DD268160A1 - Verfahren zur herstellung eines mittels mit wirkung auf knochenmarkstammzellen - Google Patents

Abstract

Die Erfindung hat ein Verfahren zur Herstellung eines Mittels mit einer direkten stimulierenden Wirkung auf Stammzellen des Knochenmarks zum Inhalt. Die Substanzen, die sich aufgrund ihrer Wirkung zur Behandlung sekundaerer Immunodefizienzerkrankungen, einschliesslich der durch Infektion mit dem HIV (AIDS), verwenden lassen, sind Spleninsequenzen und ihre Derivate, vor allem acylierte Splenotritine und Splenopentine. Das Anwendungsgebiet der Erfindung ist die pharmazeutische Industrie.

Description

Verfahren zur Herstellung eines Mittels mit Wirkung auf Knochenmarkstammzellen

Anwendungegebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Mittels zur direkten Beeinflussung der Proliferation und Differenzierung von Stemmzellen des Knochenmarks. Substanzen, die eine stimulierende und differenzierende Wirkung auf Knochenmarkstammzellen aufweisen, lassen sich zur Behandlung sekundärer Immu.iodefizienzerkrankungen, einschließlich der durch Infektion mit dem HIV (AIDS) und bestimmter Leukämieformen oder Autoimmunerkrankungen verwenden. Das Anwendungsgebiet der Erfindung ist die pharmazeutische Industrie.

Charakteristik der bekannten Lösungen

Das Milzhormon Splenin wurde 1981 entdeckt (Audhya, T. et al. (1981): Biochemistry: 20:6195). Es besteht aus 49 Aminosäuren und hat ein Molekulargewicht von 5562 Dalton. Bedeutsam war die If84 gemachte Entdeckung, daß die Sequenz 32 bis 36 des Gesamtmoleküle (Splenopentin, SP~5, Arg-Lys-Glu-Val-Tyr) gleiche bzw. ähnliche immunobiologische Wirkungen wie das Ge3amthormon selbst hat. Das trifft nuch auf das 1986 synthetisierte Tripeptid Arg-Lys-Glu, die Sequenz 32 bis (Splenotritln, SP-3) zu (Diezel et al. (1987): DD-PS 250 539), Folgende immunobiologische Wirkungen von Snlenopentin bzw. Splenopentinderivaten wurden beschrieben: SP-5 bewirkt, daß sich auf der Oberfläche von tierischen Lymphozyten Thy-1⁺ Antigene und auf der Oberfläche von B-Lymphozyten Lyb 2.I⁺ Antigene bilden (Audhya, T. et al. (1984): Proc. Natl. Acad. Sei. (USA): 8.·2«47). Diacetyl-SP-5 (DAC-SP5) erhöht die

Bildung von Interferon-gamma sowohl durch menschliche (Diezel, W. et al. (1984): Biomed. Biochim. Acta: 43:K9; Waschke, S. et al. (1984): OD-PS 216 629) als auch tierische Lyraphozyten (Rentz, E. et al. (1984): Arch. Geschwulst forsch. 54:113).

SCf-Mo

Ziel der Erfindung

Es ist das Ziel der Erfindung, der medizinischen Praxis ein therapeutisch einsetzbares neues Mittel in die Hand zu geben, das auf Knochenmarkstammzellen stimulierend wirkt.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren und ein Mittel zu entwickeln, mit deren Hilfe die Proliferation und Differenziorung von Stammzellen des Knochenmarks angeregt wind. Die Aufgabe wurde dadurch gelöst, daß Splenineequenzen und ihre Derivate vorabreicht werden. Überraschenderweise hat ee sich gezeigt, daß diese Verbindungen direkt die Proliferation unreifer Stammzellen des Knochenmarks stimulieren und/ oder Leukozyten unter ihrum Einfluß vermehrt koloniestimulierende Faktoren sezernieren und die Bildung funktionstüchtiger reifer Immunzellen aus Zellen des Knochenmarks beschleunigen.

Unter den Splenineequenzen haben sich die Derivate des Spleno· tritins I und des Splenopentins II als bedeutsam erwiesen, besonders in Form ihrer Acylverbindungen.

R¹- Arg - Lys (R²) - GIu - R³ I R¹. Arg - Lys (R²) - GIu - VaI - Tyr II

Darin	*	R2:	bedeuten:	·. Alkyl	ff	(η- 1-8)
R1I				- Aryl	- Alkyl	(η» 1-12),
			V'aeeeretof f	- Alker.1	- Aryl
			C1-C7	- Aralkyl	- Alkaryl
			C5 -°12	- Alkanoyl	- Alkanoyl
			C6 "C2O	- Alkenyl	- Alkenyl
		C6 "C2O	- Alkinyl	- Alkinyl
		Cl -C18	- Polyhydroxyalkanoyl	- Polyhydroxyalkanoyl
C1 -C7	-COOH (η- 1-8)
C1 -C7	n-COOH (η- 1-12)
C6 -C12	-CO-Arg-Lys-Glu-Val-Tyr
-C0(CH2)n	-CO-(CH0H)n-CO-Arg-Lys-Glu-Val-Tyr
-CO(CHOH)	Wassersto
-CO-(CH2)	C1 -C7
C5 "C12
C6 -C20
C6 -C18
C1 -C7
C1 -C7
C6 -C12

-CC(CH₂J_n-COOH (η» 1-8)

-CO(CHOH)_n-COOH (η« 1-12)

-C0(CH₂)_n-C0-(N -Lye)-SP5 (n« 1-8)

-CO(CHOH)_n-CO-(N -Lys)-SP5 (η» J.-12)

R³I OH, NH₂, NH"⁴, il(R⁴)₂, mit R⁴

^Cl"^C18^<"^Alky1· ty ₁₇

C_ü-C₂₀-Ar«lkyl, Cg-Cgg-Alkaryi, -(CHOH)_n- (n- 1-8),

-(CH₂)_m-NH GIu Lye Arg (m- 1-18) sowie -(CH₀CH₂O)_1n-GIu Lye Arg und -(CH₂CH₂O)_fflNH-Glu Lys Arg (mn 1-10000).

Die herausragenden Vertreter dieser Substanzklasse sind die Mono- und die Diacetylverbindungen des Splenotritine und des Splenopentins. Das Diacetylspienotritin (DAc-SP3) und das Diacetylsplenopontin (DAC-SP5) sind besonders gut handhabbare Verbindungon.

Die erfindungagemäße Wirkung wurde dadurch festgestellt, daß man Knochenmarkotammzellen von Mäusen zusammen mit Leukozyten von Kontrollper.'ionen bzw. von Kranken mit Systemischem Lupus Erythematodee und Spleninsequenzen in halbfestem Agar kultiviert. Dabei werden durch die Leukozyten koloniestimulierende Faktoren gebildet, welche die Knochenmarkstammzellen zur Proliferation (Reifung) anregen. Dabei bilden sich aus stimulierten unreifen Zellendes Knochemarks "Kolonien" reifer Zellen, Wie ersichtlich (Beispiel 1, Tabelle 1), erhöht sich im vorgestellten Testsystem in Abhängigkeit von der Konzentration der Spleninsequenz die Anzahl der Kolonien sowohl bei Kontrollpersonen als auch bei Kranken mit Systemischem Lupus Erythematodee (Methodische Einzelheiten: Schunck, H. et al. (1987): Biomed. Biochim. Acta 46:581).

Spleninsequenzen und ihre Derivate haben sich bei folgenden Erkrankungen des Menschen als therapiewirksam erwiesen:

ZCiUO

Sekundäre Immunodefizienzerkrankungen aller Art, einschließlich der durch Infektion mit dem HXV, bestimmte Leukämieforman, Autoimmunerkrankungen (entzündliche Arthritidbn, Systemiecher Lupus Erythematodes, Sclerodermia progressive, Oermatomyositis).

Die erfindungsgemäß verwendeten Mittel werden in Mengen von 0,05 ^g bis 1,0 mg pro kg Körpergewicht verabreicht. Die tierexperimentellen Untersuchungen zeigen, daß eine optimale Therapiewirkung erreicht wird, wenn das Mittel permanent bis zur vollen Regeneration der immunologischen Reaktivität appliziert wird. Es wurde erstmals bei sekundären Immunodefizienzerkrankungen des Menschen 0Ac-SP5 therapeutisch eingesetzt« Bei allen Patienten (Sekundäre Immunodefizienz als Folge suppressiver therapeutischer Maßnahmen, Immutiodefizienz als Folge einer HIV»Infektion) besserten sich durch die DAc-SP5-Medika..ion sowohl die immunologischen Parameter (objektiv gemessen am Fluoreszenz-Cytoflowmeter) als auch das subjektive Befinden der Patienten. Die Thorapiewirkung läßt sich verbessern, wenn bei HIV-Infizierten das 0Ac-SP5 in Kombination mit einem Hemmstoff der Vermehrung des HIV (Reverse-Transkriptase-Hemmer) angewendet wird.

Ausführungsbeispiele Beispiel 1:

Stimulierte Proliferation (Reifung von Knochenmarkstammzellen durch DAc~SP5 (in vitro Untersuchungen) (Tabelle 1) Knochenmarkstammzellen von 6 bis 8 Wochen alten Mäusen (Stamm C57 Bl) wurden zusammen mit Leukozyten von Kontrollpersonen bzw. von Kranken mit Systemischem Lupus Erythematodes und difforenten Menyen von DAC-SP5 in halbfestem Agar kultiviert. Dabei werden durch die Leukozyten sogenannte koloniestimuliorende Faktoren (Interleukin-3, Granulozyten/ Monozyten-kolonie-stimulierender Faktor usw.) gebildet, welche die Knochenmarkstammzellen zur Proliferation (Reifung) anregen. Dabei bilden sich aus stimulierten unreifen Zellen des Knochenmarks "Kolonien" reifer Zellen. Diese Kolonien können zahlenmäßig erfaßt werden. Wie ersichtlich (Tabelle 1), erhöht sich im vorgestellten Testsystem in Abhängigkeit von der Konzentration des DAc-SP5 die Anzahl der Kolonien sowohl bei Kontrollpersonen als auch bei Kranken mit Systemischem Lupus Erythematoiles 'Methodische Einzelheiten: Schunck, H. et a. (1987): Biomed. Biochim. Acta 46:581).

Tabelle 1

Anzahl der Zell-"Kolonien" nach Kultivierung von Knochenrcarkstan-.mzellen von C57 Bl-Mäusen und Leukozyten von Kontrollpersonen bzw, von Kranken mit Systemischem Lupus Erythematodee in Gegenwart unterschiedlicher DAc-SPö-Konzentrationen (Koloniebildunge-Test), Alle Zahlenwerte repräsentioren die prozentualen Mittelwerte von 4 Parallelkulturen, bezogen auf die "Kolonien" ohne Zusatz von DAC-SP5. (Methodik: Schunck, H. et al. (1987): Biomed. Biochim. Acta 46i581).

Gruppe

Exp. Zoll-"Kolonien" pro 1O^J Knochenmarkzel len ohne und nach Kultivierung der Zellen mit DAC-SP5. Prozentuale Angabe, bezogen auf die "Kolonien" ohne Kultivierung mit DAC-SP5 (= 100%), DAc-SPö-Konzentration pro ImI halbfestem Agar.

10 ,ug 20

Kontroll~	A	99	98	114	125
personen	B	135	136	147	187
Patienten
(Systemischer	A	180	316	270	256
Lupi's Erythe-	B	284	873	642	438
raatodes)

ICfTtO

Beispiel 2:

Beeinflussung der Funktion von Zellen des Knochenmarks durch DAC-SP3 und DAc»SP5 (tierexperimentalla Untersuchungen) (Abbildung)

Drei Monate alte AB/Bln.-Mäuse (Akademie der Wissenschaften der ODR, Berlin-Buch) wurden einmalig .ftit 8OC cGY röntgenbestrahlt. Danach wurden die Tiere in je 3 Gruppen zu je 30 Tieren aufgeteilt und sowohl mit DAc-SP3 als auch mit DAC-SP5 folgendermaßen weiterbehandelt:

Gruppe 1: Nach der Bestrahlung wurde den 30 Tieren Knochenmarkzellen von Tieren des gleichen Inzuchtstammes transplantiert (Injektion von je 5 mal 10 Knochenmarkzellen pro Tier). Anschließend wurdon die Tiere 3 mal wöchentlich mit DAc-SP5 in einer Dosis von 10,ug pro Tier behandelt (intraperitoneale Applikation). Xn differenten Zeitabständen nach der Bestrahlung und während der DAc-SP5-Behandlung wurde mittels des ÜERNE-Plaque-Teets die Fähigkeit der Tiere untersucht. Antikörper zu bildent Dazu wurden die Tiere 5 Tage vor der jeweiligen Untersuchung mit Schafserythrozyten immunisiert. 5 Tage später wurden die Milzzellen der Tiere isoliert, in vitro (OERNE-Plaque-Test) mit Schafserythrozyten in Kontakt gebracht und die als Folge der gebildeten Antikörper entstehenden Plaques (Hämolyseherde) bestimmt. (Modifizierte Methodik nach Eckert, R. st al. (1985): Biomed. Biochim. Acta: 44:1239). Oeder Wert dor Abbildung repräsentidrt den Mittelwert von je 5 Einzelwerten (Antikörperbildung durch die Milzzellen von je 5 Tieren.

Parallel dazu wurde der gleiche Versuch unter Verwendung von DAC-SP3 durchgeführt.

Gruppe 2: Gleiche Behandlung der Tiere wie in Gruppe 1, jedoch keine Therapie der Tiere mit DAc-Sp3 bzw. DAc-SP5.

ίο

Gruppe 3: Alleinige Röntgenbestrahlung der Tiere; keine Transplantation syngener Knochenmarkzellen, keine Therapie der Tiere mit DAc-SP3 bzw. DAc-SP5.

Die Ergebnisse (Abbildung) zeigen, daß unter in vivo Bedingungen Zellen des Knochenmarks durch OAc-SP? bzw. DAc-SP5 beschleunigt zu einer normalen Antikörperbildung befähigt werden. Dies impliziert, daß durch diese Mittel Zellen des Knochenmarks beschleunigt "reifen", d.h, sich schneller in funktionell aktive Zellen differenzieren. Die intraperitoneele Applikation von lO.ug pro Tier 3 mal wöchentlich hatte einen optimalen Effekt, lAig, 2.ug und 4,ug waren unter identischen Bedingungen nicht wirksam, 8 .ug wirkcen suboptimal. Nach Applikation von 20 ,ug und 50 ,ug konnte ein gleichartiger Effekt wie nach der von 10,ug gemessen werden. Durch Spleninsequenzen, z.B. durch DAc-SP3 bzw. DAc-SP5, lassen sich Immunabwehrschwächen des Menschen günstig beeinflussen. Ein derartiger Zustand ist Folge notwendiger therapeutischer Maßnahmen (Bestrahlungstherapie, Zytostatikatherapie) bzw. wird bei AIDS (aquired immunodeficiency syndrome) durch das HIV (human immunodeficiency virus) verursacht.

Abbildung

Antikörperbildung gegen Schafserythrozyten (Plaque-bildende Milzzellen durch AB/Bln.-Mäuse nach einmaliger Röntgenbestrahlung der Tiere mit 800 cGy, nachfolgender Transplantation syngener Knochenmarkzellen und anschließender Medikation mit 10/jg DAC-SP5 3 mal wöchentlich (·) oder ohne DAc-SP5-Behanalung (o). Oeder Wert (Mittelwert - Streuung) repräsentiert den Mitte3wert von mindestens 5 Tieren. Schraffierte Fläche: Plaque-bildende Milzzellen der Tiere ohne Röntgenbestrahlung und ohne DAc-SP5-Behandlung Minimal- und Maximalwerte innerhalb der Versuchezeit von 49 Tagen. Immunisierung der Tiere mit Schafserythrozyten 5 Tage vor der Bestimmung der IgM Plaque-bildenden Milzzellen.

Ro. bestrahlt •t Knochenmarktransplantation

* DAeSBX

Ro.bestrahlt

+ Knochenmarktrans

plantation

Kontrolle

(nur Rö. bestrahlt)

21 28 35 42

Behandliragsdauer in Tagen

12 ZCMGO

Beispiel 3t

Medikation von DAC-SP3 bzw. DAc-SPS und therapeutische Effektivität (tierexperimentelle Untersuchungen) (Tabelle 2)

Drei Monate ale AB/Bln.-Mäuse (Akademie der Wissenschaften der DDR, Barlin-Buch) wurden in 5 Gruppen zu je 20 Tieren aufgeteilt und folgendermaßen behandelt (Tabelle 2):

Gruppe I: koine Röntgenbestrahlung; keine üAc-SP3-bzw.

DAc-SP5-Medikation (Kontrolle) Gruppe II: Bestrahlung mit 600 cGyj keine DAC-3P3- bzw.

DAc-SP5-Medikation Gruppe III: Bestrahlung mit 600 oGyj Applikation von

DAC-SP3 bzw. DAC-3P5 nach Bestrahlung:

1. Woche: 3 mal umtägig 10.ug intraperitonealj

2. bis 4. Woche: 3 mal wöchentlich physiologische NaCl-Lösung.

Gruppe IV: Bestrahlung mit 600 cGy; Applikation von DAC-SP3 bzw. DAC-SP5 nach Bestrahlung: 1. und 2, Woche: wöchentlich 3 aial 10.ug;

3. und 4. Woohe: Applikation von physiologischer NaCl-Löoung 3 mal wöchentlich.

Gruppe V: Bestrahlung mit 600 cGy; Applikation von

10 .ug DAC-SP3 bzw. DAC-SP5 3 mal wöchentlich bis zur 4. Woche.

Vier Wochen nach der subletalen Röntgenbestrahlung und der d.lfferenten DAC-SP3-bzw. DAc-SP5-Medikation wurde bei allen Tieren «1ie Fähigkeit untersucht, Antikörper gegen Schafserythrozyten zu bilden (OERNE-Plaque-Test, s.o.). Wie ersichtlich (Tabelle 2), waren lediglich die Tiere der Gruppe V gleichermaßen wie die der Gruppe I zur Antikörperbildung befähigt (kein signifikanter Unterschied). Dieses Ergebnis zeigt, daß nur eine permanente Applikation von DAc-SPS bzw. DAc-SP5 in einer Dosierung vcn S mal wöchentlich 10 ,ug pro Mauo (lO.ug pro etwa 20g Lebendgewicht) zu einer sehr schnellen Regeneration der Imraunantwort führt.

Zi i

Tabelle 2

Antikörperbildung gegen Schafserythrozyten (Plaque-biidende Milzzellen) durch AB Bln.-Mäuse nach einmaliger Röntgenbestrahlung der Tiere mit 600 cGy und nachfolgender differenter Medikation mit DAc-SP5 bzw. DAC-SP3. Bestimmung der Antikörperbildung 4 Wochen nach der Röntgenbestrahlung. Jeder Wert (Mittelwert - Streuung) repräsentiert den Mittelwert von 20 Tieren.

Tiergruppe

Anzahl Plaque-bildender Milzzellen pro Milz nach einmaliger Röntgenbestrahlung und 4 Behandlungswochen '

DAC-SP5 DAC-SP3

32650 - 4700 8250 - 2000 15550 i 4100 21100 t 2650 30950 ΐ 3100

26350 - 3800 6150 ί 1600 12430 ί 3100 15100 ΐ 1850 24050 - 3900

Behandlungsregime

Tiergruppe Röntgen- DAc-SP5- bzw. DAc-SP3-Medikation bestrahlung

keine keine (Kontrolle)

600 cGy 1. bis 4. Woche: wöchentlich umtägig 3 mal NaCl

600 cGy 1. Woche: umtägig 3 mal DAC-SP5 bzw. DAC-SP3

2. bis 4. Woche: wöchentlich umtägig 3 mal NaCl

600 cGy 1. und 2. Woche: wöchentlich umtägig 3 mal Dac-SP5 bzw. DAc-SP3

3. und 4. Woche: wöchentlich umtägig 3 mal NaCl

600 cGy 1. bis 4. Woche: wöchentlich umtägig 10yug DAC-SP5 bzw. DAC-SP3 pro Tier

NaCl e physiologische NaCl-Lösung Beispiel 4:

Klinische Therapiestudie mit DAC-SP5 bei Erkrankungen des Menschen (Tabelle 3 und 4a/b)

Beispiel 4.1.:

Therapiestudie "Sekundäre Immunodefizienz als Folge einer itnmuno8uppres8iven Therapie" (Tabelle 3) Entsprechend dor tierexperimentelle Befunde wurde DAc-SP5 folgendermaßen in folgender Dosierung verabreicht: Subkutane Gabe von 50mg DAC-SP5, gelöst in 2ml physiologischer NaCl-Lösung, 3 mal wöchentlich (Montag/Mittwoch/ Freitag) bis zur objektiv nachweisbaren Regeneration des Immunsystems.

In Tabelle 5 wird der Behandlungserfolg bei einer Patientin vorgestellt, bei welcher als Folge einer sekundären Immunodefizienz schwere multiple Infekte auftraten· Auch unter Antibiotikatherapie verschlechterte sich der Gesundheitszustand zunehmend. Nach DAc-SP5-Medikation besserte sich das Pufinden der Patientin bei sonst gleichbleibender Antibiotikatherapie innerhalb von zwei Wochen entscheidend. Die Besserung des Befundes (Regeneration des Immunsystems) wurde durch Messungen am Fluoreszenz-Cytoflowmeter (Gerät: EPICS^ ' der Fa. Coulter, Hialeah (Fl.), USA) objektiviert. Dazu wurden Blutzöllen der Patientin isoliert, in vitro mit monoklonalen Antikörpern versetzt, die sich an bestimmte Antigene auf der Oberfläche unterschiedlicher Blutzellen binden. Danach wurden diese Antikörper mit Fluoreszein-isothiozyanat-markierten Antikörpern ebenfalls markiert (Doppel-Markierung). Die

ie

Blutzellen können dadurch hinsichtlich ihrer fluoreszierenden Aktivität mit dem o.g. Gerät gemessen werden. Die Inten· eität der Fluoreszenz jeder Zellart ist somit ein Maß für dernn quantitatives Vorkommen im Blut. Folgende monoklonale Antikörper werden zur Identifizierung und quantitativen Bestimmung der Blutzellen eingesetzt: OKT-3 (CD 3): Gesamtlymphozyten; OKT-4 (CD 4): 7-Helferlymphozyten (Subpopulationen der T-HeIferlymphozyten: CD A⁺ 2H4⁺ _# CD 4⁺ 4BY⁺); OKT-8 (CD 8): T-Suppressorlymphozyten; DR (HLA-Klasse II)i Monozyten (Methodische Details: Falck, P. et al. (1987): Z. Klin. Mod. 42:857).

Tabslle 3

Zytofluorometrischer Nachweis (quantitative Bestimmung) von Monozyten bzw. Lymphozytensubpopulationen mittels raonoklonaler Antikörper bei einer Patientin mit sekundärer Imraunodefizienz vor und unter Diacetyl-Splenopentin-Medikatlon und gleichbleibender sonstiger Therapie '

Parameter

Normalwerte Vor Behandlung

Therapie mit DAC-SP5 (Wochen) 2 3 4

Lymphozyten (Gpt/1) 1,5

CD 3 (Gpt/1) 1,0

CD 4 (Gpt/1) 0,6

CD 4 / CD 8 1.5

DR⁺-Monozyten (Gpt/1) 0

DR⁺-Monozyten (%) 65

3,5	0,29	0,84	0,74	0,83
2.0	0,04	0,39	0,55	0.67
1.3	0,03	0,29	0,34	0,38
3,0	0,58	2,3	2,2	2,4
0,6	0,02	0,08	0,26	0.60
90	16	22	62	72

Details siehe Beispiel 4.1.: Therapiestudie einer immunosuppressiven Therapie"

'Sekundäre Immunodefizienz als Folge

Beispiel 4.2.:

Therapiestudie "DAc-SP5 bei HlV-inflzierten Patienten" (Tabelle 4a/b)

Die Behandlungsercebnisse zeigen Tabelle 4a und 4b. Folgendes Behandlunge-Regime wurde durchgeführt} 3malige subkutane Gabe von je 50mg DAC-SP5 (50mg 0AC-SP5, gelöst in 2ml physiologischer NaCl-Lösung) wöchentlich (Montag/Mittwoch/Freitag) für 4 Wochen; danach subkutane Applikation von je 50mg DAc-SPS 2 n\al wöchentlich (Montag/Freitag). Bei Patient Nr« 2 wurde ab der 4. Behandlungswoche DAc-SP5 lediglich 1 mal pro Woche appliziert (Dotierung: 50mg). Wie ersichtlich (Tabelle 4a und 4b), verschlechterte sich bei keinem der Patienten innerhalb von 16 Behandlungswochen die immunologischen Parameter (Bestimmung am Pluoreszenz-Cytoflowmater, s.o.). Bei Patient 2 (Applikation von DAc-SP5 nur 1 mal wöchentlich) war der objektivierbare Behandlungserfolg geringer. Bei keinem der Patienten kam es innerhalb des Behandlungszeitrauraes zu Nebenerscheinungen bzw. zur Verschlechterung paraklinischer Werte.

Tabelle 4a

Zytofiucroraetrischer Nachweis (quantitative Bestimmung) von Monozyten bzw. Lymphozytensubpopulationen mittels moncklonaler Antikörper bei HIV-infizierten Patienten vor und unter Therapie mit Diacetyl-Splenopentin ' (DAC-SP5;

Patienten Parameter (Krankheitsstadien)

Normalwerte Vor Be- Therapie mit DAc-SP5 (Wochen) handlung 4 8 12 16

Nr. 1 (G.Th.) Lymphozyten (Gpt/1) CDC: HIb

1,5 - 3,5 1,44

CD 3 (Gpt/1) 1,0-2,0 0,04

GD 4 (Gpt/1) 0,6 - 1,3 0,10

CD 4 / CD 8 1,5-3,0 0,21

DR⁺-Monozyten (Gpt/1) O - 0,6 0,10

DR⁺-Monozyten {%) 65-90

2,85^X 2,88^X

0,57 0,17 0,32 n.b.³>

0,55 0,17 0,26 0,28

n.b. 65³

1,88'

0.75

0,28

0.58

n.b.

n.b.

2.02

1,64³

l,01³

1.85⁵

0,26

44

1,63 0.80 0,29 1.50 0,37 74^X

Nr. 2 (S„H.) Lymphozyten (Gpt/1) 1,5 - 3,5 CDC: IVb CD 3 (Gpt/1) 1,0 - 2,0

CD 4 (Gpt/1) 0,6 - 1,3

CD 4 / CD 8 1,5-3,0

DR⁺-Monozyten (Gpt/1) 0 - O₁.6 DR⁺-Monozyten {%) 65 - 90

1,12 0,01 0,06 0,18 0,08 38

1,86* 2,12* 1,34

0,02 0,13 0,20 0,16 30

0, 53 0.43 0.15 0.11 0,22 n.b.

n.b.

0,22 0,20 40

1,24 0,71 0,17 0,24 0,32 37

Details: siehe Beispiel 4.2.: Therapiestudia "DAC-SP5 bei HlV-infizierten Patienten' die mit (x) gekennzeichneten Werte entsprechen Normalwerten n.b. = nicht bestimmt

Tabelle 4b Zytofluorometrischer Nachweis (quantitative Bestimmung) von Monozyten bzw. Lymphozyte.isubpopulationen mittels monoklcnaler Antikörper bei HlV-inflzierten Patienten vor und unter Therapie mit Diacetyl-Splenopsntin ' (DAc-SP5)

Patienten Parameter (Krankheitsstadien)

Normalwerte Vor Be- Therapie mit DAC-SP5 (Wochen) Handlung 4 8 12 16

Nr. 3 (B.A.) CDC: IHb

Lymphozyten (°«t/l) 1,5 -

CD 3 (Gpt/1) i,o -

CD Λ (Gpt/1) 0.6 -

CD 4 / CD 8 1.5 -

DR⁺-Monozyten (Gpt/1) 0

DR⁺-Mcnozyten {%) 65 -

3.5	1.3	3,30X	3,81X	2,58X	1,84
2„0	0.05	0,53	1,18X	1,78X	1.20
1»3	0,02	n.b.3>	0.34	0,30	0,93
3,0	0.05	n.b.	0,21	0,27	0,72
0.6	0,03	0,13	n.b.	0,24	0,41
90	5	32	n.b.	54	67X
3,5	1,30	2,02x	1,07	n.b.	2,24
2.0	0,26	0,68	0,75	n.b.	0,74
1.3	0,08	0,04	0,47	n.b.	0,81
3,0	0,06	0.20	0,27	n.b.	1,10
0.6	0,11	0,23	0.22	n.b.	0.45
90	18	52	53	n.b.	72X

Nr. 4 (S.F.) CDC: Hb

Lymphozyten (Gpt/1) 1,5

CD 3 (Gpt/1) 1,0

CD 4 (Gpt/1) 0,6

CD 4 / CD 8 1,5

DR⁺-Monozyten (Gpt/1) ο

DR⁺-Monozyten (%) 65

Details: siehe Beispiel 4.2.: Therapiestudie "DAc-SPS bei HIV-infizierten die mi'c (x) gekennzeichneten Werte entsprechen Normalwerten n.b. β nicht bestimmt

Patienten¹

21 ΙίίΚ,Ο

Insgesamt kann festgestellt werden, daß DAc-SP5 auch bei HlV-Infizierten einen Therapieeffekt hat. Dieser fällt deutlich schlechter aus als bei Patienten mit sekundärer Immunodefizienz als Folge immunosuppra ;.siver therapeutischer Meßnahmen. Der Therapleeffeki von DAc-SP5 bei HIV-Infizierten läßt sich darauf zurückführen, daß die Substanz bereits Stammzellen des Knochenmarks zum Wachstum bzw« zur Differenzierung anregt. Derartige Stamrnzellen sind noch nicht von HIV befallen, so daß eich als Folge der DAc-SP5-Applikation bei den HIV-Infizierten vermehrt funktionstüchtige Makrophagen/Monozyten, Granulozyten und Lymphozyten bilden können.

Die Wirkung von DAc-SP3 und DAC-SP5 erstreckt sich auch auf bestimmte Leukämieformen bzw. auf eine Behandlung nach operativer Entfernung von Tumoren sowie auf Autoimmunerkrankungen des Menschen (entzündliche Arthritiden einschließlich Arthritis rheumatica, Systemischer Lupus Erythematodes, Sclerodermia progressive, Dermatomyositis).

Claims (3)

1. Patentansprüche

   1. Verfahren zur Herstellung eines Mittels mit direktem stimulate ischem Einfluß auf die Proliferation und Differenzieung von Stammzellen des Knochenmarks, dadurch gekennzeichnet, daß Spleninsequenzen und ihre Derivate eingesetzt werden.
2. 2. Verfahrung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindungen in Mengen von 0,05 bis 1,0 mg/kg eingesetzt werden.
3. 3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Spleninsequenzen insbesondere das Splenotritin der Formel I und das Splenopentin der Formel II sowie ihre Derivate, vorzugsweise in form ihrer Acylverbindungen, vor allem die Monoacetyl- bzw. Dlacetylverbindungen, umfassen

   R¹ - Arg - Lys (R²) - GIu - R³ I

   - Arg - Lys (R²) - GIu - VaI - Tyr II

   und in denen

   R¹: Wasserstoff, C^C^Alkyl, Cg-C^-Aryl, C₆-C₂₀-Alkaryl, C^Cgg-Aralkyl, C₁-C₁₈-AIkBnOyI, C₁-C₇-Alk«nyl,C₁"C₇-Alkinyl, Cg-C.p-Polyhydroxyulkanoyl, -CO(CH₂J_n-COOH (n* 1-8), -CO(CHOH)_n-COOH (η«χ 1-12), -C0(CH₂)_n-C0-Arg-Lys.-Glu-Val-Tyr (n* 1-8) -CO(CHOH)_n-CO-Arg-Lys-Glu-Va.l-Tyr (n= 1-12),

   /3

   R : Wajeerstoff, C,-C_-Alkyl, C_-C. -Aryl,

   1 / O i.e.

   C₁-C₇-AIkOnYl, C₆-C₁₂-Polyhydroxyalenoyl, -CO(CHg)_nCOOH (n- 1-8), -CO(CHOH)COOH (n= 1-12), -CO(CH₂J_nCO-(N -Lye)-SP5 (n» 1-8) und -CO(CHOH)_nCO-(N -L/8)-SP5

   sowie
   R³: OH, MH₂, NHR⁴, N(R⁴J₂, mit R⁴»

   _{118 17} C₁-C₇-AIkInYl, C₅ Aralkyl, Cg-C^-Alkaryl, -(CHOH)_n- (n» 1-8), -₂^ NH GIu Lye Arg (m* 1-18) und -(CH₀CH₂O)_1n-GIu Lye Arg bzw. -(CH₂CH₂O)_1nNH -GIu Lye Arg (m= 1-10000)

   bedeuten.