DD281089A7 - Verfahren zur chromatographischen reinigung von acylierten splenopentin-peptiden - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur chromatographischen Reinigung von Splenopentin-Peptiden auf einen Reinigungsgrad 98% (HPLC), das dadurch gekennzeichnet ist, dasz unterschiedlich acylierte Splenopentine an carboxylierten Kationenaustauschern auf Acrylatbasis mit Divinylbenzen als Vernetzer bei Ionenstaerken zwischen 10 2 und 10 5 entsprechend ihrer Polaritaet getrennt werden. Die Erfindung wird bei der Trennung und Reinigung acylierter Splenopentin-Peptide angewendet.{Chromatographie; Reinigung; Splenopentin; Peptid; Elutionssystem; Ionenstaerke; Polaritaet; carboxylierter Kationenaustauscher}
Description
Anwendungsgebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur chromatographischen Trennung von unterschiedlich acylierten Splenopentin-Peptiden und Nebenkomponenten durch Anwendung von carboxylierten Kationenaustauschern. Acylierte Splenopentine werden als Immunregulatoren in der medizinischen Therapie eingesetzt.
Die Herstellung /on biologisch aktiven Substanzen setzt im immer stärkeren Maße die gleichzeitige Entwicklung hochempfindlicher und ökonomischer effektiver chromatographischer Reinigungsmethoden voraus. Angestrebt wird dabei der Einsatz solcher Verfahren, die einen hohen Substanzdurchsatz, eine gleichmäßige gute Wiederfindungsrate und hohe Systemresolution bei Verwendung einfacher Träger- und Laufmittelsyotime aufweisen.
Die chromatographische Trennung unterschiedlich acylierter Splenopentin-Peptide erfordert auf Grund der geringen Ladungsund damit Polaritätsunterschiede einer Vielzahl von Komponenten die Anwendung aufwendiger und kostspieliger Chromatographietechniken. Vorzugsweise kommen dabei HPLC-Verfahren auf der Basis von RP-Kieselgelen sowie Methoden der polaren Adsorptions- oder Verteilungschromatographie an Normalkieselgelphasen zum Einsatz. Nach dem Vorschlag der DE 3421614 erfolgt die chromatographische Reinigung von Splenopentinen an Kieselgel-Normalphasen in dichlormethanhaltigen Laufmitteln. Es wurde weiterhin bereits vorgeschlagen, die chromatographische Trennung des synthetischen Splenopentin-Rohproduktes durch Adsorptions- bzw. Verteilungschromatographie an Kieselgel 60 unter Einsatz von pyridinhaltigen organischen Laufmitteln durchzuführen. Ähnliche Trennverfahren werden in DE 2804 S66 zur Reinigung von Thymopentin bzw. Monoacethylmopentin vorgeschlagen.
Nachteilig a ι Verfahren auf der Basis von RP- oder Normal-Phasen-Kieselgel ist der hohe apparative bzw. Materialaufwand, der ihren Einsatz bei der Herstellung größerer Mengen hochreiner Produkte ausschließt. Weiterhin sind häufig die geringe Kapazität des S,stems, niedrige Wiederfindungsraten durch unspezifische Adsorption sowie unzureichende RCoolutionsfähigkeit limitierende Faktoren für ihre Anwendung. Üblich-*) lonenaustauschchromatog.aphische Reinigungsverfahren für Peptide werden durch den Einsatz von Salzen während des Elutionsprozesses gekennzeichnet. So erfolgt die in DE 2732587 sowie in DE 2617646 beschriebene chromatographische Reinigung von Nona- bzw. Dekapeptiden durch den Einsatz von Carboxymethylcellulose mit Natriumchlorid bzw. Ammoniumacetat enthaltenden Elutionsmitteln. Zur Reingewinnung der Substanzen ist nachfolgend immer eine aufwendige Entsalzung notwendig.
In DD 242813 wird ein Verfahren zur Reinigung von Insulin an carboxylierten Kationenaustauschern vorgeschlagen. Das Verfahren verfolgt das Ziel, die Abtrennung der Nebenkomponente mit der höchsten Antigenität, des Proinsulins, zu erreichen, das sich vom Insulin durch sein Molekulargewicht, seinen isoelektrischen Punkt und seine Lipophilio deutlich unterscheidet. Nebenkomponenten mit gleicher oder annähernd gleicher Sequenz (Arginin-Insulin, Desamidoinsulin) werden dagegen lediglich abgereichert, ohne daß dabei ein Monokomponent-Insulin ertsteht. So wird denn nach diesem Verfahren ein pi oinsulinfreies Insulin mit einer Produktreinheit von 90 bis 92% (HPLC) gewonnen.
Die geforderte Reinheit chromatographierter Splenopentin-Peptide von > 98% verlangt dagegen ein Reinigungsverfahren, mit dem es gelingt, Nebenprodukte der Synthese, die in der HPLC Retentionszeitunterschiede von 1 bis 2 min aufweisen, quantitativ voneinander zu trennen, ohne daß dabei hohe Sl bstanzverluste eintreten oder kosten- und arbeitsaufwendige Techniken eingesetzt werden müssen.
Das Ziel der Erfindung besteht darin, ein einfaches, effektives Verfahren zur chromatographischen Trennung von unterschiedlich acylierten Splenopentin-Peptiden und Nebenkomponenten aufzuzeigen, das die vorstehend beschriebenen Mängel weitgehend vermeidet.
Der Erfindung liegt die technische Aufgabe zugrunde, eine Methode zur päparativen Trennung von synthetischen acylierten Splenopentin-Peptiden und enthaltenen Nebenkomponenten aufzuzeigen, die zu ei ier Produktreinheit von > 98% führt. Alle zu trennenden Splenopentin-Derivate besitzen die gleiche Aminosequenz und unter? jheiden sich lediglich durch ihren Acylierungsgrad und/oder die Acylierungsposition.
erfolgt erfindungsgemäß die Elution der Peptide isokratisch mit wäßrigen Elutionsmitteln, wobei die notwendige lonenstärkezwischen 10~? 1Ji)Cl 1CT6 durch Zugabe von Säuren, nicht hingegen von Salzen oder Puffersubstanzen, realisiert wird. Dabeigelingt es, selbst Splenopentin-Derivate, die in der HPLC Retent'onszeitunterschiede von nur 1 bis 2min ausweisen, quanitativvoneinander zu trennen, wobei ohne den Einsatz aufwendiger Techniken verlustarm gearbeitet werden kann.
und die Entantiomeren
werden überraschenderweise mit steigendem K'-Wert eluiert und damit entsprechend ihrer Polarität getrennt. Die
anschließende Gefriertrocknung einfach und schonend mit einer durch analytische RP-HPLC bestimmten Reinheit > 98% isoliertwerden.
erfindungsgemäßen Verfahren sind der Einsatz kostengünstiger Chromatographieträgermaterialien und die hohe
Substanz.
wird ein äquimolares Gemisch von Monoacetyl(N°-Arg)-SP 5 und MonoacetyKN'-SP 5 aufgetragen.
werden entsprechend ihrer Polarität (1. Monoacetyl(N°-Arg)-SP 5; 2. Monoacetyl (Nc-Lys)-SP 5) mit einer Wiederfindungsratevon 97% eluiert.
1. Monoacetyl(Na-Arg)-SP 5
2. Diacetyl(N°-Arg, N'-Lys)-SP 5 (Hauptprodukt-Anteil 75% nach HPLC)
3. Triacetyl(Na-Arg, NY-Arg, Ne-Lys)-SP 5
4. Triecetyl(N°-Arg, N'-Lys-O-TyrJ-SP 0
5. Diacetyl (N°-Arg, N'-Lys, D-Tyr)-SP 5
Auf einer Säule von 60cm Länge und 10cm Durchmesser, die 4,51 eines carboxylierten Kationenaustauschers der Korngröße 50μ-90μ enthält, werden 35g eines Splenopentin-Syntheserohproduktes in 150ml Elutionslösung aufgetragen. Die Trennung des Substanzgemisches erfolgt durch isokratische Elution mit 10% Ethanol pH 2,5 (Essigsäure) bei einer Fließgeschwindigkeit von 80ml/min. Das fraktionierte Eluat wird bei 276nm vermessen. Anschließend vereinigt man die Peakvolumina, engt bis zur Trockne ein und lyophilisiert unter Zusatz äquimolarer Mengen Salzsäure
Gesamtwiederfindungsrate-95,6%; Hauptprodukt: 19g (S4,3%); HPLC Hauptprodukt: 98,5% Reinheit.
Claims (2)
1. Verfahren zur chromatographischen Reinigung von Splenopentin-Peptiden auf einen Reinheitsgrad > 98%, dadurch gekennzeichnet, daß unterschiedlich acylierte Splenopentine an carboxylierten Kationenauslauschern auf Acrylatbasis mit Divinylbenzen als Vernetzer in wäßrigen Elutionssystemen bei lonenstärken zwischen 10"2 und 1CT5 entsprechend ihrer Polarität getrennt werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Elution der Substanzen vom Ionenaustauscher vorzugsweise isokratisch mit 10%Ethanolanteil im wäßrigen Elutionsmittel bei pH 2,5 erfolgt.
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- 1987-12-23 DD DD31108087A patent/DD281089A7/de not_active IP Right Cessation
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