HU195005B - Method and apparatus for quantitative determination of hemoglobin in biologic samples - Google Patents

Description

A találmány tárgya kvantitatív hemoglobin meghatározási eljárás biológiai mintákban, és az ilyen eljárás végrehajtására alkalmas berendezés. Közelebbről a találmány tárgya vizsgálati módszer és berendezés a hemoglobin kvantitatív meghatározására biológiai mintákban, úgy, hogy a hemoglobin nem fluoreszkáló hem részét fluoreszkáló poifirinné alakítjuk, és mérjük annak fluoreszcenciáját. Ez a vizsgálati módszer különösen jól alkalmazható olyan biológiai minták, mint például a széklet és vizelet esetén.

Különböző gyors vizsgálati módszerek ismeretesek a hemoglobin jelenlétének és mennyiségének meghatározására biológiai anyagokban, így pl. székletben. Ezeket a vizsgálati módszereket általánosan alkalmazzák az orvosi gyakorlatban, mint a béltumorok elsődleges kimutatási módját. A becslések szerint több mint egy millió ilyen vizsgálatot hajtanak végre az Amerikai Egyesült Államokban, minden évben. Annak ellenére, hogy ezek a vizsgálatok nem adnak kvantitatív eredményeket, és a hibás vizsgálati eredmények igen nagy személyes és anyagi károkat okoznak, és annak ellenére, hogy a jelenleg ismeretes vizsgálati módszerek jelentős mennyiségű hamis pozitív és hamis negatív eredményt adnak, továbbra is használják őket, mivel más módszer nem ismeretes,

A székletben levő hemoglobin kimutatására szolgáló jelenleg alkalmazott vizsgálati módszerek nem foglalják magukban a hemoglobin hem részének porfirinné való átalakítását és annak fluoreszcenciájának mérését; a jelenleg alkalmazott vizsgálati módszerek índirekt jellegűek, és a hemoglobin peroxidázszerű (pszeudoperoxidáz) aktivitásán alapulnak.

Ezekben a vizsgálatokban színtelen leuko színezékeket alkalmaznak, amelyek hemoglobin jelenlétében egy megfelelő peroxid hozzáadása után elszíneződnek. Ezeknek a vizsgálatoknak azonban vannak bizonyos korlátáik. Először is számos tényező miatt — például a specifikusság hiánya miatt és amiatt, hogy a reaktivitást gyakran gátolják vagy befolyásolják olyan anyagok, mint a vas vagy az aszkorbinsav, vagy a hemoglobin molekula változásai — igen gyakran kapnak hamis pozitív és hamis negatív eredményeket. Másodszor, a szokásos vizsgálatok eredményeinek értelmezése gyakran nehéz, mert az eredményeket csak úgy adják meg, hogy a mintában van-e vagy nincs hemoglobin. Ezen felül az egyes vizsgálati módszerek érzékenysége közötti különbségek következtében, egymáshoz viszonyítva esetenként 20szoros mennyiségű székletet kell alkalmazni, Ennek a fent említett specifikusság hiánynak, valamint a színárnyalatok közötti különbség megítéléséből adódó szubjektivitás következtében a vizsgálati módszerek al2 kalmazhatósága korlátozott. Ezek következtében a klinikai és laboratóriumi módszerek közöl a vér meghatározása biológiai mintákban egyik olyan ritka kivétel, amely kvantitatív módon nem hajtható végre.

Bár még nem áll rendelkezésre olyan kvantitatív módszer a székletben vagy vizeletben levő hemoglobin kimutatására, amely a hem protoporfirinné alakításán alapul, számos vizsgálatot végeztek ezzel kapcsolatosan, így például G. R. Morrison tanulmányában, amelynek címe; Fluorometríc Microdetermination of Heme Protein (Anal. Chem., 37, 1124—1126, /1965/) egy módszert ismertet a hem protein mérésére állati szövetekben, amely szerint a hemet porfirinné alakítják oxálsav alkalmazásával, majd a hem tartalmat fluoreszcenciás elemzéssel határozták meg. Ezzel a módszerrel azonban bizonyos koncentráció fölött a hemoglobin szintet nem tudták meghatározni. A Morrison által leírt körülmények között ugyanis a nagyobb mennyiségű hemoglobint tartalmazó székletmintákat néhány ezerszeresre kellett volna hígítani. Az ilyen nagy hígítás nem megfelelő a nagymennyiségű, sorozatban végzendő vizsgálathoz.

Szükség van tehát egy olyan kvantitatív vizsgálati módszerre és a megfelelő berendezésekre, amelyekkel ezek a vizsgálatok végrehajthatók, továbbá egy olyan készülékre, amely alkalmas a vizsgálati minta összegyűjtésére és előkészítésére, amelyek segítségével a biológiai mintákban, mint például a székletben vagy a vizeletben úgy határozható meg a hemoglobin mennyisége, hogy a hamis pozitív és hamis negatív eredményeket gyakorlatilag kiküszöböljük vagy jelentősen csökkentsük, és amely módszer könynyen alkalmazható nagyszámú vizsgálat elvégzésére.

A találmány szerinti eljárás alkalmazható laboratóriumi méretekben és automatizált eljárásként is. Az általunk kifejlesztett készülék alkalmas a székletminták összegyűjtésére és előkészítésére a laboratóriumi és az automatizált eljárás során is.

A találmány szerinti vizsgálati módszer specifikusnak bizonyult a hem vegyületekre, mint például a hemoglobinra, beleértve a biológiai minta teljes protohem tartalmát is, mentes a mintában levő egyéb anyagok elsősorban a székletben, gyomorsavban, vagy vizeletben előforduló egyéb vegyületek zavaró hatásától, különösen érzékeny, kvantitatív elemzésre alkalmas 0,02 pg/ml hemoglobin koncentrációtól több, mint 1500 pg/ml hemoglobin koncentrációig, és nem befolyásolják olyan vegyületek, mint a vas, az aszkorbinsav, a sósav, az aszpirin vagy az alkohol, amelyekről ismeretes, hogy zavarnak bizonyos leuko színezék vizsgálatokat.

A találmány tárgya eljárás hemoglobin kvantitatív meghatározására széklet-, vizelet, ill. gyomornedv mintákban, oly módon, hogy

-2195005 (1) a vizsgálandó székletből, vizeletből vagy gyomornedvből a hemoglobint meghatározott tömegben vagy térfogatban tartalmazó vizsgálati mintát készítünk, (2) a vizsgálati mintában lévő hemoglobin hem részét egy redukáló savval porfinné alakítjuk, majd megmérjük a minta fluoreszcenciáját, (3) egy korábban kimért fluoreszcencia-koncentráció diagram alapján a vizsgálati minta hemoglobin tartalmát meghatározzuk, minek során az (1) eljárás után adott esetben egy vizsgálati minta részletet a hemoglobin hem részét porfirinné alakítani nem képes redukálószerrel, előnyösen citromsavval kezeljük 100—150°C közötti hőmérsékleten, és a minta fluoreszcenciáját megmérjük, és a (2) eljárásban úgy járunk el, hogy a) a vizsgálati mintában lévő hemoglobin hem részét egy redukáló savval és egy redukáló sóval, előnyösen oxálsavval, ill. vas-oxaláttal vagy -szulfáttal 100—150°C hőmérsékleten kezelve alakítjuk porfirinné, kívánt esetben a vasionokat a mintából eltávolítjuk, majd megmérjük a minta adott esetben előkezelt felülúszó részének fluoreszcenciáját, vagy

b) a vizsgálati mintában lévő hemoglobin hem részét egy redukáló savval és egy redukáló sóval, előnyösen oxálsavval, ill. vas-oxaláttal vagy -szulfáttal, valamint a reakcióelegyet szobahőmérsékleten gélszerű konzisztenciájává alakító hordozóanyaggal, előnyösen nagy molekulatömegű polimerek elegyével összekeverve, a kapott anyagot melegítés hatására elfolyósítva, majd az elegyet lehűtve porfirinné alakítjuk, éá megmérjük a minta fluoreszcenciáját, majd a (3) eljárásban kívánt esetben a 2. eljárás előtt és után mért fluoreszcenciaértékeket egymásból kivonjuk.

Az eljárás során a nem fluoreszkáló hemoglobint kvantitatíve fluoreszkáló porfirinné alakítjuk. Ez az átalakulás végbemegy, ha a mintában levő hem vegyületet egy olyan reakcióelegyben hevítjük, amely megfelelő koncentrációban tartalmaz egy redukáló savat, mint például oxálsavat, és egy redukáló sót, mint például vas-oxalátot. Az eljárás során keletkezett porfirin koncentrációját fluoreszcenciás vizsgálattal határozzuk meg. A fluoreszcenciás mérést szilárd állapotban vagy pedig extrakció, vagy hígítás után folyékony rendszerben hajtjuk végre.

A legtöbb biológiai minta, beleértve a széklet- és vizeletmintákat is, mutat egy bizonyos, általában alacsony fluoreszcenciát, amely nincs kapcsolatban a hem vegyület reakciójával. Ha az eljárást pontosítani kívánjuk, ennek a nem specifikus fluoreszcenciának — beleértve azt is, amely a normálisan kiválasztott porfirinokból származik — a szintjét meg kell mérni egy külön mintában, amelyben citromsavat vagy egy hasonló megfelelő, nem reagáló kompozíciót alkalmazunk az oxálsav — vas-oxalát rendszer helyett. A citromsav nem alakítja át a hemet porfirinné úgy, mint az oxálsav-vas-oxalát rendszer, de megteremti az azonos savas körülményeket a fluoreszcencia méréséhez, abban az esetben, amikor hem tartalmat nem mérünk. Ha a citromsavas mérés során kapott fluoreszcencia értéket kivonjuk az oxálsavas-vas-oxalát mintával mért értékből, akkor megkapjuk azt a fluoreszcencia értéket, amely a hemből képződött protoporfirinre jellemző. Ebből a fluoreszcencia különbségből egy korábban kimért fluoreszcencia-hemoglobin (vagy protoporfirin) koncentráció diagram alapján a hem vegyületek vagy a hemoglobin koncentrációja a székletben, vizeletben, vagy más biológiai anyagmintákban meghatározható.

Egy gyors automata mérési módszer is kialakítható a fenti elv alapján a fluoreszcencia kvantitatív mérésre szilárd rendszerben. Ez az utóbbi egyszerűsített rendszer speciális vonásokat foglal magában, a veszteség (quenching) kiküszöbölésére, amely a fluoreszcenciában a közel ultraibolya fény excesszív abszorpciója miatt fellép (azon a hullámhosszon, amelyen a porfirin legintenzívebben fluoreszkál), amely a hemoglobin és más pigmentek nagy koncentrációjából adódik. Az automatizált eljárás abban az esetben is alkalmazható, ha a reakcióelegy szobahőmérsékleten gél vagy pasztaszerű, de hevítésre folyékonnyá válik.

A találmány tárgyát képezi egy javított berendezés is, egy, a biológiai anyagból vett ismert mennyiségű minta összegyűjtésére és előkészítésére. Az ilyen berendezés különösképpen jól használható székletmínta összegyűjtésére, előkészítésére és a hemoglobin meghatározására ilyen mintákban. Ez a 18 berendezés egy 10 mintavételi eszközből és számos 19a, 19b, 20a, 20b kamrából áll, amelyek mindegyike megfelelő mennyiségű reakcióelegyet vagy nem reaktív kompozíciót tartalmaz. A 10 mintavételi eszköz olyan anyagokból készül, amelyek szobahőmérsékleten szilárdak, de megolvadnak és összekeverednek a vizsgálandó anyaggal a különböző 19a, 19b, 20a, 20b kamrákban olyan hőmérsékleteken, amelyeken az átalakítási reakciót végrehajtjuk. Előnyösen a 10 mintavételi eszköz összetétele hasonló azokhoz az anyagokhoz, amelyek közegként szolgálnak az oxálsavas-vas-oxalátos és a citromsavas mintákhoz.

A találmány tárgyát közelebbről az alábbiakban ismertetjük az ábrákra való hivatkozással.

Az 1. ábra egy székletminta vételére alkalmas 10 mintavételi eszköz keresztmetszetét mutatja.

A 2. ábra egy székletmínta vételére alkalmas 10 mintavételi eszköz keresztmetszetét mutatja, amelyben a 14 hüvely felső állásban van

-3195005

A 3. ábra egy székletminta vételére alkalmas 10 mintavételi eszköz előlnézete.

A 4. ábra egy székletminta vételére alkalmas 10 mintavételi eszköz keresztmetszeti képe a 3. ábra 4—4 vonalai mentén.

Az 5. ábra egy székletminta vételére alkalmas 10 mintavételi eszköz keresztmetszeti képe a 3. ábra 5—5 vonala mentén.

A 6. ábra egy 10 mintavevő' eszköz alsó részének előlnézete, amelyben a kivett minták a 16 mintagyűjtö lyukakban helyezkednek el.

A 7. ábra a 18 berendezés képét mutatja, amelyben a vizsgálatot végrehajtjuk.

A 8. ábra az egyik, 19a kamra belső részét mutatja, benne a 23 reakcióeleggyel és a vizsgálati mintával.

A 9. ábra a 18 berendezést mutatja és a borítékot, amelyben az postára adható.

A 10. ábra egy sematikus rajz, amely a találmány szerinti automata 18 berendezést mutatja.

A 11. ábra egy gél reakcióelegy (oxálsav-vas-oxalát) fluoreszcencíás spektrumát mutatja hemoglobinnal (30. görbe) és anélkül (31. görbe).

A 12. ábra all. ábrán látható fluoreszcenciás spektrum második deriváltját mutatja.

A 13. ábra mutatja a hemoglobin spektrumát oxálsav és vas-oxalát elegyében, valamint a hemoglobin fluoreszcencíás spektrumát a cilromsavban. A függőleges tengelyen vannak a fluoreszcencia értékek, és a vízszintes tengelyen az emissziós hullámhosszok.

A 14. ábra mutatja egy székletminta fluoreszcenciás spektrumát oxálsavas-vas-oxalátos eleggyel kezelve, és ugyanannak a mintának a spektrumát citromsavval kezelve. A függőleges tengelyen vannak a fluoreszcencia értékek, a vízszintes tengelyen pedig az emissziós huliámhosszok.

« A 15. ábra mutatja az összefüggést a hemoglobintartalom és a fluoreszcencia között oxálsavas-vas-oxalátos oldatban vas-szulfát formájában adagolt vas jelenlétében. A hemoglobin koncentrációja látható a vízszintes tengelyen, és a fluoreszcencia értékek vannak feltüntetve a függőleges tengelyen.

A találmány szerinti kvantitatív eljárás három alapvető eljárási lépésből áll. Az első lépés vizsgálati minta készítése a biológiai anyagból, amelyben kvantitatíven meg akarjuk határozni a hemoglobin szintjét; a második lépés a vizsgálati mintában levő hemoglobin nem fluoreszkáló bem részének kvantitatív átalakítása fluoreszkáló porfirinné; a harmadik, a porfirin, valamint a kontroll fluoreszcenciájának megmérése, és a fluoreszcencia különbség összehasonlítása egy kontroll sztenderddel, amelyet ismert hemoglobin koncentrációnál vettünk fel.

A találmány szerinti megoldást kidolgoztuk laboratóriumi alkalmazásra is, folyékony rendszerben való fluoreszcencia méréssel, és automatikus formában is, szilárd rendszer4 ben fluoreszcencia méréssel. A laboratóriumi és az automata vizsgálat sok részlete különbözik, az alapelvek azonban azonosak. Kifejlesztettünk egy 10 mintavételi eszközt is a vizsgálati minták összegyűjtésére és előkészítésére az automatizált eljárásban. A 10 mintavételi eszközzel ismert mennyiségű székletmintát lehet biztosítani, akár a laboratóriumi, akár az automatizált eljárás részére.

A laboratóriumi eljárás során a vizsgálati minta előkészítése első lépésként a vizsgálandó biológiai anyag begyűjtését, összekeverését és súlyának vagy térfogatának meghatározását foglalja magába. A találmány szerinti eljárás és berendezés számos különböző biológiai anyag vizsgálatára alkalmazható, különösen alkalmas azonban székletés vizeletminták esetében, így az előnyös foganatosítási módokat és kiviteli alakokat székletminta vonatkozásában ismertetjük.

Először veszünk és megmérünk egy vizsgálandó székletmintát, amely például 0,5 gramm, Ezt a vizsgálati mintát azután hozzáadjuk kb. 20—40 térfogatnyi sóoldathoz, amely kb. 0,85 % nátrium-kloridot tartalmaz, az oldatot homogenizáljuk, hogy egyenletes székletdiszperziót kapjunk. A vizsgálati mintát azért keverjük össze sóoldattal, hogy a székletet — beleértve annak hemoglobin- és más pigmenttartalmát is — hígítsuk, és növeljük stabilitását. Ismeretes, hogy a hemoglobin alacsony koncentrációban stabilisabb sóoldatban, mint vízben. Előnyösnek találtuk az olyan széklet homogenizátumot, amely a vizsgálati mintából kb. 2,5—5 %-ot tartalmaz, bár a minta mennyisége nem kritikus tényező. A leírt módon elkészített vizsgálati mintát fagyott állapotban, — 15C°--30 C° hőmérsékleten tárolhatjuk felhasználásig.

Amikor a vizsgálat elvégzéséhez minden készen áll, az előkészített vizsgálati mintát összekeverjük egy bizonyos mennyiségű redukáló savval és redukáló sóval. Hevítés hatására a hemoglobin hem része porfirinné alakul. Bár más redukáló savak és sók is alkalmazhatók, redukáló savként előnyösen oxálsavat alkalmazunk, és redukáló sóként előnyösen vas-oxalátot vagy vas-szulfátot használunk. A fenti átalakítási reakció során a vasat eltávolítjuk a nem fluoreszkáló hem molekulából, így vasat nem tartalmazó, fluoreszkáló protoporfirint kapunk, amely az ulíraibolyához közeli fény — hullámhossza kb 408 nm — hatására vörösen fluoreszkál. A protoporfirin akkor is fluoreszkál — bár kevésbé intenzíven —, ha zöld fény hatásának tesszük ki kb. 558 nm hullámhosszon, vagy ha sárga fénnyel világítjuk meg, kb. 600 nm hullámhosszon. Más hasonlóan fluoreszkáló porfirinek nyomnyi mennyiségei is képződhetnek.

Az eljárás előnyös foganatosítási módja szerint 2 mól oxálsavat és megfelelő mennyiségű vas-oxalátot vagy vas-szulfátot 1 %-os

-4195005 oldattá keverünk össze. Bármelyik vas-só alkalmazása egyenes arányosságot teremt a mérhető fluoreszcencia és a hemoglobin koncentráció között egészen a legmagasabb vizsgált koncentrációig, nevezetesen 1620 pg hemoglobin per ml reagálandó oldat (kb. 50 μg hem/ml). A vas-szulfát alkalmazása azonban megnövekedett savassághoz vezet, mivel oxálsavhoz adva kénsavat és vas-oxalátot képez. A vas-szulfátot 20%-os vizes oldat formájában adagoltuk, amelyet frissen kellett készíteni, néhány órával az alkalmazás előtt, mert a vas-só oxidálódik. A vas-oxalát alkalmazása szintén jó linearitást eredményez, amenynyiben az gyakorlatilag tiszta (99 %-os). A vas-oxalátban levő szennyezések hátrányosan befolyásolják a reakció linearitását, alacsony hemoglobin koncentrációknál. Bár mind a vas-szulfát, mind pedig a vas-oxalát, éppúgy mint más vas-sók alkalmazhatók, a vas-oxalát alkalmazása előnyös.

Az 1 %-os vas-oxalát oldat előállításához 1 g vas-oxalátot adunk 99 ml 2 mólos oxálsavhoz. A vizsgálati minta homogenizátumot ezután hozzáadjuk ennek az oldatnak egy részéhez és 90 percig 120C°-ra hevítjük. A reakció gyorsasága és teljes lejátszódása (a hem átalakulása porfirinné) a hőmérséklettel változik; így bár a 60—100 C° közötti hőmérsékleten is porfirinné alakul az elegyben levő hem, a reakció egészen lassan megy végbe. Általánosságban a hőmérséklet és a tartózkodási idő az autoklávban elég kell hogy legyen ahhoz, hogy a hem teljesen porfirinné alakulhasson. Bár az eljárás előnyös foganatosftási módja szerint 20 μΐ vizsgálati minta homogenizátumot 1000 μΐ oxálsav-vas-oxalát oldattal keverünk össze, számos más vizsgálati minta homogenizátum menynyiség alkalmazható, 5 μΐ és 100 μΐ között. Az oxálsav-vas-oxalát oldatot előre el lehet készíteni és —30C°-on tárolni.

A redukáló sónak, ami a találmány szerinti eljárás előnyös foganatositási módja esetén vas-oxalát, fontos szerepe van abból a szempontból, hogy jelenléte nagymértékben növeli a hemoglobin mérés lineáris jellegét, így a találmány szerinti eljárással, széles koncentráció tartományban válik lehetségessé a fluoreszcens porfirin kvantitatív mérése. A vas eltávolítása a hemoglobinból és így a hem molekula átalakítása protoporfirinné három tényezőtől függ; a redukáló közegtől, erősen savas környezettől, és hőtől. A redukáló sav és elsősorban az oxálsav redukáló környezetet és savas körülményeket teremt. Ez egymagában alkalmas a hem eltávolítására a hemoglobin protein részéből, majd a vas eltávolítására a hem-ből, és ezáltal porfirinné alakítására. Azt találtuk azonban, hogy az oxálsav egymagában csak akkor hatásos ebben az átalakítási reakcióban, ha a hemoglobin koncentráció viszonylag kicsi, legfeljebb 15 μg/ml nagyságrendű az oxál8 sav oldatra nézve. Mivel a hemoglobin szint számos biológiai mintában, elsősorban a székletmintákban, ennek többszöröse lehet, az oxálsav vagy bármilyen más redukáló sav önmagában általában nem hatásos és ilyen nagy hemoglobin koncentrációknál nem alkalmazható, hacsak a hemoglobint nem hígítjuk több százszorosára vagy ezerszeresére. Nagyobb hemoglobin koncentrációk kvantitatív meghatározására a vas-oxalát vagy vas-szulfát additív redukáló szerként hat, növeli a redukáló körülményeket, ezáltal elősegíti az átalakulást és biztosítja, hogy a vizsgálati mintában levő hemoglobin hem-jének teljes mennyisége porfirinné alakuljon. Ez egy egyenes vonalú fluoreszcenciás görbét eredményez, amit az a 15. ábrán látható, amely egy bizonyos koncentráció tartomány felett alkalmas mindenféle lehetséges hemoglobin szint meghatározására biológiai mintákban, az ajánlott körülmények között.

A 15. ábrán a hemoglobin koncentrációját mutatjuk be a fluoreszcenciás intenzitás függvényében vas-szulfát adagolása nélkül, illetve 0,1 %, 1,0% és 3,0% vas-szulfát adagolásánál. Amint az látható, a 39 görbe, amelyet vas-szulfát adagolás nélkül vettünk fel, nagyobb hemoglobin koncentrációknál nem lineáris. Ez a linearitás lehetővé teszi, hogy a hemoglobin koncentrációt a fluoreszcenciás intenzitás mérésével és egy sztenderddel való összehasonlításával határozzuk meg. A

15. ábrán a gerjesztési hullámhossz 410 nm, míg az emissziós hullámhossz 660 nm. Ezeket az autoklávozott mintákat a fluoreszcenciás vizsgálat előtt színtelenre hígítottuk.

A laboratóriumi eljárás során előnyösnek találtuk olyan oxálsav oldat alkalmazását, amely kb. 0,1—5,0 % vas-oxalátot tartalmaz; ez a hem teljes mennyiségét protoporfirinné alakítja abban a hemoglobin koncentrációban, amely azokban a biológiai mintákban előfordul, melyekre a találmány szerinti vizsgálatot alkalmazni célszerű. Különösen előnyös az 1,0 %-os vas-oxalát koncentráció alkalmazása.

A hem protoporfirinné történt átalakítását követően az oxálsav és a vizsgálati minta elegyét hagyjuk lehűlni. Ezután megmérjük a fluoreszcenciát. Az elegy elkészítéséhez ehhez a vizsgálathoz két módszer is kínálkozik. Egyrészt az elegyet centrifugálhatjuk, a felülúszó oldatot eltávolíthatjuk, 0,5 mólos oxálsavval hígítjuk és fluoreszcenciáját megmérjük. Ebben az eljárásban a csapadék vas-oxalátból és oldhatatlan székletmaradékból áll, míg a felülúszó oldat tartalmazza az összes, hemből képződött, porfirint, továbbá kis mennyiségű széklet pigmentet, természetes porfirineket és némi vas-oxalátot.

A másik — előnyös — eljárás során az oxálsav és a vizsgálati minta elegyét úgy készítjük elő a fluoreszcenciás méréshez, hogy abból kb. 100 μΙ-t veszünk ki, összerázzuk kb. 1200 μΐ etíl-acetát:jégecet eleggyel 5

-5195005 (4:1 arányú elegy) és kb. 400 μΐ 3 mólos nátrium-acetáttal, majd centrifugáljuk. A felülúszó oldatot ezután fluoreszcenciásan mérjük. Ennek a módszernek az alkalmazása azért előnyös, mert így tisztított és gyakor- ’ Iatilag színtelen oldatot kapunk, így specifikusabb és pontosabb fluoreszcenciás vizsgálat válik lehetővé. Ebben a rendszerben a nátrium-acetát szerepe az oxálsav részleges semlegesítése, egy részének nátrium-oxalát- 1 tá alakítása. A nátrium- és vas-oxalátok nagy része a csapadékban marad a centrifugálás után. A fluoreszcenciát megmérhetjük bármilyen szokásos és megfelelően érzékeny fluoriméterrel vagy spektro-íluorofotométerrel. Az 1 előnyös foganatosítási mód során az eredményeket olyan spektro-fluorofotométerrel mértük, amelyeket az Aminco Bowman vagy Perkin Elmer gyártott. Speciális spektrumok, mint például a második derivált, a szinkron 2 letapogatás és más hasonlók, a Perkin Elmer MPF—44B készülékkel rögzíthetők.

Minthogy az anyagban bizonyos mennyiségű, természetes eredetű fluoreszkáló anyag, beleértve a természetben előforduló protopor- 2 firint és más porfirineket, van jelen, ennek a természetes, általában alacsony érzékű fluoreszcenciának a jelenlétével néha számolni kell. Ezért az eredmény pontosítása céljából kívánt esetben vakpróbát készíthetünk ₃ a vizsgálati minta egyik részletéből. A vakpróba fluoreszcenciájának mérése során azonban az oxálsavat és a vas-oxalátot

1,5 mólos citromsavval helyettesítjük, az eljárás egyebekben azonos. Azt találtuk, hogy 3 a citromsav alkalmazása nem alakítja át a hem jelentős mennyiségét porfirinné (kevesebb, mint 0,2 %-ot), így tehát, amikor ezt a vakpróba oldatot elkészítjük és fluoreszcenciáját megmérjük, a kapott intenzitás 4 szinte teljesen a vizsgálati mintában természetesen jelenlevő porfirinektől és más anyagoktól származik. A jelenlévő hemoglobin kvantitatív meghatározására ezután a vizsgálati minta és a vakpróba fluoreszcencia ér- 4 lékét kivonjuk egymásból, majd egy előre kimért fluoreszcencia-koncentráció diagram alapján a minta hemoglobin tartalmát meghatározzuk.

A fluoreszcenciás vizsgálat során a vizs- 5 gálati mintát gerjesztő fényforrás hatásának tesszük ki, és mérjük az emittált fluoreszcenciát, Az előnyös foganatosítási mód során (extrakció etil-acetáttal) akkor a legjobban értékelhető a fluoreszcencia, ha a gerjesztés 5 kb, 401 nm-en történik. Három gyengébb gerjesztési csúcs található kb. 500 és 580 nm között, amelyek speciális körülmények között valamivel előbb léphetnek fel. Ezeknek a fluoreszcenciás csúcsoknak mindegyikével 6 együtt a fluoreszkáló porfirin a székletmintában éles fluoreszcenciás csúcsot mutat kb,

630 nm-nél. A fluoreszcenciás vizsgálat során ezen a hullámhosszon összehasonlítjuk a fluoreszcencia szinteket mind a vizsgálati θ minta — amelyben a hem átalakult fluoresz6 káló porfirinné —, mind pedig a citromsavas minta etil-acetátos extraktumára. A különbséget ezután összehasonlítjuk a sztenderd értékével és meghatározzuk a hemoglobin konj centrációt. Ha az autoklávozott oldatokat oxálsavval hígítjuk, a gerjesztési hullámhossz 410 nm-nél van és fluoreszcenciát mérhetünk 660 nm-nél. A fluoreszcenciát savas oldatban 610 nm-nél is mérhetjük, de ez utób⁰ bi hullámhossznál a specifikusság csökken. A 13. és 14. ábrák egy citromsavas elegy és egy oxálsav-vas-oxalát rendszer fluoreszcenciás spektrumát mutatják. A 13. ábrán a 34 görbe a hemoglobint tartalmazó oxálsav5 -vas-oxalát rendszer fluoreszcenciás spektruma, és a 35 görbe a hemoglobint tartalmazó citromsavas rendszer fluoreszcenciás spektruma. így a 34 görbe mutatja a porfirinné átalakított hemoglobint. A 35 görbe alapján ⁰ látható az igen kismértékű fluoreszcenciás intenzitásból, hogy a citromsavas rendszer jelentéktelen mennyiségű hemoglobint alakít át porfirinné.

A 14. ábrán a 36 görbe az oxálsav-(vas-oxalát) rendszerben, míg a 37 görbe a citromsavas rendszerben oldott hemoglobin tartalmú székletminta fluoreszcenciás spektruma. A 36 görbe azt mutatja, hogy az oxál₀ sav-(vas-oxalát) rendszerben minden hem vegyület átalakul, a kapott fluoreszcencia érték a minta hemoglobin tartalma és a jelenlévő természetes porfirin mennyisége őszszegére jellemző. A 37 görbe csak a termé5 szetes porfirinek fluoreszcenciáját, továbbá néhány nem porfirin természetű vegyület fluoreszcenciáját mutatja. így a 36 és 37 görbék szerinti fluoreszcencia különbség egy specifikus hullámhosszon az átalakított por0 firin mennyiségére jellemző, amely a találmány szerinti eljárás értelmében egyenesen arányos a mintában levő hemoglobin hem tartalmával. A hemoglobin pillanatnyi kvantitatív értékét úgy határozzuk meg, hogy az ₅ adott hullámhosszon mért fluoreszcenciát összehasonlítjuk egy ismert mennyiségű hemoglobint tartalmazó minta ugyanazon a hullámhosszon felvett spektrumával.

A leírt laboratóriumi eljárást például a következőképpen hajtjuk végre. Először is

2,5 %-os széklet homogenizátumot készítünk konyhasó oldatban. Ezután 100 g reakcióelegyet állítunk elő úgy, hogy 25,5 g oxálsavat, 1,0 g porított vas-szulfátot vagy vas5 -oxalátot és 73,8 ml vizet összekeverünk. Ezeket az alkotórészeket forró vízfürdőn hevítjük, hogy feloldódjanak és összekeveredjenek. A vas-oxalát nagy része oldhatatlan marad. A reakcióelegyet ezután szétosztjuk több csőbe, amelyeket lezárunk és —30 C’on tartunk felhasználásig. Előállítunk 100 g ellenőrző elegyet is, úgy, hogy összekeverünk 28,8 g citromsavat és 71,2 ml vizet. Ezután a 2,5 %-os széklet homogenizátum 50 μΐ-ét adjuk mindegyik csőhöz, amelyben a vizsgálatot végre akarjuk hajtani. Minden

-6195005 egyes csőbe vagy 1,0 ml felmelegített oxálsav-vas-oxalát elegyet, vagy ellenőrző elegyet adunk. A csövek tartalmát ezután jól összerázzuk, majd befedjük őket Saran-fedőkkel, amelyeknek lyukak vannak a tetején. A csöveket ezután autoklávban 90 percig 120°C hőmérsékleten tartjuk, majd hagyjuk szobahőmérsékletre hűlni. A hűtést gyorsítani lehet hideg vízfürdőbe helyezéssel. Az etil-acetátos extrakciót vagy a centrifugálást, és a hígítást 0,5 mólos oxálsavval a korábban már leírt módon hajtjuk végre.

Minthogy a protoporfirin adja a hemoglobin molekulasúlyának kb. 3,37%-át, a porfirin mennyiségére kapott adatokat megszorozzuk 100/3,37-tel, azaz 29,67-dal, hogy megkapjuk a megfelelő hemoglobinmennyiség értékét. A székletmintában a hemoglobin mennyiségét mg/g-ban úgy határozzuk meg, hogy az eredményt megszorozzuk a megfelelő hígítási faktorral.

A találmány szerinti módszer automatizált változata során ugyanazokat az alapelveket alkalmazzuk, amelyeket az előbb ismertettünk. Bizonyos részleteket azonban megváltoztatunk, hogy megkönnyítsük a módszer nagyobb méretekben való alkalmazását. A laboratóriumi módszerhez hasonlóan az automatizált eljárás során is szükség van a vizsgálati minta összegyűjtésére a vizsgálandó biológiai mintából. A laboratóriumi eljáráshoz hasonlóan, az automatizált eljárást is példaként székletmintát véve ismertetjük. Az előnyös foganatosítási mód szerint a vizsgálati mintát az 1—5. ábrákon ismertetett mintavevő készülékkel gyűjtjük össze. Az ábrákon látható, hogy a 10 mintavételt eszköz egy megnyújtott, általában hengeres 12 mintavevő rúdból és 11 fogórészből, amelynek átmérője nagyobb, mint a 12 rúdé, áll. A 12 rúdrész a 11 fogórésszel kapcsolódik a 13 vállhoz. A mintavevő rúdrész egy 15 töréspontot tartalmaz, s ez lehetővé teszi, hogy a 1,2 mintavevő rudat két részre lehessen meghajlítani, miután a vizsgálati mintát őszszegy űjtöttük. A 12 mintavevő rúd alsó vége több 16 mintagyűjtő lyukat tartalmaz, amelyek a 12 mintavevő rúd szélénél helyezkednek el és a vizsgálati minta összegyűjtésére szolgálnak.

A 10 mintavételi eszköz egy általában hengeres 14 hüvelyt is tartalmaz, amelynek belső átmérője kb. megegyezik a 12 mintavevő külső átmérőjével, így lehetővé válik, hogy a 14 hüvely rácsússzon a 12 mintavevő rúdra, úgy, hogy csak kis rés maradjon közöttük. A 12 mintavevő rúd úgy van beállítva, hogy előre meghatározott székletminta mennyiséget vegyen. A 10 mintavételi eszköz működtetéséhez a 14 hüvelyt felemeljük úgy, hogy felső vége a 13 vállrészhez érjen, amint az a 2. ábrán látható. A 12 mintavevő rúd alsó végét ezután leengedjük a székleten keresztül egy pontra, amely közvetlenül a 14 hüvely alsó szintjénél van. Mia12 latt a 12 mintavevő rudat így leengedjük, egyszer vagy kétszer megforgatjuk, így biztosítva, hogy megfelelő mennyiségű minta kerüljön a székletből a 16 mintagyűjtő lyukakba. A 12 mintavevő rudat ezután kihúzzuk a székletből, és a 14 hüvelyt engedjük le az előbbi 12 mintavevő rúd helyén. Minthogy a 12 mintavevő rúd külső átmérője és a 14 hüvely belső átmérője között csak kicsi a különbség, a 12 mintavevő rúdról gyakorlatilag az összes székletet eltávolítjuk, kivéve azt, ami a 16 mintagyűjtő lyukakban marad.

Miután a 14 hüvelyt eltávolítottak, erre már nincsen szükség, és a 12 mintavevő rudat meghajlítjuk a 15 töréspontnál. A 12 mintavevő rúd alsó része, amint azt a 6. ábra mutatja, ezután egy 19a, 19b, 20a, 20b kamrába kerül, a 7. és 8. ábrán szemléltetett módon. A 7. ábra a 18 berendezést mutatja, amelyben számos 19a, 19b, 20a, 20b kamra van. Ezek a kamrák 21 fedővel vannak ellátva, amely rögzített. Mindegyik kamrához egy átlátszó 22 ablak is tartozik, amely eléggé áthatolható a fény számára 350 és 700 nm közötti hullámhosszon. Ez lehetővé teszi az anyag fluoreszcenciájának mérését a kamrán belül, közvetlenül a 22 ablakon át.

Mint azt az alábbiakban részletesen ismertetni fogjuk, a 19a, 19b, 20a és 20b kamrák mindegyike részlegesen meg van töltve egy olyan reakcióeleggyel, amely egy redukáló savból és egy redukáló sóból, így például oxálsav-vas-oxalát reakcióelegyből, vagy egy kontrollelegyből, így pl. citromsavból áll. Az előnyös foganatosítási mód szerint, a 19a és 20a kamrákat úgy töltjük meg a reakcióeleggyel, hogy azokban oxálsavas és vasoxalátos kompozíció legyen, míg a 19b és 20b kamrák tartalmazzák a kontrollelegyet, azaz a citromsavas kompozíciót. Az elegyeket a 19a, 19b, 20a, 20b kamrákban érintkezésbe hozzuk a vizsgálati mintával. A 18 berendezés, amely a kamrákat tartalmazza, sok fajta anyagból készülhet, de előnyösen bármilyen vagy többféle műanyagból, amely a következő tulajdonságokkal rendelkezik. Először is a 19a, 19b, 20a, 20b kamrák, vagy legalább is a 22 ablakok, eléggé átlátszóak kell legyenek ahhoz, hogy a 350 és 700 nm közötti fény áthatoljon rajtuk és így megkönnyítsék a fluoreszcenciás mérést. Másodszor, az anyaguknak nem szabad reakcióba lépnie a reakciótér tartalmával vagy jelentősen befolyásolni a mérést bármilyen egyéb módon. Harmadrészt, az anyaguknak optikailag és kémiailag stabilisnak kell lennie 120C°-ra hevítve autoklávban vagy kemencében.

A találmány szerinti eljárás következő lépése a vizsgálati mintában levő hemoglobin hetn részének átalakítása fémmentes porfirinné. Mint ahogy fentebb a laboratóriumi eljárásnál leírtuk, ezt úgy hajtjuk végre, hogy a kamrákban lévő megfelelő elegyhez hozzáadjuk a vizsgálandó hígított anyag ho7

-7195005 mogenizált, megmért térfogatú részét. Az automatizált eljárás előnyös foganatosítási módja szerint az előkészített vizsgálati mintákat összekeverjük egy redukáló savval és egy redukáló sóval, nevezetesen oxálsavval és vas-oxaláttal, a 19a és a 20a kamrákban. Mind a 19a, mind pedig a 20a kamra egy olyan elegyet tartalmaz, amely 2 mól oxálsavat és 1/18 (0,05) mól vas-oxalátot tartalmaz egy megfelelő hordozóval együtt. A 0,01—0,2 mólig terjedő vas-oxalát koncentráció megfelelő eredményeket ad. A hordozó anyag előnyösen különböző mól tömegű etilén-glikolok elegye. Bár a hordozó anyag különböző koncentrációjú vagy tulajdonságú lehet, így pl. szilárd vagy por, úgy mint üvegszál, cellulózpor vagy fémsók, oxálsavval vagy citromsavval impregnálva, folyadékok stb., a hordozóanyag előnyösen gélszerű, pasztaszerű vagy nem folyós konzisztenciájú szobahőmérsékleten, hogy megelőzzük kifolyását vagy elszivárgását a reakciótérből a 18 berendezésben. A hordozóanyag előnyösen 100 C° feletti hőmérsékleten válik folyékonynyá. A 19a és 20a kamrákban olyan menynyiségű reagenst alkalmazunk, amely megfelelően reakcióba lép a fent leírt 10 mintavételi eszköz segítségévei vett székletminta mennyiséggel.

A 19b és 20b kamrák a 7. ábrán szemléltetett, 18 berendezésben hasonló hordozóanyaggal vannak megtöltve, de egy nem redukáló savat tartalmaznak az oxálsav-vasoxalát elegy helyett. Az előnyös foganatosítási mód szerint ez a nem redukáló sav 1,5 mólos citromsav. így a 19b és 20b kamrákban a vakpróba, vagyis a vizsgálati minta természetes fluoreszcenciáját mérjük meg.

Az előnyös foganatosítási mód szerint a 19a, 19b, 20a és 20b kamrák mindegyikét kb. 50—-60 %-ig töltjük vagy oxálsav-vasoxalát rendszerrel vagy citromsavas elegygyel. Amikor a 12 mintavevő rudat (6. ábra) az összegyűjtött vizsgálati mintával együtt a kamrába visszük, a kamra kb. 65—75 %-ig telik meg, amint az a 8. ábrán látható.

Az egyes 18 berendezésekben az összes kamrák száma változhat; előnyösen azonban mindegyik 18 berendezés megfelelő páros számú kamrát tartalmaz, amely párhuzamos minták vételét teszi lehetővé. Az egyik mintát abban a kamrában használjuk, amelyet a hem-et porfirinné alakítjuk, míg a másikat a kontroll vakpróba kamrában. Így a 7. ábrán szemléltetett 18 berendezésnek összesen négy kamrája van, egyetlen székletürítés alkalmával kapott székletből vett nég^y minta számára vagy pedig két székletürités alkalmával kapott székletből vett két-két minta befogadására. Ezek a minták összegyűjthetők úgy, hogy a beteg az 1—6. ábrán bemutatott módon használja az eszközt, és a kivett mintát egy megfelelő 24 borítékban postára adja (9. ábra), egy központi laboratóriumhoz feldolgozásra és elemzésre.

Feltételezzük, hogy a reakcióelegyet, azaz a redukáló savat és a redukáló sót tartalmazó hordozóanyag és a vakpróba az ínért savval számos különböző összetételben, előállítható. Bár az eljárást végre lehet hajtani folyadék fázisban, szilárd vagy más egyéb típusú rendszerekben, a hordozóanyag konzisztenciája szobahőmérsékleten előnyösen gélszerű, pasztaszerű vagy nem folyékony és kb. 100 C° fölötti hőmérsékleten válik folyékonnyá. A hordozóanyag fluoreszcenciájának igen kicsinynek vagy elhanyagolhatónak kell lennie, hogy elkerüljük a fluoreszcenciás mérés zavarását, továbbá a hordozónak a reakció körülményei között stabilisnak kell lennie. A félig szilárd, gélszerű hordozóanyag alkalmazásának különösen akkor vannak előnyei, hogyha a viszonylag kevéssé gyakorlott egyének használják a módszert és hogyha a mintát postán akarják feladni. Hogy ha ilyen korlátozások nincsenek, előnyös lehet a székletet és a székletmintát közvetlenül az oxálsav-vas-oxalát vizes oldathoz, illetve a citromsavas oldathoz adni, mivel ezek a vizes oldatok kisebb mértékű, nem specifikus (vak) fluoreszcenciát fejtenek ki, mint azok, amelyek gélképző szereket tartalmaznak. Az előnyös foganatosítási mód esetén a hordozóanyag polietilén-glikolok elegyéből és hasonló nagy molekulasúlyú anyagokból, pl. polietilén-oxidokból áll. Egy megfelelő reakcióelegy például az, amely 73,8 g polietilén-gíikcl, 25,2 g oxálsav és 1,0 g porrá tört vas-oxalát elegyét tartalmazza. Ha vas-szulfátot használunk, a vas-oxalátot 1,0 g vas-szulfát helyettesíti. A vakpróbához használt elegy összetétele pl. a következő lehet: 71,2 g polietilén-glikol és 28,8 g citromsav. A fenti elegyek közül az oxálsavas 2 mólos, a citromsavas 1,5 mólos koncentrációjú.

Az automatizált módszer során a következő lépés a vizsgálati mintákat tartalmazó reakcióterek felmelegítése a benne levő reagáló vagy nem reagáló anyagokkal együtt. Mialatt a rendszert felmelegítjük az előnyös 120C° hőmérsékletre, a 12 mintavevő rúd, amelyen a székletminta van, kiengedi a folyékonnyá vált mintát, és így az összegyűjtött székletminta a reakcióelegybe kerül. A 120C°-os hőmérsékletre való hevítés szintén folyékonnyá teszi vagy szolubilizálja a reakcióelegyet, jeleértve az alkalmazott polietilén-glikol közeget és/vagy az oxálsav-vas-oxalát reagenseket, vagy a citromsavas reakcióelegyet. A 19a és 20a kamrákban az oxálsav és a vas-oxalát reakcióba lépnek a székletmintában levő hemoglobinnal és átalakítják a hem részt fluoreszkáló porfirinné. A 19b és 20b kamrákban mennyiségileg jelentős reakció nem játszódik le. Bár feltételezzük, hogy a hevítés különböző hőmérsékleteken és különböző időtartamokig hajtható végre, az automatizált módszer előnyős foganatosítási módja esetén a hevítést megfelelő autoklávban vagy kemencében 120 C° hőmérsékleten 90 percig végezzük. A hőmér-8195005 sékletnek elég magasnak kell lennie ahhoz, hogy a reakcióelegyet elfolyósítsa és elfolyósítsa azt az anyagot is, amelyből a 12 mintavevő rúd készült. A hevítési lépés folyamán a reakcióelegy a székletmintával együtt, az elfolyósodott 12 mintavevő rúd és a hordozó közeg egyenletesen összekeveredik. A hevítési lépést követően ezt az egyenletesen összekeveredett elegyet lehűtjük és újra megszilárdítjuk.

A leírt eljárás figyelembe vételével, amelyben a 12 mintavevő rúd folyékonnyá válik és egyenletesen összekeveredik a reagáló anyagokkal, a 12 mintavevő rúdnak bizonyos sajátosságokkal kell rendelkeznie, így például szilárdnak és merevnek kell lennie, legalább 50 C° hőmérsékletig és folyékonynak 100 C° feletti hőmérsékleten. Emellett tökéletesen összekevert állapotban kell maradnia a reagáló anyagokkal hűtés hatására is, és stabilnak kell lennie annyira, hogy a hevítés vagy a hosszabb ideig való tárolás normál körülmények között szobahőmérsékleten ne okozzon semmilyen jelentős változást kémiai vagv fizikai tulajdonságaiban. A 12 mintavevő rúd emellett olyan anyagból kell készüljön, amely vízben lassan feloldódik és elegyedik a kémiai reakcióeleggyel a 19a, 19b, 20a, 20b kamrában, amikor a hevítés során elfolyósodás következik be. Az is előnyös, ha a 12 mintavevő rúd olyan vegyületekből készül, amelyek hasonlók a reakcióelegyben levőkhöz, így például a polietilén-glikolokhoz; bár ez nem alapvető jelentőségű. A 12 mintavevő rúd ezen felül olyan anyagból kell készüljön, amely nem befolyásolja a hem komponens porfirinné alakulását vagy az ezt követő fluorimetriás mérést. Figyelembe véve ezeket a követelményeket, azt találtuk, hogy a 12 mintavevő rúd elsődlegesen olyan polietilén-glikolból készülhet, amelynek molekulasúlya kb. 20.000, vagy polietilén-oxiddal — amelynek molekulasúlya kb. 100.000, — vagy más polietilén-glikolokkal kombinálva, amelyek módosítják az anyag keménységét a kívánt mértékig. Amint azt korábban említettük, a 14 hüvely, amelyet a mintavétel után eldobunk, ugyanabból az anyagból készülhet, mint a 12 mintavevő rúd. Feltételezzük azonban, hogy számos más, a leírtakból eltérő molekulasúlyú elegy, mely az említett vagy hasonló vegyületekből áll, szintén megfelelő a 12 mintavevő rúd készítéséhez.

Miután a székletmintát és a különböző reakcióelegyet a 19a, 19b, 20a és 20b kamrákban felmelegítettük, majd ezt követően lehűtöttük és újra megszilárdítottuk, mindegyik kamra tartalmát fluoreszcenciásan mérjük. Az eljárás általánosságban azonos azzal, amit a laboratóriumi eljárásnál ismertettünk, azzal az eltéréssel, hogy a folyadékokban a gerjesztő fényforrás áthatol a mintán, ha a fluoreszcenciát jobboldali szögből mérjük, míg szilárd anyag esetén a fluoreszcencia mérését az ablakra merőlegesen kell végezni. A mérés során előnyösen a kontrollként alkalmazott vakpróba fluoreszcenciáját, a 19b és 20b kamrákban kivonjuk a megfelelő minta fluoreszcenciájából, amelyeket a 19a és 20a kamrában mértük. A fluoreszcencia szintek közötti így számított differenciát azután összehasonlítjuk egy ismert koncentrácíojú hemoglobin sztenderd fluoreszcenciás intenzitásával, és kiszámítjuk a vizsgálati minta hemoglobin tartalmát. Míg a fenti lépések utólag végrehajtott számítással is elvégezhetők, az előnyös foganatosítási mód esetén a fluoreszcenciás mérést, továbbá a vakpróba fluoreszcenciájának kivonását a minta fluoreszcenciás intenzitásából és ennek a különbségnek a sztenderddel való öszszehasonlítását, továbbá a hemoglobin kvantitatív szintjének meghatározását automatikusan végezzük, egy megfelelően beállított mikroprocesszorral.

Így tehát a hűtés után (25 autokláv) a 18 berendezést eltávolítjuk a 24 borítékból (9. ábra), amelyben a vizsgálati mintát postára adták, és egy mozgó lemezre vagy 26 szállítószalagra vagy más megfelelő szállítóeszközre helyezve a fluoreszcenciás mérést elvégző 28 fluoriméterhez továbbítjuk. A 19a, 19b, 20a és 20b kamrák mindegyikében levő minták fluoreszcenciáját úgy határozzuk meg, hogy a mintákat megfelelő fényforrás (szűrő vagy inonokrométer) hatásának tesszük ki, és egy fotodetektor rendszert alkalmazunk. Az egyes kamrákban mért fluoreszcenciás intenzitást azután közvetlenül betápláljuk a 29 mikroprocesszorba, ahol elemezzük, és a vizsgálati mintában levő hemoglobin térfogategységre eső mennyiségét kvantitatívan kiszámítjuk. (10. ábra).

A leírt eljárás során bizonyos speciális elővigyázatossági intézkedések szükségesek a kamrák tartalmának közvetlen fluoreszcenciás mérésekor. Ezekre az elővigyázatossági intézkedésekre elsősorban a váltakozó veszteségek (»quenching«) miatt van szükség, amelyek a fluoreszcenciás intenzitást befolyásolják a közel ultraibolya fény (kb. 410 nm) exesszív abszorpciója miatt, amelyet általában a porfirin fluoreszcenciás gerjesztésére alkalmaznak. Ez a fényabszorpció felléphet akkor, ha különösen nagy mennyiségű porfirin, epefestékek vagy ételrészecskék, vagy más hasonló anyagok vannak jelen. így hacsak a mérést nem megfelelő elővigyázatossággal végezzük, nagymértékű quenching léphet fel. amely csökkenti a fluoreszcenciás intenzitást, és így a hemoglobin számított mennyisége kisebb lesz, mint az a mennyiség, ami valójában jelen van a székletmintában.

Ez ellen úgy lehet védekezni — ha megfelelő műszer nem áll rendelkezésre —, hogy a reakciót folyékony közegben hajtjuk végre, és a próbát is hevítéssel olvasztjuk meg. A megmért aliquot részt azután eltávolítjuk, és 9

-9195005 fluorimetriásan megmérjük megfelelő hígítást és/vagy extrakciót követően, ahogy azt a laboratóriumi eljárás során már leírtuk. Folyékony rendszerben az ún, »quenching« általában egy olyan probléma, amely egyszerűen megoldható az oldat további hígításával, és a fluoreszcenciás mérés ezt kővető végrehajtásával. Ezt célszerűen automatizált rendszerben végezzük, de manuálisan is végrehajtható. Az automatizált rendszerben kb. 10—30 pl folyékonnyá tett oldatot adunk 100—300 pl 0,5 mólos oxálsavhoz. Ezt az elegyet azután összekeverjük és átengedjük egy keskeny mikrocellán fluorimetriás analízis céljára. A fluoreszcenciás gerjesztés hullámhossza látható fénynél a porfirin gerjesztési maximumánál kb. 555 nm-nél vagy 590—600 nm-nél célszerű, mivel az utóbbi hullámhosszak, — különösen az 590—600 nm-ig terjedő — viszonylag kismértékű nem specifikus fényabszorpciót mutatnak, és ezért elhanyagolható mértékű a fluoreszcenciás »quenching« az ilyen hígított mintákban. Ezek a hullámhosszak kisebb mértékű nem specifikus fluoreszcenciát gerjesztenek a széklet, vizelet és a félszilárd gélek előállítására használt hordozók alkotórészeiben is, mint az általában javasolt közel ultraibolya gerjesztési hullámhosszak.

Számos más lehetőség is van, amely megfelel az automatizálás céljának. Ezek közül a legfontosabb a fluoreszcencia mérése közvetlenül az autoklávozott mintában, a íluoreszcenciás »quenching« — amely a fényabszorpció következtében lép fel — automatikus korrigálásával. Ez a komputer által végrehajtott korrekció azon alapul, hogy a fényabszorpciót és a fluoreszcenciát egyidejűleg határozzuk meg visszavert (vagy transzmittált) fény alkalmazásával és egy külön fotócsövét használva az abszorbanciás méréshez. A második derivált fluoreszcenciás spektrum alkalmazása vagy egy nem reagáló és nem fluoreszkáló pigment adagolása, amelynek fényabszorpciója nagymértékben meghaladja bármely más, a kamrában jelenlevő anyagét, szintén megfontolást érdemel. Az utóbbi esetben gyakorlatilag konstans fluoreszcenciás »quenching«-et lehet megfigyelni változó (és ekkor viszonylag elhanyagolható) mennyiségű székletpigment jelenlétében is.

A fluoreszcenciás spektrum második deriváltjának alkalmazása jelentős előnyökkel járhat. A 11. ábrán az emissziós hullámhossz (nm) függvényben ábrázoltuk a hemoglobint tartalmazó minta (30 görbe) és a hemoglobint nem tartalmazó minta (31 görbe) fluoreszcenciás intenzitását. A hemoglobint nem tartalmazó minta csak a reagenseket tartalmazza (vakpróba). Ebben a fluoreszcenciás spektrumban a fluoreszcenciás intenzitás 550—700 nm-ig terjed, 408 nm gerjesztési hullámhossz mellett. Mint az látható a fluoreszcenciás intenzitás 608 nm hullámhossznál a 30 görbe szerinti mintára kb. 10

8200, összehasonlítva a 31 görbe szerinti vakpróba azonos hullámhosszon mért 4500 fluoreszcenciás intenzitásával. így a vizsgálati minta fluoreszcenciás intenzitása nem egészen kétszerese a vakpróba fluoreszcenciás intenzitásának. Bizonyos komputeres berendezésekkel azonban ennek a fluoreszcenciás spektrumnak a második deriváltja előállítható, és ez kiküszöböli a nem specifikus vakpróba fluoreszcenciáját. A 12. ábra a 11. ábrán látható fluoreszcenciás spektrum második deriváltját mutatja. Speciálisan a 32 görbe mutatja a 30 görbe második deriváltját és a 33 görbe szemlélteti a 31 görbe második deriváltját. A fluoreszcenciás spektrumoknak ezekben a második deriváltjában a fluoreszcenciás intenzitást úgy mérjük, mint egy különbséget a 31 és 30 görbe egymást követő minimumai a maximumai között, a 32 és 33 görbe vonatkozásában egyaránt. A 32 görbére nézve, amely hemoglobin tartalmú mintára vonatkozik, ez a különbség közelítően 4900, a különbség a pozitív értékben 587 nm-nél és a negatív értékben 604 nm-nél. A vakpróba esetén ez a különbség gyakorlatilag nulla. Ez a mérési módszer jelentősen javítja a vizsgálat pontosságát és érzékenységét.

Bár az előnyös foganatositási módokat részletesen ismertettük, számos változtatás és módosítás hajtható végre a módszeren és a találmány szerinti készüléken anélkül, hogy eltérnénk a találmány alapgondolatától,

Claims (9)

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1) a vizsgálandó székletből, vizeletből vagy gyomornedvből a hemoglobint meghatározott tömegben vagy térfogatban tartalmazó vizsgálati mintát készítünk,

1. Eljárás hemoglobin kvantitatív meghatározására széklet-, vizelet, ill. gyomornedv mintákban, oly módon, hogy

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a hemoglobin hem részét 1 tömeg%-os, 2 mól/1 oxálsav és vas-oxalát keverékét tartalmazó oldat segítségével alakítjuk porfirinné. ²θ

2) a vizsgálati mintában lévő hemoglobin hem részét redukcióval porfirinné alakítjuk, majd megmérjük a minta fluoreszcenciáját,

3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a redukált, porfirint tartalmazó vizsgálati mintát etil-acetáttal és jégecettel kezeljük elő, centrifugáljuk, majd a ²⁵ felülúszó fázis fluoreszcenciáját mérjük meg.

3) egy korábban kimért fluoreszcencia-koncentráció diagram alapján a vizsgálati minta hemoglobin tartalmát meghatározzuk, azzal jellemezve, hogy az 1) eljárás után adott esetben egy vizsgálati minta részletet a hemoglobin hem részét porfirinné át nem alakító redukálószerrel, előnyösen citromsavval kezeljük 100— —150 °C közötti hőmérsékleten, és a minta fluoreszcenciáját megmérjük, és a 2) eljárásban úgy járunk el, hogy a) a vizsgálati mintában lévő hemoglobin hem részét egy redukáló savval és egy redukáló sóval, előnyösen oxálsavval, ill. vas-oxaláttal vagy -szulfáttal 100—150°C hőmérsékleten kezelve alakítjuk porfirinné, kívánt esetben a vasionokat a mintából eltávolítjuk, majd megmérjük a minta adott esetben előkezelt felülúszó részének fluoreszcenciáját, vagy

-10195005

b) a vizsgálati mintában lévő hemoglobin hem részét egy redukáló savval és egy redukáló sóval, előnyösen oxálsavval, ill. vas-oxaláttal vagy -szulfáttal, valamint a reakcióelegyet szobahőmérsékleten gélszerű kon- 5 zisztenciájúvá alakító hordozóanyaggal, előnyösen nagy molekulatömegű polimerek elegyével összekeverve, a kapott anyagot melegítés hatására elfolyósítva, majd az elegyet lehűtve, porfirinné alakítjuk, és megmérjük 10 a minta fluoreszcenciáját, és a 3) eljárásban kívánt esetben a 2. eljárás előtt és után mért fluoreszcenciaértékek különbségét alkalmazzuk.

4. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az etil-acetátot és a jégecetet 4:1 térfogatarányban alkalmazzuk.

5. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy centrifugálás előtt nátrium-acetátot adunk a vizsgálati mintához.

6. Készülék hemoglobin kvantitatív meghatározásához biológiai mintákban, azzal jellemezve, hogy egy vagy több, átlátszó ablakkal (22) és fedővel (21) ellátott kamrából (19a, 19b, 20a, 20b), valamint a kamrába (19a, b) helyezhető mintavételi eszközből (10) áll.

7. A 6. igénypont szerinti készülék, azzal jellemezve, hogy a mintavételi eszköz (10) vállrészen (13) keresztül fogórészhez (11) kapcsolódó mintavételi rúdból (12), valamint hüvelyből (14) áll, ahol a mintavevő rúd (12) közepén levő töréspontja (15) alatti részén mintagyűjtö lyukak (16) vannak kialakítva.

8. A 6. vagy 7. igénypont szerinti készülék, azzal jellemezve, hogy a mintavevő rúd (12) 80—120°C-on elíolyósodó anyagból áll.

9. A 6—8. igénypontok bármelyike szerinti készülék, azzal jellemezve, hogy a mintavevő rúd (12) 20000 móltömegű polietilén-glikolból és/vagy 100 000 móltömegű polietiién-oxidból és/vagy más polietilén-glikolból és/vagy 100000 móltömegű polietilén-oxidból és/vagy más polietilén-glikolokból van kialakítva.