HU199878B

HU199878B - Process for producing acylated splenopentynes and pharmaceutical compositions comprising such compounds as active ingredient

Info

Publication number: HU199878B
Application number: HU883100A
Authority: HU
Inventors: Klaus Forner; Angelika Ehrlich; Wolfgang Diezel; Rolf Eckert; Elke Euthin; Eberhard Krause; Peter Slonina; Manfred Schuett; Renate Mentel; Winfried Breustedt; Hans-Dieter Volk; Heinrich Repke; Monika Georgi; Martina Leidert; Michael Bienert; Michail Ovcinnikov; Ralph Schmidt
Original assignee: Berlin Chemie Veb
Priority date: 1987-06-19
Filing date: 1988-06-16
Publication date: 1990-03-28
Also published as: DE3850196D1; JPS6485998A; EP0307553A3; EP0307553B1; ATE107311T1; HUT47310A; ES2056858T3; EP0307553A2

Description

A találmány tárgya eljárás új splenopentin Arg-Lys-G 1 u-Val-Tyr pentapept id-származékok előállítására és tisztítására. Ezeket a vegyületeket immunbiológiailag hatékony gyógyszerkészítményekben lehet használni.

A splenopentint és származékait az orvosi terápiában immunregulátorként alkalmazzák. A találmány alkalmazási területe tehát a gyógyszeripar.

Az elmúlt években számos kísérletet végeztek azon peptidek izolálására és jellemzésére, amelyek az immunrendszert befolyásolják. így izolálták a limopoielint és a splenint a timuszból, illetve a lépből (T. Audhya és munkatársai: Biochemistry 20, 6195/1981/).

Annak ellenére, hogy különböző szervből származnak, ezeknek a peptideknek messzemenőkig hasonló a szerkezetük: 49 aminosavból állnak és mindössze a 34-es helyzetben tér el a szekvenciájuk; aszparaginsav, illetve glutaminsav található bennük. Biológiai aktivitásuk szempontjából azonban lényegesen eltérnek egymástól. A timopoietinek a neuromuszkuláris transzmissziót befolyásolják (M.P. Scheid és munkatársai: J. Exp. Med. 147, 1727 /1987/), a korábbi T-sejtek differenciálódását stimulálják, és a korábbi B-sejtek differenciálását gátolják.

A splenin ezzel szemben a T- és a B-sejtek differenciálását stimulálja és nincsen neuroaktivitása. A splenin teljes molekula biológiai hatás minőségét a 32 — 36 rész-szekvenciája, Arg-Lys-Glu-Val-Tyr (splenopentin) reprodukálja.

A biológiailag aktív anyagok előállítása egyre nagyobb mértékben magával vonja a nagyérzékenységű és gazdaságilag hatásos kromatográfiai tisztítási eljárásokat is. Elsősorban azok az eljárások jönnek szóba, amelyeknél egyszerű hordozó- és futtatószer-rendszer alkalmazása mellett nagy az anyagáthaladás, egyenletesen jó a reprodukálhatóság és nagy a rendszer rezolúció.

A különböző acilezett splenopentin peptidek kromatográfiás elválasztásához, mivel a nagyszámú komponens esetében kicsik a töltés és ezáltal a polaritás különbségek, költséges és bonyolult kromatográfiás technikák alkalmazására van szükség. Előnyösen alkalmazhatók itt a HPLCeljárások, RP (reverz fázisú) szilikagél alapon, valamint a normál szilikagél fázisokon végzett adszorpciós vagy megoszlásos kromatográfiás módszerek.

A 3.421.614. számú német szövetségi köztársaság-beli (1984) szabadalmi leírásban splenopentinck kromatográfiás tisztítását szilikagél normál fázison, metil-klorid tartalmú futtatószerekkel javasolják. Javasolják ezenkívül a szintetikus splenopentin nyerstermékek kromatográfiás elválasztását adszorpciós, illetve megoszlásos kromatográfiával Kiesel-gél 60-on piridintartalmú szerves oldószerekkel. Hasonló elválasztási eljárást javasolnak a 2.804.566. számú német szövetségi köztársaságbeli I\9TII szabadalmi leírásban timopentin, illetve monoacetil-timopentin tisztítására.

Az RP- vagy normálfázisú szilikagélbázisú eljárások hátránya, hogy költséges készülékeket és anyagokat kell használni hozzá. így nagymennyiségű, nagytisztaságú termék előállítására ezek nem alkalmazhatók. További tényezők, amelyek ezek felhasználhatóságát korlátozzák: a rendszer kis kapacitása, a specifikus adszorpció miatti alacsony reprodukálhatósága, valamint a nem megfelelő rezolúciós képessége.

A peptidek tisztítására alkalmazott szokásos ioncserélő kromatográfiás eljárások az eluálási folyamat alatt sókat alkalmaznak. így például a 2.732.587. számú német szövetségi köztársaságbeli és 3.617.646. számú német szövetségi köztársaságbeli szabadalmi leírásban ismertetett kromatográfiás eljárások nona-, illetve dekapeptidek tisztítására karboxi-metil-cellulózt és nátrium-kloridot, illetve ammónium-acetátot tartalmazó eluálószerekkel dolgoznak. Az anyagok tisztításához ezután mindig egy költséges sótalanítás is szükséges.

A találmány feladata ezért eljárás kidolgozni új, immunológiáiig hatékony splenopentin•származékok (SP5-származékok) előállítására és tisztítására. A találmány feladata továbbá immunbiológiailag hatásos gyógyszerkészítmények előállítása is.

A feladatot az alábbiak szerint oldottuk meg.

A találmány tárgya eljárás új, (I) általános képletű acilezett splenopentinek (Acil-SP5) előállítására - a képletben

R¹ jelentése hidrogénatom vagy 1—18 szénatomos alkanoilcsoport,

R² jelentése hidrogénatom vagy 1 — 18 szénatomos alkanoilcsoport,

R⁴ jelentése hidroxilcsoport, aminocsoport vagy egy OR⁵ általános képletű csoport, ahol R⁵jelentése 1 — 4 szénatomos alkílcsoport, azzal a megkötéssel, hogy R¹ és R² közül legalább az egyik hidrogénatomtól eltérő.

A találmány szerinti eljárást splenopentin-származékok előállítására úgy végezzük, hogy splenopentint, valamint részlegesen védett splenopentint egy ZR általános képletű acilezőszerrel, ahol

Z jelentése reakcióképes csoport és

R jelentése 1 — 18 szénatomos alkanoilcsoport, reagáltatunk, és így szelektíven acilezzük az arginint és/vagy a lizint N-helyzetben és/vagy a tirozint O-helyzetben.

Azt tapasztaltuk, hogy mind a mono-, mind a diacil splenopentinek előállításához acilezőszerként előnyösen alkalmazhatók, az N-hidroxi-norborn-5-én-2,3-dikarboxamid-1 — 18 szénatomos karbonsavakkal alkotott észterei.

A mono- és a diacetilezett splenopentineket előnyösen N-acetoxi-norborn-5-én-2,3-dikarboximid (acetil-ONB) vagy 1-acetoxi-benzotriazol (acetil-OBt) alkalmazásával állítjuk elő.

A mono- és a diformil-splenopentinek előállítását előnyösen végezhetjük formil-ONB vagy formil OBt alkalmazásával

Azt tapasztaltuk, hogy az acetilezöszerként először alkalmazott acetil-ONB felhasználása különleges előnyökkel jár. Hidrolízissel szembeni nagy stabilitása miatt igen jó a tárolási stabilitása és acetilezésre mind szerves, mind vizes kö-21

HU 199878 Β zegben alkalmazható. Elsősorban az aminocsoportokkal szembeni nagy reakcióképessége miatt bázis hozzáadása nélkül is rendkívül rövid idő alatt reagál. A reakció során keletkező N-hidroxi-norborn-5-én-2,3-dikarboxamid könnyen elválasztható és nem toxikus, így alkalmazása mindenekelőtt a gyógyszeriparban különösen előnyös.

Ezekkel az acilezószerekkel a mono- és a diacil-vegyületeket jó kitermeléssel (az elméleti 90%-a), nemkívánatos mellékreakciók nélkül állíthatjuk elő. Ha az acilezést tercier-aminok jelenlétében végezzük, a megfelelő triacil-vegyületeket kapjuk.

A kapott acilezett splenopentinek tisztítását különösen előnyösen kromatográfiásan végezzük karboxilezett kationcserélőkön, vizes eluálórendszerekben 10’² és 10’⁵ mól/1 közötti ionerősségnél. Hordozóanyagként előnyösen akrilsav/divinil-benzol kopoíimereket alkalmazunk. Az ioncserélő kromatográfiánál szokásos magas hordozó kapacitás esetén (5-10 mg peptid/ml oszloptérfogat) a találmány szerint az eluálást izokratikusan, vizes eluálószerekkel végezzük, a 10'² és 10⁵ mól/1 közötti szükséges ionerősséget savak hozzáadásával érjük el.

A triacetil-(N^a-Arg, N^£-Lys, O-Tyr)-splenopentin, triacetil-(N^a-Arg, N^-Arg, N*-Lys)-splenopentin, diacetil-(N^a-Arg, N^£-Lys)-splenopentin, mono-(N^a-Arg)-splenopentin, mono(N^£-Lys)-splennopentin, valamint D-Tyr-diacetil-(N^a-Arg, N^£-Lys)-splenopentin és L-Tyr-Diacetil-(N^a-Arg, N^£-Lys)-splenopentin-enantiomerek meglepő módon növekvő K’-értékkel eluálhatók és ezáltal polaritásuknak megfelelően elválaszthatók. Valamennyi elválasztott pepiidnél a reprodukálhatósági ráta nagyobb, mint 95%.

Különösen jó elválasztható hatást érünk el, ha olyan eluálószert alkalmazunk, amely 10-20% etanolt tartalmaz. Az eluálórendszerben a kis ionerősség miatt a peptideket a megfelelő frakciók besűrítésével és ezután a következő liofilizálásával egyszerűen és kíméletesen, analitikus RP-HPLC-vel meghatározott 98%-osnál nagyobb tisztaságban lehet izolálni.

Az egyéb eljárásoknál szükséges kiegészítő sótalanítási lépések itt elmaradnak. A találmány szerinti eljárás további előnye, hogy nem költséges kromatográfiás hordozóanyagokat alkalmaz, valamint az, hogy a hordozóanyag igen sokszor újra felhasználható (több, mint 100 kromatográfiás ciklusban).

Ha az így kapott új vegyületeket gyógyszerészeti célra alkalmas vivöanyaggal és/vagy gyógyszerészeti segédanyaggal keveijük össze, adagolásra alkalmas gyógyszerkészítményeket állíthatunk elő.

A splenopentin acilezésével elérjük azt a célt, hogy az enzimes lebontási stabilitást növeljük és ezáltal javítsuk a hatóanyag biológiai felhasználhatóságát.

Az immunológiai hatások kimutatására a következő modelleket alkalmazzuk: ' —T4-antigének mennyiségi növekedése emberi T-limfociták felületén szisztémás lupus éritematodes (SLE) betegeknél in vitro (8. példa,

1. táblázat.) és

- antitestképződés juh eritrocitákkal szemben (vérlemezke-képző lépsejtek) AB/Bln-egerekkel röntgen besugárzás után (8. példa, 2. táblázat).

A találmány szerint előállított acilezett splenopentineknek (Acil-SP5) további farmakológiai tulajdonságaik is vannak, elsősorban azok, amelyek az immunrendszer normalizálásával kapcsolatosak.

Ezért lehet felhasználta! őket a következő orvosi indikációknál:

— Vírusos infekciók kezelése (13. példa, 3.1-3.3. táblázat). Az Acil-SP5 alkalmas szernek bizonyult influenza vírusok ellen vagy pankreatitisz kezelésére a Coxsacki-vírussal történt fertőzés után. A vírussal szembeni immun védekezés stimulálásának mértékére megállapítottuk, hogy olyan vírusmennyiségek adagolása esetén, amelyek közepes erősségű fertőzéshez vezetnek, a betegség teljesen megakadályozható, másrészről azonos súlyosságú betegség kiváltásához szükséges vírusdózis a kezelés alatt mintegy 10-szer magasabb, mint a kezelés nélküli egyedeknél.

— Kemoterápia utáni kezelés (14. példa, 4.1. ábra, 4.1. táblázat). A szer alkalmas kemoterápiás kezelés utáni immunszupresszív állapot legyőzésére, például a rák kezelésénél vagy túladagolt ciklosporin terápia esetén.

Egerek ciklofoszfamid vagy dexametazon kezelése után a humorális immunválasz normalizálása Acil-SP5 adagolásával elérhető. Az AcilSP5-nek azonban nincsen hatása a normális antigén-specifikus humorális immunválasz kialakulására, így a hátrányos immunmoduláló mellékhatásokkal nem kell számolni (4.1. ábra).

Az Acil-SP5 származékok elősegítik az immunszupresszív terápia következtében szekunder immunhiánnyal rendelkező pácienseknél az immunrendszer gyorsított helyreállását (4.1. táblázat).

- Csontvelősejtek növekedésének és érésének stimulálása (15. példa, 5.1 —5.2. táblázat, 5.1 ábra). A találmány szerint előállított vegyületek in vitro alkalmazása az egér csontvelősejtekből származó törzskolóniák kialakulási sebességét növeli, ha azokat normál személyekből származó vagy SLE-pacié rockból származó leukocitákkal együtt agarban tenyésztjük. Az a tény, hogy az Acii-SP5 jelenlétében a kolóniák keletkezése megszaporodik, arra enged következtetni, hogy az Acil-SP5-tel közvetlenül a csontvelő éretlen törzssejtjeinek a proliferációja segíthető elő és/vagy az emberi leukociták az Acil-SP5 befolyása alatt koloniaképző faktorokat választanak ki (5.1. táblázat).

Egereknél szubletális besugárzás és csontvelőátültetés után a humorális immunválasz gyorsított helyreállása figyelhető meg (5.1. ábra).

A hatóanyagok alkalmazhatók immunszupresszív, illetve citosztatikus terápiánál, besugárzás után és csontvelőátültetés után. Azáltal hatnak, hogy specifikus képződési helyeik (receptoraik) vannak az emberi csontvelősejteken (külö-3HU 199878 Β nősen a törzssejteken), amelyek radioaktív ligandumok kötési vizsgálatával kimutathatók. Ilyen kötési helyek találhatók a timocitákon is, és ³Hjelzett splenopentinnel, vagy ¹²⁵í-jelzett D-AcilSP5-tel kimutathatók (5.2. táblázat).

— HIV-infekciók terápiájánál (16. példa, 6.1. táblázat és 6.Ϊ ábra). A D-AU-SP5 adagolás a HIV-fertőzött pácienseknél elősegíti az összes limfocitaszám növekedését a kontroll területen, valamint a CD3⁺-, CD4⁺- és DR⁺-sejtek abszolút számának növekedését, valamint a CD4⁺/CD8⁺-viszony javulását. 16 hetes terápia után sem léptek fel mellékhatások (6.1. táblázat).

Ha kombinációban alkalmazzuk, az AIDS-terápiában használatos citosztatikummal és a revertáz-gátlóval, az azido-timidinnel vagy annak hatékonyabb változatával, a fluor-timidinnel, akkor gyorsabban normalizálódnak azok az immunrendszerben bekövetkezett hátrányos elváltozások, amelyeket ezek az anyagok okoznak (6.1. ábra).

- Immunszupresszív hatás megakadályozása krónikus intoxikáció esetén (17. példa, 7. táblázat). Az Acil-SP5 azáltal hat, hogy megszűnteti az alkohol és egyéb krónikusan ható noxa által kiváltott antigén specifikus humorális immunreakció szupressziót, megszünteti a fagocita-sejtek számának, illetve aktivitásának csökkenését és megakadályozza a timusz és a lép perciális atro fiáját.

— Autoimmun reakciók terápiája (18. példa,

8.1 — 8.2 táblázat). A találmány szerint előállított anyagok megfelelnek különböző olyan betegségek terápiájánál, amelyeknél az utoimmun reakció példáján ábrázolva /8.1. táblázat/). Ilyen például a reumatoid artritisz, az SLE és az atopiás reakciók.

A sikeres immunizálás után azonban nem segítik elő az antigén-specifikus antikörpertiter hátrányos csökkenését (8.2. táblázat).

A következőkben néhány példán keresztül közelebbről is bemutatjuk a találmányt.

Kiviteli példák

A példákban alkalmazott rövidítések:

M: mono-; D: di-; Pal: palmitoil-, Ac: acetil.

1. példa

Arginil-(N--acetil-Iizil)-glutamil-valil-tirozin-(N£-MAc-Sp5) előállítása

1.1 Acilezés

1,83 g (2 mmól) Boc-Arg-Lys-Glu-Val-Tyr-OH x 2HOAc-t 5 ml dimetil-formamidban oldunk és hozzáadunk 0,487 g (2,2 mmól) acetil-ONB-t. Egy óra után a reakcióelegyet normál sósavba öntjük, a kicsapódó terméket leszűijük, vízzel semlegesre mossuk. Metanol/etil-acetát keverékéből átkristályosítjuk és így 1,72 g Boc-Arg-Lys(Ac)-Glu-Val-Tyr-OH x HOAc-t kapunk. Kitermelés: az elméleti 96,3%-a.

1.2 A védőcsoport lehasítása

1,34 g (1,5 mmól) Boc-Arg-Lys(Ac)-Glu-Val-Tyr-OH x HOAc-t 30 percig 10 nil trifluor-ecetsav/diklór-ctán 1:1 arányú keverékkel kezelünk és a felesleges trifluor-ecetsav ledesztillálása után metanolból éterrel kicsapjuk. Kitermelés: 1,34 g Arg-Lys(Ac)-Glu-Val-Tyr-OH x 2TFA, az elméleti 98,2%-a.

Híg sósavból való liofilizálással a megfelelő N^É-MAc—SP5 x 2HCl-t kapjuk. Molekulatömeg: 808,75. Összegképlet: CjjHjjNjOiqCIj. Rf = 0,34 (N-butanol:jégecet:etil-acetát:víz

1:1:1:1 arányú keverékével).

A kapott vegyületet 1 n nátrium-hidroxiddal titráljuk, majd az elegyből a sót eltávolítjuk, végül liofilizáljuk a kapott reakcióelegyet. így a szabad pepiidet, az N^£-monoacetil-SP5-ot kapjuk meg.

Molekulatömeg: 735,8. Összegképlet:

C33HS3N9OK). Rf = 0,34 (N-butanol:jégecet:etil-acetát:víz 1:1:1:1 arányú keverékével).

2, példa

Arginil-(NÉ-palmitoil-lizíl)-glutamil-valil-tirozin-(t-MPal-SP5) előállítása

2.1 Acilezés

1,83 g (2 mmól) Boc-Arg-Lys-Glu-Val-Tyr-OH x 2HOAc-t 5 ml dimetil-formamidban oldunk és hozzáadunk 0,919 g (2,2 mmól) Pal-ONB-t. A reakcióelegy feldolgozása és tisztítása ugyanúgy történik, mint áz 1.1. példában. Kitermelés: 2,07 g Boc-Arg-Lys(Pal)-GLu-Val-Tyr•OH x HOAc, az elméleti 94,6%-a.

2.2 A védőcsoport lehasítása

1,64 g (1,5 mmól) Boc-Arg-Lys(Pal)-Glu-Val-Tyr-OH x HOAc-t 30 percig 10 ml trifluor-ecetsav és diklór-etán 1:1 arányú keverékével kezelünk, majd a felesleges trifluor-ecetsavat ledesztilláljuk és a terméket metanolból éterrel kicsapatjuk. Kitermelés: 1,63 g Arg-Lys(Pal)-Glu-Val-Tyr-OH x 2 TFA, az elméleti 93,7%-a. Híg sósavból való liofilizálás után a megfelelő t-Pal-SP5 x 2HCI-t kapjuk. Molekulatömeg: 1005,13. Összegképlet: €47^3^0^(¾. Rf= 0,66 (N-butanol:jégecet:etil-acetát:víz 1:1:1:1 arányú keverékével).

A kapott vegyületet 1 n nátrium-hidroxiddal titráljuk, a sót eltávolítjuk és liofilizáljuk. így a szabad pepiidet, az N^£ MPA1-SP5-1 kapjuk. Molekulatömeg: 932,2. Összegképlet:

C47H81N9O10. Rf “ 0,66 (N-butanol:jégecet:etil-acetát:víz 1:1:1:1 arányú keverékével).

3. példa (Ν^ά Ácetil-arginiD-lizil-glutamil-valil-tirozin -(a-MAcetil-SP5) előállítása

3.1 Acilezés

1,16 g (1 mmól) Arg(NOj)-Lys(Z)-Glu(OBzl)-Val-Tyr-OBzl x TFA-t 5 ml dimetil-formamidban oldunk és 180 mikroliter N-metil-morfolin (vagy más tercier-amin) hozzáadása után 0,265 g (1,2 mmól) N-acetoxi-norborn-5-én-2,3-dikarnboximiddel reagáltatjuk.

perc után a reakcióelegyet keverés közben normál sósavba öntjük, a csapadékot leszűijük és vízzel mossuk. A terméket mintegy 10 ml dimetil-formamidban oldjuk és 5%-os NaHCOj-oldattal kicsapatjuk. A csapadékot szüljük és vízzel mossuk. Metanol/éterből átkristályosítjuk és így

HU 199878 Β

1,05 g védett N^a-acetil-splenopentint kapunk. Kitermelés: az elméleti 96,2%-a.

3.2 A védőcsoport lehasftása

A védett acetil-peptidet 90%-os ecetsavban szuszpendáljuk és palládium/szén katalizátor jelenlétében hidrogénezzük. Kitermelés: 760,8 g N^a-acelil-SP5 x 2HOAc, az elméleti 95,6%-a. Molekulatömeg: 855,94. Összegképlet:

C37H61N9O14. Rf» 0,30 (N-butanol:jégecet:etilacetát:víz 1:1:1:1 arányú keverékével).

4. példa

Diacetilezett splenopentinek előállítása

4.1. példa

ÍN—-Acetil-arginil)-(N--acetil-lizil)-glutamil-valil-tirozin (DAC-SP5) előállítása

4.1.1 DAC-SP5 szintézise SP5 és N-acetoxi-norborn-5-én-2.3-karboximid reakciójával

43,7 g (50 mmól) Arg-Lys-Glu-Val-Tyr-OH x 3HOAc-t (SP5)-t 150 ml vízben oldunk és hozzáadjuk 33,2 g (150 mmól) acetil-ONB 100 ml dimetil-formamiddal készített oldatát. Dimetil-formamidot adunk a reakcióelegyhez mindaddig, amíg homogén oldat keletkezik. Az elegyet egy órán keresztül szobahőmérsékleten keverjük (DC-kontroll), majd az oldószert vákuumban eltávolítjuk és a maradékot éterrel vagy etil-acetáttal eldörzsöljük. A szilárd anyagot leszűrjük, éterrel mossuk és vákuumban kálium-hidroxid felett szárítjuk. Kitermelés: 38,4 g DAc-SP x HOAc, az elméleti 92%-a.

Híg sósavból végzett liofilizálással a megfelelő DAc-SP5 x HCl x 2H₂O-t kapjuk. Molekulatömeg: 850,39.

Összegképlet:

számított: C: 49,43, H: 7,11, N: 14,83%, talált: C: 48,62, H: 7,26, N: 14,00%.

4.1.2. DAc-Sp5 szintézise SP5 és 1-acetoxi-benzotriazol (acetil-OBt) reakciójával

Az SP5 és az acetil-OBt reakcióját és a reakcióelegy feldolgozását a 4.1. példában leírtakkal analóg módon végezzük. Kitermelés: az elméleti 90%-a.

Rf= 0,52 (N-butanol:jégecet:etil-acetát:víz 1:1:1:1 arányú keverékével).

A kapott vegyületet 1 n nátrium-hidroxiddal titráljuk, a sót eltávolítjuk és liofilizálást végzünk, így a szabad peptidet, a DAc-SP5-t kapjuk. Molekulatömeg: 777,87. Összegképlet: ^3$Η$$^9θιΐ· Rf · 0,52 (N-butanol:jégecet:etil-acetát-víz 1:1:1:1 arányú keverékével).

4.2. példa (NŰt-Acetil-arginil)fNl-acetil-lizil) glutamil-valil-tirozin-amid (DAc-SP5-NH?) előállítása

4,06 g (5 mmól) Arg-Lys-Glu-Val-Tyr-NH₂x2HOAc-t 15 ml vízben oldunk, és hozzáadjuk 3,32 g (15 mmól) acetil-ONB 10 ml dimetil-formamiddal készített oldatát. A reakcióelegyet 1 órán keresztül szobahőmérsékleten keverjük (DC-kontroll), majd az oldószért vákuumban ledesztilláljuk, és a maradékot etil-acetáttal és dietil-éterrel mossuk, majd vákuumban, kálium-hidroxid felett szárítjuk.

Kitermelés: 3,93 g (DAc-SP5-NH₂HOAc, az elméleti 94%-a. Molekulatömeg: 836,9. összegképlet: C^H^NjoO^. Rf= 0,44 (N-butanol: :jégecet:etil-acetát:víz 1:1:1:1 arányú keverékével).

A kapott vegyületet nátrium-hidroxiddal titráljuk, a sót eltávolítjuk és liofilizáljuk. így a szabad peptidet, a DAc-SP5-NH₂-t kapjuk.

Molekulatömeg: 776,8. összegképlet:

C35H₅₆Nio0₁₀. Rf= 0,44 (N-butanol:jégecet: :etil-acetát:víz 1:1:1:1 arányú keverékével).

4,3. példa (NSt-Acetil-arginil)(Nf-acetil-lizil) glutamil-valil-tirozin-etil-észter (DAc-SP5-QEt) előállítása

4,21 g (5 mmól) Arg-Lys-Glu-Val-Tyr-OEt x 2HOAc-t 15 ml vízben oldunk, és hozzáadjuk 3,32 g (15 mmól) acetil-ONB 10 ml dimetil-formamiddal készített oldatát. A reakcióelegyet 1 órán keresztül szobahőmérsékleten keveijük (DC-kontroll). Az oldószert ezután vákuumban ledesztilláljuk, és a maradékot etil-acetáttal eldörzsöljük. A szilárd anyagot leszűrjük, etil-acetáttal és éterrel mossuk, majd vákuumban, kálium-hidroxid felett szárítjuk.

4,11 g DAc-SP5-OEt x HOAc-t kapunk. Kitermelés: az elméleti 95%-a. Molekulatömeg: 866,0. Összegképlet: C3₉H₆3N₉Oi3. Rf= 0,60 (N-butanol:jégecet:etil-acetát:víz 1:1:1:1 arányú keverékével).

A kapott vegyületet 1 n nátrium-hidroxiddal titráljuk, a sót eltávolítjuk és liofilizáljuk. így a szabad peptidet, a DAc-SP5-OEt-t kapjuk meg. Molekulatömeg: 805,9. Össszegképlt:

C37H59N9OU. Rf= 0,60 (n-butanol:jégecet:etil-acetát:víz 1:1:1:1 arányú keverékével).

5. példa (N—-Palmitoil-arginil)-lizil-glutamil-valil-tirozin (q-MPal-SP5) előállítása

1 Acilezés ljó g (1 mmól) H-Arg(NO₂)-Lys(Z)-Glu(OBzl)-Val -Tyr-OBzl x TFA-t 5 ml dimetil-formamidban oldunk, majd hozzáadunk 120 mikroliter N-metil-morfolint (vagy más tercier-amint), és 0,626 g (1,2 mmól) palmitinsav-(N-oxi-norborn-5-én-2,3-dikarboximid)-észterrel reagáltatjuk.

A reakcióelegyet a 3.1. példával analóg módon dolgozzuk rel, majd etanol/éterből átkristályosítjuk. így 1,21 g védett N^a-palmitoil-splenopentint kapunk. Kitermelés: 94,3%.

5.2 A védőcsoport lehasftása

A védett palmitoil-peptidet 90%-os ecetsavban szuszpendáljuk és palládium/szén katalizátor jelenlétében hidrogénezzük. Kitermelés: 920 mg N°-Pal-SP5 x 2HOAcc, az elméleti 92,7%-a. Molekulatömeg: 1052,32, Összegképlet:

C₅,H₈9O_MN₉. Rf - 0,66 (N-butanol:jégecet:etil-acetát:víz 1:1:1:1 arányú keverékével).

A kapott vegyületet 1 n nátrium-hidroxiddal titráljuk, a sót eltávolítjuk és liofilizálást vég-51

HU 199878 Β zünk. így a szabad pepiidet, az N“MPal-SP5-t kapjuk meg. Molekulatömeg: 932,2. Összegképlet: C47H81N9O10.

Rf= 0,66 (N-butanol:jégecet:etil-acetát:víz 1:1:1:1 arányú keverékével).

6. példa

N - Acetoxi- norbom- 5-én-2,3-dikarboximid (acetil-ONB) előállítása

17,92 g (0,1 mól) N-hidroxi-norborn-5-én-2,3-dikarboxímidet 100 ml kloroformban oldunk és 0 ’C-on keverés közben hozzáadunk 21 ml (0,15 mól) trietil-amint, majd 19 ml (0,2 mól) ecetsavanhidridet. Szobahőmérsékleten 2 órán keresztül keverjük a reakcióelegyet, majd az oldószert teljesen elpárologtatjuk, vizet adunk hozzá és a csapadékot leszűrjük. Izopropanolból és vízből átkristályosítjuk és így 19,33 g acetil-ONB-t kapunk. Kitermelés: 84,7%. Op.: 112,5-113,5 ’C. Molekulatömeg: 221,2. Összegképlet:

CiiHjjNO4.

7. példa

1-Acetoxi-benzotriazol (acetil-OBt) előállítása

13,51 g (0,1 mól) 1-hidroxi-benzotriazolt 100 ml kloroformban oldunk. Ezután hozzáadunk 16,8 ml (0,12 mól) trietilamint és a reakcióelegyet 0 ’C-ra lehűtjük. Ezután keverés közben hozzáadunk 19 ml (0,2 mól) ecetsav-anhidridet és további 2 órán keresztül szobahőmérsékleten keverjük. Az oldószer eltávolítása után visszamaradó szilárd anyagot etil-acetátból vagy benzolból átkristályosítjuk. Kitermelés: 14,88 g (az elméleti 84%-a). Op.: 96 - 98 °C. Molekulatömeg:

221,2. Összegképlet: CnHuNO₄.

8. példa t-MAc-SP5 immunbiológiai hatása

Az í-MAc-SP5-nek (amely a splenin léphormon 32 — 36-os szekvenciája) a splenin teljes molekulával azonos vagy ahhoz hasonló immunbiológiai hatása van. így például az t-MAc-SP5 elősegíti a T4-antigének mennyiségi növekedését a T-limfociták felületén, amelyek a működésre jól alkalmas T-segédlimficiták felületén kimutathatók. A működésre jól alkalmas T-segédlimfociták stimulálják az antitestképződést. Az e-MAc-SP5 által kiváltott antitest-keletkezés növekedés kimutatására releváns állatkísérleti modellt választottunk: AB/Bln-egereket röntgensugarakkal szubletálisan besugároztunk, és azután egyik csoportjukat nem kezeltük, másikat pedig e-MAc-SP5-tel kezeltük. Egyidejűleg elvégeztük az állatok juh eritrocitákkal történő immunizálását. Mivel a szubletálisan besugárzott állatok elveszítik azt a képességüket, hogy mennyiségileg elegendő antitestet termeljenek, az f-MAc-SP5tel kezelt állatoknál a juh eritrocitákkal szembeni megnövekedett antitest-képződés mértéke annak, hogy az c-MAc-SP5 mennyire regenerálja az immunrendszert.

Az t-MAc-SP5-tel kezelt állatók már 34 nap után ugyanannyi antitestet tudnak képezni, mint a nem besugárzott kontroll állatok. Ezzel szemben az e-MAc-SP5-tel nem kezelt állatok erre csak az egyszeri röntgenbesugárzás után 48 nappal képesek.

A találmányt a következőkben néhány kiviteli példán keresztül közelebbről is bemutatjuk (1. és 2. táblázat).

Vizsgálat

8.1 T4-antigén növekedés emberi limfociták felületén t-MAc-SP5-tel történt érintkezés után

A működésre jól alkalmas (érett) T-segédlimfociták felületükön T4-antigéneket, T-szupreszszor limfocitákat, T8-antigéneket tartalmaznak. Az olyan betegeknél, akiknek szisztémás lupus eritematodes (SLE) betegségük van monoklonális antitestekkel a limfociták felületén kevesebb T4-antigén mutatható ki. Terápiás kezelés következtében az értékek normalizálódnak. Amennyiben terápia előtt a páciensek limfocitáit «-MAc-SP5-tel hozzák érintkezésbe, 2 órás inkubálás után egyénileg különböző, de állandóan emelkedő számú T4-antigén mutatható ki (1. táblázat). Ezzel szemben a T8-antigének (felületi antigének) mennyisége a T-szupresszor limfocitákon, illetve citotoxikus T-limfocitákon nem változik. A T4-antigének szaporodnak, ha a T4sejtek szaporodnak, illetve ha az antigének szaporodva a felületükön exprimálódnak. A vizsgálatok azt mutatják, hogy az SLE páciensek limfocitái az f-MAc-SP5-tel való érintkezés után nem rendelkeznek megnövekedett ₃H-timidin beépülési rátával (percenként 910 ± 180 impulzus, é-MAc-SP5 érintkezés nélkül — 820 ± 210 impulzus percenként €-MAc-SP5-tel való érintkezés után; n= 5, nem tapasztalható szignifikáns eltérés a t-tesztben). Ebből arra következtetünk, hogy a T4-antigének növekedése nem a T4-sejtek szaporodásából következik, hanem a T-sejt felszín valamely struktúrális megváltozásából, ami valószínűleg azonos a sejt érési folyamatával. Az érett, működésre jól alkalmas T-segédlimfociták stimulálják a B-limfociták általi antitest-képződést. Ezért azt vizsgáltuk, hogy az t-MAc-SP5 szisztémás alkalmazása után növekszik-e az antitest képződés meghatározott antigénekkel (juh eritrocitákkal) szemben.

8.2 Antitest képződés immunszupresszió és szisztémás t-MAc-SP5 kezelés után

Az antitest képződés befolyásolhatóságának kimutatására egy releváns állatkísérleti modellt alkalmaztunk. 4 hónapos AB/Bln-egereket (NDK Tudományos Akadémia, Bertin-Buch, NDK) szisztémásán (szubletálisan) röntgensugarakkal kezeltünk (600 c Gy) (Gy = gray, az elnyelt sugárdózis egysége), végül egy részüket tMAc-SP5-tel kezeltük (1., 2. és 3. állatcsoport a

2. táblázatban). Egy további állatcsoportot is vizsgáltunk, amelyet sem röntgenbesugárzásnak, sem e-MAc-SP5- kezelésnek nem vetettünk alá (4. állatcsoport a 2. táblázatban). A 2. és 3. állatcsoportot naponta 10 mikrogramm vagy 50 mikrogramm c-MAc-SP5-tel kezeljük (intraperitoneális alkalmazás). A besugárzás után különböző időpontokban (14. napon, 20. napon, stb. lásd

HU 199878 Β a 2. táblázatot) a JERNE-Plaque-teszttel (amelyet Ekéért és munkatársai módosítottak, lásd: R. Eckert, U. Pfüller, A. Kindt, E. Reichelt és H. Franz: Histaminrezeptor-tragende Lymphozyten, III. Supression von Immunreaktionen nach Abtöten dér Histaminrezeptor-tragenden Lymphozyten durch cin Konjugat aus Histamin und dér A-Kette des Misteílektins I. Biomed. Biochim. Acta 44,1239-1246 /1985/). Meghatároztuk az állatok antitest-képzésének mértékét juh eritrocitákkai szemben. Ehhez az állatokat a vizsgálat előtt 5 nappal juh eritrocitákkai immunizáljuk (intraperitoneálisan alkalmazunk állatonként 5x1ο⁸ sejtet) és a 2. táblázatban feltüntetett vizsgálati időpontokban megállapítjuk a juh eritrociták elleni antitest-képző képességüket (metodikai részleteket lásd W. Diezel és munkatársai: Biomed. Biochim. Acta 45, 1349-1352 /1986/ irodalmi helyen).

Ismeretes, hogy a szubletálisan besugárzott állatok elveszítik azt a képességüket, hogy elegendő antitestet képezzenek. A normális képződés csak egy bizonyos latens periódus után áll vissza, amely periódus alatt az állatok antitest-képző sejtjei regenerálódnak. Kísérleteink során az ál latok legkorábban 48 nappal az egyszeri röntgenbesugárzás után voltak képesek ugyanolyan mennyiségű antitestet képezni, mint a nem besugárzott kontroll állatok (nincs szignifikáns kü5 lönbség az 1. és 4. csoport között a 48. napon a 2. táblázatban). Ezzel szemben az «-MAc-SP5-tel kezelt állatok már a röntgen besugárzás után 34 nappal képesek voltak a normális antitest .termelésére (nincs szignifikáns különbség a 2. és 4., illetve a 3. és 4. csoport között a 34. napon a 2. táblázatban).

Az említett eredmények feljogosítanak annak feltételezésére, hogy az <-MAc-SP5-tel az immunvédekezési problémák előnyösen befolyásol15 hatók. Az ilyen állapot vagy veleszületett, vagy szerzett. A szerzett immunvédekezési problémák közül megemlítjük a szükséges gyógyszeres kezelés következményét (rákos megbetegedéseknél citosztatikus terápia és besugárzásos terá20 pia), valamint mindenképpen velejárója az AIDS-nek a betegség késői stádiumában. Az ismertetett eredményeknek megfelelően várható, hogy az c-MAc-SP5 az immunrendszer ilyen csökkentett funkciója esetén legalább részlege25 sen hatékonyan alkalmazható.

1. táblázat

T4-antigén mennyiségi növekedése emberi T-limfociták felületén t-MAc-SP5-tel való érintkezés után

T4-antigén meghatározás monoklonális antitestek segítségével (VIT4-CD4 cluster és VITB-CDB cluster) szisztémás lupus eritemadotes (SLE)-betegek T-limfocitái

A páciens száma	T-sejt-felületi antigén (%)
T4	TB
1. Schr., R. kontroll
(K) (í-MAc-SP5 nélkül)	1	10
+ í-MAc-SP5	54	10
2.H..A. K.	48	40
+ e-MAc-SP5	60	45
3.J..R.K.	44	50
+ _£-MAc-SP5	66	48
4.0., Η. K.	42	12
+ í-MAc-SPS	65	15
5.W., Β. K.	45	40
+ _£-MAc-SP5	67	42

-7HU 199878 Β ι

ο

Ό

-Μ '3 ι/Ί

rf £ co ό sü

o.'E νι <Ί fi ·»

HU 199878 Β

9. példa

Mono-, di- és triacetil--splenopentinek (mono-, di· és triacetil-SP5), monoacetil-(N-Arg)-SP5, diacetil-(N£-Arg, N£-Lys)-SP5, triacetil-(N^-Arg, Nf-Lys-Q-Tyr)-SP5 elválasztása

150 mm hosszú és 9 mm átmérőjű oszlopra (V * 9,54 ml), amelyben hordozóanyagként valamely 50 mikron és 90 mikron közötti szemcseméretű karboxilezett kationcserélő található, 50 mg ekvimoláris arányú mono-, di- és triacetil-SP5 keveréket viszünk fel.

Az anyagok eluálását 5 ml/óra áramlási sebességgel 1 í,5% etanollal pH/ 2,45-nél (ecetsav) végezzük. Az anyagok sorrendje mono-, di- és triacetil-SP5, R > 1, a reprodukálhatósági ráta nagyobb, mint 95% az egyes anyagoknál.

*A triacetil-splenopentinek előállítását lásd a Peptides 1988 - Proceedings of the 20th European Symposium, September 4 - 9, 1988, Tübingen, S. 745 bis 747. irodalmi helyen.

10. példa

Monoacetil-(NS.-Arg)-SP5 és monoacetil-(N--Lys)SP5 elválasztása

200 mm hosszú és 9 mm átmérőjű oszlopra (V = 12,7 ml), amely hordozóanyagként 40 mikron és 50 mikron közötti szemcseméretű karboxilezett kationcserélőt tartalmaz, ekvimoláris mennyiségű monoactil-(N^a-Arg)-SP5-öt és monoacetil-fN'-Lysj-SPő-öt viszünk fel. Az eluálást vizes futtatószerrel végezzük 2,35-ös pH ér léknél (HCI) 10 ml/óra áramlási sebességgel. Az anyagokat polaritásuknak megfelelően (1. monoacetil-(N^a-Arg)-SP5, 2. monoacetil-(N^£-Lys)-SP5) 97%-os reprodukálhatósággal eluáljuk. A rezolució 1,5.

11. példa

Triacetil—(N—-Arg, N2-Arg, N--Lys)-SP5 és diacetil-(NSL-Arg, N--Lys)-SP5 elválasztása

200 mm hosszú és 5 mm átmérőjű oszlopra, amely hordozóanyagként 50 mikron és 60 mikron közötti szemcseméretű karboxilezett kationcserélőt tartalmaz, felvisszük a keveréket, amely mindkét pepiidből 5 mg-ot tartalmaz. Az eluá15 lást 3 ml/óra áramlási sebességgel, 11,5% etanollal, pH= 2,57 értéknél (ecetsav) végezzük. Az egyes anyagokra értett 96%-os reprodukálhatósággal 0,8 rezolúciót érünk el.

* A triacetil-splenopentinek előállítását lásd a Peptides 1988 - Proceedings of the 20th European Symposium, September 4-9, 1988, Tübingen, S. 745 bis 747. irodalmi helyen.

12. példa

A 4. példa szerint előállított acilezett splenopentinek szintézis nyerstermékének elválasztása

A nyerstermékben található anyagok;

1. monoacetil-(N^a-Arg)-SP5,

2. diacetil-8(N^a-Arg, N^£-Lys)-SP5 (főtermék, nagynyomású oszlopkromatográfia szerint 75%),

3. triacetil-((N^L*-Arg,N'^í-Arg, N^£-Lys)-SP5,

4. triacetil-^NP-Arg, N^£-Lys-Ó-Tyr)-SP5,

5. diacetil-(N^a-Arg, N^£-Lys, D-Tyr)-SP5.

cm hosszú és 10 cm átmérőjű oszlopra, amely hordozóként 4,5 liter 50 mikron és 90 mikron közötti szemcseméretű karboxilezett kationcserélőt tartalmaz, felvisszük 35 g splenopentin szintézis nyerstermék 150 ml eluálószerrel készített oldatát. Az anyagkeverék elválasztását izokratikus eluálással, 10%-os etanollal, j)H = 2,5-nél (ecetsav), 80 ml/perc áramlási se bességgel végezzük. A frakcionált eluátumot 266 mm-nél mérjük. Végül a csúcstérfogatokat egyesítjük, szárazra pároljuk, és liofilizáljuk ekvimoláris mennyiségű sósav hozzáadásával. Összes reprodukálhatósági ráta: 95,6%. Főtermék: 19 g (54,3%).

A nagynyomású folyadékkromatográfiával a főtermék tisztasága 98,5%,

13. példa

Vírusos infekció kezelése

3.1. táblázat

DAc-SP5 kezelés hatása Balb/c-egerek halálozási aránya A/PR/8/34 influenzavírussal történt infekció (intranazális) után (n = 10-12)

lnfekciós dózis (L.Djq)	10^l	10²	10³	10⁴	10⁵
Halálozási arány 6 nap után %-ban: Kontroll	50	66,6	100	100	100
DAc-SP5-terápia az infekció alatt⁴⁷	33,3	33,3	66,6	100	100
DAc-SP5 infekció előtt⁴⁴⁷	n.g.	n.g.	n.g.	100	100

HU 199878 Β

3.2, táblázat

infekció után (Balb/c egerek) (n= 10-25)
Pankreatitiszes állatok	Infekciós dózis (TCID™
(%-ban, n > 10-15)	10³ 10⁴ 1CP	10⁶

Kontroll	60	60	100	100
DAc-SP5-terápia
az infekció alatt * *^z	0	0	60	100
DAc-SP5 terápia
az infekció előtt^{+ +/}	u.g.	80	100	100

3.3. táblázat

DAc-SP5 kezelés hatása a tüdő hisztopatológiai elváltozásainak kialakulására Balb/c egérnél és szíriai hörcsögnél (n = 9-10)

Hisztopatológiai tüdővel rendelkező állatok száma (%)

Kontroll DAc-SP5-terápia DAc-SP5 terápia infekció alatt⁺¹ infekció előtt * ^+/

Hörcsög (TCID50 = -2xl(F·³)

Egér (TCID = 10³·⁵)

100 10

100 0

100

Megjegyzések:

^+/ = 0,5 mg DAc-SP5, s.c. (pro kg) naponkénti adagolás 5 napon keresztül a kezelés kezdete az infekció napja * ⁺' = 0,5 mg ()DAc-SP5 pro kg, s.c., hetenként 3-szor az infekció kezdete előtti 2. hétben, n.g. = nincs adat.

14. példa

Kemoterápia utáni kezelés

4.1. ábra: DAc-SP5 és immunszupresszív hatású vegyületek befolyása az antigén specifikus IgM-válaszra egereknél.

A) Az alkalmazás módjától függetlenül DAc-SP5 terápiás dózis adagolása (háromszor 0,5 mg/kg 24 óránként) nincs szignifikáns hatással az IgM-válasz erősségére és kinetikájára egereknél juh eritrocitákkal szemben.

Állatok: himnemű 2-2,5 hónapos NMRI-egerek (kolónia tenyésztés).

Jerne-Plaque-teszt módszere: R. Eckert és G. Pastcrnak: Acta bioi. med. germ. 31, 127-137 /1973/ szerint. n= 16 (NaCl-kontroll), n= 8 (DaC- SP5-vizsgálatok).

B) A DAc-SP5 már néhány egymásutánt al4Q kalmazás esetén is visszaállítja a humorális immunválasz kémiai úton kiváltott szupresszióját a ciklofoszfamid egyszeri adagolása révén (7,2 mg/állat i.p.) kiváltott csaknem teljes antigénspecifikus IgM-válasz szupresszió részlegesen ₄r helyreállítható négy egymásutáni napon végzett DAc - SP5 (0,5 mg/kg s.c.) kezeléssel.

A dexametazon adagolással kiváltott antigénspecifikus IgM-válasz csökkenés (a = 0,2 mg/állat i.p.; b = 0,08 mg/állat i.p.) a két következő napon végzett BAc-SP5 kezeléssel (0,5 mg/kg s.c.) teljesen helyreállítható.

* = p 0,05 (összehasonlítva a megfelelő értékkel, amit GAc-SP5 kezelés nélkül kapunk).

n = 6 - 8 az A)-nál ismertetett kísérleti állat. 55

-10HU 199878 Β

4,1. táblázat

Monociták, illetve limfocita szubpopuláció citofluorimetriás kimutatása (kvantitatív meghatározás) monoklonális antitestekkel szekunder immunhiányos páciens (nő)-nél diacetil-splenopentin kezelés előtt és alatt, miközben az egyéb terápia azonos maradt

Paraméter	Normálérték	Kezelés előtt	Kezelés DAc-SP5-tel (hét)
2	3	4
Limfociták (Gpt/1)	1,5-3,5	0,28	0,84	0,74	0,83
CD 3 (Gpt/1)	1,0-2,0	0,04	0,39	0,55	0,67
CD 4 (Gpt/1)	0,6-1,3	0,03	0,29	0,34	0,38
CD 4/CD 8	1,5-3,0	0,58	2,3	2,2	2,4
DR ⁺ -monociták
(Gpt/1)	0,0-0,6	0,2	0,18	0,26	0,60
DR ⁺ -monociták (%)	65-90	16	22	62	72

15. példa

Csontvelő törzssejtek növekedésének és érésének stimulálása

5.1. táblázat

Sejtkoloniák száma C57 Bl-egerek csontvelő törzssejtjeinek és kontrollszemélyek, illetve szisztémás lupus eritremadotes betegek leukocitáinak tenyésztése után különböző DAc-SP5 koncentrációk jelenlétében (kolóniáké pződési teszt) (A táblázatban a számok a DAc-SP5 adalék nélküli kolóniákra vonatkoztatott négy pár a le lll kultúra százalékos középértékei) (Módszer: H. Schunck és munkatársai: Biomed. Biochim. Acta 46, 581 /1987/)

Csoport Vizsg.

Sejtkoloniák 10⁵ csontvelősejtenként a a sejteknek DAc-SP5-tel való tenyésztése nélkül és után.

Százalékos adatok DAc-SP5-tel való tenyésztés nélküli kolóniákra vonatkoztatva (= 100%) Dac - SP5 koncentráció/1 ml félszilárd agar lpg 2 pl 10 pl 20 pl

Kontroll

személyek	A B	99 135	98 136	114 147	125 187
Páciensek (szisztémás lupus eritematodes)	A	180	316	270	256
B	284	873	642	438

-111

HU 199878 Β

5.2. táblázat

Jelzetlen ligandumok által kiszorítható -H-splenopentin és —I-diacetil-splenopentin kötődési hely kimutatása radioligandum ötődési vizsgálatokkal U és komputerrel alátámasztott affinitás-spektrum analízissel történő affinitás számítási

Sejt/faj	Radioligandum-disszociációs állandó (Kn, M)⁺)
^JH-SP5 (n= 2 —5)	^I25I-DAc-SP5 (n = 2 — 4)
Csontvelő patkány	8,7 ± 2,2x10®	8,5 ± 0,5x10·’
CsontvelŐ/ember	nincs adat	1,2 ± 0,3x10·®
Törzssejtvonal/ember	12x10'®	nincs adat
Timuszsejtek/patkány	7,6 ±3,5x10·®	nincs adat
Lépsejt/patkány	nincs kiszorítható kötés	nincs adat
Peritoneális hízó-
sejtek/patkány⁴)	4,3 ± 1,3x10®	nincs adat

1) = A módszert lásd: H. Repke és C. Liebmann: Membranrezeptoren und ihre Effektorsysteme, Akademie-Verlag, Berlin és VCH Weinheim, NSZK, 55 —101 /1987/;

2) = A módszert lásd: H. Repke: Biochim. Biophys. Acta 929, 47 - 61 /1987/;

3) = A telítettségi tartomány alatti értékekből számítva.

4) = A sejtpreparáció módszerét lásd: H. Repke és munkatársai: Agents and Actions 20,216 — 218/1987/.

Az 5.1. ábrán a következők láthatók:

Antiteslképzés juh eritrocitákkal szemben (Plaque-képző lépsejtek AB/Bln-egér) az állatok egyszeri 800 oGy-nal történő röntgenbesugárzása után, valamint az azt követő csontvelősejt átültetés után végül heti három alkalommal 10 mikrogramm DAc-SP5-tel történő gyógyszerezéssel (·) vagy DAc-SF5 kezelés nélkül (o). Az értékek (középérték ± szórás) legalább öt állatnál mért értékek középértékét jelzik. A vonalkázott felület: az állatok Plaque-képző lépsejtjei röntgenbesugárzás nélkül és DAC-SP5 kezelés nélkül. Minimális és maximális értékek a 49 napos kísérleti időn belül. Az állatok immunizálása juh eritrocitákkal 5 nappal az IM Plaque-képző lépsejtek meghatározása előtt.

16. példa

HÍV infekció kezelése

6.1. ábra: Diacctil-splenopentin hatása a 3’-fluor-timidin-5’-trifoszfát (FdTTP) HÍV revertázgátló állal kiváltott humorális immunreakció befolyásolására.

Láisd: E. Matthes és munkatársai: Biochem. Biophys. Rés. Com. 148,1, 78 — 85. oldal/1987/.

6.1. a. ábra: 2,5 hónapos hímnemű Balb/c egereknek ivóvízzel 4 napon keresztül napi 1 mg FdTTP-t adagolunk. 24 órával az adagolás befe . 35 jezése után következik 12 órás időszakonként háromszor 0,5 mg/kg s.c. DAc-SP5 adagolása. 12 órával az utolsó DAc-SP5 kezelés után következik a juh eritrocitákkal (i.p.) történő immunizálás. Újabb 24 óra elteltével ismét FdTTP ada40 golás (s.o.) következik az állatok haláláig. (Plaque-teszt az immunizálás utáni negyedik napon).

1. csoport: NaCl-kontroll (n= 6)

2. csoport: FdTTP (n = 6)

3. csoport: FdTTP + CAc - SP5 (n = 6).

6.1.b. ábra: Az állatok, a módszerek és az anyagok megegyeznek a 6.l.a. ábrán feltüntetettekkel. Az FdTTP kezelés időtartama 11 nap. 24 órával az FdTTP adagolás után végezzük DAc50 SP5 adagolást 24 órás időszakokkal 5 napon keresztül.

1. csoport: DAc-SP5 kontroll (n « 6)

2. csoport: FdTTP (n = 6)

3. csoport: FdTTP X DAC-SP5 (n - 6)

4. csoport: NaCl-kontroll (n= 4).

A Box és Whisker Plot négy azonos gyakoriságú területtel egy szúrópróba adatait ábrázolja. A Box-ban van a szúrópróba középső 50%-a, a keresztvonal a Medián (normál eloszlású adatoknál a Box közepében). A Box feletti és alatti vonalak fedik a szúrópróba több részét.

x«= p < 0,05, illetve p < 0,01.

-12HU 199878 B cm

NO <-í o’ cd cd o e£

6.1,a. táblázat

Monocita, illetve limfocita szubpopuláció citofluorometriás meghatározása (kvantitatív meghatározás) monoklonális antitestekkel HIV-fertfizött pácienseknél diacetil-splenopentines kezelés előtt és alatt

8=⁵

XU §8i> 8 $ ja jd >-4 ο ο o rf rf oo v-ι r- vj oq © oo u-i ól cm o cf <s θ' cf o' v?

'C m r- r~ cm. . oo <c <-4 ro λ x> dodo rf rf ^33328 ’T «m © © © © n

o

V> O <*> Ο Ό Qrd rí r-Γ <d o 3K I I I I I I η ο « ιη q o r-Γ r-Γ o” rí cd irf

Ό

353888

Jddcdo ‘

Ν Λ ιη f) . . r4 m r-l Ν Λ -Q rí cd cd cd rf rf

VlNrtQlOQ oocihn no <-í cd cd cd o

Π --Ί φ 00 00 Q rt CJO -4 gö rí cd cd cd cd c£ νγ © rn © so q* r*í cT r-Γ rn cf 2F Ν I I I I ® Ό »/> O © Τ-Γ r-Γ O ©* ® »n

íj <5o 3 ni

•4U

Já <D

Ό>

H H cm m

-13HU 199878 B

38Sf3 58

-4 -4 ο” o o' r-~ ΧΊ xf xí* Ή Ο ΧΊ O <s r- oo ή ί o rf d d h o rf r6.1.b. táblázat

Monocita, illetve limfocita szubpopuláció citofluorometriás meghatározása (kvantitatív meghatározás)

MÜ

-Ö .a

Ct fe

4>

w

Im

VÜ *3 s

u

O

Z υ

w ι

Oh

M ⁰⁰ S •S £>3

24?

ΟΟΟΟΟΓ» Q χί t\ro η o ν η ο θ' σ' χ£

ΧΊ

Ή 00 xf Ή . .

oe -4 ro <μ Χΐ χ> rínod rf rf ο . ro o ro ΧΊ λ Λ ή ο ro σ' rf rfo c4 ro

ΧΊ (S ΧΊ ro Q ro ο ο ο ο ο τη σ' ο' σ' ο ΧΊΟ

ΧΊ Ο ΗΊ Ο. \Ο Qro c4 *4 ro ο eh I I I I I I ΧΊΟ'βΧΊΟΟ Ι-Γ r4 Ο .4 Ο ΧΊ

Ό

Q Ο.^ curí

2- θ« Ο.Α ’3

3as*§1 •gSS8|?

'SUU ?+ j + « £*Ω Q _ey 'TŰ ro U

X) X> X) Λ X> Λ rf rf rf rf rf rf

Γ- ΧΊ Γ r- NO o r- xf D Nő π d d d o ro

ΧΊ

SS3S rídd a ro o <s o orf

ΧΊ

SSS8 3g i-Γ σ σ- θ' o oo χί o ro ο. Ό, o* rí rí h d O 5 I I I I I I

ΧΊΟ^'ΟΧΊΟΟ r-í r-í ο ή” O XJ 'Ή

Q,i-4 r-4 Q0

Ü ·^ ^3 -Μ __ o. O.Q '2 ?

^οαυ·5 g ro »t - β o

SqqÖÍ ?

’*^,UU ? + + u eíQ tu ~ ág xtU

2) = a (*)-gal jelölt értékek megfelelnek a normálértékeknek.

3) = nd>. — nincs adat.

-14HU 199878 Β

17. példa

Krónikus alkoholintoxikáció hatása a hünnemfl Balb/c egerek immunrendszerének kiválasztott paramétereire

7. táblázat

Krónikus alkoholintoxikáció hatása hímnemfl Balb/c egerek immunrendszerének kiválasztott paramétereire

15% etanol adagolása legalább 1,5 hónapig	+	+	-	-
0,1 mg DAc-SP5 i.p. ötször naponta vizsgálat előtt		+	+
	(n-40)	(n = 40)	(n-40)	(n-40)
% fagocita peritoneális sejtek	29,0+ 1,7	' 47,5+1,7	75,0+2,6	46,0+1,7
fagocitózis index	3,0+0,08	4,5+0,1	4,9+0,15	3,7+0,08
timusz-tömeg (mg)	15,0+2,6	29,0+2,2	40,0+3,0	25,0+2,3
léptömeg (mg) Plaque-képző lépsejtek/	60,0+3,2	82,0+5,6	95,0+7,1	85,0+3,6
/10⁶ sejt (Jerne-Plaque-teszt)	61,3+3,8	214,3+5,9	285,0+11,3	156,6+12,0

Átlagértékek ±

18. példa

Autoimmun reakciók kezelése

8.1. táblázat

DAc-SP5 normalizáló hatása neuronális antigénekkel szembeni indukált autoimmun reakciója nyulaknál

Kísérleti csoportoki) Bazofílek %-os antigén specifikus reakciója neuroantigén (nyúl) standard preparátummal

Kiindulási 2 hét 6 hét 8 hét

	értékek	után	után	után
1. Hippocampus sérülés²) + DAc-SP5³>, N⁴) -6	31,3+ 1,9	42,0+4,8	28,3+3,9	15,0+2,9
2. Hippocampus sérülés + NaCl, n = 6	28,0+4,0	44,0+6,7	46,6+7,0	38,6+0,7
3. Kontroll + DAc-SP5, n - 4	21,0+5,0	20,5+3,3	10,0+2,7	23,0+6,2
4. Kontroll + NaCl, n - 4	11,0+3,0	20,5+4,6	33,5+3,3	22,5+3,8

1) — Chinchilla-nyulak (kb. 3000 g-osak), amelyek neuronális antigénekkel szemben spontán autoimmun reakciót mutatnak.

2) - A dorzális Hippocampus helyi sérülése a neuronális antigénekkel szembeni autoimmun reakció növekedését okozza.

3) - DAc-SP5 adagolás (1 mg/kg s.c.) ötször 4 napos időközökkel ’ - p < 0,005 (t-teszt Student szerint)

4) - n - állatok száma.

-151

HU 199878 Β

8.2. táblázat

DAC-SP5 hatása az (antiovalbumin) antitestek literére

Log₂ PCA-titer

I. csoport II. csoport III. csoport IV. csoport

Immunizálás
2. Booster	9,3	10,3	10,3	9,3
3. Booster	12,3	12,3	13,3	12,3
4. Booster	13,3	13,3	14,3	14,3

DAc-SP5 (háromszor hetente, s.c.) Kontroll

Napok az utolsó Boosterezés után	Lesöpört²) 10 Mg/kg	Il.csoport²) 100 Mg/kg	III .csoport²) 500 Mg/kg	IV.csoport
7.	13,6+0,6	13,5+0,7	13,6+06,	13,4+0,5
14.	13,5+1,0	13,8+0,8	13,8+0,8	13,0+0,8
21.	13,0+0,4	12,6+0,4	12,8+0,5	12,7+0,5
28.	12,9+1,3	12,9+0,8	13,0+1,0	13,0+0,9
35.	12,8+0,5	13,2+0,5	12,7+0,5	12,9+0,5
42.	13,0+0,6	13,1+0,9	12,7+0,5	12,9+0,5
49.	12,9+0,7	13,1+0,9	12,6+0,6	12,6+0,4
56.	12,3+0,4	12,6+0,9	12,1+0,9	12,1+0,4
	x± S.D.	x ± S.D.	x ± S.D.	x± S.D.
	n = 10	n = 10	n = 10	n = 10

1) = Fj-hibrid egereket (Balb/c x C57 B1/6J) 1 pg ovalbuminnal 1 mg Al(OH)₃-ban emulgeálva) immunizáljuk. Az anti-ovalbumin titert a passzív kután anafilaxis módszerével (lásd: Wyczotkowska és munkatársai: Int. Archs. Allergy Appl. Immun. 72, 16 — 21 /1983/) az egyes állatok szérumának hígitási sora segítségével határozzuk meg.

2) = A kísérleti és a kontrollcsoport értékei között nincs statisztikailag szignifikáns eltérés.

Claims

1. Eljárás (I) általános képletű acilezett sple- 40 nopentinek és savaddíciós sóik előállítására — ahol

R¹ jelentése hidrogénatom vagy 1-18 szénatomos alkanoilcsoport;

R² jelentése hidrogénatom vagy 1-18 szén- 45 atomos alkanoilcsoport,

R⁴ jelentése hidroxilcsoport, aminocsoport vagy egy OR⁵ általános képletű csoport, ahol R⁵jelentése 1 — 4 szénatomos alkilcsoport, azzal a megkötéssel, hogy R¹ és R² közül legalább az 50 egyik hidrogénatomtól eltérő - azzal jellemezve, hogy splenopentint vagy részlegesen védett splenopentint egy ZR általános képletű acilezőszerrel, ahol Z jelentése reakcióképes csoport és R jelentése 1 — 18 szénatomos alkanoilcsoport, reá- 55 gáltatunk, és adott vagy kívánt esetbn a védőcsoportot eltávolítjuk, a kapott savaddíciós sóból kívánt esetben felszabadítjuk a bázist, és kívánt esetben a kapott (I) általános képletű vegyületeket a peptidkémiában szokásos kromatográfiás 60 eljárással tisztítjuk.

(Elsőbbsége: 1988,06.16.)

2. Eljárás az (I) általános képletű acilezett splenopentinek és savaddíciós sóik előállítására -ahol· 65

R¹ jelentése hidrogénatom vagy 1-18 szénatomos alkanoilcsoport,

R² jelentése hidrogénatom vagy 1-18 szénatomos alkanoilcsoport,

R⁴ jelentése hidroxilcsoport, azzal a megkötéssel, hogy R¹ és R² közül legalább az egyik hidrogénatomtól eltérő - azzal jellemezve, hogy splenopentint, vagy részlegesen védett splenopentint egy ZR általános képletű acilezőszerrel, ahol Z jelentése reakcióképes csoport és R jelentése 1 — 18 szénatomos alkanoilcsoport, reagáltatunk, és adott vagy kívánt esetben a védőcsoportot eltávolítjuk, a kapott savaddíciós sóból kívánt esetben felszabadítjuk a bázist, és kívánt esetben a kapott (I) általános képletű vegyületeket a peptidkémiában szokásos kromatográfiás eljárással tisztítjuk.

(Elsőbbsége: 1987.06.19.)

3. Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy acilezőszerként N-hidroxi-norborn-5-én-2,3-dikarboxamid-(l —18 szénatomos)-karbonsavésztert, előnyösen N-acetoxi-norborn-5-én-2,3-dikarboximidet alkalmazunk. (Elsőbbsége: 1988.06.16.)

4. A 2. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy acilezőszerként N-bidroxi-norborn-5-én-2,3-dikarboximid-(l — 18-szénatomos)karbonsavésztert, előnyösen N-acetoxi-norborii-516

-161

HU 199878 Β

-én-2,3-dikarboximidct alkalmazunk. (Elsőbbsége: 1987.06.19.)

5. Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy acilezőszerként 1-acetoxi-benzotriazolt alkalmazunk.

(Elsőbbsége: 1988.06.16.)

6. Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy acilezőszerként 1-acetoxi-benzotriazolt alkalmazunk.

(Elsőbbsége: 1987.06.19.)

7. A 2., 4., 6. igénypont szerinti eljárás (N“-acetil-arginil)-(N^£-acetil-lizil)-glutamil-valil-tirozin előállítására, azzal jellemezve, hogy Arg-Lys-Glu-Val-Tyr-t N-acetoxi-norborn-5-én-2,3-dikarboximiddel vagy 1-acetoxi-benzotriazollal reagáltatunk.

(Elsőbbsége: 1987.06.19.)

8. A 2., 4., 6. igénypont szerinti eljárás arginil-(N^£-acetil-lizíl)-glutamil-valil-tirozin előállítására, azzal jellemezve, hogy N^a-Arg-védett splenopentint N-acetoxi-norborn-5-én-2,3-dikarboximiddel vagy 1-acetoxi-benzotriazollal reagáltatunk, majd N¹*-védőcsoportot lehasítjuk. (Elsőbbsée: 1987.06.19.)

9. Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy az acilezett splenopentineket karboxilezett kationcserélőkön, előnyösen akrilátbázisú, divinil-benzollal térhálósított kationcserélőkön, vizes eluálórendszerekben, polaritásuknak megfelelően 10'⁵ és 10‘² mól/1 közötti ion-erősségnél tisztítjuk, és az eluálást előnyösen izokratikusan 10 - 20% etanolt tartalmazó vizes eluálószerrel, pH = 2,5-nél végezzük. (Elsőbbsége: 1988. 06.16.)

10) A 2. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy az acilezett splenopentineket karboxilezett kationcserélőkön, vizes eluálórendszerekben, polaritásuknak megfelelően 10⁵ és 10*²mól/1 közötti ionerősségnél tisztítjuk, és az eluálást előnyösen izokratikusan 10 — 20% etanolt tartalmazó vizes eluálószerrel, pH = 2,5-nél végezzük.

(Elsőbbsége: 1987.12.23.)

11. Eljárás gyógyszerkészítmények előállítására azzal jellemezve, hogy egy vagy több 1. igénypont szerint előállított (I) általános képletű vegyületet vagy annak savaddíciós sóját - a képletben R¹, R , R⁴ és R⁵ jelentése az 1. igénypontban megadott — egy vagy több gyógyszerészeti célra alkalmas vivőanyaggal és/vagy gyógyszerészeti segédanyaggal összekeverünk, és gyógyszerkészítménnyé alakítjuk.

(Elsőbbsége: 1988.06.16.)

12. Eljárás gyógyszerkészítmények előállítására azzal jellemezve, hogy egy vagy több 2. igénypont szerint előállított (I) általános képletű vegyületet vagy annak savaddiciós sóját — a képletben R¹, R² és R⁴ jelentése a 2. igénypontban megadott — egy vagy több gyógyszerészeti célra alkalmas vivőanyaggal és/vagy gyógyszerészeti segédanyaggal összekeverjük, és gyógyszerkészítménnyé alakítjuk.