FI73839C - Foerfarande foer kvantitativ bestaemning av hemoglobinhalten i avfoering, urin eller magsaft. - Google Patents

Description

73839

Menetelmä hemoglobiinipitoisuuden kvantitatiiviseksi määrittämiseksi ulosteessa, virtsassa tai mahanesteessä - Förfaran-de för kvantitativ bestämning av hemoglobinhalten i avföring, urin eller magsaft Tämä keksintö koskee yleisesti hemoglobiinin spesifistä ja kvantitatiivista testiä, käsittäen menetelmän tällaisen testin suorittamiseksi. Keksintö koskee erityisesti menetelmää hemoglobiinipitoisuuden kvantitatiiviseksi määrittämiseksi, jossa menetelmässä suoritetaan seuraavat vaiheet: (a) valmistetaan testinäyte, (b) hemoglobiinin hemiosa testinäytteessä muutetaan por-fyriiniksi, (c) mitataan muutetun porfyriinin fluoresenssi ja (d) verrataan muutetun porfyriinin fluoresenssia standardin fluoresenssiin.

Tälle menetelmälle on tunnusomaista, että testinäyte on uloste, virtsa tai mahaneste ja että hemoglobiinin hemiosa testi-näytteessä muutetaan porfyriiniksi yhdistämällä testinäyte pelkistävän hapon kanssa, joka on oksaalihappo ja pelkistävän suolan kanssa, joka on ferro-oksalaatti tai ferrosulfaatti .

Erilaisia nopeita seulontatestejä (screening tests) kohonneiden hemoglobiiniarvojen määrittämiseksi biologisissa aineissa, kuten ulosteessa on yleisesti käytettävissä. Näitä testejä käytetään kaikkialla lääketieteessä ensisijaisena testinä suolistokasvainten havaintsemiskesi. On arvioitu, että yli miljoona tällaista testiä suoritetaan joka vuosi Yhdysvalloissa tätä tarkoitusta varten. Huolimatta siitä, että nämä testit eivät anna kvantitatiivisia tuloksia ja että virheet testituloksissa ovat äärimmäisen kalliita, sekä henkilökohtaisesti että rahallisesti, ja huolimatta siitä, että yleisesti käytettävissä olevat testit antavat huomattavan paljon vääriä positiivisia ja negatiivisia tuloksia, niitä käytetään jatkuvasti, koska muuta vaihtoehtoa ei ole.

Yleisesti käytettävissä olevat seulontatestit hemoglo- 2 73839 biinin toteamiseksi ulosteessa eivät käsitä hemoglobiinin hemiosan muuttamista porfyriiniksi ja sen fluoresenssin mittaamista, pikemminkin yleisesti käytettävissä olevat testit ovat epäsuoria testejä, jotka perustuvat hemoglobiinin perok-sidaasityyppiseen (pseudoperoksidaasi) aktiivisuuteen. Näissä testeissä värittömät leukoväriaineet muuttuvat hemoglobiinin läsnäollessa värillisiksi lisättäessä sopivaa perok-sidia. Tällaisilla testillä on kuitenkin useita rajoituksia. Ensinnäkin, johtuen eri tekijöistä, jollaisia ovat testin ei-spesifisyys ja se seikka, että reaktiota yleensä häiritsevät tai siihen vaikuttavat sellaiset aineet kuin rauta, askorbiinihappo tai muutokset hemoglobiinimolekyylissä, saadaan huomattavan usein vääriä positiivisia ja vääriä negatiivisia tuloksia. Toiseksi, kaupallisesti saatavissa olevien testien tulkinta on usein epäselvää, koska testitulokset ilmoitetaan ainoastaan "positiivisena" tai "negatiivisena". Johtuen eroavaisuuksista erilaisten testien herkkyydessä ulosteen määrä testattavissa näytteissä voi lisäksi helposti vaihdella tekijällä, joka on suuruusluokkaa 20 tai suurempikin. Nämä tekijät, sekä edellä esitetyt ei-spesifisyydet ja eroavaisuudet värin kehityksen henkilökohtaisessa tulkinnassa, vaikuttavat kaikki rajoittavasti näiden testien käyttökelpoisuuteen. Johtuen näistä rajoituksista koe piilevän veren toteamiseksi on niitä harvoja jäljellä olevia ei-kvantitatiivisia testejä kliinisessä ja laboratoriolääketie-teessä.

Vaikkakaan ennestään ei hemoglobiinin toteamiseksi ulosteesta, virtsasta tai mahanesteestä ole käytettävissä mitään kvantitatiivisia testejä, jotka käsittäisivät hemin muuttamisen protoporfyriiniksi, on erilaisia tutkimuksia tehty aikaisemmin, jotka käsittelevät tätä muutosta. Esimerkiksi tutkimuksessa, jonka on suorittanut G.R.Morrison, Fluorometric Microdetermination of Heme Protein (Anal.Chem., 37: 1124- 1126, 1965) on esitetty menetelmä, jossa hemiproteiinin mittaamiseksi eläinkudoksista hemi muutettiin porfuryyniksi käyttäen oksaalihappoa, jonka jälkeen mitattiin fluoresens- il 3 73839 si. Tämä menetelmä oli kuitenkin tehoton hemoglobiinin kvantitatiiviseen määritykseen tiettyjen konsentraatioiden yläpuolella. Morrisonin esittämissä olosuhteissa ulosteet, joissa hemoglobiinin määrä on kohonnut, olisi laimennettava useita tuhansia kertoja. Tällainen ääretön laimentaminen ei ole sopiva laajaskaalaisille seulontatesteille.

Niinpä on olemassa kvantitatiivisen testimenetelmän tarve hemoglobiinin määrittämistä varten biologisissa aineissa, kuten ulosteessa, virtassa ja mahanesteessä, joka testi eliminoi tai huomattavasti vähentää väärien positiivisten ja väärien negatiivisten tulosten määrää ja joka on hyvin sopiva massaseulontatestitarkoituksia varten.

Tunnettuun tekniikkaan verrattuna tämän keksinnön mukainen menetelmä eliminoi väärät positiiviset ja väärät negatiiviset tulokset ja on erityisen sopiva massaseulontakäyt-töön. Tämän keksinnön kohteena oleva testimenetelmä on osoittautunut olevan (1) spesifinen hemiyhdisteille, kuten hemoglobiinille, mukaan lukien biologisten näytteiden koko pro-to-hemipitoisuuden, (2) vapaa muiden näytteessä olevien aineiden häiriöiltä, erityisesti ulosteessa, mahanesteessä tai virtsassa esiintyvien aineiden osalta, (3) äärimmäisen herkkä, (4) sopiva kvantitatiiviseen määritykseen hemoglobiini-konsentraatioissa, jotka eroavat toisistaan tekijällä, joka on yli 75 000, alkaen konsenraatioista, jotka ovat alle 0,02 mikrogrammaa per millilitra aina yli 1 500 mikrogrammaan per millilitra testattavaa liuosta ja (5) testiin eivät vaikuta sellaiset yhdisteet kuin rauta, askorbiinihappo, kloorivety-happo, aspiriini tai alkoholi, joiden tiedetään vaikuttavan eräisiin leukoväriaine-testeihin.

Tämän keksinnön spesifisen menetelmän mukaan ei-fluore-soiva hemoglobiini muuttuu fluoresoivaksi porfyriiniksi kvantitatiivisesti kaikissa testatuissa hemoglobiinikonsentraa-tioissa. Tämän muutos tapahtuu, kun näytteessä olevia hemi-yhdisteitä kuumennetaan käyttämällä mukana sopivia konsent-raatioita muuttavaa reaktioseosta joka muodostuu pelkistävästä haposta, kuten oksaalihaposta ja pelkistävästä suolasta, 4 73839 kuten ferro-oksalaatista. Tässä menetelmässä muodostuneen porfyriinin konsentraatio määritetään fluorisenssimittauksel-la. Tällainen fluoresenssimittaus suoritetaan reaktiotuotteelle kiinteässä systeemissä tai reaktiotuotteen sopivan uuton tai laimentamisen jälkeen nestemäisessä systeemissä.

Koska useimmissa biologisissa näytteissä, mukaan lukien uloste-, virtsa- ja mahanestenäytteissä, esiintyy fluoresenssia, joka ei liity hemiyhdisteiden reaktioon, tällainen "ei-spesifinen" fluoresenssi (mukaan lukien normaalisti erittyvästä porfyriinistä johtuva fluoresenssi) mitataan erillisessä näytteessä, jossa sitruunahappo tai samanlainen, sopiva ei-reagoiva koostumus korvaa oksaalihappo:ferro-oksalaatti-systeemin. Sitruunahappo ei muuta merkittäviä määriä hemiyh-distettä porfyriiniksi kuten oksaalihappo:ferro-oksalaatti-systeemi, mutta se aikaansaa samanlaiset happamet olosuhteet, jotka tarvitaan sen fluoresenssiosuuden analysoimiseksi, joka ei liity hemipitoisuuteen. Sitruunahappo-nollako-keessa havaitun fluoresenssiarvon vähentäminen oksaalihappo: ferro-oksalaattinäytteessä havaitusta tuloksesta antaa fluo-resenssiarvon, joka johtuu spesifisesti siitä protoporfyrii-nistä, joka on muodostunut hemiyhdisteestä oksaalihappo:ferro-oksalaattinäytteessä . Tästä fluoresenssierotuksesta, jota verrataan hemoglobiinin (tai protoporfyriinin) tunnettujen pitoisuuksien standardiin, voidaan laskea hemiyhdisteiden tai hemoglobiinin konsentraatio ulosteessa, virtsassa tai mahanesteessä.

Kun keksinnön mukainen menetelmä suoritetaan kiinteässä systeemissä, selviydytään lähiultraviolettivalon (aallonpituus, jossa porfyriini fluoresoi kaikkein voimakkaimmin) liika-arbsorption aiheuttamasta fluoresenssihäviöstä ("sammutus"), joka johtuu hemoglobiinin ja muiden pigmenttien korkeista konsentraatioista. Tässä menetelmävaihtoehdossa voi reaktioseos myös olla konsistenssiltaan geeli tai tahna-mainen huoneen lämpötilassa, mutta nesteytyy kuumennettaessa.

Niinpä tämän keksinnön kohteena on menetelmä hemoglobiinipitoisuuden kvantitatiiviseksi määrittämiseksi, jossa me- it 5 73839 netelmässä suoritetaan seuraavat vaiheet: (a) valmistetaan testinäyte, (b) hemoglobiinin hemiosa testinäytteessä muutetaan por-fyriiniksi, (c) mitataan muutetun porfyriinin fluoresenssi ja (d) verrataan muutetun porfyriinin fluoresenssia standardin fluoresenssiin, Tälle menetelmälle on tunnusomaista, että testinäyte on uloste, virtsa tai mahaneste ja että hemoglobiinin hemiosa testi-näytteessä muutetaan porfyriiniksi yhdistämällä testinäyte pelkistävän hapon kanssa, joka on oksaalihappo ja pelkistävän suolan kanssa, joka on ferro-oksalaatti tai ferrosulfaatti .

Tämän keksinnön kohteena on lisäksi sellainen menetelmä-vaihtoehto hemoglobiinipitoisuuden kvantitatiiviseksi määrittämiseksi ulosteessa, virtassa ja mahanesteessä, jonka mukaan on ratkaistu fluoresenssimittauksen aikana esiintyvään liialliseen "sammumiseen" liittyvät ongelmat.

Piirustuksissa kuva 1 esittää graafisesti geeli-reaktioseoksen (oksaalihappo: ferro-oksalaati) fluoresenssispektriä, ilman hemoglobiinia ja hemoglobiinilisäyksen kera, kuva 2 esittää graafisesti kuvassa 1 esitetyn fluoresens-sispektrin toista derivaattaa, kuva 3 on graafinen vertailu hemoglobiinin fluoresenssi-spektrien välillä oksaalihappo:ferro-oksalaatti-liuoksessa ja sitruunahappo-nollakokeessa. Fluoresenssiarvot on esitetty pystyakselilla ja emissioaallonpituudet vaaka-akselilla, kuva 4 on graafinen vertailu testattavan ulostenäytteen oksaalihappo:ferro-oksalaatti-liuoksessa saadun fluoresens-sispektrin ja saman ulostenäytteen testinäytteen sitruunahappo-nollakokeessa saadun fluoresenssispektrin välillä. Fluoresenssiarvot on esitetty pystyakselilla ja emissioaallonpituudet vaaka-akselilla, kuvassa 5 on esitetty graafisesti hemoglobiinin ja fluoresenssin välinen lineaarisuus oksaalihappo:ferro-oksalaat- 6 73839 ti-liuoksessa, kun rautaa lisätään ferrosulfaatina. Hemoglobiinin konsentraatio on esitetty vaaka-akselilla ja fluore-senssiarvot pystyakselilla, kuva 6 on kaaviokuva, joka esittää käsittelylaitteistoa tämän keksinnön mukaisen menetelmän suorittamiseksi kiinteässä systeemissä.

Keksinnön mukaisessa menetelmässä testinäytteen käsittely käsittää ensimmäisenä vaiheena biologisen aineen, joka on uloste, virtsa tai mahaneste, jonka hemoglobiinipitoisuus määritetään, testinäytteen keräämisen, sekoittamisen ja sen painon tai tilavuuden määrittämisen. Vaikka tämän keksinnön mukainen menetelmä on käyttökelpoinen sekä ulostetta, virtsaa että mahanestettä varten, on se erityisen käyttökelpoinen ulostenäytteitä varten, ja täten tämän edullisen menetelmän kuvauksessa viitataan ulostenäytteeseen. Ensin kerätään ja punnitaan testattava määrä ulostenäytettä (t.s.) 0,5 g. Tämä testattava näyte lisätään sen jälkeen noin 20-40 ti-lavuusosaan suolaliuosta, joka sisältää noin 0,85 % natrium-kloridia ja homogenoidaan tasaisen ulostedispersion saamiseksi. Testinäyte yhdistetään suolaliuokseen ulosteen ja samalla sen hemoglobiinin ja muiden pigmenttien laimentamiseksi ja näin kohonneen stabiilisuuden aikaansaamiseksi. On tunnettua, että hemoglobiinin alhaiset konsentraatiot ovat pysyvämpiä suolaliuoksessa kuin vedessä, ulostehomogenaatin, jossa testattavan näytteen konsentraatio on noin 2,5-5 %, on havaittu olevan edullinen, joskaan ei kriittinen. Edellä esitetyllä tavalla valmistettu testinäyte voidaan varastoida pakastettuna -15 °C - -30 °C:ssa, kunnes sitä käytetään.

Testin suorittamiseksi valmistettu testinäyte sekoitetaan pelksitävän hapon kanssa, joka on oksaalihappo ja pelkistävän suolan kanssa, joka on ferro-oksalaatti tai ferrosulfaatti. Kuumentamalla hemoglobiinin hemiosa muutetaan por-fyriiniksi. Edellä esitetyn muutosreaktion kuluessa rauta poistuu ei-fluoresoivasta hemimolekyylistä, jolloin saadaan rautavapaata, fluoresoivaa protoporfyriiniä, joka fluoresoi punaisena lähiultraviolettivalossa aallonpituudella noin 408 li f 73839 nanometriä (nm). Se fluoresoi myöskin, tosin vähemmin voimakkaasti, joutuessaan altiiksi vihreälle valolle aallonpituudella noin 558 nm, tai keltaiselle valolle aallonpituudella noin 600 nm. Pieniä määriä muita, samalla tavalla fluoresoivia porfyriinejä voi myös muodostua.

Edullisessa systeemissä 2-molaarista oksaalihappoa ja riittävä määrä ferro-oksalaattia tai ferrosulfaattia sekoitetaan 1 %:isen liuoksen valmistamiseksi. Käytettäessä kumpaa tahansa ferrosuolaa, saadaan analysoitavan fluoresenssin ja hemoglobiinikonsentraation välille lineaarinen suhde aina korkeimpaan testattuun konsentraatioon asti, joka on 1 620 mikrogramaa hemoglobiinia ml:ssa reagoinutta liuosta (noin 50 mikrogrammaa hemiä per ml). Ferrosulfaatin käyttö lisää kuitenkin happamuutta, koska se muodostaa rikkihappoa, kuten myös ferro-oksalaatti, lisättyinä oksaalihappoon. Edelleen ferrosulfaatti on lisätty 20 %:isena vesipitoisena liuoksena, jonka tulee olla tuore ja valmistettu muutama tunti ennen käyttöä, koska siinä tapahtuu hapettuminen ferrisuolak-si. Myös käytettäessä ferro-oksalaattia saadaan hyvä lineaarisuus edellyttäen, että se on suhteellisen puhdasta (99 %). Epäpuhtaudet ferro-oksalaatissa pyrkivät vaikuttamaan häiritsevästi reaktion lineaarisuuteen hemoglobiinin alhaisissa konsentraatioissa. Vaikkakin sekä ferrosulfaattia että ferro-oksalaattia voidaan käyttää, käytetään mieluimmin ferro-oksalaattia.

1 % sisen ferro-oksalaattiliuoksen valmistamiseksi 1 g ferro-oksalaattia lisätään 99 ml saan 2-molaarista oksaalihappoa. Sen jälkeen lisätään testinäytteen homogenaatti tähän liuokseen ja kuumennetaan 120 °Csssa 90 minuuttia. Reaktion nopeus ja sen täydellisyys (hemin muuttuminen porfyrii-niksi) vaihtelee lämpötilan mukaan s täten vaikka hemin muuttuminen porfyriiniksi tapahtuu lämpötiloissa 60-100 °C, reaktio tapahtuu melko hitaasti. Yleensä lämpötilan ja autoklaavissa oloajan tulee olla riittäviä, jotta kaikki hemi muuttuu porfyriiniksi. Vaikka tässä edullisessa menetelmässä yhdistetään 20 mikrolitraa testattavan näytteen homogenaattia 8 73839 1000 mikrolitran kanssa oksaalihappo:ferro-oksalaattiliuosta, on useiden muiden testinäytteen homogenaattimäärien havaittu olevan hyväksyttäviä, kuten määrien, joka ovat välillä 5 mikrolitraa - 100 mikrolitraa. Oksaalihapposferro-oksalaatti-liuos voidaan valmistaa etukäteen ja varastoida -30 °C:ssa.

Pelkistävän suolan, joka tässä edullisessa menetelmässä on ferro-oksalaatti, tehtävä on tärkeä, koska sen läsnäolo huomattavasti lisää mitattavissa olevan hemoglobiinin lineaarista aluetta. Täten on mahdollista saada tällä menetelmällä fluoresoivan porfyriinin kvantitatiivinen saanto laajemmalla konsentraatioalueella. Raudan poistamiseksi hemoglobiinista ja täten hemimolekyylin muuttamiseksi protoporfyriiniksi vaaditaan kolme ehtoa: (1) pelkistävät olosuhteet, (2) vahvasti hapan ympäristö ja (3) lämpöä. Pelkistävä happo ja erityisesti oksaalihappo aikaansaa pelkistävät olosuhteet ja happamen ympäristön. Itsestään se poistaa hemin hemoglobiinin proteii-niosasta ja sen jälkeen se poistaa raudan hemistä, muuttaen hemin porfyriiniksi. Kuitenkin on havaittu, että oksaalihappo yksinään on tehokas tässä muutosreaktiossa ainoastaan suhteellisen alhaisissa hemoglobiinikonsentraatioissa, aina suuruusluokkaan 15 mikrogrammaa asti per millilitra oksaali-happoliuosta. Koska hemoglobiinin määrä erityisesti uloste-näytteissä voi olla monta kertaa tätä suurempi, oksaalihappo yksin on yleensä tehoton ja sillä on vähän käyttöä näin korkeissa hemoglobiinikonsentraatioissa, ellei hemoglobiinia laimenneta monisata- tai tuhatkertaisesti. Hemoglobiinin korkeampien konsentraatioiden kvantitatiiviseksi määrittämiseksi ferro-oksalaatti tai ferrosulfaatti toimii lisäpelkistys-aineena lisäten pelkistäviä olosuhteita, samalla parantaen muutosta ja varmistaen että kaikki hemi testinäytteen hemoglobiinissa muuttuu porfyriiniksi. Tuloksena saadaan suora fluoresenssikäyrä, kuten on esitetty kuvassa 5, konsentraatioalueella, joka on riittävä kaikille mahdollisille hemoglobiiniarvoille biologisessa näytteessä suositetuissa olosuhteissa.

Kuvassa 5 autoklavoidun hemoglobiinin kosentraatio on i( 9 73839 esitetty graafisesti fluoresenssi-intensiteetiin nähden 0,0, 0,1, 1,0 ja 3,0 %:n lisätyille ferrosulfaattikonsentraatioil-le. Kuten voidaan havaita, käyrä 39, joka esittää ferrosulfaattia sisältämättömiä näytteitä, muuttuu ei-lineaariseksi hemoglobiinin korkeammissa konsentraatioissa. Kuitenkin käyrä 38, joka esittää ferrosulfaatin 0,1, 1,0 ja 3,0 %:n lisättyjä konsentraatioita on lineaarinen. Tämä lineaarisuus mahdollistaa hemoglobiinin konsentraation määrittämisen mittaamalla fluoresenssin intensiteetin ja vertaamalla sitä standardiin. Kuvassa 5 heräteaallonpituus on 410 nm, kun taas emissioaallopituus on 660 nm. Nämä autoklavoidut näytteet laimennettiin värittömiksi ennen fluoresenssin mittaamista.

Edullisessa menetelmässä on havaittu, että oksaalihappo-liuos, joka sisältää noin 0,1-5,0 % ferro-oksalaattia, muuttaa kaiken hemin protoporfyriiniksi kaikissa hemoglobiini-konsentraatioissa, joita on havaittu biologisissa testinäyt-teissä, joihin tämän keksinnön mukainen testi on tarkoitettu käytettäväksi. 1,0 %:n ferro-oksalaattikonsentraatio on edullinen .

Sen jälkeen kun hemi on muuttunut protoporfyriiniksi oksaalihapon ja testinäytteen seoksen annetaan jäähtyä. Sitten sen fluoresenssi mitataan. Seos voidaan valmistaa tätä mittausta varten kahdella menetelmällä. Ensinnäkin seos voidaan sentrifugoida, jolloin sakan yllä oleva liuos (supernatant-ti) otetaan teitään, laimennetaan 0,5-molaarisella oksaalihapolla ja sen fluoresenssi mitataan. Tässä menetelmässä sakka muodostuu rautaoksalaatista ja liukenemattomasta uloste-jäännöksestä, kun taas sakan päällä oleva liuos sisältää kaiken sen porfyriinin, joka on muodostunut hemistä plus pienen määrän ulostepigmenttejä, luonnon porfyriinejä ja hiukan rautaoksalaattia.

Toisessa edullisessa menetelässä oksaalihapon ja testi-näytteen seoksen valmistamiseksi fluoresenssin mittaamista varten noin 100 mikrolitraa seosta, noin 1200 mikrolitraa etyyliasetaatti:jääetikkaliuosta, suhteessa 4:1, ja noin 400 _____— TT- ίο 738 39 mikrolitraa 3-molaarista natriumasetaattia sekoitetaan ja ravistellaan keskenään, jonka jälkeen sentrifluoidaan. Sen jälkeen sakan päällä olevan liuoksen fluoresenssi mitataan. Mieluimmin käytetään menetelmää, jossa lisätään etyyliasetaatti :jääetikkaliuosta ja natriumasetaattia, koska siten saadaan puhdas ja pääasiassa väritön liuos, jolloin saadaan spesifisempi ja tarkempi fluoresenssianalyysi. Tässä systeemissä natriumasetaatti toimii osittain oksaalihappoa neutraloiden, täten muuttaen osan siitä natriumoksalaatiksi. Suurin osa natirum- ja rautaoksalaateista jää saostumaan, joka hylätään sentrifugoinnin jälkeen. Fluoresenssi voidaan mitata millä tahansa tavallisella ja kohtuullisen herkällä fluo-rimetrilla tai spektrofluorifotometrilla. Tässä edullisessa menetelmässä tulokset on 'saatu Aminco Bowman’in tai Perkin Elmer’in valmistamilla spektrofluorifotometrei11a. Spektrien erikoistyypit, kuten toiset derivaatat, synkroniset ajot jne. on saatu laitteella Perkin Elmer, malli MPF-44B.

Koska kaikissa biologisissa testinäytteissä esiintyy tiettyjä määriä luonnollisesti esiintyviä fluoresoivia aineita, mukaan lukien luonnollisesti esiintyvä protoporfyriini ja muut porfyriinit, tämän luonnollisen fluoresenssin läsnäolo on otettava huomioon. Tätä varten vastaavasta testattavasta näytteestä valmistetaan nollakoe ja fluoresenssi mitataan samalla tavalla. Tässä nollakokeessa kuitenkin 1,5-mo-laarinen sitruunahappo korvaa oksaalihapon ja ferro-oksalaa-tin. Muuten menetelmä on identtinen. On havaittu että sitruunahapon käyttö ei muuta huomattavia määriä (vähemmän kuin 0,2 %) hemiä porfyriiniksi. Täten, kun valmistetaan tämä nollakoeliuos ja mitataan sen fluoresenssi, vastaa tämä fluoresenssi-intensiteetti melkein täysin porfyriinien ja muiden testattavassa näytteessä luonnollisesti esiintyvien aineiden fluoresenssia. Testattavassa näytteessä esiintyvän hemoglobiinin varsinainen kvantitatiivinen määritys tapahtuu sen jälkeen vertaamalla reaktionäytteen ja nollakokeen fluoresenssi-intensiteettien erotusta standardinäytteeseen, jonka he-moglobiinikonsentraatio tunnetaan.

11 73839

Fluoresenssimittauksessa testattava näyte saatetaan alttiiksi eksitoivalle valolähteelle ja testattavan näytteen emittoiva fluoresenssi mitataan. Edullisessa menetelmässä (uutto etyyliasetaattiin) fluoresenssi on herkimmillään, kun eksitointi tapahtuu noin 401 nmrssa. Kolme heikompaa eksi-tointihuuippua havaitaan välillä noin 500 ja 580 nm ja näillä voi olla joitakin etuja tietyissä olosuhteissa. Jokaisella näistä fluoresoivista huipuista, ulostenäytteissä oleva fluoresoiva porfyriini antaa terävän fluoresenssihuipun noin 630 nm:ssa. Fluoresenssimittauksen aikana verrataan sekä testattavan näytteen, jossa hemi on muutettu fluoresoivaksi pro-fyriiniksi, että sitruunahapon etyyliasetaattiuutteiden fluo-resenssiarvoja tällä aallonpituudella. Näiden välistä erotusta verrataan sen jälkeen standardiin ja hemoglobiinikonsent-raatio määritetään. Jos autoklavoituja liuoksia laimennetaan oksaalihapolla, heräteaallonpituus asetetaan 410 nm:iin ja fluoresenssi mitataan 660 nm:ssa. Fluoresenssi happamessa liuoksessa voidaan mitata myös noin 610 nmrssa, mutta spesifisyys on alentunut viimeksi mainitulla aallonpituudella.

Kuvat 3 ja 4 esittävät sekä sitruunahapposeoksen että oksaalihappo:ferro-oksalaattiseoksen fluoresenssispektrejä. Kuvassa 3 esittää fluoresenssispektri 34 oksaalihapporferro-oksalaattisysteemiä, johon on lisätty hemoglobiinia, ja fluo-resenssispektri 35 sitruunahapposysteemiä, johon on lisätty hemoglobiinia. Täten spektri 34 kuvaa porfyriiniksi muutettua hemoglobiinia. Spektri 35 varmistaa sen, että sitruuna-happosysteemi ei muuta merkittävää määrää hemoglobiinia porfyriiniksi.

Kuvassa 4 käyrä 36 esittää hemoglobiinia sisältävän ulostenäytteen fluoresenssispektriä oksalihappo:ferro-oksalaatti-systeemissä ja käyrä 37 saman, hemoglobiinia sisältävän ulostenäytteen f luoresenssispektriä sitruunahappo-nollakoesystee-missä. Spektri 36 esittää hemistä oksaalihappo:ferro-oksalaa-tin avulla saadun porfyriinin sekä myös luonnollisen porfy-riinin fluoresenssia. Spektri 37 esittää ainoastaan luonnollisen porfyriinin plus eräiden ei-porfyriinien fluoresenssia.

I2 73839 Täten spektrien 36 ja 37 tietyllä aallonpituudella esiintyvä erotus fluoresenssissa vastaa muuttunutta porfyriiniä, joka tämän keksinnön mukaisesti, on lineaarisessa suhteessa hemiin tai hemoglobiiniin näytteessä. Hemoglobiinin todellinen kvantitatiivinen pitoisuus voidaan määrittää vertaamalla tätä fluoresenssia standardiin.

Esimerkki edellä esitetystä menetelmästä on seuraavanlainen: Ensin valmistetaan 2,5 % sinen ulostehomogenaatti suolaliuokseen. Seuraavaksi valmistetaan 100 g reaktioseosta yhdistämällä 25,2 g oksaalihappoa, 1,0 g hienonnettua ferrosulfaattia tai ferro-oksalaattia ja 73,8 ml vettä. Näitä aineita kuumennetaan kiehuvassa vesihauteessa niiden liuottamiseksi ja sekoittamiseksi. Suurin osa ferro-oksalaatista jää liukenemattomaksi. Sen jälkeen reaktioseos jaetaan useaan putkeen tai pienpulloon, jotka suljetaan ja joita pidetään -30 °C:ssa, kunnes niitä käytetään. Valmistetaan myös 100 g kontrolli-nollakoeseosta yhdistelmällä 28,8 g sitruunahappoa ja 71,2 ml vettä. Seuraavaksi 50 mikrolitraa 2,5 %:ista ulos-tehomogenaattia lisätään jokaiseen niistä putkista, joissa koe tullaan suorittamaan. Jokaiseen putkeen lisätään 1,0 ml joko lämmitettyä oksaalihappo:ferro-oksalaattiseosta tai nollakoeseosta. Sen jälkeen nämä putket sekoitetaan hyvin sekoittimella, peitetään muovikelmulla (Saran wrap), johon on painettu reikiä yläosaan. Sitten putkia kuumennetaan autoklaavissa 90 minuuttia 120 °C:ssa, jonka jälkeen niiden annetaan jäähtyä huoneen lämpötilaan. Jäähtymistä voidaan nopeuttaa sijoittamalla putket kylmään vesihauteeseen. Uutetaan etyyliasetaattiin tai sentrifugoidaan ja laimennetaan 0,5-molaarisella oksaalihapolla, kuten edellä on esitetty.

Koska protoporfyriini vastaa noin 3,37 % hemoglobiinin molekyylipainosta, porfyriiniarvot kerrotaan 100/3,37:llä tai 29,67:llä hemoglobiinin vastaavan määrän laskemiseksi. Sen jälkeen määritetään mg hemoglobiinia/g ulostetta kertomalla sopivilla laimennuskertoimilla.

Menetelmässä, jossa fluoresenssimittaus suoritetaan kiinteässä systeemissä, käytetään samoja pääperiaatteita kuin ii 13 73839 mitä edellä on esitetty.

Hemoglobiinin hemiosan muuttaminen metallivapaaksi por-fyriiniksi suoritetaan siten, että testinäytteet yhdistetään pelkistävän hapon ja pelkistävän suolan, nimittäin oksaalihapon ja ferro-oksalaatin kanssa, sekä sopivan kantaja-aineen kanssa. Kantaja-aine muodostuu mieluimmin eri molekyylipai-noisten polyetyleeniglykolien seoksesta. Vaikka kantaja-aineen konsistenssi voi olla erilainen tai sillä voi olla erilaisia ominaisuuksia, ts. se voi olla jokin kiinteä aine tai jauhe, kuten lasikuitu, selluloosajauhe tai metallisuo-la, joka on kyllästetty oksaalihapolla tai sitruunahapolla, neste, jne., kantaja-aineella on mieluimmin geelimäinen, tah-namainen tai huoneen lämpötilassa ei-juokseva konsistenssi. Mieluimmin kantaja-aine nesteytyy lämpötiloissa, jotka ovat yli 100 °C.

Kantaja-ainekoostumuksella tulisi myös olla alhainen tai mitätön fluoresenssi, jotta se ei häiritsisi testattavan näytteen fluoresenssimittausta ja lisäksi sen tulisi olla pysyvä kaikissa reaktio-olosuhteissa. Puolikiinteän geeli-tyyppisen kantaja-aineen käyttö on erityisen edullista. Edullisessa suoritusmuodossa kantaja-aine koostuu polyetyleeniglykolien ja vastaavien suuren molekyylipainon omaavien yhdisteiden, kuten poly(etyleenioksidien) seoksesta. Reaktio-seos, jonka on todettu olevan hyväksyttävä, sisältää seoksen, jossa on 73,8 g polyetyleeniglykoleja, 25,2 g oksaalihappoa ja 1,0 g jauhemaista ferro-oksalaattia. Jos käytetään ferrosulfaattia, 1,0 g ferrosulfaattia korvaa ferro-oksalaatin. Kontrolli-nollakoeseos, jonka on todettu olevan hyväksyttävä, sisältää seoksen, jossa on 71,2 g polyetyleeniglykoleja ja 28,8 g sitruunahappoa. Edellä olevista seoksista saadaan lopullisiksi konsentraatioiksi 2-molaarinen oksaalihappo ja vastaavasti 1,5-molaarinen sitruunahappo.

Seuraava vaihe tässä menetelmässä on reaktioseoksen kuumentaminen. Kuumennettaessa 120 °C:seen reaktioseos, joka sisältää edullista polyetyleeniglykolikantajaa ja joko oksaa-lihapporferro-oksalaattireagenssia tai sitruunahappoa, nes- 14 73339 teytyy. Oksaalihappo ja ferro-oksalaatti reagoivat uloste-näytteessä olevan hemoglobiinin kanssa muuttaen hemiosan fluoresoivaksi porfyriiniksi. Vaikkakin kuumentaminen voi tapahtua eri lämpötiloissa ja se voi kestää eri aikoja, edullisessa menetelmässä sopivassa autoklaavissa tai uunissa tapahtuva kuumennuslämpötila on 120 °C 90 minuutin ajan. Kuu-mennusvaiheen aikana reaktioseokset yhdessä ulostenäytteen ja kantaja-aineen kanssa sekoitetaan yhtenäiseksi. Kuumen-nusvaiheen jälkeen tämä yhtenäinen seos jäähdytetään ja sen annetaan jähmettyä uudestaan.

Sen jälkeen kun ulostenäytettä ja eri reaktioseoksia on kuumennettu ja sitten jäähdytetty ja ne ovat uudelleen jähmettyneet, muutetun porfyriinin fluoresenssi mitataan. Yleinen menetelmä on sitten samanlainen kuin nestemäistä systeemiä käytettäessä, paitsi että nesteissä eksitoiva valolähde johdetaan näytteen läpi fluoresenssin mittaamiseksi oikeassa kulmassa, kun taas kiinteässä näytteessä fluoresenssi mitataan etupinnasta. Mittauksessa jokaisen kontrollinollakoe-näytteen fluoresenssi vähennetään sen vastaavasta reaktio-näytteestä. Näiden fluoresenssiarvojen välille saatua erotusta verrataan sen jälkeen tunnetun hemoglobiinikonsentraa-tion standardin fluoresenssi-intensiteettiin ja hemoglobii-nikonsentraatio testinäytteessä lasketaan. Vaikka edellä esitetyt vaiheet voidaan tehdä manuaalisesti, edullisessa menetelmässä fluoresenssin mittaaminen ja nollakoekontrollinäyt-teen fluoresenssin vähentäminen reaktionäytteen fluoresenssin intensiteetistä, tämän erotuksen vertaaminen standardiin sekä hemoglobiinin kvantitatiivisen pitoisuuden laskeminen testinäytteessä tehdään automaattisesti sopivasti ohjelmoidulla mikroprosessorilla.

Näytteen fluoresenssi määritetään saattamalla näyte alttiiksi sopivalle valolähdesysteemille (suodatin tai monokro-metri) ja fotodetektorisysteemille. Mitattu fluoresenssi-intensiteetti syötetään sitten suoraan ohjelmoituun mikroprosessoriin 29 (kuva 6) analysoitavaksi ja hemoglobiinin kvantitatiivisen pitoisuuden laskemiseksi tilavuusyksikköä koh- is 7 3 8 3 9 den testinäytteessä.

Edellä esitetyssä menetelmässä tietyt erityiset varotoimenpiteet ovat tarpeellisia, jotta fluoresenssi voidaan mitata suoraan. Nämä varotoimenpiteet ovat tarpeen etupäässä koska esiintyy vaihtelevaa fluoresenssi-intensiteetin häviötä ("sammumista") johtuen tulevan, porfyriinin fluoresenssin herättämiseksi yleensä kätyetyn lähiulotraviolettivalon (noin 410 nm) liika-absorptiosta. Tämä valon absorptio voi johtua ylisuurista määristä porfyriiniä, sappipigmenteistä, ruoka-partikkeleista, jne. Täten, ellei näitä tiettyjä varotoimenpiteitä suoriteta, voi esiintyä liikasammumista, joka täten alentaa fluoresenssi-intensiteettiä ja antaa siten hemoglobiinille alemman lasketun kvantitatiivisen pitoisuuden kuin mitä tosiasiassa ulostenäytteessä on.

Eräs varotoimenpide, joka voidaan suorittaa ellei sopivaa instrumentointia ole saatavilla, on testinäytteiden nes-teyttäminen kuumentamalla. Sen jälkeen otetaan tietty määrä ja mitataan fluorimetrisesti laimentamisen ja/tai uuttamisen jälkeen, kuten esitettiin edellä nestemäisen systeemin yhteydessä. Nestesysteemissä "sammuminen" on yleensä helposti ratkaistava ongelma, yksinkertaisesti laimentamalla edelleen liuos, jonka fluoresenssia ollaan mittaamassa. Tämä suoritetaan mieluimmin automatisoidussa systeemissä, mutta voidaan tehdä myös manuaalisesti. Automatisoidussa systeemissä noin 10-30 mikrolitraa nestetytettyä liuosta lisätään mieluimmin 100-300 mikrolitraan 0,5M oksaalihappoa. Sen jälkeen tämä koostumus sekoitetaan ja lasketaan läpi kapeasta mikrokyve-tistä fluorimetristä analyysiä varten. Fluoresenssin eksi-tointi näkyvällä valolla porfyriinin herätemaksimissa noin 555 nm tai 590-600 nm on suositeltavaa, koska viimemainituilla aallonpituuksilla (erityisesti 590-600 nm) esiintyy suhteellisesti vähemmän valon ei-spesifistä absorptiota ja siitä johtuen tapahtuu tuskin havaittavaa fluoresenssin "sammumista" tällaisissa laimennetuissa näytteissä. Ne eksitoivat myös vähemmän ulosteen, virtsan tai mahanesteeen ja puo-likiinteän geelin valmistamiseksi käytettyjen apuaineiden ____ . — T— ΐ6 73839 ei-spesifistä fluoresenssia kuin tavallisesti suositeltu ek-sitointi lähi-ultraviolettivalolla.

Useat muut vaihtoehdot ovat yhtäpitäviä automatisoinnin tarkoitusperien kanssa. Tärkeimpänä näistä on fluoresenssin mittaaminen suoraan autoklavoidussa näytteessä, käyttäen automaattista korjausta valon absorptiosta johtuvalle fluorsens-sin "sammumiselle". Tämä tietokoneella suoritettu korjaus perustuu valon absorbanssin ja fluoresenssin samanaikaisesti tapahtuvaan määrittämiseen käyttäen heijastettua (tai trans-mittoitua) valoa ja erillisiä valoputkia absorbanssimittauk-sessa. Fluoresenssispektrin "toisen derivaatan" tai sellaisen ei-reaktiivisen ja ei-fluoresoivan pigmentin käyttöä on myös ehdotettu, jonka valoabsorptio huomattavasti ylittää reaktioseoksessa muiden aineiden minkä tahansa määrän valo-absorption. Viimeksi mainitussa vaihtoehdossa havaitaan olennaisesti vakiona esiityvää fluoresenssin "sammumista" jopa erilaisten (ja nyt suhteellisen vähäisten) ulostepigmenttien läsnäollessa.

Fluoresenssispektrin toisen derivaatan käytöllä voi olla huomatavia etuja. Tyypillisen hemoglobiinireaktionäytteen fluoresenssispektri 30 on esitetty kuvassa 1 yhdessä samanlaisen kiinteän reaktioseoksen, johon ei ole lisätty hemoglobiinia, fluoresenssispektrin 31 kanssa. Tässä fluoresenssi-spektrissä fluoresenssi-intensiteetti on esitetty graafisesti 550 nm:sta 700 nm:iin, herätys 408 nmrssa. Kuten kuvasta havaitaan, fluoresenssi-intensiteetti aallonpituudella 604 nm reaktionäytteelle 30 on noin 8 200 verrattuna nollakoe-näytteen 31 fluoresenssi-intensiteettiin, joka on 4 500, tällä samalla aallonpituudella. Täten reaktionäytteen fluoresenssi-intensiteetti on vähemmän kuin kaksi kertaa niin voimakas kuin nollakoenäytteen fluoresenssi-intensiteetti. Tietyllä tietokonetoimenpiteellä tämän fluoresenssinspektrin toinen derivaatta voidaan kuitenkin esittää graafisesti, jonka seurauksena ei-spesifinen nollakoe-fluoresenssi eliminoi tuu. Kuvassa 2 on esitety kuvan 1 fluoresenssispektrin toinen derivaatta. Tarkemmin käyrä 32 esittää spektrin 30 tois- 17 738 3 9 ta derivaattaa ja käyrä 33 spektrin 31 toista derivaattaa. Tässä fluoresenssispektrin toisessa derivaatassa fluoresenssi-intensiteetti mitataan erotuksena niiden lukemien välillä, jotka saadaan vastaavien käyrien 32 ja 33 toisiaan seu-raavien minimi- ja maksimiarvojen aallonpituuksilla. Hemo-globiininaytteelle, käyrä 32, tämä erotus on noin 4 900, joka saadaan esimerkiksi positiivisen lukeman 587 nm:11a ja negatiivisen lukeman 604 nm:11a erotuksena. Nollakoenäytteel-lä (kantaja-aine) tämä erotus on käytännöllisesti katsoen nolla. Tämä huomattasti parantaa testin tarkkuutta ja herkkyyttä .

Vaikkakin edullisen suoritusmuodon kuvaus on ollut erittäin spesifinen, on selvää, että erilaiset muunnokset ja modifikaatiot voidaan tehdä tämän keksinnön mukaiseen menetelmään poikkeamatta keksinnön piiristä. Näin ollen tämän keksinnön laajuuden määrittelevät pikemminkin liitteenä olevat patenttivaatimukset kuin edullisen suoritusmuodon kuvaus.

Claims (4)

18 73839 Patenttivaatimukset;

1. Menetelmä hemoglobiinipitoisuuden kvantitatiiviseksi määrittämiseksi/ jossa menetelmässä suoritetaan seuraavat vaiheet: (a) valmistetaan testinäyte, (b) hemoglobiinin hemiosa testinäytteessä muutetaan por-fyriiniksi, (c) mitataan muutetun porfyriinin fluoresenssi ja (d) verrataan muutetun porfyriinin fluoresenssia standardin fluoresenssiin, tunnettu siitä, että testinäyte on uloste, virtsa tai mahaneste ja että hemoglobiinin hemiosa testinäytteessä muutetaan porfyriiniksi yhdistämällä testinäyte pelkistävän hapon kanssa, joka on oksaalihappo ja pelkistävän suolan kanssa, joka on ferro-oksalaatti tai ferrosulfaatti.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että a) testinäyte valmistetaan homogenisoimalla punnittu näyte tunnettuun tilavuuteen suolaliuosta, mieluimmin noin 0,85 % natriumkloridia sisältävään vesiliuokseen, noin 2,5-5,0 %:n konsentraatioon, että b) testinäyte yhdistetään oksaalihapon, mieluimmin 2-mo-laarisen oksaalihapon, ja ferro-oksalaatin tai ferro-sulfaa-tin kanssa, jonka määrä on riittävä muodostamaan noin 0,3-3 %:isen, erityisesti noin 1 %:isen liuoksen 2-molaarisen oksaalihapon kanssa, mieluimmin lämmön läsnäollessa, edullisesti yli 100 °C:n lämpötilassa, ja että c) saatu protoporfyriinin sisältävä seos yhdistetään etyyliasetaatin ja jääetikan liuoksen kanssa, mieluimmin suhteessa noin 4:1, sentrifugoidaan, jota ennen mahdollisesti lisätään tehokas määrä natriumasetaattia, ja supernatantin fluoresenssi mitataan, mieluimmin siten, että mitataan fluoresenssi testinäytteessä, jossa hemiosa on muutettu porfyriiniksi, kaksoisnollakoenäytettä vastaan, jossa hemiosa ei ole merkittävästi muuttunut porfyriiniksi, jolloin kaksoisnollakoe- tl 19 7 3 8 3 9 näyte mieluimmin yhdistetään edullisesti 1,5-molaarisen sitruunahapon kanssa.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että b) pelkistävä happo, erityisesti oksaalihappo, ja pelkistävä suola, erityisesti ferro-oksalaatti, yhdistetään kantajan kanssa, erityisesti suuren molekyylipainon omaavien po-lyetyleeniglykolien ja poly(etyleenioksidien) seoksen kanssa, huoneen lämpötilassa geelimäisen seoksen valmistamiseksi, joka kuumennetaan seoksen nesteyttämiseksi ja hemoglobiinin hemiosan muuttamiseksi porfyriiniksi testinäytteessä, ja että c) nesteytetty seos jäähdytetään, ja muutetun porfyrii-nin fluoresenssi mitataan mittaamalla testinäytteen, jossa hemoglobiinin hemiosa on muuttunut porfyriiniksi, fluoresenssi kaksoisnollakoenäytteen, jossa hemoglobiinin hemiosa ei ole muuttunut porfyriiniksi, fluoresenssia vastaan, erityisesti muodostamalla sekä testinäytteen että nollakoenäytteen fluoresenssi-intensiteetin fluoresenssispektri, ja d) verrataan testinäytteen ja nollakoenäytteen fluoresens-sispektrien toisia derivaattoja, erityisesti standardin kanssa mikroprosessorin avulla.

4. Patenttivaatimuksen 2 tai 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vaihteleva fluoresenssihäviö, joka johtuu valon liika-absorptiosta, eliminoidaan laimentamalla kuumennetut testinäytteet mieluimmin 0,5-molaarisessa oksaa-lihappoliuoksessa, ja/tai korjataan mittaamalla samanaikaisesti käytetyn herätevalon absorbanssia, erityisesti siten, että vaihteleva fluoresenssihäviö, joka johtuu valon liika-absorptiosta, minimoidaan käyttämällä herätevaloa, jonka aallonpituus on 590-600 nm tai 550-560 nm. 20 7 3 8 3 9