HU205262B

HU205262B - Process for producing new, nonreverting living vaccine and stock against shigella

Info

Publication number: HU205262B
Application number: HU894750A
Authority: HU
Inventors: Bruce Arnold D Stocker
Original assignee: Univ Leland Stanford Junior
Priority date: 1988-03-21
Filing date: 1989-03-02
Publication date: 1992-04-28
Also published as: DE68926431D1; ATE137673T1; AU640344B2; CA1335661C; HU894750D0; FI894446A; HUT53810A; EP0368966A4; EP0368966A1; PT90075B; DE68926431T2; FI100945B; AU3552089A; WO1989009063A1; US5077044A; JPH02503868A; PT90075A; EP0368966B1; FI894446A0

Description

A jelen találmány tárgya eljárás új, nem revertáló Shigella-ellenes élő vakcina és az új Shigella flexueri vakcina törzs előállítására.

Élő, legyengített törzsekkel való vakcinálást kiterjedten és sikeresen használják különböző emberi vírusos megbetegedések, például gyermekbénulás, himlő, kanyaró megelőzésében. Ezzel szemben, élő vakcinákat csak néhány, embereket vagy háziállatokat megbetegítő baktériumokkal szemben használnak: B CG-vakcina tuberkulózis megelőzésére, 19-es törzs szarvasmarha-brucellózis ellen és Steme-féle spóravakcina szarvasmarha-lépfene ellen, és élő vakcina salmonellafertőzés ellen.

Mivel az élő vakcináknak lényegesen'nagyobb a sikervalószínűsége a gazdaszervezet virulens vad törzzsel való inváziója esetén, ezért kívánatos, hogy a korábban előállított vakcinák hátrányaival nem rendelkező új élő vakcinákat állítsunk elő. Mivel a gerincesekben az antigénekre, pontosabban a patogén mikroorganizmus felületi antigénjeire adott immunválasz a vakcinálással biztosított védelem alapmechanizmusa, ezért egy élő vakcinának meg kell tartania a vad típusú törzs antigén komplementjét. Az élő vakcinának avirulensnek, a gazdaszervezetben való szaporodásra alkalmatlannak kell lennie, és semmi valószínűsége nem lehet virulens vad törzzsé való revertálásának.

Egy avirulens élő vakcina szolgálhat olyan antigének expressziőjához és gazdaszervezetként, amelyek a citoplazmában lokalizálódva a plazmába vagy a külső membránra kerülhetnek vagy kiválasztódhatnak, ezzel immunogéneket szolgáltatnak az emlős gazdaszervezet immunválasza számára. Élő vakcinát, pontosabban egy invazív gazdaszervezetet, például Salmonella typhit használva immunogént anyag hordozójaként, igen erős stimulust lehet adni az immunrendszernek, pontosabban a humorális immunrendszernek. Ily módon a legyöngített élő patogének, úgymint baktériumok, gombák, protozoák és vírusok használatának számos előnyét élvezhetjük anélkül, hogy a virulens formára való revertálást figyelembe kellene vennünk.

Sandhu et al., [Infection and Immunity, 73, 527 (1976) leírja Aspergillus fumigatus p-amino-benzoesavas auxotróf mutánsánál a virulencia elvesztését. Morris et al., [Brit. J. Exptl. Path. 57,354 (1976)] leírja a T és B limfociták hiányának hatását Salmonella typhimurium gű/E mutánsával vakcináit egerek védelmére. Lyman et al., [Inf. Imm. 75, 491 (1977)] a 0:9 aro és 0:4,5,12 S. typhimurium his* transzduktáns virulenciáját hasonlítja össze egerekben. Transzlokálódó elemek felhasználását deléciók vagy inverziók előállítására írják le a következő cikkekben: [Kleckner et al., J. Mól. Bioi., 111, 125 (1977); Kleckner et al., ibid, 127, 89; Kleckner et al., Genetics, 90, 427-467 (1978)]. A 4337 314 sorszámú amerikai egyesült államokbeli találmányban Oeschger et al. írják le élő Haemophylus influenzáé vakcinatörzsek előállítását, randommutációk egy törzsben való kombinálásával. Hoiseth és Stocker [J. Bacteriol., 163, 355-361 (1981) írja le a Salmonella typhimurium aroA és serC génjeinek kapcsolatát.

Szóbeli közlés alapján Dr. John Roth, Department of Biology, University of Utah, kifejlesztett két törzsből, amelyekben a Tn 10 transzpozont (tetraciklin rezisztenciát kódol) építették be az aromás bioszintézis-út egy génjébe, így megakadályozva az aromás aminosavak és két baktérium metabolit, p-amino-benzoesav (a fólsav prekurzora) és a dihidroxi-benzoesav (a vasat kelát-komplexbe vivő enterochelin vagy enterobactin vagy enterobactin prekurzora) bioszintézisét. R. J. Yancey, (Infection and Immunity, 24, 174 (1979)] leírja, hogy egy egérvirulens S. typhimurium törzsben létrehozott mutáció, melynek következtében a törzs képtelenné vált az enterochelin szintézisére, jelentősen csökkentette a virulenciát. A metabolit-blokk a korizm-sav és az enterobactin között volt, így a mutáció nem okozott p-amino-benzoesav-igényt.

Számos különböző Shigella-vakcina eltérő mértékig volt sikeres. Majmok és emberek parenterális immunizálása hőinaktivált Shigella-vakcinákkal magas titerű, keringési antitesteket eredményezett. Ezek közül a vakcinák közül egy sem eredményezett védelmet kísérleti fertőzéssel szemben [Formai et al., Shigellosis, In Bacterial vaccines (Ed Germanier, R.) 167-186. old., (1984); Shanghnessy et al., J. Am. Med. Assoc. 132 352-368 (1946)], vagy természetes fertőzéssel szemben [Higgins et al., Am. J. Trop. Med. Hyg., 4, 281288 (1955)]. Hasonlóképpen, élő virulens S. flexnerivel végzett immunizáció nem eredményezett védő immunválaszt rhesus majmokban [Formai et al., Proc. Soc. Exp. Bioi. Med., 25, 347-349 (1967)].

Biztonságos élő orális Shigella-vakcina előállítására három megközelítést alkalmaztak, Fonnál et al., [J. Bacteriol., 90, 63-68 (1965)] izolálták a S, flexneri 2a mutáns törzset, amely ha több dózisban adták, rezisztenciát okozott majmokban. Emberi vizsgálatokban azonban, amikor a vakcinát magas dózisokban adták mellékhatásokat figyeltek meg, például hányást, hasmenést, manifesztálódó vérhast figyeltek meg. Továbbá vad típusú tulajdonságokkal rendelkező revertáns organizmusokat izoláltak széklettenyészetekből [DuPont et al., J. Infect. Dis., 725, 5-11 (1972)]. Hasonlóképpen Istrati et al., [Meítert et al., Arch. Rozum. Path. Exp. Microbíol, 43, 251-278 (1984)] sorozatosan passzáltak virulens S. flexneri 2a-t és így kaptak egy T₃₂ jelű nem invazív mutánst. Ha a vakcinát többszöri, 10'° baktériumot tartalmazó dózisban adták, a jelentések szerint biztonságos volt és védelmet biztosított emberekben.

A második megközelítés szerint Shigella sp. streptomicin-függő mutáns törzset használták orális legyengített vakcinaként [Mel. et al., Bull. WHO, 32, 641-655 (1965); Mel et al., Bull. WHO, 45 457-464 (1971) és Mel et al., Acta Microbiologica Acad. Sci. Hung., 21, 109-114 (1974)]. Jóllehet Mel és munkatársai igazolták (1965, supra), hogy szerotípus specifikus védelmet kaptak (a bakteriális sejtburkolat O-antigén lipopoliszacharidja ellen irányuló immunitáson alapuló), más adatok azt mutatták, hogy a vakcina nem volt képes megelőzni a betegséget [Levine et al., J. Petiatr., 84, 803-806 (1974) és streptomicinfüggetlen revertánso2

HU 205 262 Β kát izoláltak [Levine et al., J, Infect. Dis. 131,704-707 (1975)] ami megállította az ilyen típusú vakcinának a fejlesztését.

Harmadik megközelítésként akár más szervezetből származó DNS beépítésével módosított Shigellában vagy Shigella antigéneket kódoló gének beépítésével módosított más szervezetekből hibrid vakcinákat állítanak elő. Formai et al., [J. Bacteriol., 89, 1374-1382 (1965)] az E. coli K12 kromoszóma egy darabját építették be virulens S. flexneri törzsbe, ezzel egy olyan legyengített mikroorganizmust állítva elő, amely vakcinaként alkalmazva nem nyújtott védelmet. Levine és munkatársai [J. Infect. Dis., 136, 577-582 (1977)] E. coli K12-t módosított oly módon, hogy az 0 (LPS) antigén típusspecifikus és csoportspecifikus faktorait kódoló géneket tartalmazó lókuszt építette be, ez a vakcina nem szolgáltatott védelmet. Az S. flexneri invazív plazmid génjének a fent leírt, módosított E. coli K12-höz adásával olyan vakcinát állítottak elő, amely rhesus majom tesztekben hatásosnak tűnt. [Formai és munkatársai, Infect. Immun., 46, 465-469 (1984)] Lásd még Formai és munkatársai [Infect. Immun., 34, 746-750 (1981)], ahol S. sonnei O-antigén géneket juttattak S. typhi 21a törzsbe.

A találmány célja új, nem revertáló, hatékony Shigella-ellenes élő vakcina előállítása. A találmány értelmében úgy járunk el, hogy élő vakcinákat állítunk elő gazdaszervezet patogén mikroorganizmussal, főleg baktériumokkal szembeni vakcinálására, valamint más patogének, főleg mikroorganizmusok, beleértve a vírusokat, prokariótákat és eukariótákat, immunogénjeinek hordozója céljából. Az élő vakcinákat úgy állítjuk elő, hogy a patogén törzsből auxotróf mutánsokat állítunk elő, amelyben legalább egy, általában kettő vagy több bioszintézis út blokkolva van, így a baktérium mutáns a szaporodáshoz legalább egy, előnyösen kettő vagy több olyan tápanyagot igényel, amelyek általában nem hozzáférhetők a gazdaszervezetben a mikroorganizmus által igényelt mennyiségben.

Az auxotróf mutáció a strukturgénben beálló genetikai változás eredménye, amely változást semmilyen egyszeres lépéssel nem lehet megváltoztatni. Az ilyen genetikai változások közé tartozik a gén egy polinukleotid szegmentjének deléciója, vagy inverzió jön létre közvetlenül a génbe beépített idegen nukleotid szomszédságában. A találmány szempontjából ezeket a változásokat „nem revertáló mutációk”-nak hívjuk. A nem revertáló mutációk általában nem érintik a patogén mikroorganizmus antigénösszetételét és főleg nem változtatják meg felületi antigénjeit, amelyek közül néhány fontos meghatározója a patogenitásnak. A kapott auxotróf mutánsoknál lényegében nulla a reverzió valószínűsége, míg ugyanolyan, vagy lényegileg ugyanolyan immunogén jellemzői vannak mint a virulens törzsnek a hatékony immunválasz létrehozása szempontjából.

Pontosabban, auxotróf mutánsokat állítunk elő, olyan virulens törzs felhasználásával, amely célszerűen a szelekciót lehetővé tevő genetikai bélyeggel rendelkezik, és egy vagy több génben legalább egy nem revertáló mutációt hozunk létre, hogy egy vagy több esszenciális metabolit bioszintézis útjában teljes gátlást hozzunk létre, amely metabolitok a gerincesek szöveteiben általában nem találhatók meg. A mutáns izolálásával és annak ellenőrzésével, hogy képtelen e reverzióra, a virulencia, valamint élő vakcinaként használva az immunizáló képesség ellenőrzésével élő vakcinaként használható törzseket állíthatunk elő.

A találmány tárgya eljárás élő avirulens mikroorganizmusok előállítására, amelyek különösen jól használhatók a megfelelő patogén mikroorganizmusokkal megbetegített gerinces gazdaszervezetek vakcinálására. Az avirulens mikroorganizmusok, főleg a baktériumok szolgálhatnak más patogének antigénjei hordozójaként, így többszörös immunválaszt váltanak ki és két vagy több patogénnel szemben humorális és/vagy sejtes védelmet biztosíthatnak. A mikroorganizmusok auxotrófok, amelyekben legalább egy, általában több olyan bioszintézis útban van nem revertáló, nem leaky blokk, amelyek a vakcináit állatban a mikroorganizmus szaporodásához szükséges mennyiségben nem található tápanyagigényt eredményeznek. A vakcinatörzseket a megfelelő tápanyagokkal kiegészített táptalajon lehet növeszteni, és a gazdaszervezetbe juttatva tovább élnek (amíg a gazdaszervezet eliminálja őket), de nem képesek szaporodni.

A nem revertáló blokkot úgy állítjuk elő, hogy a bioszintézis út egy bizonyos lépésében nélkülözhetetlen enzimet kódoló génbe viszünk be mutációt. Mivel a bioszintézis út terméke nem található meg a vakcinálandó szervezetben, a mikroorganizmus nem lesz képes szaporodni, jóllehet életben marad és megtartja természetes antigén jellemzőit. A mutáció nem revertálódik, mivel a normális genetikai funkció csak egynél több, önmagában is ritka lépésrandom egybeesésével fordul elő.

Deléció esetében a genetikai információ mutációs helyreállítása több, véletlenszerű nukleotid inszerció egybeesését igényli egymás'után, hogy az elveszett genetikai információ helyreálljon. Az inszerció plusz inverzió esetében a génfunkció helyreállításához az inszertált szekvencia pontos kihasításának és a szomszédos invertált szekvencia pontos reinverziójának kellene egybeesni, és a fenti események mindegyikének végtelenül alacsony, kimutathatatlanul kicsi az előfordulása. így mindkét fajta „nem revertáló” auxotróf mutációnak lényegében nulla a prototrófiára való reverzió valószínűsége.

Míg egyetlen nem revertáló blokk magasfokú biztonságot nyújt a virulenciához való reverzió ellen, még mindig maradnak események, amelyek jóllehet valószínűtlenek, mégis véges valószínűséggel fordulnak elő. A reverzió lehetősége megmarad, ha a gazdaszervezetben olyan mikroorganizmusok vannak, amelyek konjugációval képesek a genetikai tulajdonságot az avirulens mikroorganizmusba átvinni. Más változat szerint lehet egy kriptikus alternatív bioszintetitkus út, amely ritak mutációval vagy stressz hatására működőképes lesz. Harmadszor a gazdaszervezetbe jutott táplálék szolgáltathatja a patogén szaporodáshoz és viru3

HU 205 262 Β lenciához szükséges metabolitot. Ennélfogva fontos két külön és egymástól független bioszintézis blokkal rendelkező élő mikroorganizmus vakcinák kifejlesztése, amelyek életképesek és viszonylag hosszú ideig fennmaradnak a gazdaszervezetben, adagolás esetén a gazdaszervezetben erős immunválaszt keltenek és más patogének antigénjeinek hordozójaként műkődnek, az ilyen patogénekkel szemben immunvédelmet szolgáltatva.

Az auxotróf mutációk mellett, amelyek megakadályozzák a vakcináit állatban való szaporodást, kívánatos, hogy az élő vakcinaként használt mikroorganizmus egy vagy több, „genetikai bélyeg”-gel rendelkezzen, és ezzel megkülönböztethető legyen az azonos fajba tartozó más mikroorganizmusoktól, akár vad törzsek, akár más élő vakcinatörzsek. A genetikai bélyeg célszerűen lehet egy tápanyagigény, például hisztidinigény. Az ilyen markerek arra használhatók, hogy megkülönböztessük a vakcinatörzset a vad típusú törzsektől, különösen ha a vakcináit beteg fertőzést kapott, mielőtt a vakcinaimmunitás létrejött.

Miután a baktériumokat úgy manipuláltuk, hogy a populáció néhány tagjába egy vagy több nem revertáló mutációt vittünk be, a mikroorganizmusokat olyan körülmények között tenyésztjük, amelyek lehetővé teszik az auxotróf mutánsok izolálását, akár olyan körülmények között, mikor az ilyen mutánsok a szülő baktériumokkal szemben szelektív előnnyel rendelkeznek, vagy olyan körülmények között, amelyek lehetővé teszik a változatlan baktériumokkal vagy más típusú mutánsokkal szembeni felismerésüket. Az izolált auxotróf mutánsokat klónozzuk és vizsgáljuk virulenciájukat, reverzióra való képtelenségüket, valamint azt, hogy képesek-e megvédeni a gazdaszervezetet a virulens patogén törzstől.

A találmány szerinti eljárás a vakcinák előállítására, valamint a vakcinák maguk számos előnnyel rendelkeznek a korábbi vakcinákkal szemben. Más vakcinákkal ellentétben, jelen találmány megadja a virulencia elvesztésének pontos okát. Más élő vakcinatörzsekkel ellentétben, amelyek a lipopoliszacharid jelleg megváltozása következtében avirulensek, a találmány szerinti vakcináknak lényegében változatlan az O-antigén-karaktere, valamint más felületi antigének is, amelyeknek közük lehet a virulenciához és immunitáshoz, például a fő külső membrán fehérjék. így a találmány szerinti vakcinák stimulálják anti-0 antitestek képződését, melyekről ismert, hogy fontos komponensei a vakcináiással kapható immunitásnak. A találmány szerinti törzsek képesek a gazdaszervezetben való hosszú ideig, általában hetekig tartó fennmaradásra, megnövelve az immunizáló hatás hatékonyságát az immunrendszer folytonos stimulálásával egészen addig, amíg az immunrendszer el nem távolítja az összes mikroorganizmust. A nem revertáló, nem leaky mutációkat tartalmazó mutánsoknak lényegében nulla a virulenciára való reverzió valószínűsége. Annak a ténynek a fényében, hogy az avirulencia a gazdaszövetekből hiányzó megfelelő métából ltoktól függ és nem bármely gazdasejtfunkciőtől, a vizsgált törzsek avirulensek lesznek avirulens gazdaszervezetben is.

A baktériumok közül a jelen találmány szerinti eljárás különösen előnyösen használható Shigella, főleg S.

flexneri és S. sonnei baktériumfajokra.

A vakcinákat számos különböző háziállatnál, valamint az embernél lehet használni. A vakcinával kezelt, vagy ha bakteriális fertőzésekre érzékenynek, akkor kezelhető háziállatok közé tartoznak a baromfík, szarvasmarhák, sertések, lovak, kecskék, juhok, hogy a legfontosabb háziállatokat említsük.

Az élő vakcina előállítása során olyan patogén törzset választunk, mely a készítendő auxotróf mutánsnak a törzs többi tagjától való megkülönböztetése céljából megfelelő genetikai bélyeget tartalmaz. Különböző markereket lehet használni, például antibiotikum, vagy szintetikus antibakteriális szerrel szembeni rezisztencia, aminosavigényt (pl. hisztidin) okozó blokk egy bioszintetikus útban és hasonlók. Amarkerrel szemben kikötés, hogy nem érintheti a mikroorganizmus immunogén jellegét valamint nem interferálhat a mikroorganizmusból élő vakcinát készítő eljárással. A marker megváltoztatja a fenotípust, ezzel lehetővé teszi a kiválasztott mikroorganizmus felismerését.

A kiválasztott mikroorganizmust ezután olyan eljárásnak vetjük alá, amely egy vagy több nem revertáló mutációt eredményez. Mindegyik nem revertáló mutáció több mint öt nukieotidból álló polinukleotidot érint, előnyösen legalább tíz nukleotidot, és legalább egy, előnyösen számos bioszintetikus utat blokkol. A blokkolt bioszintetikus utak nem vehetnek részt a mikroorganizmusok virulenciájában szerepet játszó antigének előállításában, sem a gazdaszervezetek mikroorganizmus-fertőzésre adott immunválaszában. Különböző technikák használhatók deléciós vagy inszerciós inverziók bevitelére a kívánt, „nemleaky”, nem revertáló bioszintetikus blokkot tartalmazó mikroorganizmus előállítására.

A gén választását az irányítja, hogy lehet-e a gént anélkül mutáltatni, hogy lerontanánk a mikroorganizmus életképességét; a gén által expresszált termék esszenciális természete; valamint az, hogy a megcélzott gazdaszervezetben mennyire valószínűtlen a termék előfordulása. A blokkolt génnek olyan enzim termelését kell megakadályoznia, amely a szaporodáshoz szükséges metabolit bioszintetikus útjában szükséges, de az életképességhez nem szükséges. Az érdekes gének közé tartozik például számos arogén, úgymint aroA, aroB, aroD és aroE; pab, amely a p-amino-benzoesav termelésében játszik szerepet; valamint a purgének, amelyek az inozin-monofoszfát adenozin-monofoszfáttá alakításában vesznek részt, ezzel adenin vagy adenin-vegyületigényt okoznak.

Nem revertáló bioszintetikus blokk bejuttatásának egyik módja a transzlokálódó elemek, főleg a transzpozonok használata. A transzpozonok kétszálú DNS-darabok, néhány ezer nukieotidból állnak, általában antibiotikum vagy más antibakteriális szerrel szembeni rezisztenciát kódoló gént tartalmaznak, olyan génekkel együtt, amelyek előidézik a transzpozon egy másolatának a transzpozont hordozó baktérium DNS-ének számos megfelelő helye körül bármelyikbe való beépülé4

HU 205 262 B sét. Ha a transzpozon olyan génbe épül be, amely egy enzimatikusan aktív fehérje aminosavsorrendjét határozza, akkor teljesen megakadályozza, hogy ezt a fehérjét aktív formában bioszintetizálja a sejt. A teljes transzpozon azonban alacsony frekvenciával [például 10‘⁸(baktérium)generáció] kihasad abból a génből, amelybe beépült, ennek következtében a gén visszaáll eredeti állapotába, így ismét enzimatikusan aktív fehérjét határoz meg. A transzpozon pontos kivágása okozza az antibiotikummal vagy más antibakteriális anyaggal szembeni rezisztencia elvesztését, amely a transzpozon rezisztenciagénjének működéséből ered.

A pontos kivágás mellett, a transzpozon által biztosított rezisztencia elvesztése más, jóval gyakoribb folyamatok következtében is fellép, amelyek jóval gyakoribbak, mint a pontos kivágás és nem eredményezik a gén eredeti formájának helyreállítását, ezáltal nem eredményezik az elvesztett génfunkció helyreállítását. Kétféle ilyen esemény eredményezi annak a génnek, amelybe a transzpozon beépült, a nem revertáló funkcióképtelen formájának kialakulását, az egyik esemény egy olyan DNS-szegment deléciója, amely az egész transzpozont vagy annak egy részét tartalmazza, beleértve a rezisztenciagént, valamint az inszerció egyik oldalán túlnyúló DNS-darabot, így belenyúlik, néha teljesen átnyúlik a génen, amelybe a transzpozont beépítették, az inszertálásí hely egyik oldalába; a másik esemény a transzpozon egy részének deléciója, és ezzel egy időben egy olyan DNS-szegment inverziójával, amely az eredeti inszerció helyének egyik oldaláig terjedő genetikai anyagot, azaz az érintett gén-részt, vagy annak egy részét az eredeti inszerció helyének egyik oldaláig tartalmazza. Az érintett gén eredeti állapotba való visszatérése csak úgy játszódhat le, ha precízen kivágjuk a transzpozon megmaradó részét, és ezzel egy időben az invertált DNS-pontosan reinvertálódik, azaz két olyan esemény véletlen egybeesésével amelyek várhatóan nagyon ritkák, detektálhatatlanok.

A fenti két esemény bármelyikének (deléció vagy deléció és inverzió) a következménye egy bioszintetikus enzimet meghatározó génben transzpozon inszerciót tartalmazó baktériumnál az, hogy egy transzpozontartalmú antibiotikum rezisztens törzset, amely enzimhiányt okozó genetikus léziót tartalmaz, amely jóllehet teljes, mégis képes a ritka reverzióra, átalakítunk az előzővel megegyező enzimdefekttel rendelkező antibiotikumérzékeny baktériummá, amelyben hiányzik az érintetlen transzpozon, és többé nem tárgya ritka reverziós eseményeknek. így, ha a transzpozont olyan génbe építjük, amely a baktérium szaporodásához nélkülözhetetlen, de a gerinces gazdaszervezetben nem létező metabolit vagy metabolitok bioszintézisében előforduló enzimet határoz meg, akkor a végeredmény egy olyan baktériumtörzs, amely teljes és nem revertáló, avirulenciát okozó mutációval rendelkezik.

Az auxotróf mutánsok izolálását megkönnyíthetjük penicillin használatával, a nem auxotróf baktériumokat elölve és ezzel megnövelve a táplálkozási mutánsok arányát a populációban. Ha egyszer a kívánt auxotróf mutánst izoláltuk, akkor a mutáns nagy populációját vizsgálhatjuk át, van-e benne a megfelelő metabolit nélkül növekedni képes utód, ezzel tesztelve a mutáció reverziójának valószínűségét, ezt a vizsgálatot sokkal szigorúbban végezzük, ha a populációt először tettük mutagén ágens hatásának vagy olyan anyag hatásának, mely mutációs változások számos fajtáját képes létrehozni, pl. bázisszubsztitúciók, kevert mutációk stb. Továbbá, ha van rekombinációs rendszer, akkor két vagy több pontmutánst lefedő géndarab hiányával rendelkező mutánst arról lehet felismerni, hogy nincsenek vad típusú rekombinánsok, ha a deléciós mutánst a kérdéses pontmutánsokkal keresztezzük. Ily módon biztosak lehetünk abban, hogy a vizsgált auxotróf mutáns majdnem biztosan deléció eredménye, nem pedig pontmutációé.

Egy általános transzdukáló fág, úgymint a Pl fág, képes igen különböző nemzetségekbe tartozó baktériumokhoz adszorbeálódni (ha szükséges, akkor lipopoliszacharid karakterük megfelelő genetikai módosítása után, hogy ennek a fágnak a szükséges abszorpciós képességét biztosítsuk), ezért használható arra, hogy egy nem működő bioszintetikus gént, például transzpozon inszercióval vagy másképpen inaktivált aro-vagy pur gént transzdukáljunk az eredeti sejtből egy másik fajhoz vagy nemzetséghez tartozó patogén baktériumtörzsbe, ahol megvan bizonyos valószínűsége annak, hogy a kromoszómába beépüljön, a homológ vad típusú gént helyettesítse, így auxotróf transzdukánst hozzon létre. Az ilyen helyettesítésnek a gyakoriságát azonban valószínűleg igen lecsökkenti a különböző nemzetségbe tartozó baktérium megfelelő génjének nem teljes bázisszekvencia homológiája. A DNStranszformációt vagy a baktériálís konjugációt hasonlóképpen lehet használni aro, pur vagy más transzpozon inszercióval vagy másképpen inaktivált bioszintetikus gén átvitelére az eredeti törzstől eltérő fajhoz vagy nemzetségbe tartozó baktériumokba, hogy olyan auxotróf baktériumokat kapjunk amelyek avirulensek, mivel a gerinces gazdaszervezetben nem található metabolitra, van szükségük, valamint nem képesek prototróffá revertálni mivel vagy deléciós vagy inszerciós-inverziós mutánsok.

A konjugációt is használhatjuk, konjugációval keresztezve, egy virulens törzset egy avirulens, de a kívánt nem-revertáló mutált génnel rendelkező törzzsel alkalmazva, a mutált gén átvitele a virulens törzsbe rekombinációval történhet meg, a vad gént a mutált génnel helyettesítve. Az auxotróf izolátumokat az előzőkben leírtak szerint szelektálhatjuk.

A transzdukáló fágot a DNS-transzformációt és/vagy a konjugációt úgy is használhatjuk, hogy egymás után két vagy több, függetlenül mutált gént juttatunk be egyetlen gazdaszervezetbe, amelyet vakcinaként kívánunk használni. Két teljesen független mutáció jelenléte, amelyek mindegyike rendkívül alacsony reverziós gyakorisággal rendelkezik, majdnem teljes biztonságot nyújt ama nézve, hogy a vakcinatörzs nem válhat virulenssé. A kísérleti részben egy aroD' mutáció Shigellában való előállítását ismertetjük, Pl transzdukáló taggal.

HU 205 262 Β

A jelen találmány szerint a vakcinákat úgy állítjuk elő, hogy legalább egy génbe nem revertáló mutációt viszünk be, és mindegyik mutáció elegendő számú egymás utáni bázist érint ahhoz, hogy biztosítsa a reverzió lényegében 0 valószínűségét és biztosítsa, hogy egyik mutált gén se legyen képes expresszióra, abban az értelemben, hogy teljesen képtelen egy enzimatikusan aktív fehérje előállítását meghatározni. Emellett mindegyik választott gén legalább egy, előnyösen két olyan bioszintetikus útban játsszon szerepet, amelyek a gazdaszervezetben vagy nagyon ritkán előforduló, vagy abból teljesen hiányzó metabolitokat állítanak elő. Ágén típusának, számának megválasztása eredményezi annak valószínűségét, hogy a vakcina gazdaszervezete közel nulla valószínűséggel szolgáltatja a szaporodáshoz szükséges tápanyagkomponenseket.

A transzdukáció esetében a transzpozon a transzdukált mikroorganizmus szelekciójára alkalmas genetikai bélyeggel rendelkezik. Például, ha a transzpozon biosztatikus vagy biocid anyagokkal, például antibiotikummal szemben biztosít rezisztenciát, akkor a transzdukált mikroorganizmust a bioaktív anyagot tartalmazó táptalajban növesztve a bioaktív anyagot tartalmazó táptalajban a transzdukált mikroorganizmust szelektáljuk, azaz a transzdukáns törzset szelektáljuk. Más technikákat is lehet használni, amint azt az alábbiakban ismertetjük, hogy a transzdukáns törzs azon tagjait szelektáljuk, amelyekben az egész transzpozon vagy annak egy része kihasad és a transzpozon magával viszi annak a génnek egy részét, amelybe beépült, vagy a gén egy részének inverzióját eredményezi.

Auxotróf törzs izolálása céljából, akár transzdukációval, akár mutagenezissel, transzformációval vagy más módszerrel állítjuk elő, szükséges a kezelt virulens törzsre egy olyan szelekciós nyomás alkalmazása, amely megnöveli a kívánt auxotróf törzs arányát a populációban. Az egyik módszer szerint valamilyen gyógyszert, például penicillint használunk, amely csak az osztódó mikroorganizmusra halálos. Olyan táptalajt használva, amely nem tartalmazza a fentiek szerinti mutációval auxotróffá tett törzs által igényelt metabolit termékeket, az auxotróf törzs szaporodását gátoljuk, míg a virulens szülőtörzs szaporodni fog, ezáltal a penicillin elpusztítja. Általában a baktériumoknak legalább 99%-a, de kevesebb mint 100%-a elpusztul, így az eredeti baktérium-mennyiségnek körülbelül 0,01— 1%-át kitevő túlélők nagymértékben megnövekedett koncentrációban tartalmazzák az auxotróf törzset. A túlélő baktériumokat azután az auxotróf törzs szaporodását is lehetővé tevő kiegészített táptalajon szaporítjuk, és a penicillines szelekciós eljárást addig ismételjük, amíg az auxotrófot egyetlen telepből lehet izolálni, és megállapíthatjuk virulens szülőtörzs teljes hiányát.

A kapott auxotróf törzs a kívánt ímmunögén itással rendelkező avirulens élő vakcina lesz, ha a deléció nem érinti a gazdaszervezet természetes immunválaszát beindító antigének termelését. Ugyanakkor a deléció egy avirulens élő vakcinát eredményez, amely nem képes a gazdaszervezetben növekedni és képtelen virulens törzzsé revertálni.

Egy Shigella-indukált bacilusos dizentériatámadás védelmet nyújt egy későbbi támadás ellen, ha azt ugyanaz a Shigella faj okozza, de nem biztos, hogy védelmet nyújt egy más fajhoz tartozó Shigella-megbetegedéssel szemben. A Shigella flexnerire használt módszerek alkalmazhatók más fontos fajokra is, például a Shigella dysenteriae 1-es típusra, amely a legsúlyosabb megbetegedéseket okozza és a világ számos részén a halálozás egyik fő okozója, valamint a Shigella sonneire, ami a fejlett országokban a leggyakoribb betegségokozó, a betegség viszonylag enyhe, de nagyon kellemetlen.

Egy Shigella csoportba tartozó élő vakcinatörzset például Shigella flexneriből állítottak elő. A Shigella flexneri törzseket 0 antigén struktúrájuk alapján soroljuk szerotípusokba. A baktérium felülete, lipopoliszacharidja (amelyeknek szerkezete határozza meg, az 0 antigén csoport), poliszacharid láncának ismétlődő oligoszacharid egysége egy alapvető négycukros egység, ami az összes szerotípusban azonos (kivéve a 6-os szerotípust). Az Y típusban az alapegységhez semmi nem kapcsolódik, de a többi szerotípus mindegyikében egy vagy két egység glükóz vagy acetilcsoport kapcsolódik a szerotípustól függő pontokon. Az alapegységnek ezeket a módosításait profágok határozzák meg (latens baktériumvírusok), amelyeket az Y típustól eltérő típusú törzsek hordoznak. Egy Y típusú törzset bármely más típusúvá át lehet alakítani, beleértve az la, lb, 2a, 2b, 3a, 3b, 4a, 4b és 5 típusokat, ha a megfelelő bakteriofágokkal lizogénné tesszük őket.

Shigella flexneri élő vakcinák jugoszláv katonáknak való adagolásáról azt közölték, hogy csökkenti a vakcinatörzzsel azonos szerotípusú törzsek által okozott vérhas előfordulását, de nem csökkenti a más szerotípusú törzsek által okozott megbetegedés előfordulását (azaz a védelem típusspecifikusnak tűnt). A jelen élő SFL 114 vakcinatörzset egy Y típusú szülőtörzsből állítottuk elő, ennélfogva szükség esetén la, lb, 2a, 2b, 3a, 3b, 4a, 4b, 5 vagy más szerotípussá lehet alakítani, megfelelő fággal végzett lizogenizációval.

Majdnem az összes új Shigella-izolátum számos antibiotikumra rezísztens volt, és a legtöbb törzs, melyet a jelen találmány szerinti vakcinatörzzsé való módosítás szempontjából teszteltünk, nem nőtt, vagy csak nagyon lassan nőtt egyszerű, kémiailag meghatározott táptalajon, azaz kémiailag meghatározott összetételű táptalajon. Egy élő vakcinatörzsnek azonban előnyösen az összes szintetikus antibakteriális szerre és antibiotikumra, amelyek az antibiotikum korszak előtt izolált Shigella-törzsekkel szemben aktívak voltak, érzékenynek kell lennie. Továbbá a táplálkozási jellemzők egyszerű meghatározása céljából az auxotróf törzsek előállításához kiindulásként használt törzsnek egyszerű tápigénnyel kell rendelkeznie.

Egy élő vakcinaként való használatra kiszemelt Shigella sp. törzsnek képesnek kell lennie a humán sejtek megtámadására, mivel a non invazív törzsekről kiderült, hogy jóllehet avirulensek, nem hatásosak élő vakcinaként. A törzs invazív tulajdonsága attól függ, tartalmaz-e „inváztós” plazmidot, ami Shigella flexneriben

HU 205 262 Β körülbelül 140 Md méretű. Ennek a plazmidnak a jelenlétét úgy lehet meghatározni, hogy a baktériumok képesek-e a festéket megkötni, ha megfelelő, kongóvöröset tartalmazó táptalajon növesztjük őket (kongóvörös pozitív), valamint a megfelelő méretű DNS-csíkot eerdményezó plazmid jelenlétéből.

Egy élő vakcinaként való használatra kijelölt Shigella sp. törzsnek amellett, hogy képesnek kell lennie humán sejtekbe való behatolásra, ott nem szabad képesnek lennie a szaporodásra, vagy csak néhány generációnyi szaporodásra szabad képesnek lennie, mivel a korlátozatlan szaporodás betegséget eredményez. Az emberben vagy majomban vérhas előidézésére alkalmas törzsek szaru- és kötőhártya-gyulladást okoznak, ha tengerimalacok kötőhártyájára csöppentjük (pozitív Sereny-tesztnek nevezett reakció). Az élő vakcifiaként használt törzs tehát kongóvörös pozitív és Sereny-negatív.

A jelen találmány szerinti Shigella flexneri élő vakcinatörzseket a következőképpen állítjuk elő. Egy komplett lehetőleg irreverzíbilis blokkot állítunk elő egy olyan bioszintetikus útban, amely olyan metabolithoz vezet, amelyre a baktériumnak a szaporodásához van szüksége, de nem található (vagy nem található megfelelő koncentrációban) a gazdaszövetekben. Egy ilyen blokkot számos különböző módszerrel lehet előállítani, beleértve a spontán vagy mutagén indukálta mutagenezist; vagy egy előzetesen jellemzett nem revertáló mutáció genetikai transzferrel való bejuttatásával egy rokon szervezetből, számos módszer bármelyikével, vagy egy klónozott bioszintézis gén in vitro manipulálásával, majd ezt követően ennek Shigella sp. törzs kromoszómájába való bejuttatásával. Egy blokkot kényelmesen úgy állíthatunk elő, hogy transzpozont építünk egy olyan génbe, amelynek a működése létfontosságú a kérdéses bioszintetikus út működtetéséhez. A transzpozon egy szelektálható tulajdonságot, például antibiotikum-rezisztenciát kódol. Egy megfelelő génbe épített alkalmas transzpozont tartalmazó Shigella-törzset úgy kaphatunk, hogy a törzset transzpozon mutagenezisnek vetjük alá, egy transzpozon által meghatározott markere, úgymint antibiotikum-rezisztenciára vagy hasonlóra szelektálva. A kapott baktériumokat átvizsgáljuk, hogy a szóban forgó bioszintetikus út egyik génjébe beépített transzpozonnal előállított auxotrófokat kimutassuk. Még kényelmesebb módszer szerint a Shigella sp. vad típusú bioszintézis génjét azonos, vagy rokon fajból származó más törzs megfelelő génjével helyettesítjük, transzdukcióval vagy valamely más génátviteli módszerrel, mikor is a megfelelő gént más transzpozon inszercióval inaktiváltuk. A transzpozon által meghatározott rezisztencia jellemzővel rendelkező sejteket szelektáljuk.

Egy megfelelő transzpozon meghatározta auxotróf karakterű Shigella-törzs, ha Sereny-negatív és kongóvörös pozitív, akkor avirulens és emberben hatásos élő vakcina. Egy ilyen törzs azonban legalábbis elméletben elvesztheti új auxotróf jellegét és a beépült transzpozon nagyon ritka „tiszta kihasításával” visszanyerheti virulenciáját. Ezt a lehetőséget eliminálhatjuk, ha olyan mutánst izolálunk, amely elvesztette a transzpozoneredetű rezisztenciáját egy második, transzpozon által generált deléciós-inverziós vagy deléciós mutációval, amely a transzpozonon túl is terjed. A szekunder mutánsokat, amelyekben a teljes kódoló régió vagy egy lényeges része kiesett, azonosítani lehet az antibiotikum-érzékeny mutánsok között azon az alapon, hogy nem képesek a vad típusú gén megfelelő DNS-szekvenciáját tartalmazó próbával hibridizálni. Szekunder mutánsokat a kódoló régióban lévő inverzióval is azonosítani lehet megfelelő próbával, bár kevésbé egyszerűen.

Egy transzpozon-inaktivált aroD gént tartalmazó Shigella flexneri törzset, amelyben a mutáció aromás metabolitok, például p-amino-benzoesav iránti igényt okoz, általában a következőképpen állítunk elő. A Shigella flexneri aromásfüggő származékát transzdukációval állítjuk elő, tetraciklin-rezisztenciára szelektálva. A használt G2272 transzdukáló lizátum Pl fág Cm C-ts, amit az NK 5131 törzs lizogén származékának hőindukciójával állítunk elő. A törzs az E. coli K12 tetraciklin rezisztens származéka, ami aromásfüggő, mivel a TnlO transzpozon beépült az aroD génbe.

A transzdukció eredményezte tetraciklin-rezisztens kiónokat aromásfüggőnek találtuk. Az egyik ilyen kiónt, amelyet kongóvörös pozitívnak találtunk SFL114 jelzéssel láttuk el. Az SFL114 törzs megtartotta sima jellegét, amit anti-Y monoklonális antitestekkel végzett agglutinációval mutattunk ki, tartalmazza a 140Md méretű plazmidot és körülbelül a szülőtörzzsel, az Y234-79 azonos hatékonysággal hatol be HeLa és Hep-2 sejtek tenyészetébe. Az SFL114 klón azonban nem okozott a vizsgált 11 tengerimalac egyikében sem kötőhártya-gyulladást, ami azt mutatja, hogy ez a törzs avirulens.

Az SFL114 törzs abban a formában, amelyben izoláltuk', elméletileg képes aromásfüggetlenné revertálni, azaz virulenssé a transzpozon „tiszta kihasadása” következtében, habár az ilyen reverzió kimutatására irányuló erőfeszítések eddig sikertelenek voltak. Ennélfogva az SFL114-ből egy sorozat tetraciklinérzékeny mutánst izoláltunk, amelyek a transzpozon belsejéből legalább a tetraciklin-rezisztencia génen keresztül, és néhány mutáns esetében annak a génnek a DNS-éig is, amelybe a TnlO transzpozont beépítettük (ebben az esetben aroD) terjedő transzpozongenerált deléciós vagy deléciós-inverziós mutáció következtében jöttek létre. Ezeket a tetraciklinérzékeny mutánsokat végigvizsgáltuk, hogy képesek-e azt a DNS-próbát megkötni, amely az E.coli aroD⁺ gén kódoló régióját tartalmazza a 75 N-terminális bázispár kivételével. Ez a szűrés azt mutatta, hogy néhány izolátum nem volt képes megkötni a próbát, olyan deléciót mutatva ezzel, amely az egész aroD génre, vagy annak majdnem teljes kódoló részére kiterjed. Ennélfogva ezek a kiónok teljesen képtelenek aro⁺-ra revertálni. Egy ilyen törzs ugyanolyan hatásos élő vakcina, mint a kiindulási SFL114 törzs, de a reverzió szempontjából teljesen biztonságos. Ezeknek a törzseknek az előállítását részletesen leírjuk a kísérleti részben.

HU 205 262 Β

Hogy az avirulens gazdaszervezettől eltérő faj antigénjeinek prezentációját is megvalósítsuk, egy vagy több, a kívánt antigének) szintéziséhez szükséges enzimeket kódoló géneket expressziós kazetta formájában bejuttatjuk a gazdaszervezetbe. Expressziós kazetta alatt a kívánt struktúrgéneket értjük a határoló transzkripciós és transzlációs iniciációs és terminációs régiókkal együtt, a struktúrgének az említett régiók szabályozása alatt állnak, megfelelően a struktúrgénhez képest 5’ és 3’ irányban elhelyezve. Ahol baktérium vagy bakteriofág struktúrgének szerepelnek, ott a természetes vagy vad típusú szabályozó régiók általában, de nem mindig elegendőek. Az eukariótákból származó struktúrgének esetében (beleértve a vírusokat is), és néhány esetben prokariótáknál is, a struktúrgéneket a gazdabaktérium által felismert szabályozó szakaszokhoz kapcsoljuk.

Az expressziós kazetta lehet egy konstrukció, lehet vagy részét képezheti egy természetben előforduló plazmidnak, mint például a Shigella sonnei LPS O-specifikus részének előállításához szükséges enzimeket kódoló plazmid. Ha az expressziós kazetta egy konstrukció, akkor az episzomális fennmaradás érdekében egy replikáciős rendszerhez kapcsolhatjuk, vagy bejuttathatjuk a baktériumba rekombinációs és integrációs körülmények között. A konstrukciót általában egy markerhez kapcsoljuk, például antibiotikum-rezisztenciát, vagy auxotróf gazda komplementációját biztosító struktúrgénhez és szabályozó régiókhoz, így hát az expressziós vektor általában egy replikáciős rendszert (pl. plazmid vagy vírus eredetű), egy vagy több markért és az érdekes struktúrgén expressziós kazettáját tartalmazza.

Az érdeklődésre számot tartó struktúrgének különböző forrásokból származhatnak, úgymint baktériumokból, vírusokból, gombákból, protozoákból, metazoa parazitákból vagy hasonlókból. A struktúrgének kódolhatnak burokfehérjéket, kapszidfehérjéket, felületi fehérjéket, toxinokat, úgymint exotoxínokat vagy endotoxinokat, illetve az érdekes gének a gazdabaktérium poliszacharid vagy oligoszacharid antigének szintéziséhez, vagy egy szacharidtartalmú antigén (például LPS) módosításához szükséges fehérjéket, enzimeket kódolnak, vagy egy polipeptid antigén, úgymint a Bacillus anthracis kapszuláris antigénje szintézisét kódolják. Ezeket a géneket szokványos módokon izolálhatjuk, próbákat használva, ha az aminosav- vagy nukleinsav-szekvenciának legalább egy részlete ismert, Westem-blotot használva az expresszió detektálására, Íambda gtlll-et használva fuzionált fehérjék expreszszálására próbák előállítása céljából, az antigén azonosításával, a transzkonjugáns baktériumtelepeket antitesttel reagáltatva és a komplexképződést detektálva például agglutinációval stb.

Az érdekes specifikus gének közé tartoznak az enterotoxigén E. colt vagy Vibrio cholerae törzsek hőérzékeny és hőstabil enterotoxinjait kódolók, HBsAg, felületi burok vagy kapszid fehérjéi a T cruzinak, B. pertussisnak, Streptococcusoknak, pl. S. pneumoniae, Haemophilusnak, pl. Haemophilus ínfluenzea, Neisse8 riáknak, pl. N. meningitis, Pseudomonasoknak, pl. P. aeruginosa, Pasteurellának, Yersiniának, Rickettsiának, adenovírusnak, astrovírusnak, arenavírusnak, koronavírusnak, herpeszvírusnak, myxovírusnak, paramyxovírusnak, papovavírusnak, parvovírusnak, pikomavírusnak, poxvírusnak, reovírusnak, retrovírusnak, rhabdovírusnak, rotavírusnak, togavírusnak stb. vagy a poliszacharid antigének szintéziséhez szükséges enzimeket kódoló gének, például a Meningococcus kapszuláris poliszacharidja, vagy a baktérium gazdatörzs poliszacharid antigénjének módosításához szükséges enzimeket kódoló gének. A konstrukciót vagy vektort bármely egyszerű módon bejuttathatjuk a gazdatörzsbe, például konjugációval, F⁺ vagy Hfr-törzzsel, transzformációval, pl. Ca' ionokkal kicsapott DNS, transzfekcióval, transzdukcióval stb. A módosított gazdaszervezeteket szelektív táptalajon szelektálhatjuk a marker fenotípusát használva.

A tárgyalt vakcinákat gerincesek széles körében használhatjuk. A tárgyalt vakcinák főleg emlősöknél használhatók, úgymint embernél és háziállatoknál. A háziállatok közé tartoznak a szarvasmarha, birka, sertés, ló, kecske, háziszárnyas rágcsálók vagy más fogságban tartható állatok, vagy egy házi gerincest érintő betegséget hordozó állatok.

A vakcina alkalmazásának módja széleskörűen változhat, bármely az élő vakcinák adagolására ismert módszer alkalmazható. Ezek közé tartozik a szájon át történő alkalmazása, szilárd, fiziológiásán elfogadható hordozón, vagy fiziológiásán elfogadható diszperzióban, parenterálisan, injekcióval és hasonlók. A vakcina dózisa (a baktériumok száma, az adagolások száma) függ az adagolás módjától, valamint függ a megvédendő fajtól.

Az élő vakcinák formulálása széleskörűen változhat, célszerűen a formulálás megnövekedett immunválaszt biztosít. Az élő vakcinát kockacukron vagy kenyérkockán adjuk pufferolt sóoldatban, fiziológiásán elfogadható olajhordozóban vagy hasonlóképpen.

A találmány szerinti eljárást a továbbiakban - a találmány oltalmi körének szűkítése nélkül - példákkal szemléltetjük,

A'kündulásl törzs jellemzése

Az Y 234-79 (Shigella flexneri Y típus) törzs, mely Bruce Stocker vagy dr. Al Lindberg professzoroktól, Stanford Univ., korlátozás nélkül beszerezhető, jól nő egyszerű, csak nikotinsavval kiegészített, kémiailag meghatározott táptalajon, és az összes vizsgált antibiotikumra, szintetikus antibakteriális szerre érzékeny, beleértve az ampicillint, cefalothint, tetraciklint, doxiciklint, gentamicint, trimetoprimet, nalidixinsavat, kloramfenikolt és szulfadiazint. Ez az SFL1 törzs tartalmazza a Shigellának a behatolóképességhez szükséges 140 Md méretű plazmidját. A plazmid jelenléte a várt méretű plazmid DNS jelenlétével, azzal a képességével, hogy képes megfelelő táptalajon kongóvörös festéket megkötni, valamint azzal, hogy képes tenyészetben növő humán sejtekbe behatolni. A törzs emellett még Sereny-pozitív. Azaz kötőhártya-gyulladást okozott tengerimalac szemébe csöppentve. Az összes említett

HU 205 262 Β tulajdonság azt mutatja, hogy képes emberben dizentériát okozni’.

Donor törzs

Az Nk5131 törzs az E. coli K12-nek egy aromásfüggő TnlO inszerciós mutánsa, Dr. Nancy Klecknertől származik (Department of Biology, Harvard University). A TnlO transzpozon által inaktivált gént aroDnek azonosították, az NK5131 törzs tápigény fenotípusa alapján (aromásfüggő, de nő aromás vegyületek helyett sikiminsavval kiegészített kémiailag meghatározott táptalajon), ismert aroB, aroD és aroE mutánsokkal végzett transzdukciós keresztezések alapján (ez az a három mutánscsoport, amely a leírt tápigény fenotípust eredményezi), valamint a pps génnel végzett kotranszdukciós kísérletek alapján. A mutáns alléi jelzése aroD25::TnlO.

Transzdukáló lizátum

Hogy az aroD25:;TnlQ gén transzdukálására képes fágtörzset kapjunk, a Pl Cm C-ts fággal kezelt NK5131 törzset 25 pg/ml kloramfenikollal kiegészített véres-agaron inkubáljuk 30 °C-on, ezzel az erre a fágra lizogén baktériumokat izolálunk, amelyeknek a genomjába beépült a kloramfenikol-rezisztencia transzpozon. A kapott kloramfenikol-rezisztens növekedést táplevesbe oltjuk és körülbelül 18 órán át 30 °C-on inkubáljuk. Az éjszakán át növesztett tenyészetből 10 ml-t 20 ml L táptalajba teszünk. Az elegyet három órán át 30 °C-on rázatjuk, ezalatt további 10 ml L táptalajt adunk hozzá. A tenyészetet 42 °C-os vízfürdőben rázatjuk a litikus ciklus beindítására. Ez a fág, a C-ts mutációja miatt nem képes profágként fennmaradni 37 °C feletti hőmérsékleten. 90 perc elteltével a tenyészetet 37 °C-on, rázatás nélkül inkubáljuk 90 percig, majd lecentrifugáljuk: a pasztőrözéssel és kloroform hozzáadásával sterilezett felülűszó a G2227 fág lizátuma. Ez a lizátum Shigella sp 16 indikátor törzsön 2x10⁹ tarfoltképző egység/ml titerrel rendelkezik.

Tetraciklin rezisztens transzduktánsok izolálása Y

234-79 törzsből

Hogy a Shigella flexnert Y 234-79 törzsből aroD25:TnlO transzduktánsokat nyerjünk, egy SFL113 jelű rokon sejtet használunk recipiensként, amelyet dr. Alf Lindberg bocsátott rendelkezésünkre, és általa bizonyított, hogy a törzs kongóvörös pozitív és Serenypozitív. 25 pg/ml tetraciklinnel, 1-1 μg/ml nikotinsavval és 2,3-dihidroxi-benzoesavval kiegészített Oxoid véres-agar lemezeket inokulálunk, az SFL113 törzs éjszakán át növesztett folyadéktenyészetével leöntve. A fölösleges táptalajt lepipettázzuk, és az agarfelszín megszáradása után a G2272 lizátumból 0,01 ml térfogatú, tízszeresre, százszorosra hígított, vagy hígítatlan cseppeket teszünk az agarfelületre, mindegyik hígításból négy cseppet mind a nyolc lemezre. Háromnapos, 37 °C-on végzett inkubálás után 11 telepet találtunk, mindegyiket egy hígítatlan lizátumcsepp területén. A hígítatlan G2272 lizátummal véres-agart oltva nem kapunk növekedést, mutatva hogy a lizátum bakteriológiailag steril. A 22 telepből nyolcat vizsgálunk le, miután ugyanarról a táptalajról, amelyről izoláltuk izolált telepes eljárással visszaizoláljuk. Mindegyik aromásdependensnek bizonyult, ezért Shigella flexneri Y23479 aro£>25:TnlO transzduktánsoknak tekinthetők. A nyolc közül egyet, amelyről lemezagglutinációs teszttel igazoltuk, hogy Y típusú Shigella flexneri, valamint kongóvörös pozitívnak találtuk, SFL114 jelzéssel láttuk el és -70 °C-on tároljuk.

Az SFL114 törzs nem revertáló, tetraciklin-érzékeny mutánsainak izolálása

Az SFL114 törzs, a többi törzshöz hasonlóan, amelyek azért auxotrófok, mert egy bioszintézis gént TnlO beépülése inaktivál, elméletileg ismét vad típusúvá válhat, azaz ebben az esetben aroD⁺-\á (aromás-független) és feltehetően virulenssé, a transzpozon és a két szomszédos kilenc bázispár méretű szegment közül az egyiknek (a vad típusú gén bázisszekvenciájának része), a „tiszta kivágás”-ával. Az ilyen reverzió valószínűségét az űroö25::TnlO második, TnlO-generálta mutációjával lehet eliminálni, ezzel a tetraciklin-rezisztencia elvesztését okozva, ha a szekunder mutáció egy Tn 10-ből, az aroD génbe nyúló DNS-darabnak a deléciója vagy inverziója. A TnlO hordozó E. coli vagy Salmonella sp. törzsek tetraciklin-érzékeny mutánsait könnyen izolálhatjuk a Bochner és munkatársai által leírt táptalajon [J. Bact., 143, 926-933 (1980)], amelyen a tetraciklin-rezisztens mutánsok gyengén nőnek vagy egyáltalán nem nőnek. A kezdeti kísérletek, hogy az SFL114-ből tetraciklin-érzékeny mutánsokat állítsunk elő, sikertelenek voltak. Később a tetraciklin-érzékeny mutánsok izolálására módosított eljárást használtunk. A használt táptalaj fuzársavból 10 pg/ml helyett csak 1 pg/ml-t tartalmaz és az autoklávozás előtt hozzáadott klórtetraciklin HCl-ból 50 pg/ml helyett csak 10 pg/ml-t tartalmaz. A használt táptalajt 2,3-dihidroxi-benzoesavval egészítjük ki, mivel az aromásfüggő törzsek még ha tetraciklin-érzékenyek is, nem nőnek Bochner-táptalajon, ha nem tartalmazzák a fenti kiegészítést, amely lehetővé teszi a vasmegkötő vegyület, az enterobactin (euterochelin) szintézisét számunkra. A fenti összetételű lemezeket az SFL-törzs tenyészetének százszoros hígításával oltva (0,1 ml térfogatú inkokulum), inkubálva, körülbelül 100 telepet kapunk lemezenként. A telepek legnagyobb része tetraciklinérzékeny mutáns. Az SFL114 húsz mutánsát vizsgáltuk meg, hogy közülük bármelyik az aroD gént érintő delécióból származik-e.

Próba készítése

A Duncan és munkatársai [Biochemical Journal, 238,.415 (1986)] által leírt pKD201 plazmid tartalmaz egy 1,8 kb méretű Clal fragmentet, amely az E. coli nroD⁺ génjét tartalmazza; ezt a plazmidot professzor Jolin Coggins bocsátotta rendelkezésünkre (Department of Biochemistry, University of Glasgow). A plazmid DNS-t kinyerjük és tisztítjuk. A plazmid DNS-t EcoRV és Clal restrikciós endonukleázokkal emésztjük, egy körülbelül 1 kb méretű csíkot izolálunk az

HU 205 262 Β agarózgélből. Az aroD⁺ gén publikált nukleotid-szekvenciája alapján (Duncan et al., i.m.), a fragment a 778-as nukleotidtól az 1798-as nukleotidig terjedő részt tartalmazza, azaz a teljes aroD gént, az N-terminális 75 bázispár kivételével, valamint emellett a gén transzlációs terminációs kodonján túlnyúló körülbelül 370 bázispárt. A kivont DNS-t fenollal kezeljük, majd etanollal kicsapjuk. Agaróz gélelektroforézissel csak egy sáv látható. A fragment egy részét radioaktívan jelzett dCTP-vel, valamint hideg dATP-vel, dGTP-vel, dTTP-vel és DNS polimerázzal inkubáljuk, a DNS-t Biogel oszlopon átbocsátva nyerjük ki.

Telephibridizálás céljából az SFL114 20 tetraciklinérzékeny mutánsai kongóvőrös negatív mutánsainak csíkosra oltott tenyészeteit hordozó lemezre inkubálás után nitrocellulőz filtert helyezünk. A nitrocellulóz filterre átvitt baktériumokat lizáljuk, DNS-üket denaturáljuk. Miután levegőn megszárítottuk, a filtereket két órán át 60 °C-on vákuumban szárítjuk. Megfelelő mosások elvégzése után a szárított filtert 42 °C-on inkubáljuk radioaktívan jelzett próba jelenlétében, ezután néhányszor mossuk, levegőn szárítjuk, majd röntgenfilmre tesszük -70 °C-on, éjszakán át.

A kapott autoradiogram azt mutatja, hogy az SFL114 tetraciklin-érzékeny mutánsai közül tizennyolc kongó vörös negatív variáns legalább olyan jól köti a próbát mint az SFL114 maga, de a 13-as és 19-es számú mutánsok kongóvörös negatív variánsai, kimutatható mértékben nem kötik a próbát. Egy megismételt vizsgálat megerősítette, hogy a 13 és 19 számú mutánsok, mind az eredeti kongóvörös pozitív, mind kongóvörös negatív variánsaik nem képesek megkötni a próbát. Az a következtetés, hogy a 13-as számú törzs (jelzése SFL123) és a 19-es számú törzs (jelzése SFL124) TnlO által generált deléciókkal rendelkeznek, amelyek az egész aroD gént, vagy annak legnagyobb részét eltávolítják.

Az aroD gén majdnem teljes kódoló szekvenciájának kikövetkeztetett deléciója azt jelentheti, hogy az aroD25“TnlO alléit létrehozó TnlO inszercióhelye a gén promoter régiójában van, a promoter és a kódoló szekvencia között, vagy a körülbelül 75 bázispár hosszúságú N-terminális kódoló régióban: egy „jobb irányú” deléció az erre a helyre beépült Tn 10-től a megcélzott struktúrgén felé, eredményezheti a megfigyelt eredményt. Továbbá, az aroD géntől upstream levő bázisszekvencia [Duncan et al., Biochemical Journal, 238, 417 (1986)] az aroD gén feltételezett promoter régiójában a TnlO inszercióhoz előnyös szekvencia két majdnem teljesen azonos példányának jelenlétét mutatja (hat közül egy bázis eltérés). Az aroD25::Tnl0-ben lévő TnlO inszerció a két célszekvencia egyikében lehet, ezzel okozza, hogy effektív promoter hiányában a struktúrgén nem expresszálódik. A leírt megfigyelések azt mutatják, hogy az aro25D::TnlO-ben lévő transzpozon inszerció vagy a promoterben van, vagy a promoter és a kódoló szakasz kezdete között van, vagy kevésbé valószínűen a kódoló régió első száz közüli bázispárjában. Az inszerció helyétől függetlenül a két deléciós mutáns, a 13-as és

19-es (most SFL123 és SFL124 jelzésűek) a gén egész, vagy majdnem egész kódoló régióját elvesztette, ennélfogva képtelen a reverzióra.

Az SFL114 vizsgálata majmokban

A kiindulási S. flexneri Y234-79 törzset bikarbonátcitrát pufferben szuszpendáljuk, majd egy csecsemőtápláló nazális katéteren keresztül 2-4 éves Macacca fascicularis majmokba juttatjuk kontrollként. Az öt majom közül, amelyek lxlO¹¹ dózisú fertőző baktériumot kaptak, négyben fejlődött ki 1-3 napig tartó bőséges, nyálkás hasmenés. A két, lxlO⁹ baktériummal fertőzött majom közül egyben fejlődött ki hasmenés. Mindegyik esetben fertőzés előtt mindegyik majomnak legalább három negatív széklettenyészete volt. A vad típusú törzset a fertőzés utáni napon ki lehetett mutatni a székletmintákból, és általában 17 napig tartott az ürítés (9-35 napos határok között).

Külön ketrecben tartott kilenc majomból álló csoportnak az SFL114 vakcinatörzset szájon át adtuk be 2-3x10¹⁰ baktériumos dózisban a 0., 7., 14. és 39. napon. A vakcinatörzset jól elviselték, és egyik majomnál sem volt észlelhető hasmenés. A vakcinatörzset mindegyik majom székletéből vissza lehetett nyerni, és az ürítés átlagosan két napig tartott (1-4 napos határok között).

A majmokból mind immunizálás előtt, mind immunizálás utáni intervallumokban szérummintákat vettünk. A székletmíntákat is gyűjtöttük, foszfáttal pufferolt sóoldatban homogenizáltuk, majd a vizsgálatig -70 °C-on tartottuk. A szérum- és székletmintákat ezután immunesszével vizsgáltuk, S. flexneri Y, lb, 2aLPS szerotípust és S. flexneri nagy plazmid által meghatározott külső proteinfrakciót használva antigénként. A majmok szignifikáns szérum-titer növekedéssel reagáltak az YLPS antigénnel szemben, mindegyik antitestoszályban (1. táblázat).

/. táblázat

Nap	TgA	IgM	rgc
0	140 (50-240)	300 (90-570)	550 (110-1800)
6	230 (30-510)	370 (120-1900)	610 (110-1640)
13	380 (50-1230)	580 (160-1900)	1030 (180-1340)
25	240 (50-510)	440 (100-1490)	1210 (250-4000)
46	310 (60-1000)	510 (90-1780)	1280 (310-4000)
60	800 (110-1870)	590 (130-1630)	1840 (230-4000)

Osztályspecifikus szérumantitest titerek (átlag és határok) Shigella flexneri Y lipopoliszacharid ellen, im10

HU 205 262 Β munesszével becsülve, S. flexneri SFL114-gyel orálisan a 0., 7., 14. és 39. napon immunizált (2-3xl0'° baktérium), és az 52. napon S. flexneri Y 234-79-cel fertőzött (lxlO¹¹ baktérium) majmoknál.

Az átlagértékek IgA és IgG esetében több mint kétszeresükre nőttek. Azonban nem volt válasz vagy nagyon gyenge válasz volt megfigyelhető IgA-ra 3/9 majomnál, IgM-re 5/9 majomnál és IgG-re 2/9 majomnál. A fertőzés után kettő kivételével mindegyik majomban magas titer volt megfigyelhető.

A székletszuszpenziók titrálása jelentős IgA-titeremelkedést mutatott, de IgG-emelkedést nem (2. táblázat).

2. táblázat

Nap	IgA	IgO
0	160 (60-420)	130 (60-280)
4	110 (40-170)	70 (50-100)
10	400 (50-1910)	90 (40-140)
42	360 (160-740)	130 (20-370)
56	900 (80-2450)	100 (50-200)

Széklet IgA és IgG antitest titerek (átlag és határok) Shigella flexneri Y lipopoliszacharid ellen, enzim immunesszével vizsgálva Shigella flexneri SFL114-gyel orálisan a 0., 7., 14. és 39. napokon 2-3xlO¹⁰ baktériummal immunizált, és a 52. napon Shigella flexneri Y 234-79 törzzsel (lxlO” baktérium) fertőzött majmokon.

Ezek az eredmények azt mutatják, hogy slgA keletkezett. Egy majom kivételével mindegyik IgA növekedéssel reagált. A legmagasabb IgA-títereket a fertőzés után észleltük. A legtöbb majomban magas volt a külső membránfrakció elleni titerimmunizálás előtt az SFL114 vakcinatörzzsel. Csak 3/9 majomnál volt észlelhető jelentős IgA- és IgG-titeremelkedés,

Mindegyik majmot orálisan fertőztük a kiindulási Y234-79 törzzsel (lxlO¹¹ baktérium) az 52. napon, 13 nappal az utolsó immunizálás után. A majmok közül egy sem mutatta megbetegedésnek jelét sem, és nem fejlődött ki bennük hasmenés. A fertőző törzset kimutattuk a székletből és ugyanolyan hosszan választódott ki, mint immunizálás előtt. Tehát a S. flexneri SFL114 törzzsel végzett immunizálás megvéd a homológ vad törzzsel végzett szimptomatikus fertőzéssel szemben, de nem befolyásolta a kiindulási törzs ürülésének időtartamát.

Mindegyik majmot kolonoszkópiának vetettük alá ezzel egyidejű biopsziával együtt, amelyet végbélhez közeli bélből vettünk immunizálás előtt, valamint az immunizálás és fertőzés után 3 nappal. Az eredmények a 3. táblázatban láthatók.

3. táblázat

	Kontroll májmok SFLl-et kaplak	Vakcina csoport SFL114-et kaptak
Im- muni- zálás előtt	3. nap	17. nap	56. nap
Felületi epiteliás erózió fekélyesedés	++	0	0	0	0
Epiteliális hiperplázia	+	0	0	+	+
Szövet közötti gyulladás	++	0	+	+	++
Tüszőüregek gyulladása	+	0	0	+	+

Shigella-flexnerivel immunizált és fertőzött Macacca fasciculari majmok, nyálkás belbiopsziájánál talált morfológiai elváltozások félkvantitatív értékelésére. Vakcinálás S. flexneri Y234-79 törzzsel az 52. napon. 0 = nincs változás, + = kicsi (bizonyos mértékű) lokális elváltozás, ++ = közepes mértékű/általános elváltozás.

A kolonoszkópia azt mutatta, hogy az immunizálatlan majmoknak a nyálkája tökéletes. Fertőzés után egy megvörösödött és hiperámiás nyálka volt látható. A hisztopatológiai vizsgálatok azt mutatták, hogy felületi sérülések vannak epitéliális eróziókkal és foltos nyálkás fekélyekkel a leszálló vastagbéltől a végbélig (3. táblázat). Emellett közepes szövetközi gyulladás volt megfigyelhető a nyálkatüszőüregek némi gyulladásos részvételével. Másodlagos epiteliális hiperplázia volt megfigyelhető a tüszőüregek felszínének és nyakának számos területén. Az S. flexneri SFL114 törzzsel immunizált majmoknál a fertőzés és gyulladás puszta szemmel megfigyelhető nagy morfológiai jelei hiányoztak. Az első immunizálás után vett biopsziák csak gyenge szövetközi gyulladást mutattak (3. táblázat). Három immunizáló dózis után gyenge epiteliális hiperplázia és a tüszőüregek gyulladása is látható volt. Ezek az eredmények valamint a vakcinatörzs elektronmikroszkópiás kimutatása a nyálkában, megerősítették a törzs invazív tulajdonságait és kimutatták, hogy szaporodik a nyálkában.

A fertőzés után végzett kolonoszkópia is normális nyálkát mutatott. A biopsziák hisztológiai vizsgálata nem mutatott felületi eróziókat. A szövetek között azonban közepes gyulladás volt megfigyelhető. Csak néhány tüszőüreget érintett a gyulladás, és a reaktív epiteliális hiperplázia gyenge, lokális volt.

A hisztológiai vizsgálatok eredményei azt mutatják, hogy az előállított aromásfüggő SFL114 törzzsel végzett vakcinálás lokális immunvédelmet váltott ki, ami megakadályozta a bélnyálka károsodását. A védelmet nemcsak az inváziót megakadályozó lokális slgA válasz okozta, hanem a gazdaszervezet jelentős védeke11

HU 205 262 Β zése is, a fertőző S. flexneri törzs invázió utáni elpusztításával. A eelluláris immunmechanizmusok is valószínűjelöltjei ennek a gazdaszervezet-védekezésnek.

Ezek az adatok azt mutatják, hogy az SFL114 törzs rendelkezik az összes szükséges jellemzővel ahhoz, hogy S. flexneri által okozott vérhas elleni vakcina legyen. Meghatározott, nem revertálő mutációval rendelkezik, amely a gazdaszervezetben nem találhtó aromás metabolitok iránti igényt okoz. Rendelkezik behatoló képességgel és korlátozott intracelluláris szaporodási hajlammal. Tartalmazza az összes azonosított (és valószínűleg számos azonosítatlan protektív antigént) és lokális, valamint keringési antitestválaszt és celluláris immunválaszt kelt.

A törzset a majmok jól tűrik és négy napig ürítik, ami azt mutatja, hogy legalábbis korlátozott szaporodásra és kolonizációra képes a bélben.

Az SFL114 törzs kipróbálása humán önkénteseken

A Shigella flexneri SFL114 törzset, amely Y szerotípusú, és a transzdukcióval bevitt aroD:25::InlQ mutáció miatt aromásigényes, bizonyítottan Sereny-negatív és majmokban avírulens, humán önkénteseken vizsgáltuk.

Egy előkísérletben a laboratórium dolgozói SFL114 törzs ΙΟ⁵, ΙΟ⁷,10⁹ telepképző-egységnyi egyszeri dózisát itták meg foszfáttal pufferolt sóoldatban (PBS). Káros hatás nem keletkezett.

A főkísérletben az önkéntesek felnőtt fiatal orvostanhallgatók voltak, 33 férfi és 14 nő. A tájékoztatás utáni hozzájárulást és megfelelő anamnézis fizikai és laboratóriumi vizsgálatok után az önkénteseket két csoportba osztottuk. Az egyik csoport (17 férfi és 5 nő) PBS-ben szuszpendált SFL114 törzs egyszeri, 10^l° telepképző-egységből álló dózisát kapta. A másik csoport (16 férfi és 9 nő) 10⁹ telepképző egységet kapott. Mindegyik önkéntest naponta kikérdeztük, székletmintát és végbélkenetet tenyésztettünk néhány napon át. A székletmintákat eleinte kvantitatív tenyésztettük, hogy meghatározzuk, hogy a széklet grammonként hány telepképző egység Shigellát tartalmaz.

Egyik csoportba tartozó önkéntes sem közölt étvágycsökkenést, hányást, hányingert, lázt (37,5 °C-nál magasabbat), vért vagy nyálkát a székletben, komoly hasi kellemetlenséget vagy egyszerűen hasmenést. A 10'°-es csoportban néhány önkéntes (8 az első napon, 4 a második napon) említett enyhe vagy közepes hasi fájdalmat és/vagy laza vagy vizes székletet 2-4 napon át. A 10⁹-es csoportban 1-3 önkéntesnek volt laza vagy vizes széklete, nem tovább mint két napig, vagy enyhe hasi fájdalma.

Shigella flexneri Y-t izoláltunk majdnem az összes önkéntes székletéből és/vagy vastagbélkenetéből (a pozitív kumulatív százalék az 5. napon több mint 80% a

10⁹-es csoportból és több mint 90% a 10^t0-es csoportból). Az önkénteseknek kevesebb mint 10%-a volt tenyészetpozitív az 5. napon vagy később.

Ezek az eredmények azt mutatják, hogy az SFL114 törzs biztonságos élő vakcina szájon át adva, még a nagyon magas 10¹⁰ telepképző egységdózisban is. Az eredmények azt is mutatják, hogy a 10^l° telepképzőegységnyi dózis is csak enyhe mellékhatásokat okozott. Az adagolás utáni első két napban a széklet egy grammjában található Shigella-baktériumok száma azt mutatja, hogy az élő vakcinatörzs korlátozottan szaporodik akár a bél epiteliális sejtjeiben, akár a vakbélben vagy mindkettőben. Ez azt mutatja, hogy az adagolás kielégítő immunválaszt eredményez, legalábbis a béltraktusban. Ennél fogva a vakcina adagolása védelmet biztosít a természetes fertőzéssel szemben, legalábbis az Y szerotípusú Shigella flexnerivel szemben, vagy keresztreakciót adó törzsekkel szemben.

Claims

SZABADALMIIGÉNYPONTOK

1. Eljárás új, nem revertálő, Shigella-ellenes élő vakcina előállítására, azzal jellemezve, hogy nem revertálő aroD', Sereny-negatív, kongóvörös pozitív, Y szerotípusú, adott antibiotikumra érzékeny, kémiailag meghatározott összetételű táptalajon szaporodni képes, az emlős gazdaszervezetben nem található esszenciális metabolitot igénylő Shigella flexneri fajhoz tartozó törzset legalább egy adjuvánssal összekeverünk.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a Shigella flexneri SFL 114 jelű, ATCC 53755 törzset alkalmazzuk.
3. Eljárás Shigella felxneri vakcinatörzs előállítására, azzal jellemezve, hogy (i) antibiotikum-rezisztenciát kódoló transzpozont építünk be a Shigella flexneri baktérium aro génjébe, (ii) az antibiotikum-érzékennyé visszaalakult Shigella flexneri mutánsokat szelektáljuk, (iii) a szelektált mutánsokat átvizsgáljuk, hogy melyik tartalmaz olyan deléciót vagy deléciós inverziót, amely belenyúlik az aro génbe, és így a nem “revertálő mutánsokat kiválasztjuk.

(iv) majd a nem revertálő mutánsok közül szelektáljuk azokat, amelyek Sereny-negatívok és kongóvörös pozitívak.
4. A 3. igénypont szerinti eljárás (i) lépése, azzal jellemezve, hogy a transzpozont az aro génbe úgy építjük be, hogy az aro génnel homológ szekvenciához kapcsolódó transzpozont alkalmazunk.
5. A 3. igénypont szerinti (i) eljárás, azzal jellemezve, hogy transzpozonként aTnlO jelű, tetraciklin-érzékenységet kódoló transzpozont az aroD génbe építjük be.