HU197353B - Process for facilitating expression of heterologue genes with synthetic regulation area in escherichia coli - Google Patents

Process for facilitating expression of heterologue genes with synthetic regulation area in escherichia coli Download PDF

Info

Publication number
HU197353B
HU197353B HU853102A HU310285A HU197353B HU 197353 B HU197353 B HU 197353B HU 853102 A HU853102 A HU 853102A HU 310285 A HU310285 A HU 310285A HU 197353 B HU197353 B HU 197353B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
region
sequence
binding site
regulatory region
ribosome binding
Prior art date
Application number
HU853102A
Other languages
English (en)
Other versions
HUT39207A (en
Inventor
Joachim Engels
Michael Leineweber
Eugen Uhlmann
Original Assignee
Hoechst Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hoechst Ag filed Critical Hoechst Ag
Publication of HUT39207A publication Critical patent/HUT39207A/hu
Publication of HU197353B publication Critical patent/HU197353B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C12N15/72—Expression systems using regulatory sequences derived from the lac-operon
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/555—Interferons [IFN]
    • C07K14/57—IFN-gamma

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Transition And Organic Metals Composition Catalysts For Addition Polymerization (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Heterocyclic Carbon Compounds Containing A Hetero Ring Having Oxygen Or Sulfur (AREA)

Description

A találmány tárgya eljárás heterológ gének kifejezésének megkönnyítésére E. coliban szintetikus regulációs terület segítségével.
Eukariotíkus polipeptidek baktériumokban, különösen E. coliban történő géntechnológiai előállításakor a .heterológ* gént, amely a kivánt eukariotíkus polipeptidet kódolja, egy alkalmas vektorba építik be, és ezt a hibridvektort egy baktérium gazdaszervezetbe viszik be. Egy sor feltételnek teljesülnie kell azonban ahhoz, hogy a heterológ gén a kívánt polipeptid termelését kiváltsa. Az egyik alapvető feltétel egy funkcionáló regulátor terület megléte, amely operátorból, promotorból és úgynevezett .Shine-Dalgarno-szekvenciá*-ból áll. Ez utóbbi SD-szekvenciának vagy leegyszerűsítve a továbbiakban .riboszóma-kötőhely *-nek is nevezzük, mivel a riboszómán először az mRNS megfelelő szekvenciája kötődik meg.
A gén helyes kifejeződésének, tehát a kivánt polipeptid termelésének feltétele, hogy a baktérium gazdaszervezet a promotort felismerje. A gazdaszervezetben levő RNS-polimeráz enzim felismeri a promotor DNS-ben levő részszekvenciáját és erre a részszekvenciára kötődik. Ezáltal ezen a területen a kettős szálú DNS felnyílása következik be, és igy az mRNS szintézise a kódoló ágon (transzkripciós ég) elkezdődik.
Az operátort, amely általában a promotorral átfedésben van, egy, a gazdaszervezetben levő represszor-protein ismeri fel. Ennek a represszor-proteinnek a többé vagy kevésbé hatékony kötődése az operátorra szabályozza a transzkripció gyakoriságát. Ezt a rendszert induktorok (indukáló molekulák) befolyásolják, amelyek a represszor-proteinhez kötődnek és igy az operátort aktiválják.
A riboszóma kötőhelyek végül azért felelősek, hogy az mRNS legközelebbi szintetizált része olyan RNS-szekvenciával rendelkezzen, amely a riboszómára való kötődést biztosítja, ahol a transzláció, azaz a polipéptiddé való .lefordítás* folyik.
így tehát a regulációs terület illetékes a génnek a transzkripció (DNS átírása mRNS-sé) és az azt követő transzláció fokozatain át történő expressziójában. Az ilyen regulációs terület felépítésében a nukleotidok sorrendjén kívül fontos a geometria, tehát a promotor, operátor és riboszóma-kötőhely térbeli elhelyezkedése.
A következőkben a nukleotidok számozása a transzkripció kezdetének (nulla) helyéről indul, és a szokásos módon az 5’-től a 3’-irányban folytatódik.
Az E. coli-RNS-polimeráznak megfelelő természetes promotorok két konzervált DNS-szekvenciával rendelkező területet tartalmaznak. Ez egyrészt a -35-terület, másrészt a -10-terület, amely .Pribnow-Schaller-Box* néven is emlegetnek, ahol a számmegjelölés az illető nukleotid-számozására vonatkozik, azaz ezek a területek a transzkripció-start előtt helyezkednek el.
A találmány szerinti eljárásban egy szintetikus úton nyert regulációs szekvenciát alkalmazunk, amely a természetes regulációs szekvencia módosítása útján nyerhető, és amely biztosítja a promotoron az RNS-polimeréz optimális kötődését és az operátor effektív kihasználásét. A találmány szerinti eljárásban alkalmazott regulációs szekvenciát vagy közvetlenül a heterológ gén elé helyezzük, melynek hatására a kivánt polipeptid (metioninnal az aminoterminálison) kiválasztódik, vagy a heterológ gén elé részben vagy teljesen egy baktériumgént kapcsolunk, miáltal egy fúziós protein választódik ki, és igy a kívánt protein aminoterminálisához egy baktérium-proteinrész van kapcsolva.
A találmány szerinti eljárásban alkalmazott promotort, módosított lac-operátort és riboszóma kötőhelyet tartalmazó, E. coli-ban heterológ gének expressziójáért felelős szintetikus regulációs terület a következőkkel jellemezhető:
a) a -35-terület a promotorban a kővetkező nukleotid-szekvenciával rendelkezik (kódoló ág):
TTGACA, és kivánt esetben még egy vagy két nukleotid ennek a szekvenciának bármelyik végén,
b) a -10-terület a promotorban a következő nukleotid-szekvenciával rendelkezik (kódoló ág):
TATAAT, és kívánt esetben még egy vagy két nukleotid ennek a szekvenciának bármelyik végén,
c) a -35- és -10-terület között 14-17 bázispárból álló térköz-csoport van, és
d) a riboszóma kötőhely és az ATG-startkodon között egy 6-14 bázispárból álló térköz-csoport van.
Az előbb említett előnyökön kívül a találmány szerinti eljárásban alkalmazott regulációs terület további előnye az, hogy nagyon jól variálható, és egy sor szinguler restrikciós vágóhely alapján az egyes elemek, nevezetesen a promotor, operátor és riboszóma kötőhely kivágható és ismert módszerekkel kombinálható. Továbbá, a térköz-csoport módosításával a geometria is variálható, és az egyedi eset adottságaihoz még jobban igazítható.
A találmány szerinti eljárásban alkalmazott regulációs terület előállítása előnyösen teljesen szintetikus úton történhet, a jól ismert DNS-szintézis módszerekkel, például a foszfitmódszerrel.
Az I. DNS-szekvencia (1. melléklet) a teljes regulációs terület egy előnyös kiviteli alakja. A Ila-IIh DNS-szekvenciák az I. szekvencia specifikus, előnyös kiviteli alakjai. Az 1., illetve II. szekvencia szintéziséhez az 5’és 3'-végekre mindig rákapcsolunk néhány nukleotidpárt, amelyek a restrikciós enzimek számára a megfelelő vágás megkezdését lehetővé teszik. A Ha DNS-szekvenciát emellett teljesen megadtuk, itt az 5’- és 3’-végeken 3-3 nukleotidpár hozzá van illesztve. Itt természetesen más, illetve több nukleotidpár is hozzá lehetne csatolva.
A következő példákban a találmány szerinti eljárás speciális kiviteli módjait mutatjuk be, amiből szakember számára a változatok és kombinációk sokasága nyilvánvaló. A százalékos értékek tömegszázalékot jelölnek, hacsak nincs másképpen megjelölve.
1. példa
A Ha DNS-szekvencia szintézise
a) Egy egyszálú oligonukleotid kémiai szintézise
A kódoló ág 1-19 nukleotidjait (és további hármat az 5’-végen a Bam Hl vágás megkezdésének lehetővé tételére) tartalmazó la gén-épitőelem példáján bemutatjuk a gén-építóelemek szintézisét. A 3’-végen álló nukleozidot, jelen esetben tehát a timidint (19. sz. nukleotid) ismert módszerekkel [M.J.Gait és munkatársai, Nucleic Acids Rés. 8, 1081-1096 (1980)] szilikagélen (FRACTOSIL, Merck gyártmány) a 2'-hidroxil-csoportokon keresztül kovalensen megkötjük. Ehhez a szilikagélt először etanol lehasitása közben 3-(trietoxi-szilil)-propil-aminnal kezeljük, melynek során a Si-O-Si-kötések kialakulnak. A timidint paranitro-fenol és N,N’-diciklohexil-karbodiimid jelenlétében a módositott hordozóval kezeljük, melynek során a szukcinoilcsoport szabad karboxilcsoportja a propilamin-csoport aminocsoport ját acilezi.
A kővetkező szintézislépésben a báziskomponenst 5’-0-dimetoxi-tritil-nukleozid-3’-foszforossav-monoetil-észter-dialkil-amid vagy -klorid formájában alkalmazzuk, melynek során az adenin N^-benzoil-származék, a citozin N4-benzoil-származék, a guanin N2-izobutiril-származék és az aminocsoportot nem tartalmazó timidin védócsoport nélkül van jelen.
100 mg polimer hordozót, amely 4 pmól timidint tartalmaz megkötve, egymás után a következő szerekkel kezelünk:
a) nitrometán,
b) 1% vizet tartalmazó teli tett cink-bromid-oldat nitrometánban,
c) metanol,
d) tetrahidrofurán,
e) acetonitril,
f) 80 úrnői megfelelő nukleozid-foszfit és
400 Mmól tetrazol 1 ml vízmentes acetonitrilben (5 perc),
g) 20% acetanhidrid tetrahidrofuránban 40% lutidinnel és 10% dimetil-amino-piridinnel (2 perc),
h) tetrahidrofurán,
i) tetrahidrofurán 20% vizzel és 40% lutidinnel,
j) 3% jód kollidin - viz - tetrahidrofurán
5:4:1 térfogatarányú elegyében.
k) tetrahidrofurán és
l) metanol.
A .foszfit' kifejezésen a dezoxiribóz-3’-monofoszforossav-monoetil-észter értendő, ahol a harmadik vegyértéket klór vagy egy tercier aminocsoport, például morfolinocsoport köti le. Az egyes szintézislépések kitermelését a b) detritilezési reakció után spektrofotometriásán a dimetoxi-tritil-kation 496 nm hullámhosszon mért abszorpciójával lehet meghatározni.
Az oligonukleotid szintézisének befejezése után az oligomer metil-foszfát-védöcsoportjait p-tiokrezol és trietil-amin segítségével hasítjuk le. Végül az oligonukleotidot a szilárd hordozóról 3 óra hosszat tartó ammóniás kezeléssel választjuk le. Az oligomer koncentrált ammóniával végzett 2-3 napos kezelése az aminovédőcsoportokat a bázisról teljesen lehasitja. Az igy kapott nyers terméket nagynyomású folyadék kromatogrófiával (HPLC) vagy poliakrilamidgél-elektroforézissel tisztítjuk.
Az Ib-Ih építőelemeket egészen hasonló módon szintetizáljuk, amelyeknek a nukleotid sorrendje a Ila DNS-szekvenciából következik.
b) Az egyszálú oligonukleotidok enzimatikus kapcsolása
Az oligonukleotidok 5’-végi foszforilezéséhez 1,0 nmól Ib és Ic oligonukleotidot 10 nmól adenozin-trifoszfát adagolása mellett 6 egység T4-polinukleotid-kináz 20 m1 50 mmól/l-es Tris-HCl-pufferrel (pH=7,6) készült oldatával, amely 10 mmól/1 magnézium-kloridot és 10 mmól/1 ditiotreitolt (DTT) tartalmaz 30 percig 37 °C-on kezeljük [C.C. Richardson, Progress in Nucl. Acid Rés. 2, 825 (1972)]. Az enzimet 95 °C-on 5 percig tartó kezeléssel dezaktiváljuk.
Az If és lg oligonukleotidokat hasonló módon foszforilezzük.
Az la és Id oligonukleotidokat és a foszforilezett Ib és Ic oligonukleotidokat 40 m1 50 mmól/l-es Tris-HCl-pufferben 5 percig 95 °C-on melegítjük, majd lassan szobahőmérsékletre lehűtjük. Ehhez az elegyhez hozzáadunk 20 mmól magnézium-kloridot, 10 mmól DTT-t és 1 mmól ATP-t, és 100 egység T4-DNS-ligázzal 25 °C-on 16 óra hosszat reagáltatjuk.
Hasonlóképpen kapcsoljuk az le és Ih fragmenseket a foszforilezett If és lg fragmensekkel.
Az Ia-Id (A génfragmens) oligonukleotidok ligázreakciójának termékeit fagyasztva szárítjuk, és 100 m1 pufferoldatban (150 mmól/1 NaCI, 10 mmól/1 Trie-HCl, pH=7,6, mmól/1 magnézium-klorid), amely 200 egység Bam Hl endonukleázt tartalmaz, 37 °C-on 3 óra hosszat inkubáljuk.
Az Ie-Ih oligonukleotidok (B génfragmens) ligázreakciójának termékeit fagyasztva száritjuk, és J.00 μ1 pufferoldatban (100 mmól/1 Tris-HCl, pH=7,5, 50 mmól/1 NaCl, 5 mmól/1 magnézium-klorid), amely 200 egység Eco Rí endonukleázt tartalmaz, 37 °C-on 3 óra hosszat inkubáljuk. Az enzimreakció 95 °C-on 2 percig tartó hőkezeléssel végzett leállítása után az A és B vágott génfragmenseket gélelektroforézissel 15%-os poliakrilamidgélen (karbamid adagolása nélkül, 20x x40 cm, 2 mm vastag) tisztítjuk, ahol markeranyagként Hae III-mal vágott pBR 322-t (Fa. Biolabs) használunk. A DNS-foltok extrakciója és Sephadex G50-en és Sep Pak-on (Fa. Waters) végzett tisztítás után az A és B génfragmenseket .tompa vég ligálással kapcsoljuk. Ilyen módon szintetikus, Ha DNS-szekvenciának megfelelő regulációs területet kapunk, amely a kódoló ág 5’-végén a Bam Hl számára és a 3’-végen az Eco Rí számára tartalmaz toldalékban támadási helyet.
2. példa
A szintetikus kontroli-területet tartalmazó hibridplazmidok
a) A kontroll-terület beépítése pUC 8-ba
A forgalomban levő pUC 8 plazmidot Eco Rí és Bam Hl restrikciós endonukleázokkal ismert módon megnyitjuk, és 1%-os alacsony olvadáspontú agaróz-gélen a kivágott oligonukleotidoktól elválasztjuk. A vágott plazmid visszanyerését a gél felmelegítéssel végzett feloldásával végezzük, az előállító előírásai szerint. Az igy megnyitott pUC 8 plazmidból 1 pg-ot 10 Mg szintetikus kontroli-területtel T4-DNS-ligáz segítségével 14 °C-on egy éjszakán át ligáljuk. Ilyen módon módosított, beépített kontroli-területtel rendelkező pUC 8 plazmidot kapunk. Ezt a hibridplazmidot az
1. ábrán mutatjuk be, ahol a kontrollterületet .SÍP jelzés jelöli, (jelentése: synthetischer idealisierter Promotor).
b) Transzformáció
E. coli K 12 törzset 70 mmól/l-es kalcium-klorid-oldattal történő kezeléssel kompetenssé teszünk, és a hibridplazmid 10 mmól/ /1-es Tris-HCl-pufferrel (pH=7,5) készült szuszpenziójával, amely 70 mmól/1 kalcium-kloridot tartalmaz, kezeljük. A transzformált törzseket ampiclllinrezisztencia alapján szelektáljuk, és a beépített szekvenciát Maxaro-Gilbert féle szekvenciameghatározásBal [A.Maxam és W.Gilbert, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 74, 560-564 (1977)] igazoljuk.
3. példa
A szintetikus kontroli-területet tartalmazó expressziós plazmidok
A forgalomban levő pBR 322 plazmidot Bam Hl és Sál I restrikciós enzimekkel megnyitjuk, és a fent leirt módon 1%-os agarózgélen tisztítjuk. A szintetikus kontrollterületet a módosított pUC 8-ból Eco Rí és Bam Hl enzimekkel végzett vágás után visszanyerjük, 10%-os poliakrilamid gélen tisztítjuk, és végül elektroelúcióval visszanyerjük. Hasonló módon izoláljuk a ^-interferon-gént a megfelelő hibridplazmidokból Eco Rí és Sál I enzimes vágással, 2%-os alacsony olvadáspontú agarózgélen végzett tisztítással, γ-interferont tartalmazó hibridplazmidként pMX 2 plazmidot alkalmazunk, amelynek előállítását a P 3 409 966.2 számú NSZK sztabadalmi leírás írja le. Alkalmazhatjuk azonban a 0 095 350 számú európai szabadalmi leírásban ismertetett plazmidot is.
A linearizált pBR 322 plazmidot, amely szintetikus kontrollterületet és γ-interferon-gént tartalmaz, ismert módon ligáljuk,· így a
2. ábrán bemutatott plazmidot kapjuk.
4. példa
A szintetikus kontrollterület és az ismert erős tac-kontrollterület aktivitásának összehasonlítása
Az ismert pKK 177.3 plazmidot [E.Amann és munkatársai, Gene 25, 167 (1983)] Eco Rí és Sál I restrikciós enzimekkel a fent leírt módon vágjuk és a γ-interferon-gént beépítjük, így ez a tac-kontrollterülethez kapcsolódik. így a 3. ábrán bemutatott plazmidot kapjuk.
A pKK 177.3 plazmidból a tac-kontrollterület eltávolítására Bam Hl ás Sál I emésztést végzünk. Az így linearizált plazmidot a fent leírt módon γ-interferon-génnel és szintetikus kontrollterülettel ligáljuk. igy a 4. ábrán bemutatott plazmidot kapjuk.
A 3. és 4. ábra szerinti hibridplazmidot E. coli K 12-be transzformáljuk, és a baktériumot 2 Yt-tápközegen [Miller, Experiments in Molecular Genetics (1972)] tenyésztjük, mig a rázatott kultúra 578 nm-en mért 1 optikai sűrűségét el nem érjük. A baktériumtenyészet egy részéhez 0,1 mmól IPTG-t (izopropil-tiogalakto-piranozid) adunk, igy a γ-interferon szintézisét 2 óra hosszat indukáljuk.
Végül a baktériumokat lecentrifugáljuk, és lizozimmal, EDTA-val és ultrahangos kezeléssel feltárjuk [Maniatis és munkatársai, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor, (1982)]. A baktériumlizátum interferon-titerét a kö5 vetkező radioimmunassay módszerrel (Celltech) határozzuk meg:
3. ábra szerinti plazmid: l,5xl05 egység/ml
4. ábra szerinti plazmid: lxlO5 egység/ml
Az ismert kitűnő tac-területekkel összehasonlítva a találmány szerinti kontrollterület 5 50%-kal magasabb ^-interferon-kitermelést mutat.

Claims (11)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Eljárás heterológ gének kifejezésének megkönnyítésére E. coliban, azzal jellemezve, hogy a heterológ gén elé leolvasási irányban egy szintetikus regulációs területet építünk, amely promotort, módosított lac-operátort és riboszóma kötőhelyet tartalmaz, és a regulációs terület a következő jellemzőkkel jellemezhető:
    a) a promotorban a — 35-terület nukleotid— -szekvenciája (kódoló ég)
    TTGACA, és kívánt esetben még egy vagy két nukleotid ennek a szekvenciának bármelyik végén,
    b) a promotorban a -10-terület nukleotid-szekvenciéja (kódoló ág)
    TATAAT, és kívánt esetben még egy vagy két nukleotid ennek a szekvenciának bármelyik végén,
    c) a -35- és -10-terület között 14-17 bázispárból álló térköz-csoport található,
    d) a riboszóma kötőhely és az ATG-starkodon között 6-14 bázispárból álló térkőz-csoport található.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a -35-területben
    TTGACAT szekvenciával rendelkező regulációs területet használunk.
  3. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a -10-területben
    GTATAAT szekvenciával rendelkező regulációs területet használunk.
  4. 4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a -35-területben
    CTTGACAT
  5. 5 szekvenciával rendelkező regulációs területet használunk.
    5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a -10 és -35-terület között 15 bázispárból állá térköz10 csoportot tartalmazó regulációs területet használunk.
  6. 6. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a -35 és -10-terület közötti térköz-csoportként, 50%15 -nél több adenozint és timídint tartalmazó csoportot használunk.
  7. 7. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a riboszóma kötőhely és a startkodon között 10
    20 bázispárból álló térköz-csoportot tartalmazó regulációs területet használunk.
  8. 8. Az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a riboszóma kötőhely és a startkodon közötti tér25 köz-csoportként 50%-nét több adenozint és timídint tartalmazó csoportot használunk.
  9. 9. Az 1-8. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy purinban gazdag riboszóma kötőhelyet tartalmazó re30 gulációs területet használunk.
  10. 10. Az 1-9. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy I. DNS-szekvenciával rendelkező módosított lac-operátort tartalmazó regulációs területet
    35 használunk.
  11. 11. Az 1-10. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy lla, DNS-szekvenciával rendelkező módosított lac-operátort tartalmazó regulációs területet
    40 használunk.
HU853102A 1984-08-21 1985-08-13 Process for facilitating expression of heterologue genes with synthetic regulation area in escherichia coli HU197353B (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19843430683 DE3430683A1 (de) 1984-08-21 1984-08-21 Synthetische regulationsregion

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HUT39207A HUT39207A (en) 1986-08-28
HU197353B true HU197353B (en) 1989-03-28

Family

ID=6243523

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU853102A HU197353B (en) 1984-08-21 1985-08-13 Process for facilitating expression of heterologue genes with synthetic regulation area in escherichia coli

Country Status (13)

Country Link
EP (1) EP0173149B1 (hu)
JP (1) JPS6158591A (hu)
KR (1) KR870002259A (hu)
AT (1) ATE46538T1 (hu)
AU (1) AU592062B2 (hu)
DE (2) DE3430683A1 (hu)
DK (1) DK378385A (hu)
ES (1) ES8605033A1 (hu)
FI (1) FI853177L (hu)
GR (1) GR852000B (hu)
HU (1) HU197353B (hu)
PT (1) PT80989B (hu)
ZA (1) ZA856304B (hu)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3514113A1 (de) * 1985-04-19 1986-10-23 Hoechst Ag, 6230 Frankfurt Veraenderung der dna-sequenz zwischen shine-dalgarno-sequenz und startcodon des trp-operons zur steigerung der proteinexpression
FR2598430B1 (fr) * 1986-05-06 1990-02-02 Roussel Uclaf Nouveaux vecteurs d'expression, leur procede d'obtention et leur application pour exprimer une proteine quelconque dans escherichia coli
JP2970811B2 (ja) * 1987-10-30 1999-11-02 オンコゲン ア リミテッド パートナーシップ 原核生物細胞中にポリペプチドを調製するための発現システム
US5268284A (en) * 1988-03-11 1993-12-07 The Upjohn Company Ribosome binding site
JPH03503360A (ja) * 1988-03-11 1991-08-01 ジ・アップジョン・カンパニー リボソーム結合部位
GR1002113B (en) * 1988-09-02 1996-02-02 Oncogen Expression systems for preparation of polypeptides in prokaryotic cells
US6689604B1 (en) * 1998-03-20 2004-02-10 National Research Council Of Canada Lipopolysaccharide α-2,3 sialyltransferase of Campylobacter jejuni and its uses

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL65775A (en) * 1981-05-18 1985-05-31 Genentech Inc Microbial hybrid promotors and plasmids and e.coli comprising them
AU575301B2 (en) * 1982-10-08 1988-07-28 Juridical Foundation, Japanese Foundation For Cancer Research Novel vector
GR81701B (hu) * 1983-01-18 1984-12-12 Lilly Co Eli
FI843351A (fi) * 1983-08-26 1985-02-27 Du Pont Expressionsplasmider foer produktion av specifika proteiner.

Also Published As

Publication number Publication date
PT80989B (pt) 1987-11-11
PT80989A (de) 1985-09-01
FI853177L (fi) 1986-02-22
EP0173149A1 (de) 1986-03-05
JPS6158591A (ja) 1986-03-25
AU4646885A (en) 1986-02-27
DE3573134D1 (en) 1989-10-26
ES8605033A1 (es) 1986-03-01
GR852000B (hu) 1985-12-18
HUT39207A (en) 1986-08-28
FI853177A0 (fi) 1985-08-19
KR870002259A (ko) 1987-03-30
ES546242A0 (es) 1986-03-01
AU592062B2 (en) 1990-01-04
DE3430683A1 (de) 1986-03-06
ATE46538T1 (de) 1989-10-15
EP0173149B1 (de) 1989-09-20
DK378385D0 (da) 1985-08-20
DK378385A (da) 1986-02-22
ZA856304B (en) 1986-04-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI91883B (fi) Menetelmä hirudiinin vaikutusta omaavan polypeptidin valmistamiseksi
EP0046039B2 (en) Synthetic urogastrone gene, corresponding plasmid recombinants, transformed cells, production thereof and urogastrone expression
Rink et al. A large fragment approach to DNA synthesis: total synthesis of a gene for the protease inhibitor eglin c from the leech Hirudo medicinalis and its expression in E. coli
Aoyama et al. Essential structure of E. coli promoter effect of spacer length between the two consensus sequences on promoter function
EP0163406B1 (en) Novel polypeptide expression method
JPH0141312B2 (hu)
FI90436C (fi) Ihmisen gammainterferonin kaltaisesti vaikuttavien polypeptidien valmistus
DK166681B1 (da) Dna-sekvenser, dna-sekvenser og dna-oligonucleotider til brug ved fremstilling af de foerstnaevnte dna-sekvenser, hybridplasmider indeholdende dna-sekvens, vaertsceller indeholdende hybridplasmiderne samt genteknologisk fremgangsmaade til fremstilling af il-2
HU197353B (en) Process for facilitating expression of heterologue genes with synthetic regulation area in escherichia coli
JPH088868B2 (ja) Ｄｎａ配列、その調製法、該配列を含むプラスミドおよび原核細胞における真核細胞遺伝子生産物の合成のためのそれらの利用
JPH07121229B2 (ja) 酸アミド―カルボキシ末端を有するポリペプチドの調製
JPS63304987A (ja) アンギオゲニン類の遺伝子工学産生方法
Aoyama et al. Signal structure for transcriptional activation in the upstream regions of virulence genes on the hairy-root-inducing plasmid A4
US4711847A (en) Preparation of secretin
JP2661959B2 (ja) 二本鎖ｄｎａの製造法
HU197355B (en) Process for preparing signal sequency for the transformation of proteins in expression systems
Luk et al. Tandem transcription-termination sites in the late rightward operon of bacteriophage lambda
NO851065L (no) Genteknologisk fremgangsmaate til fremstilling av human-gammainterferon og middel til gjennomfoering av denne fremgangsmaaten
HU202925B (en) Process for producing expressive vector containing 6/23 consensus promoter

Legal Events

Date Code Title Description
HU90 Patent valid on 900628
HMM4 Cancellation of final prot. due to non-payment of fee