HU206048B

HU206048B - Process for producing pharmaceutical composition against leukaemia, comprising interleukin-2 as active ingredient

Info

Publication number: HU206048B
Application number: HU906463A
Authority: HU
Inventors: Maud Brandely; Dominique Maraninchi
Original assignee: Roussel Uclaf
Priority date: 1989-10-17
Filing date: 1990-10-16
Publication date: 1992-08-28
Also published as: EP0426521B1; HUT55241A; CA2027725A1; OA09317A; HU906463D0; FR2653020A1; DE69007744D1; EP0426521A1; JPH03193736A; KR910007541A; US5582822A; JP2961189B2; KR0168420B1; FR2653020B1; DE69007744T2; ZA907648B; AU640173B2; ATE103494T1; AU6466790A; DK0426521T3

Description

A találmány tárgya eljárás hatóanyagként humán interleukin 2-t tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására, amelyek akut mieloid leukémia kezelésére alkalmasak.

A limfokinek körébe tartozó, aktivált T limfociták által termelt interleukin 2 (IL₂) immunmodulátor és daganat ellenes hatással rendelkezik [lásd például Fletcher M. és munkatársai Lymphokine Research 6 47-57 (1987) közleményét]. E hatásai lényegében a T limfociták proliferációjának elindítását, továbbá természetes és limfokinnel aktivált ölő sejtek sejt-toxicitásának indukcóját foglalják magukban. Megfigyelték, hogy az IL^-t önmagában nagy dózisban vagy limfokinnel aktivált ölő sejtekkel kombináltan adagolva, egerekben bizonyos, bizonyítottan rák betegségek és humán rákos eredetű áttétek, így például melanoma, veserák, vastagbél rák, továbbá nem-Hodgkin típusú Iimfóma visszafejlődését idézte elő [Rosenberg S. A. és munkatársai N. Engl. J. Med. 316, 889-897 (1987)].

Mind ez ideig nem történt azonban említés az IL₂-vel önmagában vagy adaptációs immunkezeléssel együtt végzett terápia hatásosságáról különféle krónikus vagy akut leukémia, különösen akut mieloid leukémia esetén. A szervezet szabályozó mechanizmusa működésében bekövetkező zavar leukémia sejtek proliferációját eredményező hatásának folyamata igen összetett. Elfogadott nézet szerint ennek befolyásolása szükségessé teszi a differenciálódás különböző tényezőinek együttes alkalmazását, főként az IL₂-nek például interferonnal, tumor nekrózis faktorral vagy más típusú interleukinnel vagy másfajta differenciálódási faktorral történő kombinálását, miként azt például a WO 88/06891 nemzetközi közzétételi számú szabadalmi bejelentés krónikus limfoid leukémia kezelésére ismerteti.

Korábban feltételezték, tnajd igazolták is, hogy akut mieloid leukémiás betegek esetén az IL₂ az éretlen sejtek (blasztok) proliferációját, ín vitro körülmények között, szignifikánsan fokozza [Carron J. A., Cawley J. C. Br. J. Haematol. 71 (1) 169 (1989)].

Meglepő módon úgy találtuk, hogy a fentiekkel ellentétben az IL₂ önmagában is terápiás hatással rendelkezik mieloid leukémiák ellen.

A találmány tárgya eljárás mieloid leukémiák elleni gyógyszerkészítmény előállítására, amely hatóanyagként redukált humán interleukin 2-t tartalmaz, például Taniguchi T. és munkatársai [Natúré 302,305-310 (1983)] vagy a 91530 B számú európai szabadalmi leírás szerint kapott rekombináns humán IL₂-t vagy ezek változatait, amilyeneket például Ju. C. és munkatársai [J. Bioi. Chem. 262, 5723-5731 (1987)] ismertetnek.

A találmány szerinti eljárással előállított gyógyszerkészítmény a leukémiás megbetegedések közül krónikus mieloid vagy limfoid leukémia, akut limfoid leukémia, továbbá nem-limfoblaszt leukémia típusok, így például olyan mieloid leukémiák, amelyekre az éretlen sejtek (blasztok) proliferációja jellemző, kezelésére alkalmazható.

A találmány szerinti eljárással előállított gyógyszerkészítmény közelebbről akut mieloid leukémia - amelyet ismert módon, hisztológiai, citológiai és biológiai vizsgálatokkal diagnosztizálunk - vagy ennek kiújulása/súlyosbodása kezelésére vagy ez utóbbi megelőzésére alkalmazható. A találmány szerinti, IL₂-tartalmú gyógyszerkészítménnyel végzett kezelés hatékonysága mintegy 20% olyan akut mieloid leukémiás betegségeknél. amelyek a szokásos kemoterápiás kezeléssel szemben rezisztensek vagy kemoterápiás kezelés vagy csontvelő átültetés után kiújultak.

A találmány szerinti eljárásban előnyösen humán IL₂-ként tiszta rekombinánst IL₂-t használunk. A találmány szerinti gyógyszerkészítmény hatóanyagként egy a fentiekben ismertetett rekombinánst humán IL₂-t, ennek változatait - amelyeket tiszta formájukban az e területen jártas szakember számára ismert tisztítási módszerekkel kapunk - használunk.

IL₂-ként különösen előnyösen redukált formában lévő nem-glikozilezett rekombináns IL₂-t használunk. Az alkalmazott nem-glikozilezett IL₂ a természetes IL₂133 aminosavának szekvenciájával azonos szekvenciával rendelkezik, adott esetben további N-terminális metionint tartalmaz és az 58-as, 105-ös és 125-ös helyzetben lévő risztéin redukált formában van jelen; továbbá biológiai aktivitása összemérhető az oxidált, azonos szekvenciájú és az 58-105 helyzete között diszulfid-hidat tartalmazó IL₂ biológiai aktivitásával. A redukált rekombináns humán 1L₂ E. coli törzzsel történő előállítását a kísérleti részben ismertetjük. A redukált fonna megjelölést abban az értelemben használjuk, hogy ez esetben az IL₂-ben lévő risztéin egységek szabad szulfhidrilcsoportot tartalmaznak. E csoportok jelenlétét például ditio-dipiridin reagens alkalmazásával spektrofotometriásán mutathatjuk ki. A biológiai hatást IL₂, CTLL-2-függő leukémiás egér sejt-kultúra proliferációjának tetrazólium-sóval végzett kolorimetriás mérésével határozzuk meg Mossmann T. leírása szerint [J. Immunoi. Meth. 65, 55-63 (1983)]. A találmány szerinti rekombináns IL₂ fajlagos aktivitása legalább 0,5xl0⁶ egység BRMP/mg, előnyösen lxlO⁷egység BRMP/mg. Az IL₂ biológiai hatékonyságának egysége az a mennyiség, amely a vizsgálat során a maximális válasz 50%-át váltja ki. Referensként egy a Nemzeti Rák Intézet (National Cancer Institute, NCI) által rendelkezésünkre bocsátott referens humán IL₂mintát [„Biological Response Modifier Program, BRMP. reference agent Humán IL₂ (jurkat)”] használunk.

A találmány szerinti eljárásban az IL₂-t egy injekcióra vonatkoztatva 2-20xl0⁶ egység/M² dózisban adagoljuk.

A találmány szerinti gyógyszerkészítményt például intravénásán lassú bólusban, perfúzióban, muszkulárisan vagy szubkután adagolhatjuk. Előnyösen az adagolást intravénásán, lassú bólusban injekcióként 8xl0⁶ egység/M² IL₂ dózisban végezzük. Különösen előnyösen olyan módon járunk el, hogy az IL₂-t ismételten, legalább naponta kétszer és hetente néhány napon át, legalább három nem egymást követő héten át adagoljuk, a kezelt egyén állapotától függően. A napi dózis 24 órára vonatkoztatva néhány napos ciklusban felnőtt vagy gyermek esetében 2xl0⁶ egy2

HU 206 048 Β ség/M² és 30xl0⁶ egység/M² közötti, előnyösen 20xl0⁶ egység/M². Az IL₂-t tartalmazó találmány szerinti gyógyszerkészítmény, előnyösen liofilizált ampulla 0,1 és 2 mg közötti mennyiségű hatóanyagot tartalmaz, amelyet desztillált vízzel alakíthatunk injekcióvá. Az így kapott oldatot azonnal valamilyen oldattal, például 0,9% nátrium-klorid vagy 5% glü,kóz oldattal lassú bólus injekció előállítására hígítjuk. Lassú bólus adagolási mód alatt rövid ideig, például 15 percen át tartó perfúziót értünk.

A találmány szerinti előnyös kezelési mód szerint úgy járunk el, hogy egy találmány szerinti előnyös, IL₂-ként előnyösen redukált rekombináns IL₂-t tartalmazó készítményt injekcióként 8xl0⁶ egység/M² dózisban 8 óránként (naponta háromszor) vagy 12 óránként (naponta kétszer) öt egymást követő napon át három nem egymást követő héten át tartósan, összességében 360xl0⁶ egység/M² és 36 mg mennyiségben felnőtt esetében, intravénásán lassú bólus adagolással 15 perc alatt adagolunk.

A mellékelt ábrákon a találmány szerinti készítményben alkalmazott rekombináns humán IL₂ egyes fázisai termékeinek jellemzőit mutatjuk be.

la. ábra: az előállítás szerinti 8M guanidin nyers extraktum analitikai RP-HPLC kromatogramját mutatja be;

lb. ábra: az oxidált és redukált IL₂ standard analitikai RP-HPLC kromatogramja;

2. ábra: az előállítás „újraoldási fázisának” analitikai RP-HPLC kromatogramja;

3. ábra: az előállítás „fő frakciójának” RP-HPLC kromatogramja;

4. ábra: az előállítás szerinti „59” frakció analitikai RP-HPLC kromatogramja.

A találmányt az alábbi példákkal világítjuk meg közelebbről, az oltalmi kör korlátozása nélkül.

Redukált rekombináns humán IL₂ (r-hIL₂) előállítása

Transzformált E. coli törzs kultúrák centrifugálásával kapott granulákból állítunk elő IL₂-t. Az E. coli törzs transzformálását ismert módon, a természetes IL₂-t kódoló szekvenciát tartalmazó és az IL₂-t sejten belül felhalmozni képes plazmiddal végezzük, például Sato T. és munkatársai leírása szerint [J. Biochem. 101, 525-534 (1987)]. A 10 1-es fermentorból így kapott sejteket Manton Gaulin homogenizátorban feltárjuk. Az elkülönített és mosott sejttörmelékből kiindulva (90-170 g nedvesen) IL₂-t 2,5 térfogatrész tris— HC120 mmól/l-es pH 8 pufferben, amely 8 mól/1 guanidin-hidrokloridot és 100 mmól/1 ditiotreitolt is tartalmaz, oldjuk. Az oldott IL₂ mennyiségét (1,5-2,5 g) analitikai RP-HPLC kromatográfiás módszerrel 4 VYDAC (0,46x15 cm) oszlopon (300 A, 5 mikron), 2 cm³/min. sebességgel, 0,1% TFA-t tartalmazó acetonitril lineáris gradiensével (30-70% 10 perc alatt), 280 nm vagy 210 nm hullámhosszon végzett spektrofotometriás detektálással, IL₂ standarddal 280 nm-en végzett csúcs alatti terület előzetes kalibrálásával határozzuk meg (la. és lb. ábrák). Ezt követően az IL₂-t ditiotreitol jelenlétében leválasztjuk úgy, hogy a guanidin-hidroklorid koncentrációját 2 mól/l-re csökkentjük. A csapadékot 0,1% TFA-t tartalmazó vizes oldattal addig mossuk, míg a felülúszó pH-ja 5 lesz, majd az IL₂-t 20% acetonitrilt és 0,1% TFA-t tartalmazó vizes oldatban feloldjuk. Az így „újraoldással” kapott oldat, amelynek redukált IL₂ tartalma 85%-nál nagyobb az analitikai RP-HPLC meghatározás szerint (2. ábra), kevesebb mint 0,01xl0⁷ egység/mg redukált IL2/mg biológiai aktivitással rendelkezik és a redukált IL2 egy móljára vonatkoztatva 2,85 szulfhidrilcsoportot (-SH) tartalmaz. A kapott oldat 200 mg IL2-t tartalmazó alikvot részét (ezt analitikai RP-HPLC módszerrel határozzuk meg) felhígítjuk úgy, hogy a 0,1 %-os TFA oldatban az acetonitril koncentrációja 10%-nál kevesebb legyen, majd C4 VYDAC (5,7x30 cm) oszlopon kromatografáljuk. Az IL2-t 100 cm³/min. sebességgel 0,1% TFA-t tartalmazó acetonitril lineáris gradiensével (30-80% 40 perc alatt) eluáljuk. A fő frakciót kb. 60% acetonitril koncentrációnál kapjuk a 280 nm-en végzett RP-HPLC spektrofotometriás meghatározás szerint. E „fő frakciót”, amely a redukált IL2-t tartalmazza azonnal kétszeres térfogatú 5%-os vizes citromsav oldattal hígítjuk. Az oldatot C4 VYDAC (5,7x30 cm) oszlopon 0,5% citromsavat tartalmazó izopropanol lineáris gradiensével (20-70% 40 perc alatt), 50 cm³/min. sebességgel kromatografáljuk. Az elúciót 280 nm-en spektrofotometriásán követve, körülbelül 48% izopropanol koncentrációnál egy kisebb, 59% izopropanol koncentrációnál egy fő csúcsot („48”, illetve „59” frakció) kapunk (3. ábra). Az „59” frakciót összegyűjtjük. E frakció 0 °C-on levegő kizárásával legalább 24 órán át stabil.

E frakcióból az izopropanolt azeotróp desztillálással vákuumban eltávolítjuk és a maradékot analitikai RP-HPLC módszerrel analizáljuk. így egy homogén csúcsot kapunk (4. ábra). Ez a csúcs körülbelül 60% acetonitril koncentrációnál, míg a referens oxidált IL₂körülbelül 57% acetonitril koncentrációnál (lb. ábra) eluálódik. Az „59” jelölésű frakció, amelyben az izopropanol eltávolítása után az IL₂ koncentrációja 1 mg/cm³ értéknél nagyobb és pH-ja 3±0,5, +4 °C hőmérsékleten, levegő kizárásával legalább egy héten át tárolható vagy pedig állás nélkül liofilizálható és gyógyszerkészítménnyé alakítható. A liofilizált „59” jelű frakció biológiai aktivitása CTLL-2 sejtek proliferációjának in vitro mérése alapján l,3+0,5xl0⁷ egység/mg érték, amely a természetes IL₂ aktivitásával összevethető érték. E liofilizált frakció szabad szulfhidrilcsoport tartalma 2,94 -SH csoport egy mólra vonatkoztatva, míg a referens oxidált IL₂ 0,76 -SH csoportot tartalmaz szintén egy mólra vonatkoztatva, ditiopiridinnel végzett kolorimetriás meghatározás szerint.

Egy 101-es fermentor alkalmazásával az „59” jelzésű frakcióban 150 és 300 mg közötti mennyiségű, analitikai RP-HPLC módszerrel titrált és e szerint homogén, 3 -SH csoportot tartalmazó biológiailag aktív redukált r-hIL₂-t kapunk.

HU 206 048 B

1. példa

Perfúziós gyógyszerkészítmény

Intravénásán perfúzióban adagolható gyógyszerkészítményt az alábbi összetételben állítunk elő:

redukált r-hIL₂ 0,5 mg citromsav 5 mg mannit 50 mg steril víz ' 1 ml

5% glükóz 50 ml

2. példa

Akut mieloid leukémia kezelésének klinikai vizsgálata

E vizsgálatot olyan betegeken végeztük, akik a hisztoiógiai diagnózis szerint elsődleges akut mieloid leukémiában szenvednek (a FAB osztályozás szerinti M1-M5 fokozat), és akiknél a megkezdett kemoterápiás kezelést vagy ennek folytatása, vagy autolog csontvelő átültetés (ABMT) követte,

A megelőző diagnózis szerint a kemoterápiás beavatkozás után vagy súlyosbodás következett be vagy rezisztencia volt megfigyelhető, annak alapján, hogy legalább egyhetes, például kéthetes időközökben vett két csontvelő mintában több mint 10% blasztot lehetett kimutatni.

A találmány szerinti gyógyszerkészítmény injekciónként 8xl0⁶ egység/M² dózis bevitelét teszi lehetővé, lévén, hogy egy injekció 0,8 mg/M² IL₂-t tartalmaz Az adagolást az első héten öt egymás utáni napon át

8 óránként, majd a harmadik és ötödik héten ugyanezt a dózist 12 óránként és ugyancsak öt egymást követő napon át intravénásán lassú bólus injekcióban 15 perc alatt végeztük. A kezeléshez az 1. példa szerinti gyógyszerkészítményt alkalmaztuk.

A betegeket az IL₂-vel végzett kezelés előtt és után az alábbiak szerint vizsgáljuk. Csontvelő mintákban meghatározzuk a blasztok számát, továbbá velő prekurzorok differenciálódásának fokozatát. Tizenegy így vizsgák beteg adatait az 1. táblázatban foglaljuk össze.

1. táblázat

Beteg	Kor	Nem	Típus³	Hematológiai állapot	% Csontvelő blasztok IL₂ kezelés után	Válaszreak- ció
D0	D8	D14	D36
1	68	férfi	M5	első súlyosbodás kt^b alatt	30	4	2	0	teljes
2	17	nő	M5	primer rezisztencia	35	83	80	80	elégtelen
3	60	férfi	M5	2. súlyosbodás, rezisztens kt-re	42	24	43	16	elégtelen
4	5	férfi	M5	3. visszaesés ABMT után	81	3	ND	0	teljes
5	56	férfi	M4	1. súlyosbodás kt alatt	13	ND	19	60	elégtelen
6	25	férfi	M2	1. súlyosbodás kt alatt	14	ND	ND	0	elégtelen
7	45	férfi	M4	primer rezisztencia	²⁵	ND	22	83	elégtelen
8	28	férfi	M4	1. visszaesés ABMT után	61	89	57	70	elégtelen
9	53	nő	Ml	1. súlyosbodás, rezisztens kt-re	83	74	93	92	elégtelen
10	59	nő	M4	1. súlyosbodás ABMT után	80	74	89	ND	elégtelen
11	39	férfi	Ml	1. súlyosbodás kt alatt	44	38	64	70	elégtelen

^aFAB osztályozás szerint; ^l,kt: kemoterápia; ^CABMT: autolog csontvelő átültetés

A fenti adatokból kitűnik, hogy két esetben teljes választ kaptunk, ez 20%-nak felel meg. Az elégtelen válaszreakciók közül két betegnél (a 3. és 7. a táblázatban) a velő blasztok százaléka szignifikánsan csökkent, arra utalva, hogy az IL₂ ez esetekben is bizonyos hatékonysággal rendelkezett.

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Eljárás hatóanyagként rekombináns humán interleukin 2-t tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy az ismert módon előállított hatóanyagot a gyógyszerkészítésben szokásos hor4

HU 206 048 Β dozó-, hígító- és kívánt esetben egyéb segédanyagokkal összekeverve mieloid leukémiák elleni, parenterálisan adagolható gyógyszerkészítménnyé alakítjuk.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy hatóanyagként nem-glikozilezett, redukált rekombináns humán interleukin 2-t használunk.