HU204071B - Process for producing immune stimulant peptides and pharmaceutical compositions comprising same - Google Patents

Process for producing immune stimulant peptides and pharmaceutical compositions comprising same Download PDF

Info

Publication number
HU204071B
HU204071B HU893902A HU390289A HU204071B HU 204071 B HU204071 B HU 204071B HU 893902 A HU893902 A HU 893902A HU 390289 A HU390289 A HU 390289A HU 204071 B HU204071 B HU 204071B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
arg
lys
glu
ala
boc
Prior art date
Application number
HU893902A
Other languages
English (en)
Other versions
HUT53914A (en
Inventor
Brunetto Brunetti
Marco Prada
Original Assignee
Ellem Ind Farmaceutica
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ellem Ind Farmaceutica filed Critical Ellem Ind Farmaceutica
Publication of HUT53914A publication Critical patent/HUT53914A/hu
Publication of HU204071B publication Critical patent/HU204071B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/66—Thymopoietins
    • C07K14/662—Thymopoietins at least 1 amino acid in D-form
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/08—Tripeptides
    • C07K5/0819—Tripeptides with the first amino acid being acidic
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

A találmány tárgya eljárás immunstimuláló peptidek és ezeket tartalma 7ή gyógyszerkészítmények előállítására.
A találmány szerinti eljárással előállított peptideket az© általános képlet szemléletű
A-x-Lys-y-B© ahol
A jelentés ehidrogénatom, egy Arg-Ala-Arg képiéin tripeptid vagy egy Glu-Lys-Arg-Arg-AIa-Arg képletű hexapeptid, x és Y egymástól eltérő, ésN&gy arginin maradékot (Arg), vagy glutaminsavmaradékot (Glu) képvisel,
B jelentése hidroxilcsoport vagy Arg-Ala-Arg képletű tripeptid, azzalamegkőtéssel, hogyha A jelentése hidrogénatom és x jelentése Arg, akkor B jelentése hidroxilcsoporttól eltérő.
A találmány szerinti eljárással előállított peptideket alkotó amínnsavak lehetnek a természetes L-formábanvagy D-formában vagy a kétfonna racém elegyefonnájában.
A találmány szerinti eljárással előállított peptidek közöl előnyösek azok, amelyekben A vagyB jelentése Arg-Ala-Arg, x jelentése Arg és y jelentése Glu.
A találmány szerinti eljárással előállított peptidek egy másik előnyös csoportja az, amelyekben A jelentése Glu-Lys-Arg-Arg-AIa-Arg, x jelentése Glu és y jelentése Arg. Apeptidekegy további előnyös csoportjaaz, amelyekben AésB jelentése Arg-Ala-Arg, mígx és y jelentése egymástőlfüggetlenül Argvagy Glu.
Előnyösek azok a peptidek, amelyekben az aminosavak L-f ormában vannak, de lehetnek D- vagy DLformában is, különösen a D-Ala vagy D-Glu jelenléte előnyös.
A találmány tárgya tehát eljárás az említett peptidek előállítására, valamint eljárás immunstimuláló gyógyszerkészítmények előállítására, amelyek hatóanyagként ezeketapeptídekettartalmazzák,
A továbbiakban a kővetkező rövidítéseket alkalmazzulc
Ala-L-alanin
Arg-L-arginin
Boc- butű-oxi-karbonil
D-Ala-D-alanin
Glu-L-glutaminsav
D-Glu-D-glutaminsav
Lys-L-Iizin
N2- szubsztitúció az Argguanidin-nitrogénjén.
Az Arg-Ala-Arg képletű tripeptid ismert a 3 712 050 sz. NSZK-beli közrebocsátási úatból: immunstimuláló aktivitással rendelkezik, és képes a Tsejtek érését és funkciósképességeit fokozni.
Az Arg-Lys-Glu képletű tripeptid (splenotritin), amely a splenopoietin 32-34fragmensének felel meg, olyan polipeptid hormon, amelyet szarvasmarha-lépból extrahálnak, és amelyet eredetileg timopoietinlHként ismertettek, mivel nagy affinitást mutat a timuszból izolált timopoietin I és H-höz, immunstimuláló tulajdonságokkal rendelkezik, beleértve a T-limfocitákérését és funkcionálását (3 712050 sz. NSZKbeli közrebocsátási úat; Diezel W. és munkatársai: Biomed.Biochim.Acta45,1349,1986). Hasonlóképpen, az Arg-Lys-Asp képletű peptid, amelyazArg-Lys-Gluképletűpeptidbőlcsaka C-terminális aminosav-maradékban tér el, hasonló tulaj5 donságokat mutat (00 67425számú európai szabadalmi leírás), valamint az Arg-Gly-Asp, amelyet a 3 826 595sz.NSZK-beliközrebocsátási irat ismertet.
A találmány szerinti eljárással előállított peptidek immunstimuláló aktivitással rendelkeznek, és in vitro kísérleti modellekben hatásosnak bizonyultak éretlen rágcsáló T-limfocíták érésének elősegítésében, és a humán T-sejték funkcionálásának fokozásában. A peptidek képesek helyreállítani meztelen timuszmentesegerekimmunfunkcióit, Snapig, 2vagy őhétigorá15 lisanvagyíp. úton adagolva.
Az Arg-Ala-Arg és Arg-Lys-Glu peptidekhez hasonlóan a találmány szerinti eljárással előállított peptidek stabilak az in vitro stimulált emésztőnedvekkel szemben.
A két említett peptidhez hasonlóan, amelyeknek stabilitása a stimulált emésztőnedvekben az orális adagolás utáni aktivitással kapcsolatos, úgy találtuk, hogy a találmány szerinti eljárással előállított peptidek is immunstimuláló aktivitással rendelkeznek orálisvagy parenterális adagolás után.
Ez a tény jelentős előnyt jelent a terápiás alkalmazásban, különösen gyerekek és olyan betegekkezelésében, akik nem tolerálják a parenterális adagolást, tehát az előírt terápia kellemesebb a betegeknek.
Afentiek alapján tehát a találmány szerinti eljárással előállított vegyűletek tulajdonságaik alapján különösen hasznosak a klinikai gyakorlatban primer és szekunder űnmunhiányosságokkezelésében.
Immunstimuláló vegyűletek klinikai használhatóságát úja le például az Immun. Lett. 16, 363,1987; JAMA, 258,3005,1987 ésDrugDiscoveryandDevelopment, szerlc Williams M. és Malick J. B„ Humana 1987,227. oldal.
A találmány szerinti eljárással előállított peptidek adagolhatók önmagukban vagy farmakológiailag elfogadható hordozóval keverve alkalmas farmakológiai készítményfoimájában.
Ilyen farmakológiai készítmények például, amelyeket jólismertmódszerekkel és segédanyagokkal készítünk, például a „Remington’s Pharmaceutical Sciences Handbook, Mack Pub. Co., N.Y. USA irodalmi helyen ismertetett módon, a tabletták, kapszulák, szirupok és más orális adagolásra alkalmas készítmények, míg parenterális adagolásra alkalmas fonnák például a steril oldatok vagy szuszpenziók, alkalmas folyadékban, implantátumok stb. Az előnyös adagolási forma az az egységdózis, amely körülbelül 0,1500 mg © általános képletű pepiidet, vagy ezzel ekvivalens mennyiségű farmakológiailag elfogadható só55 ját, például acetátját, hidrokloridját, trifluor-acetátját, szulfátját tartalmazza.
Az adagolás különböző tényezőktől függ, így például a kezelendő patológiás állapot típusától és komolyságától, a beteg testtömegétől és nemétől, stb, ezek 60 alapján szakember által egyszerűen megállapítható.
HU 204071 Β
Általában 1-4 adagolás szükséges naponta.
Az (I) általános képletű peptidek szokásos módszerekkel, a peptidkémiában ismert módon, például szilárd fázisban gyantán előállíthatók.
A találmány szerinti eljárást a kövektező példákkal szemléltetjük, a korlátozás szándéka nélkül.
1. Példa
Általános eljárás a peptidek szilárd fázisú szintézisére
1. Boc-aminosavakkal szubsztituált gyanták előállítása
Klór-metilezett polisztirolt (1% térhálós; 200400 mesh) dimetil-formamiddal duzzasztunk (körülbelül 8-10 ml 1 g gyantára számítva), majdBoc-aminosawal (1 mól 1 g gyantára számítva), majd káliumfluoriddal (2 mól 1 g gyantára számítva) kezelünk. Ezután kismennyiségű oldószert (5-10 ml) vákuumban ledesztillálunk, majd az elegyet 80-100 °C hőmérsékleten, 16-18 óra hosszat melegítjük Hűtés után a gyantát leszűrjük, DMF-fel, DMF és víz 1:1 térfogatarányú elegyével, vízzel, etanollal, diklór-metánnal és metanollal mossuk, majd vákuumban megszáritjuk. A helyettesítés (a tömegnövekedés alapján számolva) 0,4-0,6 mól grammonként.
2. Általános szintetikus módszer
Alkalmas mennyiségű, a peptidlánc C-terminális Boc-aminosavával helyettesített gyantát a kívánt sorrendben szobahőmérsékleten (20-25 ’C) a következő anyagokkal kezeljük egymás után:
a) CH2a2
b) 50 térf.% CF3COOH:CH2C12
c) 50% CF3COOH-CH2C12
d) CH2G2 (háromszori ejizopropanol
f) 10 térfogati trietil-amin:CH2Cl2 (kétszer)
g) CH2Cl2
h) metanol (kétszer)
i) CH2Cl2 (kétszer)
Az érintkeztetési idő minden kezelésben 3-5 perc, kivéve a c) kezelést.
g gyantára 10-15 ml oldószert vagy oldószer-reagens elegyet alkalmazunk minden lépésben.
j) Agyantát a kívánt szekvencia megfelelően védett, utolsó előtti Boc-aminosava (3 ekvivalens) diklór-metános oldatával keverjük, majd hozzáadunk 3 ekvivalens diciklohexil-karbodiimidet diklór-metánban, A reakció legalább 2-4 órát tart, tarthat azonban egy éjszakán át (16-18 órát).
A gyantát, amelyhez a peptid van kötve, leszűrjük, diklór-metánnal, metanollal és diklór-metánnal mossuk, és a szintézis teljességét ninhidrin-próbával ellenőrizzük. Ha a szintézis nem teljes, ugyanazt az aminosavat fél mennyiségű reagensekkel újra kötjük. A ciklust a szekvencia minden aminosavával addig ismételjük, amíg a szekvencia teljes nem lesz.
Az N-terminális Boc-csoport eltávolítása után a gyantát, amelyhez a peptid van kötve, óvatosan mossuk, és vákuumban megszárítjuk.
A pepiidet elválasztjuk a gyantától, és ugyanakkor eltávolítjuk a védőcsoportokat anizolt tartalmazó (10 térfogat%) vízmentes hidrogén-fluoriddal (10 ml 1 g gyantára számítva) 1 óra alat 0 ‘C-on.
Ezután a hidrogén-fluoridot csökkentett nyomáson 5 bepároljuk, a nyers peptidet extraháljuk úgy, hogy a gyantát híg vizes ecetsawal mossuk, és a terméket liofüezéssel izoláljuk.
3. A nyers peptid tisztítása
Anyers peptidet reverz fázisú preparatívHPLC-vel 10 tisztítjuk C18 lánchosszúságú szilanizált szilíciumdioxidon, például a Waters Prep 500 készüléken. Alkalmas vizes pufferrel, például vizes 0,1%-os trifluorecetsawal kiegyenlített 5x30 cm-es oszlopra felviszszük a nyers peptidet (körülbelül 2 g), és emelkedő mennyiségű acetonitril-gradienssel eluáljuk. A frakciókat analitikai nagynyomású folyadék kromatográfiás eljárással ellenőrizzük, és azokat amelyek a kívánt .tisztaságú (95%) peptidet tartalmaznak, összegyűjtjük és liofilizáljuk. Végül a tisztított terméket a kívánt sóvá alakítjuk egy, a kívánt só formában lévő ioncserélő gyantával.
ARG-LYS-GLU-ARG-ALA-ARG szintézise A peptidet a fent ismertetett általános módszerrel szintetizáljuk, Boc-N8-tozil-L-arginint tartalmazó gyantából kiindulva (5 g; szubsztitúció 0,5-0,6 mól 1 g gyantára számítva), és a következő aminosavakat adagoljuk:
1. Boc-L-alanin,
2. Boc-Ng-tozil-L-arginm (DMF-ben)
3.Boc-y-henzil-L-glutaminsav
4. Boc-e-bezü-oxi-karbonil-L-lizin
5. Boc-NS-tozil-L-arginin (DMF-ben) ARG-LYS-GLU-ARG-D-ALA-ARG szintézise Boc-NS-tozil-L-argininnel helyettesített gyantát (6 g, szubsztitúció kb. 0,5 mól 1 g gyantára számítva) egymás után a kövektező aminosavakkal kezelünk az előbbiekben ismertetett általános előírás szerint:
1. Boc-D-alanin
2. Boc-N8-tozil-L-arginin (DMF-ben)
3.Boc-y-benzil-L-glutaminsav
4. Boe-£-2-klór-benzil-oxi-karbonil-L-lizin
5. Boc-NS-tozil-L-arginin (DMF-ben) ARG-ALA-ARG-ARG-LYS-GLU szintézise
A peptidet a fentiekben ismertetett általános mód45 szer szerint szintetizáljuk Boc-y-benzil-L-glütaminsavat tartalmazó gyantából kiindulva (5 g, szubsztitúció: 0,5-0,6 mól 1 g gyantára számítva), és a következő aminosavakat adagoljuk:
l.Boc-E-benzÍl-oxi-karbonil-L-lizin
2. Boc-Ng-tozil-L-arginin (DMF-ben)
3. Boc-NS-toziI-L-arginin (DMF-ben)
4. Boc-L-Alanin
5. Boc-NS-tozil-L-arginin (DMF-ben) ARG-D-ALA-ARG-ARG-LYS-GLU szintézise
Boc-y-benzil-L-glutaminsawal helyettesített gyantát (5 g; szubsztitúció: körülbelül 0,5 mól 1 g gyantára számítva) a következő aminosav-származékokkal keverünk a fentiekben ismertetett általános módszer szerint:
1. Boc-e-2-ldór-benzil-oxi-karbonil-L-lizm,
HU 204071 Β
2. Boc-N8D-tozil-L-arginin (DMF-ban)
3. Boc-N8-tozil-L-argimn (DMF-ban)
4. Boc-D-alanin
5.Boc-Ng-tozil-L-arginin (DMF-ban) ARG-ALA-ARG-ARG-LYS-GLU-ARG-ALA- 5
ARG szintézise
A pepiidet a fentiekben ismertetett általános módszer szerint szintetizáljuk, Boc-N8-tozil-L-arginint tartalmazó gyantából kiindulva (5 g; szubsztitúció: körülbelül 0,5 g mól 1 ggyantára számítva), a következő aminosavakatadagolva:
1. Boc-L-alanin
2. Boc-N8-tozü-L-arginin(DNF-ban)
3. Boc-7-benzil-L-gJutaminsav
4. Boc-e-2-klór-benzil-oxi-karbonil-L-lizin
5. Boc-Ns-toziI-L-arginin (DMF-ban)
6. Boc-Ng-tozil-L-argimn ©)MF-ban)
7. Boc-L-aIanin
8. Boc-Ng-toziI-L-arginin (DMF-ban)
GLU-LYS-ARG és ezzel rokon peptidek szintézise
Boc-NMozü-L-arginmt tartalmazó gyantát (20 g;
szubsztitúció: kb. 0,6 mmól 1 g gyantára számítva) a kövéktező aminosav-származékokkal kezelünk, az előbbiekben ismertetett általános módszer szerint
1. Boc-2-klór-benzil-oxi-karbonil
2. Boc-y-benzil-L-glutaminsav
Az előző módszert ismételjük, de L-glutaminsav helyett D-glutaminsavat használunk. Ugyanilyen módszerekkel a kővetkező peptideketszintetizáljulc -Arg-Ala-Arg-Glu-Lys-Arg
- Glu-Lys-Arg-Arg-AJa-Arg
-Glu-Lys-Arg-Arg-Ala-Arg-Glu-Lys-Arg
2. Példa
Kémiai jellemzők
Akövetkezőkben ismertetett adatokminden peptid esetén egyetlen adagra vonatkoznak, nem korlátozó jelleggel adjukmeg ezeket
ARG-LYS-GLU-ARG-ALA-ARG
Molekulatömeg: 815,0
Megjelenés:fehérpor
Aminosav analízis
Ammosav számított talált
Alanin 1,00 0,978
Lizin 1,00 1,00
Glutaminsav 1,00 1,00
Arginin 3,00 3,05
Peptidtartalom: 80,9% (±0,3%)
Peptidtisztaság: 98,62%
HPLC: az analízist a kövektező módszerrel végeztük:
Eluensek: A- NaH2PO4 25 mmól/1 „ NaCIO4 60 mmól/1, (pH-2,9)H3PO4ral
B-60% CH3Cn+40%H2O
Gradiens: 100% A-ból a B lineáris emelkedésével (1%/perc)
Oszlop: ultraszférikus ODS 5 pm, 4,6 mmx25 cm (Beckman)
Átfolyási arány: 0,9 ml/perc Hullámhossz: 210 nm Retenciós idő: 21 perc
ARG-LYS-GLU-ARG-D-ALA.-ARG Molekulatömeg: 815,0 Megjelenés: fehér por Aminosavanalízis
Aminosav számított talált
10 Alanin 1,00 1,03
Lizin 1,00 1,01
Glutaminsav 1,00 1,00
Arginin 3,00 2,87
._ Peptidtartalom:65,9%(±0,3%) 10 Peptidtisztaság: 99,2%
HPLC: az analízist a kövektező módszerrel végeztük;
Eluensek: A- NaH2PO4 25 mmól/1 + NaQ04 70 mmól/1, (pH- 3,0) H3PO4ral
B-60%CH3CN+40%H20 Gradiens: B 0%-ról 25%-ra 30 perc alatt Oszlop:Deltapack-C1815 pm,3,9mmx30cm Átfolyási arány: 0,7 ml/perc Hullámhossz: 210 nm
Retenciós idő: 22perc ARG-AIA-ARG-ARG-LYS-GLU Molekulatömeg: 815,0 Megjelenés:fehérpor ηΛ Aminosavanalízis
Aminosav számított talált
Alanin 1,00 1,01
Lizin 1,00 1,00
Glutaminsav 1,00 0,99
Arginin 3,00 3,03
Peptidtartalom: 73,5% (± 1,0%)
Peptidtisztaság: 99,81%
HPLC: az analízist a kövektező módszerrel végez40 tűk:
Eluensek: A- NaH2PO4 25 mmól/1,, NaQO4 60 mmól/1, (pH-2,9)H3PO4-ral
B-60% CH3CN+40%H2O
Gradiens: 100% A-hől a B lineáris emelkedésével (1%/perc)
Oszlop: Ultraszférikus ODS 5 fim, 4,6 mmx25 cm (Beckman)
Átfolyási arány: 0,9 ml/perc Hullámhossz: 210 nm
Retenciós idő: 20 perc
ARG-D-ALA-ARG-ARG-LYS-GLU Molekulatömeg: 815,0 Megjelenés:fehérpor Ammosav analízis
Aminosav számított talált
Alanin 1,00 0,98
Lizin 1,00 1,02
Glutaminsav 1,00 1,00
Arginin 3,00 2,96
HU 204071 Β
Peptidtartalom: 74,0% (± 2,7%)
Péptidtisztaság: 99,1%
HPLC: az analízist a kövektező módszerrel végeztük:
Eluensek: A- NaH2PO4 25 mmól/1 + NaC104 70 mmól/1, (pH-3,0) H3PO4-ral
B-60%CH3Cn+40%H20 Gradiens: B 0%-ről 25%-ra növekedett 30 perc alatt Oszlop: Deltapak-C815 pm, 3,9 mm x 30 cm Átfolyási arány: 0,7 ml/perc
Hullámhossz: 210 nm Retenciós idő: 23 perc
ARG-ALA-ARG-ARG-LYS-GLU-ARG-ALAARG
Molekulatömeg: 1198,5 Megjelenés: fehér por Aminosav analízis
Aminosav számított talált
Alanin 2,00 2,01
Lizin 1,00 1,03
Glutaminsav 1,00 0,99
Arginin 5,00 4,91
Peptidtartalom: 69,6% (± 7,2%)
Péptidtisztaság: 99,2%
HPLC: az analízist a kövektező módszerrel végeztük:
Eluensek: A- NaH2PO4 25 mmól/1 „ NaClO4 70 mmól/1, (pH- 3,0) H3PO4-ral
B«60%CH3CN+40%H20
Gradiens: B 0%-ról 30%-ra növekedett 25 perc alatt
Oszlop: Deltapak C18 15 pm, 3,9 mmx 30 cm (Beckman)
Átfolyási arány: 0,7 ml/perc Hullámhossz: 210 nm Retenciós idő: 26 perc GLV-LYS-ARG Molekulatömeg: 431,5 Megjelenés: fehér por Aminosav analízis
Aminosav számított talált
Lizin 1,00 0,89
Glutaminsav 1,00 1,06
Arginin 1,00 0,94
Peptidtartalom: 71,2% (± 3%) Péptidtisztaság: 97% D-GLU-LYS-ARG
Molekulatömeg: 431,5 TLC:butanol/AcOHZH2O 4/2/2Rf-0,2
Peptidtartalom: 81,0% Aminosav analízis
Aminosav számított talált
Lizin 1,00 1,03
Glutaminsav 1,00 1,00
Arginin 1,00 0,96
ARG-ALA-ARG-GLU-LYS-ARG Molekuletömeg: 815 Aminosav analízis
Aminosav számított talált
Alanin 1,00 0,99
Lizin 1,00 0,96
Glutaminsav 1,00 1,02
Arginin 3,00 3,10
Peptidtartalom: 74,4%
Péptidtisztaság: 98,6%
RP-1LC:H2O/CH3CN/TFA 80/20/0,1 Rf-0,8 GLÜ-LYS-ARG-ARG-ALA-ARG Molekulatömeg: 815
Aminosav számított talált
Alanin 1,00 2,99
Lizin 1,00 1,00
Glutaminsav 1,00 1,11
Arginin 3,00 0,99
Peptidtartalom: 74,3% Péptidtisztaság: 95%
GLU-LYS-ARG-ARG-ALA-ARG-GLU-LYSARG
Molekulatömeg: 1228,4 H2O/CH3CN/IEA 80/20/0,1 Rf-0,8
Aminosav számított talált
Alanin 1,00 1,04
Lizin 2,00 1,94
Glutaminsav 2,00 2,00
Arginin 4,00 3,97
Peptidtartalom: 83% Péptidtisztaság: 95%
3. Példa
Biológiai jellemzők
Ellenállás az in vitro szimulált gyomor-körülmények esetén
Az Arg-Lys-Glu-Arg-Ala-Arg és Arg-Ala-ArgArg-Lys-Glu 37 “C hőmérsékleten 3 óra hosszat stabil az in vitro szimulált gyomor-körülmények között, USP XXI jelű (sósav+pepszin) szimulált emésztőnedv alkalmazása esetén.
Thy 1.2 antigén in vitro indukálása csupasz egerek splenocitáiból
Veleszületetten timuszmentes csupasz egerek lépsejtjeit használtuk különböző peptidkoncentrációkkal 18 óra hosszat inkubálva. A Thy 1.2 marker indukcióját közvetlen immun fluoreszcenciával értékeltük ki, fluoreszcencia mikroszkóp segítségével.
A táblázatban összefoglalt eredmények azt mutatják, hogy az Arg-Lys-Glu-Arg-Ala-Arg és Arg-AlaArg-Arg-Lys-Glu képletű hexapeptid a Thy 1.2 marker megjelenését indukálják egy harangalakú dózisválasz összefüggést jelölő görbével, amint ez az immunstimuláló vegyületekre jellemző.
HU 204071 Β
I. táblázat
Pepiid- koncent- ráciő mg/ml ARG-LYS-GLU-ARG-Ala-Arg l.teszt 2.teszt %Tbyl2pozitfvsejtek ARG-ALA-ARG-ARG-LYS-GLU
l.teszt 2.teszt
0 5 9 5 9
0,0001 7 12 5 10
0,001 10 25 8 18
0,001 18 24 14 22
0,1 28 34 20 30
1 32 39 27 32
10 34 40 28 32
50 31 31 28 25
100 20 24 17 14
In vitro fitohemagglutininnel stimulált humán Γ- hogy a GIu-Lys-Arg tripeptid, az Arg-AIa-Arg-Arg-
lifociták RNS szintézise Lys-Glu, Arg-Lys-GIu-Arg-Ala-Arg, Arg-D-Ala-
In vitro 24 óra hosszat 0,5% fitohemagglutinin (PHA) és különböző' peptid koncentrációk jelenlétében inkubált humán T-limfocitákat RNS szintézisre vizsgáltunk 3H-uridin jelzés segítségével. Akövetkező táblázatban összefoglalt eredmények azt mutatják,
Arg-Arg-Lys-Glu, Arg-Lys-Glu-ARg-D-Ala-Arg képletű bexapeptid és az Arg-Ala-Arg-Arg-Lys-GluARg-Ala-Arg képletű nonapeptid a PHA-val aktíváit humán limfocitákRNS szintézisét stimulálja.
2. táblázat
Peptid- 3H-uridin beépülése (beütés/perc) koncentráció ARG-LYS-GLU-ARG-ALA-ARG ARG-ALA-ARG-ARG-LYS-GLU
mg/ml X*+/-SK A% X»+/-SK Δ%
0 13748 1806 - 13748 1806 —
0,0001 14337 1649 +4 13490 1405 +2
0,001 15471 1792 +13 14395 1704 +5
0,01 17851 2248 030 17285 1602 +26
0,1 21320 2167 +55 19939 2027 +45
1 20403 1429 +48 18144 1729 +32
10 20147 1338 +47 16628 1371 +21
100 16194 702 +18 1044 14397 +5
♦6 érték átlaga SK-standard hiba
HU 204071 Β
3. táblázat
RNS szintézise (5 vizsgálat átlaga)
Koncentráció ARG-ALA-ARG-ARG-LYS- GLU-ARG-ALA-ARG ARG-LYS-GLU-ARG- D-ALA-ARG ARG-D-ALA-ARG- ARG-LYS-GLU
mg/ml betltés/perc beütés/perc beütés/perc
X±SJ3. Δ% X±SK Δ% X±SK Δ%
0 3835 - 3835 - 3835 -
108 108 108
0,0001 3606 -6 4073 4Ő 3970 +4
298 318 416
0,001 3855 4586* +20 4023 +5
238 479 206
0,01 4456 +16 5774** +51 4775* +25
266 657 220
0,1 4623** +21 5526** +44 5016** +31
200 314 357
1 4747 +24 5450** +42 4369 +14
581 272 393
10 4986** +30 4848 +26 4569 +19
445 473 309
*=P0,05 **=P0,01
4. táblázat
GLU-LYS-ARG 3H-uridin
koncentráció beépülése
pgml (beültetés/perc
X(±SE) Δ%
0 2866(517) -
0,01 3489(574) +22
0,1 5149(545)* +80
1 7883(311)’ +175
10 3609(1486) +26
*-p,01 pes a peptid a már aktivált sejtek RNS szintézisét fokozni.
5. táblázat
Peptid 3H-uridin beépülése (cpm)
X ±Se%
Kontroll 1155 115 • -
Glu-LYS-ARG 3657 406 +217
RNS in vitro szintézise anti-T3 monoklonális antitesttel aktivált humán limfociták áltál
Egy, aPHA-nál specifikusabb aktivátorral, azaz anti-T3 monoklonális antitesttel aktivált (1,56 ng/ml) humán T-limfocitákat 1 pg/ml Glu-Lys-Arg-val inkubáltunk, és az RNS szintézist a 3H-uridin beépülésével értékeltük ki.
Amint a táblázatból látható, ebben az esetben is kéDNS in vitro szintézise PHA-val stimulált humán T-limfocitákban
Humán T-limfocitákat in vitro inkubáltunk 72 óra hosszat 0,5% PHA és különböző peptidkoncentráció ö jelenlétében, és a DNS szintézist (sokszorozódást) 3Htimidin jelzéssel analizáltuk.
Az alábbi táblázatban megadott eredmények azt mutatják, hogy a peptidek képesek a DNS szintézisét stimulálni.
HU 204071 Β
6. táblázat
Peptid- koncent- ráciő mg/ml 3H-uridin beépülése (beütés/perc)
ARG-LYS-GLU-ARG-ALA-ARG ARG-ALA-ARG-ARG-LYS-GLU
X*+/-SJS. Δ% X*+/-SJs, Δ*
0 59399 4346 59399 4346 —
0,0001 57477 5346 -3 59758 4762 -1
0,001 61682 4559 +4 62751 4213 +6
0,001 69164 1601 +16 68755 2556 +16
0,1 76821 3772 +29 77401 3023 +30
1 80920 3935 +36 78390 4063 +32
10 74648 6772 +26 77983 5975 +31
100 62863 7050 +6 69780 6146 +17
*5 érték átlaga
7. táblázat
DNS szintézis (5 vizsgálat átlaga
Koncentráció ARG-ALA-ARG-ARG-LYS- GLU-ARG-ALA-ARG ARG-LYS-GLU-ARG- D-ALA-ARG ARG-D-ALA-ARG- ARG-LYS-GLU
mg/ml beütés/perc beütés/perc beütés/perc
X±SR. Δ% X±SK Δ% X±SK Δλ
0 22642 3688 - 22642 3688 - 22642 3688 -
0,0001 21369 3009 -6 22454 2943 -1 21904 3684 -3
0,001 21876 3076 -3 22916 2924 +1 24915 4734 +10
0,01 23715 3998 +5 26613 3639 +18 27658* 4827 +22
0,1 27960 3394 +23 30044 3824 +33 28640 4108 +26
1 29866 +32 29482 +30 25956 +14
10 27400 3878 +21 26414 3727 +17 24568 3884 +9
8. táblázat
GLU-LYS-ARG 3H-uridin
koncentráció beépülése
pgml (beültetés/perc
X(±SE) Δ%
0 10140(2205) -
0,01 20648(4456) +104
0,1 18660(6032) +84
1 22332(7014) +120
10 23241(1209) +129
ConA-val indukált sokszorozódás in vitro stimulálása
Egészséges Önkéntesektől vett perifériás vér mononukleáris sejteket (PBMC) ConA-val inkubáltunk a sokszorozódás kiértékelése érdekében jelzett tímidínfelvétel formájában. Amint a 9. és 10. táblázatból lát55 ható, a 0,325 pg/ml ConA-val indukált sokszorozódás Arg-Lys-Glu esetén gyakorlatilag nem változott, míg a találmány szerinti peptidek 10,0 pg/ml-nél közel 30%-kalstimuláltákasokszorozódást.A0,625 pgg/ml ConA-val indukált sokszorozódást az ismert tripeptid 60 csak 10,0 pg/ml értéknél stimulálta, míg 0,01 pgg/ml8
HÜ 204071 Β nél csökkentette. Ezzel szemben a találmány szerinti lálmány szerinti egyik hexapeptid stimuláló hatása a tripeptid már 0,1 pg/ml-nél 31%-kal stimulálta. A ta- 40%-ot is eléri.
9. táblázat
0,325 pg/ml ConA-val indukált sokszorozódás in vitro stimulálása beütés/perc (átlag ± S.E.)
Kezelés Peptid konc. (mg/ml) beütés/perc Δ%
PBMC - 2582 ±658 -
PBMC3ConA - 4620 ± 3002 -
ARG-ALA-ARG-ARG-LYS-GLU 0,1 47455 ± 5981 +3
ARG-ALA-ARG-ARG-LYS-GLU 1,0 52516 ± 974 +14
ARG-ALA-ARG-ARG-LYS-GLU 10,0 61329 ± 859 +33
ARG-ALA-ARG-ARG-LYS-GLU-ARG-ALA-ARG 0,1 52125 ± 416 +13
ARG-ALA-ARG-ARG-LYS-GLU-ARG-ALA-ARG 1,0 54704 ± 10827 +18
ARG-ALA-ARG-ARG-LYS-GLU-ARG-ALA-ARG 10,0 57256 ± 12729 +24
Összehasonlításképpen
ARG-LYS-GLN 0,1 47791 ± 4870 +3
1,0 50121 ± 4099 +8
10,0 37710 ± 2978 -18
10. táblázat
0,625 pg/ml ConA-val indukált sokszorozódás in vitro stimulálása beültetés/perc (átlag ± S.E.)
Kezelés Pept. (mg/ml) beütés/perc %
PBMC - 950 ± 276 -
PBMC+ConA - 67890 ± 5093 -
GLU-LYS-ARG 0,01 88280 ± 17106 +30
GLU-LYS-ARG 0,1 88734 ± 12731 +31
GLU-LYS-ARG 1,0 79319 ± 4435 +17
GLU-LYS-ARG 10,0 K72666 ± 19568 +7
ARG-LYS-GLU-ARG-D-ALA-ARG 0,1 73582 ± 4843 +8
ARG-LYS-GLU-ARG-D-ALA-ARG 1,0 96977 ± 10762 +43
ARG-LYS-GLU-ARG-D-ALA-ARG 10,0 93568 ± 7191 +38
ARG-ALA-ARG-ARG-LYS-GLU 0,1 72178 ±7076 +6
ARG-ALA-ARG-ARG-LYS-GLU 1,0 70260 ± 6782 +3
ARG-ALA-ARG-ARG-LYS-GLU 10,0 84390 ± 345 +24
Összehasonlításképpen
ARG-LYS-GLU 0,01 39489 ± 11833 -42
0,1 64037 ± 8286 -6
1,0 75193 ± 13076 +11
10,0 84472 ± 8901 +24
PHA-val aktivált sejtek IL-2,BCGF és y-IFN in vitro termelésének stimulálása
Humán T-limfocitákat PHA-val inkubáltunk 1 pg peptid jelenlétében vagy anélkül IL-2 esetén 24 óra hosszat, BCGF esetén 72 óra hosszat és gamma-interferon (γ-IFN) esetén 36 óra hosszat.
A felülúszókat összegyűjtöttük, leszűrtük, (0,2 pm), és IL-2, illetve BCGF aktivitásra vizsgáltuk, hosszú ideig tenyésztett, friss T-lífocitákhoz, illetve Bsejtekhez adva különböző koncentrációban. Az említett sejtek megfelelő növekedési faktor jelenlététől függő szaporodóképességét 3H-timidin beépülése alapján értékeltük ki.
A γ-interferon aktivitást a felülúszóban ELISA-kit (AMGEN) segítségével értékeltük ki. A következő táblázatban összefoglalt eredmények azt mutatják, hogy a peptidek stimulálják a limf okin termelést.
HU 204071 Β
11. táblázat
Felöl úszó % IL-2termelés (beötés/perc)
COÍÍIRARG-LYS-GLU-ARG-ALA-ARG ARG-ALA-ARG-ARG-LYS-GLU
X*+/-SE. X*+/-SK Δ% X*+/-SJS. Δ»
3,125 2366 4482 +90 4601 +94
395 625 570
6,25 4528 12813 +183 15053 +232
802 2925 3303
12,5 8312 18938. +128 21682.. +161
1522 1760 1612
25 15616 24144. +55 28808.. +84
1823 1753 · 1155
50 19166 26535 +38 32777. +71
2459 1400 2054
♦= 4 érték átlaga
.-P,05;_-P,01
12. táblázat
Felöl BCGF termelés (beötés/per)
úszó
CONTRARG-LYS-GLU-ARG-ALA-ARG ARG-ALA-ARG-ARG-LYS-GLU
% X*+/-SK X*+/-SE Δ% X*+/-SK Δ%
3,125 2042 3779 +85 4923 +141
259 232 1820
6,25 4975 14092.. +183 16165.. +225
638 937 1569
12,5 9798 20354. +108 23538.. +150
608 1459 2356
25 15605 23821. +53 28953.. +86
1458 1007 1809
50 20129 28966. +44 300215. +49
1883 1139 1814
*« 4 érték átlaga
,-P,05;--P,01
13. táblázat
Felöl- IL-2 termelés (beötés/perc)
úszó
% Kontroll GLU-LYS-ARG
X±SK X±55SK Δ%
3.125 2351 4237 +80
514 48
62 4681 15877 +239
516 1986
12,5 11397 24414 +114
524 2928
25 18009 30912 +72
2835 1729
50 15470 29269 +89
608 519
HU 204071 Β
14. táblázat
Felül- úszó % BCGF termelés (beütés/perc)
Kontroll X ± SJB. GLU-LYS-ARG
X±55S£. Δ%
3,125 2803 4854 +73
66 1008
6,2 5653 13995 +148
1774 5827
12,5 10347 20765 +101
2529 4873
25 18236 26208 +44
2609 3473
50 18868 27983 +48
2725 2173
15. táblázat
Peptid Gamma-interferon termelés (egység/ml)
X+/-SR Δ%
Kontroll 54,5
6,2
ARG-LYS-GLU-ARG-ALA-ARG 87,3 +60
3,0 *
ARG-ALA-ARG-ARG-LYS-GLU 112,8 +107
3,2
ConA-val stimulált humán sejtek in vitro IL-2 termelése
Egészséges önkéntesektől nyert PBMC-t egy éjszakán át inkubáltunk különböző peptidekkel, és az IL-2 termelést ELISA teszt segítségével analizáltuk, 30 és 60 perces leolvasással. A sejteket 10 μg/πll ConA-val aktiváltuk. Az eredmények (16. táblázat) azt mutatják, hogy az ismert tripeptideknek a humán sejtek in vitro IL-2 termelésre kifejtett hatása ellentmondó, ezzel szemben a találmány szerinti tripeptid és hexapeptidek jelentősen fokozzák az IL-2 termelést.
16. táblázat
Humán sejtek in vitro IL-2 termelése
Kezelés Peptid konc.(mg/ml) IL-2 Δ»
30 perc E/ml után Δ% 60 perc E/ml
PBMC - 1,0 - ,8 -
PBMC+ConA 1,45 - 1,45 -
GLU-LYS-ARG 1,0 2,3 +59 1,8 +24
ARG-LYS-GLU-ARG-ALA-ARG 1,0 2,3 +59 2,0 +38
ARG-LYS-GLU-ARG-ALA-ARG 10,0 2,0 +38 1,95 +34
ARG-LYS-GLU-ARG-D-ALA-ARG 1,0 4,5 +210 2,5 +72
Összehasonlításképpen;
ARG-LYS-GLU 1,0 1,0 -31 1,05 -28
10,0 1,7 +17 1,7 +17
ARG-ALA-ARGA 1,0 1,35 -7 1,3 -10
10,0 1,2 -17 1,35 -7
Ηϋ 204071 Β
ConA-val aktivált humán sejtek in vitro gammaintenferon termelése
Egészséges önkéntesektől nyert pBMC-t inkuháltunk egy éjszakán át 2,5 pg/ml ConA-val és peptidekkel. A felülúszót gamma-interferon jelenlétére vizsgáltukELISA teszt segítségével.
Amint a 17. táblázatbóllátható a ConA-val aktivált humán sejtek in vitro gamma-interferon-tennelését az ismert tripeptidek csak csekély mértékben, a találmány szerinti hexa- és nonapeptidek ennél jobban f o5 kozzák különösen jelentős a nonapeptid 10,0 pg/ml koncentrációjánál élért +85%-os fokozás.
17. táblázat
Kezelés Peptidkonc. (pg/ml γ-interferon egység/ml Δ%
ConA - 5,4 -
ARG-LYS-GLU-ARG-D-ALA-ARG 1,0 5,4 -
ARG-LYS-GLU-ARG-D-ALA-ARG 10,0 6,8 +26
ARG-ALA-ARG-ARG-LYS-GLU 1,0 5,5 +2
ARG-ALA-ARG-ARG-LYS-GLU 10,0 6,2 +15
ARG-ALA-ARG-ARG-LYS-
GLU-ARG-ALA-ARG 1,0 5,4 0
ARG-ALA-ARG-ARG-LYS-
GLU-ARG-ALA-ARG 10,0 10,0 +85
Összehasonlításképpen
ARG-LYS-GLU 11,0 5,5 +2
10,0 6,0 +11
ARG-ALA-ARG 10,0 5,8 +7
Mitogénnel indukált szaporodás ex-vivo stimulálása
Amitogénnel indukált szaporodás stimulálásátúgy vizsgáltuk, hogy a peptideket orálisan vagy i.p. úton adagoltuk csupasz tönuszmentes egereknek (testtömeg: 28 g) 10 pgfegér dózisban, naponta 5 napon át, 2 vagy 6 hétig. Az állatokat az utolsó kezelés után 24 órával leöltük, és a DNS szaporodást a lépsejtek által felvett jelzett timidin alapján határoztuk meg. Mitogénként fitohemogglutinint (PHA), konkanavalin A-t (ConA) és alkönnös mitogént (PWM) használtunk.
A táblázatokban megadott kontroll csoport állatai
PBS-t kaptak, amely a kezelt állatoknál a peptidek vivőanyaga volt.
Az eredményeket a 18-24. táblázatban adjuk meg. Amint a táblázatokból látható a lépsejtek mitogénnel (ConA-val) indukált sokszorozódását az ismert tripeptid csak a 0 és a0,625 pg/ml mitogén-koncentrációnál stimulálja (lásd 21. táblázatot), míg a találmány szerinti peptidek ennél jelentősen aktívabbak, kivéve a nonapeptidet. A nonapeptid viszont a PWM-mel történő indukálás esetén megfelelően aktív (lásd 20. táblázatot).
18. táblázat
Mitogénnel indukált sokszorozódás 5 napig 10 pg/egér dózisban ARG-LYS-GLU-ARG-ALA-ARGpeptiddel orálisan kezelt csupasz egerekben (beüt/perc. átlag ± SE.)
Mitogén % Kontroll Peptid Δ%
PHA 0,00 614 ± 234 630 ±379 +3
0,15 1109 ± 511 1515 ±786 +37
0,31 3043 ±519 2965 ± 850 +45
0,62 1230 ± 104 3047 ±72 +145
1,25 1215 ± 116 6034 ± 2962 +397
2,50 954 ± 182 3738 ± 910 +292
ConA 0,00 839 ±657 1093 ± 902 +30
0,62 903 ±3 1752 ± 83 +94
1,25 805 ± 91 2152 ± 297 +167
2,50 359 ± 143 1657 ±636 +362
5,00 197 ± 17 946 ± 323 +380
10,00 286 ± 50 1071 ± 308 +274
HU 204071 Β
19. táblázat
PWM-rel indukált sokszorozódás 5 napig 10 μg/egér dózisban ARG-LYS-GLU-ARG-D-ALA-ARG pepiiddel kezelt csupasz egerekben (beütés/perc) (átlag ± S.E.)
%PWM Adagolás módja Kontroll Peptid Δ%
0,00 orális 914 ± 336 888 ± 97 -3
0,15 orális 867 ± 291 3914 ± 1055 +351
0,31 orális 2855 + 1279 7076 ± 777 +148
0,62 orális 1246 ± 549 2821 ± 1476 +126
1,25 orális 681 ± 168 657 ± 170 -4
2,50 orális 272 ± 150 634 ± 30 -13
0,00 i-P· 1728 ± 501 2103 ± 351 +22
0,15 i.p. 5352 ± 2925 9028 ± 1642 +69
0,31 i.p. 3882 + 1654 7027 ± 1059 081
0,62 i.p. 2501 ± 1353 5999 ± 3205 +140
1.25 i.p. 2334 ± 920 4187 ± 842 ' +79
2,50 i.p. 2609 ± 1561 4201 ± 2139 +61
20. táblázat
Mitogénnel indukált sokszorozódás 5 napig 10 ^g/egér dózisban peptidekkel orálisan kezelt csupasz egerekben (beültetés/perc, átlag ± S.E.)
Mitogén % Kontroll X ± S.E. GLU-LYS- ARG X±S.E.A% ARG-LYS- -GLU-ARG -D-ALA-ARG X±S.E.A% ARG-ALA- -ARG-ARG- -LYS-GLU X±S.EA% ARG-ALA-ARG- -LYS-ARG-GLU- -ARG-ALA-ARG X±SE.A%
PHA
0,000 379 ± 43 860 ±145+127 628 ±68+66 422 ± 104+17 499 ± 4+32
0,125 323 ±9 660 ± 94+104 800 ± 105+148 284 ± 3+19 374 ± 21+16
0,250 490 ± 229 953 ± 10+93 1066 ±203+118 617 ± 91+26 573 ± 63+17
0,500 476 ± 61 1435 ± 35+202 2313 ±829+386 827 ± 59+74 934 ± 432+96
1,000 675 ± 90 2948 ± 395+337 3922 ± 15+48 2652 ± 666+293 622 ± 118-8
2,000 2937 ± 1931 . 3675 ±85+25 2968 ± 14303 3266 ± 1469+11 2741 ± 1679-7
PWM
0,000 504 ± 139 881 ± 33+75 1397 ± 106+177 405 ± 18-20 421 ± 81-17
0,125 393 ± 30 1981 ± 257+404 1661 ± 53+323 588 ± 58+50 610 ± 3+55
0,250 633 ± 164 2627 ± 691+315 1788 ± 199+182 644 ± 112+2 811 ± 11+28
0,500 524 ±9 4655 ± 558+788 2525 ± 323+382 613 ± 10+17 1168 ± 50+123
1,000 569 ± 6 4801 ± 1440+744 2735 ± 412+381 752 ± 72+32 930 ± 32+63
2,000 991 ± 324 4993 ± 1223+404 2511 ± 18+152 886 ± 189-11 1151 ± 23+16
ConA
0,000 314 ± 23 897 ± 25+163 1080 ± 246+217 440 ± 41+29 352 ± 3+3
0,312 402 ± 57 4818$ ± 0+1099 3860* ± 441+860 559 ± 40+39 514 ± 3+28
0,625 450 ± 13 111083 ± 252+2368 57213 ± 194+1171 1191* ± 92+165 484 ± 150+8
1,250 706 ± 99 27398 ± 1280+3781 6493 ± 277+883 3234 ± 806+358 694 ± 103-2
2,500 720 ± 91 73703 ± 6790+10137 5527 ± 1421+668 4861* ± 720+575 741 ± 16+3
5,000 1700 ± 806 52567* ± 11504+2992 4479 ± 743+163 14857 ± 9644+774 l· 1783 ± 12+5
*p 0,05;
p 0,01;
Sp.OOl.
HU 204071 Β
21. táblázat
Mitogénnelindukáltsokszorozódás 5 napig 10 pg/egér dózisban ismert pepiiddel orálisan kezelt csupasz egerekben (beütés/perc; átlag ± SJE.) Összehasonlításképpen: ARG-LYS-GLU
Mitogén % Peptid X±S/E. %
ConA 0,000 525 ±66 +54
0,312 501 ±61 +25
0,625 600* ±32 +33
1,250 563 ±70 -20
2,500 834 ± 25 +16
5,000 1353 ± 375 -20
*-p0,05 22. táblázat
Mitogénneol indukált sokszorozódás 2 hétig 10 pg/egér dózisban
orálisankezelt csupasz egerekben (beütés/perc, átlag ± SK)
Mitogén % Kontroll GLÜ-LYS-ARG Δ%
PHA 0,00 4140 ± 196 4672 ± 131 +13
0,50 4201 ±506 6876 ±963 +63
0,75 4098 ±301 7740 ± 630 +89
1,00 4607 ±533 19842 ± 594 +383
2,00 4470 ± 343 35657±619 +698
ConA 0,00 4269 ± 587 3528 ±516 -18
0,50 4272 ±77 113536 ± 17906 +2558
0,75 3896 ± 384 73952 ±4889 +1798
1,00 4194 ±709 6805 ± 389 +62
2,00 1517 ± 362 762 ±240 -50
PWM 0,00 1363 ± 162 2319 ±220 +70
0,50 2074 ± 206 22126 ±2811 +967
0,75 1990 ± 28 21448 ± 717 +987
1,00 2351 ± 873 21919 ± 2506 +832
2,00 1602 ± 109 12816 ± 839 +700
23. táblázat
Mitogénnel indukált sokszorozódás 6 hétig 10 pg/egér dózisban orálisan kezelt csupasz egerekben (beütés/perc, átlag ± S.E.)
Mitogén % Kontroll GLÜ-LYS-ARG Δ%
ConA 0,00 1001 ±587 2671 ± 331 +167
0,25 3568 ±71 4825 ± 877 +35
0,50 2670 ±39 5311 ± 1030 +99
1,00 3103 ± 123 7361 ± 404 +137
2,00 2128 ± 106 3141 ± 101 +48
4,00 853 ± 16 959 ±221 +12
PWM 0,00 1228 ± 175 3779 ± 1142 +208
0,125 779 ±50 2264 ± 198 +191
0,25 1106 ± 167 2124 ± 141 +14
0,50 2322 ±299 2646 ± 141 +14
1,00 1146 ±476 2616 ±64 +128
2,00 898 ± 323 2607 ± 584 +190
HU 204071 Β
24. táblázat
Mitogénnel indukált sokszorozódás 6 hétig 10 pg/egér dózisban i.p. kezelt csupasz egerekben (beütés/perc, átlag ± S.E.)
Mitogén % Kontroll GLU-LYS-ARG Δ%
CnoA 0,00 2015 ± 159 2583 ± 491 +28
0,25 2084 ± 101 6486 ± 388 +211
0,50 2313 ± 157 10099 ± 584 +337
1,00 3289 ± 133 17192 ± 169 +334
2,00 2498 ± 647 10850 ± 1459 +334
4,00 1525 ± 107 2472 ± 901 +62
PWM 0,00 1936 ± 150 2856 ± 113 +48
0,125 2464 ± 297 3437 ± 914 +39
0,25 2991 ± 95 3955 ± 193 +32
0,50 2434 ± 540 3503 ± 502 +44
1,00 3177 ± 292 3246 ± 860 +3 ’
2,00 2509 ± 359 2453 ± 467 -2
4. Példa
Akut toxicitás
A találmány szerinti eljárással előállított peptidek LD j0 értéke magasabb, mint 500 mg/kg i.p. egérben.
Összefoglalásképpen elmondhatjuk: a találmány szerinti peptidek immunofarmakológiai profilja, valamint az érett humán és rágcsálóT-sejtek in vitro és in vivő stimulálása alapján megállapítható, hogy az új peptidek sokkal aktívabba, mint az ismert Arg-LysGlu és Arg-Ala-Arg tripeptidek. Ez különösen akkor nyilvánvaló, ha az összehasonlítást nem tömegre, hanem mólra vonatkoztatjuk.

Claims (2)

  1. SZABADALMIIGÉNYPONTOK
    1. Eljárás (I) általános képletű peptidek és savaddíciós sóik előállítására A-x-Lys-yB (I) ahol
    A jelentése hidrogénatom, egy Arg-Ala-Arg képletű tripeptid vagy egy Glu-Lys-Arg-Arg-Ala-Arg képletű hexapeptid, x és Y egymástól eltérő, és/vagy arginin maradékot (Arg), vagy glutaminsavmaradékot (Glu) képvisel,
    B jelentése hidroxilcsoportvagy Arg-Ala-Arg képletű tripeptid, azzal a megkötéssel, hogy ha A jelentése hidrogénatom és x jelentése Arg, akkor B jelentése hidroxilcsoporttól eltérő, azzal jellemezve, hogy apeptidlánc C-terminális aminosavának megfelelő Boc-csoporttal védett aminosavat alkalmas gyantához kötjük, azN-terminálisról aBoc-csoportot eltávolítjuk, majd a peptidláncnak megfelelő sorrendben a többi Boc-cso30 porttal védett aminosavt a gyantához kötött aminosavhoz kapcsoljuk, végül a védőcsoportokat eltávolítjuk, a kapott pepiidet a gyantáról lehasítjuk, és kívánt esetben savaddíciós sóvá alakít juk.
  2. 2. Eljárás gyógyszerkészítmények előállítására, az35 zal jellemezve, hogy valamely, az 1. igénypont szerinti eljárással előállított pepiidet vagy farmakológiailag elfogadható savaddíciós sóját a gyógyszerkészítésben szokásos hordozó-, hígító- és/vagy egyéb segédanyagokkal összekeverve gyógyszerkészítménnyé alakí40 tünk.
HU893902A 1988-07-29 1989-07-28 Process for producing immune stimulant peptides and pharmaceutical compositions comprising same HU204071B (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
IT8821556A IT1226552B (it) 1988-07-29 1988-07-29 Peptidi immunostimolanti.

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HUT53914A HUT53914A (en) 1990-12-28
HU204071B true HU204071B (en) 1991-11-28

Family

ID=11183555

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU893902A HU204071B (en) 1988-07-29 1989-07-28 Process for producing immune stimulant peptides and pharmaceutical compositions comprising same

Country Status (9)

Country Link
US (1) US5079231A (hu)
EP (1) EP0353565B1 (hu)
JP (1) JPH0288595A (hu)
AT (1) ATE87315T1 (hu)
DE (2) DE68905552T2 (hu)
ES (1) ES2013584A4 (hu)
GR (1) GR900300062T1 (hu)
HU (1) HU204071B (hu)
IT (1) IT1226552B (hu)

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU9140891A (en) * 1990-11-23 1992-06-25 Immunodynamics, Inc. Synthetic immunoactive peptides having immunomodulating and therapeutic activities
US5492894A (en) * 1991-03-21 1996-02-20 The Procter & Gamble Company Compositions for treating wrinkles comprising a peptide
CA2143823C (en) 1992-08-27 2005-07-26 Alfio Comis Retro-, inverso - and retro-inverso synthetic peptide analogues
US6080719A (en) * 1996-02-23 2000-06-27 Hoechst Aktiengesellschaft Cyclohexapeptides and their mixtures, a process for preparing them, and their use
AU8912698A (en) 1997-08-19 1999-03-08 University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey Inhibition of hiv-1 replication using d-amino acid peptides
FR2806727A1 (fr) * 2000-03-23 2001-09-28 Pf Medicament Molecule d'interet pharmaceutique comprotant en son extremite n-terminale un acide glutamique ou une glutamine sous forme de sel d'addition d'acide fort physiologiquement acceptable
BR0313429A (pt) * 2002-08-13 2007-07-31 Wyeth Corp peptìdeos como excipientes solubilizantes para proteìnas do fator de crescimento beta de transformação
WO2008150025A1 (ja) * 2007-06-05 2008-12-11 Oriental Yeast Co., Ltd. 新しい骨量増加薬
CN102234314B (zh) * 2010-04-29 2014-07-09 上海医药工业研究院 一组蛇毒来源的活性肽的制备方法及其在抗肿瘤方面的应用
KR101791526B1 (ko) * 2016-02-18 2017-11-01 (주)케어젠 발모 촉진 활성을 나타내는 펩타이드 및 이의 용도
US20210380639A1 (en) * 2018-05-15 2021-12-09 Interk Peptide Therapeutics Limited Activating Agents
CN112399970A (zh) 2018-05-15 2021-02-23 英特肽治疗有限公司 肽活化剂

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
HU164903B (hu) * 1969-04-05 1974-05-28
CH665645A5 (fr) * 1981-07-09 1988-05-31 Michel Flork Derives de dipeptides et leur procede de preparation.
US4581168A (en) * 1983-02-21 1986-04-08 Sanofi Synthesis of hpGRF (Somatocrinin) in liquid phase and intermediate peptides
DE3401545A1 (de) * 1983-08-03 1985-02-14 Hoechst Ag, 6230 Frankfurt Neue peptide mit immunstimulierender wirkung, verfahren zu deren herstellung und deren verwendung
US4505853A (en) * 1983-11-18 1985-03-19 Ortho Pharmaceutical Corporation Enzyme-resistant immunomodulatory peptides
FR2567524B1 (fr) * 1984-07-10 1987-11-27 Sanofi Sa Procede de synthese de la somatocrinine en phase liquide et peptides intermediaires
US4654419A (en) * 1984-08-08 1987-03-31 Scripps Clinic And Research Foundation Synthetic polypeptides and antibodies related to epstein-barr virus nuclear antigen
WO1987002775A1 (en) * 1985-10-24 1987-05-07 Southwest Foundation For Biomedical Research Synthetic peptides and use for diagnosis and vaccination for aids and arc
IT1188645B (it) * 1986-04-09 1988-01-20 Ellem Ind Farmaceutica Tripeptide ad attivita' immunostimolante
IT1222437B (it) * 1987-08-04 1990-09-05 Ellem Ind Farmaceutica Tripeptidi utili come immunostimolanti e nella prevenzione delle metastasi e relativo procedimento di preparazione

Also Published As

Publication number Publication date
ATE87315T1 (de) 1993-04-15
DE68905552D1 (de) 1993-04-29
EP0353565B1 (en) 1993-03-24
EP0353565A1 (en) 1990-02-07
US5079231A (en) 1992-01-07
HUT53914A (en) 1990-12-28
JPH0288595A (ja) 1990-03-28
ES2013584A4 (es) 1990-05-16
GR900300062T1 (en) 1991-07-31
IT1226552B (it) 1991-01-24
IT8821556A0 (it) 1988-07-29
DE68905552T2 (de) 1993-07-15
DE353565T1 (de) 1990-06-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2126014C1 (ru) Пептид или его органические или неорганические соли, способ получения, фармацевтическая композиция, способы стимулирования высвобождения гормона роста и увеличения его содержания в крови
CA2091873C (en) Parathyroid hormone derivatives
US4748232A (en) Peptide production and use thereof
JPH05163298A (ja) 新規ポリペプチドおよびこれを用いる抗ｈｉｖ剤
KR100225679B1 (ko) 노나펩티드 봄베신 길항제
NZ228677A (en) Calcitonin derivatives or analogues thereof
HU204071B (en) Process for producing immune stimulant peptides and pharmaceutical compositions comprising same
CA2069943A1 (en) Synthetic calcitonin peptides
AU673431B2 (en) Motilin-like polypeptides that inhibit gastrointestinal motor activity
JPS59139347A (ja) Ｇｒｆ類似体
EP0155786A2 (en) New peptide, and production and use thereof
NZ263668A (en) Bombesin antagonist peptides and compositions thereof
JPS62116595A (ja) 新規化合物、その製法及びそれを含む医薬組成物
HUT61579A (en) Process for producing polypeptides and pharmaceutical compositions with anti-hiv activity, comprising same as active ingredient
CA2051157A1 (en) Neurotrophic peptide derivatives
EP0181121B1 (en) Novel polypeptide and process for producing the same
JPS6033854B2 (ja) 中枢神経系作用を有するトリペプチド誘導体およびその製法
US6051685A (en) Peptide derivatives
EP0755942B1 (en) N-amidino dermorphin derivative
US4497801A (en) New peptides, process for preparation thereof and use thereof
US5225400A (en) Immunostimulating peptides, a process for their preparation and pharmaceutical compositions containing them
EA001001B1 (ru) Производные пептидов
Meldal et al. Synthesis of a proposed antigenic hexapeptide from Escherichia coli K88 protein fimbriae
HU187503B (en) Process for preparing gonadoliberine derivatives containing beta-aspartyl group
CA1041088A (en) Val27, ala29-salmon calcitonin

Legal Events

Date Code Title Description
HMM4 Cancellation of final prot. due to non-payment of fee