljárás a Penicillium chrysogenum izopenicillin N szintetáz génjének transzkripciós terminációs és mRNS poliadenilációs és szintézis szignáljait hordozó dezoxi-ribonukleinsav molekula előállítására, azzaljellemezve, hogy a pLC2 plazmid dezoxi-ribonukleinsavat BamHI és BgUI restrikciós enzimekkel kezeljük, és izoláljuk a 0,65 kb nagyságú BamHI-Bglü restrikciós fragmenst, vagy EcoRI és HindlII restrikciós enzimmel emésztjük a pPS41 plazmid dezoxi-ribonukleinsavat és a 0,68 kb nagyságú EcoRI-Hindlü restrikciós fragmenst izoláljuk.
16. Eljárás izopenizillin N szintetáz enzim termelésére E. coli, Cephalosporium és Penicillium gazdasejtben, azzaljellemezve, hogy a gazdasejtet pLC3, pLC2, pPS44, pPS42A.2, pPS42B.l, pPS42B.2, pPS45A.l, pPS45A.2, pPS45B.l vagy pPS45B.2 plazmiddal transzformáljuk, a sejteket tenyésztjük, és az enzimet kinyerjük.
17. A 16. igénypont szerinti eljárás, azzaljellemezve, hogy E. coli sejteket pLC3 plazmiddal transzformálunk.
18. A 17. igénypont szerinti eljárás, azzaljellemezve, hogy Penicillium chrysogenum vagy Cephalosporium acremonium sejteket transzformálunk pLC2, pPS44, pPS45A.l, pPS45A.2, pPS45B.l, pPS45B.2, pPS42A.l, pPS42A.2, pPS42B.l vagy pPS42B.2 plazmiddal.
19. Eljárás E. coli, Penicillium chrysogenum vagy Cephalosporium acremonium rekombináns gazdasejt előállítására, azzaljellemezve, hogy E. coli sejteket pPS38, pPS38.A, pPS39, pPS39.1, pPS4, pLC3, pLC2, pPS44, pPS42A.l, pPS42A.2, pPS42B.l, pPS42B.2, pPS45A.l, pPS45A.2, pPS45B.l vagy pPS45B.2 plazmiddal transzformálunk; vagy P. chrysogenum vagy C. acremonium protoplasztokat transzformálunk pLC2, pPS44, pPS45A.l, pPS45A.2, pPS45B.l, pPS45B.2, pPS42A.l, pPS42A.2, pPS42B.l vagy pPS42B.2 plazmiddal.
HU864856A 1985-11-25 1986-11-24 Process for producing recombinant deoxy-ribonucleinic acid expressive vectors for producing penicillium chrysogenum isopenicillin n synthetase and determining deoxy-ribonucleinic acids HU206519B (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US06/801,523 US4892819A (en) 1985-11-25 1985-11-25 Recombinant DNA expression vectors and DNA compounds that encode isopenicillin N synthetase from penicillium chrysogenum

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HUT44801A HUT44801A (en) 1988-04-28
HU206519B true HU206519B (en) 1992-11-30

Family

ID=25181331

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU864856A HU206519B (en) 1985-11-25 1986-11-24 Process for producing recombinant deoxy-ribonucleinic acid expressive vectors for producing penicillium chrysogenum isopenicillin n synthetase and determining deoxy-ribonucleinic acids

Country Status (12)

Country Link
US (1) US4892819A (hu)
EP (1) EP0225128B1 (hu)
JP (1) JPH0773499B2 (hu)
AT (1) ATE87974T1 (hu)
AU (1) AU599343B2 (hu)
CA (1) CA1309675C (hu)
DE (1) DE3688236T2 (hu)
DK (1) DK561886A (hu)
ES (1) ES2054618T3 (hu)
HU (1) HU206519B (hu)
IE (1) IE59776B1 (hu)
IL (1) IL80710A0 (hu)

Families Citing this family (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PT72786B (en) 1980-04-03 1983-01-10 Biogen Nv Process for producing dna sequences recombinant dna molecules and human fibroplast interferon-like polypeptides
DE3683080D1 (de) * 1985-04-22 1992-02-06 Lilly Co Eli Rekombinante dns-expressionsvektoren und dns-verbindungen.
US4892819A (en) * 1985-11-25 1990-01-09 Eli Lilly And Company Recombinant DNA expression vectors and DNA compounds that encode isopenicillin N synthetase from penicillium chrysogenum
US6709859B1 (en) 1986-01-31 2004-03-23 Beecham Group P.L.C. Chromosomal DNA Fragments Encoding Enzymes for Encoding B-Lactam Biosynthesis Enzymes, and Vector and Transformants for Their Expression
GB8607502D0 (en) * 1986-03-26 1986-04-30 Antibioticos Sa Penicillium chrysogenum
EP0233715B1 (en) * 1986-01-31 1994-05-25 BEECHAM GROUP plc Isolation and expression of genes involved in the biosynthesis of beta-lactams
IL85535A (en) * 1987-03-04 1994-02-27 Lilly Co Eli AND Recombinant expression vectors encoding datastoxysplosporin C synthetase and datacetylsephalosporin C synthetase
GB2208077A (en) * 1987-04-24 1989-02-22 Antibioticos Sa Isopenicillin n synthetase gene derived from aspergillus nidulans
AU1975988A (en) * 1987-08-10 1989-02-16 Governers Of The University Of Alberta, The Cloning and nucleotide sequence determination of the isopenicillin n. synthetase gene from streptomyces clauvigerus
US4885252A (en) * 1987-09-08 1989-12-05 Eli Lilly And Company Recombinant DNA expression vectors and DNA compounds that encode isopenicillin N synthetase from aspergillus nidulans
EP0311273A1 (en) * 1987-09-24 1989-04-12 Beecham Group Plc Transformation system for Penicillium
US4950603A (en) * 1987-11-02 1990-08-21 Eli Lilly And Company Recombinant DNA expression vectors and DNA compounds that encode isopenicillin N synthetase from Streptomyces lipmanii
US6258555B1 (en) 1987-12-09 2001-07-10 Beecham Group P.L.C. DNA encoding ACV synthetase
GB8728811D0 (en) * 1987-12-09 1988-01-27 Beecham Group Plc Novel substance
FI104264B (fi) * 1988-08-11 1999-12-15 Dsm Ip Assets Bv Menetelmä sekundääristen metaboliittien tuoton parantamiseksi käyttämällä rykelmöityjä biosynteettisiä geenejä
US5108918A (en) * 1988-08-11 1992-04-28 Gist-Brocades Method for identifying and using biosynthetic genes for enhanced production of secondary metabolites
US5589385A (en) * 1990-07-26 1996-12-31 American Cyanamid Company Cloning of the biosynthetic pathway for chlortetracycline and tetracycline formation and cosmids useful therein
US5997913A (en) * 1990-12-10 1999-12-07 Genencor International, Inc. Method enhancing flavor and aroma in foods by overexpression of β-glucosidase
DK0562003T4 (en) * 1990-12-10 2015-07-13 Danisco Us Inc Improved saccharification of cellulose by cloning and amplification of.-Glucosidase gene from Tricodermareesei
US6495348B1 (en) 1993-10-07 2002-12-17 Regents Of The University Of Minnesota Mitomycin biosynthetic gene cluster
US6524812B1 (en) 1993-10-07 2003-02-25 Regents Of The University Of Minnesota Genes encoding resistance to DNA alkylating agents
EP0783581B1 (en) * 1994-09-28 2006-07-26 Novozymes A/S Process for the production of secondary metabolites
US5981281A (en) * 1996-12-13 1999-11-09 Eli Lilly And Company Method for knockout mutagenesis in Streptococcus pneumoniae
US6284483B1 (en) * 1999-10-06 2001-09-04 Board Of Trustees Operating Michigan State University Modified synthetases to produce penicillins and cephalosporins under the control of bicarbonate
US20030194784A1 (en) * 2001-04-17 2003-10-16 Sherman David H. DNA encoding methymycin and pikromycin
KR20060061295A (ko) * 2003-05-28 2006-06-07 디에스엠 아이피 어셋츠 비.브이. 세펨 화합물

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4178210A (en) * 1977-03-07 1979-12-11 Massachusetts Institute Of Technology Accellular synthesis of cephalosporins
DE2759053A1 (de) * 1977-12-30 1979-07-12 Uhlin Verfahren zum herstellen von genprodukten von plasmid-dns
US4307192A (en) * 1979-05-17 1981-12-22 Massachusetts Institute Of Technology Cell-free synthesis of deacetoxycephalosporin C
US4618578A (en) * 1984-07-17 1986-10-21 Chiron Corporation Expression of glycoprotein D of herpes simplex virus
DE3683080D1 (de) * 1985-04-22 1992-02-06 Lilly Co Eli Rekombinante dns-expressionsvektoren und dns-verbindungen.
US4892819A (en) * 1985-11-25 1990-01-09 Eli Lilly And Company Recombinant DNA expression vectors and DNA compounds that encode isopenicillin N synthetase from penicillium chrysogenum

Also Published As

Publication number Publication date
AU599343B2 (en) 1990-07-19
DK561886A (da) 1987-05-26
JPH0773499B2 (ja) 1995-08-09
ES2054618T3 (es) 1994-08-16
US4892819A (en) 1990-01-09
ATE87974T1 (de) 1993-04-15
IL80710A0 (en) 1987-02-27
EP0225128A1 (en) 1987-06-10
HUT44801A (en) 1988-04-28
IE863085L (en) 1987-05-25
DK561886D0 (da) 1986-11-24
CA1309675C (en) 1992-11-03
EP0225128B1 (en) 1993-04-07
DE3688236T2 (de) 1993-08-12
IE59776B1 (en) 1994-04-06
AU6561986A (en) 1987-05-28
JPS62130691A (ja) 1987-06-12
DE3688236D1 (de) 1993-05-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU206519B (en) Process for producing recombinant deoxy-ribonucleinic acid expressive vectors for producing penicillium chrysogenum isopenicillin n synthetase and determining deoxy-ribonucleinic acids
US5070020A (en) Recombinant dna expression vectors and dna compounds that encode deacetoxycephalosporin c synthetase
KR20010025039A (ko) 세팔로스포린의 개선된 생체내 생산
FI95810C (fi) Eristetty DNA-yhdiste, joka koodaa rekombinantti DNA isopenisilliini N-syntetaasia, sitä sisältävät vektorit ja menetelmä isopenisilliini N-syntetaasiaktiivisuuden tuottamiseksi näiden avulla
US6180361B1 (en) Recombinant DNA expression vectors and DNA compounds that encode deacetoxycephalosporin C synthetase and deacetylcephalosporin C synthetase
EP0377295B1 (en) Recombinant DNA expression vectors and DNA compounds that encode isopenicillin N epimerase (racemase) activity
US4885251A (en) Recombinant DNA expression vectors and DNA compounds which encode isopenicillin N synthetase
US4950603A (en) Recombinant DNA expression vectors and DNA compounds that encode isopenicillin N synthetase from Streptomyces lipmanii
KR0131063B1 (ko) 디-아미노산 옥시다제 생산성 형질 전환체
US4885252A (en) Recombinant DNA expression vectors and DNA compounds that encode isopenicillin N synthetase from aspergillus nidulans
EP0444775A1 (en) Recombinant DNA expression vectors and DNA compounds that encode isopenicillin N epimerase activity
EP0469919A2 (en) A process for the enzymatic preparation of 7-aminocephalosporanic acid
EP0551750B1 (en) Recombinant DNA compounds and expression vectors encoding para-nitrobenzyl esterase activity from bacillus
IL95766A (en) Recombinant DNA expression vectors And DNA compounds. Which encode Aspergillus acyltransferase activity

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees