JPS6054689A - 欠失した非感染性植物ウイルスゲノムまたはｄｎａの維持及び増殖のための方法及び再生された植物細胞，植物カルスまたは植物組織 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は植物材料を増殖するときに、ウィルスゲノム及
びそれらの派生物を維持及び増殖するための方法に関す
るものである。

新規なまたは改良された性質を有する植物材料は、植物
遺伝性材料の中に新規な遺伝の情報を入れたとき、仲介
物として遺伝上操作されたウィルスを使用することによ
って生産できる。

世界人口の急激な増加により、有用な植物の遺伝上の改
良は生物学研究の主要な焦点である。

一方では、食料、エネルギー及び原材料の代替再生可能
源に対する研究がある。例えば、新しい植物種、とくに
病原菌（例えば植物病原昆虫、真菌、細菌、ビールスな
ど）、環境の影響または位置の条件（例えば熱暑、寒冷
、風、土壌条件、湿気、乾燥など）に対する抵抗が増カ
ルたような有用な性質を有するまたは葉１種子、塊茎、
根、柄などでの保存または貯蔵物質の形成が増加したハ
イブリッド（ｈｙｂｒｉｄ　１種である、他方、有用な
バイオマス（ｂｉｏｍａｓｓ　）　Ｋ対す必要性の増大
に加えて１Ｍ薬的に許容しつる植物起源の有効成分及び
その誘導体、例えばアルカロイド、ステロイドなどに対
しての必要性も増加している。そして天然原料からの収
量が低いため、それらは代替方法たとえば遺伝子操作さ
れた植物種からの抽出にエリしだいに入手可能になって
きている。

したがって、多数の植物種を選択的に操作することの実
務上の可能性に対する関心が増している。

この目的を達成するための１つの手段は１分離された植
物細胞に対する異種遺伝子の転移、遺伝材料の複製及び
表現（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　］、並びに最初の細胞か
ら細胞分裂により形成された全ての娘細胞中の生殖及び
維持である。このような娘細胞は単細胞、組織培養物ま
たは完全な植物の形態で存在してもよい。

分裂する植物細胞はウィルスの浸潤を妨げそしてウィル
スの生育性及び増加能力を部分的にまたは完全に抑制す
る傾向を有する。

例えば、化キャベツモザイクウィルス（ＣａＭＶ　）は
植物の分化された細胞中で増加し、そして全ての他の分
化された細胞に感染することができるが、生長の中枢ま
たは分裂組織例えば分裂する細胞は感染されないことは
公知である。従ってウィルスを含まない植物は分裂組織
培養物を通じてウィルスに感染された植物から再生され
ることができる。

従うて新しい遺伝情報のための仲介物としてウィルスを
使用すると、そのウィルスが増殖する植物材料を浸潤し
ないかまたはその中で死んでしまうであろうから、遺伝
的に変換された植物材料に導かれないであろうし％また
花キャベソモＩＪ′イクウィルスを通じて増殖する植物
細胞の中に入れた遺伝材料は植物細胞の遺伝的材料の中
に吸収されないかまたＶｉ複製されないであろうことが
期待される。

しかし、仲介物としてウィルスを使用して遺伝的植物材
ｙＰ＋を変えるため、及び最初の植物材料の遺伝上同一
の子孫を生産するためには、自己複製するため及び新し
い寄生細胞を浸潤するための能力を失わせることなくウ
ィルスを培養することが必要である。

驚くべきことに１本発明者らは植物材料を分裂即ち増殖
する際にウィルスゲノムオたはそれらの派生物を培養す
ること、及びウィルスゲノムまたはそれらの派生物を植
物ゲノムの中に入れることが可能であることをここに見
い出したものである。

従って１本発明はウィルスゲノムまたはそれらの派生物
を含有する分離された植物原形質体、細胞または組織を
適当な培地で培養することよりなる。植物材料を増殖す
る際のウィルスゲノムまたはそれらの派生物の維持及び
増殖のための方法に関するものである。本発明方法はま
た完全な植物を培養及び再生することを包含する。

そのようにして得られるある種の植物は別のウィルスの
感染に対して耐性がある（抵抗性交叉）。

本発明の範囲内で、通常の自然条件下では生存が不可能
で、そして高度の再現性をもち、挿入した遺伝情報に関
して実質的に制限をもたないので、ウィルスまたはそれ
らのゲノムを含有する植物が疾病の症状を示さないよう
な、全く感染性のないウィルス（欠陥ウィルス）を使用
することもできる。従って、欠陥ウィルス（ｄｅｆｅｃ
ｔ　１ｖｅｖｉｖｕｓｅｓ　）は遺伝情報のための仲介
物として特に有利に使用でをる。さらに、欠陥ウィルス
またはそれらのゲノムを含有する原形質体、細胞または
組織から、植物病原性ウィルスに耐性を有する完全な植
物を再生することができる。

感染されたカーＩＩ　（ｃａｌｌｉ　）　の細胞中のウ
ィルス性ＤＮＡの記録密度は非常に大きく、大部分は制
限がないようである。ウィルス性Ｔ）　Ｎ　Ａはカブジ
ッドによシ包み込まれていない遊離の形態でここに存在
する。

本発明の範囲内で、下記定義を適用する。

ウィルスゲノム： 最初の］’）ＮＡ 最初のＲＮＡ １つの複製 ＤＮＡ の形態の１つのウィルスの遺伝情報 ウィルスゲノムの派生物： 欠失 突然変異体 新しい組み合せ 別の遺伝材料との組み合せ 原形質体： 細胞培養物または完全な植物に再生するための効力を有
する。細胞壁のない分離された植物細胞 細胞培養物： 禾ケ化状態の細胞の増殖する塊。

本発明方法のための適当な最初の植物材料は特に分離さ
れた原形質体、好ましくは農芸的に培養された植物の原
形質体である。この意味において適当な培養植物は特に
ホモノ科、ナス科、キク・科及びジュウジパナ科並びに
マメ目の植物である。

前記の群の具体例は例えばホモノ科：小麦、ライ麦、大
麦、オート麦、稲、とうもろこし。

モロコシ及びさとうきび；−ナス科：じゃがいも、トマ
ト及びタバコ；キク科：ひまわり、レタス（チシャ）、
工ンデビイ（ｅｎｄｉｖｙ　；シコリウムエ／ディビア
（Ｃｉｃｈｏｒｉｕｍ　ｅｎｄｉｖｉａ　）　）及びカ
モミレ（カミツレ）；ジェウジパナ科二種々のキャベツ
及びビートの種々のもの並びに油及び薬味植物；及びマ
メ目；大豆、ハウチヮマメ、ルセルネ（１ｕｃｅｒｎｅ
ｓ　）、えんどう豆、豆及び落花生である。

例えばアブラナ、かぶ、黒からしな、白からしな、並び
にキャベツ及びビートの種々のものからなるアブラナ属
の中では、特にブラシカラバ（Ｂｒａｓｓｉｃａ　ｒａ
ｐａ　）　、例えばブラシカラノ：シーブイ　ジャスト
　ライト（Ｂｒａｓｓｉｃａ　ｒａｐａｅＶ　Ｊｕｓｔ
　Ｒｉｇｈｔ　）が特に選んで記載すべきものである。

本発明方法の好ましい具体例は植物ウィルスのゲノムま
たはそれらの派生物を含有する分離された植物原形質体
、細胞または組織を培養す、ることよりなる。

本発明方法の別の好ましい具体例によると、分離された
植物原形質体、細胞または組織はウィルスゲノムまたは
それらの派生物を含有し、そのウィルスゲノムまたはそ
れらの派生物は該原形質体、細胞または組織の植物ゲノ
ム中に入れられた遺伝材料を含有している。そのウィル
スは特にＤＮＡ　ウィルス、好ましくはカウリモウィル
ス（ｃａｕｌｉｍｏｖｉｒｕｓｅ　）　、最も好ましく
は花キャベツモザイクウィルスである。

注目に値いするウィルスゲノムは原始のウィルス性ＤＮ
Ａ及びウィルス性ＲＮＡの１’）ＮＡ複製である。ウィ
ルスゲノムは遺伝操作することができる。例えば、ウィ
ルスゲノムはそれらの病原性に限定されることができ、
葦たけ入れられた異質の遺伝材料を含有することもでき
る。

植物由来の異種の遺伝材料を挿入されたウィルスゲノム
を含有する植物体原形質、細胞及び組織、好ましくはウ
ィルスゲノムを含有する植物原形質、細胞または組織の
ものとは異なるゲノムを含む植物材料、即ち遺伝的に異
質の植物力Ｓ遺伝材料の受容体及び供給体として働いて
いる、分離された植物体原形質、細胞及び組織を培養す
るのが一般的に便利である。

入れられた異質の遺伝材料のための適当な担体は特にｒ
ｌＮＡウィルス、好ましくはカラ１１モウ、Ｉ　＃　ス
（ｃａｕｌｉｍｏｖｉｒｕｓｅａ　）、　そしてそれら
の中で最も好ましくは花キャベツモザイクウィルスであ
る。

本発明方法の特に好ましい具体例は、ゲノムがブラシカ
　ラバ（Ｂｒａｓｓｉｃａ　ｒａｐａ　）の原形質体。

細胞または組織のゲノムとは異なる植物体の異種遺伝材
料を挿入した花キャベツモザイクウィルスのゲノムを含
有するブラシカ　ラバ（Ｂｒａｓｓｉｃａ　ｒａｐａ　
：例えばＢｒａｓｓｊｃａ　ｒａｐａ　ＣＶＪｕｓｔ　
Ｒｉｇｈｔ　）の分離された植物原形質体、細胞または
組織を培養することよりなる。

分離された原形質体、細胞または組織の培養は公知方法
または公知方法に類似な方法により行なうことができる
。

分離される細胞及び組織のための適当な出発材料を構成
する分離された植物原形質体は植物の任意の部分、例え
ｄ葉、茎、花、根、花粉または種子から得ることができ
る。葉の原形質体を使用するのが好ましい。分離された
原形質体はまた細胞培養物から得ることもできる。原形
質体を分離する方法は例えばガムボルグ・オー・エルと
ベラター・エル・アール著フラントティシュ　カルチャ
ー　メノドー１９７５年・１１ないし２１頁（Ｇａｍｂ
ｏｒｇ、　０．Ｌ、ａｎｄ　Ｗｅｔｔｅｒ、　Ｌ、Ｒ。

Ｐｌａｎｔ　Ｔｉ５ｓｕｅ　（’ｕｌＬｕｒｅ　Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ、１９７５　、　１１−２１〕に見い出すこと
ができる。

植物材料の生産及び培養は下記の詳細に従って行なうこ
とが便利であるが、これにエフ本発明がいかなる限定を
されるものでもない。

植物器官は−もし出発材料がすでに殺菌した細ｌＩ！培
養物から成るのでないならば−例えばエタノール、Ｈｇ
Ｃ／　、　Ｃａ　（ＯＣ／　）　！または市販の漂白剤
により処理することによって殺菌し、次に殺菌した水の
中で注意深く洗わなければならない。全てのその後の操
作は完全に無菌の条件下にｆｆなわなければならない。

殺菌は使用する道具及び溶液に対しても必要である。

組織果合体の細胞壁の破壊は酵素によ抄、例えば微生物
接養ｆ液として市販されており、そして濃度範囲０．０
０１ないし５９６で使用されるセルラーゼ、ヘミセルラ
ーゼまたはペクチナーゼを使用することによって行なう
１本明細書において％特に言及しない場合は、／（−セ
ントは重量による。）。

分離及びその後の培養の間に、植物細胞の膨圧圧力は分
離培地及び培養培地のより高い浸透圧により等しくされ
なければならない。これは［ｔばマンニトール、ノルビ
トール、スクロース、グルコース％ＣａＣ’ｌ、または
他の中性塩イオンのような浸透活性物質を単独で、また
はこれら相互及び／または単一の培地と組み合わせて使
用することによって行なわれる。分離培地及び培養培地
の浸透圧は２００ないし１０００　ｍｕｓ／ｋｆｌ−１
２０の範囲が好都合である（Ｏ８＝重量モル濃度＝浸透
活性粒子のモル／溶媒の〜）。

酵素混合物は通常ｐＨ５，２ないし８０の範囲、好まし
くはｐＨ５，４に調節する。

便宜的に細かい部分に切断された組織（葉を使用すると
きは１表皮を除去することもできる。）の培養は一般的
に温度範囲５＃ないし４０℃１通常２４℃で行なう。培
養時間は酵素の濃度、培養温度１組織のタイプ及び組織
の分化の状態に依存する。培養時間は通常２０分ないし
数日である。

培養後、原形質体は未消化の組織を除去するために培養
された材料をメッシ二サイズ２５ないし２８０μｍのふ
るいをとおして分離して、そして遠心分離することによ
り濃縮される。原形質体が沈漬するかまたは浮子（ｆｌ
ｏａｔ　）　となるかはそれら自体の浮揚性比重、及び
培養及び洗浄溶液の密度による。その沈殿するかまたは
浮く原形質体は、浸透的に安定化された洗浄培養媒体Ｃ
例えば糖アルコール、糖または中性塩の溶液単独ま、た
け溶液相互及び／または培地との組み合せ；　ｐｌｉ範
囲５，４ないし６５）の中でそれらを懸濁及び遠心分離
することによって繰り返して洗い、引き続き培地中に取
９出す。その後の培養における重要な因子は原形質体の
個体群密度、例えば培地のミリリットル当りの原形質体
の故である。その個体群留置は有利には１ないしＩ　Ｘ
　１０’／　ｍｅの範囲であり、最適条件範囲は２Ｘ１
０’／Ｍｌないし６　ｘ　１０’／　ｍｅでるる。

培養の方法は容量範囲１μｌないし２００μｌの液滴ま
たは懸濁する液滴によって、ベトリ皿中に薄い層として
液体培地中で培養することから凝固培地（寒天、アガロ
ース）中、または凝固培地と液体培地の組み合せ中で培
養することまで変化することができる。培養輻ベトリ皿
。

？Ａ／チチトレ　プレート（ｍｕｌｔｉｔｉｔｒｅ　ｐ
ｌａｔｅｓ　）、コ／テナー、三角フラスコ、微小毛％
’（ｍｉｃｒｏ−ｃａｐｉ　Ｉｌａ？ｉｅｓ　）または
被覆されたまたけ被覆されていないプラスチ・ツクまた
はガラスであってもよい組織培養フラスコ中で行なうこ
とができる。

培養は通常温度範囲７＠ないし４２℃、好ましくは２４
′″ないし２７℃の範囲で行なうことができる。温度は
一定に保つことも引き続いて変化させることもできる。

培養している間の光の条件は常に暗い状態がら５００な
いし５０００Ｌｕｘの範囲で常に明るい状態及び明／暗
期間を交互にする状態まで変化させてもよい。明／暗を
交互に連続するのが好ましい。

個（々の成分蓉たは成分の群が異なっているＩ広い範囲
の培地がすでに入手でき盃。しかし、全ての培地の組成
は下記の原則に従っている：それらは約１０岬／ｌない
し数百■／ｌの濃度範囲の無機イオン群（いわゆる巨大
要素、例えば硝酸塩、燐酸塩、硫酸塩、カリウム、マグ
ネシウム、鉄）５Ｍ太限で数ｑ／ｌの別の゛無機イオン
群（いわゆる微量要素１例えばコノ（シト、亜鉛、銅、
マグネシウム）、及びいくつかのビタミン（例えばイノ
シトール、ｉ＃酸、チアミ／）５ヌクロースオたはグル
コースのような炭素及びエネルギーの源、及び００１な
いし１ｏｔｑ／ｌの濃度範囲のオウキシ７類及びシトキ
ニン類〃１ら得られる天然または合成植物ホル・モノの
形態の生長調節剤を含有する。培地はさらに糖アルコー
ル（例えばマンニトール）または糖（例えばグルコース
）または塩イオン（例えばＣａＣ１＊　）を加えること
によって浸透的に安定イヒし、ｐＨ（直５．６ないし６
５に潤製する。

一般に使用される培地のさらに詳しい記載は例えばコブ
リッツ・）・−著、メト−デイシュアスヘクテテル　ツ
エルー　ラント　ゲペーベ　チュヒトンダ　バイ　グラ
ミニエ／　ランター　ペグ／プラー　ベリュックズイ・
Ｉヒティグング　デル　ゲトライデ、クルトールプラン
ｙ　、　（Ｍｅｔｈｏｄｊｓｃｈ　Ａｓｐｅｋｔｅ　ｄ
ｅｒ　Ｚｅｌｌ　−ｕｎｃｌＧｃｗｅｂｅｚＭｃｈｔｕ
ｎｇ　ｂｅｉ　Ｇｒａｍｉｎｅｅｎ　ｕｎｔｅｒ　ｂｅ
ｓｏｎｄｅｒｅｒＢｅｒｉｉｃｋｓｉｃｈｔｆｇｕｎｇ
　ｄｅｒ　Ｇｅｔｒｅｉｄｅ　、　Ｋｕｌｔｕｒｐｆｌ
ａｎｚｅ　）ＸＸｉＩ　、　１９７４　、９３ナイシ１
５７　頁に見イ出ｆことができる。

培養（ｃｕｌｔｕｒｉｎｇ　ａｎｄ　１ｎｃｕｂａｔｉ
ｏｎ　１条件例えば培地の温度及び周囲の温度、湿度、
光の強さ及びその照射時間、培地の再補給若しくは再生
またはそれらの組成の変化は例えば原形質体の性質、ウ
ィルスゲノムまたはそれらの派生物のタイプ、植物材料
及び／またはウィルスゲノムの生長及び分裂の速度、残
層の童及び他の要因のような個々の条件に適合させるこ
とができる。

分離された植物原形質体、細胞または組織の培養は適当
な培地１通常は凝固培地中で行なわれる。

アガロースをゲル化剤として使用すると、著しく上首尾
である。栄養素培養基中のアガロース含量は通常０４な
いし４俤である。

アガロースは寒天の構成要素の１つである。

市販品として利用できる寒天は主に中性アガロースと多
数の結合された側基を有讐るイオン性アガロペクチンの
混合物工す構成されている。

市販のアガロースは寒天から慣用の商業生産的方法によ
り得られる。通常側鎖の数はそのままであり１例えばゲ
ル生成、融点及びゲル化温度のような物理化学的性質を
決定する。

低温で溶融及びゲル化するアガロースは例えば引き続い
てアガロース分子中にヒドロキシエチル基を導入するこ
とによって得ることができる。この方法で改質されたア
ガロースは本明細書を通じてＬＴＭ（低融）アガロース
と称する。

適当なアガロース製剤の例は下記のタイプでアル：シー
プ５　り（−８ｅａ　Ｐｌａｑｕｅ　）　ＬＭ’ｌ’　
、　ＬＭＰ、タイプＶ［ｌ　、ＨＧＴ　、ＨＧＴＰ、Ｌ
Ｅ標準ＬＭ’ｒｔたけシープレプ（８ｅａ　−Ｐｒｅｐ
）。

ウィルスゲノムまたはそれらの派生物を含有する原形質
体、細胞または組織は種々の方法で培地中に入れること
ができる。例えば、その操作はウィルスゲノムまたはそ
れらの派生物を含有する原形質体、細胞または組織を液
体の、すでにゲル化剤を含有し、冷やすと凝固する暖か
い培地の中に入れることであってもよい。しかし、ゲル
化剤の入っていない液体培地中のウィルスゲノムまたは
それらの派生物を含有する原形質体、細胞または組織の
懸濁液ＶＣゲル化剤の入った液体培地の別の部分を加え
、そして完全に混合した後その培地を凝固するのが有利
である。

ウィルスゲノムまたはそれらの派生物を含有する原形質
体、細胞または組織を含有する凝固された培地を液体培
地で取シ囲むことによって特に良好な結果が得られる。

従って１例えば凝固された培地を、深皿及びプレート例
えばバクテリアまたは酵母菌ｍ胞を培養するためにも使
用されるベトリ皿に取った後、その培地が凝固した後に
９め１に切断することができ、そしてその０１ハは液体
培地、奸才しくは栄養素溶液に移される。液体培地また
は栄養素溶液に対する９乃１の容量割合は有利には１：
２ｏないし１　：　１００の範囲である。例えばジャイ
レートリー振ＷＬ機で振盪することにエシユ片、を含有
する液体培地をかき混ぜるのが賢明である。凝固された
培地の分割は通常培地が固まってすぐかまたは固まって
から４週間内、好ましくは培地が固まってから３ないし
８日の間に行なう。

ニルは大きさ及び形状において均等にするのが好ましい
。それらは不規則または好ましくは規則的な構造例えば
円錐体、立方体、角柱、平円盤及び球であってもよい。

ｔＪ）ｉ＋は一般に平均直径または断面径２ないし１０
０簡、好ましくは２ないし１０ｍを有する。

本発明方法の範囲内で、分離される前にウィルス感染さ
れた原形質体、細胞及び組織または分離の前にまだウィ
ルスを含まず後に人工的にウィルスで感染させた原形質
体、細胞及び組織の双方を使用することができる。

切体またはそれらの派生物を含有する分離された植物原
形質体、細胞または組織を培養することによるウィルス
突然変異体の維持及び増殖をも包含する。ウィルスの突
然変異体は通常の自然条件下では生存できないもの、特
に植物ウィルスの突然変異体であってもよい。

原形質体、細胞または組織は原始のウィルス性ＤＮＡま
たは通常の自然条件下で生存できないようなウィルスの
突然変異体のＲＮＡのＤＮＡ複製を含有することができ
、またはそのようなりＮＡウィルスの叩当する突然変異
体を含有してもよく、特にこれらのＤＮＡウィルスの代
表的なものはカルリモウィルス（Ｏａｕｌｌｍｏｖｉｒ
ｕｓｅｍ）　％に化キャベツモザイクウィルスである。

本発明の範囲内には、もしウィルスゲノムまたはそれら
の派生物を含有する植物細胞、植物組織または完全な植
物がこれらのウィルスゲノムまたはそれらの派生物を含
有する分離された植物原形質体、特に培養された植物の
原形質体から生産されたならば、それらを再生すること
も含まれる。

この関係において適当な培養される植物は特にホモノ科
、ナス科、キク科及びジュウジバナ科並びにマメ目の植
物である。特に記載すべきジュウジバナ科の植物はアブ
ラナ属のものであり、この関係においては好ましくはブ
ラシカラバ（Ｂｒａｓｓｌｃａ　ｒａｐａ）、例えばＢ
ｒａｓｓｌｃａ　ｒａｐａＯＶ　Ｊｕｓｔ　Ｒｉｇｈｔ
）である。

ウィルスは特に植物ウィルスである。

再生された植物細胞、植物組織または完全な植物は例え
ば原始のウィルス性ＤＮＡ、ウィルス性ＲＮＡのＤＮＡ
複製またはＤＮＡウィルス、特にカルリモウィルス（Ｏ
ａｕｌｌｍｏｖｉｒｕｓｅｍ　）及び、最も特に化キャ
ベツモザイクウィルスを含むことができる。化キャベツ
モザイクウィルスを含有するブラシカ　ラバ（Ｂｒａｓ
ｓｉｃａ　ｒａｐａ）の再生された植物細胞または組織
は特に記載されるべきである。

さらに、再生された植物細胞または組織は植物細胞また
は組織のゲノムの中に入れられた遺伝材料を運ぶウィル
スゲノムまたはそれらの派生物を含有することができ；
またそれらは遺伝操作されたウィルスゲノムまたはそれ
らの派生物例えばそれらの病原性に限定されるかまたは
好ましくは、植物のゲノムがウィルスゲノムまたはその
ゲノムがそれらの派生物を含有する植物細胞または組織
のゲノムと異なる植物に由来する入れられた異質の遺伝
材料を含有するもの、を含有することができる。従って
再生された植物細胞または組織は例えば入れられた異質
の遺伝材料、特に植物のゲノムが花キャベツモザイクウ
ィルスを含有する植物細胞または組織のゲノムと異なる
植物からの材料と一緒に花キャベツモザイクウィルスの
ゲノムを含有することができる。

花キャベツモザイクウィルスを含有する植物は、本発明
においては、特にブラシカ　ラバ（Ｂｒａｓｓｉｃａ　
ｒａｐａ）、例えばブラシカ　ラバ　ジーブイ　ジャス
ト　ライト（Ｂｒａｓｓｉｃａ　ｒａｐａ　０ＶＪｕｓ
ｔ　Ｒｉｇｈｔ　）である。

本発明はまたウィルスゲノムまたはそれらの派生物を含
み、培養によるウィルスゲノムまたは派生物（雌雄生殖
または植物生殖により生産されてよいそれらの子孫を含
む。）を含有する原形質体から生産された再生された植
物にも関するものである。

別の見方をすれば、本発明はウィルスゲノムまたはそれ
らの派生物を含む植物細胞または組織を該ウィルスゲノ
ムまたはそれらの派生物を含有する分離された植物原形
質体から生産及び培養するためのアガロースの使用方法
に関するものである。

本発明はさらにウィルス性のガラス器具内で生産された
突然変異体の生殖にも関するものである。そのような突
然変異体は分離された植物原形質体を遺伝操作されたウ
ィルスまたはウィルスゲノムで感染し、その感染された
原形質体を適当な培地、好ましくはアガロース−凝固さ
れた培地中で、植物を形成するために十分分化するまで
培養することによって増殖する。

本発明の別の目的は遺伝操作されたウィルスまたはウィ
ルスゲノムを使用して上記のように増殖されたウィルス
性のガラス器具内で生産された突然変異体の原形質体変
態系における使用方法に関するものである。

原形質体から形成された細胞培養物中のウィルス生産は
例えば２つの異なる方法で検出できる： ａ）細胞培養ＤＮＡを放射性の著しいウィルス性ＤＮＡ
と交雑することによる、または ｂ）健康な植物を細胞培養抽出物で再感染することによ
る。

原形質体の分離力゛法及びウィルス生産の検出方法は公
知である。しかし、個々の条件に従って方法を変えるの
が賢明である。

分離された原形質体の生産を下記に、より詳細に記載す
る。次の実施例は原形質体及び細胞の増殖並びにウィル
ス生産の検出に関するものである。

ブラシカ　ラバ植物（かぶ）を温室内で栽培し、５−葉
期にウィルス学で慣用される方法の１つ（ウィルス懸濁
液を、カーボランダム粉末で機械的に傷をつけることに
よって、葉の表面にすりつける。）により花キャベツモ
ザイクウィルスで感染する。人工的に感染された植物を
下記条件下にさらに培養するために生長室に移す：明／
暗で１２７１２時間周期、光度５０００　Ｌｕｘ〔シル
ハニア（ＳＩＬＶＡＮＩＡ）昼光螢光管〕、昼の温度２
７°０及び夜の温度２０°０１一定の相対湿度７０優、
土／砂／芝生混合物の入った鈴生で生長する植物を植物
肥料濃厚物、例えばグＱ　−ンジツ）　（Ｇｒｅｅｎｚ
ｌｔ■）肥料溶液で１日２回の処理。原形質体は下記の
ように人工的に感染された植物の１２α長の葉から慣例
的に分離される：その葉は水道水で洗い、α５係の次亜
塩素酸カルシウム溶液で３０分間殺菌し、次に殺菌した
作業台で無菌条件下に殺菌した脱イオン水中で５回注意
深く洗う。その葉面を２−幅のストリップに分割し、そ
れを重ねて非常に鋭いカミンリの刃で１ｌ幅の横断面に
切断する。その葉の横断したものを下記組成の浸透的に
安定な酵素溶液に移し、減圧−浸潤する：１優セルロー
ルオノズ力（ＯＮＯ２［ＪＫＡ）Ｒ１０＋０．１４ヘク
チナーセマケロジメ（ＭＡＯＥ１’ＬＯＺＹＭＥ）　Ｒ
Ｉ　Ｏ（双方ともヤクルト製薬株式会社（Ｙａｋｕｌｔ
　Ｐｈａ’ｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＩｎｄｕｓｔｒｙ　
Ｏｏ、Ｌｔｄ、）日本、西宮、シンギカン町８−２１）
をマンニトール１１Ｌ４５モル（３容量）と０ａ０４０
．１７モル（１容量）の混合物に溶解しα１モルのＫＯ
ＨでＰＨを５，４に調節する。酵素溶液の浸透圧は約５
１０ｍＯｓ／ＩＩＨ，０である。組織のほとんどはその
ｔ７１月を１２°Ｃで１６時間培養することによって、
分離された原形質体に変える。その原形質体懸濁液は１
００μｍの鋼製の篩を通してｐ過して残骸を取り除き、
殺菌した遠心分離管に移し、そして７５０ｇで１０分間
沈殿させる。その沈殿された原形質体を殺菌したオスモ
テイキューム（ｏｓｍｏｔｉｃｕｍ　；　ａｌ　７５モ
ルの０ａＯｔｌ　＋［ｌＬｓ　ＭＦｉ８緩衝剤（Ｍｇ２
は２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸；シグマＮ
Ｏ，Ｍ−８２５０１ｐ　Ｈｓ、７　：　５１０１１１ｏ
１／ｋ　Ｈｘ　Ｏに調製されている。〕に再懸濁し、約
５００２で沈降すること及び、オスモティキューム（ｏ
ｓｍｏＮｉｃｕｍ）中に再懸濁することにより５回洗う
。次にその原形質体を実施例１に記載する培地中に再懸
濁し、個体群密度Ｂ　Ｘ　１０　’／ｍｌに調整する。

実施例１ ブラシカ　ラバ（Ｂｒａｓｓｉｃａ　ｒａｐａ）の原形
質体の培養 培地： カオ・ケー・エヌ（Ｋａｏ、に、Ｎ、　）著（１９７７
）、　モレツク１ゲンゆゲネット（Ｍｏｌｅｃ、ｇｅｎ
、Ｇｅｎｅｔ、　）１５０．２２５ないし２３０頁及び
コブリッツ・ケーとコブリッツ・ディー　（Ｋｏｂ目ｔ
ｚ、に、ａｎｄ　Ｋｏｂ目ｔｚ。

Ｄ、）著、　（１９８２）、プラント　セル　レポート
（Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｐｏｒｔｓ）　１　、１
４７ないし１５０頁による改良培地。

目 ’４．．．．．．．．．．．　、 日 Ｐ　Ｈ（ＫＯＨ）　５．８　；　５２０　ｍＯＢ／Ｋｓ
　Ｈ２Ｏ＊全て溶解され、そして二酸化珪素処理による
２回蒸留−蒸留水（ｑｕａｒｔｚ　ｄｏｕｂｌｅ−ｄｉ
ｓｔｉｌｌ＠ｄｗａｔｅｒ　）にて１０１００Ｏに調製
される。

培養法 上記培地中の原形質体の懸濁液２．５ｒｎｔ部を直径６
αのプラスチックペトリ皿の中にピペットで入れ、さら
に製置５憾の溶けたシー　ブレーク　アガロース（Ｓｅ
ａ　Ｐｌａｑｕｅ　ａｇａｒｏａｅ　、海水コロイド）
を含有する同量の培地と混合する。アガロース（ａｇａ
ｒｏｓｅ　）を含有する培地の温度は混合の前に４０°
Ｃを決して越えてはいけない。

この処理の後に、原形質体はアガロース（ａｇａｒｏｓ
ｅ　）　１．５１を含有する固形培地中に個体群密度４
Ｘ１０／ｒｎＬで存在する。原形質体層濁液を凝固した
後、ゲル層を分け、直径１０ｃＭの熱面のプラスチック
容器中の上記液体培地３０ｄに移しそして約４　Ｏｒｐ
ｍ及び２４’Ｏで連続的暗所にて旋回攪拌器で培養する
。３日ないし４日の一定期間をおいて、その液体培地を
同一の組成の新鮮な培地と交換する。１４日間培養した
のち、培地の浸透圧を、３週間以上培地中のグルコース
の水準を順次減少させることにより２５０ｍ０．ＡＩ（
，０にまで下げる。この処理によって、原形質体の４０
係までが肉眼で見ることのできる細胞コロ；、−になっ
た。

実施例２ ブラシカ　ラバ（Ｂｒａｓｓｉｃａ　ｒａｐａ　）の細
胞コロニーの培養 迦堕Ｌ： ニトスク・ジエー・ビーとニトスク・シー（Ｎ１ｔｓｃ
ｈ、Ｊ、Ｐ、　ａｎｄ　Ｎ１ｔｓｃｈ、０　）著（１９
６９）、サイエンス（８ｃｉｅｎｃｅ　）　１／１５，
８５−７による改良培地 へ 厘 ＰＨ（ＫＯｆ（）５．８ １気圧で２０分間圧熱滅菌する。

培養法： 直径１ｕ以上になった実施例１で得た細胞コロニーを上
記の固定寒天培地の表面に移植し、さらに常時暗くして
２４°０で培養する。

２０回以上の実験において、全く感染されていないブラ
シカ　ラバ（Ｂｒａｓｓｉｃａ　ｒａｐａ　）Ｍ物及び
花キャベツモザイクウィルスで感染されたブラシカ　ラ
バ植物から得た原形質体を、上記の方法で細胞培養に再
生した。

実施例３： 細胞培養ＤＮＡを放射性標識した花キャベツモザイクウ
ィルスＤＮＡと交雑することによるウィルス増殖の検出
。

ＤＮＡ９．９のための水溶液： プロティナーゼＫ　（Ｍｅｒｃｋ　２４５６Ｂ　）　：
プロティナーゼＫＱ、１悟ｆ／常ｔ ０．１係アジドナトリウム ０．１１硫酸ドデシルナトリウム（＝ＳＤＳ）アルカリ
溶液： ０．５　ＭＮａＯＨ １、５ＭＮａＯｔ 中性塩溶液二 ＭＮａＯＬ ０、５　Ｍ　トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン
緩衝剤（＝トリス−Ｈｏｔ−緩衝剤）。

Ｐ　Ｈ７，０ 方法 ａ）実施例２の個々の細胞コロニーを各々２−メトキシ
エタノール１愼を中で室温で５時間培養する； ｂ）　２−メトキシエタノールを注意深く吸引除去し、
細胞コロニーを液体窒素中で凍らせる：Ｃ）　凍うせた
細胞コロニーをエツペンドルフ管中で均質に粉末化する
； ｄ）その粉末材料を水２００μを中に懸濁して完全に混
合する； ｅ）その試料をエツペンドルフ遠心分離機中で２分間遠
心分離する； ｆ）その澄んだ上澄をＤＮＡ交雑のために使用する。

交雑： ｇ）上澄５０μを部〔参照、上記ｆ））をＢＲＬ点交雑
システム（ＢＲＬ　ｄｏｔ　ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏ
ｎ　：Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｉｅｓ　ＢＲＬ　Ｎｏ。

１０５１０５Ｏのｐ過室の中に入れるが、そのフィルタ
ーは予め湿らせ、そして少し減圧する（水流減圧）； ｈ）水２００μｔを加えそして試料をＰ遇する；ｉ）上
記プロティナーゼに溶液１５０μｔを各々の室に入れ、
その系をプラスチックフィルムで包装し、−晩培養する
； ｊ）プロティナーゼ溶液を吸引除去し、上記アルカリ溶
液１５０μｔで置き代えそしてその試料をさらに１５分
間培養する： ｋ）アルカリ溶液を吸引除去し、そして上記中性溶液１
５０μｔで置き代え、そしてその試料をさらに１５分間
培養する； １）その中性塩溶液を除去した後、フィルターを塩化ナ
トリウム／クエン酸ナトリウム緩衝液（＝　ＳＳＯ：Ｈ
，０１１当りＮａ０１ＩＺ５Ｆ及びクエン酸ナトリウム
８．８２：ＰＨはＮａＯＨで７に調整する。）１５０μ
ｔで５分間で２回洗う； ｍ）　８８０を除去した後、フィルターを８０°０で２
時間熱する；そして ｎ）引き続き放射活性のＯａλ■ＤＮＡで交雑する； ０）フィルター上の放射能はフィルムに暴露することに
よって視覚的にとらえられた；ｐ）　（！ａＭＶまたは
ＯａＭＶ　ＤＮＡを含有する細胞培養からの抽出物を放
射性標識したＯａＭＶ　ＤＮＡとフィルター上で交雑し
、現像されたフィルム上に黒点を呈する。ＢＲＬ交雑点
システム（ｈｙｂｒｉｄ　ｄｏｔ　ｓｙｓｔｅｍ）の個
々の室に対応するフィルム上の黒点の存在または不存在
から、試験した細胞コロニーのどれがＯａＭＶまたはＯ
ａＭＶ　ＤＮＡを含有しているか検出することができる
。

実施例４： 細胞培養抽出物で健康な植物を再感染することによるウ
ィルス増殖の検出 ａ）実施例２の個々の細胞コロニーを各々２−メトキシ
エタノール１社中で室温で５時間培養する； ｂ）　２−メトキシエタノールを注意深く吸引除去し、
細胞コロニーを液体窒素中で凍らせる；ｃ）凍うせた細
胞コロニーをエッペンドルフ管中で均質に粉末化する； ｄ）その均質化した試料を水２００μを中に懸濁して完
全に混合する： ｅ）その試料をエッペンドルフ遠心分離機中で２分間遠
心分離する； ｆ）その澄んだ上澄を再感染検出のために使用する。

再感染： 完全に殺菌した条件下で上澄（参照上記ｆ））をカルボ
ランダムと一緒に、健康なブラシカラバ（Ｂｒａｓｓｉ
ｃａ　ｒａｐａ　）植物の葉の上側にすりつける。その
植物を５ないし４週間側のウィルスが感染しないように
保ち、次にウィルスの症状（モザイクの症状、葉ρ葉状
の透明度）の発生を調べる。カルボランダムで処理した
対照植物を接種した植物と同一の条件下−に保つ。健康
な植物の葉に上澄をすりつけた後にウィルスの症状が発
生するかしないかは、その上流が得られた細胞培養中に
目に見えるＯａＭＶ粒子が存在するかしないかの証拠と
なるものである。

上記試験の結果は多量のウィルスが、ウィルスに感染さ
れた植物の原形質体から再生された細胞培養物の約５憾
中に、形成されたことを示した。

実施例５二 植物組城中の細胞コロニーのための仲介物として全く感
染していないウィルスの突然支ｙ体を使用。

ＯａＭＶ　ＤＮＡを含有するブラシカ　ラバ（Ｂｒａｓ
ｓｉｃａｒａｐａ）の異なるカルス分枝基（Ｏａｌｌｕ
ｓ　ｃｌｏｎｅｓ）から取り出した樹液試料を、健康な
ブラシカ　ラバ（Ｂｒａｉｓｉｃａ　ｒａｐａ　）植物
の葉の上面にすりつける。その植物を３ないし４週間側
のウィルスが感染する可能性がないように保ち、次にウ
ィルスの症状の発生を検査する。

コロニーの５０優が感染し、これらの分校系の樹液で処
理した植物はＯａＭＶ感染の通常の症状を示す。これら
の植物のウィルス性ＤＮＡは感染のために使用される樹
脂試料のウィルス性ＤＮＡと全く同じ制限様式を有する
。

コロニーの５０憾は全（感染せず、ＤＮＡの分析はウィ
ルスゲノムが欠除していることを示す。

特許出願人

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）適当な栄養素培地中で、ウィルスゲノムまたはそ
   れらの派生物を含有する、分離された原形質体、細胞ま
   たは組織を培養増殖することニジなる、植物材料におけ
   るウィルスゲノム及びそれらの派生物を維持及び増殖す
   るための方法。 （２）　ウィルスゲノムまたはそれらの派生物全含有す
   る分離された原形質体、細胞または組織全完全な植物に
   再生することよりなる特許請求の範囲第１項記載の方法
   。 （３）分離された植物の原形質体を培養することよりな
   る特許請求の範囲第１項記載の方法。 （４）　栄養素培地中の原形質体の濃度が１ないし１　
   ×１０６／ｄである特許請求の範囲第３項記載の方法。 （５）　完全な植物を分離された植物の原形質体から再
   生することよりなる特許請求の範囲第２項記載の方法。 （６）　ウィルスゲノムまたはその派生物を含有する分
   離された原形質体、細胞または組織を、培養された植物
   から培養することよりなる特許請求の範囲第１項記載の
   方法。 （７）植物ウィルスゲノムまたはそれらの派生物を含有
   する分離された原形質体、細胞または組織を培養するこ
   とよりなる特許請求の範囲第１項記載の方法 （８）分離された植物原形質体、細胞菫たは組織の植物
   ゲノム中に入れられる造成材料を有するウィルスゲノム
   オたはそれらの派生物を含有する該植物原形質体、細胞
   または組織を培養することよシなる特許請求のｆｉＩｉ
   ！囲第１項記載の方法。 （９）　遺伝操作されたウィルスゲノムを含有する分離
   された植物原形質体、ａ胞または組織を培養することよ
   りなる特許請求の範囲第１項記載の方法。 ＱＯウィルスゲノムの病原性に限定されたそのウィルス
   ゲノムを含有する分離された原形質体、ａｍまたは組織
   を培養することよりなる特許請求の範囲第９項記載の方
   法、 （１℃　ウィルスゲノムまたはそれらの派生物を含有す
   る分離された原形質体、細胞または組織を温度範囲７°
   ないし４２゛Ｃで培養することよりなる特許請求の範囲
   第１項記載の方法。 θ２　ウィルスゲノムまたはそれらの派生物を含有する
   分離された植物原形質体、細胞または組織を適当な液体
   栄養素培地中に入れ、該培地をアガロースで固化し、固
   化した後のアガロース−固化栄養素培地を切断し、その
   切片を適当な栄養素溶液に移すことよりなる特許請求の
   範囲第１項記載の方法。 （１３ウィルスの突然変異体のウィルスゲノムまたはそ
   れらの派生物を含有する分離された植物原形質体、細胞
   または組織を、適当な栄養素培地中で培養することより
   なる、通常の条件下では生存できないウィルス突然変異
   体の維持及び増殖のための％−＃！ｆ請求の範囲第１項
   記載の方法。 Ｑ４’ｌ　ウィルスゲノムまたはそれらの派生物を含有
   し、そして該ウィルスゲノムまたはそれらの派生物を含
   有する分離された植物原形質体から培養された再生され
   た植物細胞または組織。 ０υ　前記植物細胞または組織のゲノムの中に入れられ
   た遺伝材料を有するウィルスゲノムまたはそれらの派生
   物を含有する特許請求の範囲第１４項記載の再生された
   植物細胞才たは組織。 Ｑｆ９　遺伝操作されたウィルスゲノムを含有する特許
   請求の範囲第１４項記載の再生された植物細胞または組
   織。 αη　ウィルスゲノムの病原性に限定されるウィルスゲ
   ノムを含有する特許請求の範囲第１６項記載の何生され
   た植物細胞または組織。 （２）　ウィルスゲノムまたはそれらの派生物を含有す
   る分離された原形質体、及びそれらの遺伝上同一な子孫
   から培養される。ウィルスゲノムまたはそれらの誘導体
   を含有する再生された植物。 Ｑｌ　ウィルスゲノムまたはそれらの派生物を含有する
   植物細胞または組織を該ウィルスゲノムまたはそれらの
   派生物を含有する分離された植物原形質体から生産及び
   培養するためのアガロースの使用方法。゛