HU191984B - Process for preparing hybridomes and by means thereof antibodies - Google Patents
Process for preparing hybridomes and by means thereof antibodies Download PDFInfo
- Publication number
- HU191984B HU191984B HU84189A HU18984A HU191984B HU 191984 B HU191984 B HU 191984B HU 84189 A HU84189 A HU 84189A HU 18984 A HU18984 A HU 18984A HU 191984 B HU191984 B HU 191984B
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- cells
- human
- hybridoma
- cell
- cell line
- Prior art date
Links
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 25
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 250
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 claims abstract description 96
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 48
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 16
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 11
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 11
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 11
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 claims description 16
- 230000002950 deficient Effects 0.000 claims description 12
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 claims description 11
- 102000018251 Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase Human genes 0.000 claims description 9
- 108010091358 Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase Proteins 0.000 claims description 9
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 5
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 claims description 5
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 claims description 5
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 claims description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 4
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 claims description 4
- 201000005296 lung carcinoma Diseases 0.000 claims 3
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 claims 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 28
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 abstract description 28
- 230000012010 growth Effects 0.000 abstract description 15
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 abstract description 3
- 239000013543 active substance Substances 0.000 abstract 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 44
- LPXQRXLUHJKZIE-UHFFFAOYSA-N 8-azaguanine Chemical compound NC1=NC(O)=C2NN=NC2=N1 LPXQRXLUHJKZIE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 43
- 229960005508 8-azaguanine Drugs 0.000 description 42
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 20
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 20
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 19
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 19
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 18
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 18
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 17
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 13
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 13
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 12
- 206010062129 Tongue neoplasm Diseases 0.000 description 10
- 201000006134 tongue cancer Diseases 0.000 description 10
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 9
- VZUNGTLZRAYYDE-UHFFFAOYSA-N N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine Chemical compound O=NN(C)C(=N)N[N+]([O-])=O VZUNGTLZRAYYDE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 8
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 8
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 8
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 7
- PLUBXMRUUVWRLT-UHFFFAOYSA-N Ethyl methanesulfonate Chemical group CCOS(C)(=O)=O PLUBXMRUUVWRLT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 7
- TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 4-aminofolic acid Chemical compound C1=NC2=NC(N)=NC(N)=C2N=C1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 6
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 6
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 6
- 229960003896 aminopterin Drugs 0.000 description 6
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 5
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 5
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000005717 Myeloma Proteins Human genes 0.000 description 4
- 108010045503 Myeloma Proteins Proteins 0.000 description 4
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 4
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 4
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 4
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 4
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 4
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 3
- 206010011906 Death Diseases 0.000 description 3
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 3
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 3
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 3
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 3
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 3
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 3
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 238000009281 ultraviolet germicidal irradiation Methods 0.000 description 3
- WOVKYSAHUYNSMH-RRKCRQDMSA-N 5-bromodeoxyuridine Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(Br)=C1 WOVKYSAHUYNSMH-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 2
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 7H-purine Chemical compound N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WOVKYSAHUYNSMH-UHFFFAOYSA-N BROMODEOXYURIDINE Natural products C1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C(Br)=C1 WOVKYSAHUYNSMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 2
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 2
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 2
- 102000008072 Lymphokines Human genes 0.000 description 2
- 108010074338 Lymphokines Proteins 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 229950004398 broxuridine Drugs 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- 210000002741 palatine tonsil Anatomy 0.000 description 2
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 2
- 229920002523 polyethylene Glycol 1000 Polymers 0.000 description 2
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- 241000272473 Aquila chrysaetos Species 0.000 description 1
- 208000003950 B-cell lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 241000272184 Falconiformes Species 0.000 description 1
- 201000003741 Gastrointestinal carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 102000006395 Globulins Human genes 0.000 description 1
- 108010044091 Globulins Proteins 0.000 description 1
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 241000711408 Murine respirovirus Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N Pyrimidine Chemical compound C1=CN=CN=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 1
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010042135 Stomatitis necrotising Diseases 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 210000000628 antibody-producing cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940088623 biologically active substance Drugs 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 235000013351 cheese Nutrition 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000035250 cutaneous malignant susceptibility to 1 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 239000000032 diagnostic agent Substances 0.000 description 1
- 229940039227 diagnostic agent Drugs 0.000 description 1
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 238000007499 fusion processing Methods 0.000 description 1
- 229940044627 gamma-interferon Drugs 0.000 description 1
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002980 germ line cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001492 haemagglutinating effect Effects 0.000 description 1
- 210000003630 histaminocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 1
- 201000002313 intestinal cancer Diseases 0.000 description 1
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 239000013028 medium composition Substances 0.000 description 1
- 201000008585 noma Diseases 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- HQQSBEDKMRHYME-UHFFFAOYSA-N pefloxacin mesylate Chemical compound [H+].CS([O-])(=O)=O.C1=C2N(CC)C=C(C(O)=O)C(=O)C2=CC(F)=C1N1CCN(C)CC1 HQQSBEDKMRHYME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
- C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
- C12N5/16—Animal cells
- C12N5/163—Animal cells one of the fusion partners being a B or a T lymphocyte
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
- C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
- C12N5/16—Animal cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/555—Interferons [IFN]
- C07K14/57—IFN-gamma
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/948—Microorganisms using viruses or cell lines
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
A jelen találmány tárgya eljárás új hibridómák előállítására, továbbá egy eljáráe hasznos vegyületek, pl. antitestek vagy limfokinek előállításéra az új hibridómák tenyésztésével.
Az immunológia, biológia, orvostudományok és a farmakológia területén intenzív erőfeszítéseket tesznek diagnosztikai ágensként vagy terápiás ágensként olyan homogén és erősen fajlagos antitestek (monoklonális antitestek) alkalmazására, amelyeket in vitro körülmények között nőni képes és fajlagos antigének elleni antitestek képzésére alkalmas hibridóma törzsekből állítanak elő. Az ilyen hibridómák előállításénak lehetőségét és ezek felhasználását biológiai anyagok in vitro termelésében először Ceaser Milstein és munkatársai mutatták meg a Cambridge Egyetemen (Milstein C. és munkatársai: Natúré, 256, 495). Mutáns sejtvonalat (P3-X63-Ag8) állítottak elő egér mielóma törzsből (P3K), amelyet a Salk Intézetből Leó Sacks biztosított. A mutáns sejteket ezután egyesítették birka vörösvérsejttel (SRBC) immunizált egér lép-sejtekkel. Az így nyert hibridóma képesnek mutatkozott in vitro nőni és SRBC-re monoklonális antitesteket (MoAb) előállítani. A hibridómák alkalmazásának az a nagy előnye, hogy eszközül szolgálhat biológiailag aktív vegyületek tömegtermeléséhez olyan módon, hogy nagy burjánzási képességgel rendelkező tumor-sejteket egyesítenek olyan sejtekkel, amelyek a megfelelő biológiailag aktív anyagot képesek termelni, de amelyek in vitro általában csak csekély burjánzási képességgel rendelkeznek, vagy egyáltalán nem rendelkeznek burjánzási képességgel.
Milstein és munkatársainak közleményeit követve számos kutató végzett tanulmányokat fajlagos antigének elleni MoAb termelő hibridómákkal. Mindezekben a tanulmányokban a hibridómák készítésében használt szülő-törzsek csontvelő sejtekből származó tumor-sejtek voltak, mint pl. mielóma sejtek vagy B-sejtekböl származó tumor-sejtek. Az olyan tumor-sejteknek, mint a mielóma sejt, genetikai tulajdonságait, amelyek a hibridóma előállításához és a hibridóma-kéBzítés elméleti szempontjaihoz szükségesek, az alábbiakban részletesen leírjuk.
Egy hibridóma előállításához két vagy többféle szülősejtböl az első követelmény egy olyan rendszer alkalmazása, amelyben csak a hibridizált sejt képes túlélni, a szülősejtek túlélése tehát megakadályozott. Ezért a hibridómák előállítására irányuló kísérletek nagy részében a tumor sejtek amelyek élénken képesek növekedni in vitro, olyan mutáns sejtek, amelyek hiányosak vagy hipoxantin-guanin foszforibozil transzferázban (HGPRT) vagy timidin-kinázban (TK). Mindkét mutáns genetikai és biokémiai tulajdonságai lényegében azonosak, így az ez után következő leírást a sokkal közönségesebb HGPRT-hiányos sejtekre alapozva végezzük. Amint ismeretes, a HGPRT egyike azoknak az enzimeknek, amelyek felelősek minden sejtben a DNS- szintézisért egy mentő-ciklus útján a DNS- szintézis menetében. Részletesebben szólva, ha az enzimes reakcióhoz szubsztrátumként purin vagy pirimidin komponenseket igénylő de novo ciklusban a DNS szintézist bizonyos inhibitorok (pl. aminopterin) elfojtják, a HGPRT működésbe hozza a mentő-ciklust, mint kisegítő utat és lehetővé teszi a DNS szintézis folytatását a sejt életben tartásához Ennél fogva a HGPRT-hiányos sejtek nem tudnak túlélni olyan tápközegben, amely hipoxantint, aminopterint és timidint tartalmaz (HAT tápközeg) az aminopterin jelenlétének következtében, amely inhibitora a de novo ciklusnak. A hibridóma készítéséhez szükséges partner sejtek, pl. lép-sejtek (B sejtek) képesek szintetizálni DNS-t mind a de novo, mind a mentő cikluson keresztül. Ennél fogva az a hibridóma, amely a lépsejteknek fúziójával jött létre HGPRT-hiányos szülősejtekkel, túléli a de novo ciklus aminopterines gátlását HAT tápközegben és hatásosan lehetővé teszi a hipoxantin alkalmazását a DNS szintézisében a lépsejtekből eredő mentő cikluson keresztül. Más szavakkal a hibridóma rendelkezik mind a szülő mielóma sejtnek azzal a képességével, hogy élénken nő in vitro, mind azzal a képességgel, hogy a lépsejtekből eredő mentő ciklus által DNS-t tud szintetizálni még a de novo ciklust gátló körülmények között is, vagyis HAT tápközegben aminopterin jelenlétében. Ezen túl a hibridóma a lépsejtekből olyan genetikai információkkal rendelkezik, hogy immunglobulinokat (antitesteket) termeljen fajlagos antigének ellen, így tehát úgy képes nőni HAT tápközegen, hogy közben immunglobulinokat állít elő.
A HGRTP-hiányos törzset, mint a hibridóma-készités szülőtörzsét általában úgy választják ki, mint egy olyan sejt-vonalat, amelyet a megfelelő mutációs technikával létre lehet hozni és amely rezisztens 8-azaguanidinre és amely nem képes nőni a HAT tápközegen. Hagyományosan ez a szülőtörzs csontvelőből származó tumor-sejtekből, mint pl. mielóma sejtek vagy B sejt limfómák, áll. A legtöbb tumor-sejt azonban, amelyet klónozni lehet a hibridóma-készitésben történő felhasználáshoz, egérből vagy patkányból származik és a humán mielóma sejteket ritkán használják. Ennek okai a következők: 1.) olyan kiónokat, amelyeket a HAT tápközegben történő szelekciónak (a továbbiakban ezt HAT szelekciónak nevezzük) ki lehet tenni, nehéz készíteni humán mielóma sejtekből; 2.) a humán mielóma sejteknek nincs meg az a burjánzási képessége, amely egy szülő-sejtvonalhoz szükséges, így egy olyan hibridóma, amelyet ebből a sejtvonalból és egy partner sejtvonalból fúzióval készítenek, csupán korlátozott növekedési képességei rendelkezik, ezen túl ez nem is elég stabil ahhoz, hogy nagy mennyiségű kívánt anyagot, pl. immun3 globulinokat tudjon termelni. Ennél fogva lehetetlen volt a szakterületen olyan humán-humán hibridómákat előállítani, amelyek megfelelő növekedési képességgel rendelkeznek és hasznos vegyületeket termelnek. A kutatók nem képesek jelentősebb mennyiségű immunglobulint előállítani a tenyésztett sejtekből és e helyett olyan immunglobulinokat kell használniok, amelyek állat-állat hibridóma sejtekből származnak. Az állat-állat hibridómákból gyártott immunglobulinok azonban olyan fehérjék, amelyek az ember száméra idegenek, ezért ezek antigenicitása gátolja kiterjedt alkalmazásukat emberben. Ennél fogva határozottan kívánatos humán-humán hibridómákból származó immunglobulinok előállítása. Amint azonban korábban említettük, a humán mielóma sejtekből származó hibridómák tömeges tenyésztése nagy nehézséget jelent az instabilitás miatt.
A mielóma sejtek nagy mennyiségű, mielóma-fehérjének nevezett fehérjét állítanak elő. Nem ismeretes azonban, vajon az így termelt immunglobulinok antitestjei-e bármilyen fajlagos antigénnek, és csaknem lehetetlen olyan mielóma-sejteket kiválasztani amelyek egy fajlagos antigén elleni antitestet képeznek. A tudósok arra a megállapításra jutottak, hogy a mielóma fehérje jelenléte bonyolulttá teszi a hibridómák kirostálását vagy az antitestek tisztítását, igy azokat a mielómasejteket, amelyek mielóma-fehérjét képeznek, olyanokkal kell helyettesíteni, amelyek nem képeznek mielóma fehérjét. Más szavakkal, az in vitro növekedési képességet tekintjük most fontosabb tényezőnek azokhoz a mielóma sejtekhez, amelyek a hibridóma előállításához szülőtörzsek.
Ezek között a körülmények között kívánatos olyan humán sejteket szerezni szülő-se jtvonalként a hibridóma-előállitáshoz, amely élénken nő és amelyet alá lehet vetni HAT szelekciónak a partner sejttel történt fúzió után, valamint olyan humán hibridómákat nyerni, amelyek in vitro kielégítően stabilak maradnak ahhoz, hogy a kívánt anyagok, mint pl. az immunglobulinok nagyobb mennyiségét tudják előállítani. Általánosságban meg lehet érteni, hogy a hibridóma-képzés érdekében a partner sejtekkel fizionálandó szülő sejteket a mielóma- és B sejtekből [beleértve az Epstein-Barr-vírus (EBV) által transzformált sejteket is) származó ráksejtekből kell kiválasztani. Előre meg kell mondani azonban, hogy ezeknek a szülő sejteknek különböző defektusai, hiányosságai vannak, amelyek gátolják kiterjedt használatukat a klinikai alkalmazásban.
Ennél fogva a jelen találmány egyik tárgya egy olyan teljesen új típusú, következetes humán sejt vonal kialakítása, amelyet partner sejtekkel fuzionálva hibridómák állíthatók elő, az ilyen sejtvonalak a korábban szülö-se jtvonalként használt hagyományos sejtvonalakkal ellentétben mentesek a defektusoktól. A jelen találmány a feltalálóknak azon a felismerésén alapszik, hogy bármilyen sejt, amely in vitro élénken képes növekedni, használható partner sejtekkel fuzionálandó szülőtörzsként a hibridóma-készítésben.
Részletesebben a jelen bejelentés egyik tárgya egy új típusú humán sejtvonal kialakítása egy olyan sejt-mutánsból, amelyet mielóma sejtektől vagy B sejtektől eltérő sejtekből eredő ráksejtek természetes vagy indukált mutációjával nyerünk. Ilyen tumor sejtek típusa pl. az epidermális rák (melanóma)-, hepatóma-, gyomorrák-, bélrák-, nyelvrák- és tüdőrák-sejt, előnyösen emberi melanóma-, hepatóma- és nyelvrák-sejt lehet. A mutánsok fajlagos példái a genetikailag hiányos sejtek, amelyek nem képesek előállítani néhány olyan enzimet, amelyek a DNS-szintézisért felelősek.
A jelen találmány egy másik tárgya egy olyan szülő sejtvonal kialakítása, amely in vitro sokkal jobban burjánzik, mint a hagyományos sejt-vonalak, amelyek a csontvelő-eredetű tumor-sejtekből (mielóma-sejtekböl) származnak, és amelyeket antitest-termelő sejtekkel (B-sejtekkel) fuzionálni lehet egy olyan hibridóma kialakítása érdekében, amely éppen olyan burjánzó-képességű, mint a szülő-sejt és amely mégis elég stabil marad ahhoz, hogy immunglobulinokat állítson elő.
A jelen találmány további tárgya egy olyan hibridóma előállítása az említett szülő sejtvonalból, amely in vitro kielégítően stabil egy hasznos anyag, mint pl, egy antitest előállításához. Részletesebben a jelen találmány egy fajlagos antitest-termelő hibridóma előállítását célozza az említett szülősejtvonal, elsősorban egy humán tumor sejtvonal fuzionálásával az embertől eltérő állatokból származó B sejtekkel, amelyeket egy fajlagos antigénnel érzékennyé tettek.
A jelen találmány további tárgya egy fajlagos antitestet termelő humán-humán hibridöma előállítása az említett szülő sejtvonal fuzionálása útján egy bizonyos antigénnel érzékennyé tett emberek perifériás vér-, mandula-, nyirokcsomó- vagy lépsejtjeiből nyert B sejtekkel.
A jelen találmány egy további tárgya egy olyan humán-humán hibridóma előállítása, amely olyan emberi immunglobulinokat termel, amelyeket az emberbe be lehet vezetni anélkül, hogy nem-kivánatos antigenicitási problémákat okoznának.
A jelen találmány egy további tárgya eljárást nyújtani egy hasznos vegyület, pl. egy antitest előállítására vagy közvetlenül az említett hibridóniából, vagy az említett hibridóma tenyészetéből.
Az 1. és 2. ábrák mindegyike egy felülnézeti kép, amely sematikusan bemutatja az
1. kísérletben végrehajtott Ouchterlony-vizsgélat módszerét.
A 3. ábra egy grafikus ábrázolás, amely három növekedési görbét ír le; egyet a mela-37 nómához és a többieket a jelen találmány szerinti szülő-sejtvonalhoz (ME1), amelyet a hibridóma készítéséhez alkalmazunk.
A jelen találmány szerinti hibridóma készítéséhez szükséges új tumor sejtvonal készítésének módszerét, az ezt a sejtvonalat szülö-sejtvonalként használó hibridóma készítésének módszerét és ebből a hibridómából hasznos biológiai anyagok előállításának folyamatát írjuk le a későbbiekben. A jelen találmány szerinti hibridóma készítéséhez a szülő sejtvonalat a csontvelő sejtekből származó tumor sejtektől eltérő tumorsejtek természetes mutációjával vagy indukált mutációjával nyerhetjük, ilyen humán tumor sejtek főleg humán melenóma sejtek, humán nyelvrák sejtek és humán hepatóraa sejtek lehetnek. A jelen találmány szerinti hibridómát ennek az új sejtvonalnak egy másik szüló-sejtvonallal, vagyis partnerrel történő fúziójával készíthetjük, amely partner származhat pl. állatok B-sejtjéből, beleértve a szóban forgó antigénnel immunizált embert is. Az egyszerűség kedvéért a jelen találmányt az alábbiakban úgy írjuk le, hogy főleg humán tumor sejtek egér lépsejtekkel történő fúziójával készített hibridóma tenyészetéből nyert monoklonális antitest (MoAb) termelésének kivitelezésére utalunk. Meg lehet érteni azonban, hogy a jelen találmány semmiképpen sem korlátozódik erre a szóban forgó kivitelre.
A humán tumor sejtek, amelyek szüló-törzsként szolgálnak a hibridóma készítéséhez, előállításának folyamata egy, a DNS szintézis mentő ciklusában érdekelt enzim (HGPRT)-hiányos klón izolálásával kezdődik abból a célból, hogy lehetővé váljon hibridómák ezt követő HAT-szelekciója. Ezt a lépést a következő két módszer egyikével lehet végrehajtani. Az egyik módszerben közvetlenül 8-azaguanint adunk megfelelő koncentrációban a tápközeghez úgy, mint 8-azaguanin rezisztens törzsek nyeréséhez. Egy másik módszerben ráksejteket vagy UV besugárzással vagy mutációs induktorral kezelünk a ráksejt fajlagos típusától függően, és az igy kezelt sejteket ezt követően visszük át egy 8-azaguanint tartalmazó tápközegbe. Az UV besugárzást úgy hajtjuk végre, hogy a sejteket UV lámpa (GL-15)-fényének tesszük ki 30 cm távolságból 15 másodperc és 10 perc közti időtartamokra. Egy megfelelő mutációs induktor az etilmetánszulfonát (EMS) vagy az N-metil-N’-nitro-N-nitrozo-guanidin (MNNG), ezeket 0,05-10 ug/ml mennyiségben alkalmazzuk. Miután a sejteket a mutációs induktor jelenlétében tenyésztettük több órától 3 napig terjedő időtartamokon át, a tenyészetet szérummentes tápközeggel alaposan átmossuk és átvisszük egy 8-azaguanint tartalmazó tápközegre. Bármelyik módszert használjuk, a folyamat első lépése egy vagy több 8-azaguanin-rezisztens törzs megjelenésével végződik.
A második lépés ellenőrzésből áll, hogy megláthassuk, vajon a 8-azaguanin rezisztens törzs sejtjei lehetővé teszik-e az ezt követő HAT-szelekciöt. A 8-azaguanin rezisztens törzseket megfelelő tápközegben tenyésztjük, amelyet azután centrifugálással eltávolítunk. A fennmaradó sejteket azután kétszer mossuk megfelelő tápközegben, majd átvisszük friss HAT tápközegbe (105 sejt/ml). 5 napos inkubálés után a sejteket triptán-kékkel megfestjük. Ha csaknem az összes sejtet elpusztultnak találjuk, az azonos 8-azaguanin- rezisztens törzs sejtjeit (105 sejt/ml) Costar 3596 lemezre (mikro-lemez 96 üreggel) helyezzük el, miután 105 betápláló sejtet (azaz lépsejtet) helyeztünk el minden egyes üregbe. A lemezre helyezés előtt a 8-azaguanin rezisztens sejteket olyan koncentrációra hígítjuk, hogy biztosítva legyen, hogy egynél több sejt ne legyen az egyes üregekben (valószínűség alapján 0,1 sejt/üreg). A lemezre helyezett sejteket kb. 1 hétig inkubáljuk. A kiónokat hagyjuk szaporodni a sejt-populációban és amikor ezek elérik a 105 sejt/ml koncentrációt, ezeket ismét HAT tápközeggel hozzuk össze, majd addig hagyjuk, amíg mind elpusztulnak. A fenti eljárást előnyösen legalább kétszer megismételjük. A második lépés a 8-azaguanin rezisztens sejtek teljes pusztulásának bizonyságéval végződik HAT tépközegben. Szükséges, hogy 8-azaguanint mindig tegyünk a HAT tápközegbe, amíg a kívánt sejtvonalat létrehozzuk.
A fenti eljárásban 8-azaguanint helyettesíteni lehet BudR-el (bróm-dezoxi-uridin) ahol TK-ban hiányos és HAT tápközegre ismét érzékeny kiónok nyerhetők. A kívánt sajtvonal létrehozása után ezt olyan tápközegben kell tartani, amely 8-azaguanint tartalmaz, ha alkalmas. A létrehozott sejtvonal tenyésztéséhez szükséges tápközeg lehet ugyanolyan, mint amilyent a humán tumor sejt mutációja előtt használtunk. Sót, a létrehozott sejtvonalat lehet használni szülő sejtvonalként a hibridóma-készítéshez anélkül, hogy ehhez speciális tápközegre lenne szükség. A létrehozott sejtvonalat megfelelően lehet tárolni hagyományos módszerrel, egy 10% FCS-et (borjú-embrió szérum) és 10% DMSO-t (dimetil-szulfoxid) tartalmazó tápközegben szuszpendálva, amelyet ezután vagy folyékony nitrogénben tartunk, vagy egy fagyasztóban -80 °C vagy ennél alacsonyabb hőmérsékleten.
A jelen találmány szerint létrehozott sejtvonal alkalmas szülő sejtvonalként egy hibridóma előállításához. Ha a sejtvonal humán tumor sejtből ered, ez alkalmas lesz szülő sejtvonalként humán-humán hibridóma előállításához. A másik szülő (partner-sejt) lehet a szóban forgó antigénnel immunizált ember perifériás véréből, mandulájából, nyirokcsomójából és lépéből származó B-sejt. A humán-humán hibridömáknak egyik nagy előnye az, hogy olyan immunglobulinok előállító— sa várható tőle, amelyek humán fehérjék és ezért be lehet vezetni azokat emberekbe anélkül, hogy nem kívánt antigenicitás problémáját okozná. Még fontosabb, hogy a jelen találmányról úgy véljük, hogy képes hibridómákat létrehozni nemcsak humán B sejtekkel, hanem humán T sejtekkel is. igy a találmány szerinti szülő sejtvonalat fuzionálni lehet egy partnerral, amely gamma interferon vagy limfokin termelésére képes humán T sejt. Az ennek eredményeképpen létrejött T sejt híbridómától azt várjuk, hogy rendelkezik gamma-interferon és limfokin termelő képességgel. Ennél fogva a jelen találmány szerinti sejtvonalak az alkalmazás széles választékát találják és ezeket fel lehet használni különböző típusú hibridömák előállításához.
Egy hibridóma előállító folyamatot, amelyben szülő sejtvonalként a létrehozott sejtvonalat használjuk, a következőkben mutatjuk be. A használandó tápközeg a szokásos tápközegek bármelyike lehet, mint pl. Eagle MÉM, Dulbecco által javított MÉM és RPMI 1640, amely 10% CS-t (borjú-szérum), 5% FCS-t + 5% CS-t vagy 10% FCS-t tartalmaz. A szülő sejtek szokásos fenntartásához ezeknek a tápközegeknek bármelyike használható, de a hibridóma-készítés speciális céljaira 10% FCS előnyös. Az első lépésben a szülő sejtek, azaz a humán ráksejtek és a partner sejtek, azaz lépsejtek fuzionálnak 1:5 arányban HVJ-vel (hemagglutináló vírus Japánból, Sendai-vírusként is ismeretes) vagy polietilén-glikollal (PEG), mint közvetítővel. PEG 1000 30-50%-os oldata az előnyös. A fuzionált sejteket HAT szelekciónak vetik alá a korábban már leírt eljárás szerint. Az ennek eredményeként kapott hibridóma sejtek átrostálását főként a tenyészet felülúszójának ellenőrzésével hajthatjuk végre, az immunglobulinok megjelenésére, az immunglobulinokat előállító hibridóma kiónokat az SPA-vak-SRBC módszerrel (SPA: Staphylococcus aureus .A fehérje; lásd: Procedures of Immunological Experiments (Az immunológiai kísérletek eljárásai) VII., 2375 oldal/vagy ELISA-módszerrel (Dynatech-módszer) .keresve meg. A kiónokat ezután fokozatosan szaporodni hagyjuk a sejt-populációban és amikor elérik 105 sejt/ml koncentrációt, szubklónozásnak vetjük alá. Abból a célból, hogy biztosítsuk, hogy az összes hibridóma-sejt monoklonólis legyen, lemezre kell vinni ezeket, egy 96 üreges mikro-lemezre, amelynek minden egyes üregébe kb. 105 normál lépsejtet helyeztünk el, mint betápláló réteget. A hibridóma sejteket olyan koncentrációra kell hígítani, hogy biztos legyen, hogy egynél több hibridóma sejt nem kerül az egyes üregekbe (0,1 sejt/üreg átlagszám a valószínűség alapján). Mintegy egy hetes inkubálás után az Így létrejött kiónokat ellenőrizzük fajlagos antitestet előállító képességük alapján. A fenti eljárást addig ismételjük, amíg monoklonális hibridóma sejteket nyerünk.
A hibridóma által előállított immunglobulinokat könnyű ellenőrizni osztályuk és alosztályuk szerint az agaróz-gélt alkalmazó Ouchterlony technikával. Olyan immunglobulinok, amelynek termelését várjuk hibridómától, elleni antitesteket reagáltatunk a tenyészet felülúszójával agaróz lemezen és a 24 órával később feltűnő precipitációs vonalakat megfigyeljük. Az Ouchterlony módszer részleteivel kapcsolatban lásd az 1. kísérletet.
Amint az előbbi leírásból nyilvánvaló, a jelen találmány tagadja Milsteinnek és munkatársainak azt a következtetését, hogy a hibridóma készítéséhez a szülő sejtvonalaknak olyan tumor sejteknek kell lenniök, amelyek csontvelő sejtekből erednek, mint pl. mielóma vagy B sejtek. Más szavakkal a jelen találmány feltalálói azt demonstrálják, hogy bármilyen tumor-sejt, amely in vitro képes nőni, használható hibridóma készítéshez alkalmas szülő-sejtek létrehozásához. A jelen találmány szerint létrehozott humán tumor sejtvonalat sokkal egyszerűbb tenyészteni, mint a hagyományos mielóma sejtvonalat, és még stabilabb is, valamint burjánzóképesebb is, mint az utóbbi. Ezt a sejtvonalat használva bzüIő eejtvonalként, humán-egér hibridómát lehet előállítani a jelen találmány szerint. A jelen találmány szerint nem csupán egy monoklonális antitestet termelő hibridómát, hanem olvan hibridómákat is elő lehet állítani, amelyek hasznos fiziológiai aktivitással rendelkező limfokínokat termelnek.
A jelen találmány szerinti hibridóma előállításához alkalmas szülő sejtvonal készítésének módszerét, az említett sejtvonalból egy hibridóma készítésének folyamatát, valamint a képződött hibridómából eredő antitest termeléséhez szükséges folyamatot és az antitest azonosításának módszerét az alábbiakban kiviteli példákkal és kísérleti adatokkal írjuk le.
1, Példa
Colo 38 humán tumor sejtből egy szülő sejtvonal készítése hibridóma-készítményhez (A módszer)
A következő kiviteli példákban minden tenyésztést 5% CO2+95% levegő atmoszférában hajtottunk végre kb. 100% relatív nedvességtartalomnál (r. n) és 37 °C hőmérsékleten.
Colo 38 rosszindulatú humán melanóma sejtet 2 vagy 3 napig tenyésztjük, amíg az eléri a log-fázist. A sejtekhez MNNG (N-metil-N'-nitro-N-nitrozo-guanidin, Sigma Chemical Co. gyártmánya) mutációs induktort adunk, hogy végső koncentrációja 0,05-10 ug/ml legyen. 36 órás inkubálás után 5 pg/ml MNNG koncentrációnál a melanóma sejtek mintegy 20%-a pusztul el. A tenyészetet az MNNG-től megszabadítjuk szérum-mentes RPMI 1640-el (a Nissui Seigaku Co., Ltd. gyártmánya) há-5π rom centrifugálás közben. Összesen 10 ml ilyen módon kezelt sejtet (2.105 sejt/ml) adunk egy, a végső koncentrációban 1-50 pg/ml 8-azaguanint tartalmazó tápközeghez. A tenyésztést folytatjuk legalább egy hétig megfelelő 8-azaguanin koncentráció mellett, amely biztosítja, hogy a sejtek legalább 99%-a elpusztul egy héten belül 20 jug/ml 8-azaguaninban. Ennél a 8-azaguanin koncentrációnál a tenyésztést folytatjuk legalább két hétig a kezdettől számitva, a sejtnövekedést naponta figyelve. Mintegy két hét múlva a sejt gyors növekedése következik be. Ekkor a sejteket centrifugálással összegyűjtjük és egy olyan tápközeghez adjuk, amely 50 jug/ml végső koncentrációban 8-azaguanint tartalmaz (a beadott sejtek száma azonos azzal, amelyet az első 8-azaguaninos kezdésnél alkalmaztunk: 2.1O5 sejt/ml). Azokat a sejteket, amelyek a 2 hetes inkubációt túlélték, kiválasztjuk, mint 8-azaguanin rezisztens törzseket.
A 8-azaguanin rezisztens törzsek sejtjeit szérum-mentes tápkőzegben mossuk háromszori centrifugálással és átvisszük 10 ml HAT tápközegbe. A tápkőzeg RPMI 1640 tápközegből áll, amely ki van egészítve 10% FCS-el (CSL Co., Ausztrália, terméke), amelyhez hipoxantint, aminopterint ée timidint adunk 10-4 mól/liter illetve 4.10-’ mól/liter és 1,6.10-5 mól/liter végső koncentrációban. A sejtek koncentrációja a HAT tápközegben 105 eejt/ml. Az inkubáció 5. napján a sejteket túlélésre ellenőrizzük, triptán kékkel megfestve azokat. Ha az ösezes sejtet elpusztultnak találjuk a HAT tápkőzegben, a 8-azaguanin rezisztens sejtek egy másik részletét elhelyezzük 96 üregben 0,1 sejt/üreg valószinűséggel lép-sejtekkel együtt, amelyeket minden egyes üregben elhelyeztünk, mint betápláló réteget 105 sejt/üreg koncentrációval. Körülbelül egy hetes inkubáció utón hat klón képződik a 96 üreg közül. Az inkubálást további egy vagy két hétig folytatva a sejtek száma minden egyes kiónban kb. 105/ml-re növekszik. Ez után az összes kiónt HAT szelekciónak vetjük alá. A sejtek minden egyes kiónban elpusztulnak 5 napon belül. A hat klón egyikét ismét lemezre helyezzük, 96 üregbe, az előzőhöz hasonló módon, és szubklónozzuk, 8 kiónt nyerve. Ezeket is számban növekedni hagyjuk és HAT szelekciónak vetjük alá, bizonyítandó, hogy az öszszes sejt elpusztul a HAT tápközegben.
Az igy nyert rosszindulatú humán melanóma sejteket, amelyek rezisztensek 8-azaguaninra és érzékenyek HAT szelekcióra, ME 1-sorozatnak nevezzük. Ezek a következő öszszetételű tápközegben vannak tárolva: [10% FCS, 10% DMSO (dimetil-szulfoxid) és 80% közönséges tápkőzeg), folyékony nitrogénben vagy egy fagyasztón belül kb. -80 °C hőmérsékleten.
2. példa
Colo 38 humán tumorsejtböl egy szülő sejtvonal készítése hibridóma-készítményhez (B módszer)
A B módszer abban különbözik az A módszertől, hogy a mutációt UV besugárzással indukáljuk kémiai induktorok helyett. A rosszindulatú humán melanóma sejteket lóg fázisban egy 10 cm átmérőjű Petri-csészébe helyezzük 2.105 sejt/ml koncentrációban (összesen 10 ml-t). UV-lámpával (GL 15, a Matsushita Electric Xndustrial Co., Ltd. gyártmánya) történő besugárzás után (30 cm magasságból), 8-azaguanint adunk a sejtekhez, hogy annak végső koncentrációja 20 pg/ /ml legyen. Egy héten belül a sejtek legalább 99,5%-a elpusztul. Az inkubációt folytatjuk további két hétig hasonló körülmények között, naponta figyelve a tenyészetet. Három héttel az első 8-azaguanin-beadés után a sejtek száma gyorsan nő, a sejtek egységes szuszpenzióját képezve. Ezeket centrifugálással összegyűjtjük és 2.1O5 sejt/ml koncentrációban olyan tápközeghez adjuk, amely végső koncentrációban 50 pg/ml 8-azaguanint tartalmaz. A sejteket amelyek túlélik a további két hetes inkubálást, kiválasztjuk mint 8-azaguaninrezisztens sejteket.
Ezeket a sejteket ezt követően az 1. példában leírt módszer szerint HAT szelekciónak vetjük alá, és három ΜΕ 1 sejtvonalat nyerünk. A 8-azaguanin-rezisztens sejtek megjelenésének valószínűsége az 1. példában elért érték mintegy egyötöde. Annak valószínűsége azonban, hogy a 8-azaguanin-rezisztens sejtek érzékenyek a HAT szelekcióra, azonos mindkét példa szerinti módszernél.
3. Példa
Colo 38 humán tumorsejtből egy szülö-sejtvonal készítése hibridóma-készitményhez (C módszer)
A C módszer abban különbözik az A és a B módszertől, hogy a 8-azaguanint közvetlenül a humán tumor-sejt tápközegéhez adjuk. 10 ml, Colo 38 rosszindulatú humán melanóma sejtet 2.105/ml koncentrációban lóg fázisban tartalmazó tenyészetet 5 napig inku bálunk 5 pg/ml koncentrációjú 8-azaguanin jelenlétében. A 8-azaguanin mennyiségét ez után 20 pg/ml-re növeljük. Az inkubációt folytatjuk, 10 napon belül csaknem minden sejt elpusztul. Az inkubációt azonban tovább folytatjuk további 20 napig azonos körülmények között. A sejtnövekedés elérésének valószínűsége kicsi, de a sejtek számában gyors növekedés következik be a vizsgált 18 lombik egyikében. A kinőtt sejtek egy részét további két hétig tenyésztjük 8-azaguanin jelenlétében, amelynek végsó koncentrációja
-613
Mg/ml. Azokat a sejteket, amelyek ilyen körülmények között normális növekedésre képesek, kiválasztjuk, mint 8-azaguanin-rezisztens sejteket.
Ezeket a sejteket ezt követően az 1. példában leírt módszer szerint HAT szelekciónak vetjük aló, és hat El-sejtvonalat nyerünk.
Az 1-3. példákban összesen 17 ΜΕ 1 sejtvonalat nyerünk rosszindulatú humán melanóma sejtekből (Colo 38-ból) három különböző módszerrel. A sejtvonalakat SUN N-21-1 - SUN N-21-17 jelzéssel azonosítjuk.
4. Példa
M21 humán tumor-sejtből egy szülő-sejtvonal készítése hibridóma-készítményhez
Ez a példa azt mutatja meg, hogy lehet készíteni hibridómakészitményhez szolgáló szülő-sejtvonalat más humán tumor sejtekből, nemcsak Colo 38-ból. A 4. példában alkalmazott módszer lényegében azonos az 1. példában leírt módszerrel.
M21 humán melanóma sejteket 60 órán át tenyésztjük, amíg elérik a lóg fázist. MNNG mutációs induktort adunk a sejtekhez 5 pg/ /ml végső koncentrációban. 36 órás inkubálás után, amely közben a melanóma-sejtek 35%-át elpusztultnak találjuk, a tenyészetet megszabadítjuk az MNNG-től szérum-mentes RPMI 1640-es történő mosással három centrifugálás közben. 2.105 élő sejt/ml koncentrációban összesen 10 ml-t inkubólunk egy 8-azaguanint 20 jug/ral végső koncentrációban tartalmazó tápközegben. Egy héten belül a sejtek legalább 99,5%-a elpusztul, de az inkubációt folytatjuk további két hétig hasonló körülmények között.
A tenyészetet egyszer egy nap ellenőrizzük bármiféle sejtnövekedésre mikroszkóp alatt. 20 nappal később a sejtek számában fokozatos növekedés következik be, és további 5 napon belül gyors sejtnövekedés megy végbe. A kinőtt sejtekét centrifugátassal kigyűjtjük és 2.1O5 sejt/ml koncentrációban 10 ml tápközegben szuszpendáljuk, a tápközeg végső koncentrációban 50 pg/ml 8-azaguanint tartalmaz. Az inkubációt további két hétig folytatjuk, és azokat a sejteket, amelyeknek száma növekedik, kiválasztjuk, mint 8-azaguanin rezisztens sejteket.
Ezeket a sejteket HAT-szelekciónak és ismételt szubklónozásnak vetjük alá az 1. példa szerinti módon. Ennek eredményeképpen hat szülő sejtvonalat nyerünk M21 humán melanóma-sejtból hibrídóma-készilményhez, amelyek 8-azaguaninra rezisztensek és amelyek HAT-tápközegben elpusztulnak. Ezt a hat sejtvonalat a ME-2 sorozatban SUN-N-22-1 - SUN N-22-6 jelöléssel azonosítjuk.
5. Példa
Humán hcpnlóuia sejtből egy szúlö-sejtvonal készítése hibridóma-készítményhez (1) módszer)
1IC C-4 humán hcpntómu sejtet tenyésztünk RPMI 1640-ben 24 órán át. A tenyészethez EMS (etil-metánszulfonát), Sigma Chemical Co. gyártmánya) mutációs induktort adunk, hogy annak végső koncentrációja 1 mmól/liter legyen. A 3 órás inkubálás folyamán mutáció indukálódik a HC C-4 humán hepatóma sejtben. A sejteket azután háromszor mossuk szérum-mentes RPMI 1640 tápközeggel, 48-72 órás időtartamon át tenyésztjük teljes (szérumot is tartalmazó) RPMI 1640 tépkőzegben, majd a továbbiakban 3-4 hétig tenyésztjük olyan RPMI 1640 tápközegben, amely 2,0 pg/ml 8-azaguanint tartalmaz. Mintegy három hét múlva gyors növekedés következik be a sejtek számában, és tapadó sejtek egységes kiónjai képződnek. A tenyészetet további két hétig inkubáljuk RPMI 1640 tápközegben, amely 10 pg/ml 8-azaguanint tartalmaz. A növekvő sejteket, mint 8-azaguanin rezieztens törzseket, kiválasztjuk.
Ezeket a sejteket ezt követően IIAT-szelekcióra történő érzékenységre ellenőrizzük, mint ahogyan ezt az 1. példában tettük. Ennek eredményeképpen 8-HGPRT-hiányos sejtvonal kiónt, amelyek szülö-sejtvonalak hibridóma-készítinényhez, nyerhetünk humán hepatóma sejtekből. Ezeket a kiónokat SUN-N-31-1 - SUN N-31-8 jelöléssel azonosítjuk.
á. Példa
Humán hepatóma sejtből egy szülő-sejlvonal készítése hibridóma készítményhez (E módszer)
Az 5. példában leírtakkal azonos módon HC C-4 humán hepatóma sejtek tenyészetét EMS mutációs induktorral kezeljük. A tenyészetet azután az EMS-től megszabadítjuk szérum-mentes RPMI 1640 tápközeggel történő mosással. A tenyészetet 3-4 héten át inkubáljuk egy 2,0 g/ml BudR-t (bróm-deoxi-uridin, a Sigma Chemical Co. gyártmánya) tartalmazó tápközegben. A növekvő sejLeket olyan Lápközegbe visszük át, amely 10 g/ml BudR-L tartalmaz, ebben a tápközegben mintegy 2 héten át inkubálunk. A sejLeket, amelyek növekedési, érnek el ebben az inkubációban, leválasztjuk, mint Budit-rezisztens törzseket.
Ezeket azután ellenőrizzük HAT szelekcióra történő érzékenységre, az. 1. példában leírtak szerint. Ennek eredményeképpen a humán hepatóma sejtekből hal TE hiányos
-715 sejtvonal-klónt nyerünk, amely szülö-sejtvonalként szolgál hibridóma-késziLményhez.
7. Példa
Humán nyelvrák-sejtekból egy szülő-sejtvonal készítése hibridóma-készítményhez.
A-549 humán nyelvrák-sejteket tenyésztünk 24 órán át RPMI 1640 tápközegben. A tenyészethez EMS mutációs induktort adunk, 1 mmól/liter végsó koncentrációban. Három órás inkubáció során mutáció indukálódik az A-549 humán nyelvrák sejtekben. A sejteket ez után háromszor mossuk szérum-mentes RPMI 1640 tápközegben, majd tenyésztjük 48-72 órán át teljes RPMI 1640 tápközegben, ezután pedig 3-4 héten át tenyésztjük 2,0 Mg/ml BudR-t tartalmazó RPMI 1640 tápközegben. Mintegy három hét múlva gyors növekedés következik be a sejtek számában, és a tapadó sejtek egységes kiónjai képződnek. A tenyészetet további két hétig inkubáljuk RPMI 1640 tápközegben, amely 10 mg/ /ml BudR-t tartalmaz. A növekvő sejteket, mint BudR rezisztens törzseket, kiválasztjuk.
Ezeket a sejteket ezt követően HAT-szelekciöra történő érzékenységre ellenőrizzük, mint ahogyan ezt az 1. példában tettük. Ennek eredményeképpen 5 TK-hiányos sejtvonal-klónt, amelyek szülö-sejtvonalak hibridóma készítményhez, nyerhetünk humán nyelvrák sejtekből. Ezeket a kiónokat SUN N-33-1 - SUN N-33-5 jelöléssel azonosítjuk.
Az 1-7. példákban létrehozott szülö-sejtvonalakat lehet fuzionálni B-sejtekkel, mint pl. lépsejtekkel, hibridómák képzése érdekében, amely hibridómák immunglobulinokat hoznak létre a tenyészetben, amint ezt a következő példa szemlélteti.
8. Példa
Hibridóma előállítása az 1. példa szerinti ΜΕ 1 fúziójával A-549 humán nyelvrák sejtekkel immunizált egér lépsejtekkel, és a hibridómából nyert monoklonális antitest kiválasztásának bizonyítása.
107 sejt SUN N-21-2 (szülő-sejtek) tenyészetét egyesítjük 4 hetes BALB/C nőivarú egér 5.107 lépsejtjével (partner-sejtek), amely egereket négy héten át egyszer egy héten beoltottunk A-549 humán nyelvrák sejtekkel, alkalmanként 107 sejtet tartalmazó dózissal.
Fúziós közvetítőként polietilén-glikolt (PEG 1000, a Wako Pure Chemical Industries
I.td. gyártmánya) használunk 40% koncentrációban. A fúziós eljárás a következő: A szülő-sejteket és a partner-sejteket összekeverjük és centrifugáljuk egy centrifuga-csőben és a felülüszót eldobjuk. Mintegy 0,5 ml PEG
1000-t, amelyet 40%-ra hígítottunk RPMI 1640-el, adunk a beburkolt sejtekhez. A keveréket állni hagyjuk 3 percen át és 500 fordulat/perccel centrifugáljuk 3 percen át. Ezután 5 ml tápközeget adunk lassan hozzá, és a keveréket centrifugáljuk, és a feiülúszót elöntjük. Az összes sejtet lassan átvísszük egy T-75 lombikba (Falcon 3024) és további tápkőzeget adunk hozzá, amíg a teljes térfogat kb. 40 ml lesz. Egy éjszakán át történő tenyésztést követően az összes sejtet magába foglaló tenyészetet egy centrifuga-csőbe visszük át, centrifugálunk, majd a felülüszót elöntjük. HAT tápközeget (40 ml) adunk a beburkolt sejtekhez és alaposan étkeverjük. A keveréket egy mikrolemez 96 ürege között elosztjuk, kb. 100 pl mennyiséget adva egy üregbe. Ugyanezt a folyamatot megismételjük 4 mikrolemez üregeit megtöltve sejt és HAT tápközeg keverékével. Egy hetes inkubálást követően az üregek kb. 10%-ában telepek képződnek. Ezeknek a telepeknek az a jellegzetessége, hogy sokkal laposabban terjednek szét, mint a szülő-sejtek telepei. Az inkubálás első hetétől kezdve egy csepp (kb. 25-30 μΐ) HT tápközeget (amely azonos a HAT tápközeggel azzal a kivétellel, hogy nem tartalmaz aminopterint) adunk minden egyes üreghez. Amikor hibridóma elfogadható növekedése megtörtént (kb. 10-14 nap múlva), a tenyészet felülúszóját ellenőrizzük az A-549 humán nyelvrák elleni monoklonális antitest megjelenésére az A-fehérje-kötés SRBC módszerrel. A képződött 45 klón közül négyet találunk A-549 elleni monoklonális antitestet képzőnek. A négy klón egyikét az 1. példában leírtak szerint szubklónozzuk. Négy szubklón nő ki és ezek mind termelnek monoklonális antitestet A 549 ellen.
Ezeket a hibridóma sejteket ismert módon tároljuk, pl. 10% FCS-t, 10% DMSO-t és 80% szokásos tápközeget tartalmazó tápközegben szuszpendálva és folyékony nitrogénben vagy kb. -80 °C hőmérsékleten fagyasztóban tároljuk.
1. Kísérlet
A 8. példa szerint előállított hibridóma által termelt immunglobulinok osztályának és alosztályának meghatározása Ouchterlony módszerrel.
ml 15%-os agaróz oldatot (0,01% NaN3—al) helyezünk négy Petri-csészébe (belső átmérő: 52 mm) és 30 percig állni hagyjuk, amíg az agaróz megszilárdul. Üregeket lyukasztunk az agaróz gélbe minden egyes csészében, amint ezt az 1. ábra bemutatja. A perem melletti üregekbe az 1. Táblázatban felsorolt antitestek mindegyikéből 5 μΐ-t adunk, mig a központi üregek az agaróz gélben a 8. példában készített hibridóma által termelt négy monoklonális antitestet (LAC 1, 2, 5 és 4) tartalmazó tápközeg tízszeres kon-817
191384 eentrátumából 15 μΐ-el vannak töltve. A géleket 24 órán át állni hagyjuk, és minden egyes monoklonális antitest osztályát a precipitációs vonal képződésével meghatározzuk.
1. Táblázat
| Szám | Antitest | Eredet |
| 1 | anti-humán lg M (Hoechst AG) | Nyúl |
| 2 | anti-humán lg G (Hoechst AG) | Nyúl |
| 3 | anti-egér lg G (Capel Co.) | Nyúl |
| 4 | anti-egér lg M (Hoechst AG) | Birka |
| 5 | anti-humán IG (G+A+M) (Hoechst AG) | Birka |
| 6 | anti-humán lg A (Hoechst AG) | Nyúl |
A négy vizsgált antitestet egér lg G-nek találjuk, mivel az összes precipitációs vonal a 3 üreg és a 7 központi üreg között alakul ki.
Az lg G alosztályát azonos módszerrel határozzuk meg. Amint a 2. ábra bemutatja, öt üreget lyukasztunk az agaróz gélbe a négy Perti csésze mindegyikében. A négy perem melletti üregbe a 2. Táblázatban felsorolt alosztályok antitestjeiből 5 μΐ-eket helyezünk be, mig a központi üregek az agaróz gélben a monoklonális antitestek (LAC 1-4) mindegyikéből 15 μΐ-el vannak töltve. A Petri-csészéket 24 órán át állni hagyjuk szobahőmérsékleten.
2. Táblázat
| Szám | Antitest | Eredet |
| 1 | anti-egér lg G 1 (Miles Laboratories Inc.) | Nyúl |
| 2 | anti-egér lg G 2a (Miles Laboratories Inc.) | Nyúl |
| 3 | anti-egér lg G 2b (Miles Laboratories Inc.) | Nyúl |
| 4 | anti-egér lg G 3 (Miles Laboratories Inc.) | Nyúl |
A vizsgált négy monoklonális antitestet lg 2a-nak találjuk, mivel precipitációs vonalai a 2. és 5. üregek között keletkeznek.
A 8. példa szerinti hibridóma által termelt monoklonális antitestek mennyisége kb. 30 ug/ml, amely csaknem azonos az egér mielóma sejt, mint szülő-sejt felhasználásával készült hibridómák által termelt monoklonális antitestek mennyiségével. A 8. példa szerinti hibridóma által termelt antitest egységességét tovább bizonyítjuk gél-elektroforézissel.
A fenti eredmények azt mutatják, hogy a jelen találmány szerinti sejtvonalak (pl. az ΜΕ 1 sorozat SUN N-21-1 sejtvonala), amikor B sejtekkel fuzionáljuk, olyan immunglobulinokat állítanak elő, amelyek a B-sejtből adott genetikai információt fejezik ki.
A humán mielóma sejtek, amelyeket megkíséreltek szülő sejtekként használni hibridóma készítéséhez, számtalan különböző defektussal bírnak, mint pl. nehézségeket a tenyésztésben, kis növekedési sebesség, és instabilitás. Amint az alábbiakban bemutatjuk, a jelen találmány szerinti sejtvonal viszont képes következetes növekedésre, amely a ráksejtek öröklött tulajdonsága.
2. Kísérlet
A jelen találmány szerinti ΜΕ 1 sejtvonal és a ráksejtek növekedési profiljai.
ml, 2.105 Colo 38 humán melanóma sejt/ml koncentrációjú sejttömeget inkubálunk 10% FCS-et is tartalmazó RPMI 1640 tápközegben. A Colo 38-ból származó ME 1-sorozat SUN N-21-1 törzséből 2.105 sejt/ml-t tartalmazó 10 ml tenyészetet szintén inkubálunk 10% FCS-et is tartalmazó RPMI 1640 tápközegben. Egy másik, azonos mennyiségű SUN N-21-1 sejtet tartalmazó 10 ml-es tenyészetet inkubálunk olyan, 10% FCS-t is tartalmazó RPMI 1640 tápközegben, amely 8-azaguanint is tartalmaz 20 pg/ml végső koncentrációban. Mintákat veszünk és az élő sejtek számát minden egyes tenyészetben megszámoljuk. Az eredményeket a 3. ábrában mutatjuk be, amelyből az tűnik ki, hogy a SUN N-21-1 növekedése hasonló a Colo 38 humán melanóma sejt növekedéséhez és ezek a tapasztalatok csak kissé változnak még 8-azaguanin jelenlétében is.
A 8. példában készített hibridóma négy kiónja szintén a SUN N-21-1 növekedési profiljához hasonló növekedési profillal bír, bár ezt a 3. ábra nem mutatja be.
Claims (7)
- SZABADALMI IGÉNYPONTOK1. Eljárás fajlagos fehérjéket termelő hibridómák előállítására, azzal jellemezve, hogy állati (embert is beleértve) eredetű B sejteket humán melanóma sejtek, humán hepatoma sejtek vagy humán tüdó-karcinoma sejtek természetes vagy indukált mutációjával előállított sejtjeivel fuzionáltatunk.
- 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy antigénnel immunizált, állati (embert is beleértve) eredetű B sejteket használunk.
- 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy humán melanóma sejtként Colo 38 vagy M21 sejteket használunk.-919
- 4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy humán hepatoma sejtként HC C-4 sejteket használunk.
- 5. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy humán tüdő-karcinoma sejtként A549 sejteket használunk.
- 6. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy humán melanóma, hepatoma vagy tüdó-karcinóma sejtként hipoxantin-guanin-foszforibozil-transzferáz vagy timidin-kináz enzimhiányos sejteket használunk.
- 7. Eljárás monoklonális antitestek előál5 Utasára, azzal jellemezve, hogy valamely, az1. igénypont szerinti eljárással előállított, fajlagos fehérjéket termelő, hibridomát tenyésztünk, és a tenyészfolyadékból az antitestet elkülönítjük.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58007744A JPS59132885A (ja) | 1983-01-20 | 1983-01-20 | 新規細胞ライン |
| JP58007745A JPH0679553B2 (ja) | 1983-01-20 | 1983-01-20 | 新規な雑種細胞 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HU191984B true HU191984B (en) | 1987-04-28 |
Family
ID=26342092
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU84189A HU191984B (en) | 1983-01-20 | 1984-01-18 | Process for preparing hybridomes and by means thereof antibodies |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5126253A (hu) |
| EP (1) | EP0114670B1 (hu) |
| KR (1) | KR930005453B1 (hu) |
| AU (1) | AU569002B2 (hu) |
| CA (1) | CA1214123A (hu) |
| CH (1) | CH683526A5 (hu) |
| DE (1) | DE3485128D1 (hu) |
| DK (1) | DK23384A (hu) |
| FR (1) | FR2539759B1 (hu) |
| GB (1) | GB2134134B (hu) |
| HU (1) | HU191984B (hu) |
| IL (1) | IL70686A (hu) |
Families Citing this family (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4693975A (en) * | 1984-11-20 | 1987-09-15 | The Wistar Institute | Human hybridroma fusion partner for production of human monoclonal antibodies |
| US5126262A (en) * | 1984-12-20 | 1992-06-30 | Suntory Limited | Monoclonal antibody |
| EP0185135A3 (en) * | 1984-12-20 | 1988-07-13 | Suntory Limited | Novel monoclonal antibody |
| US5106746A (en) * | 1985-05-22 | 1992-04-21 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Process for the in vitro immunization of human splenocytes against tumor associated antigens |
| US6274552B1 (en) | 1993-03-18 | 2001-08-14 | Cytimmune Sciences, Inc. | Composition and method for delivery of biologically-active factors |
| US20010055581A1 (en) * | 1994-03-18 | 2001-12-27 | Lawrence Tamarkin | Composition and method for delivery of biologically-active factors |
| DE19634159C1 (de) * | 1996-08-23 | 1997-09-25 | Gsf Forschungszentrum Umwelt | Induktion einer Tumorimmunität durch Injektion von Hybridzellen |
| US7229841B2 (en) * | 2001-04-30 | 2007-06-12 | Cytimmune Sciences, Inc. | Colloidal metal compositions and methods |
| US6407218B1 (en) | 1997-11-10 | 2002-06-18 | Cytimmune Sciences, Inc. | Method and compositions for enhancing immune response and for the production of in vitro mabs |
| DE69833455T2 (de) * | 1997-11-10 | 2006-10-19 | Cytimmune Sciences, Inc. | Verfahren und zusammensetzungen zur verstärkung der immunantwort und zur in-vitro herstellung von monoklonalen antikörpern (mabs) |
| AU2004311630A1 (en) | 2003-12-02 | 2005-07-21 | Cytimmune Sciences, Inc. | Methods and compositions for the production of monoclonal antibodies |
| WO2005072893A1 (en) * | 2004-01-28 | 2005-08-11 | Cytimmune Sciences, Inc. | Functionalized colloidal metal compositions and methods |
| AU2008302035A1 (en) * | 2007-09-21 | 2009-03-26 | Cytimmune Sciences, Inc. | Nanotherapeutic colloidal metal compositions and methods |
| US20110014118A1 (en) * | 2007-09-21 | 2011-01-20 | Lawrence Tamarkin | Nanotherapeutic colloidal metal compositions and methods |
| CA2706700A1 (en) | 2007-11-08 | 2009-05-14 | Cytimmune Sciences, Inc. | Compositions and methods for generating antibodies |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4196265A (en) * | 1977-06-15 | 1980-04-01 | The Wistar Institute | Method of producing antibodies |
| DE2757169A1 (de) * | 1977-12-22 | 1979-07-05 | Hoechst Ag | Verfahren zur gewinnung insulin produzierender tierischer zellen |
| NZ198851A (en) * | 1980-11-07 | 1984-07-31 | Wistar Inst | Stable,continuous human myeloma cell line capable of hybridisation with antibody-producing cells:production of hybrid cell line |
| NO820248L (no) * | 1981-01-28 | 1982-07-29 | Coats Patons Plc | Fremgangsmaate ved fremstilling av monoklone antistoffer og celler istand til aa produsere slike antistoffer |
| US4434230A (en) * | 1981-08-12 | 1984-02-28 | Research Corporation | Human nonsecretory plasmacytoid cell line |
| JPS6011889B2 (ja) * | 1981-10-28 | 1985-03-28 | 電気化学工業株式会社 | 継代可能なリンホカイン産生ヒトｔ細胞融合株及びその取得方法 |
| GB2115005B (en) * | 1981-12-03 | 1984-11-14 | Cancer Research Campaign | Anti rat liver monoclonal antibody |
| CA1213229A (en) * | 1982-04-12 | 1986-10-28 | Gary S. David | Antibodies having dual specificities, their preparation and uses therefor |
| DE3245665A1 (de) * | 1982-05-04 | 1983-11-10 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Verfahren zur herstellung permanenter tierischer und humaner zellinien und deren verwendung |
| US4693975A (en) * | 1984-11-20 | 1987-09-15 | The Wistar Institute | Human hybridroma fusion partner for production of human monoclonal antibodies |
-
1984
- 1984-01-13 CA CA000445216A patent/CA1214123A/en not_active Expired
- 1984-01-13 IL IL70686A patent/IL70686A/xx not_active IP Right Cessation
- 1984-01-16 AU AU23510/84A patent/AU569002B2/en not_active Ceased
- 1984-01-17 GB GB08401151A patent/GB2134134B/en not_active Expired
- 1984-01-18 HU HU84189A patent/HU191984B/hu not_active IP Right Cessation
- 1984-01-19 DK DK23384A patent/DK23384A/da not_active Application Discontinuation
- 1984-01-19 FR FR8400828A patent/FR2539759B1/fr not_active Expired
- 1984-01-19 DE DE8484100548T patent/DE3485128D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1984-01-19 EP EP84100548A patent/EP0114670B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1984-01-19 KR KR1019840000221A patent/KR930005453B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1984-01-20 CH CH267/84A patent/CH683526A5/de not_active IP Right Cessation
-
1986
- 1986-09-25 US US06/912,678 patent/US5126253A/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU569002B2 (en) | 1988-01-14 |
| GB8401151D0 (en) | 1984-02-22 |
| DK23384D0 (da) | 1984-01-19 |
| EP0114670A2 (en) | 1984-08-01 |
| US5126253A (en) | 1992-06-30 |
| IL70686A (en) | 1988-07-31 |
| AU2351084A (en) | 1984-07-26 |
| FR2539759A1 (fr) | 1984-07-27 |
| DK23384A (da) | 1984-07-21 |
| GB2134134B (en) | 1986-06-18 |
| IL70686A0 (en) | 1984-04-30 |
| CA1214123A (en) | 1986-11-18 |
| EP0114670A3 (en) | 1987-01-21 |
| KR840007256A (ko) | 1984-12-06 |
| CH683526A5 (de) | 1994-03-31 |
| FR2539759B1 (fr) | 1988-03-25 |
| GB2134134A (en) | 1984-08-08 |
| EP0114670B1 (en) | 1991-10-02 |
| KR930005453B1 (ko) | 1993-06-22 |
| DE3485128D1 (de) | 1991-11-07 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4720459A (en) | Myelomas for producing human/human hybridomas | |
| HU191984B (en) | Process for preparing hybridomes and by means thereof antibodies | |
| Kao et al. | Genetics of somatic mammalian cells. IV. Properties of Chinese hamster cell mutants with respect to the requirement for proline | |
| CA1315715C (en) | Human cell line and triomas, antibodies, and transformants derived therefrom | |
| US4350683A (en) | Antibody production from hybrid cell line | |
| JPS61128886A (ja) | ヒト体細胞ハイブリドセルラインおよびその製造法 | |
| US20050221393A1 (en) | Method of increasing product expression through solute stress | |
| Olsson et al. | [1] Human-human monoclonal antibody-producing hybridomas: Technical aspects | |
| FI85282B (fi) | Foerfarande foer framstaellning av permanenta djur- och humancellinjer. | |
| JPS59169489A (ja) | ヒト培養株化細胞 | |
| US4806476A (en) | Efficient cell fusion process | |
| FI76118B (fi) | Foerfarande foer framstaellning av en hgprt-defekt leukemisk human-t-cellinje. | |
| US4407945A (en) | Constitutive production of interleukin 2 by a T cell hybridoma | |
| CA1312030C (en) | Method to increase antibody titer | |
| GB2108528A (en) | Process for preparing sub-culturable lymphokine-producing human T cell hybridomas | |
| EP0077571A2 (en) | Process for producing a lymphokine | |
| Shay | Human hybridomas and monoclonal antibodies: the biology of cell fusion | |
| SU1495374A1 (ru) | Штамм культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS - продуцент ростстимулирующих факторов гибридом | |
| JPS59132885A (ja) | 新規細胞ライン | |
| Neiders et al. | Murine Plasma Cells Secreting More Than One Class of Immunoglobulin Heavy Chain: III. Immunoglobulin Production by Established Cultures and Cloned Lines of SAMM 368 | |
| Di Sabato et al. | Production of thymocyte-stimulating factor by murine spleen lymphocytes: Cellular and biochemical mechanisms | |
| YAMAMOTO et al. | Macrophage-like chemotactic hybridomas active for various chemotactic factors | |
| SU1641884A1 (ru) | Штамм культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS L., используемый дл получени гибридомы | |
| Collavo et al. | Colony formation of cytolytic T cells in semisolid medium | |
| JPS63185374A (ja) | ヒト−ヒトハイブリド−マ作製用親細胞株 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| HU90 | Patent valid on 900628 | ||
| HMM4 | Cancellation of final prot. due to non-payment of fee |