FI73088B - Foerfarande och reagens foer bestaemning av glykosilerat hemoglobin. - Google Patents
Foerfarande och reagens foer bestaemning av glykosilerat hemoglobin. Download PDFInfo
- Publication number
- FI73088B FI73088B FI823454A FI823454A FI73088B FI 73088 B FI73088 B FI 73088B FI 823454 A FI823454 A FI 823454A FI 823454 A FI823454 A FI 823454A FI 73088 B FI73088 B FI 73088B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- hemoglobin
- glycosylated
- haptoglobin
- glycosylated hemoglobin
- determination
- Prior art date
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/72—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood pigments, e.g. haemoglobin, bilirubin or other porphyrins; involving occult blood
- G01N33/721—Haemoglobin
- G01N33/723—Glycosylated haemoglobin
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
- Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10T436/10—Composition for standardization, calibration, simulation, stabilization, preparation or preservation; processes of use in preparation for chemical testing
- Y10T436/107497—Preparation composition [e.g., lysing or precipitation, etc.]
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
1 73088
Menetelmä ja reagenssi glykosiloituneen hemoglobiinin määrittämiseksi
Keksintö koskee menetelmää glykosiloituneen hemoglobiinin määrittämiseksi verinäytteistä.
Glykosiloitunut hemoglobiini (HbA^) muodostuu hemoglobiinin (HhA^) ei-entsymaattisen glykosiloitumisen kautta. Normaalisti glykosiloituneen hemoglobiinin pitoisuus veressä on noin 5 % hemoglobiinin kokonaismäärästä laskettuna. Diabeetikoilla on tämä pitoisuus kaksin- tai nelinkertainen.
Glykosiloituneen osan määrittäminen hemoglobiinin kokonaismäärästä on viime vuosina tullut merkittäväksi diabetes-diagnostiikassa (vrt. L. Jovanovic ja C.M. Peterson, Am.J.Med. 7_0 (1981) ss, 331-338). Yksittäisten hemoglobiini-molekyylien ja glukoosin välisessä reaktiossa muodostuu stabiili reaktiotuote, joka säilyy punasolujen koko elinajan, siis noin 100-200 vuorokautta. Lyhytaikaiset veren sokeripitoisuuden vaihtelut eivät vaikuta glykosiloituneen hemoglobiinin pitoisuuteen merkittävästi. Glykosiloituneen hemoglobiinin pitoisuus heijastaa näin ollen suhteellisen tarkasti potilaan veren keskimääräistä sokeripitoisuutta pitemmän ajanjakson kuluessa.
Ennestään tunnetaan useita hemoglobiinin kokonaismäärän sisältämän glykosiloituneen osan määritysmenetelmiä. Kro-matograafinen erotusmenetelmä on eniten käytetty kliinisissä laboratorioissa. Tällöin glykosiloitunut hemoglobiini-osa erotetaan ei-glykosiloituneesta kromatografiapylvään avulla käyttämällä mikropylvästä tai HPLC-menetelmää (HPLC = High pressure liquid chromatography) siten, että pylväät on täytetty ioninvaihtimellä, kuten "BioRex 70":llä. Kaikki nämä menetelmät ovat kuitenkin hyvin herkkiä pH-arvon, lämpötilan ja ionipitoisuuksien vaihteluille. Siksi 2 73088 erotus täytyy suorittaa hyvin varovaisesti, jotta saavutettaisiin optimaalisia tuloksia (vrt, s. 332 edellä mainitussa viitteessä).
Saksalaisesta Offenlegungsschrift-julkaisusta n:o 29 50 457 tunnetaan menetelmä glykosiloituneen hemoglobiinin määrittämiseksi verinäytteistä siten, että käytetään hyväksi verinäytteen spektroskooppisten ominaisuuksien muutosta, kun lisätään allosteeristä efektoria HbA^:n määrittämiseksi. Tällöin vaikutetaan pelkästään hemoglobiinin gly-kosiloitumattomaan pääosaan. Mitatut ekstinktioerot ovat relevantilla alueella hyvin pieniä. Sitäpaitsi ne vielä pienenevät, kun hemoglobiinin kokonaismäärän sisältämä glykosiloitunut osa kasvaa.
Näin ollen tämän keksinnön tarkoituksena on tarjota menetelmä, jolla glykosiloitunut hemoglobiini voidaan määrittää luotettavasti ja tarkasti nopealla ja teknisesti yksinkertaisella toteutettavalla tavalla.
Tämä on keksinnön mukaisessa menetelmässä ratkaistu siten, että verinäyte käsitellään kemiallisesti tai fysikaalisesti siten, että hemoglobiini vapautuu punasoluista, ja sen jälkeen glukosiloitunut ja glykosiloitumaton hemoglo-biiniosa erotetaan toisistaan haptoglobiinin avulla ja joko seurataan kineettisestä hemoglobiinin ja haptoglobiinin välistä reaktiota tai mitataan tunnetuilla menetelmillä haptoglobiiniin sidottu osa hemoglobiinista tai haptoglo-biiniin sitoutumaton osa hemoglobiinista. Glykosiloidun ja glykosiloitumattoman hemoglobiinin toisistaan erottamis-menetelmillä tarkoitetaan kaikkia sellaisia menetelmiä, joilla glykosiloitu ja glykosiloitumaton hemoglobiini voidaan määrittää kemiallisten ja fysikaalisten ominaisuuksien perusteella.
Näin ollen tämä keksintö koskee menetelmää glykosiloituneen hemoglobiinin määrittämiseksi verinäytteistä siten, 73088 että ensin punasoluista vapautetaan glykosiloitu ja gly-kosiloitumaton hemoglobiini käsittelemällä verinäyte kemiallisesti tai fysikaalisesti ja mahdollisesti hemoglobiini muunnetaan methemoglobiiniksi ja sen jälkeen glykosi-loitunut ja glukosiloitumaton hemoglobiini erotetaan toisistaan ja lopuksi glykosiloitunut tai myös glykosiloitu-maton hemoglobiini määritetään tunnetulla tavalla, ja menetelmälle on tunnusomaista se, että glykosiloitunut ja glykosiloitumaton hemoglobiini erotetaan toisistaan hapto-globiinin avulla.
Keksinnön mukainen menetelmä voidaan suorittaa sopivan puskurijärjestelmän läsnäollessa. Sopivina puskurijärjestelminä voidaan keksinnön puitteissa käyttää kaikkia pH-alueella 4,0-8,5, sopivimmin 6,0-7,0 vaikuttavia puskureita. Erikoisen edullisiksi ovat fosfaatti- ja bis-tris-puskurit osoittautuneet.
Haptoglobiini (Hp) on plasmaproteiini . On jo pitkään ollut tunnettua, että haptoglobiini kykenee liittymään punasoluista vapautuneeseen hemoglobiiniin (vrt. T. Sasazuki, Immunochemistry {3 (1971) ss. 695-704).
Nyt on yllättäen havaittu, että glykosiloitunut ja glykosiloitumaton hemoglobiini eroavat toisistaan haptoglobiiniin sitoutumisensa suhteen. Glvkosiloitunut hemoglobiini sitoutuu haptoglobiiniin nopeammin kuin glykosiloitumaton hemoglobiini. Tämä ilmenee esim. haptoglobiinia sisältävän mittausliuoksen fluoresenssi-intensiteetin vähenemisenä, kun lisätään glykosiloitunutta tai glykosiloitumatonta hemoglobiinia. Fluoresenssisäteily, joka on hemoglobiinin ja haptoglobiinin välisen vuorovaikutuksen mitta, voidaan määrittää sinänsä tunnetulla tavalla.
Kuviossa 1 on esitetty kummankin mittausliuoksen fluoresenssi-intensiteetin väheneminen ajan suhteen. Käyristä 4 73088 voidaan havaita, että fluoresenssi-intensiteetti vähenee glykosiloituneen hemoglobiinin lisäyksen jälkeen nopeammin kuin glykosiloitumattoman hemoglobiinin lisäyksen jälkeen. Tämä viittaa siihen, että sitoutuminen haptoglo-biinin ja glykosiloituneen hemoglobiinin välillä on tehokkaampaa kuin haptoglobiinin ja glykosiloitumattoman hemoglobiinin välillä.
Hemoglobiinin kokonaismäärän sisältämän glykosiloituneen osan määritys on menetelmän mukaisesti tarkoituksenmukaista suorittaa siten, että ensin glykosiloitunut ja glykosi-loitumaton hemoglobiini vapautetaan punasoluista tavallisilla menetelmillä. Hemolysoituun verinäytteeseen, jonka hemoglobiini on mahdollisesti ensin sopivaa hapetusainet-ta lisäämällä muunnettu methemoglobiiniksi, lisätään hap-toglobiinia sisältävä liuos. Hemoglobiinin glykosiloitunut osa sitoutuu ensisijaisesti haptoglobiiniin. Sitoutunut ja sitoutumaton hemoglobiini tai methemoglobiini määritetään tavallisilla menetelmillä. Mittaamalla erilaisia hemoglobiinipitoisia näytteitä, joiden glykosiloituneen hemoglobiinin pitoisuus vaihtelee, voidaan piirtää kalib-rointikäyrä, jonka avulla voidaan määrittää tuntemattomien näytteiden sisältämä glykosiloituneen hemoglobiinin osuus.
Kun lisätään yhtä tai useampaa yhdistettä, jolla on sito-misvaikutus allosteeriseen efektorikohtaan, voidaan voimistaa sitä eroa, joka esiintyy glykosiloituneen ja glykosiloitumattoman hemoglobiinin sitoutumisessa haptoglobiiniin. Tällaiset yhdisteet ovat ennestään tunnettuja. Esimerkkeinä voidaan mainita orgaaniset fosforiyhdisteet, kuten 2,3-difosfoglyseraatti ja inosiittiheksafosfaatti, ja orgaaniset sulfaatit, kuten inosiittiheksasulfaatti, ja karboni-hapot, kuten melliittihappo.
Keksinnön mukaisen menetelmän edullisen toteutusmahdollisuuden mukaan suoritetaan glykosiloituneen ja glykosiloi- 5 73088 tumattoman hemoglobiinin erottaminen toisistaan haptoglo-biinin avulla siten, että lisätään yhtä tai useampaa sellaista yhdistettä, jolla on sitomisvaikutus hemoglobiinin allosteeriseen efektorikohtaan. Keksinnön mukaisen menetelmän toteuttamiseksi on asiantuntijalla käytettävissä lukuisia yhdisteitä, joilla on sitomisvaikutus allosteeriseen efektorikohtaan. Keksinnön kannalta ovat inosiitti-heksafosfaatti, 2,3-difosfoglyseraatti ja melliittihappo erittäin sopivia. Niitä lisätään liuokseen vähintään ek-vivalenttinen määrä hemoglobiinimäärän mukaan laskettuna. Yleensä on kuitenkin edullista käyttää näitä yhdisteitä ylimäärin, mielellään kymmen-kaksisataakertainen molaari-nen ylimäärä.
Kuviosta 2 ilmenee inosiittiheksafosfaatin vaikutus siihen sitoutumiskäyttäytymiseen, joka glykosiloituneella ja glykosiloitumattomalla hemoglobiinilla on haptoglobiinin suhteen. Tässä esitetään haptoglobiinia sisältävän liuoksen fluoresenssi-intensiteetin väheneminen ajan suhteen inosiittiheksafosfaatin ja glykosiloitumattoman hemoglobiinin lisäyksen jälkeen. Mittauskäyrien kulku osoittaa selvästi, että inosiittiheksafosfaatin läsnäollessa gly-kosiloitunut hemoglobiini sitoutuu haptoglobiiniin oleellisesti nopeammin kuin glykosiloitumaton hemoglobiini.
Saattaa olla tarkoituksenmukaista muuntaa normaalisti punasolujen hemolyysin jälkeen esiintyvä hemoglobiini met-hemoglobiiniksi ennen glykosiloituneen ja glykosiloitumattoman hemoglobiinin erottamista toisistaan. Ammatti-ihmi-sellä on tähän tarkoitukseen käytettävissä lukuisia tunnettuja menetelmiä, kuten hapetus kalium-heksasyanofer-raatti-(III) :11a tai natriumnitriitillä.
On edullista stabiloida sekä hemoglobiini että mahdollinen methemoglobiini yhdellä tai useammalla heemejä sitovalla ligandilla. Periaatteessa voidaan keksinnön mukaisessa menetelmässä käyttää kaikkia mahdollisia heeminsitoja ligande ja .
6 73088
Erityisen edullisia heeminsitojaligandeja hemoglobiinille ovat alkyyli-isosyanidit, happi, hiilimonoksidi ja typpi-monoksidi ja methemoglobiinille fluoridi, atsidi, syanidi ja vesi. Heeminsitojaligandien väkevyyden mittausliuokses-sa pitää olla vähintään ekvimolaarinen heemiväkevyyden kanssa. Koska jokaisessa hemoglobiinimolekyylissä on neljä heemiryhmää, on pienin mahdollinen konsentraatio neljä kertaa hemoglobiinikonsentraatio. Kuitenkin on edullista käyttää heeminsitojaligandeja suuri ylimäärä, mielellään 10 - 10^-kertainen molaarinen ylimäärä.
Lisäksi on tarkoituksenmukaista lisätä mitattavaan liuokseen ionisidoksia stabiloivaa ainetta, ennenkuin se saatetaan kosketukseen haptoglobiinin kanssa. Tällaisia ioni-sidoksia stabiloivia aineita ovat mm. polyetyleeniglykolit ja sakkaroosi.
Hemoglobiini esiintyy veressä kahdessa muodossa, so. ok-simuodossa ja deoksimuodossa . Keksinnön mukaisen menetelmän kannalta on edullista, jos hemolysoidun verinäytteen sisältämä hemoglobiini saatetaan yhtenäiseen muotoon. Tämä voi olla joko oksi- tai deoksimuoto. Kuitenkin on edullista, jos koko hemoglobiinimäärä saatetaan ennen glykosiloi-tuneen ja glykosiloitumattoman hemoglobiinin erottamista deoksimuotoon. Menetelmät, joilla oksimuoto muunnetaan deoksimuodoksi tai päinvastoin, ovat ammatti-ihmisille tuttuja. Esimerkiksi oksimuoto voidaan ditioniitin tai muiden pelkistysaineiden avulla muuntaa deoksimuodoksi.
Erittäin edullinen tämän keksinnön mukaisen menetelmän toteutustapa on se, jossa hemolysoidun verinäytteen sisältämä hemoglobiini muunnetaan pelkistysaineen, esim. natriumditioniitin, avulla kokonaan deoksimuotoon ja suoritetaan reaktio yhden tai useamman sellaisen aineen kanssa, jolla on sitomisvaikutus allosteeriseen efektorikoh-taan, ja/tai yhden tai useamman heeminsitojaligandin kanssa 73088 ja sen jälkeen hemoglobiini saatetaan kosketukseen hapto-globiinin kanssa. Tällä tavalla saavutetaan se, että näytteen sisältämästä koko hemoglobiinimäärästä vain glykosi-loitunut osa sitoutuu haptoglobiiniin ja voidaan määrittää kvantitatiivisesti.
Haptoglobiinia käytetään vähintään ekvimolaarinen määrä hemoglobiiniin verrattuna. Kuitenkin on myös tässä on etua oleellisesta ylimäärästä. Mielellään käytetään 2-50-kertais-ta ylimäärää.
Haptoglobiini voidaan saattaa vapaassa muodossa kosketukseen mittausliuoksen kanssa. Tässä tapauksessa on tarkoituksenmukaista määrittää koko hemoglobiinimäärän sisältämä glykosiloitunut osa homogeenisessa faasissa tunnetuilla menetelmillä. Glykosiloitunut osa voidaan määrittää esim. fluoresenssin sammumismenetelmällä Nagelin ja Gibsonin mukaan /3. Biol. Chem. 242 (1967) s. 34287. Vielä eräs mahdollisuus liittyy siihen pH-riippuvuuden eroon, joka vapaalla hemoglobiinilla ja haptoglobiiniin sidotulla hemoglobiinilla on pseudoperoksidaasiaktiivisuudessa /vrt. Kawamura et ai., Biochem. Biophys. Acta 285 (1972), ss. 22-277.
Koska haptoglobiinia voidaan pitää hemoglobiinin luonnollisena vasta-aineena, tulevat haptoglobiinin ja hemoglobiinin välisen vuorovaikutuksen määrityksessä kysymykseen myös immunologisen diagnostiikan menetelmät, kuten radioimmuunimääritys, entsyymi-immuunimääritys jne.
Lisäksi on mahdollista kiinnittää haptoglobiini kantajaan. Tässä tapauksessa voidaan määritys suorittaa siten, että joko a) haptoglobiinilla varustettu kantaja upotetaan hemoly-soituun, mahdollisesti esikäsiteltyyn verinäytteeseen tai b) tietty määrä esikäsiteltyä verinäytettä lisätään tippoina haptoglobiinikantajaan tai 8 73088 c) haptoglobiini eluoidaan kantajasta tietyllä määrällä esikäsiteltyä verinäytettä.
Kantajamateriaaleiksi sopivat analyyttisissä määritysrea-gensseissa tavallisesti käytetyt kantajat, kuten paperi, selluloosa, kuituhuopa, huokoiset muovit tms. Valmistus tapahtuu kastamalla haptoglobiinipitoiseen liuokseen tai suihkuttamalla liuosta kantajaan.
Haptoglobiini voidaan myös sitoa kovalenttisesti liukenemattomaan kantajaan. Kantajiksi sopivat kaikki tavalliset proteiinien kiinnitykseen soveltuvat kantajamateriaalit. Haptoglobiinin kiinnittäminen kantajamateriaaliin tapahtuu ammatti-ihmisen tuntemalla tavalla. Kantajaan sidottu haptoglobiini lisätään hemolysoituun verinäytteeseen, joka mahdollisesti on varustettu edellämainituilla lisäaineilla. Riittävän kosketusajän, esim. noin 1 minuutin kuluttua liukenemattomaksi tehty haptoglobiini sekä sidottu glykosi-loitunut hemoglobiiniosa erotetaan ja glykosiloitunut hemoglobiini määritetään tavalliseen tapaan joko suoraan fotometrisesti ominaisvärinsä perusteella tai pseudo-per-oksidatiivisen aktiivisuutensa perusteella.
Haptoglobiinipitoinen kantaja voidaan sijoittaa myös pylvääseen, jonka läpi johdetaan hemolysoitu, mahdollisilla lisäaineilla varustettu verinäyte. Hemoglobiinin sisältämä glykosiloitunut osa jää tässä menetelmässä kiinni kantajassa olevaan haptoglobiiniin ja voidaan näin ollen helposti erottaa liuokseen jääneestä glykosiloitumattomasta osasta. Tässä tapauksessa on tarkoituksenmukaisinta määrittää eluaatista sitoutumaton eli glykosiloitumaton hemoglobiiniosa. Tällöin HbA^-pitoisuus on kokonaishemoglobiini-määrän ja glykosiloitumattoman hemoglobiiniosan välinen ero.
Edelleen tämä keksintö koskee reagenssia, jolla voidaan määrittää glykosiloitunut hemoglobiini verinäytteestä, ja joka sisältää sopivassa puskurisysteemissä olevan punasoluja 73088 hemolysoivan aineen sekä vapaan tai kantajaan sidotun hap-toglobiinin. Reagenssiin voi olla edullista lisätä myös yhtä tai useampaa ainetta, jolla on sitomisvaikutus allo-steeriseen efektorikohtaan, yhtä tai useampaa heeminsitoja-ligandia ja/tai ionisidoksia stabiloivia aineita.
Edelleen tämä keksintö koskee reagenssia, jolla voidaan erottaa toisistaan glykosiloitunut ja glykosiloitumaton hemoglobiini, ja joka sisältää haptoglobiinia vapaassa tai kantajaan sidotussa muodossa.
Liitteenä on seuraavat kuviot:
Kuvio 1: Haptoglobiiniliuoksen fluoresenssi-intensiteetin väheneminen, kun on lisätty glykosiloitunutta hemoglobiinia (käyrä 1) tai glykosiloitumatonta hemoglobiinia (käyrä 2) .
I = fluoresenssi-intensiteetti ajankohdassa t I = fluoresenssi-intensiteetti reaktion loputtua 00
Kuvio 2: Haptoglobiiniliuoksen fluoresenssi-intensiteetin väheneminen, kun on lisätty glykosiloitunutta hemoglobiinia ja inosiittiheksafosfaattia (käyrä 1) tai glykosiloitumatonta hemoglobiinia ja inosiittiheksafosfaattia (käyrä 2) I^_ = fluoresenssi-intensiteetti ajankohdassa t I = fluoresenssi-intensiteetti reaktion loputtua
OO
Kuvio 3: Haptoglobiiniin sitoutuneen hemoglobiinimäärän riippuvuus koko hemoglobiinimäärän sisältämästä glykoli-soidun hemoglobiinin prosentiaalisesta osuudesta.
Keksintöä valaistaan seuraavilla esimerkeillä:
Esimerkki 1
Liuoksesta, jossa on 0,3 mmoolia/1 K^/Fe(CN)g_/, 25 mmoo-lia/1 natriumfluoridia ja 45,5 mg/1 ihmisestä peräisin olevaa haptoglobiinia (sekatyyppi) 100 mmoolia/1 fosfaatti- 10 73088 puskurissa, pH = 6,70, laitetaan 2,2 ml mittauskyvettiin. Liuokseen lisätään 100 ^ul glykosiloidun hemoglobiinin 0,05-prosenttista liuosta, joka samoin sisältää 0,3 iranoo-lia/1 K^Fe (CN) g_/ ja 25 mmoolia/1 natriumfluoridia ja sen jälkeen seurataan fluoresenssi-intensiteetin vähenemistä ajan funktiona, (herätysaallonpituus 280 nm, emissioaallon-pituus 330 nm). Mittaustulos on esitetty kuvion 1 käyrässä 1.
Fluoresenssi-intensiteetti mitataan edellä kuvatulla tavalla sen jälkeen, kun mittausliuokseen on glykosiloituneen hemoglobiinin sijasta lisätty glykosiloitumatonta hemoglobiinia. Tulos on esitetty kuvion 1 käyrässä 2.
Esimerkki 2
Mittausliuokset valmistetaan samoin kuin esimerkissä 1. Fosfaattipuskurin tilalla käytetään 0,05 M bis-tris-pusku-ria, pH = 6,70 /bis-tris-puskuri = Ν,Ν-bis-(2-hydroksi-etyyli)-imino-tris(hydroksimetyyli)metaani/. Ennen glykcsi-toituneen tai glykosiloitumattoman hemoglobiinin lisäystä lisätään mittausliuoksiin 0,2 mmoolia/1 inosiittiheksafos-faattia. Fluoresenssi-intensiteetin väheneminen ajan funktiona on esitetty kuviossa 2.
Esimerkki 3
Haptoqlobiinisefaroosin valmistus 20 mg ihmisestä peräisin olevaa haptoglobiinia (sekatyyp- pi) (Fa. Behringwerke AG) liitetään 4 grammaan bromisyaa- nilla aktivoitua sefaroosia menetelmällä Klein ja Mihaesco, /Biochem. and Biophys. Research Comun. 5>2 (1973) ss. 774- 778/. Saatu kantajaan sidottu haptoglobiinipreparaatti laimennetaan lisäämällä 16 g inaktivoitua sefaroosia. Näin saadaan sefaroosiin sidottu haptoglobiinivalmiste, jonka -9 sidontakapasiteetti on 5 x 10 moolia hemoglobiinia per 1 g kosteata massaa.
11 73088
Haptoglobiinisefaroosiin sitoutuneen hemoglobiinin määritys_
Daoksimuotoonmuuttamistarkoituksessa 1 ml:aan liuosta, jossa on 8 x 10 moolia/1 hemoglobiinia 0,05 moolia/1 bis-tris-puskurissa, pH 6,70, lisätään n. 5 mg natrium-ditioniittia. Perättäisestä lisätään inosiittiheksafos-faattia ja n-butyyli-isosyanidia niin, että saadaan allamainitut väkevyydet:
Inosiitti- n-butyyli-iso- Näyte Hemoglo- heksafosfaat- syanamidi Ekstinktio nro biini ti (moolia/1) (moolia/1)_ (mE)_ 1 HbA-,^ 5 · 10“5 0 0 2 HbA1 5 · 10-5 5 · 10~4 188 3 HbA-L 0 5 - 10-4 194 4 HbAQ 5 · 10“5 0 0 5 HbAQ 5 * 10-5 5 · 10-4 0 6 HbA0 0 5 · 10“4 184
Liuosta ravistellaan tehokkaasti 1 min 160 mg:n kanssa edelläkuvattua haptoglobiinisefaroosivalmistetta. Sitten pestään ensin ditioniittipitoisella puskurilla ja seuraa-vaksi kaksi kertaa pelkällä puskurilla ja pesuliuokset erotetaan pois.
Haptoglobiinisefaroosiin sitoutunut hemoglobiini määritetään tunnetulla tavalla guajakoiin avulla pseudoperoksi-daasiaktiivisuutensa perusteella. Tätä varten lisätään sentrifugoituun haptoglobiinisefaroosiin 1 ml liuosta, jossa on 30 mmoolia/1 guajakoliliuosta 0,1 moolia/1 asetaat-tipuskurissa, pH 4,0. Reaktio käynnistetään lisäämällä vielä 50 ^ul 1-prosenttista vetyperoksidiliuosta. 5 minuutin kuluttua sentrifugoidaan sefaroosi pois ja liuokseen muodostuneen värin ekstinktio määritetään 436 nmrssä.
Saadut ekstinktioarvot on esitetty edellä olevassa taulukossa .
Saadut ekstinktioarvot osoittavat, että pelkän inosiitti-heksafosfaatin läsnäollessa ei glykosiloitunut eikä gly- 12 73088 kosiloitumaton hemoglobiini sitoudu haptoglobiinisefaroo-siin. Kun läsnä on n-butyyli-isosyanidia ilman inosiitti-heksafosfaattia, tapahtuu vuorovaikutus haptoglobiinin ja sekä glykosiloitumattoman että glykosiloituneen hemoglobiinin välillä, Glykosiloituneen ja glykolisoitumattoman hemoglobiinin erottaminen toistaan on mahdollista oikein hyvällä tarkkuudella, kun näytteeseen lisätään inosiitti-heksafosfaattia ja n-butyyli-isosyanidia. Edellä esitetyt ekstinktioarvot osoittavat, että tässä tapauksessa vain hemoglobiinin glykosiloitunut osa sitoutuu haptoglobiini-sefaroosiin.
Esimerkki 4
Deoksimuotoonmuuttamistarkoituksessa 1 ml:aan liuosta, _7 jossa on 8 x 10 moolia/1 hemoglobiinia 0,05 moolia/1 bis-tris-puskurissa, pH 6,70, lisätään n. 5 mg natriumdi-tioniittia. Sitten lisätään 25 ^ul natriumnitriittiliuosta (0,1 moolia/1). 5 minuutin reaktioajan kuluttua lisätään niin, että saadaan seuraavat väkevyydet:
Inosiitti- Näyte Hemoglo- heksafosfaat- Ekstinktio n:o biini ti (moolia/1) (mE)_ 1 HbA-j^ 0 224 2 HbA1 5 · 10~5 190 3 HbAQ 0 219 4 HbA0 5 · 10"5 16
Liuosta sekoitetaan voimakkaasti minuutin ajan 160 mg:n kanssa haptoglobiinisefaroosipreparaattia, joka on valmistettu esimerkin 3 mukaisesti, ja sen jälkeen suoritetaan jatkokäsittely esimerkin 3 mukaisesti.
Haptoglobiinisefaroosiin sitoutunut hemoglobiiniosa määritetään samoin kuin esimerkissä 3. Saadut ekstinktioarvot on esitetty edellä olevassa taulukossa.
13 73088
Saadut ekstinktioarvot osoittavat, että inosiittiheksa-fosfaatin läsnäollessa glykosiloitunut hemoglobiini on sitoutunut haptoglobiinisefaroosiin paljon voimakkaammin kuin glykosiloitumaton hemoglobiinimuoto.
Esimerkki 5
Esimerkissä 3 esitetyllä tavalla valmistetaan hemoglobiini-pitoisia näytteitä, joiden sisältämä glykosiloidun hemoglobiinin osuus kasvaa välillä 0-100 %. Kuhunkin näytteeseen _5 lisätään 5 mg natriumditioniittia, 5 x 10 moolia/1 ino-siittiheksafosfaattia ja 5 x 10 ^ moolia/1 n-butyyli-iso-syanidia ja käsitellään esimerkin 3 mukaisesti. Haptoglo-biinireagenssina käytetään esimerkin 3 mukaisesti valmistettua haptoglobiinisefaroosivalmistetta, jonka sidonta- — 8 kapasiteetti kuitenkin on 1,7 x 10 moolia hemoglobiinia per 1 g preparaattia. Kuviossa 3 on esitetty ekstinktioarvot koko hemoglobiinimäärän sisältämän glykosiloituneen osan prosentuaalisen osuuden funktiona.
Kuviossa 3 esitetyn standardikäyrän mukaan voidaan tässä kuvatun menetelmän mukaisesti määrittää näytteen sisältämä tuntematon glykosiloituneen hemoglobiinin pitoisuus.
Claims (2)
1. FÖrfarande för bestämning av glykosilerat hemoglobin i blodprover sä, att glykosilerat ooh oglykosilerat hemoglobin först frigörs fran erytrosyterna genom kemisk och fysika-lisk behandling av ett blodprov och hemoglobinet eventuellt omvandlas tili methemoglobin, varefter det glykosilerade och det oglykosilerade hemoglobinet separeras och det glykosilerade hemoglobinet slutligen bestämmes, kännetecknat av att det glykosilerade och det oglykosilerade hemoglobinet separeras medelst haptoglobin.
1. Menetelmä glykosiloituneen hemoglobiinin määrittämiseksi verinäytteistä siten, että ensin punasoluista vapautetaan glykosiloitunut ja glykosiloitumaton hemoglobiini käsittelemällä verinäyte kemiallisesti tai fysikaalisesti ja mahdollisesti hemoglobiini muunnetaan methemoglobiiniksi ja sen jälkeen glykosiloitunut ja glykosiloitumaton hemoglobiini erotetaan toisistaan ja lopuksi glykosiloitunut hemoglobiini määritetään, tunnettu siitä, että glykosiloitunut ja glykosiloitumaton hemoglobiini erotetaan toisistaan haptoglobiinin avulla.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että glykosiloituneen ja glykosiloitumattoman hemoglobiinin erottaminen toisistaan suoritetaan sopivan puskuri-systeemin ja/tai yhden tai useamman sellaisen aineen läsnäollessa, joka saa aikaan konformaationmuutoksen glykolisoitu-neessa ja/tai glykosiloitumattomassa hemoglobiinissa.
3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että aineina, jotka saavat aikaan konformaationmuutoksen glykosiloituneessa ja/tai glykosiloitumattomassa hemoglobiinissa käytetään yhdisteitä, joilla on sitomisvaikutus al-losteeriseen efektorikohtaan, ja/tai heeminsitojaligandeja.
4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että yhdisteinä, joilla on sitomisvaikutus allosteeri-seen efektorikohtaan, käytetään inosiittiheksafosfaattia, 2,3-difosfoglyseraattia tai melliittihappoa.
5. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että heeminsitojaligandeina käytetään alkyyli-isosya-nideja, happea, hiilimonoksidia tai typpimonoksidia sekä fluoridia, atsidia, syanidia tai vettä. is 73088
6. Jonkin patenttivaatimuksen 1-5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että haptoglobiinia käytetään 2-50-kertainen ylimäärä hemoglobiinimäärään verrattuna.
7. Reagenssi glykosiloituneen hemoglobiinin määrittämiseksi verinäytteistä, tunnettu siitä, että se sisältää aineen punasolujen hemolysoimiseksi, sopivan puskurisysteemin ja vapaata tai kantajaan sidottua haptoglobiinia ja mahdollisesti yhtä tai useampaa ainetta, jolla on sitomisvaikutus al-losteeriseen efektorikohtaan, ja yhtä tai useampaa heeminsi-tojaligandia ja/tai ainetta, jolla on ionisidoksia stabiloiva vaikutus.
8. Reagenssi glykosiloituneen ja glykosiloitumattoman hemoglobiinin erottamiseksi toisistaan, tunnettu siitä, että se sisältää haptoglobiinia vapaassa tai kantajaan sidotussa muodossa.
2. FÖrfarande enligt patentkravet 1, kännetecknat av att separeringen av det glykosilerade och det oglykosilerade hemoglobinet utförs i närvaro av ett lämpligt buffertsystem och/eller ett eller flera sädana ämnen, som ästadkommer en konformationsförändring i det glykosilerade och/eller det oglykosilerade hemoglobinet.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3141146 | 1981-10-16 | ||
| DE19813141146 DE3141146A1 (de) | 1981-10-16 | 1981-10-16 | Verfahren und reagens zur bestimmung von glykosiliertem haemoglobin |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI823454A0 FI823454A0 (fi) | 1982-10-11 |
| FI823454L FI823454L (fi) | 1983-04-17 |
| FI73088B true FI73088B (fi) | 1987-04-30 |
| FI73088C FI73088C (fi) | 1987-08-10 |
Family
ID=6144259
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI823454A FI73088C (fi) | 1981-10-16 | 1982-10-11 | Foerfarande och reagens foer bestaemning av glykosilerat hemoglobin. |
Country Status (14)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4438204A (fi) |
| EP (1) | EP0077515B1 (fi) |
| JP (1) | JPS5879163A (fi) |
| AT (1) | ATE12318T1 (fi) |
| AU (1) | AU537363B2 (fi) |
| CA (1) | CA1199257A (fi) |
| DD (1) | DD203778A5 (fi) |
| DE (2) | DE3141146A1 (fi) |
| DK (1) | DK157047C (fi) |
| ES (1) | ES8306406A1 (fi) |
| FI (1) | FI73088C (fi) |
| HU (1) | HU188211B (fi) |
| IE (1) | IE53534B1 (fi) |
| ZA (1) | ZA827547B (fi) |
Families Citing this family (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3314308A1 (de) * | 1983-04-20 | 1984-10-25 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Verfahren und reagens zur bestimmung des haemoglobin-haptoglobin komplexes in gegenwart von freiem haemoglobin |
| DE3532868A1 (de) * | 1985-09-14 | 1987-03-26 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren und reagenz zur bestimmung von glykosiliertem haemoglobin sowie hierzu geeignete verbindungen und verfahren zu deren herstellung |
| US4837170A (en) * | 1986-01-20 | 1989-06-06 | Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. | Monoclonal antibody, measuring method of glucosylated protein by utilizing the monoclonal antibody, and kit therefor |
| EP0299419B1 (en) * | 1987-07-14 | 1993-10-20 | Kabushiki Kaisha Kyoto Daiichi Kagaku | Automatic measurement method of glycohemoglobin |
| US4970171A (en) * | 1987-11-09 | 1990-11-13 | Miles Inc. | Denaturant reagents for convenient determination of hemoglobin derivatives in blood |
| JP3032891B2 (ja) * | 1989-03-04 | 2000-04-17 | 吉富製薬株式会社 | 遊離ヘモグロビン測定用試薬キット及びそれを用いる遊離ヘモグロビンの測定法 |
| US5484735A (en) * | 1989-08-23 | 1996-01-16 | Northwestern University | Immunoassay of glycosylated proteins employing antibody directed to reductively glycosylated N-terminal amino acids |
| CA2591834C (en) * | 1992-03-04 | 2009-04-28 | Abbott Laboratories | Determination of glycated hemoglobin by fluorescence quenching |
| US5739037A (en) * | 1992-09-29 | 1998-04-14 | Drew Scientific Limited | Process for eliminating labile glycohaemoglobin from a sample |
| CA2148483A1 (en) * | 1992-11-03 | 1994-05-11 | Alexander Saunders | Methods and procedures for preparing red blood fractions |
| US5424447A (en) * | 1993-07-07 | 1995-06-13 | The Medical College Of Wisconsin Research Foundation, Inc. | Heme binding compounds and use thereof |
| US6174734B1 (en) | 1997-10-24 | 2001-01-16 | Abbott Laboratories | Measurement of glycated hemoglobin |
| DE19856433C2 (de) * | 1998-12-08 | 2001-09-13 | Aventis Behring Gmbh | Verfahren zum spezifischen Nachweis von glykosilierten Proteinen |
| DE102009053225A1 (de) * | 2009-11-06 | 2011-05-12 | Deutsche Sporthochschule Köln | Verfahren zur Bestimmung der totalen Hämoglobinmenge im Körper eines Lebewesens |
| US20130130391A1 (en) * | 2010-03-31 | 2013-05-23 | Hiroaki Taira | Method of analyzing hemoglobins |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3350174A (en) * | 1964-01-08 | 1967-10-31 | Miles Lab | Process of determining hemoglobin separated from peroxidase inhibitors in urine |
| US4189304A (en) | 1978-10-27 | 1980-02-19 | Miles Laboratories, Inc. | Device and method for detecting myoglobin |
| US4200435A (en) * | 1978-12-26 | 1980-04-29 | Abbott Laboratories | Determination of glycosylated hemoglobin in blood |
| US4268270A (en) * | 1979-04-30 | 1981-05-19 | Children's Hospital Medical Center | Glycosylated hemoglobin measurement |
| US4255385A (en) | 1979-10-23 | 1981-03-10 | Abbott Laboratories | Reagent and test kit for determining glycosylated hemoglobin |
| US4371374A (en) | 1980-11-17 | 1983-02-01 | The Rockefeller University | Monitoring metabolic control in diabetic patients by measuring glycosylated amino acids and peptides in urine |
-
1981
- 1981-10-16 DE DE19813141146 patent/DE3141146A1/de not_active Withdrawn
-
1982
- 1982-09-29 US US06/426,510 patent/US4438204A/en not_active Expired - Lifetime
- 1982-09-30 AU AU88896/82A patent/AU537363B2/en not_active Ceased
- 1982-10-11 DE DE8282109382T patent/DE3262693D1/de not_active Expired
- 1982-10-11 EP EP82109382A patent/EP0077515B1/de not_active Expired
- 1982-10-11 FI FI823454A patent/FI73088C/fi not_active IP Right Cessation
- 1982-10-11 AT AT82109382T patent/ATE12318T1/de not_active IP Right Cessation
- 1982-10-13 DD DD82243954A patent/DD203778A5/de unknown
- 1982-10-14 ES ES516496A patent/ES8306406A1/es not_active Expired
- 1982-10-15 DK DK458682A patent/DK157047C/da not_active IP Right Cessation
- 1982-10-15 HU HU823286A patent/HU188211B/hu not_active IP Right Cessation
- 1982-10-15 JP JP57180095A patent/JPS5879163A/ja active Granted
- 1982-10-15 CA CA000413594A patent/CA1199257A/en not_active Expired
- 1982-10-15 ZA ZA827547A patent/ZA827547B/xx unknown
- 1982-10-15 IE IE2493/82A patent/IE53534B1/en unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE3262693D1 (en) | 1985-04-25 |
| AU537363B2 (en) | 1984-06-21 |
| ZA827547B (en) | 1983-09-28 |
| EP0077515A2 (de) | 1983-04-27 |
| ATE12318T1 (de) | 1985-04-15 |
| FI823454A0 (fi) | 1982-10-11 |
| AU8889682A (en) | 1983-04-21 |
| IE822493L (en) | 1983-04-16 |
| US4438204A (en) | 1984-03-20 |
| FI73088C (fi) | 1987-08-10 |
| HU188211B (en) | 1986-03-28 |
| DD203778A5 (de) | 1983-11-02 |
| JPS5879163A (ja) | 1983-05-12 |
| EP0077515A3 (en) | 1983-08-17 |
| JPH0153748B2 (fi) | 1989-11-15 |
| FI823454L (fi) | 1983-04-17 |
| ES516496A0 (es) | 1983-06-01 |
| DK458682A (da) | 1983-04-17 |
| DE3141146A1 (de) | 1983-04-28 |
| CA1199257A (en) | 1986-01-14 |
| IE53534B1 (en) | 1988-12-07 |
| DK157047B (da) | 1989-10-30 |
| DK157047C (da) | 1990-04-02 |
| ES8306406A1 (es) | 1983-06-01 |
| EP0077515B1 (de) | 1985-03-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FI73088C (fi) | Foerfarande och reagens foer bestaemning av glykosilerat hemoglobin. | |
| Riggs | The nature and significance of the Bohr effect in mammalian hemoglobins | |
| Dabrio et al. | Recent developments in quantification methods for metallothionein | |
| CA1119081A (en) | Determination of glycosylated hemoglobin in blood | |
| US5686316A (en) | Methods and reagents for the rapid determination of glycated hemoglobin | |
| US4371374A (en) | Monitoring metabolic control in diabetic patients by measuring glycosylated amino acids and peptides in urine | |
| Gow et al. | S-Nitrosothiol measurements in biological systems | |
| Giustarini et al. | Detection of S-nitrosothiols in biological fluids: a comparison among the most widely applied methodologies | |
| US4255385A (en) | Reagent and test kit for determining glycosylated hemoglobin | |
| EP2813854A1 (en) | Hemolysis reagent composition for hemoglobin a1c quantitative analysis using enzymatic method | |
| DE69817794D1 (de) | Verfahren zur bestimmung des prozentualen anteils von glykosiliertem hämoglobin | |
| FI102698B (fi) | Menetelmä ja testausjärjestelmä hemoglobiinin Alc:n määrittämiseksi | |
| Macvanin et al. | Methods for measurements of oxidized LDL, homocysteine and nitric oxide as clinical parameters of oxidative stress and endothelial dysfunction | |
| JP7182724B2 (ja) | 患者の液体試験サンプル中の糖化ヘモグロビンパーセントを決定するためのキャリブレーターおよびコントロール | |
| Nathan et al. | Two commercial methods evaluated for eliminating the labile fraction from the assay for glycated hemoglobin (glycohemoglobin). | |
| JP4144117B2 (ja) | グルコースの測定方法及び測定装置 | |
| Fiechtner et al. | Affinity binding assay of glycohemoglobin by two-dimensional centrifugation referenced to hemoglobin A1c | |
| EP0448072A2 (en) | Process for assaying free hemoglobin and reagent kit for assaying free hemoglobin | |
| CN112485453A (zh) | 一种测定糖化血红蛋白的液相层析试剂及其制备方法 | |
| Rose et al. | A hemoglobin A1C immunoassay method not affected by carbamylated hemoglobin | |
| JP3181390B2 (ja) | タンパク質の糖化割合の測定方法 | |
| Maltsev et al. | Determination of myoglobin in human serum by high-performance liquid chromatography with chemiluminescence detection | |
| JP3292766B2 (ja) | 糖化蛋白の測定方法 | |
| Schnedl et al. | Hemoglobin D [β 121 (GH4) Glu→ Gln] causing falsely low and high HbA1C values in HPLC | |
| RU1814075C (ru) | Способ определени трипсина в крови |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM | Patent lapsed |
Owner name: BOEHRINGER MANNHEIM GMBH |