HU192569B - Process for conserving and reproducing virusgenomes and derivatives - Google Patents
Process for conserving and reproducing virusgenomes and derivatives Download PDFInfo
- Publication number
- HU192569B HU192569B HU842958A HU295884A HU192569B HU 192569 B HU192569 B HU 192569B HU 842958 A HU842958 A HU 842958A HU 295884 A HU295884 A HU 295884A HU 192569 B HU192569 B HU 192569B
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- cells
- derivatives
- tissues
- viral
- plant
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/04—Plant cells or tissues
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
- A01H4/00—Plant reproduction by tissue culture techniques ; Tissue culture techniques therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
- C12N15/8202—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by biological means, e.g. cell mediated or natural vector
- C12N15/8203—Virus mediated transformation
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Botany (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Virology (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
A találmány tárgya eljárás a vírusgenomok és származékaik fenntartására és szaporítására proliferáló növényi anyagban.
A genetikailag manipulált vírusok vektorként történő felhasználásával a növényöröklés új genetikai informá- 5 cióinak bevitelekor a növényanyag új, vagy javított tulajdonságokkal állítható elő.
A világ népességének gyors emelkedése miatt a biológiai kutatás súlypontját a növényanyag genetikai befolyásolása képezi. 10
A kutatás egyrészt alternatív, reprodukálható élelmiszereket, energia- és nyersanyagforrásokat keres, mint előnyös tulajdonságokkal rendelkező új növény-, különösen hibridfajtákat, amelyek kórokozókkal (mint növénypatogén rovarokkal, gombákkal, baktériumokkal, víru- 15 sokkal stb.), az időjárási vagy termőhelyi behatásokkal (mint forrósággal, hideggel, széllel, talajállapottal, nedveséggel, szárazsággal stb.) szemben fokozottan rezisztensek, vagy a levelekben, magvakban, gumókban, vagy gyökerekben, szárakban stb. megemelt tartalék- és kész- 20 letanyagképzéssel rendelkeznek. Másrészt az értékes biomassza keresése mellett nő a gyógyászatban felhasználható növényi hatóanyagok és származékaik, mint az alkaloidok, szteroidok és más hasonló anyagok iránti igény. Ezeknek a hatóanyagoknak a hozama igen csekély 25 a természetes előfordulású növényekben, a nagyobb hozam alternatív úton, mint gépmanipulált növényfajták extrakciójával hozzáférhetővé tehető.
Ezért a növények célirányos manipulációjának gyakorlati lehetőségei iránt fokozott az érdeklődés. 30
E cél elérésének egyik útja az idegen gének átvitele izolált növénysejtekbe, a genetikai anyag replikációja és expressziója, valamint azok elszaporítása és fenntartása a kiinduló sejtből sejtosztódással képződő leánysejtekben. Ilyen leánysejtek egysejt és szövettenyészet vagy 35 egész növény formájában állíthatók elő.
Az osztódó növényseiteknél olyan Irányzat figyelhető meg, hogy a vírusok behatolását, a vírusok élet- és szaporodóképességét gátolni vagy teljesen lekötni képesek.
így például ismert, hogj' a karfiol mozaik vírus 4C (cauliflower inosaic vírus = CaMV) egy növény differenciált (állandósult) sejtjeiben szaporodni képes és minden további állandósult sejtet megtámadni képes, ugyanakkor a növekedési centrumot vagy a merisztémát, vagyis az itt osztódó sejteket nem fertőzi meg. így a vírusfertő- 45 zott növényből merisztéma tenyészettel vírusmentes növény állítható elő.
Ezért az volt várható, hogy a vírusoknak mint új genetikai információk vektorainak a bevitele nem vezet genetikailag módosított növényanyaghoz, a vírusok az 5C osztódó növényi anyagba írem jutnának el, vagy ott tönkremennének, vagy a genetikai anyagot, amelyet a karfiol mozaik vírus (cauliflower mosató vírus) az osztódó növénysejtekbe juttat, a növénysejtek öröklődéskor nem vennék föl vagy replikációhoz nem jutnának el. 55
A vírusoknak vektorokként való bevetésével a növényöröklés átalakítása és a növényi kiindulási anyaggal genetikailag azonos utódok előállítása céljából szükséges a vírusokat tenyészteni anélkül, hogy önszaporodásuk és az új gazdasejtbe történő behatolásuk képességét elve- 60 szítenék.
Azt találtuk, hogy a vírusgenomok vagy származékaik tenyészthetők osztódó növényi anyagban és elértük a vírusgenomok vagy származékaik beépítését a növényi genomba. 65
A találmány eljárás a vírusgenomok és származékaik fenntartására és szaporítására osztódó növényi anyagban. Ez az eljárás abból áll, hogy a vírusgenomokat és származékaikat tartalmazó izolált növényi piotopíasztokat, sejteket vagy szöveteket megfelelő táptalajon tenyésztjük.
A tenyésztés az egész növény újraképződésével zárul. Az így fenntartott növények némely esetben reziszten- : ciát mutatnak a további vírusfertőzésre (cross-resistance).
A találmány szerinti eljárás keretében lehetséges nem fertőző, természetes körülmények között nem életképes vírusokat (defektes vírusokat) vagy azok genomjait felhasználni, amelyeknek nagy replíkációs rátájuk van és lényegében a beépített genetikai információ nagysága semmiféle korlátozást nem mutat, emellett az ilyen vírust vagy genomjait tartalmazó növények betegségtünetet nem mutatnak. Ily módon a defektes vírusokat a genetikai információk vektoraként nagyon előnyösen lehet alkalmazni. Továbbá lehetséges defektes vírusokat vagy azok genomjait tartalmazó protoplasztokból, sejtekből vagy szövetekből egész növényeket regenerálni, amelyek a patogén vírusokkal szemben rezisztensek.
A vírus-DNS sűrűsége a fertőzött kallusz sejtjeiben nagyon nagy és úgy tűnik, hogy messzemenően határtalan. A vírus-DNS itt szabadon, nem pedig fehérje (protein) köpennyel burkoltan fordul elő.
A taláhnány keretében az alábbi definíciók érvényesek: Vírusgenomok: Egy vírus genetikai információinak formái:
eredeti DNS eredeti RNS egy átirat (transzkripció)
DNS
Egy vírusgenom származéka (derivátuma):
deleciók (letörés, kitörés) mutánsok új kombinációk kombinációk más génanyaggal Protoplaszt; izolált, sejtfal nélküli növényi sejt,amely sejtkultúrává vagy teljes növénnyé történő regeneráló képességgel rendelkezik Sejttenyészet: A sejtek szaporodó tömege nem differenciált (homogén) állapotban.
A találmány szerinti eljárás kiinduló növényanyagaként, különösen izolált protoplasztokként mindenekelőtt termesztett növények használatosak.
A termesztett növények közül ezek mindenekelőtt a Gramineae, a Solanaceae, a Compositae, a Cruciferae és Leguminosae családok jöhetnek számításba.
A fen t nevezett csoportok képviselőj eként a Gramineae esetében búza, rozs, árpa, zab, rizs, kukorica, köles, cukornád, a Solanaceae esetében burgonya, paradicsom és dohány, a Compositae esetében napraforgó, saláta (Lactuca sativa), endivia (Cichorium endivia) és kamilla (Matricaria), a Cruciferae esetében különböző káposztaés répafajok, mint olaj- és fűszernövények és a Leguminosae esetében szója, Lupinus, csillagfürt, lucerna, borsó, bab és földimogyoró nevezhetők meg.
A Cruciferae családból főleg a Brassica nemzetség említésre méltó, amelyhez például a repce, a réparepce, tariórépa, a fekete és fehér mustár, valamint a káposzta, répafajok tartoznak. Itt különösen a Brassica rapa cv Just Right nevezhető meg.
A találmány egyik előnyös eljárása szerint olyan izolált növényi proloplasztokat, sejteket vagy szöveteket tenyésztünk, amelyek a növényvírusok genomjait, vagy azok derivátumait tartalmazzák.
192 569
A találmány szerinti eljárás további előnye, hogy az izolált, növényi protoplasztok, sejtek vagy szövetek vírusgenomokat vagy derivátumaikat tartalmazzák, amelyek a protoplasztok, sejtek és szövetek növénygenomjába vannak beépítve.
A vírusok közül különösen a DNS vírusok, mindenekelőtt a caulimovírusok említhetők meg és ezek közül különösen a Cauliflower-Mosaic-Virus (karfiol mozaik vírus = CaMV).
Vírusgenomként a vírus RNS-ből az eredeti vírus DNS és DNS-másolatok (kópiák) említendők. A vírusgenomok genetikailag manipuláltak lehetnek, például patogenitásuk korlátozott lehet, vagy beépített, vírusidegen, genetikai anyagot tartalmaznak.
Általában célszerű izolált növényi protoplasztokat, sejteket és szöveteket tenyészteni, amelyek növényi eredetű beépített, vírusidegen, genetikai anyaggal rendelkező vírusgenomokat tartalmaznak, előnyösen egy olyan növényi anyagot, amelynek genonija a vírusgenomokat tartalmazó protoplasztok, sejtek és szövetek genomjától különbözik, vagyis a genetikailag egymástól különböző növények a genetikai anyagok recipienseként és donorjaként működnek.
A beépített, vírusidegen, genetikai anyagok hordozóiként mindenekelőtt a DNS-vírusok, előnyösen a caulímovírusok és ezek közül a Cauliflower-Mosaic-Virus (karfiol mozaik vírus) jöhet számításba.
A találmány szerinti különösen előnyös eljárás abból áll, hogy a Brassica rapa, például Brassica rapa cv Just Right izolált, növényi protoplasztjait, sejtjeit vagy szöveteit tenyésztjük, amelyek a Cauliflower-Mosaic-Virus egy növényi, beépített, vírusidegen genetikai információjával rendelkező genomjait tartalmazzák, és amelyek genomja a Brassica rapa protoplasztjainak, sejtjeinek vagy szöveteinek genomjaitól különbözik.
A növényi, izolált protoplasztok, sejtek és szövetek kinyerése az ismert módszerekkel vagy azokkal analóg módon történik.
Az izolált növényi protoplasztok, amelyek az izolált sejtek és szövetek kiindulási anyagaként is alkalmasak, a növény tetszés szerinti részéből nyerhetők, mint például levelekből, szárakból, virágokból, gyökerekből, pollenből vagy magból. Eló'nyösen a levélprotoplasztok használhatók fel. Az izolált protoplasztok sejttenyészetekböl is nyerhetők. A protoplasztok izolálásának módszere megtalálható például: Gamborg, O. L. és Wetter, L. R., Plánt Tissue Culture Methods c. kötetében (1975), 11-21. oldalak.
A növényi anyag feldolgozása és tenyésztése célszerűen a következőkben ismertetett módon történhet, amely azonban nem jelent semmiféle korlátozást.
A növényi szerveket — hacsak a kiindulási anyagnál már nem steril sejtkultúráról van szó — sterilezni kell, például etanollal, higany(II)-kloriddal, kalcium-liipokloritfal vagy kereskedelmi forgalomban lévő fehérítőszerrel, és ezt követően steril vízzel alaposan le kell mosni. Minden további kezelést teljesen steril körülmények között kel! végezni, ahol a sterilitás követelménye a használt eszközökre és oldatokra is vonatkozik.
A szövetek sejtfalainak lebontása enzimatikusan történik, például a cellulóz, hemicelluláz vagy pektináz segítségével, amely a kereskedelemben mikrobiológiai kultúrfiltrátumként kapható és 0,001 %-tól 5 %-ig terjedő koncentrációban rendelhető (ha nincsen más megadva, akkor a következőkben tömegszázalékról van szó).
A növény sej tek turgornyomását az izolálás és a hozzákapcsolódó tenyésztés során a táptalaj és az izolálási közeg nagyobb ozmotikus nyomásával kell kiegyenlíteni. Ez az ozmotikusán hatásosabb közegek, mint például a mannit, szorbit, szacharóz, glükóz, kálcium-klorid vagy semleges sóionok egyedüli használatával vagy az egyszerű táptalaj és/vagy egymás közötti kombinációjával történik. Az izolálási közeg és táptalaj ozmotikus értéke célszerűen kb. 200-1000 mOs/kg H2O (Os = Molalitás = az ozmotikusán ható részecske (partikulum) mólja/kg oldószer) között van.
Az enzimkeveréket általában 5,2-8,0, előnyösen
5,4 p'l értékre kell beállítani.
A szövetek — amelyekből célszerű finom metszeteket készíteni (a levelek esetében az epidermisz eltávolítását is lelret alkalmazni) - inkubációja általában 5—40 °C hőmérséklettartományban, többnyire 24 °C-on történik. Az inkubáció időtartama az enzim koncentrációjától, az inkubáció hőmérsékletétől, a szövettípustól, valamint a szcvetdifferenciálódás állapotától függ. Az inkubációs időtartam általában 20 perc és több nap közötti időtartam lehet.
Ezt követően a protoplasztokat a fel nem oldódott szövetekből 25-280 mikrométer lyukbőségü szitán elkülönítjük és centrifugálással betöményítjük. A protoplasztok lebegési sűrűségük és az inkubációs — illetve mosóoldat sűrűsége függvényében ülepednek vagy lebegnek. Az ülepedő vagy lebegő protoplasztokat reszuszpendálással és centrifugálással ozmotikusán stabil mosószeri el (például cukoralkohol, cukor, semleges sók oldataival egyedül vagy ezek kombinációjával, és/vagy a tápközeggel való kombinációjával 5,4-6,5 pH tartományban) ismételten mossuk és végül a tápközegbe visszük. Az ezt követő tenyészet fontos tényezője a protoplasztok populációsűrűsége, vagyis a tápközeg milliliterében lévő protoplasztok száma. A populációsűrűség célszerűen l-tó'l 1 x 106/ml-ig, optimálisan 2x 104/ml-töl6x 104/miig terjed.
A tenyésztés módja változó, általában folyékony tápközeget alkalmazunk vékonyrétegben Petri-csészében, μ -tői 200 jul-ig terjedő térfogatú csepp- vagy függőcsep ptenyészetben, egészen az agar-agarral, agarózzal gélesített tápközegben vagy a szilárdító anyagot tartalmazó táptalaj és folyékony tápközeg kombinációit használjuk. A tenyésztés történhet Petri-csészében, multititer lemezen dobozban, Erlenmeyer lombikban, mikrokapillárisban vagy szövettenyésztő edényekben. Ezek rétegezett, vagy rétegezetten műanyagból vagy üvegből lehetnek.
A tenyésztést általában 7 és 42 °C között, előnyösen 24 és 27 °C között végezzük, amelyet vagy állandó hőmé: sékleten tarthatunk, vagy sorozatszerűen váltogatunk.
Λ fényviszonyokat a tenyésztés során tartós sötétség és 500-5000 Ix tartós fény és fény-sötétség sonenddel váltogathatunk, előnyösen a fény-sötétség váltogatását alkalmazzuk.
Jelenleg számos lápközeg áll rendelkezésünkre, amelyek az egyes komponensekben vagy azok csoportjában különböznek egymástól. Minden közeget a következő elv szerint állítottunk össze: szervetlen ionok egy csoportját tartalmazza körülbelül 10 mg/l-től néhány 100 mg/1 koncentrációban (ún. makroelemeket, mint nitrátot, foszfátot, szulfátot, káliumot, magnéziumot, vasat), a szervetlen ionok egy további csoportját (ún. mikroelemeket, mint a kobaltot, cinket, rezet, mangánt) tartal3
-3192 569 mázzá legfeljebb néhány mg/1 mennyiségben, továbbá számos vitamint (inozitot, fólsavat, tiamint), energia- és szénforrásokat, mint például szacharózt, vagy glükózt, valamint az auxinok és citokininek osztályába tartozó növekedésszabályozó természetes és szintetikus fitohormonokat 0,01-10 mg/1 mennyiségben. A táptalajokat ezenkívül a cukoralkoholok (például maimit) vagy cukor (például glükóz), vagy sóionok (például kalcium-klorid) hozzáadásával ozmotikusán stabilizáltuk és a pH értékét 5,6—6,5-re állítottuk be.
A használatos tápközegek részletesebb leírása megtalálható például Koblitz, H., Methodische Aspekte dér Zell- und Gewebezüchtung bei Gramineen unter besonderer Berücksichtigung dér Getreide, Kulturpflanze XXII., 1974. (93 157. oldalak) c. munkájában.
A tenyésztési és inkubációs feltételeknek, mint például a tápközeg és a környezet hó'mérsékletének, a páratartalomnak, a megvilágítás erősségének és tartamának, a táptalajok kiegészítésének, felújításának, vagy azok összetétele változtatásának alkalmazkodnia kell a mindenkori adottságokhoz, mint a protoplasztok fajtájához, a vírusgenomok és származékaik fajtájához, a növényi anyag és/vagy vírusgenomok növekedési és osztódási sebességéhez, a kiválasztódó anyagok mennyiségéhez és más tényezőkhöz.
Az izolált, növényi protoplasztokat, sejteket vagy szöveteket megfelelő táptalajon, általában gélképző anyagot tartalmazó táptalajon tenyésztjük.
Gélképző anyagként az agarózt eredményesen alkalmaztuk. A táptalaj agaróztartalma 0,4—4 % között van.
Az agaróz az agar egyik alkotórésze. A forgalomban lévő agar a semleges agaróz, az ionos agaropektin és a hozzájuk kapcsolódó, számos származékvegyület keverékéből áll. A forgalomban lévő agarózt az agárból ismert eljárással állítják elő. Általában egyes oldalcsoportok megmaradnak, amelyek lényegében a legfontosabb fizikai-kémiai tulajdonságokat, mint a gélképzést, a gélesedést és az olvadáspontot meghatározzák.
Az alacsony olvadáspontú és a gélképző agarózt a hidroxi-etil-csoport agarózmolekulába történő utólagos bevitelével állítják elő. Az így módosított agarózt most és a későbbiekben LMT-Agarose (iow melting agarose) névvel jelöljük.
A megfelelő agaróz preparátumok például a következők: Sea Plaque LMT, LMP, Typ VII, HGT, HGTP, LE Standard LMT vagy Sea-Prep.
A vírusgenomokat vagy derivátumaikat tartalmazó protoplasztokat, sejteket vagy szöveteket különböző módon vihetjük a tápközegbe. Ezt úgy végezhetjük el, hogy a vírusgenomokat vagy derivátumokat tartalmazó protoplasztokat, sejteket vagy szöveteket folyékony, meleg tápközegbe visszük, amely gélképző anyagot tartalmaz és kihűléskor megdermed. Kedvezőbb viszont, ha a vírusgenomokat vagy derivátumaikat tartalmazó protoplasztok, sejtek vagy szövetek szuszpenzióját gélképző nélküli folyékony tápközegbe visszük, majd gélképző anyagot tartalmazó folyékony tápközeget hozzáadva alaposan összekeverjük és utána hagyjuk megdermedni.
Különösen jó eredményt lehet elérni-Kikkor, ha a gélképzőt tartalmazó tápközeget, amelyben a vírusgenomokat vagy derivátumaikat tartalmazó protoplasztok, sejtek vagy szövetek vannak, folyékony tápközeggel vesszük körül. így például a gélképző tápközeg csészékbe, például Petri-csészébe lemezöntéssel történő kitöltése után
- mint ahogy a baktériumok és élesztősejtek tenyésztésekor használják — a megdermedés után szegmensekre (részekre) darabolhatjuk és azt a folyékony tápközegbe, előnyösen tápoldatba helyezzük. A szegmensek térfogatának aránya a folyékony tápközeghez, illetve a tápoldathoz 1 : 20-tól 1 :100-ig lehet. Ajánlatos folyékony tápközeget a szegmensekkel például rázással rázógépben mozgásban tartani. A géies közeg szegmentációját általában a tápközeg dermedése után azonnal, vagy a tápközeg dermedését követő 4 héten belül, előnyösen 3—8 nap múlva kell elvégezni.
Olyan szegmenseket állítunk elő, amelyek nagysága és mérete előnyösen egyforma. Ezek lehetnek szabálytalan, előnyösen szabályos alakúak. Alakjuk például kúp, kocka, oszlop, prizma, szelet és golyó lehet. A szegmensek átlagos átmérője vagy keresztmetszete általában 2—100 mm, előnyösen 2—10 mm.
A találmány szerinti eljárásban protoplasztokat, sejteket és szöveteket használunk, amelyek közvetlenül izolálásuk előtt vírussal fertőzöttek voltak vagy olyanokat, amelyek izolálásukkor még vírusmentesek voltak, és amelyeket később vírussal mesterségesen fertőztünk.
A találmány szerinti eljárás magában foglalja a vírusmutánsok fenntartását és szaporítását, emellett az ilyen mutánsok vagy ezek derivátumainak vírusgenonjait tartalmazó, izolált növényi protoplasztok, sejtek vagy szövetek megfelelő tápközegben való tenyésztését. A vírusmutánsok természetes körülmények között életképtelenek is lehetnek, különösen vonatkozik ez a növényvírusok mutánsaira.
A protoplasztok, sejtek vagy szövetek tartalmazhatják például az ilyen vírusmutánsok eredeti vírus-DNS-ét vagy az RNS DNS-másolatát (kópiáját), amelyek természetes körülmények között életképtelenek, vagy a DNSvírusok megfelelő mutánsait, emellett a DNS-vírusokként elsősorban a caulimovírusok, különösen a CauliflowerMosaic-Virus említendők.
A találmány tárgyát képezi a regenerált vírusgenomokat vagy derivátumaikat tartalmazó növénysejtek, a nö401 vényszö vetek vagy egész növények termesztése, amennyi; ben ezeket az izolált, növényi - ezeket a vírusgenomo/ kát vagy derivátumaikat tartalmazó — protoplasztokból, i különösen a termesztett növények protoplasztjaiból ál» Htjuk elő.
Termesztett növényként itt mindenekelőtt a Gramineae, Solanaceae, Compositae, Cruciferae, Leguminosae családok jöhetnek számításba, amelyek közül a Cruciferae családon belül különösen a Brassica nemzetséget kell megemlíteni, és itt mindenekelőtt a Brassica rapa-t, például a Brassica rapa cv Just Right-ot.
Vírusként különösen a növény vírusok említendők.
A tenyésztett növénysejtek, növényszövetek, vagy az egész növények tartalmazhatják az eredeti vírus-DNS-t, a vírus-RNS DNS-másolatát (kópiáját) vagy DNS-vírust, elsősorban a caulimovírust és különösen a CauliflowerMosaic-Virust.
Különösen kiemelendők a Brassica rapa regenerált növénysejtjei vagy szövetei, amelyek a Cauliflower-Mosaic-Virust tartalmazzák.
Továbbá a tenyésztett növénysejtek vagy szövetek olyan vírusgenomokat vagy ezek derivátumait tartalmazhatják, amelyek genetikai információt hordoznak, amelyek a növénysejtek vagy szövetek genömjábabeépülnek, vagy ezek genetikailag manipulált vírusgenomokat vagy ezek derivátumait tartalmazzák, például amelyek pato-4192 569 genitása korlátozott, vagy amelyek beépített, vírusidegen genetikai információt tartalmaznak, amely előnyösen egy növényből származik, és genomja különbözik attól a növénysejttől vagy szövettől, amely a vírusgenomot vagy annak derívátumát tartalmazza. így a tenyésztett növénysejtek vagy szövetek például a beépített, vírusidegen genetikai anyagot hordozó Cauliflower-Mosaic-Vírus genomját tartalmazhatják, különösen olyan növényi anyagot, amelynek genomja eltér a Cauliflower-Mosaic-Vírust tartalmazó növénysejtek és szövetek genomjaitól.
Növényként, amely a Cauiiflower-Mosaic-Virust tartalmazza, főleg a Brassica rapa, például a Brassica rapa cv Just Right jöhet számításba.
A találmány a termesztett növényekre is vonatkozik, amelyek a vírusgenomokat vagy derivátumaikat tartalmazzák és azok a vírusgenomokat vagy derivátumokat tartalmazó protoplasztokból termesztéssel állíthatók elő, beleértve azok szaporulatait, amikoris a szaporulat mind ivarosán, mind vegetatív úton előállítható.
Egy további szempont az agaróz felhasználása a vírusgenomokat vagy azok derivátumait tartalmazó növénysejtek vagy szövetek előállítása és tenyésztése során az ugyanazon vírusgenomokat vagy derivátumaikat tartalmazó izolált, növény protoplasztokból.
A találmány tárgyát képezi továbbá a virusok in-vitromutánsainak szaporítása. Ilyen mutánsok akkor szaporíthatok, ha az izolált, növényi protoplasztok genetikailag manipulált vírusokkal vagy vírusgenomokkal fertőzöttek, és egy megfelelő tápközegben, előnyösen agarózzal mint gélképző anyaggal kezelt táptalajon a növény differenciálódásáig tenyésztjük azokat.
A találmány tárgyához tartozik továbbá az in-vitro-vírusmutánsok felhasználása, amelyet a fentiekben leírtak szerint genetikailag manipulált vírusokból vagy vírusgenomokból lehet szaporítani a protoplasztok transzformációs rendszerében.
A vírusszaporítás a protoplasztokból álló sejttenyészetben két különböző úton végezhető el: a) a sejttenyészet-DNS hibridizációja radioaktív jelölt vírus DNS-sel, vagy b) az egészséges növény reinfekciója a sejttenyészet extraktumaival.
A protoplasztok izolálásának és a vírus szaporodás kimutatásának módszere ismert. Előnyös a módszert a mindenkori adottságoknak megfelelően változtatni.
A következőkben az izolált protoplasztok kinyerését írjuk le, valamint a protoplaszt-és sejtszaporítás, valamint a vírusszaporítás kimutatásának példáit mutatjuk be.
A Brassica rapa-t (Wasserrübe, Trunip) növényházban termesztjük és azt 5 leveles állapotban a virológiában ismert módszerrel (a vírusszuszpenzió bedörzsölése a levél színén dörzsporral, szilicium-karbid porral okozta mechanikai sebzéssel) a Cauliflower-Mosaic-Virussal fertőzzük. A szisztemikusan fertőzött növényeket növénynevelőkamrába visszük, és ott az alábbi feltételek között tenyésztjük: 12/12 óra fény/sötétség ritmus, 5000 Ix fényintenzitás a SILVANIA daylight típusú fénycsővel, 27 °C nappali és 20 °C éjszakai hőmérséklet, állandó 70 % relatív páratartalom, naponta kétszeri öntözés a talaj(tőzeg)hoinokkeverékben, cserépedényben fejlődő növényeket 0,1 %-os növény mii trágya-koncentrátumnsal, mint a Greenzit ® tápoldattal (Ciba-Geigy ÁG, Basel). A protoplasztok izolálásához a szisztemikusan fertőzött növények kb. 12 cm hosszú leveleit használjuk fei. A leveleket csapvizzel lemossuk, 30 percig 0,5 %-os kalcium-hipoklorit-oldatban sterilezzük és végül gondosan, steMESX: 2-(N-morfotino)-etánszulfonsav, Sigma cég terméke, száma: M-8250 rí] körülmények között, steril munkaasztalon ötször, ionmentesített, steril vízzel mossuk. A levéllemezt 2 cm széles csíkokra feldaraboljuk, egymásra helyezzük és éles borotvapengével 1 mm széles levélkeresztmetszeteket készítünk. A levélkeresztmetszeteket a következő összetételű, ozmotikusán stabilizált enzimoldatba helyezzük, amely a szövetbe vákuumszerűen beszűrődik, 1 %-os cellulázt (cellulase, ONOZUKA RIO) + 0,1 %-os pektinázt (pekrinase, MACEROZYME RIO, mindkettő a Yakult Pharrtiaceutical Industry Co., Ltd. 8—21 Shingikan-cho, Nishinomiya, Japán cég terméke) oldunk egy elegyben, amely 0,45 mól/1 mannitot (3 tf) és 0,17 mól/1 kalcium-kloridot (tf/í) tartalmaz, a pH-t 5,4-re állítjuk be 0,1 mól/1 kálium-hidroxiddal. Az enzimoldat ozmotikus értéke kb. 510 mOs/kg H2O. A szövetmetszeteket 16 órán át, c'C-on inkubáljuk, a szövetek túlnyomó része izolált protoplasztokká bomlik. A protoplasztszuszpenziót 100 mikíométer lyukbőségű acélszűrővel a fel nem oldódott szövetrészektőí elválasztjuk és steril centrifugacsövecskékbe helyezzük át, 10 percig 750 fordulat/perc, ülepítjük (szedimentálás). Az ülepített (szedimentált) protopias/tokat steril ozmotikumban(0,175 mól/1 kalcium-kloridot és 0,5 % MESx-t tartalmazó pufferral, a pH-értéket
5,7--e állítjuk be, 510 mOs/kg H2O-val) reszuszpendáljuk és 500 fordulat/perc-en ülepítjük, reszuszpendáljuk az czmotikumban és háromszor mossuk. A protoplasz- , tokát ezt követően az 1. példa szerinti táptalajban reszuszpendáljuk és 8 x 104/ml populációsűrűségre állítjuk be.
1. példa
A Brassica rapa protoplasztjainak tenyésztése
Tápközeg:
Kao, K. N. (1977), Molec. gén, Génét. 150,225-230 és Koblitz K. és Koblltz, D. (1982), Plánt Cell Reports(l, 147—150) nyomán módosítva:
| NH4NO3 | 600 | mg/1 | Na-purivát | 5 | mg/1 |
| KNO3 | 1900 | mg/1 | Citrát | 10 | mg/l |
| CaCl2 · 2H2O | 600 | mg/1 | Maleát | 10 | mg/1 |
| MgSO4 7H2O | 300 | mg/1 | Fumarát | 10 | mg/1 |
| KH2PO4 | 170 | mg/1 | Nikotin-amid | 0,5 | mg/1 |
| KCi | 300 | mg/1 | ' Piridoxin-HG, | 0,5 | mg/1 |
| FeC!3 · 6H2O | 27 | mg/1 | Tiamin-HCl | 5,0 | mg/1 |
| Na^EDTA | 74,6 | mg/1 | D-Kalcium- | ||
| -pantotenát | 0,5 | mg/1 | |||
| MnSO4'1H2° | 10 | mg/1 | Folát | 0,2 | mg/1 |
| Na2MoC>4 · 2H2O 0,25 | mg/1 | p-Amino- | |||
| benzoesav | 0,01 | mg/1 | |||
| H33O3 | 3,0 | mg/1 | Biotin | 0,005 mg/1 | |
| ZnSO4'7H2O | 2,0 | mg/1 | Kolin-klorid | 0,5 | mg/l |
| CU.5O4 · 5H2O | 0,025 mg/1 | Riboflavin | 0,1 | mg/1 | |
| CoC12 · 6H2O | 0,025 mg/1 | Aszkorbinsav | 1,0 | mg/1 | |
| KJ | 0,75 | mg/1 | D3-Vítatnin | 0,005 mg/1 | |
| Fruktóz | 125 | mg/1 | B(2-Vi tanún | 0,01 | mg/1 |
| Ribóz | 125 | mg/1 | m-Inozit | 100 | mg/1 |
| Xüóz | 125 | mg/1 | Kazein-liidro- lizátum | 125 | mg/1 |
| Mcnnóz | 125 | mg/1 | 2,4-Diklór-fenoxi-ecetsav | 0,25 | mg/1 |
| Rsmnóz | 125 | mg/1 | Oí-Naftil-ecetsav | 0,5 | mg/1 |
| Ceiiobióz | 125 | mg/1 | 6-Benzil amino-purin | 0,1 | mg/1 |
| Szorbit | 125 | mg/1 | Szacharóz 20000 | mg/1 | |
| Mimiit | 125 | mg/1 | Glükóz 64500 | mg/1 |
-5192 569 pH (KOH) 5,8, 520 mOs/kg H2O, összes anyagot oldjuk és 1000 ml-re kiegészítjük kvarcon kétszer desztillált vízzel.
Tenyésztési módszer
Az előzőekben megadott táptalajban lévő protoplaszt szuszpenzióból 2,5 ml-t pipettázunk 6 cm átmérőjű műanyag Petri-csészébe és a fentiekben megadott, azonos térfogatú tápközeget - amely 3 % olvasztott agarózt (Agarose-t) „Sea Plaque (Maríné Colloids) tartalmaz — keverünk. Az agarózt tartalmazó táptalaj hőmérséklete semmi esetre sem lehet 40 °C-nál magasabb. A kezelés után a protoplasztok 4 x 104/ml populációsűrűségben
1,5 %-os agaróztartalmú géles táptalajba vannak beágyazva. A protoplasztszuszpenzió megdermedése után a gélből részeket (szektorokat) vágunk ki és 10 cm átmérőjű, steril műanyag edényekbe, amely 30 ml, az előzőekben megadott folyékony tápközegbe visszük át és kb. 40 fordulat/perc mozgású rotációs rázógépben állandó sötétségben, 24 °C-on inkubáljuk, 3—4 napos időközben a folyékony tápközeget azonos összetételű, friss táptalajjal egészítjük ki. 14 napos tenyésztés után a tápközeg ozmotikus értékét — a glükóz ozmotikum fokozatos csökkentésével - 3 hét alatt 250 mOs/kg H2O-ra csökkentjük.
E kezelés során a protoplasztok közel 40 %-a makroszkóposán látható sejtkolóniává fejlődik.
2. példa
A Brassica rapa sejtkultúráinak tenyésztése
Tápközeg:
Nitsch, J. P. és Nitsch, C. (1969), Science 163, 85-87. nyomán módosított:
| KNO3 | 950 | mg/l | m-Inozit 100 | mg/l | |
| NH4NO3 | 720 | mg/l | Nikotinsav | 5 | mg/l |
| MgSO4 ' 7H2O | 185 | mg/l | Piridoxin-HCl | 0,5 | mg/l |
| CaCl2 · 2H2O | 220,5 | mg/l | Tiamin-HCl | 0,5 | mg/l |
| KII2PO4 | 68 | mg/l | Fólsav | 0,5 | mg/l |
| FeCl3 6H2O | 27 | mgll | Biotin | 0,5 | mg/l |
| Na2EDTA | 74,6 | mg/l | Glicin | 2 | mg/l |
| MnS04'1H2O | 17,25 | mg/l | Agár (Difco) 9000 | mg/l | |
| H3BO3 | 10 | mg/l | Szacharóz 20000 | mg/l | |
| Z11SO4 · 7H2O | 10 | mg/l | Kókusztej (Gibco) | 2,5 | mg/l |
| Na2MoO4 · 2H2O 0,25 | mg/l | 2,4-Diklór-fenoxi- | |||
| -e cetsav | 0,25 | mg/l | |||
| C11SO4 · 5H2O | 0,025 mg/l | O-Naftil-ecetsav | |||
| 6-Benzil-amino- | |||||
| -purin | 0,1 | mg/i |
pH (KOII) 5,8, 20 percig 101,325 kPa nyomáson autoklávozzuk.
Tenyésztési módszer
Az 1. példa sejtkolóniáit, amelyek keresztmetszete egy vagy több mm-t is elérte, a fentiekben megadott, agart tartalmazó ta'ptalaj felületére visszük, és 24 °C-on tartós sötétségben inkubáljuk.
Az előzőekben leírt módon a nem fertőzött és a Cauliflower-Mosaic-Virussal fertőzött Brassica rapa növények húszon felüli protoplaszt szériában sejttenyészetté regenerálódnak.
3. példa
A virnsszaporodás kimutatása a DNS sejttenyészet radioaktív jelölt DNS-Caulifiower-Mosaic-Virussal történő hidridizációval
Vizes oldatok DNS-hibridizációhoz
Proteináz K 0,1 mg/ml Proteináz K (Merck 24568): 0,1 tömeg% Nátrium-azid
0,1 tömeg% Nátrium-dodecilszulfát (= SDS)
Alkálifém-oldat: 0,05 mól/lNaOH
1,5 mól/1 NaCl
Semlegessó oldat: 3,0 mól/1 NaCl
0,5 mól/1 trisz(hidroxi-metil)-amino-metán-puffer (= Trisz-HCI-puffer), pH = 7,0
Módszer
a) A 2 példa sejtkolóniáit egyenként 1—1 m! 2-metoxi-etanolban, 5 órán át szobahőmérsékleten inkubáljuk,
b) a 2-metoxÍ-etanolt elővigyázatosan leszivatjuk és a sejtkolóniákat folyékony nitrogénben megfagyasztjuk,
c) a megfagyasztott sejtkolóniákat Eppendorf-csövecskékben porrá homogenizáljuk,
d) a porított anyagot 200—200 μΐ vízben szuszpendáljuk és alaposan összekeverjük,
e) 2 percig Eppendorf centrifugában erőteljesen centrifugáljuk,
f) az átlátszó felső részt használjuk a DNS-hibridizációhoz.
Hibridizálás
g) Az átlátszó rész 50-50 μΐ-ét (1. f) pont) a BRL-dot hibridizációs rendszerbe (a BRL-dothybridisationsSystems, Bethesda Research Laboratories BRL. Nr. 1050 MM) szűrőkamráiba visszük, a szűrőket előzőleg benedvesítjük és gyenge vákuum (vízsugárvákuum) is szükséges,
h) végül 200—200 μΐ vizet adunk hozzá és átszűrjük,
1) a fentiekben leírt proteináz-K-oldatből 150-150 jul-t adunk minden egyes kamrához, az egész rendszert műanyag fóliába csomagoljuk és egy éjszakán át inkubáljuk,
j) a proteináz-oldatot leszivatjuk,a fentiekben megadott alkálifém-oldat 150-150 μΐ-ével pótoljuk, és 15 percig szobahőmérsékleten inkubáljuk,
k) az alkálifém-oldatot leszivatjuk és az előzőekben megadott, semlegessó-oldaí 150-150 μ 1-ével pótoljuk és további 10 percig inkubáljuk,
l) a semlegessó-oldat leszivatása után kétszer 5 percen át mossuk 150-150 μΐ nátrium-klorid/-nátrium-citrátpufferrel ( = SSC: 17,5 g NaCl és 8,8 g Na-citrát/liter H2Ö, a pH-t NaOH-dal 7-re) állítjuk be,
m) az SSC leszivatása után a szűrőket 2 órára 80 °C-ra melegítjük, és
n) ezt követően radioaktív CaMV-DNS-sel hibridizáljuk,
o) a radioaktív jelzett szűrőket filmmel láthatóvá tesszük,
p) a sejttenyészetek extraktumai, amelyek CaMV-t, illetve CaMV-DNS-t tartalmaznak, a szűrőn hibridizálódnak a radioaktív jelzett CaMV-DNS-sel és ezáltal a film megfeketedését idézik elő. A BRL-Hybrid-DotSystem egyes kamráiban lévő szűrők megfeketedése vagy meg nem feketedése alapján fotokémiai kezeléssel leolvashatjuk, hogy melyek azok a vizsgált sejtko-61
192 569 lóniák, amelyek a CaMV-t, illetve a CaMV-DNS-t tartalmazzák.
4. példa
A virusszaporodás kimutatása az egészséges növények sejttenyészet-extraktumával történő reinfekciójával
a) A 2. példa egyes sejtkolóniáit 1-1 ml 2-metoxi-etanolban 5 órán át szobahőmérsékleten inkubáljuk,
b) a 2-metoxi-etanolt óvatosan leszivatjuk és a sejtkolóníákat folyékony nitrogénben megfagyasztjuk,
c) a megfagyasztott sejtkolóniákat Eppendorf-csövecskékben porrá homogenizáljuk,
d) a porított anyagot 200—200 μΐ-vízben szuszpendáljuk, és alaposan összekeverjük, ezt követően
e) 2 percig erősen centrifugáljuk az Eppendorf centrifugában,
f) az átlátszó részt a reinfekcióhoz használjuk fel. Reinfekció
Szigorú sterilitási feltételek között az egészséges Brassica rapa növény levél színét szilicium-karbiddal (dörzspor, papír) megsértjük és a 4. példa f) pontja szerinti átlátszó résszel inokuláljuk. A növényeket 3-4 hétig egyéb vírusfertőzés lehetőségének kizárásával neveljük és ezt követően a fellépő vírustüneteket (mozaiktünet, a levélér sávosodás) megvizsgáljuk. A dörzsporral kezelt kontroli-növényeket az inokulált növényekkel azonos feltételek között neveljük. Az egészséges növényeknek az f) szerinti átlátszó résszel történő bedörzsölése után a vírustünetek fellépése vagy elmaradása bizonyíték a sejttenyészetben a funkcióképes CaMV-részecskék jelenlétére vagy hiányára.
Az előzőekben leírtak alapján beigazolódott, hogy a sejttenyészetek 5 %-ában - amelyek vírusfertó'zött növények protoplasztgaíból fejlődnek - a vírusok nagy tömege képződött.
5. példa
Nem fertőzőképes vírusmutánsok felhasználása sejtklőnok vektoraiként növény szövetben
A Brassica rapa különböző kailuszklónjaiban lévő CaMV-DNS présnedvével az egészséges Brassica rapa növények levélszínét egyenként bedörzsöljük. A növényeket 3-4 hétig egyéb vírusfertőzés lehetőségének kizárásával neveljük és ezután a vhustünetek előfordulását megvizsgáljuk. Ezenkívül a vírus-DNS-t a növényekből izoláljuk.
Ha a kiónok 50 %-a fertőzött és a növények, amelyeket a kiónok présnedvével kezeltünk, a CaMV fertőzés szokásos tüneteit mutatják, akkor e növények vírusDNS-e restrikciós anyagot tartalmaz, amelyek a kezeléshez felhasznált présnedv vírus-DNS-ével azonosak.
Ha a kiónok 30 %-a nem fertőzött, és DNS analízise azt mutatja, hogy a vfrusgenoin deleciókat tartalmaz.
Claims (9)
1. Eljárás vírusgenomok és derivátumaik fenntartására és szaporítására növényi anyagban, amely a vírusgenomoxat már tartalmazza vagy olyan növényi anyagban, amely vírusgenomokat nem tartalmaz és a termesztés előtt a vírusgenomokkal önmagában ismert módon fertőzünk, azzal jellemezve, hogy a vírusgenomokat vagy derivátumaikat tartalmazó izolált protoplasztokat, sejteket vagy szöveteket önmagában ismert táptalajon, amely szükséges alkotórészként makroelemeket, mikroelemeket, vitaminokat, valamely energiaszolgáltató szénforrást, az auxinok és a citokininek osztályába tartozó fitohormonokat, valamint adott esetben gélképző anyagokat tartalmaz, ozmózisos nyomása stabilizált, és amelyben g protoplasztok sűrűsége I/ml és 1 x 106/ml közötti, a pH értéke 5,6 és 6,5 közötti, 7 0 és 42 °C közötti hőmérsékleten tenyésztünk és kívánt esetben a fenti protoplasz’.okból, sejtekből vagy szövetekből kifejlett növényt nevelünk.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a tápközegben a protoplasztsűrűség 2 x 104/ml és 6 x 104/ml közötti.
3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a növényvírusok genomjait vagy azok derivátumait tartalmazó, izolált növényi protoplasztokat, sejteket vagy szöveteket tenyésztünk.
4 Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a protoplasztok, sejtek vagy szövetek növénygenomjába beépülő, genetikai anyaggal rendelkező vírusgenomokat és ezek derivátumait tartalmazó izolált növényi protoplasztokat, sejteket vagy szöveteket tenyésztünk.
5 Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy genetikailag manipulált vírusgenomokat tartalmazó izolált növényi protoplasztokat, sejteket vagy szöveteket lenyésztünk.
6. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy korlátozott patogenitású vírusgenomokat tartalmazó izolált, növényi protoplasztokat, sejteket vagy szöveteket tenyésztünk.
7. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a vírusgenomokat vagy derivátumaikat tartalmazó, izolált növényi protoplasztokat, sejteket vagy szöveteket 24 °C-27 °C közötti hőmérsékleten tenyésztünk.
8. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a vírusgenomokat vagy ezek derivátumait tartalmazó, izolált növényi protoplasztokat, sejteket vagy szöveteket valamely önmagában ismert folyékony tápközegbe viszünk, amelyhez gélképző agarózt adunk és megdermedés után szegmentáljuk, a szegmenseket önmagában ismert tápközegben tenyésztjük.
9. Az 1. igénypont szerinti eljárás természetes körülmények között életképtelen vírusmutánsok fenntartására és szaporítására, azzal jellemezve, hogy a vírusmutánsok vín sgenomjait vagy ezek derivátumait tartalmazó izolált növényi protoplasztokat, sejteket vagy szöveteket valarne'y önmagában ismert tápközegben tenyésztünk.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CH423583 | 1983-08-04 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HUT39773A HUT39773A (en) | 1986-10-29 |
| HU192569B true HU192569B (en) | 1987-06-29 |
Family
ID=4272327
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU842958A HU192569B (en) | 1983-08-04 | 1984-08-03 | Process for conserving and reproducing virusgenomes and derivatives |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0134536B1 (hu) |
| JP (1) | JP2602010B2 (hu) |
| AT (1) | ATE74162T1 (hu) |
| AU (1) | AU583795B2 (hu) |
| BR (1) | BR8403851A (hu) |
| DE (1) | DE3485610D1 (hu) |
| HU (1) | HU192569B (hu) |
| IL (1) | IL72571A (hu) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4552844A (en) * | 1983-06-15 | 1985-11-12 | Stauffer Chemical Company | Plant growth medium |
| EP0132360A3 (en) * | 1983-07-22 | 1986-05-28 | Sandoz Ltd. | Plant growth medium |
| JPS60168381A (ja) * | 1984-02-09 | 1985-08-31 | Koasa Shoji Kk | ノリ葉体のプロトプラストの調製法 |
| JPS61265086A (ja) * | 1985-05-21 | 1986-11-22 | Mitsui Toatsu Chem Inc | プロトプラストの培養法 |
| FR2638607A1 (fr) * | 1988-11-04 | 1990-05-11 | Agronomique Inst Nat Rech | Procede de regeneration et de clonage d'angiospermes, regenerants et clones obtenus par ce procede |
| JP2868543B2 (ja) * | 1989-09-25 | 1999-03-10 | 三菱電機株式会社 | 計算機装置 |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3071031D1 (en) * | 1979-06-27 | 1985-10-03 | Brodelius P | Catalysts for the production and transformation of natural products having their origin in higher plants, process for production of the catalysts, and use thereof |
| US4407956A (en) * | 1981-03-13 | 1983-10-04 | The Regents Of The University Of California | Cloned cauliflower mosaic virus DNA as a plant vehicle |
| CA1192510A (en) * | 1981-05-27 | 1985-08-27 | Lawrence E. Pelcher | Rna plant virus vector or portion thereof, a method of construction thereof, and a method of producing a gene derived product therefrom |
| DD223165A5 (de) * | 1983-04-29 | 1985-06-05 | Ciba Geigy Ag | Verfahren zur erzeugung proliferierender zellverbaende |
| EP0149430A1 (de) * | 1984-01-04 | 1985-07-24 | Ciba-Geigy Ag | Verfahren zur Herstellung chimärer DNS |
| GB2159173B (en) * | 1984-05-11 | 1988-10-12 | Ciba Geigy Ag | Transformation of hereditary material of plants |
-
1984
- 1984-08-01 AT AT84109138T patent/ATE74162T1/de not_active IP Right Cessation
- 1984-08-01 EP EP84109138A patent/EP0134536B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1984-08-01 DE DE8484109138T patent/DE3485610D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1984-08-02 IL IL72571A patent/IL72571A/xx not_active IP Right Cessation
- 1984-08-02 BR BR8403851A patent/BR8403851A/pt not_active Application Discontinuation
- 1984-08-03 AU AU31481/84A patent/AU583795B2/en not_active Ceased
- 1984-08-03 HU HU842958A patent/HU192569B/hu not_active IP Right Cessation
- 1984-08-04 JP JP59164168A patent/JP2602010B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| BR8403851A (pt) | 1985-07-09 |
| EP0134536A2 (de) | 1985-03-20 |
| JP2602010B2 (ja) | 1997-04-23 |
| EP0134536B1 (de) | 1992-03-25 |
| IL72571A0 (en) | 1984-11-30 |
| AU583795B2 (en) | 1989-05-11 |
| AU3148184A (en) | 1985-02-07 |
| DE3485610D1 (de) | 1992-04-30 |
| JPS6054689A (ja) | 1985-03-29 |
| ATE74162T1 (de) | 1992-04-15 |
| IL72571A (en) | 1990-07-12 |
| EP0134536A3 (en) | 1987-10-28 |
| HUT39773A (en) | 1986-10-29 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Endress et al. | Plant cell biotechnology | |
| EP0332581B1 (de) | Regeneration von fertilen Gramineen-Pflanzen aus der Unterfamilie Pooideae ausgehend von Protoplasten | |
| US5008200A (en) | Propagating multiple whole fertile plants from immature leguminous | |
| Dyer et al. | Leaf nucleic acids: II. Metabolism during senescence and the effect of kinetin | |
| EP0469273B1 (de) | Fertile transgene Maispflanzen mit artfremdem Gen sowie Verfahren zu ihrer Herstellung | |
| Meyer | Isolation and culture of tobacco mesophyll protoplasts using a saline medium | |
| Sinha et al. | Plant regeneration from stem-derived callus of the seed legume Lathyrus sativus L. | |
| Goh et al. | Micropropagation of the monopodial orchid hybrid Aranda ‘Deborah’using inflorescence explants | |
| KR890004024B1 (ko) | 원형질체로 부터 벼 식물체의 재생방법 | |
| HU192569B (en) | Process for conserving and reproducing virusgenomes and derivatives | |
| Berliner | Protoplasts of eukaryotic algae | |
| HADDON et al. | The Effect of Growth Conditions and Origin of Tissue 5 Phaseolus vulgaris L. | |
| Keck et al. | Nuclear control of enzyme synthesis in Acetabularia | |
| CS244812B2 (en) | Production method of propiferating plant cell agglomerates | |
| EP0385296B1 (en) | Method of producing hybrid allium plant | |
| Cvetić et al. | In vitro culture and apogamy: Alternative pathway in the life cycle of the moss Amblystegium serpens (Amblystegiaceae) | |
| US5215903A (en) | Process for the maintenance and proliferation of defective non-infectious virus genomes in proliferating plant materials | |
| JP2833795B2 (ja) | ナデシコ属植物のプロトプラスト調製方法及び植物体再生方法 | |
| Geerts et al. | Development of an in vitro pod culture technique for young pods of Phaseolus vulgaris L. | |
| US5212076A (en) | Production of quercetin glucuronide | |
| Sita et al. | Preliminary studies on isolation and culture of protoplasts from sandalwood (Santalum album) | |
| Ling et al. | Isolation and culture of daylily mesophyll protoplasts | |
| Thanh-Tuyen | Coconut (Cocos nucifera L.): anther culture | |
| Binding et al. | Protoplast regeneration | |
| Leng et al. | Effect of reduced N 6-Benzyladenine, explant type, expiant orientation, culture temperature and culture vessel type on regeneration of adventitious shoot and in vitro plantlets of Spilanthes acmella |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| HU90 | Patent valid on 900628 | ||
| HPC4 | Succession in title of patentee |
Owner name: NOVARTIS AG, CH |
|
| HMM4 | Cancellation of final prot. due to non-payment of fee |