HU188211B - Process and reagent for determining glycolyzed hemoglobine - Google Patents

Process and reagent for determining glycolyzed hemoglobine Download PDF

Info

Publication number
HU188211B
HU188211B HU823286A HU328682A HU188211B HU 188211 B HU188211 B HU 188211B HU 823286 A HU823286 A HU 823286A HU 328682 A HU328682 A HU 328682A HU 188211 B HU188211 B HU 188211B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
hemoglobin
glycosylated
haptoglobin
reagent
concentration
Prior art date
Application number
HU823286A
Other languages
English (en)
Inventor
Rolf Deeg
Urban Schmitt
Joachim Ziegenhorn
Original Assignee
Boehringer Mannheim Gmbh,De
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Boehringer Mannheim Gmbh,De filed Critical Boehringer Mannheim Gmbh,De
Publication of HU188211B publication Critical patent/HU188211B/hu

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/72—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood pigments, e.g. haemoglobin, bilirubin or other porphyrins; involving occult blood
    • G01N33/721—Haemoglobin
    • G01N33/723—Glycosylated haemoglobin
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/10—Composition for standardization, calibration, simulation, stabilization, preparation or preservation; processes of use in preparation for chemical testing
    • Y10T436/107497—Preparation composition [e.g., lysing or precipitation, etc.]

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Description

A találmány glikozilált hemoglobin vérmintákban való meghatározására szolgáló eljárásra vonatkozik.
Glikozilált hemoglobin (HbAj) a hemoglobin (HbA0) nem enzimatikus glikozilálásával keletkezik. Normálisan a glikozilált hemoglobin koncentrációja a vérben mintegy 5% az összhemoglobinra vonatkoztatva. Cukorbetegeknél ez a koncentráció a 2-4-szeresére emelkedik.
Az összhemoglobin glikozilált részének meghatározása az utóbbi években kapott jelentőséget a cukorbetegség-diagnosztikánál [lásd L. Jovanovic és C. M. Peterson, Am. J. Med. 70, 331-338 (1981)]. Az egyes hemoglobin molekulák és a glükóz közti reakció stabil reakcióterméket eredményez, amely az erithrociták egész élettartama alatt, tehát körülbelül 100-200 napig megmarad. A vércukortartalom rövididejű csökkenései a glikozilált hemoglobin koncentrációját döntően nem befolyásolják. A glikozilált hemoglobin koncentrációja ezért viszonylag pontosan tükrözi az átlagos glükózkoncentrációt egy paciens vérében hosszú időtartamon át.
Több eljárás ismeretes az összhemoglobin glikozilált részének meghatározására. Klinikai laboratóriumokban a legszélesebben kromatográfiás elválasztási eljárások terjedtek el. Ezeknél a hemoglobin glikozilált részét a nem glikozilálttól egy kromatográfiás oszlop, egy mikrooszlop segítségével vagy pedig a HPLC-módszer (HPLC = high pressure liquid chromatography = nagynyomású folyadékkromatográfia) segítségével választjuk el, amikor az oszlopok valamilyen ioncserélővel, például BioRex 70-nel vannak töltve. Mindezek a módszerek azonban nagyon érzékenyek a pHérték, a hőmérséklet, az ionkoncentráció változásaira. Az elválasztási eljárásokat ezért nagyon óvatosan kell elvégezni, hogy optimális eredményeket kapjunk (lásd az előbb hivatkozott irodalmat a 332. oldalon).
A 2 950 457 sz. német szövetségi köztársaságbeli nyilvánosságra hozatali iratból ismeretes egy eljárás a glikozilált hemoglobin vérmintákban való meghatározására, amelynek során egy vérminta spektroszkópiai tulajdonságainak egy allosztérikus effektor hozzáadásakor fellépő változásait hasznosítják a HbAt meghatározására. Ekkor csak a hemoglobin nem glikozilált főtömegét befolyásolják. A mért extinkciókülönbségek az illető tartományban nagyon kicsik. Azonkívül még kisebbek lesznek, ha az összhemoglobinban a glikozilált rész nő.
A találmány feladata ezért az volt, hogy egy olyan eljárást dolgozzon ki, amellyel a glikozilált hemoglobint gyors és technikailag egyszerűen elvégezhető módon, megbízhatóan és pontosan meg lehet határozni.
Ezt a feladatot a találmány szerinti eljárással oldottuk meg, amelynek során a vérmintának a hemoglobin eritrocitákböl való felszabadítását szolgáló kémiai és fizikai kezelése után a glikozilált és nem glikozilált hemoglobin-résznek haptoglobin segítségével való differenciálását hajtjuk végre, és vagy a hemoglobin és haptoglobin közötti reakciót követjük kinetikusán, vagy a hemoglobinnak a haptoglobinhoz kötött, illetve a haptoglobinhoz nem kötött részét mérjük ismert módszerekkel. A glikozilált és nem glikozilált hemoglobin differenciálása alatt valamennyi olyan módszert értjük, amelyek lehetővé teszik a glikozilált és nem glikozilált hemoglobin megkülönböztetését kémiai és fizikai tulajdonságaik alapján.
A jelen találmány tárgya tehát eljárás glikozilált hemoglobin meghatározására vérmintákban, amelynek során először a vérminta kémiai vagy fizikai kezelésével felszabadítjuk az eritrocitákböl a glikozilált és nem glikozilált hemoglobint, adott esetben a hemoglobint methemoglobinná alakítjuk, ezután a glikozilált és nem glikozilált hemoglobin differenciálását végezzük el, és végül a hemoglobin nem glikozilált vagy glikozilált részét is ismert módon meghatározzuk; a találmány szerinti eljárást az jellemzi, hogy a glikozilált és nem glikozilált hemoglobin differenciálását haptoglobin segítségével hajtjuk végre.
A találmány szerinti eljárás valamilyen alkalmas pufferrendszer jelenlétében hajtható végre. Alkalmas pufferrendszerként a találmány keretén belül minden 4,0-8,5, előnyösen 6,0-7,0 pH-érték között hatásos puffer alkalmazható. Különösen alkalmas a foszfát- és a bisz-trisz-pulfer.
A haptoglobin (Hp) plazmaprotein. Hosszú ideje ismeretes, hogy az eritrocitákböl szabaddá vált hemoglobint haptoglobin képes megkötni [lásd erre vonatkozólag T. Sasazuki, Immunochemistry 8, 695-704 (1971)].
Meglepő módon azt állapíthattuk meg, hogy a glikozilált és nem glikozilált hemoglobin kötődési viselkedésük szempontjából haptoglobinnal szemben eltérően viselkednek. A glikozilált hemoglobin gyorsabban kötődik a haptoglobinhoz, mint a nem glikozilált hemoglobin. Ez következik például egy haptoglobin-tartalmú mérőoldat fluoreszcenciaintenzitásának glikozilált és nem glikozilált hemoglobin hozzáadása utáni csökkenéséből. A fluoreszcenciasugárzás mérése, amely mérték a hemoglobin és haptoglobin közötti kölcsönhatásra, ismert módon történhet.
Az 1. ábrán a fluoreszcenciaintenzitás csökkenése látható mindkét mérőoldatra az idő függvényében. Látható, hogy a fluoreszcenciaintenzitás glikozilált hemoglobin hozzáadása után gyorsabban csökken, mint nem glikozilált hemoglobin hozzáadása után. Ez arra utal, hogy a haptoglobin és a glikozilált hemoglobin közötti kötési hatása erősebb, mint a haptoglobin és a nem glikozilált rész közötti.
Az összhemoglobin glikozilált részének meghatározására szolgáló eljárást célszerűen úgy hajtjuk végre, hogy először szokásos módszerek szerint szabaddá tesszük az eritrocitákböl a glikozilált és a nem glikozilált hemoglobint. A hemolizált vérmintát, adott esetben a hemoglobin methemoglobinná való átalakítására alkalmas valamilyen oxidálószer előzetes hozzáadása után, egy haptoglobint tartalmazó oldathoz adjuk. A hemoglobin glikozilált része előnyösen a haptoglobinhoz kötődik. A hemoglobin illetve methemoglobin kötött részének a nem kötöttől való megkülönböztetésére szokásos mérési módszereket alkalmazzunk. Különböző hemoglobintartalmú minták mérésével, ame-21 lyek különböző mennyiségű glikozilált hemoglobint tartalmaznak, felrajzolható egy olyan kalibrációs görbe, amelynek alapján ismeretlen mintákban lévő összhemoglobin glikozilált része meghatározható.
A glikozilált és nem glikozilált hemoglobinnak a haptoglobinnal szemben tanúsított kötési viselkedésében lévő különbség egy vagy több, az allosztérikus effektorhelyekre kötési hatással bíró vegyület hozzáadásával növelhető. Ilyen vegyületek ismertek. Példaként a következők említhetők: szerves foszforvegyiiletek, így 2,3-difoszfo-glicerinsav és az inozit-hexafoszfát, szerves szulfátok, így inozithexaszulfát, és karbonsavak, így a mellitsav.
A találmány szerinti eljárás egy előnyös foganatosítási módja szerint a glikozilált és nem glikozilált hemoglobin haptoglobin segítségével történő differenciálását a hemoglobin allosztérikus effektorhelyeire hatással levő egy vagy több vegyület hozzáadásával hajtjuk végre. A találmány szerinti eljárás végrehajtására a szakembereknek egy sor olyan anyag áll rendelkezésére, amely kötési hatással vannak az allosztérikus effektor-helyre. A találmány értelmében különösen alkalmas az inozin-hexafoszfát, 2,3-difoszfo-glicerinsav és mellitsav. Ezeket a hemoglobin-tartalomra vonatkoztatva legalább ekvivalens mennyiségben adjuk az oldathoz. Általában előnyös azonban, ha ezeket az anyagokat feleslegben, előnyösen 10-200-szoros moláris feleslegben használjuk.
Inozit-hexafoszfátnak glikozilált és nem glikozilált hemoglobin haptoglobinnal szembeni kötési viselkedésére gyakorolt befolyása a 2. ábrából látható. Ezen egy haptoglobint tartalmazó oldat fluoreszcenciaintenzitásának lefutása látható az idő függvényében inozit-hexafoszfát és nem glikozilált hemoglobin hozzáadása után. A mérési görbék lefutása egyértelműen mutatja, hogy inozit-hexafoszfát jelenlétében a glikozilált hemoglobin lényegesen gyorsabban kötődik haptoglobinhoz, mint a nem glikozilált hemoglobin.
Adott esetben célszerű a glikozilált és nem glikozilált hemoglobin differenciálása előtt a rendesen az eritrociták hemolízise után jelenlévő hemoglobint methemoglobinná átalakítani. A szakembernek erre a célra egy sor ismert módszer áll rendelkezésére, például kálium-[hexaciano-ferrát(in)]-mal vagy nátrium-nitrittel végzett oxidáció.
Előnyös mind a hemoglobint, mind adott esetben a methemoglobint egy vagy több hem-kötő ligandummal stabilizálni. Lényegében minden lehetséges hem-kötő ligandum megfelel a találmány szerinti eljárás részére. Különösen előnyösek az alkil-izocianidok, oxigén, szénmonoxid és nitrogénmonoxid a hemoglobin részére, valamint a fluoridok, azidok, cianidok és a víz hem-kötő ligandumokként a methemoglobin részére. A hem-kötő ligandumok koncentrációjának a mérőoldatban legalább ekvimolárisnak kell lennie a hem-koncentrációval. Mivel minden egyes hemoglobin molekula négy hem-maradékot tartalmaz, ennek a minimális koncentrációnak a hemoglobin-koncentráció négyszeresének kell megfelelni. Előnyösen azonban a hem-kötő ligandumokat is nagy, előnyösen lO-lOs-szeres moláris feleslegben alkalmazzuk.
Célszerű továbbá a mérőoldathoz haptoglobinnal való egyesítés előtt valamilyen ionkötés-stabilizáló szert hozzáadni. Ilyen, az ionos kötésre stabilizáló hatással bíró anyagok például polietilénglikolok és szacharóz.
A hemoglobin a vérben két alakban fordul elő: az oxi- és dezoxi-formában. A találmány szerinti eljárás esetében célszerű a hemolizált vérmintában lévő hemoglobint egységes formába hozni. Ez lehet mind az oxi- mind a dezoxi-forma is. Előnyösen a glikozilált és nem glikozilált hemoglobin differenciálása előtt az egész hemoglobin-tartalmat a dezoxi-formába alakítjuk át. Az oxi-forma dezoxiformába, illetve a dezoxi-forma oxi-formába való átalakítására szolgáló módszerek a szakembernek közismertek. Például az oxi-forma ditionit vagy más redukálószerek segítségével átalakítható a dezoxi-formává.
Egészen különösen előnyös a találmány szerinti eljárásnak az a kivitelezési formája, amelyben a hemolizált vérmintában lévő hemoglobint valamilyen redukálószerrel, például nátrium-ditionittal a dezoxi-formába alakítjuk, egy vagy több, az allosztérikus effektorheiyre kötési hatással rendelkező anyaggal és/vagy egy vagy több hemkötő ligandummal elegyítjük, és utána hozzuk érintkezésbe haptoglobinnal. Ezen a módon elérjük, hogy egy minta összhemoglobin-tartalmának csak a glikozilált részét köti meg a haptoglobin, és kvantitatíve meghatározható.
A haptoglobint a hemoglobinra számolva legalább ekvimoláris mennyiségben alkalmazzuk. Itt is előnyös azonban egy jelentős felesleg. Előnyösen a 2-50-szeres moláris mennyiséget alkalmazzuk.
A haptoglobin érintkezésbe hozható szabad formában a mérőoldattal. Ebben az esetben célszerűen az összhemoglobin glikozilált részletét határozzuk meg homogén fázisban, ismert módszerekkel. A glikozilált részlet például a fluoreszcenciakioltásos módszerrel mérhető Nagel és Gibson [J. Bioi. Chem. 242, 3428 (1967)] szerint. További lehetőség adódik szabad és haptoglobinhoz kötött hemoglobin pszeudoperoxidáz aktivitásának eltérő pHfüggöségéből [lásd Kawamura és mtsai., Biochem. Biophys. Acta 285, 22-27 (1972)].
Mivel a haptoglobin a hemoglobin természetes antitestjeként tekinthető, a haptoglobin és hemoglobin közötti kölcsönhatás meghatározására szolgáló további módszerekként bizonyos, az immundiagnosztikából ismert eljárások, így a radioimmun-analízis, enzimimmun-analízis és egyebek is számításba jönnek.
Az is lehetséges továbbá, hogy a haptoglobint valamilyen hordozón fixáljuk. Ebben az esetben a meghatározási eljárás úgy végezhető, hogy vagy
a) a haptoglobinnal preparált hordozót mártjuk a hemolizált, adott esetben előkezelt vérmintába, vagy
b) az előkezelt vérminta meghatározott mennyiségét cseppentjük a haptoglobin-hordozóra, vagy
c) meghatározott mennyiségű előkezelt vérmintával eluáljuk a haptoglobint a hordozóról.
Hordozóanyagként az analitikai kimutatási reagensekhez szokásos hordozók, így papír, cellulóz, műszálfilc, pórusos műanyagok és hasonlók megfe3 lelök. Az elkészítés haptoglobin-tartalmú oldatba való bemártással vagy ezzel való bepermetezéssel történhet.
A haptoglobin kovalensen köthető valamilyen oldhatatlan hordozóra is. Hordozóként minden szokásos, proteinek fixálására alkalmas hordozóanyag megfelel. A haptoglobinnak a hordozóanyaggal való kapcsolása a szakember által általánosan ismert módok valamelyike szerint történhet. A hordozóhoz kötött haptoglobint a hemolizált vérmintához adjuk hozzá, amely adott esetben a fent említett adalékanyagokkal van elegyítve. Elegendő érintkezési idő, például körülbelül 1 perc múlva az oldhatatlanná tett haptoglobint a megkötött gükozilált hemoglobin-résszel elválasztjuk, és a gükozilált hemoglobint szokásos módon vagy saját színe alapján közvetlenül fotometriásan vagy pszeudo-peroxidáz aktivitása alapján meghatározzuk.
A haptoglobin-tartalmú hordozó oszlopba töltve is alkalmazható, amelyen a hemolizált ás esetleges adalékokkal ellátott vérmintát átengedhetjük. A hemoglobin gükozilált része ennél az eljárásmódnál a hordozóhoz kötött haptoglobinon marad, és így könnyen elválasztható az oldatban maradt nem gükozilált hemoglobin-résztől. Ebben az esetben célszerű a meg nem kötött, nem gükozilált hemoglobin-részt azeluátumban meghatározni. A HbA,tartalom azután az összhemoglobin és a mért, nem gükozilált hemoglobin-rész különbségéből adódik.
A találmány tárgyát képezi továbbá a gükozilált hemoglobin vérmintában való, az erilrociták szokásos hemolízise utáni meghatározására szolgáló reagens, amit az jellemez, hogy
50-200 mmól/liter, 6,0-7,0 pH-értékű pufferrendszert,
20-160 mg/liter szabad vagy hordozóhoz kötött haptoglobint, valamint adott esetben
0,05-0,2 mmól/liter egy vagy több, az allosztérikus effektorhelyre kötési befolyással bíró anyagot,
0,5-100 mmól/liter egy vagy több hem-kötő ligandumot és/vagy
0,25-1000 mmól/liter ionos kötésekre stabilizáló hatású poühidroxi-vegyületet tartalmaz.
A találmány tárgya továbbá gükozilált és nem gükozilált hemoglobin differenciálására szolgáló olyan reagens, amely szabad vagy hordozóhoz kötött formában haptoglobint tartalmaz.
A mellékelt ábrák magyarázata a következő:
7. ábra: Haptoglobin oldat fluoreszcenciaintenzitásának felvétele gükozilált (1. görbe), illetve nem gükozilált (2. görbe) hemoglobin hozzáadása után. I, = fluoreszcenciaintenzitás t időpontra; l00 = fluoreszcenciaintenzitás a reakció lefutása után.
2. ábra: Haptoglobin oldat fluoreszcenciaintenzitásának felvétele gükozilált hemoglobin és inozithexafoszfát (1. görbe), illetve nem gükozilált hemoglobin és inozit-hexafoszfát (2. görbe) hozzáadása után.
1, = fluoreszcenciaintenzitás t időre;
Ioo = fluoreszcenciaintenzitás a reakció lefutása után.
3. ábra: A haptoglobinhoz kötött hemoglobin függése az összhemoglobinban lévő gükozilált hemoglobin százalékos részarányától.
A következő példák szemléltetik a találmányt:
1. példa:
Egy olyan oldatból, amely 0,3 mmól/liter kálijm-[hexaciano-ferrát(lll)]-at, 25 mmól/liter nátrium-fluoridot és 45,5 mg/liter humán eredetű haptoglobint (vegyes típusú) tartalmaz 100 mmól/liter koncentrációjú 6,7 pH-jú foszfátpuflerban, 2,2 ml-t adagolunk be egy mérőküvettába. Hozzáadunk 100 pl 0,05%-os gükozilált hemoglobin oldatot, amely szintén 0,3 mmól/liter kálium-fhexacianof’errát(111)]-at és 25 mmól/liter nátrium-fluoridot tartalmaz, majd utána időben követjük a fluoreszcenciaintenzitás lefutását (gerjesztési hullámhossz: 280 nm); emissziós hullámhossz: 330 nm). A mérési eredményt az 1. ábrán az 1. görbén ábrázoljuk.
Hasonló módon, mint az előbb leírtak, megmérjük a fluoreszcenciaintenzitás lefutását úgy is, hogy a mérőoldathoz a gükozilált hemoglobin helyett nem gükozilált hemoglobint adunk. Az eredményt az 1. ábrán a 2. görbén ábrázoljuk.
2. példa:
Az 1. példában megadottakhoz hasonlóan mérőoldatokat készítünk. A foszfát-pufler helyett azonban egy 0,05 mólos 6,7 pH-jú bisz-trisz-pufferl adunk hozzá. [Bisz-lrisz-pufler = N,N-bisz(2hidroxi-etil)-ímino-trisz(hidroxi-metil)-metán].
A gükozilált, illetve a nem gükozilált hemoglobin hozzáadása előtt a mérőoldatokhoz 0,2 mmól/liter inozit-hexafoszfátot adunk. A fluoreszcenciaintenzitás időbeli felvételét a 2. ábrán ábrázoljuk.
3. példa:
Hap tag lob in - Sepharose k észítése .
mg humán eredetű (vegyes típusú) haptoglobint (Fa. Bchringwerke AG) kapcsolunk 4 g brómciánnal aktivált Sepharose-zal Klein és Mihaesco eljárása szerint [Biochem. und Biophys. Research Commun. 52, 774-778 (1973)]. A kapott hordozóra kötött haptoglobulin-készítményt 16 g inaktív Sepharose hozzáadásával hígítjuk. így olyan Sepharose-hoz kötött haptoglobin-készítményt kapunk, amelynek kötési kapacitása 5 x 10” g hemoglobin/! g nedves készítmény.
A haptoglobin-Sepharose-hoz kötött hemoglobin meghatározása.
ml 0,05 mól/üter koncentrációjú 6,70 pH-jú bisz-lrisz-pufferral készített 8 x 10” mól/liter koncentrációjú hemoglobin oldatot a dezoxi-formába való átalakítás céljából körülbelül 5 mg nálriumdilionittal reagáltatunk. Ezután egymás után inozit-hexafoszfátot és n-butil-izocianidol adunk hozzá a következő koncentrációkban:
188 211.
Minta száma Hemoglo- bin Inozil-hexa- loszfát (mól/liter) it-Butil-izoeianid (mól/liter) Extinkció (ηιΕ)
1 HbA, 5 I0'5 0 0
? 1 IbA, 5 · 10 ' 5 · 10 4 1X8
3 HbA, 0 5 10 4 194
4 HbA„ 5 · ΚΓ5 0 0
5 HbA,, 5 · 10 5 5 · 10 4 0
6 HbA„ 0 5 10 4 1X4
Az oldatot 160 mg előbb leírt módon előállított haploglobin-Sepharose preparátummal 1 percen át rázás közben intenzíven elegyítjük. Utána ditioniltartalmú pufferral, majd kétszer csak pufferral mossuk, és a felülúszótól elválasztjuk.
A haptoglobin-Sepharose-ra kötött hemoglobint pszeudo-peroxidáz aktivitása alapján gvajakollal ismert módon határozzuk meg. Ezen célból a centrifugált haptoglobin-Sepharose-hoz 1 ml 30 mmól/ liter koncentrációjú gvajakol-oldatot adunk 0.1 mól/liter töménységű 4,0 pH-jú acetátpufferban. A reakciót ezután 50 μΐ 1 %-os hidrogén-peroxid oldattal beindítjuk. Az elegyet 5 perc reakcióidő után lecentrifugáljuk a Sepharose-ról, és a keletkezett színezék extinkcióját a felülúszóban 436 miinél lemérjük. A talált extinkcióértékeket az előbb megadott összeállításban tüntettük fel.
A talált extinkcióértékek azt mutatják, hogy egyedül inozit-hexafoszfát jelenlétében sem a glikozilált, sem a nem glikozilált hemoglobint nem köti mega haptoglobin-Sepharose. n-Butil-izocianid jelenlétében inozit-hexafoszfát hozzáadása nélkül a haptoglobin és mind a nem glikozilált, mind a glikozilált hemoglobin között kölcsönhatás jön létre. A nem glikozilált és glikozilált hemoglobin közötti különbségtétel nagyon jó pontossággal akkor lehetséges, ha a mintához inozit-hexafoszfátot és n-butil-izocianidot adunk. Az előbb felsorolt extinkeióértékek azt mutatják, hogy ebben az esetben a hemoglobinnak csak a glikozilált része kötődik a haptoglobin-Sepharose-hoz.
4. példa:
ml 0,05 mól/liter koncentrációjú 6,70 pH-jú bisz-trisz-pufferral készült 8 x 107 mól/liter töménységű hemoglobin oldatot a dezoxi-formába való átalakítás céljából körülbelül 5 mg nátriumditionittal reagáltatunk. Hozzáadunk 25 μΐ 0,1 mól/liter koncentrációjú nátrium-nitrit oldatot. Körülbelül 5 perc reakcióidő után inozit-hexafoszfálot adunk hozzá a következő koncentrációkban:
Minta száma Hemo- globin Inozit-hexafoszfát (mól/liter) Extinkció (rnE)
1 HbA, 0 224
2 HbA, 5 icrs 190
3 HbA„ 0 219
4 HbA0 5 · 10s 16
Az oldatot 160 mg haptoglobin-Sepharosekészítménnyel - amelyet a 3. példában megadottakhoz hasonlóan állítottunk elő - rázás közben egy percig intenzíven elegyítjük, és a 3. példában leírtakhoz hasonló módon kezeljük tovább.
A haptoglobin-Sepharose-hoz kötött hemoglobin-részt a 3. példában megadottakhoz hasonlóan határozzuk meg. A talált extinkciós értékeket az előbbi összeállításban tüntettük fel.
A talált extinkcióértékek azt mutatják, hogy inozit-hexafoszfát jelenlétében a glikozilált hemoglobin sokkal erősebb mértékben kötődik a haptoglobin-Sepharose-hoz, mint a nem glikozilált hemoglobin-forma.
5. példa:
A 3. példában megadott módon olyan hemoglobin tartalmú mintákat állítunk elő, amelyekben a glikozilált hemoglobin rész 0-100%-ig terjed. A mintákat mindenkor 5 mg nátrium-ditionittal, 5 x 10 5 mól/liter inozit-hexafoszfáttal és 5 x 10 4 mól/liter n-butil-izocianiddel elegyítjük, és a 3. példában megadottak szerint kezeljük tovább. Haptoglobinreagensként egy haptoglobin-Sepharosepreparátumot használunk, amelyet a 3. példában megadottakhoz hasonló módon állítunk elő, azonban kötési kapacitása 1,7 x 10~8 mól hemoglobin/ g preparátum. A 3. ábrán a talált extinkcióértékeket az összhemoglobin glikozilált hemoglobin százalékos részének függvényében adjuk meg.
A 3 ábrán megadott standardgörbe segítségével határozható meg egy mintában lévő ismeretlen glikozilált hemoglobin-tartalom az itt megadott eljárással
6. példa:
Az 1. és 2. példában leírtakkal analóg módon eljárva oxihemoglobint (hemolizátum mosott eritrocitákból) 0,05% koncentrációjú oldattá oldunk 50 mmól/liter, 6,7 pH-értékű bisz-trisz-pufferben. Ennek az oldatnak egy részét inozit-hexafoszfáttal elegyítjük, 0,2 mmól/liter koncentráció eléréséig. A hemoglobin-oldat 100-100 pliterét 2,2 ml olyan haptoglobin-oldattal (45,5 mg haptoglobin, 50 mmól/liter, 6,7 pH értékű bisz-trisz-pufferben) keverjük össze, amely járulékosan az alábbi - ionos kötésekre stabilizáló hatású - anyagokat tartalmazza, a Táblázatban megadott mennyiségben:
Adalékanyag Koncentráció A félig maximális [g/liter] fluoreszcencia-kioltásig terjedő idő inozit-hexa- inozil-hcxafoszlát foszfát lávollétében jelenlétében
nélkül 1.40 s 5.5 s
szacharóz 10 0.X0 s 7.0 s
glicerin 10 1.25 s 6.X s
glicerin 100 0,75 s 1 l.x s
PEG4 40 000 10 0.90 s 10.3 s
PEG4 40 000 100 2,25 s 35.0 s
4polietilénglikol
A hemoglobin haptoglobinon való kötési reakciója sebességének mértékéül azt az. időtartamot mértük.
188 211 ami a léiig maximális fluoreszcencia-kioltásig eltelt. A mért értékeket a Táblázat tartalmazza.
A Táblázat adataiból kitűnik, hogy az adalékanyagok egyedül hemoglobinra - a kísérleti ingadozásoktól eltekintve - kevés befolyást gyakorolnak, ezzel szemben az inozit-hexafoszfát hatását szignifikánsan növelik. Ez a hatás az inozit-hexafoszfát hemoglobinon való kötésének stabilizálására vezethető vissza.
Ismert mennyiségű glikozilált hemoglobint tartalmazó standard-minták analóg mérésével és kiértékelésével kalibrációs görbét készítünk, amelyből az ismeretlen minták HbA,-értéke megállapítható.

Claims (5)

  1. A következő reagenseket készítjük el:
    la jelű reagens: 200 mmólos bisz-trisz-puffer, pH
    6,0(6,5)7,0 szaponin 0,1 g/liter 0,1 g/liter digitonin
    1b jelű reagens: mint az la jelű, de 0,08 mmól/ liter koncentrációban járulékosan még inozit-hexafoszfátot is oldunk benne
    II jelű reagens: 7 mmólos bisz-trisz-puffer, pH 6,0(6,5)7,0 2 mmól/liter 2,2'-azino-di-[3-etil-benztiazolin-szulfonát(6)] 20 mg/liter haptoglobin 0,2 g/ml szacharóz
    III jelű reagens: 0,5 mólos citrát-puffer, Ph 3,8 30 mmól/liter nátrium-perborát, 3 g/liter szaponin.
    Egészséges egyéntől származó, mosott eritrocitákat az la jelű reagenssel 0,5 mg/ml hemoglobinkoncentrációra hígítunk, ennek során az eritrociták detergensek hatására gyorsan hemolízist szenvednek.
    A hemolízátumot szilárd nátrium-ditionittal 50 mg/ml koncentrációig és szilárd nátrium-nitrittel 5 mg/ml koncentrációig elegyítjük. Szobahőmérsékleten való rövid inkubálás után az előkezelt hemolizátum egy-egy alikvot részét az la és az Ib jelű reagenssel 0,5 mg/liter hemoglobin-koncentrációra állítjuk be és hígított oldatokat Abbot VP automata elemzökészülék mintaedényeibe töltjük. A készülék az oldat 2,5 gliterét összekeveri a II jelű reagens 250 gliterével, 40 másodpercig inkubál 25 °C-on, és indítja a peroxidáz-reakciót 150 gliter III jelű reagens hozzáadásával. A peroxidáz-reakciót 2 percen keresztül követjük az extinkció növekedésének mérésével, a 415/450 nm-es szűrőkombináció alkalmazásával és a reakciósebességet ΔΕ/2 minben fejezzük ki.
    Az íb jelű reagensek a mintához való hozzáadásánál kapott reakciósebességet az la jelű reagenssel mérttel elosztjuk.
    Az alábbi Táblázat mérési adataiból kitűnik, hogy az allosztérikus effektor a teljes pH-tartományban hatásos.
    1. Eljárás glikozilált hemoglobin meghatározására vérmintákban, amelynek során először a vérminta kémiai vagy fizikai kezelésével az eritrocitákból szabaddá tesszük a glikozilált és nem glikozilált hemoglobint, adót esetben a hemoglobint methemoglobinná alakítjuk át, utána a glikozilált és nem glikozilált hemoglobin differenciálását hajtjuk végre, és végül meghatározzuk a hemoglobin glikozilált részét, azzal jellemezve, hogy a glikozilált és nem glikozilált hemoglobin differenciálását haptoglobinon való kötéssel végezzük.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a glikozilált és nem glikozilált hemoglobin differenciálását valamilyen alkalmas pufferrendszer és/vagy konformációváltozást okozó anyagként 2,3-difoszfo-glicerinsav, inozit-hexafoszfát, inozithexaszulfát vagy mellitsav, illetve hem-kötő ligandumokként alkil-izocianid, oxigén, szén-monoxid, nitrogén-monoxid, fluorid, azid, cianid vagy víz jelenlétében végezzük.
  3. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a haptoglobint a hemoglobinhoz képest 250-szeres feleslegben alkalmazzuk.
  4. 4. Reagens glikozilált hemoglobin meghatározására vérmintákban, az eritrociták szokásos hemolizise után, azzal jellemezve, hogy
    50-200 mmól/liter, 6,0-7,0 pH-értékü pufferrendszert,
    20-160 mg/liter szabad vagy hordozóhoz kötött haptoglobint, valamint adott esetben
    0,05-0,2 mmól/liter egy vagy több, az allosztérikus effektorhelyre kötési befolyással bíró, konformáció-változást okozó anyagot,
    0,5-100 mmól/liter egy vagy több hem-kötő ligandumot és/vagy
    0,25-1000 mmól/liter ionos kötésekre stabilizáló hatású polihidroxi-vegyületet tartalmaz.
  5. 5. Reagens glikozilált és nem glikozilált hemoglobin differenciálására, azzal jellemezve, hogy 20-160 mg/liter haptoglobint tartalmaz szabad vagy hordozóhoz kötött formában.
HU823286A 1981-10-16 1982-10-15 Process and reagent for determining glycolyzed hemoglobine HU188211B (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19813141146 DE3141146A1 (de) 1981-10-16 1981-10-16 Verfahren und reagens zur bestimmung von glykosiliertem haemoglobin

Publications (1)

Publication Number Publication Date
HU188211B true HU188211B (en) 1986-03-28

Family

ID=6144259

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU823286A HU188211B (en) 1981-10-16 1982-10-15 Process and reagent for determining glycolyzed hemoglobine

Country Status (14)

Country Link
US (1) US4438204A (hu)
EP (1) EP0077515B1 (hu)
JP (1) JPS5879163A (hu)
AT (1) ATE12318T1 (hu)
AU (1) AU537363B2 (hu)
CA (1) CA1199257A (hu)
DD (1) DD203778A5 (hu)
DE (2) DE3141146A1 (hu)
DK (1) DK157047C (hu)
ES (1) ES8306406A1 (hu)
FI (1) FI73088C (hu)
HU (1) HU188211B (hu)
IE (1) IE53534B1 (hu)
ZA (1) ZA827547B (hu)

Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3314308A1 (de) * 1983-04-20 1984-10-25 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim Verfahren und reagens zur bestimmung des haemoglobin-haptoglobin komplexes in gegenwart von freiem haemoglobin
DE3532868A1 (de) * 1985-09-14 1987-03-26 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren und reagenz zur bestimmung von glykosiliertem haemoglobin sowie hierzu geeignete verbindungen und verfahren zu deren herstellung
US4837170A (en) * 1986-01-20 1989-06-06 Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. Monoclonal antibody, measuring method of glucosylated protein by utilizing the monoclonal antibody, and kit therefor
EP0299419B1 (en) * 1987-07-14 1993-10-20 Kabushiki Kaisha Kyoto Daiichi Kagaku Automatic measurement method of glycohemoglobin
US4970171A (en) * 1987-11-09 1990-11-13 Miles Inc. Denaturant reagents for convenient determination of hemoglobin derivatives in blood
JP3032891B2 (ja) * 1989-03-04 2000-04-17 吉富製薬株式会社 遊離ヘモグロビン測定用試薬キット及びそれを用いる遊離ヘモグロビンの測定法
US5484735A (en) * 1989-08-23 1996-01-16 Northwestern University Immunoassay of glycosylated proteins employing antibody directed to reductively glycosylated N-terminal amino acids
CA2591834C (en) * 1992-03-04 2009-04-28 Abbott Laboratories Determination of glycated hemoglobin by fluorescence quenching
US5739037A (en) * 1992-09-29 1998-04-14 Drew Scientific Limited Process for eliminating labile glycohaemoglobin from a sample
CA2148483A1 (en) * 1992-11-03 1994-05-11 Alexander Saunders Methods and procedures for preparing red blood fractions
US5424447A (en) * 1993-07-07 1995-06-13 The Medical College Of Wisconsin Research Foundation, Inc. Heme binding compounds and use thereof
US6174734B1 (en) 1997-10-24 2001-01-16 Abbott Laboratories Measurement of glycated hemoglobin
DE19856433C2 (de) * 1998-12-08 2001-09-13 Aventis Behring Gmbh Verfahren zum spezifischen Nachweis von glykosilierten Proteinen
DE102009053225A1 (de) * 2009-11-06 2011-05-12 Deutsche Sporthochschule Köln Verfahren zur Bestimmung der totalen Hämoglobinmenge im Körper eines Lebewesens
US20130130391A1 (en) * 2010-03-31 2013-05-23 Hiroaki Taira Method of analyzing hemoglobins

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3350174A (en) * 1964-01-08 1967-10-31 Miles Lab Process of determining hemoglobin separated from peroxidase inhibitors in urine
US4189304A (en) 1978-10-27 1980-02-19 Miles Laboratories, Inc. Device and method for detecting myoglobin
US4200435A (en) * 1978-12-26 1980-04-29 Abbott Laboratories Determination of glycosylated hemoglobin in blood
US4268270A (en) * 1979-04-30 1981-05-19 Children's Hospital Medical Center Glycosylated hemoglobin measurement
US4255385A (en) 1979-10-23 1981-03-10 Abbott Laboratories Reagent and test kit for determining glycosylated hemoglobin
US4371374A (en) 1980-11-17 1983-02-01 The Rockefeller University Monitoring metabolic control in diabetic patients by measuring glycosylated amino acids and peptides in urine

Also Published As

Publication number Publication date
DE3262693D1 (en) 1985-04-25
AU537363B2 (en) 1984-06-21
ZA827547B (en) 1983-09-28
EP0077515A2 (de) 1983-04-27
ATE12318T1 (de) 1985-04-15
FI823454A0 (fi) 1982-10-11
AU8889682A (en) 1983-04-21
IE822493L (en) 1983-04-16
US4438204A (en) 1984-03-20
FI73088C (fi) 1987-08-10
DD203778A5 (de) 1983-11-02
JPS5879163A (ja) 1983-05-12
EP0077515A3 (en) 1983-08-17
JPH0153748B2 (hu) 1989-11-15
FI823454L (fi) 1983-04-17
ES516496A0 (es) 1983-06-01
DK458682A (da) 1983-04-17
DE3141146A1 (de) 1983-04-28
CA1199257A (en) 1986-01-14
IE53534B1 (en) 1988-12-07
DK157047B (da) 1989-10-30
DK157047C (da) 1990-04-02
FI73088B (fi) 1987-04-30
ES8306406A1 (es) 1983-06-01
EP0077515B1 (de) 1985-03-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US5589393A (en) Method for preparing a glycated hemoglobin solution
US4200435A (en) Determination of glycosylated hemoglobin in blood
EP2813854B1 (en) Hemolysis reagent composition for hemoglobin a1c quantitative analysis using enzymatic method
HU188211B (en) Process and reagent for determining glycolyzed hemoglobine
JP5568636B2 (ja) キャピラリー電気泳動による糖化ヘモグロビンの分析およびアッセイ、緩衝組成物およびキャピラリー電気泳動のためのキット
US4255385A (en) Reagent and test kit for determining glycosylated hemoglobin
US8546144B2 (en) Method of preparing controls for glycated hemoglobin S-A1c derived from healthy blood cells
HU186508B (en) Process and reagent for determining glyco-hemoglobin-content during continuous control of blood-sugar level
US8551784B2 (en) Cis di-ahl modified controls for glycated hemoglobin S-A1c derived from healthy blood cells
JPH0698027B2 (ja) 体液中のフルクトサミンの測定方法および試薬
JP2000333696A (ja) 糖化アミンの測定方法
HU206157B (en) Method for detecting hemoglobin
JP4144117B2 (ja) グルコースの測定方法及び測定装置
JP2694004B2 (ja) 血清又は血漿中のフルクトサミンの測定法
US5227305A (en) Buffer solution systems for standardizing pH analyzers and electrolytes
JP3181390B2 (ja) タンパク質の糖化割合の測定方法
Deeg et al. A new approach to photometry of glycated hemoglobin in human blood.
Rose et al. A hemoglobin A1C immunoassay method not affected by carbamylated hemoglobin
JP3292766B2 (ja) 糖化蛋白の測定方法
JPH0411824B2 (hu)
JPH08262027A (ja) 全ヘモグロビン含量測定用試薬
Tornqvist et al. Pre‐HbA1c in children with insulin dependent diabetes mellitus
JP2002527076A (ja) ヘモグロビン妨害を排除しつつアルカリホスファターゼを測定する方法
JPH0484768A (ja) 糖付加アルブミン測定方法および測定用試薬
JPH02259467A (ja) 不安定型糖化ヘモグロビン解離剤

Legal Events

Date Code Title Description
HU90 Patent valid on 900628
HMM4 Cancellation of final prot. due to non-payment of fee