HU205717B

HU205717B - Process for producing pharmaceutical composition against human immunodeficiency, comprising pyridionecarboxylic acid derivative

Info

Publication number: HU205717B
Application number: HU895654A
Authority: HU
Inventors: Genkichi Ohta; Mitsuru Furusawa; Junko Nozaki; Takashi Iino
Original assignee: Daiichi Seiyaku Co
Priority date: 1989-04-28
Filing date: 1989-11-02
Publication date: 1992-06-29
Also published as: NZ231246A; HU895654D0; ES2076190T3; IL92187A; EP0394553A2; AU638421B2; IE69269B1; DK545889A; DK545889D0; AU4434189A; HUT53523A; EP0394553A3; EP0394553B1; CA2002137A1; KR900015733A; IE893528L; DE68923169T2; IL92187A0; DE68923169D1; ATE123945T1

Description

A találmány humán immunelégtelenség vírus elleni készítmények előállítására vonatkozik.

Ismeretes, hogy a humán immunelégtelenség vírus (HIV=human immunodeficiency vírus) okozza a szerzett immunhiány tünetegyüttest, az úgynevezett AIDS-t (AIDS=acquired immunodeficiency syndrome) a vírussal fertőzött embereknél. Az anti-HIV-készítmények kutatására fordított munka máris számos hatásos szer kifejlesztését eredményezte, azonban ezek közül egy sem bizonyult kielégítőnek.

Ugyanis még az azidotimidin (AZT) - amelyről azt mondják, hogy igen hatásos kemoterápiás szer - sem mentes problémáktól; az AZT hosszan tartó alkalmazása a csontvelő működőképességének gátlása következtében mellékhatásokkal jár, ilyen például az anémia, neutropénia, és a ΗΓΥ-ben AZT ellen rezisztencia alakulhat ki [N. Engl. J. Med., 317, 185-191 (1987), N. Engl. J. Med., 317,192-197 (1987)].

Azt találtuk, hogy különböző fluortartalmú piridonkarbonsav-származékok egyrészt meggátolhatják a fertőzött sejtekben a HÍV növekedését, másrészt elősegítik a sejt proliferációját.

Azok a piridon-karbonsav-származékok, amelyek ezt a nem várt hatást mutatják, az (I) általános képlettel jellemezhetők - a képletben

R¹ jelentése 1-4 szénatomos alkilcsoport, ciklopropilcsoport vagy monofluor-ciklopropil-csoport,

R⁷ jelentése piperazinocsoport, N-(l-4 szénatomos alkil)-piperazino-csoport vagy 7-amino-5-azaspiro[2.4]heptán-5-il-csoport,

Q jelentése «Ν- vagy »C(R⁸)-csoport, amelyben R⁸ jelentése hidrogén- vagy klőratom, vagy R⁸ és R¹ együtt -O-CH₂-CH(CH₃)-csoportot képezhet A találmányunk szerint előállított készítményekben alkalmazhatjuk a fenti vegyületek sóit is.

A találmányunk szerinti hatóanyagok körébe tartozó vegyület az ofloxacin, melynek vaccinia és herpes vírusok elleni hatását ismertetik a JP-A-60-202822 számon nyilvánosságra hozott japán szabadalmi bejelentésben.

Ebben a bejelentésben azt közlik, hogy az ofloxacin vírusellenes hatású vaccinia és herpes vírusok ellen, de hatástalan influenza vírus ellen. Á bejelentésből és az annak feltalálói által publikált, a további kutatási eredményeket is ismertető cikkből [Antiviral Research, 8, 103-113, (1987)] megismerhető, hogy az ofloxacin említett vírusok elleni hatása a vírus DNS-topoizomeráz gátlásának következménye, ami a vírusspecifikus DNS és RNS szintézisének gátlásához vezet.

A találmányunk szerint alkalmazott vegyületek vírusellenes hatása azonban nem áll közvetlen kapcsolatban a DNS-topoizomeráz aktivitás gátlásával; ez kiviláglik a szerkezet és a vírusellenes hatás összefüggésére irányuló vizsgálatainkból is, amelyek során például azt találtuk, hogy a nalidixsav, amely erős DNS-topoizomeráz-Π inhibitor, nem mutat anti-HIV hatást.

A fluortartalmú piridon-karbonsavakhoz tartoznak a kinolin- karbonsav-, a naftiridin-karbonsav- és a pirido-benzoxazin-karbonsav-vegyületek. Ezek a vegyületek például az alábbi szabadalmi bejelentésekben, illetve leírásokban szerepelnek: JP- A-53-141286, JP-A58-74667, IP-A-59-67279, IP-A-60-64979, IP-A60-174786, illetve IP-A-60-228479 számon nyilvánosságra hozott japán szabadalmi bejelentések, az 1106762,1-123366 és 1-156316 számú japán szabadalmi bejelentések, az EP-A-0 206 283 számú európai szabadalmi bejelentés, a 4 382 892 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás, az 5 053 407 számú amerikai egyesült államokbeK szabadalmi leírás és a 07/343 567 (1989. 04. 27.) és 07/400 835 (1989. 08. 30.) számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentések. A találmányunk szerinti készítményekben alkalmazott (I) általános képletú vegyületek például az ezekben a leírásokban foglalt, a technika állásához tartozó ismert eljárásokkal állíthatók elő. E vegyületek többségükben antimikrobiális hatással rendelkeznek. Az 1. és 2. igénypontbeE „ismert módon előállított” kifejezés a technika állásából megismerhető eljárásokra vonatkozik.

A fent felsorolt vegyülettípusokon belül ismeretesek kiváló antimikrobiális hatással rendelkező olyan piridon-karbonsav-származékok, amelyek a kinolonvegyületek csoportjába tartoznak [Naika: Internál Medicine, 62 (1), 28-33, (1988), és Farumashia: 25 (5), 434-440, (1989)].

Ismeretes az, hogy a vírusellenes vegyületek egyegy specifikus vírus ellen hatásosak, a vírusellenes hatás a vírus fajtájától függően változik. Ez azt jelenti, hogy nem lehet megjósolni, hogy egy vegyületnek egy specifikus vírussal szembeni hatása hasonlóan fellép-e egy másik vírussal szemben is. Számos szakirodalmi forrásból is jól ismert, hogy egy vírusellenes szer speciális hatása az egyedi vírusspecifitásnak köszönhető [ld. például: Baba és munkatársai: Antimicrob. Agent Chemother., 31, 337-338, (1987); De Clercq és munkatársai: Antiviral Rés., 8,261-271, (1987)].

Az (I) általános képletú vegyületek anti-HIV hatása tehát ezeknek a vegyűleteknek az eddig ismert hatásai alapján meglepő és nem volt előre látható.

A találmány szerinti, humán immunelégtelenség vírus elleni készítményekben alkalmazott fluorozottpiridon-karbonsavaknak 6-fluor-kinolin-3-karbonsav, 6fluor-l,8-nafüridin-3-karbonsav vagy 9-fluor-2,3-dihidro-7-oxo-7H-pirido[l,2,3-de][l,4]benzoxazin-6karbonsav vázuk van; ezek a vegyületek sóik vagy hidrátjaik formájában is alkalmazhatók. Az alábbiakban ezen vegyületekre jellemző példákat sorolunk fel: 7-[7-(S)-7-amino-5-aza-spiro[2.4]heptán-5-il]-8-klór6-fluor-l-[2-(S)-2-fluor-l-(R)-ciklopropil]-4-oxo-l,4dihidro-kinolin-3-karbonsav, 7-[7-(S)-7-amino-5-azaspko[2.4]heptán-5-il]-8-ldór-l-ciklopropil-6-fluor-4oxo-1,4-dihidro-kinolin-3-karbonsav, (-)-(S)-9-fluor2,3-dihidro-3-metil-10-(4-metil-l-piperazinil)-7-oxo7H-pirido[l,2,3-de][l,4]benzoxazin-6-karbonsavhenühidrát (levofloxacin, DR-3355 jelű vegyület).

A találmány eljárásaiban felhasználható, kereskedelemben kapható vegyületek közé tartoznak többek között a kővetkezők: ofloxacin [OFLOX]; (±)-9-fluor-3metil-10-(4-metil-l-piperazinil)-7-oxo-2,3-dihidro7H-pirido[l,2,3-de][l,4]benzoxazin-6-karbonsav] és

HU 205 717 Β ennek 3S formája, norfloxacin [NFLX; l-etil-6-fluor1.4- dihidro-4-oxo-7-(l-piperazinil)-3-kinolin-karbonsav], ciprofloxacin [CPFX; l-ciklopropil-6-fluor-l,4dihidro-4-oxo-7-(l-piperazinil)-3-kinolin-karbonsavhidroklorid-hidrát] és enoxacin [ENX; l-etil-6-fluor1.4- dihidro-4-oxo-7-(l-piperazinil)-l,8-naftiridin-3karbonsav-szeszkvihidrát].

A találmány szerint előállított anti-HIV-készítmények hagyományos módon, szájon keresztül és intravénásán, cseppinfúzióban alkalmazhatók. Orális alkalmazás esetén a készítmény formája tabletta, kapszula, granula, por, szirup és ehhez hasonlók lehetnek. Intravénás cseppinfúzió céljára a készítmény formája olyan oldat lehet, amelyet oldódást elősegítő szerek - savak vagy bázisok - hozzáadásával készítünk. Orális alkalmazás esetén a hatásos mennyiség 2-200 mg/kg/nap, amely napi kettő-négy alkalomra osztható el, azaz felnőtt ember esetén a megfelelő teljes napi dózis körülbelül 100 mg-tól körülbelül 1000 mg-ig terjed, de leginkább 200 mg-tól 600 mg-ig. Intravénás injekció esetén a hatásos mennyiség a napi kétszeri 1-20 mg/kg/injekció, azaz felnőtt embernél a megfelelő injiciálható mennyiség 100 mg-tól 600 mg-ig terjed, amely naponta kétszer adható és például cseppinfúzió esetén az előnyös adagolás 200 mg hatóanyag-tartalmú 40 ml oldat.

A következő példák a találmány megvilágítására szolgálnak.

HIV-gazdasejtekként humán T sejt eredetű T4, antigén pozitív CEM sejteket használtunk, amelyeket a Pasteur Intézet (Franciaország) bocsátott rendelkezésünkre. A sejttenyésztést szén-dioxid-tartalmú atmoszférában, 37 'C-os inkubátorban végeztük a szokásos eljárás szerint [Japán Állami Közegészségügyi Intézet tagjainak szövetsége szerkesztésében: Virus Jikkengaku Soron (Experiments in Virology), 131-151 oldal]. Tenyésztéshez a Gibco-féle RPMI 1640 táptalajt használtuk, amely 10% fetális borjúszérumot (FCS) tartalmazott. A tenyészet-felülúszót (5·10⁶ TCIDjo/ml), amelyet úgy kaptunk, hogy a CEM-sejteket HIV-vel (LAV 1) fertőztük, -70 °C-on tároltuk, s ezt használtuk HIV-forrásként. A TCID50 (50% tissue culture infections dose) rövidítés jelentése a következő: 50%-os szövettenyészet fertőző adag [Hisao Uetake (szerk.): „Virus-gaku (Virology)”, Rikogakusha, Tokio, 472. oldal]. A „MOI” (multiplicity of infection) rövidítés jelentése a következő: a fertőzöttség foka (lásd a fent idézett monográfia 36. oldalán).

l.példa

Anti-HIV-aktivitás

A sejttenyésztéshez szolgáló táptalajt (10 ml) - amelyet műanyag tenyésztőedény (25 cm²) tartalmaz - beoltjuk annyi CEM sejttel, hogy a sejtsűrűség 2,5· 1(P sejt/ml legyen. Három napig tartó inkubálás után a tenyészetet egy 15 ml-es centrifugacsőbe visszük át, amelyet 5 percig 1000 fordulat/perc mellett centrifugálunk a sejtek ülepítése és á táptalaj eltávolítása céljából.

Annyi vírus törzsszuszpenziót adunk a gazdasejtekhez, hogy 0,05 MOI értéket érjünk el, s akeveréket 'C-on tartjuk 90 percig, miközben 30 perces időközönként megkeverjük, hogy a vírus adszorbeálódjék. Annyi táptalajt adunk a HIV-vel fertőzött sejtekhez, hogy a sejtsűrűség 5,0-10⁵ sejt/m legyen. így kapjuk a HIV-vel fertőzött sejtszuszpenziót.

Az alábbiakban felsorolt három alkotórész keverékéből egy 24 üregű műanyag tenyésztőlemez minden üregébe bemérünk 1,0 ml-t, és a vizsgált anyag végső koncentrációját a következőképpen állítjuk be: 10 pg/ml, pg/ml, 2,5 pg/ml és 1 pg/ml. A „bemérés nincs” jelű üregek (0 pg/ml) kontrollként szolgálnak.

HIV-vel fertőzött sejtszuszpenzió 0,5 ml

Táptalaj (RPMI 1640,10% FCS) 0,4 ml

A vizsgálandó anyag fiziológiás ' sóoldattal készített oldata 0,1 ml

Összesen 1,0 ml

A vírusfertőzést követő négy napos inkubáció után a 24 üregű tenyésztőlemez minden üregében a sejteket pipettázással egyenletesen felszuszpendáljuk, és a szuszpenzióból 0,5 ml-es részt különítünk el. Vizsgálati anyagot nem tartalmazó friss táptalajból 2,0 ml-t adunk a sejtszuszpenzió visszamaradt 0,5 ml-es részéhez, majd inkubálás következik. (Ofloxacinnal és DR-3355-tel folyamatos adagolási kísérleteket is végeztünk, amelyek eredményeit az 1-1. és 1-3. táblázat szemlélteti.)

A vírusfertőzés után 7 nappal úgy végezzük a pipettázást, hogy minden üregben egyenletes sejtszuszpenziót kapjunk és a szuszpenzióból 0,5 ml-t veszünk ki.

Folytatjuk az inkubálást, és 10 nappal a vírusfertőzés után ugyanígy egyenletes sejtszuszpenziót készítünk minden üregben, majd mindegyikből kiveszünk 1,5 ml-nyi részt. Ezután az üregbe vizsgálandó anyagot nem tartalmazó (vagy tartalmazó) friss táptalajból 2,0 ml-t teszünk és újból folytatjuk az inkubálást.

A vírusfertőzést követő 15. napon, hasonló módon, pipettázással minden üregben egyenletes szuszpenziót készítünk és a szuszpenzióból 2,0 ml-t veszünk el. A sejtszuszpenzió visszamaradt 0,5 ml-éhez hozzáadunk vizsgálandó anyagot nem tartalmazó (vagy tartalmazó) friss táptalajból 2,0 ml-es adagot és folytatjuk az inkubálást.

A vírusfertőzés utáni 20. és 25. napon ugyanígy végezzük el a táptalajcserét.

A vírusfertőzést követő 4. napon, 7. napon, 10. napon, 20. napon és 30. napon levett sejtszuszpenziókat élő sejt számra vizsgáljuk és megállapítjuk az élő sejt százalékát tripánkékfestéssel. Ugyanekkor meghatározzuk a vírus antigén pozitív sejtek százalékát immunfluoreszcenciával, egészséges HIV-hordozóból izolált anti-HIV-antiszérum használatával.

Az így kapott eredményeket alább, az I-1-1-5. táblázatokban mutatjuk be. Minden megadott számérték a tenyésztőlemez két megfelelő üregének középértéke. Az élősejtszámot megkapjuk, ha az összsejtszámból levonjuk a tripánkékkel festődön élettelen sejtek számát. Az élősejtszám százalékos aránya azt jelenti, hogy az összes sejtből (beleértve az elpusztult sejteket) hány százalékot tesznek ki az élő sejtek. A vírus antigén

HU 205 717 Β pozitív sejtszázalék azt fejezi ki, hogy az összes sejt (az elpusztult sejtekkel együtt) közül a sejtek hány százalékán mutatkozik antigén kifejeződés.

2. példa

Ciíotoxicitás

A műanyag tenyésztőedényben (25 cm²) lévő 10 ml sejttenyésztő táptalajt annyi CEM-sejttel oltjuk be, hogy a sejtsűrűség 2,540⁵ sejt/ml legyen. A beoltott táptalajt 3 napig ínkubáljuk. Ezután a tenyészetet átvisszük egy 15 ml-es műanyag centrifugacsőbe és 1000 fordulat/perc mellett 5 percig centrifugáljuk a táptalaj eltávolítása céljából. A sejtekhez ekkor annyi friss táptalajt adunk, hogy a sejtsűrűség 5,040⁵ sejt/ml értékre álljon be. Az így készített sejtszuszpenziót tartalmazó alábbi keveréket (1,0 ml) 24 tartályos műanyag tenyésztőlemezen ínkubáljuk 4 napig:

Sejtszuszpenziő (5,0· 10⁵ sejt/ml) 0,5 ml

Táptalaj (RPMI1640,10% FCS) 0,4 ml

A vizsgálandó anyag fiziológiás sóoldattal készített oldata 0,1 ml

Összesen 1,0 ml

A sejteket ekkor minden tartályban pipettázással egyenletesen felszuszpendáljuk, és a szuszpenzióból 0,5 ml-t elkülönítünk.

Vizsgálandó anyagot nem tartalmazó tápoldatból friss 2 ml-es adagot adunk a visszamaradt sejtszuszpenziőhoz (0,5 ml) és további 2 napig tartó inkubálás után az azonos módon készített sejtszuszpenziókból 0,5 ml-eket veszünk el.

A fentiek szerint gyűjtött sejtszuszpenziókban meghatározzuk az élősejtszámot és az élő sejtek százalékát tripánkékfestés segítségével.

A vizsgálati eredmények szerint az ofloxacin, ciprofloxacin, enoxacin, norfloxacin, DR-3355 és azidotimidin nem mutat citotoxicitást 10 gg/ml-t meg nem haladó koncentrációknál.

3. példa

Összetételre vonatkozó példa (kapszulák)

Fluortartalmű piridon-karbonsav Kukoricakeményítő Karboxi-metil-celIulőz(CMC)-kalcium Hidroxi-propil-metil-cellulóz Magnézium-sztearát	100,0 mg 23,0 mg 22,5 mg 3,0 mg 1,5 mg 150,0 mg
4. példa Összetételre vonatkozó példa (injekciós oldat)
DR-3355	20 g
nátrium-klorid	6g
injekcióhoz alkalmazható desztillált víz	1000 g-ig

5. példa

7-[7-(S)-7-amino-5-aza-spiro[2.4]heptán-5-il]-8klór-6-fluor-l-[2-(S)-2-fluor-l-(R)-ciklopropil]-4-oxol,4-dihidro-kinolin-3-karbonsav (A jelű vegyület) antiHIV hatása CEM-sejteken

HTV-ként HIV-I-et (LAV 1 törzs) alkalmazunk. A CEM-sejteket megfertőzzük a HIV-l-gyel. A kapott tenyészet felülúszóját (540⁶ TCIEWml) szétosztjuk néhányszor 10 kémcsőbe, -70 C-on tároljuk és minden egyes kísérlet előtt felolvasztjuk a megfelelő mennyiséget. A CEM-sejteket sejttápközegben (RPMI 1640 közeg, amely 10% FCS-t tartalmaz) szuszpendáljuk 2,540⁵ sejt/ml sűrűségben. A szuszpenziót átoltjuk egy 25 cm²-es műanyag tenyésztőüvegbe és 3 napig inkubáljuk. A tenyésztett sejtszuszpenziót centrifugacsőbe visszük át és 5 percig 1000 fordulat/perc sebességgel centrifugálva eltávolítjuk belőle a tápközeget. A fagyasztva tárolt vírusszuszpenziót felolvasztjuk, és a vírus a gazdasejteken (CEM-sejtek) való adszorbeálódásának lehetővé tételére hozzáadjuk a centrifugacsőben levő sejtpellethez, 0,05 MOI értékig. A megfertőzött sejteket 37 °C-on ínkubáljuk 90 percig, a csövet 30 percenként alaposan összerázva. A sejtsűrűséget 5,040⁴ sejt/ml-re állítjuk be, a fent említett sejttápközegnek a vírussal fertőzött sejtekhez adagolásával, és 2 ml-es sejtszuszpenziő adagokat teszünk egy 24 üregű műanyag tenyésztőlemez üregeibe. A sejteket szén-dioxid inkubátorban ínkubáljuk 37 °C-on. A fertőzött sejtek inkubálását folytatva a sejteket az A jelű vegyülettel kezeljük a vírusfertőzést követően 12 napig. A kísérlet során az A jelű vegyület végső koncentrációja 0,5, 0,2, 0,1, 0,05, 0,02, illetve 0,01 gg/ml. A kezeletlen kontrollvizsgálatban fiziológiás konyhasóoldatot alkalmazunk. Mindegyik sejtszuszpenziő 0,3 ml-nyi mennyiségében meghatározzuk az élősejtszámot, az élő sejtek százalékos arányát és a vírus (HTV-1) antigén pozitív sejtek százalékos arányát 4, 8 és 12 nappal a vírusfertőzés után.

Az élősejtszám jelentősen csökken a vírusfertőzést kővető 8. nap után a kontrollcsoportban (az A jelű vegyület hozzáadása nélkül), és az A jelű vegyületet 0,1 gg/ml vagy ennél kisebb koncentrációban tartalmazó csoportokban, míg ha az A jelű vegyületet nem kevesebb, mint 0,2 gg/ml koncentrációban adagoljuk, az élősejtszám jelentősen nő. Ha az A jelű vegyületet 0,5 gg/ml koncentrációban alkalmazzuk, a vírus antigén pozitív sejtek százalékos aránya jelentősen csökken a vírusfertőzést követő 12. napon.

A vizsgálat eredményeit az 1-6. táblázatban szemléltetjük.

ő. példa

7-[7-(S)-7-amino-5-aza-spiro[2.41heptán-5-ilI-8klór-l-ciklopropil-6-fluor-4-oxo-l,4-dihidro-kinolin-3karbonsav (B jelű vegyület) anti-HIV hatása CEM-sejteken

HlV-ként HIV-l-et (LAV 1 törzs) alkalmazunk. A CEM-sejteket megfertőzzük a HIV-l-gyel. A kapott tenyészet felülúszóját (540⁶ TCIDjo/ml) szétosztjuk néhányszor 10 kémcsőbe, -70 °C-on tároljuk és minden egyes kísérlet előtt felolvasztjuk a megfelelő mennyiséget. A CEM-sejteket sejttápközegben (RPMI 1640 közeg, amely 10% FCS-t tartalmaz) szuszpendáljuk 2,540⁵ sejt/ml sűrűségben. A szuszpenziót átoltjuk egy 25 cm²-es műanyag tenyésztőüvegbe és 3 napig inku4

HU 205 717 Β báljuk. A tenyésztett sejtszuszpenziót centrifugacsóbe visszük át és 5 percig 1000 fordulat/perc sebességgel centrifugálva eltávolítjuk belőle a tápközeget. A fagyasztva tárolt vírusszuszpenziót felolvasztjuk, és a vírusnak a gazdasejteken (CEM-sejtek) való adszorbeálődásának lehetővé tételére hozzáadjuk a centrifugacsőben levő sejtpellethez, 0,02 MOI értékig. A megfertőzött sejteket 37 °C-on inkubáljuk 90 percig, a csövet 30 percenként alaposan összerázva. A sejtsűrűséget 5,0·10⁴ sejt/ml-re állítjuk be, a fent említett sejttápközegnek a vírussal fertőzött sejtekhez adagolásával, és 2 ml-es sejtszuszpenzió adagokat teszünk egy 24 üregű műanyag tenyésztőlemez üregeibe. A sejteket szén-dioxid-inkubátorban inkubáljuk 37 °C-on. A fertőzött sejtek inkubálását folytatva a sejteket a B jelű vegyülettel kezeljük a vírusfertőzést követően 12 napig. A kísérlet során a B jelű vegyület végős koncentrációja 5,0, 2,0, 1,0, 0,5, illetve 0,2 pg/ml. A kezeletlen kontrolivizsgálatban fiziológiás konyhasóoldatot alkalmazunk. Mindegyik sejtszuszpenzió 0,3 ml-nyi menynyiségében meghatározzuk az élősejtszámot, az élő sejtek százalékos arányát és a vírus (HIV-1) antigén pozitív sejtek százalékos arányát 4, 8 és 12 nappal a vírusfertőzés után.

Az élősejtszám jelentősen csökken a vírusfertőzést követő 8. nap után a kontrollcsoportban (a B jelű vegyület hozzáadása nélkül), míg ha a B jelű vegyületet nem kevesebb, mint 0,2 pg/ml koncentrációban adagoljuk, az élősejtszám jelentősen nő és a vírus antigén pozitív sejtek százalékos aránya jelentősen csökken a vírusfertőzést követő 12. napon.

A vizsgálat eredményeit az 1-7. táblázatban szemléltetjük.

Mint fent említettük, a találmány szerinti hatóanyagok az 1. példában leírt kísérleti rendszerben az idő előrehaladtával a vírus antigén pozitív sejtek százalékos arányának csökkenését váltották ki, újbóli proliferáció nélkül.

Az azidotimidin gátolta a HÍV növekedését a kísérlet korai szakaszában, de az idő múltával a HÍV újbóli proliferációja lépett fel. Azt mondhatjuk tehát, hogy a találmány értelmében használt vegyületek olyan hatásmechanizmus révén fejtik ki anti-HTV hatásukat, amely az azidotimidin hatásmechanizmusától különbözik és így előnyösen alkalmazhatók anti-HTV-szerekként.

A találmány értelmében használt vegyületek toxicitása alacsony. Példaként említhetjük a következő LDso-értékeket, amelyeket egéren határoztunk meg: ofloxacinnál 5,450 mg/kg (orálisan), ciprofloxacinnál, enoxacinnál és norfloxacinnál nem kevesebb, mint 4 g/kg (orálisan) és DR-3355-nél nem kevesebb, mint 200 mg/kg (intravénásán).

A következő táblázatokban feltüntetett vizsgált anyagok kémiai nevét leírásunk 5-6. oldalán adjuk meg.

A táblázatokban a „4 napos adagolás” azt jelenti, hogy az inkubálást 4 napig a vizsgált anyagot tartalmazó közegben, majd ezután a vizsgált anyagtól mentes, friss közegben végezzük. Első közelítésben tehát azt mondhatjuk, hogy az inkubálást a 4 nap eltelte után a vizsgált anyagot nem tartalmazó friss közegben folytatjuk. Pontosabban meghatározva azonban 4 nap inkubálás után a tápközeg térfogatának négyötöd részét távolítjuk el (azaz a tápközeg egyötöde megmarad) és a friss közeget az eltávolított négyötöd résszel azonos mennyiségben adjuk a megmaradt tápközeghez. Ezért a 4 nap után végrehajtott tápközegcsere után a végső vizsgált anyagkoncentráció egyötöde megmarad a következő tápközegcseréig, amit 10 naponta hajtunk végre.

A „folyamatos adagolás” azt jelenti, hogy az inkubálást állandóan a vizsgált anyagot tartalmazó közegben végezzük, a vizsgálat befejezéséig (30 nap). A vizsgált anyag koncentrációját a táblázatban megadott értéken tartjuk. A tápközeg 10 naponkénti cseréje során az előző tápközeggel azonos koncentrációjú tápközeget alkalmazunk.

1-1. táblázat

	Élősejtszám	Élősejtszázalék	Vírus antigén pozitív
Vizsgált anyag	(•10⁴ sejt/ml)	(%)	sejtszázalék (%)
(OFLOX)	4 7 10 20 30	4 7 10 20 30	4 7 10 20 30
(pg/ml)	nap múlva	nap múlva	nap múlva

napos adagolás

10	260	63	280	310	320	94	73	85	92	95	74	63	40	14	3
5	250	60	170	320	330	93	59	77	86	97	82	50	33	5	4
2,5	260	58	83	300	300	96	67	67	95	97	80	67	49	4	6
1	260	43	13	34	10	96	53	21	87	37	88	80	77	16	UN

Folyamatos adagolás

10	280	55	130	290	390	95	66	87	92	95	78	72	43	9	6
5	340	58	160	300	290	98	64	87	95	94	75	76	40	11	2
2,5	260	59	110	220	360	94	64	81	94	97	83	62	38	17	10
1	300	39	46	15	11	94	55	42	75	33	82	78	85	UN	UN
0	300	46	36	2	0	95	59	45	5	0	78	>90	87	UN	UN

UN: nem határozható meg sok sejttörmelék jelenléte miatt.

HU 205717 Β

1-2. táblázat

Vizsgált anyag	Élősejtszám. (•10⁴ sejt/ml) 4 7 10 20 30	Élősejtszázalék (%) 4 7 10 20 30	Vírus antigén pozitív sejtszázalék (%) 4 7 10 20 30
(pg/ml)	nap múlva	nap múlva	nap múlva

ma 10	180	61	260	310	330	88	74	93	91	94	82	75	26	18	6
1	240	37	19	20	14	92	57	30	78	40	72	65	30	20	UN
IUblO	190	62	240	320	300	89	70	83	92	94	80	50	40	13	4
1	220	53	19	25	14	89	75	27	81	36	88	62	UN	UN	UN
HIclO	200	51	250	340	320	92	67	93	93	95	80	47	9	9	3
1	220	46	28	10	10	87	60	33	55	32	82	70	UN	UN	UN
mdio	190	60	280	290	300	88	67	91	95	94	78	50	25	11	4
1	250	50	24	12	9	91	62	28	60	31	72	70	UN	UN	UN
kontroll 0	270	47	20	7	0	92	55	31	9	0	81	80	UN	UN	UN

IHa: (±)-9-fluor-3-metil-10-(4-etil-l-piperazinil)-7-oxo-2,3-dihidro-7H-pirido[l,2,3-de][l,4]benzoxazin-6-karbonsav IHb: (±)-9-fluor-3-metil-10-(4-n-propil-l-piperazinil)-7-oxo-2,3-dihidro-7H-pirido[l,2,3-de][l,4]benzoxazin-6-karbonsav lUc: (±)-9-fIuor-3-metil-10-(4-n-butil-l-piperazinil)-7-oxo-2,3-dihidro-7H-pirido[l,2,3-de][l,4]benzoxazin-6-karbonsav üld: (±)-9-fluor-3-metil-10-(4-izopropil-l-piperazinil)-7-oxo-2,3-dihidro-7H-pirido[l,2,3-de][l,4]benzoxazin-6-karbonsav UN: nem határozható meg sok sejttönnelék jelenléte miatt.

1-3. táblázat

	Élősejtszám	Élősejtszázalék	Vírus antigén pozitív
Vizsgált anyag	(•10⁴ sejt/ml)	(%)	sejtszázalék (%)
DR-3355	4 7 10 20 30	4 7 10 20 30	4 7 10 20 30
(pg/ml)	nap múlva	nap múlva	nap múlva

napos adagolás

10	170	50	280	230	320	92	68	94	85	92	88	57	31	19	<1
5	190	78	320	190	360	91	76	95	87	92	90	59	33	36	2
2,5	190	76	280	230	130	94	80	92	87	83	88	53	44	30	10
1	220	71	54	3	68	95	70	61	20	98	91	61	56	UN	16

Folyamatos adagolás

10	160	43	220	260	260	91	75	92	87	83	89	55	31	21	4
5	160	51	260	320	210	89·	66	95	89	75	87	53	37	29	4
2,5	210	53	290	390	270	94	68	94	95	88	87	51	25	35	11
1	190	65	110	11	360	94	69	61	50	98	88	52	43	UN	15
0	180	48	27	4	0	92	66	38	4	0	89	75	UN	UN	UN

UN: nem határozható meg sok sejttörmelék jelenléte miatt.

1-4. táblázat

		Élősejtszám			Élősejtszázalék			Vírus antigén pozitív
Vizsgált anyag		(•10⁴ sejt/ml)				(%)				sejtszázalék (%)
NFLX	4	7 10 20	30	4	7	10	20	30	4	7 10 20	30
(pg/ml)		nap múlva			nap múlva			nap múlva
10	180	60 250 3'70	400	92	71	91	97	94	92	63 50 4	<1
5	230	84 86 28	330	94	67	61	81	95	83	65 UN UN	<1
2,5	240	59 40 2	70	94	67	47	33	96	93	55 UN UN	<1
1	230	52 26 0	0	94	59	30	0	0	88	75 UN UN	NT
0	188	52 32 1	0	95	58	43	14	0	87	78 UN UN	NT

NFLX: norfloxacin

UN: nem határozható meg sok sejttörmelék jelenléte miatt NT: vizsgálat nem történt

HU 205 717 Β

1-5. táblázat

Vizsgált anyag	Élősejtszám (•10⁴ sejt/ml) 4 7 10 20 30	Élősejtszázalék (%) 4 7 10 20 30	Vírus antigén pozitív sejtszázalék (%) 4 7 10 20 30
(pg/ml)	nap múlva	nap múlva	nap múlva

CPFX

10	180	65	250	300	330	91	77	92	96	95	88	57	27	10	<1
5	220	76	310	280	320	97	75	92	95	92	92	67	29	4	<1
2,5	200	98	320	220	360	95	77	85	95	97	87	60	31	3	<1
• 1	220	86	52	8	33	84	73	53	53	92	83	62	37	33	NT
ENX 10	140	52	150	178	379	97	61	91	96	94	88	68	30	5	<1
5	210	58	78	11	310	98	60	62	11	98	93	68	UN	UN	<1
2,5	240	67	30	1	2	95	68	35	13	67	90	65	UN	UN	NT
1	220	64	29	7	0	95	66	41	50	0	88	70	UN	UN	NT
0	194	66	32	1	0	93	68	42	17	0	88	73	UN	UN	NT

CPFX: ciprofloxacin-hidroklorid

ENX: enoxacin

UN: nem határozható meg sok sejttörmelék jelenléte miatt

NT: vizsgálat nem történt

1-6. táblázat

A jelű vegyület hatása HIV-l-gyel fertőzött CEM-sejtekre

Vizsgált anyag	Élősejtszám	Élősejtszázalék	Vírus antigén pozitív
(A jelű vegyület)	(•10⁴ sejt/ml)	(%)	sejtszázalék (%)
(pg/ml)	4 8 12	4 8 12	4 8 12
	nap múlva	nap múlva	nap múlva

0,5	34	246	368	93,1	90,9	83,9	74	94	43
0,2	38	215	115	89,4	87,0	40,2	84	70	92
0,1	45	89	28	93,7	75,6	19,5	80	77	100
0,05	34	104	22	91,9	77,3	18,7	82	82	100
0,02	40	66	9	88,9	67,3	9,6	81	78	100
0,01	43	53	5	90,4	59,6	5,7	82	75	100
0	42	44	5	90,2	48,9	6,2	78	87	100

A jelű vegyület: 7-{7-(S)-7-amino-5-aza-spiro[2.4]heptán-5-il}-8-klór-6-fluor-l-[2-(S)-2-fluor-l-(R)ciklopropil]-4-oxo-l,4-dihidro-kinolin-3-karbonsav

1-7. táblázat

B jelű vegyület hatása HIV-l-gyel fertőzött CEM-sejtekre

Vizsgált anyag (B jelű vegyület) (pg/ml)	Élősejtszám (•10⁴ sejt/ml)	Élősejtszázalék	Vírus antigén pozitív sejtszázalék (%) 4 8 12 nap múlva
4 na]	(%) 8 p múlv	12 a
4 8 nap múl	12 va
0	24 .35	11	88,7	46,3	10,3	18	79	82
0,2	27 57	280	94,6	62,4	83,0	25	75	47
0,5	28 59	275	94,9	57,8	83,2	24	85	49
1	26 65	286	94,5	64,0	81,5	18	82	49
2	21 45	225	97,6	61,0	82,3	26	74	55
5	19 29	172	88,1	56,4	84,1	19	79	41

B jelű vegyület: 7-{7-(S)-7-amino-5-aza-spiro[2.4]heptán-5-il}-8-klór-l-ciklopropil-6-fluor-4-oxo1,4-dihidro-kinolin-3-karbonsav

HU 205717 Β

Noha a jelen találmányt részletesen ismertettük, és hivatkoztunk speciális megvalósításaira, azok számára, akik e szakterületen járatosak nyilvánvaló, hogy különböző változtatásokat és módosításokat eszközölhetnek anélkül, hogy a találmány szellemétől és tárgykörétől eltérnének.

Claims

1. Eljárás hatóanyagként egy vagy több (1) általános képletű vegyületet - a képletben R¹ jelentése 1-4 szénatomos alkilcsoport, ciklopropilcsoport vagy monofluor-ciklopropil-csoport,

Q jelentése =N- vagy “C(R⁸)-csoport, amelyben R⁸ jelentése hidrogén- vagy klóratom, vagy R⁸ és R¹ együtt -0-CH₂-CH(CH₃)-csoportot képezhetés/vagy sóit tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy az ismert módon előállított hatóanyagot a gyógyszerészetben szokásos hordozó- és/vagy egyéb segédanyagokkal összekeverve humán immunelégtelenség vírus elleni gyógyászati készítménnyé alakítjuk. (Elsőbbsége: 1989.07.24.)

2. Eljárás hatóanyagként egy vagy több (I) általános képletű vegyületet - a képletben R⁷ jelentése N-(l-4 szénatomos alkil)-piperazino-csoport, 30

Q jelentése -C(R⁸)-csoport, és R⁸ és R¹ együtt -O-CH₂-CH(CH₃)-csoportot képez és/vagy sóit tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy az ismert módon 5 előállított hatóanyagot a gyógyszerészetben szokásos hordozó-és/vagy egyéb segédanyagokkal összekeverve humán immunelégtelenség vírus elleni gyógyászati készítménnyé alakítjuk. (Elsőbbsége: 1989.04.28.)

3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, 10 hogy hatóanyagként 7-{7-(S)-7-amino-5-azaspiro[2.4]heptán-5-il}-8-klór-6-fIuor-l-[2-(S)-2-fluorl-(R)-ciklopropil]-4-oxo-l,4-dihidro-kinolin-3-karbonsavat alkalmazunk. (Elsőbbsége: 1989.07.24.)

4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, 15 hogy hatóanyagként 7-{7-(S)-7-amino-5-azaspiro[2.4]heptán-5-il}-8-klór-l-ciklopropií-6-fIuor-4oxo-1,4-dihidro-kinolin-3-karbonsavat alkalmazunk. (Elsőbbsége: 1989.07.24.)

5. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzaljellemezve, 20 hogy hatóanyagként ofloxacint, ennek 3S formáját, ciprofloxacin-hidrokloridot, enoxacint, norfloxacint, vagy levofloxacint alkalmazunk. (Elsőbbsége: 1989.07.24.)

6. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy hatóanyagként 9-fluor-2,3-dihidro-3-metil-10-[425 (1-4 szénatomos alkil)-l-piperazinil]-7-oxo-7H-pirido[l,2,3-de][l,4]-benzoxazin- 6-karbonsavat vagy sóját vagy hidrátját alkalmazzuk. (Elsőbbsége: 1989.04.28.)