DD263778A1 - Verfahren zur herstellung acylierter splenopentine - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von mono- und diacylierten Splenopentinderivaten aus Splenopentin und Acylierungsmitteln, wie N-Acetoxy-norborn-5-en-2,3-dicarboximid und 1-Acetoxy-benzotriazol. Die Erfindung hat das Ziel, neue, immunbiologisch wirksame Peptide zur Verfuegung zu stellen, die die Funktion des Immunsystems bei primaeren und sekundaeren Immundefizienzen wiederherstellen. Das Anwendungsgebiet der Erfindung ist die pharmazeutische Industrie.

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft Verfahren zur Herstellung von Derivaten des Pentapeptids Splenopentin Arg-Lys-Glu-Val-Tyr, bei denen die N^a-Position des Arginins und/oder die N^E-Position des Lysins acyliert sind. Splenopentin und seine Derivate sind auf Grund ihrer immunbiologischen Wirkungen zur therapeutischen Anwendung bei Erkrankungen des Menschen und von Tieren geeignet. Das Anwendungsgebiet der Erfindung ist die pharmazeutische Industrie.

Charakteristik der bekannten Losungen

Im Ergebnis umfangreicher Untersuchungen zui Isolierung und Charakterisierung von Peptiden, die das Immunsystem beeinflussen, wurden in den vergengenen Jahren u.a. aie Thymopoietine und das Splenin (T. Audhya et al.. Biochemistry 20, 6195 [1981]) aus dem Thymus bzw. der Milz isoliert.

Bei unterschiedlicher Organherkunft weisen diese Peptide eine weitgehende Strukturähniichkeit auf; sie bestehen aus 49 Aminosäuren und untersc' eiden sich in ihrer Sequenz nur im Position 34 durch Asparaginsäure bzw. Glutaminsäure voneinander. Hinsichtlic' ihrer biologischen Aktivität unterscheiden sie sich dagegen deutlich. So beeinflussen die Thymopoietine die neur' muskuläre Transmission (M. P. Scheid et al., J. E;<p. Med 147,1727 [1978I). stimulieren die Differenzierung früher T-Zellen und inhibieren die Differenzierung früher B-Zellen.

Splenin stimuliert dagegen die Differenzierung von T- und B-Zellen und weist keine Neuroaktivität auf. Die biologische Wirkqualität des Gesamtmoleküls Splenin wird durch seine Teiise-.juenz 32-36 Arg-Lys-Glu-Val-Tyr (Splenopentin) reproduziert.

Die Hersteüung acylierter Splenopentine ist bisher nicht beschrieben worden.

Ziel der Erfindung

E:> ist das Ziel der Erfindung, immunologisch wirksame Peptide zur Verfügung zu stellen und Verfahren anzugeben, nach denen diese Peptide hergestellt werden können.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Dor Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, Verfahren zu entwickeln, nach denen sich immunologisch w rksame Peptide herstellen lassen. Die Aufgabe wurde dadurch gelöst, daß Splenopentin-Derivate (SP5) der allgemeine ι Formel I,

R'-Arg-Lys(R²K3lu-Val-Tyr (I)

in welcher

R¹: Wasserstoff

C₁-C₇ - Alkyl

C₅-C₁, - Aryl

Ce-C2o - Alkaryl

C₆-C₂₀ - Aralkyl

C)-Ci₈ - Alkanoyl

C₁-C₇ - Alkenyl

C₁-C₇ - Alkinyl

C₆-C₁₂ - Polyhydroxyalkanoyl

-CO(CH₂I_n-COOH (η = 1-8)

-CO(CHOH)_n-COOH (η = 1-12)

-CO-(CHj)_n-CO-Arg-Lys-Glu-Val-Tyr (η = 1-8)

-CO-fCHOHIn-CO-Arg-Lys-Glu-Val-Tyr (η = 1-12) und R²: Wasserstoff

C₁-C₇ - Alkyl

C₅-C₁₂ - Aryl

C₆-C₂₀ - Alkaryl

C₁-C₁S · Alkanoyl

C₁-C₇ Alkenyl

C₁-C₇ - Alkinyl

C₆-Ci₂ - Polyhydroxyalkanoyl

-CO(CH₂I_n-COOH (η = 1-8)

-CO(CHOH)_n-COOH (η = 1-12)

-CO(CH₂)_n-CO-(N-Lys)-SP5 (η = 1-8)

-C0(CH0H)_n-C0-(N-Lys)-SP5 (η = 1-12)

bedeuten, dadurch

hergestellt werden, daß bei Anwendung entsprechender Schutzgruppen sowie unterschiedlicher Acylierungsreagenzien eine selektive Acylierung der N^a-NH₂-Gruppe des Arginine und/oder der N'-NHj-Gruppe des Lysins im Peptid erreicht wird und die Bildung von Nebenprodukten vermieden wird. Verfahren zur Acylierung von Splenopentin sind bisher nicht beschrieben. Es hat sich gezeigt, daß die Verwendung üblicher Acylierungsmittel, wie von Acetanhydrid und von Säurechloriden, beim Splenopentin in erheblichem Ausmaß zur Bildung unerwünschter Nebenprodukte (O-Acyläerung am Tyr, Racemisierung am VaI, Gluta. imid-Bildung) führen. Auch die Umsetzung mit Essigsäure-p-nitrophenylester verläuft nicht nebenproduktfrei; zudem bereitet die Entfernung des dabei entstehenden toxischen p-Nitrophenols, speziell aus argininhaltigen Peptiden, erhebliche Schwierigkeiten.

l::findungsgemäß geling! die selektive Acylierung jedoch bei Verwendung der entsprechenden N-Hydroxy-norborn-B-en^.S-dicarboximidester von Carbonsäuren, im besonderen bei Vep/vendung von N-Acetoxy-norborn-ö-en^.S-dicarboximid (Acetyl-ONB) (II) sowie von 1· Acetoxy-benzotriazol (Acetyl-OSt) (III) zur Herstellung der entsprechenden Mono- bzw. Diacetyl-Splenopentine.

Mit der Hilfe dieser Acylierungsmittel gelingt es, die Mono- und Diacylverbindungen in guten Ausbeuten (90% d. Th.) unter Vermeidung unerwünschter Nebenreaktionen herzustellen. Nach der Acylierung werden die Splenopentine mit Hilfe der in der Peptidchemie üblichen chromatographischen Methoden gereinigt, (preparative HPLC an RP18 in Methanol/Triethylamin/ Ameisensäure) Vertoilungschromatographie an Kieselgel 100 mit Schwyzer System Pyridin/Eisessig/Wasser/Essigester) DieCharakterisierungdergereinigten Produkte erfolgte Ober Aminosäureanalyse, C,H,N-Analyse, Dünnschichtchromatographie in 3 verschiedenen Laufmittelsystemen und HPLC.

Überraschenderweise hat sich gezeigt, daß das überhaupt erstmals als Acotylierungsmittel eingesetzte N-Acetoxy-norborn-5-en-2,3-dicarboximid (Formel II)

ο Λχ\

I CHyC-O-H-KQl JiI

besondere Vorteile aufweist. Auf Grund seiner hohen Hydrolysestabilität besitzt es eine sehr gute Lagerungsstabilität und kann bei Acetylierungen sowohl in organischen wie wäßrigen Medien eingesetzt werden, vor allem wegen seiner hohen Reaktionsfähigkeit mit Aminogruppen auch ohne Basenzusatz und in extrem kurzer Zeit. Das im Reaktionsverlauf entstehende N-Hydroxy-norborn-5-en-2,3-dicarboximid läßt sich leicht abtrennen und ist nicht toxisch, so daß seine Anwendung vor allem in der pharmazeutischen Industrie besonders vorteilhaft erscheint.

Mit der Acylieiung von Splenopentin wird das Ziel erreicht, die enzymatische Abbaustabilität zu erhöhen und damit die Bioverfügbarkeit als immunbiologisch wirksames Arzneimittel zu verbessern.

Durch Vermischen der neuen Verbindungen mit pharmazeutisch akzeptablen Träyerstoffen gelangt man zu den entsprechenden pharmazeutischen Verabreichungsformen.

Zum Nachweis der immunologischen Wirkung werden zwei relevante Modelle verwendet:

— die quantitative Zunahme von T4-Antigenen auf der Oberfläche menschlicher T-Lymphozyten bei Patienten mit systemischem Lupus Erythematodes (SLE) in vitro und

— die Antikörperbildung gegen Schafsorytrozyten (Plaque-bildende Milzzelleii) durch AB/Bln.-Mäuse nach Röntgenbestrahlung.

Ausführungsbeispiele

1. Herstellung von (N^Acetyl-arginyUIN'-acetyl-lysyDglutamylvalyltyrosin (DAC-SP5)

1.1. Synthese von DAc-SP5 durch Umsetzung von SP5 mit N-Acetoxy-norborn-ö-er^.S-carboximid (II)

43,7g (5OmMoI) Arg-Lys-Glu-Val-Tyr-OH χ 3HOAc (SP5) werden in 150ml Wasser gelöst und mit einer Lösung von 33,2g (15OmMoI) Acetyl-ONB in 100ml Dimethylformamid vorsetzt. Man gibt solange Dimethylformamid zu, bis eine homogene Lösung entsteht. Nach einstündigem Rühren bei Raumtemperatur (DC-Kontrolle) wird das Lösungsmittel im Vak. entfernt und der verbleibende Rückstand mit Ether oder Essigester verrieben. Der Feststoff wird abgesaugt, mit Ether gewaschen und im Vak.

über KOH getrocknet.

Ausbeute: 38,54g (92% d.Th.) DAc-SP 5 x HOAc

Anschließend erfolgt Reinigung durch Verteilungscnromatographie. Durch Lyophilisieren aus verd. Salzsäure wird das entsprechende DAc-SP5 χ HCI χ 2H₂Oorhalten.

MG = 850,39

Summenformel: C₃₅H₆₀N₉OnCI

ber. C 49,43 H 7,11 N 14,83

gef. 48,62 7,26 14,00

1.2. Synthese von DAc-SP5 durch Umsetzung von SP5 mit 1-Acetoxybenzotriazol (Acetyl-OBt) (III) Die Umsetzung von SP5mit Acetyl-OBt und Aufarbeitung erfolgt analog 1.1.

Ausbeute: 90%d.Th.

2. Herstellung von Arginyl (N-acetyl-lysyl)glutamylvalyltyrosin (N^e-MAc-SP5)

2.1. Acylierung

1,83g (2mMol) Boc-Arg-Lys-Glu-Val-Tyr-OH χ 2HOAc werden in 5ml Dimethylformamid gelöst und mit 0,487g (2,2mMol) Acetyl-ONB umgesetzt. Nach 1 Stunde wird die Reaktionsmischung in N HCI eingetragen, das ausgefallene Produkt abgesaugt, mit Wasser neutral gewaschen. Nach Umfallen aus Methanol/Essigester werden 1,72g (96,3% d.Th.) Boc-Arg-LyslAct-Glu-Val-Tyr-OÜ x HOAc erhalten.

2.2. Schutzgruppenabspaitung

1,34g (1,5mMol) Boc-Arg-Lys(Ac)-Glu-Val-Tyr-OH χ HOAc werden 30min mit lOmlTrifluoressigsäure/Dichlorethan (1:1) behandelt und nach Abdestillieren der überschüssigen Trifluoressigsäure aus Methanol mit Ether gefällt.

Ausbeute: 1,34g (92,8% d.Th.) Arg~i.ys(Ac)-GkJ-Val-Tyr-OH x 2TFA Durch Lyophilisieren aus verd. Salzsäure wird das entsprechende-MAc-SP5 χ 2HCI erhalten.

MG 809,76 Summenformel C₃₃H₆₆N₉Oi₀CI₂

3. Herstellung von Aiginyl-(N^c-Palmitoyl-lysyl)-glutamylvalyltyrosin (s-Pal-SP5)

3.1. Acylierung

1,83g (2mMol) Boc-Arg-Lys-Glu-Val-Tyr-OH χ 2HOAc werden in 5ml DMF gelöst und mit 0,919g (2,2mMol) PaI-ONB umgesetzt. Die Aufarbeitung und Reinigung erfolgt analog 2.1. Ausbeute: 2,07g (94,6% d. Th.) Boc-Arg-LysfPaD-Gli-Val-Tyr-OH χ HOAc

3.2. Schutzgruppenabspaltung

1,64g (1,5mMol) Boc-Arg-LysfPaD-Glu-Val-Tyr-OH χ HOAc werden 30min mit 10ml Trifluoressigsäure/Dichlorethan (1:1) behandelt und Pdch Abdestillieren der überschüssigen Trifluoressigsäure aus Methanol mit Ether gefällt.

Ausbeute: 1,63g (93,7% d.Th.) Arg-Lys(Pal)-Glu-Val-Tyr-OH x 2TFA Durch Lyophilisieren aus verd. Salzsäure wird das entsprechende e-Pal-SP5 χ 2 HCI erhalten.

MG: 1090,2 Summenformel C₄₃H₉₂N₉O₁₄CI₂

4. Herstellung von (N^a-Acetyl-arginyl)lysylglutamylvalyltyrosin (a-MAc-SPö) 4.1. Acylierung

1,16g (1 mMol) Arg(NO₂)-Lys(Z)-Glu(OBzl)Val-Tyr-OBzl χ TFA werden in 5ml Dimethylformamid gelöst und nach Zugabe von 180μΙ N-Methylmorpholin (oder einem anderen tertiären Amin) mit 0,265g (1,2mMol) N-Acetoxy-norborn-ö-en^.S-dicarboximid umgesetzt.

Nac!'. 30min wird die Reaktionsmischung unter Rühren in N HCI eingetragen, der Niederschlag abgesaugt und mit Wasser gewaschen. Das Produkt v/ird in etwa 10ml Dimethylformamid gelöst und mit 5%iger NaHCO₃-Lösung gefällt, filtriert und mit Wasser gewaschen. Nach Umfällung aus Methanol/Ether werden 1,05g (96,2% d.Th.) geschütztes N°-Acetylsplenopentin erhalten.

4.2. Schutzgruppenabspaltung

Das geschützte Acetylpeptid wird in 90%iger Essigsäure suspendiert und in Gegenwart von Pd-Schwarz hydriert.

Ausbeute: 760,8g (95,6%d.Th.) an N^a-Acetyl-SP5 χ 2HOAc.

MG: 856,94 Summenformel C₃₇H₆JN₉O₁₄

5. Herstellung von (N^a-Palmitoyl-arginyl)lysylglutamylvalyltyrosin (a-Pal-SP5)

5.1. Aclierung

1,16g (1 mMol) H-Arg(NO₂)-Lys(Z)-Glu(OBzl)-Val-Tyr-OBzl χ TFA werden in 5ml Dimethylformamid gelöst und nach Zugabe von 120μΙ NMethylmorpholin (oder einem anderen tertiären Amin) mit 0,626g (1,2mMol) Palmitinsäure-(N-oxy-norbom-5-en-2.3-dicarboximid'-ester umgesetzt.

Nach Aufarbeitung analog 4.1. und Umfällung aus Methanol/Ether werden 1,21 g (94,3% d. Th.) geschütztes N^a-Palmitoylsp!enopentin erhalten.

5.2. Schutzgruppenabspaltung

Das geschützte Palmitoylpeptid wird ii ao%iger Essigsäure suspendiert und in Gegenwart von Pd-Schwarz hydriert. Ausbeute: 920mg 02,7% d. Th.) an N^a-Pal-SP5 x 2HOAc MG: 1035,29 Summenformel: C₅₁H₈₈O₁₃N₉

6. Herstellung von N-Acetoxy-norborn-ö-en^.S-dicarboximid (Acetyl-ONB)

17,92g (0,1 Mol) N-Hydroxy-norborn-5-en-2.3-dicarboximid werden in 100ml Chloroform weitgehend gelöst und bei 0°C unter Rühren 21 ml (0,15 Mol) Triethylamin, danach 19ml (0,2 Mol) Acetanhydrid zugegeben. Nach zweistündigem Rühren bei Raumtemperatur wird das Lösungsmittel weitgehend entfernt, mit Wasser versetzt und c'er Niederschlag abfiltriert. Nach Umkristallisieren aus Isopropanol/Wasser werden 19,33g (87,4% d. Th.) Acetyl-ONB erhalten. Schmp.:112,5-113,5°C

7. Herstellung von i-Acetoxy-benzotriazoKAcetyl-OBt)

13,51g (0,1 Mol) 1-Hydroxy-benzotriazol werden in 100ml Chloroform gelöst. Nach Zugabe von 16,8ml (0,12 Mol) Triethylamin wird auf 0⁰C abgekühlt, unter Rühren 19 ml (0,2 Mol) Acetanhydrid zugegeben und 2 Stunden bei Raumtemperatur nachgerührt. Der nach Entfernen des Lösungsmittels verbleibende Feststoff wird aus Essigester oder Benzen umkristallisiert. Ausbeute: 14,88g (84% d. Th.) Schmp.: 96-98⁰C.

8. Immunbiologische Wirkung von e-MAcSP5

MAcSP-5 (Sequenz 32 bis 36 des Milzhormons Splenin) hat die gleichen bzw. ähnlichen immunbiologischen Wirkungen wie das Gesamtmolekül Splenin. So induziert e-MAcSP-5 die quantitative Zunahme von T4-Antigenen auf der Oberfläche von T-Lymphozyten, die auf der Oberfläche funktionstüchtiger T-Helferlymphozyten nachweisbar sind. Funktionstüchtige T-Helferlyrnphozyten stimulieren die Antikörperbildung. Zum Nachweis einer Erhöhung der Antikörper-Bildung durch ε-MAcSP-5 wurde ein relevantes tierexperimentelles Modell gewählt: AB/Bln.-Mäuse wurden mit Röntgenstrahlen subletal bestrahlt und danach mit bzw. ohne e-MAcSP-5 therapiert. Gleichzeitig erfolgte die Immunisierung der Tiere mit Schafserythrozyten. Da subletal bestrahlte Tiere die Fähigkeit verlieren, quantitativ ausreichend Antikörper zu produzieren, ist eine vermehrte Bildung von Antikörpern gegen Schafserythrozyten bei den e-MAcSP-5 behandelten Tieren ein Maß für die Regen« ation des Immunsystems durch ε-MAcSP-S. ε-MAcSP-ö behandelte Tiere konnten bereits nach 34 Tagen Antikörper in gleicher Menge wie unbestrahlte Kontrolltiere bilden. Im Vergleich dazu waren e-MAcSP-5 unbehandelte Tiere dazu erst 48 Tage nach der einmaligen Röntgenbestrahlung befähigt. Die Erfindung wird anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert (Tabelle 1 und Tabelle 2).

Testung

8.1. Zunahme von T4-Antigenen auf der Oberfläche menschlicher Lyphozyten nach Kontakt mit ε-MAcSP-S. Funktionstüchtige (reife) T-Helferlymphozyten besitzen auf ihrer Oberfläche T4-Antigene, T-Suppressorlymphozyten T8-Antigene. Bei Patienten mit Systemischem Lupus Erythematodes (SLE) wurde mittels monoklonaler Antikörper ein verminderter Gehalt von T4-Antigenen auf der Lymphozytenoberfläche bestimmt. Als Folge therapeutischer Maßnahmen normalisieren sich die Werte. Wurden vor Therapie die Lymphozyten der Patienten mit ε-MAcSP-ö in Kontakt gebracht, war nach 2stündiger Inkubation eine individuell differente, jedoch permanent erhöhte Anzahl von T4-Antigenen nachweisbar (Tabelle 1). Die T8 Antigene (CL^erflächenantigene auf T-Suppressorlymphozyten bzw. zytotoxischen T-Lymphozyten veränderten sich dagegen quantitativ nicht. T4-Antigene nehmen zu, wenn sich T4-Zellen vermehren bzw. wenn die Antigene vermehrt auf ihrer Oberfläche exprimiert werden. Die Untersuchungen ergaben, daß die Lymphozyten der SLE-Patienton nach Kontakt mit -MA SP-5 keine erhöhten ³H-Thymidineinbauraten aufweisen (910 ± 180 Impulse je Minute ohne ε-MAcSP-ö Kontakt/820 ± 210 Impulse je Minute nach Kontakt mit ε-MAcSP-ö; η = 5, keine signifikante Abweichung im t-Test). Wir nehmen daher an, daß die Zunahme der T4-Antigene nicht durch eine Vermehrung von T4-Zellen zustande kommt, sondern Folge einei strukturellen Veränderung der T-Zelloberfläche, möglicherweise identisch mit einem „Reifeprozeß" der Zelle, ist. Reife, funktionstüchtige T-Helferlymphozyten stimulieren die Antikörperbildung durch B-Lymphozyten. Daher wurde untersucht, ob sich nach systematischer ε-MAcSP-ö Applikation die Antikörpt-:rbildung gegen definierte Antigene (Schafserythrozyten) erhöht.

8.2. Antiköi oerbildung nach Immunosuppression und systemischer 8-MAcSP-5-Medikation

Zum Nachweis der Beeinflussung der Antikörperbildung wurde ein relevantes tierexperimentelles Modell verwendet: Vier Monate altes AB/Bln.-Mäuse (Akademie der Wissenschaften der DDR, Berlin-Buch) wurden systematisch (subletal) mit Röntgenstrahlen behandelt (60OcGy) und anschließend mit bzw. ohne c-MAcSP-5 therapiert (Tiergruppen Nr. 1, 2 und 3 der Tabelle 2). Eine weitere Tiergruppe wurde weder röntgenbestrahlt noch mit ε-MAcSP-ö behandelt (GruppeNr.4, Tabelle 2). Die Tiergruppen Nr.2 und 3 wurden umtägig mit entweder 10pg oder 50pg 8-MAcSP-5 behandelt (intraperitoneale Applikation). In differenten Zeitabständen nach Bestrahlung (14.Tag, 20.Tag usw., Tabelle 2) wurde mittels des JERNE-Plaque-Testes (modifiziert nach Eckert et al./V) das Ausmaß der Antikörperbildung der Tiere gegen Schafserythrozyten bestimmt. Dazu wurden die Tiere 5 Tage vor der Untersuchung mit Schafserythrozyten immunisiert (intraperitoneala Applikation von je 5 χ 10⁸ Zellen pro Tier) und an den in Tabelle 2 angegebenen Untersuchungstagen hinsichtlich ihrer Fähigkeit, Antikörper gegen Schafserythrozyten zu bilden, untersucht (Methodische Details siehe/2/).

Es ist bekannt, daß subletal bestrahlte Tiere dio Fähigkeit verlieren, ausreichend Antikörper zu bilden. Eine normale Bildung tritt erst nach einer gewissen Latenzperiode ein, in welcher sich die antikörperbildenden Zellen der Tiere regenieren. In unseren Experimenten konnten die Tiere frühestens 481 age nach der einmaligen Röntgenbestrahlung Antikörper in gleicher Menge wie unbestrahlte Kontrolltiere bilden (kein signifikanter Unterschied zwischen Nr. 1 und 4 am Tag 48, Tabelle 2). Im Vergleich dazu waren mit -MA SP-5 behandelte Tiere schon 34 Tage nach der Röntgenbestrahlung zu einer normalen Antikörperproduktion befähigt (kein signifikanter Unterschied zwischen den Weiten Nr. 2 und 4 bzw. 3 und 4 am Tag 34, Tabelle 2). Die vorgestellten Ergebnisse berechtigen zu der Annahme, daß Immunabwehrschwächen durch e-MAcSP-5 günstig beeinflußt werden können. Ein derartiger Zustand ist angeboren bzw. erworben. Eine erworbene Immunabwehrschwäche kann als Folge notwendiger therapeutischer Maßnahmen (Zytostatikatherapie und Bestrahlungstherapie bei Krebserkrankungen) auftreten, bzw. ist obligat bei AIDS im Spätstadium der Krankheit. Entsprechend der vorgestellten Ergebnisse sollte durch ε-MAcSP-S eine derartige beeinträchtigte Funktion des Immunsystems zumindest partiell behoben worden können.

1 Eckert, R., Pfüller, U., Kindt, Α., Reichelt, E. und Franz, H.: Histaminrezeptor-tragende Lymphozyten. III. Suppression von Immunreaktionen nach Abtöten der Histaminrezeptor-tragenden Lymphozyten durch ein Konjugat aus Hitamin und der Α-Kette des Mislellektins I.

Biomed. Biochim. Acta 44 (1985) 1239-1246

2 Diezel, W., Eckert, R., Forner, K. und Grüner, S.: Functional effects of splenin₃₂__w on antibody formation in immunosuppressed mice. Biomed. Biochim. Acta 45 (1986) 1349-1352.

Tabelle 1

Quantitative Zunahme von T4-Antigenen auf der Oberfläche menschlicher T-Lymphozyten nach Kontakt mit e-MAcSP-5. Bestimmung des T4-Antigens mittels monoklonaler Antikörper (VIT4-CD4 cluster und VIT8-CD8 cluster). T-Lymphozyten von Patienten mit Systemischem Lupus Erythematodes (SLE).

Nr.

Patient (SLE)

T-Zell-Oberflächenantigene (%) T4 T8

Sehr., R.

2.	H., A.
3.	J.,R.
4. .	Ο.,Η.
5.	W., 8.

Kontrolle (K)	1	10
(ohnee-MAcSP-5)
+e-MAcSP-5	54	10
K	48	40
+e-MAcSP-5	60	45
K	44	50
+E-MAcSP-ö	66	48
K	42	12
+ε-MAcSP-ö	65	15
K	45	40
+E-MAcSP-5	67	42

Tabelle 2

Antikörperbildung gegen Schafserythrozyten (Plaque-bildende Milzzellen) durch AB/Bln.-Mäuse nach einmaliger Röntgenbestrahlung der Tiere mit 600c Gy und nachfolgender Behandlung mit e-MAcSP-5. Umtägige Peptidapplikation von 10Mg und50μg pro Tier. Jeder Wert (Mittelwert ± Streuung) repräsentiert den Mittelwert von mindestens 5 Tieren.

Nr.	Bebdiicüung	Anzahl Plaque-bildender Milzzellen pro Milz	Tag 20	Tag 27	Tag 34	Tag4i	Tag 48
		Tag 14	1 500 ± 500	400011000	1200012500	2800017 800	40000 + 6600
1.	Röntgenbestrahlung	1 6001600	440011000	1700012000	41000 + 9500	4400018500	4450014000
2.	Röntgenbestrahl.11	3 20011 500
	+ MASP-5(10Mg)		5 200+ 900	15000 + 3000	39000 + 7 000	n.b.21	n.b.
3.	Röntgenbestrahlung	3000+ 400
	+ MASP-5(50°g)		42 500 + 4000	44000 + 5500	44000 + 8000	4300019300	4350019000
4.	ohneRöntgenbestr.	4410016600
	ohneMASP-5

1) U-Test (Mann und Whithney). Vergleich zwischen Nr. 1/2 und 1/3: Tag 14: p0,05; Tag 20: ρΟ,ΟΟΙ; Tag 34: pu,001: Vergleich Nr. 'h: Tag 41: ρΟ,ΟΙ; Tag 48: kein signifikanter Unterschied.

2) n.b. = nicht bestimmt.

Claims (3)

1. Verfahren zur Herstellung acylierter Splenopentine, dadurch gekennzeichnet, daß Splenopentin bzw. partiell geschützte Splenopentine mit C3rbonsäure-(N-oxy-norborn-5-en-2,3-carboximid)-estern und im besonderen mit N-Acetoxy-benzotriazol (Acetyl-OBt) zu den entsprechenden Acyl-Spenopentinen der allgemeinen Formel I

R'-Arg-LysIR^-Glu-Val-Tyr (I),

in der

R¹: Wasserstoff, C,-C₇-Alkyl, C₅-C₁₂-ArYl, C₆-C₂₀-AlkaryI, Ce-C^-Aralkyl, C,-C,₈-Alkanoyl, C₁-C₇-Alkenyl.C^-Alkinyl.C^-Cu-Polyhydroxyalkanoyl.-COICHzK.-COOHin = 1-8),-CO(CHOH)_n-COOH (n = i-^h-COiCH^n-CO-Arg-Lys-Glu-Val-Tyrin = 1-bj-CO(CHOH )_n-CO-Arg-Lys-Glu-Val-Tyr (n = 1-12)

R²: Wasserstoff, C₁-C₇-AIkYl, C₅-C₁₂-Aryl, Cg-C₂₀-Alkaryl, C₆-C₂₀-ÄraIkyi, C^C^-Alkanoyl, C₁-C₇-Alkenyl, C₁-C₇-AIkIfIyI, Ce-C₁₂-Polyhydroxvalkanoyl,-CO(CH₂)_nCOOH (n = 1-8), -CO(CHOH)COOH (n = 1-12),-CO(CH₂)_nCO-(N-Lys)-SP5(n = 1-8) und-CO(CHuH)_nCO-(N-Lys)-SP 5

sein können, umgesetzt werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet ciaß (N^a-Acetyl-arginyl)(N^E-acetyl-lysyl) glutamyivalyltyrosin erhalten wird durch Umsetzung von Arg-Lys-Glu-Val-Tyr mit N-Acotoxynorborn-5-en-2,3-dicarboximid bzw. 1-Acetoxy-benzotriazol.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Arginyl(N^E-acetyllysyOgluiamylvalyltyrosin erhalten wird durch Umsetzung von N°-Arg-geschütztem Splenopentin mit N-Acetoxy-norborn-5-en-2,3-dicarboximid bzw. 1-Acetoxy-benzotriazol und nachfolgender Abspaltung der N°-Schutzgruppe.