HU193812B

HU193812B - Process for separating corrinoides

Info

Publication number: HU193812B
Application number: HU347085A
Authority: HU
Inventors: Agnes Kelemen; Istvan Jaksa; Emilia Simonovits; Bela Stefko
Original assignee: Richter Gedeon Vegyeszet
Priority date: 1985-09-16
Filing date: 1985-09-16
Publication date: 1987-12-28
Also published as: JPS6296490A; FR2587362A1; FR2587362B1; HUT41046A; CN86106277A; BE905410A; ES2001685A6; DE3629985A1; GB2180538A; GB8622276D0; GB2180538B

Description

A találmány tárgya eljárás korrinoidok elválasztására.

A találmány szerinti eljárásban inkomplett korrinoidoknak komplett korrinoidoktól való elválasztását és a komplett korrinoidok további szétválasztását végezzük, valamilyen nagy fajlagos felületű polimer adszorbens segítségével.

A korrinvázas vegyületek, amelyeknek elsőként izolált és biológiai szempontból legértékesebb tagja a B_l2-vitamin, az a-(5,6-dimetil-benzimídazolil) -kobamid-cianid, ismert gyógyhatású vegyületek. Előállításuk fermentációs úton történik. A fermentációhoz használt különböző mikroorganizmusok egymástól eltérő korrinvázas vegyűleteket termelhetnek, illetve a fermentlé a fermentálás leállításakor a bioszintézis különböző fázisában lévő korrinoidokat tartalmazhat. A fermentlében lévő sejtekben együtt megtalálhatók mind a komplett. — nukleotíd tartalmú — mind az inkomplett — nukleotid mentes — korrinoidok.

Az inkomplett korrinoidok, így a kobinamid és a kobinsavak, biológiailag értéktelen, sőt bizonyos esetekben káros vegyületek. Jelenlétük nehezíti a tulajdonképpeni értékes hatóanyagok, a komplett korrinoidok (kobalaminok) izolálását és kristályosítását. Az inkomplett korrinoidok jelenléte még a nyers, {az összes komponenseket együtt tartalmazó) takarmánykiegészítőként alkalmazható termékben sem kívánatos, mert ismeretes, hogy például csirkéknek kobinamidot adva takarmánykiegészítőként, a B₁₂-vitamin antagonistaként hat. (E. L. Smith: Vitamin B₁₂, Methnen, London, 1960, 84. oldal).

Adott esetben szükséges lehet a komplett korrinoidok egymástól való elválasztása is. Bizonyos fermentációs eljárásoknál, így például a 159 359 számú magyar szabadalmi leírásban ismertetett félfolyamatos eljárással, vegyes populáöiójú mikroorganizmusokkal fermentálva az inkomplett korrinoidok mellett komplett korrinoidként főként B_l2-vitamin és az úgynevezett III. faktor, a-(5-hidroxi-benzimidazolil)-kobamid-cianid keletkezik. A III. faktor biológiai aktivitása takarmánykiegészítőként való alkalmazás esetén azonos, vagy közel azonos a B₁₂-vitaminéval, így takarmánykiegészítőként való alkalmazás esetén nem szükséges a B₁₂-vitamin és a III. faktor egymástól való elválasztása. Humán terápiás célra azonban csak egységes, más kobalamin származékot nem tartalmazó kristályos B₁₂-vitamint használnak, tehát ilyen cél esetén szükség van a B,₂-vitamin és a III. faktor egymástól való elválasztására is. A B_l2-vitamintól elkülönített 111. faktor kívánt esetben történő további tisztítás után önmagában is adható takarmány kiegészítőként.

Az irodalomban különféle eljárások ismeretesek az inkomplett és komplett korrinoidok szétválasztására, vagyis a kobinamidnak és kobinsavaknak a kobalaminokbó) való 2 elkülönítésére. Vannak ismert eljárások a B,₂-vitamin és a III. faktor elválasztására is.

A 930 651 számú német szövetségi köztársaság-beli szabadalmi leírás szerint cellulózkor töltetű oszlopon, cianid ionokat tartalmazó víz-n-butanol eleggyel végzett megoszlásos kromatográfiával választják el a különböző korrinoidokat. A szennyvízből nyert tisztított terméket, amely B₁₂-vitamint, III. faktort és inkomplett korrinoidokat is tartalmaz, szilikagélre csapják ki, megszárítják, majd ezt viszik az oszlopra. Az eljárás hátránya az, hogy analitikai módszer, amely nagyobb, ipari méretű mennyiségek elválasztására nem alkalmas, továbbá a III. faktornak az inkomplett korrinoidoktól való elkülönítésére ad ugyan módszert, de nem adja meg, hogy hogyan különítik el ezeket a B^-vitamintól.

A 143 549 számú magyar szabadalmi leírás szerint a B_l2vvitamint az egyéb korrinoidokat is tartalmazó elegyből úgy különítik el, hogy a koncentrátumot ápol áros oldószer és fenolos hidroxilt tartalmazó vegyület elegyével kivonatolják, majd az oldószeres fázisból a B|₂-vitamint alumínium-oxidra abszorbeálják, és erről acetonnal leoldják.

A 147 627 számú magyar szabadalmi leírás az előző eljárás javított változata, e szerint 4-5 pH-jú vizes közegből, fenol/kloroform 1:6 arányú keverékével kivonják a kobinamidot a kobalaminok mellől, majd a vizes íázist pH=8-9 értékre lúgosítják és fenol/kloroform 1:5 arányú elegyével kivonják a kobataminokat. Ezt követően acetonos közegben, alumínium-oxid töltetű oszlopon kromatográfiával választják szét a B,₂-vitamint és a III. faktort.

Az előbbi két leírásban ismertetett eljárás hátránya, hogy a fenol/kloroform eleggyel való extraháláskor igen nagyfokú az emulzióképződés: ennek következtében ipari méretben való alkalmazáskor az oldószerfázisok szétválasztása csak centrifugális szeparátorral lehetséges. Az emulzióképződés természetesen az extrahálás hatásfokát is rontja. Hátránynak tekinthető még az is, hogy az oldószerelegyek regenerálása nem valósítható meg gazdaságosan. Mindezek mellett, amiatt, hogy a kobinamid ilyen körülmények között történő extrahálása nem szelektív, elég nagy a kobalamin veszteség.

A 150 555 számú magyar szabadalmi leírás olyan izolálás! eljárást ismertet, amely B,₂-vitamint, III. faktort és inkomplett korrinoidokat tartalmazó vizes vagy vizes-alkoholos oldatból oxicellulózon való adszorpcióval elkülönítik az inkomplett korrinoidokat, majd az így tisztított oldatból 1:7-1:8 arányú fenol/kloroform eleggyel, amely timolt is tartalmaz, kivonja a Bi₂-vitamint. A szerves fázist vízzel mossák, majd acetont adva hozzá, a B,₂-vitamint a vizes fázisba visszaszorítják és azt kloroformos extrahálással fenolmentesítik. Ezt követően bepárlás után kris-2193812 tályosítják a B₁₂-vitamint. A III. faktor egy oldószeres tisztítási lépés után vizes oldatból kristályosítják. Ezt az utóbbi tisztítási lépést a szabadalmi leírás nem ismerteti. Az eljárás egyik hátránya, hogy ipari méretű alkalmazásának korlátot szab az oxicellulóz gyenge fajlagos adszorpciós kapacitása. Emellett további hátrány az is, hogy az oxicellulóz regenerálása ipari méretekben csak körülményesen és költségesen oldható meg, mivel az nem történhet magában az oszlopban, ugyanis az oxicellulózt 60-70°C hőmérsékleten, 0,1 N sósavval lehet regenerálni. További nagy hátránya az eljárásnak, hogy a B₁₂-vitamin és a III. faktor elválasztása hatalmas térfogatokat igényel. 1 kg B₁₂-vitamin kristály kinyeréséhez az eljárásban 2,4 m³ fenol/kloroform elegyet használnak és feltehetően ilyen nagyságrendű oldószermennyiség szükséges a vizes fázisban maradó III. faktor kinyerésére is. A nagy mennyiségű fenol-kloroform-aceton oldószerelegy regenerálása pedig gazdaságosan nem oldható meg.

Az előzőekben ismertetett eljárások egyike sem teszi lehetővé a vegyes mikropopulációjú mikroorganizmus tenyészettel végzett fermentáció során keletkező korrinoidok ipari méretben, szelektív és gazdaságos módon való elválasztását.

Célkitűzésünk volt tehát iparilag is jól alkalmazható szelektív és gazdaságos módszer kidolgozása inkomplett és komplett korrinoidok elválasztására, valamint komplett korrinoidok, így főként B₁₂-vitamin és III. faktor egymástól való elválasztására.

Vizsgálataink során azt találtuk, hogy a kobalaminoknak a kobinamidtól és kobinsavaktól való elválasztása egyetlen lépésben igen jó hatásfokkal és megfelelő tisztasággal elvégezhető valamilyen nagy fajlagos felületű polimer adszorbens segítségével történő szelektív adszorpcióval vagy elúcióval, majd kívánt esetben egy további lépésben a B₁₂ mellől a III. faktor szelektív elúcióval eltávolítható és a B₁₂-vitamin ismert módon kinyerhető.

A találmány szerinti eljárásban a komplett és inkomplett korrinoidokat, vagyis kobalaminokat, kobinamidot és kobinsavakat együttesen tartalmazó vizes oldatból, vagy legfeljebb 20 tf% valamilyen vízzel elegyedő rövidszénláncú alifás alkoholt — előnyösen metanolt vagy etanolt — vagy legfeljebb 5 tf% valamilyen vízzel elegyedő rövidszénláncú alifás ketont —-előnyösen acetont — tartalmazó vizes oldózserelegybŐl környezeti hőmérsékleten, pH=8-ll, előnyösen pH=9,0-10,0 közötti értéken, cianid vagy szulfit ionok, illetve ezeket leadni képes vegyületek jelenlétében a komplett korrinoidokat valamilyen nagy fajlagos felületű polimer adszorbensen megkötjük, az inkomplett korinoidok pedig- az oldatban maradnak.

Eljárhatunk úgy is, hogy a komplett és inkomplett korrinoidokat ismert módon, híg vizes vagy vizes-szerves oldószeres oldatból, pH=2-8 közötti értéken együttesen megkötjük az adszorbensen, majd ezután az inkomplett korrinoidokat környezeti hőmérsékleten, pH=8-ll, előnyösen pH=9,0-10,0 közti értékre lúgosított vizes oldattal, vagy legfeljebb 20 tf% valamilyen vízzel elegyedő rövidszénláncú alifás alkoholt — előnyösen metanolt vagy etanolt — vagy legfeljebb 5 tf% valamilyen vízzel elegyedő rövidszénláncú alifás ketont — előnyösen acetont — tartalmazó vizes oldószereleggyel cianid vagy szulfit ionok, vagy ezeket leadni képes vegyületek jelenlétében eluáljuk, a komplett korrinoidokat pedig az oszlopon megkötve maradnak.

Ha a cél a Bi₂-vitamin és a III. faktor elválasztása, akkor mindkét eljárásváltozat esetén az adszorbensen megkötött komplett korinoidok közül a III. faktor környezeti hőmérsékleten, pH=8-ll értékre, előnyösen pH=9,0-10,0 közötti értékre lúgosított, 20-40 tf% valamilyen vízzel elegyedő rövidszénláncú alifás alkoholt — előnyösen metanolt vagy etanolt — vagy 5-20 tf% valamilyen rövidszénláncú alifás ketont — előnyösen acetont — tartalmazó vizes oldószereleggyel, cianid vagy szulfit ionok, vagy ezeket leadni képes vegyületek jelenlétében eluáljuk, majd az adszorbensen maradt B₁₂-vitamint ismert módon, például metanollal vagy vizes acetonnal leoldjuk.

Ha nincs szükség a B₁₂-vitamin és a III. faktor elválasztására, akkor az adszorbensen maradt komplett korrinoidokat ismert módon, például metanollal vagy vizes acetonnal együtt leoldjuk.

Nagy fajlagos felületű polimer adszorbensként például 10'—10'⁷ m pórusméretű, legalább 200 m²/g fajlagos felületű, nem ionos, nem poláros vagy gyengén poláros makroretikuláris adszorpciós gyantát alkalmazunk. Ilyenek például az Amberlite XAD 2, XAS 4, XAD 7, XAD 8 gyanták (Rohm & Haas gyártmány), a Diaion HP 20, HP 21, SP 207, HP 2 MG gyanták (Mitsubishi gyártmány).

A találmány szerinti eljárásban szulfit ionokat leadni képes vegyületként alkalmazhatjuk például a nátrium- vagy kálium-hidrogénszulfitot, a nátrium- vagy kálium-metabiszulfitot, nátrium- vagy kálium-szulfitot, vizes kéndioxid oldatot, diaIkílszulfltokat, például a dimetilszulfitot. Cianid ionokat leadni képes vegyületek lehetnek például a fém-cianidok, így a kálium-cianid, nátrium-cianid, továbbá az ammónium-cianid, hidrogén-cianid. Alkalmazhatunk olyan vegyületeket is, amelyek a cianid csoportot komplex formában — ilyen például a káliumferrocianid — vagy szénatomhoz kötött formában — ilyenek például a benzilcianid, benzonitril — tartalmazzák.

Az adszorpciót végezhetjük úgy, hogy az alkalmazott adszorbenst összekeverjük a korrinoidokat tartalmazó oldattal, az adszorbenst tölthetjük oszlopba, alkalmazhatunk állóágyas vagy mozgóágyas (fluid) technológiát, 3

-3193812 az oldatokat lefele vagy felfele áramoltathatjuk.

A pH beállítását valamilyen alkalmas lúggal, előnyösen ammónium-hidroxiddal vagy nátrium-hidroxiddal végezzük.

A találmány szerinti eljárással az elválasztás elvégezhető nyers fermentlevek esetében, de elvégezhető már tisztított oldatok esetében is.

A fentiek alapján a találmány szerinti eljárás előnyeit a következőkben foglalhatjuk össze:

1) Az elválasztás szelektív, nem jár kobalamin veszteséggel.

2) Az eljárás egyaránt alkalmas nyers fermentlevek esetében a sejtek feltárásával oldatba vitt korrinoidok, valamint a már egy vagy több lépésben tisztított, korrinoidokat tartalmazó oldatok kezelésére.

3) A módszer ipari méretben egyszerűen megvalósítható technológiát tesz lehetővé, mert az alkalmazott nagy fajlagos felületű polimer adszorbensek adszorpciós kapacitása .igen nagy, fizikai és kémiai stabilitása jó, az adszorbens az elválasztás után az adszorpciós berendezésben is könnyen regenerálható.

4) A fenti előnyöket még fokozza az, hogy· az eljárás alkalmazható csak szulfit ionok, illetve ezeket leadni képes vegyületek esetében is, így ipari alkalmazás esetében kiiktathatók a cianid ionok alkalmazásakor mindig nagy költséget és figyelmet igénylő biztonságtechnikai és környezetvédelmi beruházások.

5) Acetont alkalmazva a B₁₂-vitamin ismert módon való eluálására, eljárásunk szerint a kivonatban lévő B₁₂-vitamin további aceton hozzáadásával már kristályosítható. Az ismert eljárásokban leírt oldószerek alkalmazása esetén viszont csak egy további bepárlási lépés közbeiktatása után kristályosítható a B₁₂-vitamin.

6) Az elkülönített III. faktor esetleges sómentesítés, bepárlás és szárítás után takarmányadalék koncentrátumként jól hasznosítható.

A találmány szerinti eljárást az alábbi példák szemléltetik anélkül, hogy igényünket ezekre a példákra korlátoznánk.

A) Kiindulási anyagok előállítása

A) a) A 159 356 lajstromszámú magyar szabadalmi leírás szerint félfolyamatos eljárással készített, az Országos Közegészségügyi Intézetben 76, 77, 78, 79 szám alatt deponált Corynebacterium sp,-t (jelzése 244 Cl), Lactobacillus sp.-t (jelzése 244 B Cl) és Propionbacterium sp.-t (jelzése 239 AI/6) tartalmazó, metántermelő, vegyes populációjú fermentlé feltárását, azaz a sejteken belül elhelyezkedő korrinoidok oldatbevitelét a 171 339 lajstromszámú magyar szabadalmi leírás szerint végezzük a következő módon:

m³ íermentléhez, amely 24,2 g kobalamint és 95,6 g inkomplett korrinoidot tartalmaz, liter 10%-os nátriumcianid oldatot adunk és 20%-os nátriumhidroxid oldattal pH=9 4 értékre lúgosítjuk, majd az elegyet keverés közben 70°C hőmérsékletre melegítjük és ezen a hőmérsékleten tartjuk 30 percig. Ezután 50 liter 30%-os vas(III) - klorid oldatot (17,4 kg FeCl₃ 6H₂O) adunk az elegyhez, 10 perc keverés után 20%-os nátrium-hidroxid oldattal az elegy pH-ját 8 értékre állítjuk be.További 10 perc keverés után az elegyből a csapadékot ülepítő centrifugával elkülönítjük. Az így nyert oldat 1 m³-e 23 g kobalamint és 88 g inkomplett korrinoidot tartalmaz.

A) b) Az A) a) pontban megadott módon nyert fermentlevet a 469/83 számú magyar szabadalmi bejelentés szerint, annak 1. példájában megadott módon tisztítjuk, makroretikuláris adszorbciós gyantával megkötve a íermentlében levő szennyezéseket a korrinoidokat tartalmazó még ép sejtek mellől, majd a sejteket feltárva oldatba visszük a korrinoidokat. Az így nyert csapadékos oldatból történik jelen eljárásunk szerint a korrinoidok szelektív adszorbciója, illetve szelektív elúciója. A fermentlé fenti tisztítását a következőképpen végezzük.

Az A) a) pontban megadott módon fermentált 1 m³ fermentlevet, amely literenként 28 mg B₁₂-vitamint és 5,2 mg III. faktort, valamint 129 mg inkomplett korrinoidokat tartalmaz, kéttagú, sorbakapcsolt, mozgóágyas adszorbciós rendszerben tisztítunk·, a szüretien fermentlevet folyamatos áramoltatással két, egyenként 25 liter hasznos térfogatú és 10-10 liter Diaion SP207 adszorbciós gyantát tartalmazó készüléken áramoltatjuk át 100 liter/óra átfolyási sebességgel. Ennek során a fermentlében jelenlévő extracelluláris szenynyezőanyagok fő tömege adszorbeálódik a gyantán. A fermentlé átfolyása után a gyantaoszlopokat 100 liter vízzel átmossuk. Az így részlegesen tisztított íermentléhez 2500 ml 10%-os kálium-metabiszulfit oldatot adunk, majd a pH értéket 50%-os vizes kénsav folyamatos adagolásával 4-re állítjuk be. Ezután a fermentlevet átfolyó rendszerben 10 perc tartózkodási idővel 110°C hőmérsékletre melegítjük, amikor is a sejtek feltáródnak és a korrinoidok a fermentlében oldatba mennek. Az így feltárt fermentlevet hőcserélőn átvezetve 3Ó°C hőmérséklet alá hütjük. A fenti módon nyert oldat literenként 27 mg B,₂-vitamint, 5 mg III. faktort és 118 mg inkomplett korrinoidot tartalmaz.

A) c) Az A) a) pontban megadott módon nyert fermentléből a 188. 425 lajstromszámú magyar szabadalmi leírásban és T/35717 számon közzétett magyar szabadalmi bejelentésben leírtak szerint komplett és inkomplett korrinoidokat együttesen tartalmazó vizes sűrítményt nyerünk a következő módon:

Az A) b) példában megadott módon tisztított és feltárt fermentlevet mozgóágyas technológiával alulról felfelé átvezetjük két sorbakapcsolt, egyenként 10 liter Diaion SP 207 gyantát tartalmazó oszlopon. Ekkor a fermentléből a komplett és inkomplett korrinoi-4193812 dók megkötődnek a gyantán. A sejt-törmeléket, a szerves és szervetlen kísérő anyagokat a megkötéssel azonos irányban vízzel kimossuk a gyanta oszlopokból. Ezután az oszlopokra 20 liter, összesen 3 g kálium-cianidot tartalmazó vizes oldatot nyomatunk fel, a korrinoidok ciano-formájának kialakítása céljából. 10 perc állás után leengedjük az oszlopokról a kálium-cianid tartalmú vizet és 100 liter vízzel átmossuk a gyanta oszlopokat. Az adszorbciós gyantáról a cianokorrinoidokat 100 liter 90 tf%-os metanollal oldjuk le, felülről történő folyamatos rávezetéssel. A metanolos eluátumból a metanolt 50°C-t meg nem haladó hőmérsékleten lepároljuk. A 10 liter vizes sűrítmény 23 g B₁₂-vitamint, 4 g III. faktort és

99,7 g inkomplett korrinoidot tartalmaz.

B) A találmány szerinti eljárás kiviteli példái

1. példa m³ fermentléből az A) c) pontban leírtak szerint nyert 10 liter vizes sűrítményt, amely összesen 27 g kobalamint és 99,7 g inkomplett korrinoidot tartalmaz, tömény ammónium-hidroxiddal pH=9,5-re lúgosítunk, majd 50 g kálium-metabiszulfitot adunk az oldathoz. Ezután az oldatot 5 liter/óra sebességgel átengedjük 5 liter DIAION HP-20 gyantából készült 100x1000 mm méretű adszorbciós oszlopon, majd 5 liter olyan vízzel mossuk az adszorbens oszlopot, amelyet pH=9,5-re lúgosítottunk tömény ammónium-hidroxíddal és 1 g/liter kálium-metabiszulfitot oldottunk fel benne. Ezután vízzel semlegesre mossuk a gyanta oszlopot. A gyantán átfolyt oldat és a vizes mosó oldatok tartalmazzák a kiindulási oldatban lévő inkomplett korrinoidok teljes mennyiségét, míg a kobalaminok a gyantán adszorbeálódnak. A kobalaminokat ismert módon 2 liter 90 tf%-os vizes metanollal eluáljuk. A metanol lepárlása utáni vizes oldat 25 g kobalamint tartalmaz, hozam 92,6% a kiindulási vizes sűrítmény kobalamin tartalmára vonatkoztatva.

2. példa

1,5 m³ fermentléből az A) c) pontban leírtak szerint nyert 15 liter vizes sűrítményhez, amely 40,5 g kobalamint és 177 g inkomplett korrinoidot és a metanol nagy részének a lepárlása után még 5% metanolt tartalmaz, 150 ml 10%-os kálium-cianid oldatot adunk, a pH-t 10,0-re állítjuk 2 N nátrium-hidroxiddal. A fenti oldatot 6 liter Amberlite XAD-2 adszorbciós gyantából készült oszlopon engedjük át 6 liter/óra sebességgel, majd 10 liter vízzel mossuk a gyanta oszlopot.. Az átfolyt lé és a mosóvíz tartalmazza az irikomplett korrinoidok teljes mennyiségét. A gyantán adszorbeált kobalaminokat 6 liter 80 tf%-os vizes metanollal ismert módon eluáljuk. Az eluátumból a metanolt lepárolva olyan vizes olda tót nyerünk, amely 36,45. g kobalamint tartalmaz. A kiindulási vizes sűrítmény kobalamin tartalmára vonatkoztatott hozam 90%.

3. példa

1000 liter fermentléből az A) b) pontban leírtak szerint előállított korrinoidokat, a sejtfeltárás során oldatba ment anyagokat és sejttörmeléket tartalmazó vizes elegyet, amely 32 g kobalamint és 118 g inkomplett korrinoidot tartalmaz, pH-értéke 4,0, mozgóágyas technológiával alulról felfelé átáramoltatjuk 20 liter DIAION SP 207 adszorbciós gyanta oszlopon, 200 liter/óra sebességgel. Ekkor a fermentléből pz összes korrinoid megkötődik a gyantán. A sejttörmeléket, a szerves és szervetlen kísérő anyagokat a megkötéssel azonos irányban áramló vízzel kimossuk a gyanta oszlopból. Ezután az oszlopon felülről lefelé 200 liter olyan vizes oldatot engedünk, át, amely 0,1% kálium-cianidot tartalmaz és pH értéke 9,5, aceton tartalma 4 tf%. Ezután 200 liter vízzel átmossuk a gyanta oszlopot. A kálium-cianidot tartalmazó lúgos mosóoldat és az azt követő vizes mosóoldat tartalmazza a kiindulási lében lévő inkomplett korrinoidok teljes mennyiségét. Az adszorbciós gyantáról a cianokobalaminokat ismert módon 60 tf%-os vizes acetonnal eluáljuk. Az aceton lepárlása után kapott vizes oldat kobalamin tartalma

28,5 g a kiindulási tisztított és feltárt fermentlé kobalamin tartalmának 89%-a.

4. példa

Az A) a) pontban leírtak szerint nyert, 23 g kobalamint és 88 g inkomplett korrinoidot tartalmazó 1000 liter nyers, feltárt, centrifugálásal csapadékmentesített fermentlé pH-ját nátrium-hidroxiddal 9,0-re állítjuk be és 50 g nátrium-cianidot oldunk benne, majd alulról felfelé, mozgóágyas technológiával átáramoltatjuk 40 liter DIAION SP 207 adszorpciós gyantából készült oszlopon a kobalaminok megkötése céljából. Az inkomplett korrinoidok ilyen körülmények között nem adszorbeálódnak a gyantán. Az adszorbenst szintén alulról felfelé, mozgóágyas technológiával vízzel kimossuk, majd a cianokobalaminokat 90 tf%-os metanollal ismert módon eluáljuk. Az eluátum 20,24 g cianokobalamint tartalmaz. A kiindulási feltárt fermentlére vonatkoztatott kobalamin hozam 88%.

5. példa

Az A) c) pontban leírtak szerint tisztított, illetve ciano-vegyületté alakított 10 liter vizes oldatot, amely 27 g kobalamint és 99,7 g inkomplett korrinoidot tartalmaz 1 N nátrium-hidroxid oldattal pH=9,5-re lúgosítjuk, 50 g kálium-metabiszulfitot oldunk fel benne, majd 4 liter, kismértékben poláros, akrilészter-polimer DIAION HP2MG gyanta oszlopon engedjük át. A gyantaoszlopot ezután vízzel semlegesre mossuk. Az átfolyt lé és a lúgos mosóvíz tartalmazza a kiindulási anyagban lévő inkomplett korrinoidok teljes mennyiségét. Ezután a kobalaminokat ismert módon 65 tf%-os etanollal eluáljuk az adszorbciós gyantáról. Az eluátum 23,2 g kobalamint tartalmaz. A kiindulási vizes sűrítmény hatóanyag tartalmára vonatkoztatott hozam 86%.

-5193812

6. példa liter, 23 g B₁₂-vitamÍnt, 4 g III. faktor és 99,7 g inkomplett korrinoidot tartalmazó vizes sűrítményből kiindulva az 1. példában leírtak szerint járunk el, azzal az eltéréssel, hogy a gyantán megkötött kobalaminokat nem együttesen, hanem szelektíven eluáljuk. Ezt úgy végezzük, hogy 5 liter DIAION HP 20 adszorbenst tartalmazó oszlopon 10 liter vizet — amely 10 tf% acetont tartalmaz és amelyben a pH-nak ammónium-hidroxiddal 9,5-re való beállítása után 2 g kálium-cianidot oldottunk — nyomatunk át alulról felfelé, 5 liter/óra sebességgel. Ezt követően az oszlopot 5 liter vízzel mossuk. Az eluátumot és a mosóvizet egyesítve, abból ismert módon takarmáhykiegészítőként felhasználható III. faktor tartalmú terméket állítunk elő a következő módon: a lúgos, acetonos eluátumot és vizes mosóoldatot egyesítjük, 10%-os kénsavval pH=4 értékre állítjuk be, majd annyi vizet adunk hozzá, hogy aceton tartalma 5 tf% alatt legyen. Ezután 0,5 liter DIAION HP 20 gyanta oszlopon átáramoltatva azon adszorbeáltatjuk a 111. faktort. Az adszorbenst 5 liter vízzel átmossuk, majd a III. faktort 1 liter 90 tf%os metanollal eluáljuk. Az eluátum 3,7 g III. faktort tartalmaz, 92,5% a hozam. A metanol lepárlása, majd a vizes oldat porlasztvaszárítása után takarmánykiegészítőként hasznosítjuk a terméket.

,A III. faktor eluálását és a vizes mosást követően a gyanta oszlopot 1,5 liter 0,1 N ecetsav oldattal mossuk, majd vízzel semlegesre mossuk. Az oszlopról a B₁₂-vitarnint 2 liter 70 tf%-os acetonos vízzel oldjuk le. Az így nyert oldatból a B₁₂-vitamint ismert módon aceton hozzáadásával kristályosítjuk. Hozam 19,3 g B,2 -vitamin. A B₁₂-vitamin termelés a kiindulási vizes sűrítményre vonatkoztatva 84%.

7. példa

1,5 m³ fermentléből az A) c) pontban leírtak szerint nyert 15 liter, 5 tf% metanolt tartalmazó vizes sűrítményt, amely 34,5 g B₁₂-vitamint és 6 g 111. faktort, valamint 149,6 g inkomplett korrinoidot tartalmaz, a 2. példában megadott módon dolgozunk fel azzal az eltéréssel, hogy a gyantán adszorbeált B₎₂-vitamint és III. faktort külön-külön oldjuk le a következő módon: a 6 liter Amberíite XAD 2 gyanta oszlopon 30 liter 30 tf% metanolt tartalmazó, 1 N nátrium-hidroxiddal pH=9,0-re lúgosított vizet — amelyben 0,01% kálium-cianidot oldottunk — áramoltatunk át 6 liter/óra sebességgel. Ezután átmossuk az oszlopot 6 liter vízzel. A mosóvizet egyesítjük az eluátummal. Ez az oldat 5,4 g III. faktort tartalmaz. A pH-t 10%-os sósavval pH 4-4,5 értékre savanyítjuk, majd annyi vizet adunk az oldathoz, hogy metanoltartalma 10 tf% alatt legyen. Ezután 1 liter Amberíite XAD 2 gyantaoszlopon átáramoltatva adszorbeáltatjuk a III. faktort, az adszorbenst 5 liter víz6 zel átmossuk, majd a III. faktort 2 liter 90%-os metanollal eluáljuk. A metanolt lepároljuk, majd a vizes oldatot porlasztva szárítva takarmánykiegészítő terméket nyerünk.

A III. faktor elúciója és a vizes mosás után a gyanta oszlopot tovább mossuk vízzel mindaddig, míg az átfolyt lé semleges nem lesz. Ezután az adszorbensre a B₁₂-vitamin leoldása céljából 2,5 liter 90 tf%-os metanolt nyomatunk fel, 10 perc állás után leengedjük az elátumot. A fenti műveletet még kétszer 1-1 liter 90 tf%-os metanollal megismételjük. Az egyesített eluátum 31,4 g B₁₂-vitamint tartalmaz. A metanol lepárlása után nyert vizes oldatból hétszeres térfogatú aceton hozzáadásával ismert módon 31 g nyers B₁₂-vitamint kristályt nyerünk, amely 28,9 g B₁₂-vitamint tartalmaz. Ezt szintén ismert módon vízből átkristályosítva 30,2 g B₁₂-vitamin kristályt nyerünk, amely megfelel a VI. Magyar Gyógyszerkönyv minőségi követelményeinek, B₁₂-vitamin tartalma 96%. A hozam a kiindulási vizes sűrítményben levő mennyiség 84%-a.

8. példa

1000 liter fermentléből az A) b) pontban leírtak szerint tisztított és feltárt fermentlevet, amely 27 g B₁₂-vitamint, 5 g III. faktort és 118 g inkomplett korrinoidot tartalmaz, a 3. példában megadott módon dolgozunk fel azzal az eltéréssel, hogy az inkomplett korrinoidok szelektív elúciója után a gyanta oszlopból a

III. faktort 10%-os nátrium-hidroxiddal pH= =9,5-re lúgosított és 15 tf% acetont és 0,01% kálium-cianidot tartalmazó 30 liter vízzel eluáljuk, majd ezután 5 liter vízzel átmossuk az oszlopot. Az egyesített eluátum és mosóvíz 4,3 g III. faktort tartalmaz. A feltárt fermentlére vonatkoztatott III. faktor hozam 86%.

A gyantaoszlopot a III. faktor elúciója és a vizes mosás után vízzel az átfolyt lé semlegességéig mossuk. Ezután a gyantán adszorbeált B|₂-vitamint 30 liter 70 tf%-os acetonnal leoldjuk. Az eluátumhoz azonos térfogatú acetont adunk a B,₂-vitamin kristályosítása céljából. A kivált nyers kristályt vízből ismert módon átkristályosítva 21,6 g kristályt nyerünk, amelynek B₁₂-vitamin tartalma 96% (20,7 g). A tisztított és feltárt fermentlé hatóanyagtartalmára vonatkoztatott B₁₂-vitamin hozam 76,8%.

9. példa

Az A) c) pontban leírtak szerint nyert 10 liter vizes oldatból, amely 23 g B,₂-vitamint és 4 g III. faktort, valamint 99,7 g inkomplett korrinoidot tartalmaz, az 5. példa szerinti szelektíven adszorbeáltatjuk az inkomplett korrinoidok mellől a B,₂-vitamint és a III. faktort, kis mértékben poláros 4 liter DIAION HP2MG adszorbciós gyanta oszlopon. A gyanta vizes mosása után 5 liter 0,02%-os kálium -cianidot tartalmazó, 10%-os nátrium-hidroxiddal pH=10,0-re lúgosított és 25 tf% metanolt tartalmazó vizet engedünk át az adszorbens oszlopon, majd 5 liter vízzel mossuk azt.

-6193812

Az egyesített eluátum és mosóvíz 3,4 g III. faktort tartalmaz. Ezután a gyantaoszlopot vízzel semlegesre mossuk, majd a B₁₂-vitamint ismert módon 90 tf% metanollal eluáljuk az adszorbensről. A metanol lepárlása után a 5 vizes oldatból hétszeres térfogatú aceton hozzáadásával 23,57 g nyers 80% B₁₂-vitamin tartalmú kristályt kapunk, amelyet vízből ismert módon átkrístályosítva 17,·6 g gyógyszerkönyvi minőségű B_l2-vitamin kristályt nye- 10 rünk, amely 96,5% B₁₂-vitamin tartalmú. A kiindulási vizes sűrítményre vonatkoztatott hozam 74%.

Claims

1. Eljárás korrinoidok szelektív adszorpcióval és/vagy szelektív elúcióval történő elválasztására valamilyen nagy fajlagos felületű polimer adszorbens segítségével, azzal 20 jellemezve, hogy

a) a komplett korrinoidokat pH=8-ll, előnyösen pH=9-10 közti értékre lúgosított vizes oldatból, vagy legfeljebb 20 tf% valamilyen vízzel elegyedő rövidszénláncú alifás alko- 25 holt, vagy legfeljebb 5 tf% valamilyen vízzel elegyedő rövidszénláncú alifás ketont tartalmazó lúgos vizes oldószerelegyből, cianid vagy szulfit ionok, vagy ezeket leadni képes vegyületek jelenlétében az adszorbensen meg- 30 kötjük, vagy

b) az adszorbensen előzőleg bármilyen módon megkötött korrinoidok közül az inkomplett korrinoidokat pH=8-ll, előnyösen pH=9-10 közti értékre lúgosított vizes oldat- 35 tál, vagy legfeljebb 20 tf% valamilyen vízzel elegyedő rövidszénláncú alifás alkoholt, vagy legfeljebb 5 tf% valamilyen vízzel elegyedő rövidszénláncú alifás ketont tartalmazó lúgos vizes oldószereleggyel, cianid vagy szulfit ionok, vagy ezeket leadni képes vegyületek jelenlétében eluáljuk, és kívánt esetben az adszorbensről a megkötött komplett korrinoidokat ismert módon, előnyösen valamilyen vízzel elegyedő és adott esetben víztartalmú szerves oldószerrel eluáljuk, vagy kívánt esetben az adszorbensről az a-(5-hidroxi-benzimidazolilj-kobamid-cianidot pH=8,11 értékre, előnyösen pH=9-10 értékre lúgosított, 2040 tf% valamilyen vízzel elegyedő rövidszénláncú alifás alkoholt, vagy 5-20 tf% valamilyen rövidszénláncú alifás ketont tartalmazó lúgos vizes oldószereleggyel, cianid vagy szulfit ionok, vagy ezeket leadni képes vegyületek jelenlétében eluáljuk, majd az adszorbensen megkötve maradt B_!2-vitamint ismert módon, előnyösen valamilyen vízzel elegyedő és adott esetben víztartalmú szerves oldószerrel eluáljuk.

2. Az 1. igénypont szerinti a) vagy b) eljárás, azzal jellemezve, hogy vízzel elegyedő rövidszénláncú alifás alkoholként metanolt vagy etanolt, vízzel elegyedő rövidszénláncú alifás ketonként acetont alkalmazunk.

3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy cianid vagy szulfit ionokat leadni képes vegyületként kálium- vagy nátrium-cianidot vagy kálium- vagy nátrium-metabiszulfitot alkalmazunk.