HU188081B

HU188081B - Process for producing new cyclopeptides and pharmaceutical compositions containing them

Info

Publication number: HU188081B
Application number: HU801664A
Authority: HU
Inventors: Hans Rink; Peter Siember; Bruno Kamber
Original assignee: Ciba-Geigy,Ch
Priority date: 1979-07-04
Filing date: 1980-07-03
Publication date: 1986-03-28
Also published as: KR840000927B1; IL60474A0; NO802009L; IL60474A; IE49995B1; AU6007380A; EP0023192A1; PT71490A; IE801371L; DD152543A5; NO152092B; ES493029A0; KR830003401A; NO152092C; ES8105698A1; NZ194227A; DE3067252D1; GR69319B; AU539499B2; DK287680A

Description

(57) KIVONAT

A találmány szerinti eljárással az új,

L Asn-Phe-Phe-trp-Lys-Thr-Phe-Gaba(Ar) -I I

6 7 8 9 10 11 12

I általános képletű szomatosztatin-analóg ciklusos oktapeptideket - ahol trp D-Trp csoportot vagy 5-F-D-Trp csoportot jelent és Gaba(Ar) egy olyan y-aminovajsav gyökét jelenti, amely ^-helyzetben cikloalkil-, naftil-, halogén-naftil-, fenil-, halogén-fenil-, nitro-fenil- vagy fenoxi-fenil-csoportot hordoz - és azok savaddíciós sóit és komplexeit állítják elő a megfelelő lineáris oktapeptidek ciklizálásával.

-1188 081

A találmány tárgya eljárás szomatosztatin-típusú új ciklopeptidek és az azokat tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására.

Közelebbről a találmány olyan ciklopeptidek előállítására vonatkozik, amelyek a szomatosztatin leglényegesebb jellemzőit, így az 5-11 aminosavak rész-szekvenciáját vagy egy egyenértékű szekvenciát tartalmaznak, amellett azonban kénmentesek. A találmány szerinti eljárással előállítható szomatosztatin-analóg ciklopeptidek az ^Asn-Phe-Phe-trp-Lys-Thr-Phe-Gaba(Ar) -J I

6 7 8 9 10 11 12 általános képletű ciklusos oktapeptideket foglalják magukban, ahol trp D-Trp vagy 5-fluor-D-Trp csoportot jelent és Gaba(Ar) egy olyan y-amino-vajsav gyökét jelenti, amely //-helyzetben 5-7 szénatomos cikloalkilcsoportot, naftil-, halogén-naftil-, fenil-, halogén-fenil-, nitro-fenil- vagy fenoxi-fenilcsoportot hordoz. A Gaba(Ar) savgyöknek megfelelő sav rövid jelölése H-Gaba(Ar)—OH.

A Gaba(Ar)-nak nevezett csoport Ar-ral jelzett helyettesítői közül előnyös a ciklopentil- és ciklohexil-csoport. A naftilcsoport előnyösen 1- vagy

2- naftilcsoport.

A helyettesített fenil- és naftilcsoportok közül előnyös a 4-fluor-fenil-, 4-klór-fenil-, 4-nitro-fenilés különösen a 3-fenoxi-fenil-csoport, valamint a 4-klór-l-naftilcsoport.

A Gaba(Ar) általános képletű, különösen előnyös csoportok az alábbi vajsavakból származnak: 4-amino-3-ciklohexil-, 4-amino-3-fenil-, 4-amino3- (4-fluor-fenil)-, 4-amino-3-(4-nitro-fenil)-, 4-amino-3-(4-klór-l-naftil)-, 4-amino-3-(2-naftil)- és mindenek előtt a 4-amino-3-(l -naftil)- és 4-amino3-(3-fenoxi-fenil)-vajsav.

Az Ar csoporttal történő szubsztitúció eredményeként a savlánc megfelelő szénatomján aszimmetria centrum keletkezik, ennek az a következménye, hogy a találmány szerinti eljárással előállítható ciklopeptidnek mindig két diasztereomerje van, ezek kívánt esetben elválaszthatók egymástól vagy együttesen, diasztereomer elegyként használhatók ugyanarra a célra. Általában mindig a B izomernek nevezett diasztereomer az előnyös, azaz az olyan vegyület, amely a megfelelő, védett, II általános képletű közbenső termékek ellenáramú megosztásakor a hidrofilebb diasztereomerekből származik

Különösen előnyös, találmány szerinti eljárássá! előállítható, I általános képletű ciklusos oktapepti dek az alábbiak:

L- Asn-Phe-Phe-[D-trp]-Lys-Thr-Phe-(/?-ciklohexil)Gaba J

- általános képletű [D-Trp⁸;/?-ciklohexil-Gaba¹²]ciklo-szomatosztatin(5-12)-oktapeptid, IÁ

C Asn-Phe-Phe-[D-trp]-Lys-Thr-Phe-(/?-fenil)Gaba 3

- általános képletű [D-Trp;/?-fenil-Gaba¹²]-cikIoszomatosztatin(5-12)-oktapeptid, IB

L Asn-Phe-Phe-[5-F-D-trp]-Lys-Thr-Phe-[/J-naftil]Gaba -)

- általános képletű [5-F-D-Trp⁸;//-(l-naftil)-Gaba¹²]ciklo-szomatosztatin(5-12)-oktapeptid, IC mindenek előtt az t- Asn-Phe-Phe-[D-trp]-Lys-Thr-Phe-[/?-( 1 -naftil)]-Gaba -J

- általános képletű [D-Trp⁸;/?-(l-naftil)-Gaba¹²]ciklo-szomatosztatin(5-12)-oktapeptid, ID és az

L Asn-Phe-Phe-[D-trp]-Lys-Thr-Phe-[/?-(3-fenoxi-fenil)]Gaba J

- általános képletű [D-Trp⁸;/J-(3-fenoxi-feniI)Gaba¹²]-ciklo-szomatosztatin(5-12)-oktapeptid; IE ezeknek a vegyületeknek mindegyike előfordulhat egy racém [dl-Gaba(Ar)] csoportból levezetett diasztereomer elegyként, azonban önálló diasztereomer alakjában is, például a [Gaba(Ar)]-csoport optikai izomerjeinek csak egyikéből származó, az alábbi példákban leírt és fizikai állandókkal jellemzett diasztereomer alakjában. A fentiekben megnevezett vegyületeknek mindig a B izomerje a különösen előnyös.

Az összes, fentiekben általánosan vagy előnyösként jellemzett, I általános képletű szomatosztatinanalóg előfordulhat savaddiciós sója vagy komplexei alakjában is. Savaddiciós sókként különösen a szokásos, gyógyászatilag elfogadható savakkal képezett, fiziológiailag elviselhető sók jönnek szóba; a szervetlen savak közül megnevezzük a hidrogénhalogenideket, így a sósavat, valamint a kénsavat és a foszfor-^ illetve pirofoszforsavat is, a szerves savak közül elsősorban a szulfonsavakat, így a benzol- vagy p-toluol-szulfonsavat vagy a rövidszénláncú alkánszulfonsavakat, így a metánszulfonsavat, továbbá a karbonsavakat, így az ecetsavat, tejsavat, palmitin- és sztearinsavat, almasavat, borkősavat, aszkorbinsavat és citromsavat.

Komplexeken a szerkezetükben még teljesen fel nem derített vegyületeket kell érteni, amelyek bizonyos szervetlen vagy szerves vegyületek peptidekhez való hozzáadásakor keletkeznek, és ezeknek megnyújtott hatást biztosítanak. Ilyen anyagokat írnak le például az ACTH és más, adrenokortikotrop hatású peptidek esetére. Megnevezünk például szervetlen vegyületeket, amelyek fémekből, így kalciumból, magnéziumból, alumíniumból, kobaltból és különösen cinkből származnak, mindenek előtt az ilyen fémek rosszul oldódó sóit, így foszfátjait, pirofoszfátjait és polifoszfátjait, valamint hidroxidjait, továbbá az alkálifémpolifoszfátokat, például a Calgon N, Calgon 322 vagy Calgon 188 néven kereskedelmi forgalomba kerülő anyagokat. Hatás meghosszabbodást kiváltó szerves vegyületek például a nem antigén zselatin-fajták, például a polioxizselatin, polivinilpirrolidon és karboximetilcellulóz, továbbá az alginsav, dextrán, polifenolok és polialkoholok szulfonsav- és foszforsavészterei, mindenek előtt a polifloretinfoszfát és fitinsav, továbbá bázikus vagy mindenek előtt savas aminosavak polimerizátumai és kopolimerizátumai, például a protamin vagy poliglutaminsav.

Ha mást nem adunk meg, az aminosavcsoportok rövidítései az L-sorozatba tartozó a-aminosavak csoportjaira vonatkoznak, amelyek a természetben előfordulnak.

Ha mást nem adunk meg, egy szerves csoporttal vagy egy vegyülettel kapcsolatban előforduló „rövidszénláncú” kifejezés olyan csoportot vagy olyan vegyületet jelöl, amely legfeljebb 7-, előnyösen azonban legfeljebb 4-szénatomos.

188 081

A találmány szerinti eljárással előállítható új ciklopeptidek olyan fiziológiai hatással rendelkeznek, amely alapjellegében a szomatosztatin hatásához hasonló. így ugyanolyan terápiás indikációkban használhatók, például különösen olyan funkciózavarok kezelésére, amelyekben a növekedési hormon vagy glukagon szekréciója abnormálisán magas, így acromegalia vagy diabetes. Minthogy ezenkívül gátolják a vérveszteséget a gasztrointesztinális traktusban, ilyen indikációs területen is eredményesen alkalmazhatók.

A szomatosztatin, amely egy

H-AIa-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-OH 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 képletű ciklusos tetradekapeptid [Science, 179., Π. (1973,)], ismert módon gátolja a növekedési hormon (szomatotropin) hipofízis által szabályozott szekrécióját. Ezenkívül gátolja az endokrin pankreász szekréciós aktivitását, így az inzulin és glukagon szekrécióját. Ezeket az értékes tulajdonságokat magának a szomatosztatinnak az esetében nem lehet a gyakorlati alkalmazáskor teljesen kihasználni, mert ennek a vegyületnek a hatástartama rövid. Gyakran előnyös továbbá, ha a hatóanyag gátló hatását főként a két mirigy egyikén fejti ki, ezzel szemben a másikat lehetőleg kevéssé befolyásolja. (A legtöbb esetben kevésbé kívánatos a hipofízises kiválasztás, azaz a növekedési hormon kiválasztásának gátlása.) Ezért arra kell törekedni, hogy az alapszekvencia módosításával, különösen egyes eredeti aminosavak kihagyásával és/vagy más, gyakran „nem természetes” aminosavakra való cserélésével a gátló hatás disszociációját, valamint viszonylag hosszú hatástartamot érjünk el. így például azt tapasztalták, hogy különösen előnyös ilyen fajta fiziológiai tulajdonságok lépnek fel az l-Asn-Phe-Phe-[D-trp]-Lys-Thr-Phe-[Gaba] J (M)

6 7 8 9 10 11 típusú ciklopeptidek - ahol Gaba y-amino-vajsav gyökét jelenti és p értéke 0, 1 vagy 2 - és további hasonló vegyületek esetében, lásd a 78 100994.9 számon bejelentett és 0 001 295 számon nyilvánosságra hozott európai szabadalmi bejelentésünket. Az ilyen vegyületek tipikus jellemzője, hogy egy egyenes szénlánc van bennük, amely a szomatosztatin cisztincsoportjában levő eredeti — CH₂—S—S—CH₂— csoportot szimulálja.

Meglepődve tapasztaltuk, hogy ennek az egyszerű, mindig szubsztituálatlan láncrésznek egy teljesen szokatlan módosításával, azaz a y-aminosav ciklusos szénhidrogén-csoporttal történő szubsztitúciójával a kívánt aktivitás nemcsak megmarad, hanem még tovább fokozódik. így az I általános képletű vegyületek a szomatosztatinhoz képest jobban gátolják az inzulin- és glukagon-szekréciót, másrészt a hatástartam is lényegesen meghosszabbodik. így például az inzulin- és glukagonkiválasztás izolált perfundált patkány-pankreászon való meghatározásakor (Grodsky, G. M. és Fanska, R. E.: „Methods in Enzymology”, 39., D. rész, 364. oldal, szerkesztők: Hardman, J. G. és O’Malley, B. W., Academic Press, New York, 1975.) azt tapasztaltuk, hogy a [D-trp⁸;-/?-(l-naftil)Gaba¹²]ciklo-szomatosztatin(5-12)-oktapeptid (ID képlet) diasztereomer elegyként körülbelül tízszeres, míg az izolált B izomer körülbelül húszszoros gátló hatást mutat a [D-trp⁸;Gaba¹²]-ciklo-szomatosztatin(5-12)-oktapeptidhez (M képlet, p= 1) viszonyítva.

Az I általános képletű vegyületeket önmagában ismert módokon állíthatjuk elő, ekkor úgy járunk el, hogy egy

Η—[II]—C III általános képletű lineáris pepiidet - ahol ΙΓ valamilyen, az alábbiakban definiált II általános képletű ciklopeptidnek megfelelő lineáris oktapeptidgyököt jelent, amelyben az amidkötés a peptidgyűrű két tetszőleges szomszédos aminosavcsoportja között van megszakítva és C szabad hidroxilcsoportot, aktiváló csoporttal átalakított hidroxilcsoportot vagy —NH—NH₂ hidrazinocsoportot jelent ciklizálunk és a kapott

I- Asn-Phe-Phe-trp-Lys(A)-Thr(B)-Phe-Gaba(Ar) -í II általános képletű vegyületről - ahol Gaba(Ar) és trp a fentiekben megadott jelentésű, A egy e-amino védőcsoportot vagy hidrogénatomot és B hidroxil védőcsoportot vagy hidrogénatomot jelent, ahol az A és B csoportok közül csak az egyik jelenthet hidrogénatomot - a védőcsoporto(ka)t lehasítjuk.

ε-Amino védőcsoportokként a peptidkémiában szokásos összes amino védőcsoportot alkalmazhatjuk, ahogyan ezeket a szakkönyvekben összefoglalóan leírják, lásd például Houben-Weyl: Methoden dér organischen Chemie, 4. kiadás, 15/1. kötet,

Wünsch, E.: Synthese von Pepiiden, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, 1974. Előnyösek az acidolízissel lebasítható csoportok, így elsősorban a terc-butiloxikarbonilcsoport és az analóg csoportok, például a terc-amiloxikarbonil-, izopropiloxikarbonil-, diizopropilmetoxikarbonil-, alliloxikarbonil-, ciklopentiloxikarbonil-, ciklohexiloxikarbonil-, ςΐ-ίζοborniloxíkarbonil- és adamantiloxikarbonilcsoport, valamint az aralkil-típusú csoportok, így a benzhidril- és trifenilmetilcsoport (tritilcsoport) vagy bizonyos, az 509 266 számú svájci szabadalmi leírásban ismertetett, 2-(p-bifenilil)-2-propiloxikarbonil-típusú aralkoxikarbonilcsoportok.

Alkalmazhatunk továbbá reduktív vagy bázikus úton lehasítható amino védőcsoportokat is, például különösen a benziloxikarbonilcsoportot és olyan benziloxikarbonilcsoportokat, amelyek az aromás részben halogénatomokkal, nitrocsoportokkal, rövidszénláncú alkoxicsoportokkal és/vagy rövidszénláncú alkilcsoportokkal vannak helyettesítve, így a p-klór- és p-bróm-benziloxikarbonil-, ρ-nitro-benziloxikarbonil-, p-metoxi-benziloxikarbonil-, p-toliloxi-karbonilcsoportot vagy izonikotiniloxikarbonilcsoportot, továbbá acilcsoportokat, így ρ-toluolszulfonil-, benzolszulfenil-, p-nitrobenzolszulfenil-, illetve formil-, trifluoracetil- vagy ftaloilcsoportot.

Különösen előnyös e-amino védőcsoport az etoxikarbonilcsoport, /(-helyzetben három szénhidrogéncsoporttal helyettesített szililcsoport, így a trifenilszilil-, dimetilbutilszilil- vagy mindenek előtt trimetilszililcsoport. Egy ilyen /(-(trihidrokarbilszilil)etoxikarbonilcsoport, így egy /?-(tri-rövidszénláncú alkilszilil)-etoxikarbonilcsoport, például különösen

-3188 081 a /I-(trimetilszilil)-etoxikarbonilcsoport a védendő c-aminocsoporttal megfelelő /J-trihidrokarbilszililetoxikarbonilaminocsoportot (például /?-trimetilszilil-etoxikarbonilaminocsoportot) képez, amely a savas hidrolízis és hidrogenolízis körülményei között stabilis, azonban specifikus, nagyon enyhe körülmények között fluoridionok hatására lehasítható. Ilyen vonatkozásban hasonlóan viselkedik, mint az alábbiakban karboxil védőcsoportként leírt /I-szililetilésztercsoport. (Ezt a hasonlóságot a szintézis,során különösen figyelembe kell venni, az ilyen védőcsoportok alkalmazása egyes esetekben kizárja más védőcsoport egyidejű alkalmazását.) További részleteket a karboxilcsoport jff-szililetilésztercsoporttal való megvédésének ismertetésekor adunk meg.

Hidroxil védőcsoportként az összes, a peptidkémiában ilyen célra általánosan használatos csoportot alkalmazhatjuk, vesd össze a fentiekben idézett szakkönyvvel (Houben-Weyl). Előnyösek az acidolízissel lehasítható csoportok, így a 2-tetrahidropiranilcsoport és különösen a terc-bütilcsoport. Használhatunk azonban reduktív vagy bázikus úton lehasítható védőcsoportokat is, például olyan benzilcsoportokat, amelyek az aromás részben halogénatommal, nitro- és/vagy rövidszénláncú alkoxicsoporttal lehetnek helyettesítve, illetve rövidszénláncú alkanoilcsoportokat, így az acetilcsoportot vagy aroilcsoportokat, így benzoilcsoportot

Az A és B védőcsoportokat előnyösen úgy választjuk meg, hogy azok hasonló körülmények között legyenek lehasíthatók; különösen előnyösek a már említett, acidolízissel lehasítható csoportok. Mindkét védőcsoport lehasítását előnyösen egyetlen műveletben végezzük; használhatunk azonban különböző fajta csoportokat is, amelyeket különkülön hasítunk le.

Valamilyen C szimbólummal ábrázolt funkcionális csoport a C-terminális aminosavcsoport karbonilcsoportját egészíti ki, és azzal együtt szabad karboxilcsoportot, aktivált észtercsoportot, illetve karbazolilcsoportot képez.

A hidroxilcsoportot átalakító aktiváló csoport különösen egy olyan csoport, amely az N-hidroxiszukcinimid, 1-hidroxi-benztriazol, N,N'-diciklohexil-izokarbamid, 2,4,5-triklór-fenol, 2-nitrofenol, 4-nitro-fenol, pentaklórfenol vagy pentafluorfenol aktivált észterét képezi, lehet azonban egy ilyen fajta, a peptidkémiából ismert más aktiváló csoport is, lásd Houben-Weyl, 15/11. kötet.

A III általános képletű lineáris peptidek.közül azok az előnyösek, amelyekben a Gaba(Ar) csoport egy, a ΙΓ csoportban szereplő terminális aminosav. Ezeket az előnyös kiindulási anyagokat a

H-Gaba(Ar)-Asn-Phe-Phe-trp-Lys(Á)-Thr(B)Phe-C Illa és különösen a

H-Asn-Phe-Phe-trp-Lys(A)-Thr(B)-Phe-Gaba(Ar)-C Illb általános képlet jellemzi, ahol a képletekben A, B, C, trp és Gaba(Ar) a fentiekben megadott jelentésű. Különösen előnyös Illa és Illb általános képletü vegyületek azok, amelyekben A amino védőcsoportot, mindenek előtt acidolízissel lehasítható amino védőcsoportot, B hidroxil védőcsoportot, mindenek előtt acidolízissel lehasítható hidroxil védőcsoportot és C szabad hidroxilcsoportot jelent.

A találmány szerinti eljárásban a III általános képletű lineáris peptidek ciklizálását önmagában ismert módon, a szokásos, amidkötés kialakításához általánosan használt összekapcsoló módszerekkel végezzük, ennek során azonban a peptid kiindulási anyagokat nagyon kis koncentrációban adagoljuk, hogy a kapcsolás lefolyását az intramolekuláris ciklizálás felé toljuk el az intermolekuláris polikondenzáció rovására.

A lineáris peptideket előnyösen körülbelül 1 · 10⁴ - körülbelül 1 10^-2 mólos, előnyösen körülbelül 1 · 10³ mólos koncentrációban adagoljuk, ez körülbelül 0,01-1,0, előnyösen 0,1 súly/térfogat% koncentrációnak felel meg. A reakcióelegyben kezdettől fogva megfelelő hígítást állítunk be, vagy a hígítást a kiindulási anyag és adott esetben a többi reagens reakcióelegybe való lassú becsöpögtetésével folyamatosan is előállíthatjuk.

A ciklizálást előnyösen úgy végezzük, hogy. a fentiekben megadott kiindulási koncentráció esetén

a) egy III általános képletű kiindulási anyagot

- ahol C szabad hidroxilcsoportot jelent és amelyben mind a lizingyök e-aminocsoportja, mind a treoningyök hidroxilcsoportja védett - egy karbodiimiddel kezelünk adott esetben egy aktív észtert képező komponens jelenlétében, vagy

b) egy III általános képletű kiindulási anyagot

- ahol C egy aktivált észterré átalakított hidroxilcsoportot jelent, a terminális aminocsoport protonált formában van és legalább a lizingyök e-aminocsoportja védett - valamilyen szerves bázissal reagáltatunk, vagy

c) egy III általános képletű kiindulási anyagot

- ahol C —NHNH₂ csoportot jelent és legalább a lizingyök e-aminocsoportja védett - először savas körülmények között salétromossavval vagy annak rövidszénláncú alkilészterével kezelünk, majd a fentiekben említett alacsony koncentrációban feleslegben levő szerves bázissal ciklizáljuk.

A ciklizálást alkalmas oldószerekben valósítjuk meg; oldószerként példaképpen megnevezzük a dioxánt, tetrahidrofuránt, acetonitrilt, piridint, dimetilformamidot, dimetilacetamidot, dimetilszulfoxidot, N-metil-pirrolidont, hexametilfoszfortriamidot, valamint az etilacetátöt, kloroformot és metilénkloridot és azok elegyeit.

Az a) eljárásváltozatban a ciklizálást valamilyen karbodiimiddel, előnyösen N,N'-diciklohexilkarbodiimiddel végezzük, amelyet előnyösen feleslegben alkalmazunk; meg kell jegyezni, hogy ennek során a szabad karboxilcsoportot tartalmazó III általános képletű kiindulási anyag először a diciklohexilizokarbamid (illetve egy analóg izokarbamid) aktivált észterévé alakul és ez az in situ képződött aktív észter azonnal tovább reagál. Egy aktív észtert képező komponens mint segédreagens beadagolása kétségtelenül egy aktív észter átmeneti képződéséhez kell, hogy visszavezessen; erre a célra a peptidkémiában szokásos, aktív észtert képző komponenseket használhatjuk, így különösen a

2,4,5-triklór-fenolt, 2- vagy 4-nitro-fenolt, pentaklór- és pentafluorfenolt, mindenek előtt azonban

188 081

N-hidroxi-vegyületeket, ezek közül különösen előnyös az N-hidroxi-szukcinimid, N-hidroxi-piperidin és mindenek előtt az I-hidroxi-benztriazol. Ennek az eljárásváltozatnak az esetén a reakcióhőmérséklet általában 0-70 ’C, előnyösen 35-55 ’C.

A b) eljárásváltozat esetén, amelyet kész aktív észterekkel, különösen a már említettekkel végzünk, a ciklizálás spontán végbemegy, amint a terminális aminocsoportot a bázis protonmentesíti. Az alkalmazott bázisok előnyösen kvaterner vagy mindenek előtt tercier aminok, például trietilamin vagy N-etil-morfolin. A reakciót előnyösen 10-30 ’C-on, különösen szobahőmérsékleten végezzük.

A c) eljárásváltozat esetén az első lépést, azaz a savazid salétromossavval vagy annak észterével való kezeléssel történő kialakítását előnyösen jelentősen magasabb kiindulási anyag koncentráció mellett valósítjuk meg, mint az azt követő ciklizálást. Célszerűen körülbelül egy egyenérték mennyiségű rövidszénláncú alkilnitrittel, így etil-, izoamil- és különösen terc-butilnitrittel végezzük a reakciót sósavas közegben, körülbelül -30 - körülbelül - 5 ’C hőmérsékleten, előnyösen körülbelül -20’C-on; kis nitritfelesleg megengedhető. Ezután a képződött azid oldatát a szükséges hígítás után, körülbelül 0 ’C és körülbelül 35 ’C közötti hőmérsékleten feleslegben levő szerves bázissal, például a fentiekben megadott bázisok egyikével meglúgosítjuk, és így, a b) eljárásváltozathoz hasonlóan spontán ciklizálást végzünk.

Ha kiindulási anyagként racém H-Gaba(Ar)— OH y-amino-vajsavat vagy annak származékát használjuk, egy sztérikusan egységes 5-11 részszekvencia kombinálásával diasztereomerpárt kapunk. Ezt a szokásos fizikai elválasztási módszerekkel az egyes diasztereomerekre bonthatjuk, például frakcionált kicsapással vagy kristályosítással, különböző kromatográfiás technikákkal, így adszorpciós, illetve megosztásos kromatográfiával, gélszűréssel és ioncserélővel történő elválasztással vagy két alkalmas oldószerrendszer közötti megosztással, különösen ellenáramú megosztással (Craig-eljárás). Különösen előnyösen megy végbe a megoszlás az utóbbi módszer esetén már ciklizált vegyületek esetén, azaz I általános képletű végtermékek és mindenek előtt azok II általános képletű ciklusos előtermékei esetén. (Az ekkor izolált, kevésbé hidrofil diasztereomert A izomerként, a hidrofilebbet B izomerként jelöljük.) Az ilyen elválasztáshoz megfelelő oldószerrendszerek a peptidkémiában általánosan ismertek, és többnyire klórozott szénhidrogének, rövidszénláncú alkoholok és víz kétfázisú kombinációjából állnak, amelyeket általában úgy választunk meg, hogy mindkét fázis közel azonos térfogatmennyiségben legyen jelen. Ezek a rendszerek szoros összhangban állnak a vékonyrétegkromatográfiában használt rendszerekkel és ezekből elvezethetők (lásd a kiviteli példákat is).

A II általános képletű vegyületekben előforduló védőcsoportok lehasitását önmagában ismert módon végezzük; a savas hidrolízist (acidolízis) például trifluorecetsavval, sósavval vagy hidrogénfluoriddal, savra érzékeny védőcsoportok esetén rövidszénláncú alifás karbonsavval, így hangyasavval és/vagy ecetsavval is végezzük, víz és adott esetben polihalogénezett rövidszénláncú alkanol vagy rövidszénláncú alkanon, így 1,1,1,3,3,3-hexafluorpropán-2-ol vagy hexafluoraceton jelenlétében. A redukcióval lehasítható csoportokat, különösen azokat, amelyek benzilcsoportokat tartalmaznak, előnyösen hidrogenolízissel távolítjuk el, például palládium katalizátorral való hidrogénezéssel. Az izonikotiniloxikarbonilcsoportot előnyösen cinkkel történő redukálással hasítjuk le.

A végtermékeket az elkülönítés módja szerint bázisok vagy savaddíciós sók alakjában kapjuk, ezeket utólag önmagában ismert módon egymásba átalakíthatjuk.

A fentiekben említett komplexek előállítását is ismert vagy azokkal ekvivalens módokon végezzük.

A szervetlen anyagokkal, így nehezen oldódó fém-, például alumínium- vagy cinkvegyületekkel alkotott komplexeket előnyösen ugyanúgy állítjuk elő, mint az ACTH komplexeit, például az illető fém oldható sójával, például cinkkloriddal vagy cinkszulfáttal való reagáltatással és valamilyen alkalifémfoszfáttal és/vagy -hidroxiddal való kicsapással. A szerves vegyületekkel, így polioxizselatinnal, karboximetilcellulózzal, polivinilpirrolidonnal, polifloretinfoszfáttal, poliglutaminsavval stb. alkotott komplexeket úgy állítjuk elő, hogy ezeket az anyagokat vizes oldatban összekeverjük a peptiddel. Hasonlóképpen állíthatunk elő oldhatatlan vegyületeket is alkálifémpolifoszfátokkal.

A II általános képletű vegyületek újak, és előállításuk szintén a találmány tárgyát képezi.

A III általános képletű lineáris peptídek is újak, és előállításuk szintén a találmány tárgyát képezi, önmagában ismert módszerekkel állítjuk elő őket, ennek során a felépítésükhöz szükséges aminosavakat, illetve kisebb peptidegységeket —CONH— kötések kialakítása közben tetszőleges időbeli sorrendben egymással kondenzáljuk, ekkor a reakcióban részt nem vevő funkcionális csoportokat átmenetileg megvédhetjük.

A fentiekben előnyösnek nevezett, Illa és Illb általános képletű lineáris peptídek különösen olyan közbenső termékekből hozzáférhetők, amelyeknek előállítását más szomatosztatin-analógok szintézisével összefüggésben a fentiekben már említett, 0 001 295 számon nyilvánosságra hozott európai szabadalmi bejelentésünkben tüzetesen leírtuk. Az ott leírt közbenső termékek az előnyös (D-trp)⁸szomatosztatin(5-l l)-szekvenciát már megfelelő, védett alakban tartalmazzák, és egy H-Gaba(Ar)— OH általános képletű, szubsztituált y-aminovajsav megfelelő származékával közvetlenül kondenzálhatok. Az utóbbi kiindulási anyagok ismertek vagy ismert eljárásokkal előállíthatok.

A III általános képletű lineáris peptídek, valamint azok közbenső termékeinek az előállításakor a terminális α-amino- és karboxilcsoportok védőcsoportjaiként különösen a hosszúszénláncú peptidek szintézisében szokásos védőcsoportok jönnek számításba, így például a szolvolízissel vagy redukcióval könnyen és szelektíven lehasítható csoportok.

α-Amino védőcsoportokként példaképpen meg5

188 081 nevezzük az alábbiakat: adott esetben, például halogénatommal, nitro-, rövidszénláncú alkil- vagy rövidszénláncú alkoxicsoporttal helyettesített divagy triaril-(rövidszénláncú alkil)-csoportok, így difenilmetil- vagy trifenilmetilcsoportok, például benzhidril-, tritil-, di-(p-metoxi)-benzhidrilcsoport vagy mindenek előtt a szénsavból levezethető, hidrogenolízissel lehasítható csoportok, így az aromás részben adott esetben halogénatomokkal, nitrocsoportokkal, rövidszénláncú alkil- vagy rövidszénláncú alkoxicsoportokkal helyettesített benziloxikarbonilcsoportok, például benziloxikarbonil-, p-bróm- vagy ρ-klór-benziloxikarbonil-, p-nitrobenziloxikarbonil-, p-metoxi-benziloxikarbonilcsoport, továbbá 2-(p-bifenilil)-2-propiloxikarbonilcsoport és hasonló, az 509 266 számú svájci szabadalmi leírásban leírt ariloxikarbonilcsoportok. Ekkor arra kell ügyelni, hogy az α-amino védőcsoportnak a lizingyök adott esetben jelenlevő ε-amino védőcsoportjának a kialakítása közben szelektíven lehasithatónak kell lennie. Az is előnyös továbbá, hogy ha lehasításkcr az adott esetben jelenlevő karboxil és hidroxil védőcsoport is sértetlen marad.

A karboxilcsoportokat például hidrazid-képzéssel vagy észterezéssel védjük meg. Az észterezéshez alkalmasak például a rövidszénláncú, adott esetben helyettesített alkanolok, így a metanol, etanol, ciánmetilalkohol, 2,2,2-triklór-etanol, benzoilmetilalkohol vagy különösen a terc-butilalkohol, azonban egy adott esetben helyettesített benzilalkohol is. A helyettesített alkanolok különösen előnyös csoportját jelentik az olyan etilalkoholok, amelyek //-helyzetben egy triszubsztituált szililcsoportot, így trifenilszilil-, dimetilbutilszilil- vagy mindenek előtt trimetilszililcsoportot tartalmaznak. Az ilyen alkoholok - amint ezt a 851 576 számú belga szabadalmi leírásban leírták - azért alkalmasak különösen jól a karboxilcsoportok megvédésére, mert a megfelelő //-szililetilészterek, például a //-(trimetilszilil)etilészter, bár ugyanolyan stabilisak, mint a többi alkilészter, azonban enyhe körülmények között, fluoridionok hatására az összes többi védőcsoport meghagyása közben szelektíven lehasíthatók.

Aktív észterek előállítására, így például a III általános képletű vegyületek esetén, alkalmasak például az elektronvonzó szubsztituensekkel helyettesített fenolok és tiofenolok, így fenol, tiofenol, tiokrezol, p-nitro-tíofenol, 2,4,5- és 2,4,6-triklór-fenol, pentaklórfenol, pentafluorfenol, o- és p-nitro-fenol, 2,4-dinitro-fenol, p-ciano-fenol, továbbá például az N-hidroxi-szukcinimid, N-hídroxi-ftálimid és N-hidroxi-piperidin.

A treoningyök hidroxilcsoportját észterezéssel vagy éterezéssel védhetjük meg a fentiekben leírt módon, azonban szabad is maradhat.

Ezeket a védőcsoportokat ismert módon hasíthatjuk le. így a benziloxikarbonilcsoportot hidrogenolízissel, az N-tritilcsoportot ásványi savakkal, így hidrogénhalogenidekkel, például hidrogénfluoriddal vagy előnyösen sósavval vagy valamilyen szerves savval, így hangyasavval, ecetsavval, klórecetsavval vagy trifluorecetsawal, vizes vagy abszolút trifluoretanolban mint oldószerben (2 346 147 számú német szövetségi köztársaságbeli nyilvánosságrahozatali irat) vagy vizes ecetsavval, a terc6 butiloxikarbonilcsoportot trifluorecetsawal vagy sósavval, a 2-(p-bifenilil)-izopropiloxikarbonilcsoportot vizes ecetsavval vagy például jégecet, 82,8%os hangyasav és víz 7 : 1 : 2 arányú elegyével vagy a 2 346 147 számú német szövetségi köztársaságbeli nyilvánosságrahozatali iratban ismertetett eljárással hasíthatjuk le.

A //-szililetilésztercsoportokat előnyösen fluoridionokat leadó reagensekkel, például kvaterner szerves bázisok fluoridjaival, így tetraetilammóniumfluoriddal hasítjuk le. Azonban a szokásos alkilészterekhez hasonlóan lúgos hidrolízissel is, például alkálifémhidroxidokkal, -karbonátokkal vagy -hidrogénkarbonátokkal lehasíthatók, vagy hidrazinolízissel, például hidrazinhidráttal, a megfelelő karbazoilcsoportokká alakíthatók. A terc-butilészterek lehasításához előnyösen acidolízist alkalmazunk, a benzilészterekhez hidrogenolízist.

A III általános képletű lineáris peptidek előállításához vezető aminosav- és/vagy peptidegységkondenzációt önmagában ismert módon valósítjuk meg. Ekkor előnyösen egy védett ot-aminocsoporttal és adott esetben aktivált terminális karboxilcsoporttal rendelkező aminosavat vagy pepiidet (aktív komponens) szabad α-aminocsoporttal és szabad vagy védett, például észterezett terminális csoporttal rendelkező aminosavval vagy peptiddel (passzív komponens) kapcsolunk, a képződött termékben a terminális aminocsoportot szabaddá tesszük és ezt a peptidet, amely szabad α-aminocsoportot és egy adott esetben védett terminális karboxilcsoportot tartalmaz, újra egy további aktív komponenssel, azaz aktivált terminális karboxilcsoporttal és szabad α-aminocsoporttal rendelkező aminosavval vagy peptiddel reagáltatjuk stb. A karboxilcsoportot például savaziddá, -anhidriddé, -imidazoliddá vagy aktivált észterré, például valamilyen fentiekben megadott észterré történő alakítással, vagy valamilyen karbodiimiddel, így N,N'-diciklohexilkarbodiimiddel való reagáltatással, adott esetben Nhidroxi-szukcinimid vagy egy szubsztituálatlan vagy például halogénatommal, metil- vagy metoxicsoporttal helyettesített 1-hidroxi-benztriazollal vagy 4-hidroxi-benzo-l,2,3-triazin-3-oxiddal (lásd például 1 917 690, 1 937 656 és 2 202 613 számú német szövetségi köztársaságbeli szabadalmi leírás) vagy Ν,Ν'-karbonildiimidazollal aktiválhatjuk. A legalkalmasabb kapcsolási módszerként a karbodiimides módszert kell megnevezni, továbbá az azidos módszert, az aktivált észteres módszert és az anhidrides módszert, valamint a Merrifield-, az N-karbonsavanhidrides vagy N-tiokarbonsavanhidrides módszert.

A III általános képletű lineáris peptidek különösen előnyös előállításakor kapcsolási módszerként a karbodiimides módszert használjuk N,N'-diciklohexilkarbodiimiddel, 1-hidroxi-benztriazol jelenlétében. A terminális karboxilcsoportot ekkor //-(trimetil-szilil)-etilészter alakjában megvédjük, az aktív komponens α-aminocsoportját benziloxikarbonilcsoporttal védjük meg, amelyet minden kapcsolás után hidrogenolízissel lehasítunk. A lizingyök ε-aminocsoportjának a megvédésére a tercbutoxikarbonilcsoporttal végzett acilezést és a treoningyök hidroxilcsoportjához a terc-butilcsoport-61

188 081 tál végzett éterezést használjuk. Mindkét ilyen védőcsoportot kívánt esetben utoljára, egy lépésben, savas hidrolízissel, például trífluorecetsavval, sósavval vagy hidrogénfluoriddal hasíthatjuk le.

Az alkalmazott eljárásmód szerint a vegyületeket bázisok vagy sóik alakjában kapjuk. A sókból önmagában ismert módon nyerhetjük ki a bázisokat. Az utóbbiakból savakkal, például olyan savakkal, amelyek a fentiekben megadott sók előállítására alkalmasak, újra gyógyászatilag alkalmazható savaddíciós sókat állíthatunk elő.

A szabad alakban vagy só alakjában levő új vegyületek közötti szoros összefüggés következtében az előzőekben és az alábbiakban szabad vegyületek vagy sóik alatt értelem- és célszerűen adott esetben a megfelelő sókat, illetve szabad vegyületeket is érteni kell.

A találmány az eljárás olyan foganatosítási módjait is magában foglalja, amikor egy tetszőleges eljáráslépésben közbenső termékként kapható vegyületből indulunk ki és a hiányzó eljáráslépéseket valósítjuk meg, vagy egy kiindulási anyagot a reakció körülményei között állítunk elő vagy egy származéka, adott esetben egy sója alakjában alkalmazunk.

A találmány szerinti eljárásban előnyösen olyan kiindulási anyagokat használunk, amelyek a fentiekben különösen előnyösnek nevezett vegyületekhez vezetnek.

A találmány tárgya továbbá olyan gyógyszerkészítmények előállítása, amelyek hatóanyagként I általános képletű vegyületeket tartalmazzák. Ezeket a gyógyászati készítményeket különösen a fentiekben megadott indikációkban alkalmazzuk intraperitoneálisan, így intravénásán, intramuszkulárisan vagy szubkután vagy pedig intranazálisan. A szükséges adag a kezelendő betegségtől, a betegség súlyosságától és a terápia hosszától függ. Az egyszeri adagok számát és mennyiségét, valamint a beadás módját legjobban a mindenkori beteg egyéni vizsgálata alapján határozhatjuk meg. Ezeknek a tényezőknek a meghatározási módja szakember számára ismert. Általában azonban injekció esetén egy ilyen vegyület terápiásán hatásos mennyisége körülbelül 0,001 - körülbelül 2 mg/testsúly kg dózistartományba esik. Az előnyös hatóanyag tartomány körülbelül 0,0015 - körülbelül 0,15 mg/testsúly kg, és a beadás módja intravénás infúzió vagy szubkután injekció. A parenterális beadásra szánt gyógyászati készítmények ennek megfelelően az adagolás módjától függően egyszeri adagban körülbelül 0,08 - körülbelül 15 mg találmány szerinti hatóanyagot tartalmaznak. A készítmények a hatóanyagon kívül általában még valamilyen puffért, például egy foszfát-puffért, amelynek a pH-t körülbelül 3,5 és 7 között kell tartania, továbbá az izotónia beállításához nátriumkloridot, mannitot vagy szorbitot tartalmaznak. A készítmények lehetnek fagyasztva szárítottak vagy oldott állapotban is tartalmazhatják a hatóanyagot; az oldatok előnyösen valamilyen antibakteriális hatású konzerválószert, például 0,2-0,3% 4-hidroxi-benzoesavmetilésztert vagy -etilésztert tartalmazhatnak. Ha az ilyen készítményekben a hatóanyagnak meghoszszabbított hatású komplex alakjában kell jelen lennie, ezt közvetlenül előállíthatjuk oly módon, hogy a komplexképző komponenst az injekciós oldathoz adjuk, amelyet például a fentiekben megadott módon állítunk elő. Adalékanyagként például 0,1-1,0 súly% cink(II)-sót, például cinkszulfátot használhatunk 0,5-5,0 súly% protaminnal, például protaminszulfáttal, ahol a mennyiségek az injekciós oldat össztérfogatára vonatkoznak. Ez a készítmény 3,5 - körülbelül 6,5 pH-értékű oldat vagy körülbelül 7,5-8,0 pH-értékü szuszpenzió.

Intranazális beadásra szánt készítmény lehet egy vizes oldat vagy zselé, egy olajos oldat vagy szuszpenzió, azonban egy zsírtartalmú kenőcs is. A hatóanyagból vizes oldatot például úgy készíthetünk, hogy az I általános képletű hatóanyagot vagy annak egy terápiásán alkalmazható savaddíciós sóját legfeljebb 7,2 pH-értékű vizes puffer-oldatban feloldjuk és az oldatot izotóniássá tevő anyagot adunk hozzá. A vizes oldathoz célszerűen egy polimer tapadást elősegítő anyagot, például polivinilpirrolidont és/vagy egy konzerválószert adunk. Az egyszeri adag körülbelül 0,08 - körülbelül 15 mg, előnyösen 0,25-10 mg, ezt körülbelül 0,05 ml oldat, illetve 0,05 g zselé tartalmazza.

Intranazális beadásra alkalmas olajos készítményt például úgy állíthatunk elő, hogy egy I általános képletű peptidet vagy annak egy terápiásán alkalmazható savaddíciós sóját olajban szuszpendáljuk adott esetben duzzasztószerek, így alumíniumsztearát és/vagy olyan felületaktív szerek (tenzidek) hozzáadásával, amelyeknek HLB-értéke (hidrofil-lipofil egyensúly) 10 alatti, ilyenek például a többértékü alkoholok zsírsavmonoészterei, például a glicerinmonosztearát, szorbitánmonolaurát, szorbitánmonosztearát vagy szorbitánmonooleát. Zsírtartalmú kenőcsöt például úgy állítunk elő, hogy a találmány szerinti hatóanyagot kenhető zsíros alapanyagban szuszpendáljuk, adott esetben egy 10 alatti HLB-értékű tenzid hozzáadásával. Emulziós kenőcsöt úgy állítunk elő, hogy a peptid hatóanyag vizes oldatát lágy, kenhető, zsíros alapanyagban eldörzsöljük, 10 alatti HLB-értékű tenzid hozzáadásával. Az összes ilyen, intranazális beadásra szánt készítmény konzerválószert is tartalmazhat. Az egyszeri adagok körülbelül 0,08 körülbelül 15 mg, előnyösen 0,25-10 mg-osak körülbelül 0,05 - körülbelül 0,1 g alapmasszában.

Intranazális beadásra alkalmasak továbbá az inhaláló, illetve befúvó készítmények, így a befúvásra használható kapszulák, amelyek lehetővé teszik, hogy a hatóanyagot por alakjában a belélegzett levegővel befújjuk, valamint az aeroszolok és sprayk. amelyek azt, hogy a farmakológiai hatóanyagot por alakjában vagy egy oldat vagy szuszpenzió cseppjeinek az alakjában eloszlathassuk. Λ port eloszlató tulajdonságokat mutató készítmények a hatóanyagon kívül általában segédanyagokat tartalmaznak; a befúvásra használható kapszulák például szilárd hordozóanyagokat, így laktózt tartalmaznak, az aeroszol és spray-készítmények például egy folyékony, szobahőmérséklet alatti forráspontú hajtógázt, valamint kívánt esetben további hordozóanyagokat, így folyékony vagy szilárd nem ionos vagy anionos tenzideket és/vagy szilárd hígítószereket. Azok a készítmények, amelyekben

-7188 081 a hatóanyag oldatban van, ezenkívül alkalmas hajtószert, továbbá szükség esetén egy további oldószert és/vagy egy stabilizálószert tartalmaznak. Hajtógáz helyett használhatunk nyomás alatti levegőt is, amelyet alkalmas sűrítő- és kiterjesztő készülék segítségével szükség szerint állítunk elő.

A találmány szerinti eljárással előállítható gyógyászati készítmények napi adagja 70 kg súlyú melegvérű esetében körülbelül 0,1 - körülbelül 120 mg hatóanyagnak megfelelő készítmény.

A találmány szerinti eljárást az oltalmi kör korlátozása nélkül az alábbi példákkal szemléltetjük. Rövidítésekként, például az aminosavak, peptidek, védöcsoportok stb. jelölésére az alábbi irodalmi helyeken megadott rövidítéseket használjuk: „Synthese von Pepiiden” (kiadó: Wünsch, E.), Houben-Weyl: Methoden dér organischen Chemie, XV. kötet, G. Thieme kiadó, Stuttgart, 1974. Különösen az alábbi rövidítéseket használjuk:

Boc	terc-butiloxikarbonilcsoport,
Bút	terc-butilcsoport (mint éterképző csoport),
DCC	Ν,Ν'-diciklohexil-karbamid,
DCCI	N,N'-diciklohexil-karbodiimid,
Gaba	4-amino-vajsav-csoport,
	—NH—(CH₂)₃—CO—,
OBzl	benziloxicsoport,
Z	benziloxikarbonilcsoport,
CD	cirkulárdikroizmus,
ORD	optikai rotációs diszperzió,
DC	vékonyrétegkromatográfia.
A vékonyrétegkromatográfiás vizsgálatokban, ha mást nem adunk meg, adszorbensként kovasavgélt és futtatószerként az alábbi rendszereket alkalmazzuk: Rendszer száma
52:	n-butanol-ecetsav-víz (75 : 7,5 : 21)
101:	n-butanol-piridin-ecetsav-víz
	(38 : 24 : 8 : 30)
111B:	n-butanol-piridin-25%-os vizes ammóniaoldat-viz (40 : 24 : 6 : 30)
112A	n-butanol-piridin-hangyasav-víz
	(42 : 24 : 4 : 20)
157A:	kloroform-metanol-víz-ecetsav
	(90 : 10 : 1 : 0,5)
157C:	kloroform-metanol-víz-ecetsav
	(75 : 27 : 5 : 0,5)
157F:	kloroform-metanol-víz-ecetsav
	(70 : 40 : 9 : 0,5)
	l.A példa

I— Asn-Phe-Phe-(D-trp)-Lys-Thr-Phe-(/?-fenil)Gaba

- izomer A 160 mg védett,

L Asn-Phe-Phe(D-trp)-Lys(Boc)-Thr(But)-Phe-(/f-fenil)Gaba -I

- izomer A képletű oktapeptidet 5 °C hőmérsékleten, nitrogén atmoszférában feloldunk 1,5 ml, 89 térfogat% trifluorecetsavat, 10 térfogat% vizet és 1 térfogat% tiolglikolsavat tartalmazó elegyben, az oldatot azonnal 25 °C-ra melegítjük, és 50 perc múlva ezen a hőmérsékleten a terméket 5 ml peroxidmentes éterrel kicsapjuk. A végtermék így kapott nyers trifluoracetátját leszűrjük, vákuumban megszárítjuk, 5 ml n ecetsavoldatban feloldjuk és ml anioncserélőn, például acetát formájú AG 1-X8 ioncserélőn (gyártja Bio-Rad Laboratories, Richmond, California, Amerikai Egyesült Államok) átszűrjük, majd az eluátumot liofilizáljuk.

A kapott, címben szereplő vegyület vékonyrétegkromatográfiásan, három rendszerben vizsgálva egységes

DC (cellulóz, Merck):

101 számú rendszer: R_f=0,66,

111B számú rendszer: R_r=0,48,

112A számú rendszer: R_f=0,60.

DC (vízben): A(nm)/mol. Ellipt.: 235/ —5800 (min); 223/ + 6600 (max.)

Hasonlóképpen eljárva állítjuk elő az

L Asn-Phe-Phe-(D-trp)-Lys-Thr-Phe-(Ar)Gaba -I képletű végterméket megfelelően védett oktapeptidekből:

(Ar)Gaba=/?-(2-Naftil)Gaba - izomer A DC: 157C számú rendszer: R_f 0,27;

(Ar)Gaba=/?-(2-Naftil)Gaba - izomer B DC: 157C számú rendszer: R_f 0,27;

(Ar)Gaba =/?-(4-Fluor-fenil)Gaba - izomer B

DC: 157C számú rendszer: R_f 0,29.

l.B példa

1— Asn-Phe-Phe-(D-trp)-Lys-Thr-Phe-(/?-fenil)Gaba —I

- izomer B 189 mg

L Asn-Phe-Phe-(D-trp)-Lys-(Boc)-Thr(But)-Phe-(/J-fenil)Gaba -I

- izomer B képletű védett oktapeptidet 5 °C hőmérsékleten, nitrogén atmoszférában feloldunk 1,9 ml, 89 térfogat% trifluorecetsavból, 10 térfogat% vízből és 1 térfogat% tioglikolsavból álló elegyben, az oldatot azonnal 25 °C-ra melegítjük, és a terméket 50 perc múlva ezen a hőmérsékleten 5 ml peroxidmentes éterrel kicsapjuk. A végtermék nyers trifluoracetátját leszűrjük, vákuumban megszárítjuk, 5 ml n ecetsavban feloldjuk és 15 ml anioncserélőn, például acetát formájú AG 1-X8 ioncserélőn (gyártja Bio-Rad Laboratories, Richmond, California, Amerikai Egyesült Államok) átszűrjük.

Az eluátomot vákuumban bepároljuk és a maradékot 270 lépcsős ellenáramú megosztásnak vetjük alá n-butanol-ecetsav-víz rendszerben (2400 : 600 : 3000). A 229-250 fokozatokban kapott fázisokat (K = 6,7) összegyűjtjük, vákuumban bepároljuk és 1 : 1 arányú terc-butanol-víz elegyből liofilizáljuk.

A kapott, címben szereplő vegyület vékonyrétegkromatográfiásan, három rendszerben vizsgálva egységes.

DC (cellulóz, Merck):

101 számú rendszer: R_f=0,64

111B számú rendszer: R_r=0,48

112A számú rendszer: R_f=0,58 CD (vízben): 2(nm)/mol. Ellipt.: 235/-3700 (min); 220/ + 35 000 (max).

Az l.A és l.B példában kiindulási anyagként alkalmazott peptideket az alábbi módon állíthatjuk elő.

188 081

7.7 lépés dl-H-(/?-Fenil)Gaba-OBzl-p-toluolszulfonát

1,10 g d 1 -4-amino-3-fenil-vajsav és 1,17 g p-tolu-^!olszulfonsav-monohidrát elegyét 3,2 ml benzilalko- ⁵hóiban és 50 ml benzolban normál nyomáson lassan addig desztilláljuk, amíg 3 óra alatt összesen 40 ml, 70-90 °C forráspontú frakciót fel nem fogunk. A tiszta reakcióelegyet először vízsugárszivattyúval előállított, majd nagy vákuumban, körül- ¹⁰bélül 60 °C-on 3 ml-re betöményítjük. A kivált kristálypépet 15 ml éterrel elkeverjük, a kristályokat leszűrjük és 10 ml éterrel mossuk. Ezt az anyagot további tisztítás céljából egy órán keresztül keverjük szobahőmérsékleten 10 ml éterrel, majd ¹⁵leszűrjük, éterrel mossuk és vákuumban megszárítjuk. Olvadáspont: 145-148 °C.

DC: [kloroform-metanol-víz (14 : 6 : 1)]:

R_f=0,40 [kloroform-metanol (85 : 15)]: R_r=0,17 ²⁰

Hasonlóképpen eljárva állítjuk elő az alábbi vegyületeket is:

a) dl-4-amino-3-(2-naftil)-vajsavból a dl-H-[/?(2-naftil)]-Gaba-OBzl-p-toluolszulfonátot, DC: 157C számú rendszer: R_f=0,48 és ²⁵

b) dl-4-amino-3-(4-fluor-fenil)-vajsavból a dlH-[6-(4-fluor-fenil)]-Gaba-OBzl-p-toluolszulfonátot, DC: 157 számú rendszer: R_f=0,45.

7.2 lépés

Z-Asn-Phe-Phe~(D-trp)-Lys( Boc)-Thr( Bút) -Phe-[ d,l-( β-fenil) Gaba ]-OBzl

500 mg Z-Asn-Phe-Phe-(D-trp)-Lys(Boc)Thr(But)-Phe-OH (lásd a fentiekben hivatkozott európai szabadalmi bejelentés 1. példájának 1.7 lépését) és 189 mg dl-4-amino-3-fenil-vajsav-benzilészter-p-toluolszulfonát (1.1 lépés) 2 ml dimetilformamiddal készített elegyét összekeverjük 0,048 ml ⁴⁰N-metil-morfolinnal, 58 mg N-hidroxi-benztriazollal és 104 mg Ν,Ν'-diciklohexil-karbodiimiddel, és az elegyet 20 órán keresztül szobahőmérsékleten állni hagyjuk. A reakcióelegy feldolgozása céljából a kivált Ν,Ν’-diciklohexil-karbamidot centrifugá- 45 lássál elkülönítjük, a felülúszót 15 ml vízzel összekeverjük és leszűrjük. A kapott szilárd anyagot; további tisztítás céljából 10 percen át keverjük 3 ml etanollal, majd a szuszpenziót 0 °C-ra hütjük, a; tiszta terméket leszűrjük és vákuumban megszánt- 50 juk.

DC: [kloroform-metanol (85 : 15)]: R_f=0,70.

Hasonlóképpen eljárva állítjuk elő az 1.1 lépésben megadott, megfelelő vegyületekből az alábbiakat* 55

a) Z-Asn-Phe-Phe-(D-trp)-Lys(Boc)-Thr(But)-Phe-/d 1 -[/?-(2-naftil)]Gaba/-OBzl,

DC: 157A számú rendszer: R_r=0,65; és

b) Z-Asn-Phe-Phe-(D-trp)-Lys(Boc)-Thr(But)-Phe-/d 1 -[/?-(4-fluor-fenil)]óaba/-OBzl, 60

DC: 157A számú rendszer: R_f=0,64.

1.3 lépés

H-Asn-Phe-Phe-(D-trp)-Lys(Boc)-Thr(But)-Phe-[dl-G?-fenil)-Gaba]-OH

453 mg Z-Asn-Phe-Phe-(D-trp)-Lys(Boc)-Thr(But)-Phe-[d 1 -(/i-fenil)Gaba]-OBzl (1.2 lépés) 20 ml dimetilformamiddal készített oldatát 50 mg, aktív szénre felvitt palládium (10%) hozzáadása után 3 órán keresztül hidrogénezzük szobahőmérsékleten és normál nyomáson. A reakcióelegy feldolgozása céljából az oldatot a katalizátor kiszűrése után nagy vákuumban 2 ml-re betöményítjük, a terméket 25 ml peroxidmentes éterrel kicsapjuk, leszűrjük és vákuumban megszárítjuk. A nyersterméket további tisztítás nélkül használjuk fel az 1.4 lépéshez (ciklizálás).

Hasonlóképpen eljárva állítjuk elő az 1.2 lépésben megadott megfelelő vegyületekből az alábbiakat:

a) H-Asn-Phe-Phe-(D-trp)-Lys(Boc)-Thr(But)-Phe-/dl-[/?-(2-naftil)]Gaba/-OH;

DC: 157C számú rendszer: R_f=0,67 és

b) H-Asn-Phe-Phe-(D-trp)-Lys(Boc)-Thr(But)-Phe-/d 1 -[/?-(4-fluor-fenil)]Gaba/-OH,

DC: 157A számú rendszer: R_f=0,06.

7.4 lépés

L- Asn-Phe-Phe-tD-trpPLystBocpThrtBuO-Phe-OÍ-feniOGaba^-'

386 mg nyers H-Asn-Phe-Phe-(D-trp)-Lys(Boc)Thr-(But)-Phe-[dl-G?-fenil)Gaba]-OH (1.3 lépés), 400 mg N-hidroxi-benztriazol és 610 mg N,N'diciklohexil-karbodiimid 300 ml dimetilformamiddal készített oldatát 20 órán keresztül 50 °C hőmérsékleten tartjuk. Feldolgozás céljából az oldószert nagy vákuumban, körülbelül 30 °C-on lepároljuk, és a maradékot 15 ml etilacetáttal eldörzsöljük. A kivált diciklohexil-karbamidot szűréssel eltávolítjuk, a szűrletet etilacetáttal 50 ml-re felhígítjuk, három alkalommal, 40-40 ml n vizes oxálsav-oldattal, majd vízzel semlegesre mossuk, nátriumszulfát felett megszárítjuk és vákuumban bepároljuk. A nyersterméket tisztítás és az A és B diasztereomer elválasztása céljából 440-lépcsős ellenáramú megosztásnak vetjük alá metanol-víz-kloroform-széntetraklorid rendszerben (2700 : 675 : 900 : 1575 térfogatrész). A 104-155 fokozatokban kapott fázisok (K = 0,41) tartalmazzák a két diasztereomer egyikét (A izomer), míg a 164-207 fokozatokban található fázisok (K = 0,70) a másikat (B izomer). A megfelelő fokozatok fázisait egyesítjük és vákuumban bepároljuk. A maradékot 20 ml terc-butanolban feloldjuk és liofilizáljuk, így mindig egy, a fenti összegképletű, vékonyrétegkromatográfiásan egységes diasztereomert kapunk.

DC: [kloroform-metanol (85—15)]

A izomer: R_f=0,65, B izomer: R_f=O,55;

[kloroform-metanol-víz (14:6: 1)]

A izomer: R_r=0,95, B izomer: R_f=0,90.

Hasonlóképpen eljárva állítjuk elő az 1.3 lépésben megadott, megfelelő vegyületekből az alábbiakat:

188 081

a)

L Asn-Phe-Phc-(D-trp)-Lys(Boc)-Thr(But)-Phe-[/?-(2-naftil)]-GabaJ

A izomer: K=0,27; DC: 157A számú rendszer: R_r=0,39;

B izomer: K = 0,51; DC: 157A számú rendszer: R_r=0,32, valamint

b) :Asn-Phe-Phe-(D-lrp)-Lys(Boc)-Thr(But)-Phe-[/?-(4-fluor- I fenil)]Gaba —’

B izomer: K = 0,78; DC: 157A számú rendszer:

R_f=0,31.

2. A példa

L- Asn-Phe-Phe-(D-trp)-Lys-Thr-Phe-[/}-( 1 -naftil)]Gaba

A izomer 250 mg

EAsn-Phe-Phe-(D-trp) Lys(Boc)-Thr(But)-Phe-[/í-(l-naftil)]- I

Gaba -J

A izomer képletű védett oktapeptidet 5 °C hőmérsékleten, nitrogén atmoszférában feloldunk 2,5 ml, 89 térfogat% trifluorecetsavat, 10 térfogat% vizet és 1 térfogat) tioglikolsavat tartalmazó elegyben, az oldatot azonnal 25 ’C-ra melegítjük, majd a terméket 50 perc múlva ezen a hőmérsékleten 8 ml peroxidmentes éterrel kicsapjuk. A nyerstermék így kapott nyers trifluoracetátját leszűrjük, vákuumban megszárítjuk, 5 ml n ecetsav-oldatban feloldjuk és 15 ml anioncserélőn, például acetát formában levő AG 1-X8 ioncserélőn (gyártja Βίο-Rad Laboratories, Richmond, Califomia, Amerikai Egyesült Államok) leszűrjük, az eluátumot liofilizáljuk.

A kapott, címben szereplő vegyület vékonyrétegkromatográfiásan, három rendszerben vizsgálva egységes:

DC (cellulóz, Merck):

101 számú rendszer: R_f=0,60

111B számú rendszer: R_f=0,45

112A számú rendszer: R_f = O,58 CD (1%-os vizes ecetsavban):

Z(nm)/mol. Ellipt.: 226/8000 (min).

2.B példa

I— Asn-Phe-Phe-(D-trp)-Lys-Thr-Phe-[/í-(l-naftil)]-Gaba —1

-B izomer 257 mg

I Asn-Phe-Phe(D-trp)-Lys(Boc)-Thr(But)-Phe-[/!-(l-naftil)]- I

L Gaba —I

-B izomer képletű védett oktapeptidet 5 ’C hőmérsékleten, nitrogén atmoszférában feloldunk 2,5 ml, 89 térfogat% trifluorecetsavat, 10 térfogat% vizet és 1 térfogat% tíolglikolsavat tartalmazó elegyben, az oldatot azonnal 25 ’C-ra melegítjük, és a terméket 50 perc múlva ezen a hőmérsékleten 10 ml peroxidmentes éterrel kicsapjuk. A végtermék így kapott nyers trifluoracetátját leszűrjük, vákuumban megszárítjuk, 5 ml n ecetsav-oldatban feloldjuk, és 15 ml ioncserélőn (gyártja Bio-Rad Laboratories, Richmond, California, Amerikai Egyesült Államok) átszűrjük, az eluátumot liofilizáljuk.

DC (cellulóz, Merck):

101 számú rendszer: R_r=0,57

111B számú rendszer: R_r=0,44

112A számú rendszer: R_f=O,53 CD (1%-os vizes ecetsavban):

(nm)/mol. Ellipt.: 237/ + 6500 (max); 231/- 7000 (min); 223/+ 12 000 (max).

Á 2.A és 2.B példában kiindulási anyagként alkalmazott peptideket az alábbi módon állítjuk elő.

2.1 lépés d 1 -H-[/?-( 1 -Naftil)]Gaba-OBzl-p-toluolszulfonát

1,05 g dl-4-amino-3-(l-naftil)-vajsav és 0,871 ,g p-toluolszulfonsav-monohidrát 2,4 ml benzilalkohollal és 50 ml benzollal készített elegyét normál nyomáson, lassan addig desztilláljuk, amíg 3 óra alatt összesen 40 ml, 70-90 ’C forráspontú frakciót fel nem fogunk. A tiszta reakcióelegyet először vízsugárszivattyúval előállított, majd nagy vákuumban, körülbelül 60 ’C hőmérsékleten 3 ml-re be tömény ítj ük. A kivált kristálypépet 15 ml éterrel összekeverjük, a kristályokat leszűrjük és 10 ml éterrel mossuk. További tisztítás céljából ezt az anyagot szobahőmérsékleten, egy órán át keverjük 10 ml éterrel, majd leszűrjük, éterrel mossuk és vákuumban megszárítjuk. Olvadáspont: 152— 154’C.

DC: [kloroform-metanol-víz (14:6:1)]:

R_f=0,60, [kloroform-metanol (85 : 15)]: R_f=0,28.

2.2 lépés

Z-Asn-Phe-Phe-(D-trp)-Lys(Boc)-Thr(But)-Phe-[dl-j?-(l-naftil)]Gaba-OBzI

700 mg Z-Asn-Phe-Phe-(D-trp)-Lys(Boc)Thr(But)-Phe-OH (1.2 lépés) és 295 mg dl-4amino-3-( 1 -naftil)-vajsav-benzilészter-p-toluolszulfonát (2.1 lépés) 2 ml dimetilformamiddal készített elegyét összekeverjük 0,067 ml N-metilmorfolinnal, 81 mg N-hidroxi-benztriazollal és 147 mg Ν,Ν'-diciklohexil-karbodiimiddel, és a reakcióelegyet 20 órán át szobahőmérsékleten állni hagyjuk. A reakcióelegy feldolgozása céljából a kivált Ν,Ν'-dicikIohexil-karbamidot kiszűrjük, a felülúszót 20 ml vízzel összekeverjük és leszűrjük. A kapott szilárd anyagot további tisztítás céljából 10 percen keresztül 3 ml metanollal keverjük, a szuszpenziót 0 ’C-ra hűtjük, a tiszta terméket leszűrjük és vákuumban megszárítjuk.

DC: [kloroform-metanol (85 : 15)]: R_f=0,72, [kloroform-metanol-víz (14 : 6 : 1)]: R_f=0,93.

-101

188 081

2.3 lépés

H-Asn-Phe-Phe-(D-trp)-Lys(Boc)-Thr(But)-Phe-[d 1 -β-( 1 -naftil)]Gaba-OH

794 mg Z-Asn-Phe-Phe-(D-trp)-Lys(Boc)-Thr(But)-Phe-[dl-/?-(Lnaftil)]Gaba-OBzl (2.2 lépés) 40 ml dimetilformamiddal készített oldatát 80 mg, aktív szénre felvitt palládium katalizátor (10%) hozzáadása után 4 órán át szobahőmérsékleten és normál nyomáson hidrogénezzük. A reakcióelegy feldolgozása céljából az oldatot a katalizátor kiszűrése után nagy vákuumban 2 ml-re betöményítjük, a terméket 40 ml, peroxidmentes éterrel kicsapjuk, leszűrjük és vákuumban megszárítjuk. A nyersterméket további tisztítás nélkül használjuk fel a 2.4 lépéshez (ciklizálás).

2.4 lépés

EAsn-Phe-Phe-(D-trp)-Lys(Boc)-Thr(But)-Phe-[/J-( 1 -naftil)]- I

Gaba

678 mg nyers H-Asn-Phe-Phe-(D-trp)-Lys(Boc)Thr(But)-Phe-[dl-/?-(l-naftil)]Gaba-OH (2,3 lépés), 676 mg N-hidroxi-benztriazol és 1030 mg N,N'diciklohexil-karbodiimid 500 ml dimetilformamiddal készített oldatát 20 órán keresztül 50 ’C hőmérsékleten tartjuk. A reakcióelegy feldolgozása céljából az oldószert nagy vákuumban, körülbelül 30 ’C-on bepároljuk, és a maradékot 20 ml etilacetáttal eldörzsöljük. A kivált diciklohexil-karbamidot szűréssel eltávolítjuk, a szűrletet etilacetáttal 200 ml-re felhígítjuk, három alkalommal, 50-50 ml n vizes oxálsav-oldattal, majd vízzel semlegesre mossuk, nátriumszulfát felett megszárítjuk és vákuumban bepároljuk. A nyersterméket tisztítás céljából 560-lépcsős ellenáramú megosztásnak vetjük alá metanol-víz-kloroform-széntetraklorid (2700: 675 :900 : 1575 térfogatrész) rendszerben. A 89-143 fokozatokban található fázisok (K = 0,22) tartalmazzák a két diasztereomer egyikét (A izomer), a 152-224 fokozatokban található fázisok (K = 0,47) a másikat (B izomer). A megfelelő fokozatok fázisait egyesítjük és vákuumban bepároljuk. A maradékot 20 ml terc-butanolban feloldjuk és liofilizáljuk, így mindig egy, a fenti öszszegképletü, vékonyrétegkromatográfiásan egységes diasztereomert kapunk.

DC: [kloroform-metanol (85-15)]:

A izomer: R_f=0,60, B izomer: R_r=0,50.

3.A példa

1— Asn-Phe Phe-(D-trp)-Lys-Thr-Phe-0?-ciklohexil)-Gaba —1

- A izomer 182 mg

LAsn-Phe-Phe-(D-trp)-Lys(Boc)-Thr(But)-Phe-(/J-ciklohexil)-|

Gaba -1

- A izomer képletű oktapeptidet 5 ’C hőmérsékleten, nitrogén atmoszférában feloldunk 1,8 ml, 89 térfogat% trifluorecetsavat, 10 térfogat% vizet és 1 térfogat% tiolglikolsavat tartalmazó elegyben, az oldatot azonnal 25 °C-ra melegítjük és a terméket 50 perc múlva ezen a hőmérsékleten 6 ml 2 : 1 arányú hexán éter eleggyel kicsapjuk. A végtermék ily módon előállított nyers trifluoracetátját leszűrjük, vákuumban megszáritjuk, 5 ml n ecetsav-oldatban feloldjuk és 15 ml anioncserélón, például acetát formában levő AG 1-X8 ioncserélőn (gyártja BioRad Laboratories, Richmond, California, Amerikai Egyesült Államok) átszűrjük, az eluátumot liofilizáljuk.

A kapott címben szereplő vegyület vékonyrétegkromatográfiásan három rendszerben vizsgálva egységes.

DC: 101 számú rendszer: R_r=0,88,

111B számú rendszer: R_r=0,50,

112A számú rendszer: R_f=0,78.

3.B példa

L. Asn-Phe-Phe-(D-trp)-Lys-Thr-Phe-(/?-ciklohexil)-Gaba J

- B izomer

167 mg |Asn-Phe-Phe-(D-trp)-Lys(Boc)-Thr(Bul)-Phe-ü?-ciklohexil)- I

L- Gaba —I

- B izomer képletű védett oktapeptidet 5 ’C hőmérsékleten, nitrogén atmoszférában feloldunk 1,7 ml, 89 térfoga t% trifluorecetsavat, 10 térfogat% vizet és 1 térfogat% tioglikolsavat tartalmazó elegyben, az oldatot azonnal 25 ’C-ra melegítjük, és a terméket 50 perc múlva ezen a hőmérsékleten 6 ml 2 : 1 arányú hexán-éter eleggyel kicsapjuk. A végtermék így kapott, nyers trifluoracetátját leszűrjük, vákuumban megszárítjuk, 5 ml n ecetsav-oldatban feloldjuk és . 15 ml anioncserélón, például AG 1-X8 ioncserélőn (gyártja Βίο-Rad Laboratories, Richmond, California, Amerikai Egyesült Államok) átszűrjük, az eluátumot liofilizáljuk.

A kapott, címben szereplő vegyületet vékonyrétegkromatográfiásan, három rendszerben vizsgálva egységes.

DC: 101 számú rendszer: R_f=0,83,

111B számú rendszer: R_f=0,75,

112A számú rendszer: R_f=0,70.

A 3.A és 3.B példában kiindulási anyagként alkalmazott vegyületeket az alábbi módon állítjuk elő.

3.1 lépés d 1 -H-(/?-CikIohexil)Gaba-OBzl-p-toluolszulfonát

0,50 g dl-4-amino-3-cikIohexiI-vajsav-hidrokíorid és 0,428 p-toluolszulfonsav-monohidrát 1,2 ml benzilalkohollal és 40 ml benzollal készített elegyét normál nyomáson lassan addig desztilláljuk, amíg 3 óra alatt összesen 30 ml, 70-90 °C forráspontú frakciót fel nem fogunk. A tiszta reakcióelegyet vízsugárszivattyúval előállított, majd nagy vákuumban, körülbelül 60 ’C hőmérsékleten 3 ml-re betöményítjük. A kivált kristálypépet 15 ml éterrel elkeverjük, a kristályokat leszűrjük és 10 ml éterrel mossuk. További tisztítás céljából ezt az anyagot szobahőmérsékleten, egy órán át keverjük 10 ml

-111

188 081 éterrel, majd leszűrjük, éterrel mossuk és vákuumban megszárítjuk.

DC: [kloroform-metanol-víz (14 : 6 : 1)]: R_r=0,48, [kloroform-metanol (85 : 15)]: R_f=0,15.

3.2 lépés

Z-Asn-Phe-Phe-(D-trp)-Lys(Boc)-Thr(But)-Phe-(d l -/Fciklohexil)Gaba-O Bzl

1,06 g Z-Asn-Ph’e-Phe-(D-trp)-Lys(Boc)Thr(But)-Phe-OH (1.2 lépés) és 448 mg dl-4amino-3-ciklohexil-vajsav-benzilészter-p-toluolszulfonát (3.1 lépés) 5 ml dimetilformamiddal készített elegyét összekeverjük 0,111 ml N-metilmorfolinnal, 123 mg N-hidroxi-benztriazollal és 223 mg Ν,Ν'-diciklohexil-karbodiimiddel, és az elegyet 20 órán keresztül szobahőmérsékleten állni hagyjuk. Az elegyböl feldolgozás céljából centrifugálással eltávolítjuk a kivált N,N'-diciklohexilkarbamidot, a felülúszót összekeverjük 20 ml vízzel és leszűrjük. Az így kapott szilárd anyagot a további tisztítás céljából 10 percen át 3 ml metanollal keverjük, a szuszpenziót 0 °C-ra hűtjük, a tiszta terméket leszűrjük és vákuumban megszárítjuk.

DC: [kloroform-metanol (85 : 15)]: R_f=0,80, [kloroform-metanol-víz (14 : 6 : 1)]: R_f=0,95.

3.3 lépés

H-Asn-Phe-Phe-(D-trp)-Lys(Boc)-Thr(But)-Phe-(d 1 -/?-ciklohexil)-Gaba-OH

980 mg Z-Asn-Phe-Phe-(D-trp)-Lys(Boc)Thr(But)-Phe-(dl-/?-ciklohexil)Gaba-OBzl (3.2 lépés) 50 ml dimetilformamiddal készített oldatát 100 mg, aktív szénre felvitt palládium (10%) hozzáadása után 4 órán át hidrogénezzük szobahőmérsékleten és normál nyomáson. Az elegy feldolgozása céljából az oldatot a katalizátor kiszűrése után nagy vákuumban 2 ml-re betöményítjük, a terméket 40 ml peroxidmentes éterrel kicsapjuk, leszűrjük és vákuumban megszárítjuk. A nyersterméket további tisztítás nélkül használjuk fel a következő

3.4 lépéshez (ciklizálás).

3.4 lépés

Asn-Phe-Phe-(D-trp)-Lys(Boc)-Thr(But)-Phe-(/J-ciklohexil)Gaba 836 mg nyers H-Asn-Phe-Phe-(D-trp)-Lys(Boc)Thr-(But)-Phe-(dl-/J-ciklohexil)Gaba-OH (3.3 lépés), 860 mg N-hidroxi-benztriazol és 1.31 g N,N'diciklohexil-karbodiimid 640 ml dimetilformamiddal készített oldatát 20 órán keresztül 50 ’C hőmérsékleten tartjuk. Az elegy feldolgozása céljából az oldószert nagy vákuumban, körülbelül 30 ’C hőmérsékleten lepároljuk, és a maradékot 20 ml etilacetáttal eldörzsöljük. A kivált diciklohexilkarbamidot szűréssel eltávolítjuk, a szűrletet etilacetáttal 200 ml-re felhígítjuk, három alkalommal 50-50 ml n vizes oxálsav-oldattal, majd vízzel semlegesre mossuk, nátriumszulfát felett megszárítjuk és vákuumban bepároljuk. A nyersterméket tisztítás céljá12 ból 400-lépcsős ellenáramú megosztásnak vetjük alá metanol-kloroform-víz-széntetraklorid rendszerben (2700:900:675:1575 térfogatrész). A 81-108 fokozatokban található fázisok (K = 0,30) tartalmazzák a két diasztereomer egyikét (A izomer), a 120-147 fokozatokban található fázisok (K = 0,49) a másikat (B izomer). A megfelelő fokozatok fázisait egyesítjük és vákuumban bepároljuk. A maradékot 20 ml terc-butanolban feloldjuk és liofilizáljuk, így mindig egy, fenti összegképletü, vékonyrétegkromatográfiásan egységes diasztereomert kapunk.

DC: [kloroform-metanol (85: 15)] A izomer: R_f=0,51, B izomer: R_f=0,42.

4. A példa

1- Asn-Phe-Phe-(D-trp)-Lys-Thr-Phe-[/?-(3-fenoxi-fenil)]Gaba -I

- A izomer

280 mg

Γ Asn-Phe-Phe-(D-trp)-Lys(Boc)-Thr(But)-Phe-[/l-(3-fenoxi- I

I— fenil)]Gaba —«

- A izomer képletű védett oktapeptidet 5 ’C hőmérsékleten, nitrogén atmoszférában feloldunk 2,8 ml, 89 térfogat% trifluorecetsavat, 10térfogat% vizet és 1 térfogat% tioglikolsavat tartalmazó elegyben, az oldatot azonnal 25 ’C-ra melegítjük és a terméket 50 perc múlva ezen a hőmérsékleten 25 ml peroxidmentes éterrel kicsapjuk. A végtermék így előállított nyers trifluoracetátját leszűrjük, vákuumban megszárítjuk, 5 ml n ecetsav-oldatban feloldjuk és 15 ml anioncserélőn, például AG 1-X8 ioncserélőn (gyártja Bio-Rad Laboratories, Richmond, California, Amerikai Egyesült Államok) átszűrjük, az eluátumot liofilizáljuk.

DC: 52 számú rendszer: R_r=0,49,

111B számú rendszer: R_f=0,40,

157F számú rendszer: R_r=0,53.

CD: 1%-os vizes ecetsavban: z/mol Ellipt.

[nm/fok · cm² · dmol¹]: 210/-37430(min); 222/ -534(max); 230/- 15506(min).

4.B példa

L Asn-Phe-Phe-(D-trp)-Lys-Thr-Phe-[/?-(3-fenoxi-fenil)]Gaba -1

- B izomer 268 mg

EAsn-Phe-Phe-(D-trp)-Lys(Boc)-Thr(But)-Phe-[/?-(3-fenoxi- I fenil)]Gaba —I

- B izomer képletű védett oktapeptidet 5 ’C hőmérsékleten, nitrogén atmoszférában feloldunk 2,7 ml, 89 térfoga t% trifluorecetsavat, 10 térfogat% vizet és 1 térfogat% tioglikolsavat tartalmazó elegyben, az oldatot azonnal 25 ’C-ra melegítjük, és a terméket 50 perc múlva ezen a hőmérsékleten 30 ml peroxidmentes éterrel kicsapjuk. A végtermék így kapott nyers

-121

188 081 trifluoracetátját leszűrjük, vákuumban megszárítjuk, 5 ml n ecetsav-oldatban feloldjuk, és 15 ml anioncserélőn, például AG 1-X8 ioncserélőn (gyártja Bio-Rad Laboratories, Richmond, California, Amerikai Egyesült Államok) átszűrjük, az eluátumot liofilizáljuk.

A kapott, címben szereplő vegyület vékonyrétegkromatográfiásan 3 rendszerben vizsgálva egységes:

DC: 52 számú rendszer: R_f=0,49,

111B számú rendszer: R_f=0,38,

157F számú rendszer: R_f=0,52.

CD: 1%-os vizes ecetsavban: A/mol. Ellipt.

[nm/fok · cm² · dmol^-1]: 220/ + 30 354(max); 232,5/— 13 81 l(min).

A 4.A és 4.B példában kiindulási anyagként alkalmazott peptideket az alábbi módon állítjuk elő.

4.1 lépés d 1 -H-[/?-(3-Fenoxi-fenil)]Gaba-OBzl-p-toluol-szulfonát

0,500 g dl-4-amino-3-(3-fenoxi-fenil)-vajsavklorid és 0,308 g p-toluolszulfonsav-monohidrát 0,85 ml benzilalkohollal és 70 ml benzollal készített elegyét normál nyomáson lassan addig desztilláljuk, amíg 3 óra alatt 30 ml, 70-90 °C forráspontú frakciót fel nem fogunk. A tiszta reakcióelegyet vízsugárszivattyúval előállított, majd nagy vákuumban körülbelül 60 °C hőmérsékleten 3 ml-re betöményítjük. A kivált kristálypépet 15 ml éterrel elkeverjük, a kristályokat leszűrjük és 10 ml éterrel mossuk. Ezt az anyagot további tisztítás céljából szobahőmérsékleten egy órán át keverjük 10 ml éterrel, majd leszűrjük, éterrel mossuk és vákuumban megszárítjuk.

DC: [kloroform-metanol-víz (14 : 6 : 1)]: R_f=0,61, [kloroform-metanol (85 : 15)]: R_f=0,30.

4.2 lépés

Z-Asn-Phe-Phe-(D-trp)-Lys(Boc)-Thr(But)-Phe-[d 1 -/?-(3-fenoxi-fenil)]Gaba-OBzl

819 mg Z-Asn-Phe-Phe(D-trp)-Lys(Boc)Tjr(But)-Phe-OH (1.2 lépés) és 341 mg dl-4-amino3-(3-fenoxi-fenil)-vajsav-benzilészter-p-toluolszulfonát (4.1 lépés) 6 ml dimetilformamiddal készített elegyét összekeverjük 0,071 ml N-metil-morfolinnal, 95 mg N-hidroxi-benztriazollal és 171 mg Ν,Ν'-dicikIohexil-karbodiimiddel, és az elegyet 20 órán keresztül szobahőmérsékleten állni hagyjuk. Az elegy feldolgozása céljából a kivált diciklohexilkarbamidot centrifugálással eltávolítjuk, a felülúszót 20 ml vízzel elkeverjük és a terméket leszűrjük. A kapott szilárd anyagot további tisztítás céljából 10 percen át 3 ml metanollal keverjük, a szuszpenziót 0 °C-ra lehűtjük, a tiszta terméket leszűrjük és vákuumban megszárítjuk.

DC: [kloroform-metanol (85 : 15)]: R_f=0,76, [kloroform-metanol-víz (16 : 6 : 1)]: R_f=0,94.

4.3 lépés

H-Asn-Phe-Phe-(D-trp)-Lys(Boc)-Thr(But)-Phe-[dl-/?-(3-fenoxi-feniI)]Gaba-OH

943 mg Z-Asn-Phe-Phe-(D-trp)-Lys(Boc)Thr(But)-Phe-[d 1 -/?-(3-fenoxi-fenil)]Gaba-OBzl (4.2 lépés) 30 ml dimetilformamiddal készített oldatát 100 mg, aktív szénre felvitt palládium (10%) hozzáadása után 4 órán keresztül szobahőmérsékleten és normál nyomáson hidrogénezzük. Az oldatot feldolgozás céljából a katalizátor kiszűrése után nagy vákuumban 2 ml-re betöményítjük, a terméket 40 ml peroxidmentes éterrel kicsapjuk, leszűrjük és vákuumban megszárítjuk. A nyersterméket további tisztítás nélkül használjuk fel a következő,

4.4 lépéshez (ciklizálás).

4.4 lépés

Asn-Phe-Phe-(D-trp)-Lys(Boc)-Thr(But)-Phe-[/í-(3-fenoxi- I

L fenil)]Gaba

811 mg nyers H-Asn-Phe-Phe-(D-trp)-Lys(Boc)Thr(But)-Phe-[dl-/?-(3-fenoxi-fenil)]Gaba-OH (4.3 lépés), 784 mg N-hidroxi-benztriazol és 1,20 g N,N'-diciklohexil-karbodiimid 580 ml dimetilformamiddal készített oldatát 20 órán át 50 °C hőmérsékleten tartjuk. Az elegy feldolgozása céljából az oldószert nagy vákuumban, körülbelül 30 °C-on lepároljuk, és a maradékot 20 ml etilacetáttal eldörzsöljük. A kivált diciklohexilkarbamidot szűréssel eltávolítjuk, a szűrletet etilacetáttal 200 ml-re felhígítjuk, három alkalommal, 50-50 ml n vizes oxálsav-oldattal, majd vízzel semlegesre mossuk, nátriumszulfát felett megszárítjuk és vákuumban bepároljuk. A nyersterméket tisztítás céljából 600-lépcsős ellenáramú megosztásnak vetjük alá metanolviz-kloroform-széntetraklorid rendszerben (2700 : 675 : 900 : 1575 térfogatrész). A 80-113 fokozatokban található fázisok (K = 0,17) tartalmazzák a két diasztereomer egyikét (A izomer), a 125-167 fokozatokban található fázisok (K = 0,31) a másikat (B izomer). A megfelelő fokozatok fázisait egyesítjük és vákuumban bepároljuk. A maradékot 20 ml terc-butanolban feloldjuk és liofilizáljuk, így mindig egy, fenti összegképletű, vékonyrétegkromatográfiásan egységes diasztereomert kapunk.

DC: [kloroform-metanol (85 : 15)]

A izomer: R_f=0,60, B izomer: R_r=0,51, [kloroform-metanol-víz (14 : 6 : 1)]

Λ izomer: R_r=0,89, B izomer: R_r=0,83.

5. példa

L Asn-Phe-Phe-(5-F-D-trp)-Lys-Thr-Phe-[/?-(l-naftil)]Gaba J

- B izomer (5-F-D-trp = 5-fluor-D-triptofil)

147 mg

Asn-Phe-Phe-(5-F-D-trp)-Lys(Boc)-Thr(But)-Phe-(/J-(l-naftil)]- Gaba —

- B izomer képletű védett oktapeptidet 5 °C hőmérsékleten, nitrogén atmoszférában feloldunk 2,5 ml, 89 térfo13

-13188 081 gat% trifluorecetsavat, 10 térfogat% vizet és 1 térfogat^ tioglikolsavat tartalmazó elegyben, az oldatot azonnal 25 °C-ra melegítjük, és a terméket 50 perc múlva ezen a hőmérsékleten 15 ml peroxidmentes éterrel kicsapjuk. A végtermék kapott, nyers trifiuoracetátját leszűrjük, vákuumban megszárítjuk, 5 ml n ecetsav-oldatban feloldjuk és 15 ml anioncserélőn, például acetát formában levő AG 1-X8 ioncserélőn (gyártja Bio-Rad Laboratories, Richmond, California, Amerikai Egyesült Államok) átszűrjük. Az eluátumot vákuumban bepároljuk, a maradékot 230-lépcsős ellenáramú megosztásnak vetjük alá n-butanol-ecetsav-víz rendszerben (4 : 1 : 5). A 230-274 fokozatokban található fázisokat (K= 13,7) összegyűjtjük, vákuumban bepároljuk és 1 : I arányú terc-butanol-víz elegyből liofilizáljuk.

A kapott, címben szereplő vegyületet vékonyrétegkromatográfiásan, három rendszerben vizsgálva egységes:

DC: 52 számú rendszer: R_r=0,50,

111B számú rendszer: R_f=0,45,

157F számú rendszer: R_f=0,55.

A kiindulási anyagként alkalmazott peptideket az alábbi módon állítjuk elő.

5.7 lépés

Z-Asn-Phe-Phe-(5-F-D-trp)-Lys(Boc)-Thr(But)-Phe-[dl-/?-(l-naftil)]Gaba-OBzl

411 mg Z-Asn-Phe-Phe-(5-F-D-trp)-Lys(Boc)Thr(But)-Phe-OH (11.5 lépés, a fentiekben megadott európai szabadalmi bejelentés 11. példája) és 172 mg dl-4-amino-3-(l-naftil)-vajsav-benzilészter-p-toluolszulfonát (2.1 lépés) 3 ml dimetilformamiddal készített elegyét összekeverjük 0,039 ml N-metil-morfolinnal, 47 mg N-hidroxi-benztriazollal és 85 mg Ν,Ν'-diciklohexil-karbodiimiddel, és az elegyet 20 órán át szobahőmérsékleten állni hagyjuk. Az elegy feldolgozása céljából a kivált diciklohexil-karbamidot centrifugálással eltávolítjuk, a felülúszót 10 ml vízzel elkeverjük és a terméket leszűrjük. A kapott szilárd anyagot további tisztítás céljából 10 percen át 2 ml metanollal keverjük, a szuszpenziót 0 °C-ra lehűtjük, a tiszta terméket leszűrjük és vákuumban megszárítjuk.

DC: [kloroform-metanol (85 : 15)]: R_f=0,67, [kloroform-metanol-víz (14 : 6 : 1)]: R_f=0,87.

5.2 lépés

H-Asn-Phe-Phe-(5-F-D-trp)-Lys(Boc)-Thr(But)-Phe-[d 1 -β-( 1 -naftil)]Gaba-OH

421 mg Z-Ásn-Phe-Phe-(5-F-D-trp)-Lys(Boc)Thr(But)-Phe-[dl-/?-(l-naftil)]Gaba-OBzl (5.1 lépés) 15 ml dimetilformamiddal készített oldatát 50 mg, aktív szénre felvitt palládium (10%) beadagolása után 4 órán keresztül szobahőmérsékleten és normál nyomáson hidrogénezzük. Az elegy feldolgozása céljából az oldatot a katalizátor kiszűrése után nagy vákuumban 2 ml-re betöményítjük, a terméket 40 ml peroxidmentes éterrel kicsapjuk, leszűrjük és vákuumban megszárítjuk. A nyersterméket további tisztítás nélkül használjuk fel a következő, 5.3 lépéshez (ciklizálás).

5.3 lépés

Asn-Phe-Phe-(5-F-D-trp)-Lys(Boc)-Thr(But)-Phe-[/}-(l-naftil)51 (y— Gaba

357 mg nyers H-Asn-Phe-Phe-(5-F-D-trp)Lys(Boc)-Thr(But)-Phe-[d 1-/7-(1-naftil)]Gaba-OH (5.2 lépés) 355 mg N-hidroxi-benztriazol és 543 mg Ν,Ν'-diciklohexil-karbodiinud 260 ml dimetilfor15 mamiddal készített oldatát 20 órán keresztül 50 °C hőmérsékleten tartjuk. Feldolgozás céljából az oldószert nagy vákuumban körülbelül 30 °C hőmérsékleten lepároljuk, és a maradékot 20 ml etilacetáttal eldörzsöljük. A kivált diciklohexil-karbami20 dót szűréssel eltávolítjuk, a szürletet etilacetáttal 200 ml-re felhígítjuk, három alkalommal, 50-50 ml n vizes oxáísav-oldattal, majd vízzel semlegesre mossuk, nátriumszulfát felett megszárítjuk és vákuumban bepároljuk. A nyersterméket tisztítás cél25 jából 480-lépcsős ellenáramú megosztásnak vetjük alá metanol-viz-kloroform-széntetraklorid rendszerben (2700:675:900:1575 térfogatrész). A 75-114 fokozatokban található fázisok (K = 0,24) tartalmazzák a két diasztereomer egyi30 két (A izomer), a 161-186 fokozatokban található fázisok (K = 0,50) pedig a másikat (B izomer). A megfelelő fokozatok fázisait egyesítjük és vákuumban bepároljuk. A maradékot 20 ml tercbutanolban feloldjuk és liofilizáljuk, így mindig egy, a fenti összegképletű, vékonyrétegkromatográfiásan egységes diasztereömert kapunk.

DC: [kloroform-metanol (85 : 15)]:

A izomer: R_r=0,54, B izomer: R_f=0,45, Jkloroform-metanol-víz (14 : 6 : 1)]:

A izomer: R_f=0,90, B izomer: R_r=0,85.

6. példa í— Asn-Phe-Phe-(D-trp)-Lys-Thr-Phe-[/?-(4-klór-l-naftil)]Gaba -J

- B izomer 178 mg :Asn-Phe-Phe-(D-trp)-Lys(Boc)-Thr(But)-Phe-l/?-(4-klór-l- I nafti!)]Gaba —I

- B izomer képletű védett oktapeptidet az l.B példában leírt módon dolgozzuk fel. A termék tisztítását 770-lépcsős ellenáramú megosztással végezzük terc-butanol-toluol-metanol-puffer rendszerben ⁵⁵ (800 : 800 : 340 : 1140), a puffer 1 liter vízben 2,2 g ammóniumacetátot és 1,6 ml jégecetet tartalmaz. A tiszta B izomert tartalmazó fázisokat (K= 1,1) vákuumban bepároljuk, és a maradékot terc-butanol és víz elegyéből liofilizáljuk.

⁶⁰ DC: 52 számú rendszerben: R_f=0,46,

157C számú rendszerben: R_f=0,24.

. Hasonlóképpen eljárva állítjuk elő az

Asn-Phe-Phe-(D-trp)-Lys-Thr-Phe-[/!-(4-nitrofeniI)]Gaba J

- B izomer

-141

188 081 képletű peptidet is, K = 0,33 (a fenti oldószerrendszerben), DC: 157C számú rendszerben: R_f=0,28.

6.1 lépés

H-Asn-Phe-Phe-(D-trp)-Lys(Boc)-Thr(But)-Phe-OH

3,1 g Z-Asn-Phe-Phe-(D-trp)-Lys(Boc)Thr(But)-Phe-H (amelyet a fentiekben idézett európai szabadalmi bejelentés 1. példa, 1.7 lépésében szereplő módon állítottunk elő) 100 ml dimetilformamiddal készített oldatát 300 mg, aktív szénre felvitt palládium (10%) hozzáadása után 2 órán keresztül hidrogénezzük. A katalizátor kiszűrése után az oldatot nagy vákuumban 20 ml-re betöményítjük, és további tisztítás nélkül használjuk fel a következő, 6.2 lépéshez.

6.2 lépés

N^a-2-Trimetilszililetoxikarbonil-Asn-Phe-Phe-(D-trp)-Lys(Boc)-Thr(But)-Phe-OH

A védett heptapeptid 6.1 lépésben kapott dimetilformamidos oldatát összekeverjük 940 mg 2-trimetilszililetil-szukcinimidilkarbonáttal ^COCH₂ (Me₃SiCH₂CH₂OCOON | 'XOCH, és 0,27 ml N-metil-morfolinnal, és a reagáltatást 45 percen keresztül végezzük szobahőmérsékleten. További 0,13 ml N-metil-morfolin hozzáadása után a reagáltatást további 2 Vi órán keresztül folytatjuk. A terméket 100 ml 0,2 n sósav-oldat becsöpögtetésével 0 °C-on lecsapjuk, és tisztítás céljából három alkalommal etilacetáttal és acetonitrillel eldörzsöljük.

DC: 157A számú rendszerben: R_f = 0,29.

hideg 0,2n sósav-oldat becsöpögtetésével kicsapjuk, leszűrjük és vízzel mossuk. Szárítás után három alkalommal etilacetáttal és acetonitrillel eldörzsöljük.

DC: 157A számú rendszerben:

R_f = 0,39 és 0,41 (diasztereomerek). Hasonlóképpen eljárva állítjuk elő dl-4-amino3-(4-nitro-fenil)-vajsavból kiindulva az N°'-2-trimetilszililetoxikarbonil-Asn-Phe-Phe-(Dtrp)-Lys-(Boc)-Thr(But)-Phe-[dl-/?-(4-nitro-fenil)jGaba-OH-t,

DC: 157A számú rendszerben: R_f=0,37.

6.4 lépés

H-Asn-Phe-Phe-(D-trp)-Lys(Boc)-Thr(But)-Phe-[d 1 -/?-klór-naftil)]Gaba-OH-hidroklorid

1,55 g 2-trimetilszililetoxikarbonil-Asn-Phe-Phe(D-trp)-Lys(Boc)-Thr(But)-Phe-[dl-/?-(4-klórnaftil)]Gaba-OH (6.3 lépés) 4,2 ml dimetilformamiddal készített oldatát 0 °C hőmérsékleten 2 perc alatt összekeverjük 8,6 ml 0,59 mólos, dimetilszulfoxiddal készített tetraetilammóniumfluorid-oldattal, és az elegyet 3 órán keresztül 30 °C-on reagáltatjuk. A terméket 200 ml jéghideg 0,1 n sósavoldat becsöpögtetésével kicsapjuk. A csapadékot centrifugáljuk, jéghideg vízzel mossuk, terc-butanolban feloldjuk és liofilizáljuk. A maradékot 3 ml dimetilformamidban feloldjuk, és vízzel újra kicsapjuk. A centrifugálással elkülönített terméket vízzel többször mossuk és nagy vákuumban megszárítjuk.

DC: 157A számú rendszerben:

R_f=0,09 és 0,12 (diasztereomerek). Hasonlóképpen eljárva állítjuk elő megfelelő kiindulási anyagokból (lásd 6.3 lépés) a

H-Asn-Phe-Phe-(D-trp)-Lys(Boc)-Thr(But)-Phe[d 1 -/?-(4-nitro-fenil)]Gaba-OH-hidrokloridot.

DC: 157C számú rendszerben:

R_f=O,53 és 0,55 (diasztereomerek).

6.3 lépés

Ν’-2-Trimetilszililetoxikarbonil-Asn-Phe-Phe-(D-trp)-Lys(Boc)-Thr(But)-Phe-[d 1 -/J-(4-klór-1 -naftil)]-Gaba-OH

135 mg N^í'-2-trimetilszilil-etoxikarbonil-AsnPhe-Phe-(D-trp)-Lys(Boc)-Thr(But)-Phe-OH (6.2 lépés) és 180 mg N-hidroxi-szukcinimid 2 ml dimetilformamiddal készített oldatához 0 °C hőmérsékleten hozzáadjuk 216 mg N,N'-diciklohexil-karbodiimid 0,8 ml dimetilformamiddal készített oldatát, és az elegyet 4 Vi órán át reagáltatjuk (1. részlet). Eközben 304 mg dl-4-amino-3-(4-klór-l-naftil)vajsavat feloldunk 0,6 ml 2n metanolos benziltrimetilalumíniumhidroxidban 10 ml dimetilformamid és kis mennyiségű víz hozzáadása közben, és nagy vákuumban újra 3,5 ml-re betöményítjük. A zavaros oldatot 0 °C hőmérsékleten hozzáadjuk a fenti 1. részlethez, két alkalommal 0,2-0,2 ml dimetilformamiddal mossuk, és éjszakán át szobahőmérsékleten reagáltatjuk. A terméket 100 ml jég6.5 lépés :Asn-Phe-Phe-(D-trp)-Lys(Boc)-Thr(But)-Phe-[/?-(4-klór-l- 1 naftil)]Gaba —’

- B izomer

1,25 g HC1 H-Asn-Phe-Phe-(D-trp)-Lys(Boc)-Thr-(But)-Phe-[d 1 ->9-(4-kló r-1 -naftil)]Gaba-OH (6.4 lépés), 1,33 g N-hidroxi-benztriazol-monohidrát, 0,1 ml N-metil-morfolin és 1,8 g N,N'-diciklohexil-karbodiimid 800 ml dimetilformamiddal készített oldatát 18 órán keresztül 50 °C hőmérsékleten tartjuk. Az elegy feldolgozása céljából hozzáadunk 1,1 g oxálsavat, az oldatot nagy vákuumban erősen bepároljuk, és a kivált diciklohexil-karbamidot szűréssel eltávolítjuk. A szűrletből a terméket híg nátriumhidrogénkarbonát-oldat becsöpögtetésével kicsapjuk. A nyersterméket tisztítás céljából 560-lépcsős ellenáramú megosztásnak vetjük alá metanol-víz-kloroform-széntetraklorid rendszerben (2700 : 675 : 900 : 1575 térfogatrész).

-15188 081

A 154-228 fokozatokban található terméket (K = 0,43) a szokásos módon elválasztjuk.

DC: B izomer: 157A számú rendszer: R_f=O,33.

Hasonlóképpen eljárva állítjuk elő a megfelelő lineáris kiindulási anyagból (6.4 lépés) ciklizálással és ugyanolyan oldószerrendszerben végzett ellenáramú megosztással az

EAsn-Phe-Phe-(D-trp)-Lys{ Boc)-Thr(But)-Phe-[/?-(4-nitrofenil)]Gaba - B izomert

K = 0,8;

DC: 157A számú rendszer: R_f = 0,27.

Az alábbi 7-13. példában a gyógyászati készítmények előállítását írjuk le. A „hatóanyag” kifejezés a találmány szerinti eljárással előállítható I általános képletű végtermékre, különösen az 1-6. példában szereplő ilyen vegyületekre, elsősorban a 2.B példában szereplő [D-trp⁸;/f-(l-naftil)Gaba¹²]ciklo-szomatosztatin(5-12)-oktapeptid-B izomerre és a 4.B példában szereplő [D-trp⁸;-/?-(3-fenoxifenil)Gaba¹²]ciklo-szomatosztatin(5-12)-okta pepiidre vonatkozik.

7. példa

A) 2,0 mg hatóanyagot tartalmazó injekciós oldatot az alábbi módon' állítunk elő.

0,7 ml desztillált vízben feloldunk 1,0 mg jégecetet, 0,8 mg nátriumacetátot, 8,0 mg nátriumkloridot és 2,0 mg hatóanyagot, és desztillált vízzel 1 ml-re feltöltjük. Az oldatot autoklávban 20 percen át melegítjük 120 °C-on. Az oldat pH-ja sterilizálás után 4,5.

B) 0,5 mg hatóanyagot tartalmazó injekciós oldatot az alábbi módon állítunk elő.

0,7 ml fiziológiás nátriumklorid-oldatban feloldunk 0,5 mg hatóanyagot, és az oldatot 0,1 n sósavoldattal pH = 4,0-ra savanyítjuk. Desztillált vízzel 1 ml-re feltöltjük és sterilre szűrjük.

8. példa

A) 0,1 mg hatóanyagot tartalmazó, zselatintartalmú injekciós oldatot az alábbi módon állítunk elő.

A hatóanyag sterilre szűrt vizes oldatát melegítés közben, aszeptikus körülmények között olyan steril zselatin-oldattal keverjük össze, amely konzerválószerként fenolt tartalmaz. 1,0 ml oldat az alábbi összetételű:

hatóanyag 0,5 mg zselatin 280,0 mg fenol 5,0 mg desztillált víz ad 1,0 ml

Az elegyet aszeptikus körülmények között ampullába töltjük.

9. példa

0,5 mg hatóanyagot steril szárazanyagként tartalmazó, injektálásra szánt készítményt az alábbi módon állítunk elő.

0,5 mg hatóanyagot feloldunk 1 ml, 20 mg mannitot tartalmazó vizes oldatban. Az oldatot sterilre szűrjük és aszeptikus körülmények között 2 ml-es ampullába töltjük, mélyhütjük és liofilizáljuk. Használat előtt a liofilizátumot desztillált vízben feloldjuk. Az oldatot intramuszkulárisan vagy intravénásán adjuk be.

10. példa

A hatóanyagot polifoszfát-szuszpenzióként tartalmazó injekciós készítményt az alábbi módon állítunk elő.

A) 1,0 mg hatóanyaggal:

1,0 mg hatóanyag és 9,0 mg nátriumklorid 0,5 ml desztillált vízzel készített oldatát összekeverjük 2 mg nátriumpolifoszfát (Calgon N) 0,5 ml desztillált vízzel készített oldatával. A kapott szuszpenzió az alábbi összetételű:

hatóanyag 1,0 mg nátriumpolifoszfát (Calgon N) 2,0 nig nátriumklorid 9,0 mg desztillált víz ad 1,0 ml

A szuszpenzió pH-ja 6,9. Intramuszkuláris beadásra alkalmas.

B) 0,5 mg hatóanyaggal:

A fentiekben leírt módon állítjuk elő az alábbi összetételű szuszpenziót: hatóanyag 0,5 mg nátriumpolifoszfát (Calgon 322) 1,0 mg nátriumklorid 9,0 mg desztillált víz ad 1,0 ml

A szuszpenzió pH-ja 5,9.

11. példa

0,3 mg hatóanyagot olajos alumíniumsztearát gél alakjában tartalmazó injekciós készítményt az alábbi módon állítunk elő.

2%-os alumíniumsztearát gélt állítunk elő a szokásos módon úgy, hogy 1,0 g alumíniummonosztearátot 49,0 g földimogyoróolajban szuszpendálunk és 10 percen keresztül 130 °C-on melegítjük. 0,3 g így kapott alumíniumsztearát gélben 15,0 mg hatóanyagot szuszpendálunk, a szuszpenziót homogenizáljuk és az alumíniumsztearát gél fennmaradó részével felhígítjuk. Az így kapott gél az alábbi összetételű:

hatóanyag 0,3 mg alumíniummonosztearát 20,0 mg földimogyoróolaj ad 1,0 mg

Az olajos alumíniumsztearát gél-szuszpenzió intramuszkuláris beadásra alkalmas.

12. példa

0,5 mg hatóanyagot dextránszulfáttal készített depó-szuszpenzió alakjában tartalmazó injekciós készítmény

0,36 mg ecetsavat, 1,9 mg nátriumacetát-trihidrátot, 0,8 mg nátriumkloridot és 0,5 mg hatóanyagot feloldunk 0,4 ml desztillált vízben, és az oldatot

-161

188 081 desztillált vízzel 0,5 ml-re feltöltjük. Ehhez az oldathoz keverés közben hozzáadunk 0,5 ml, 0,1% dextránszulfátot (molekulasúly 500,000) tartalmazó oldatot, így homogén szuszpenzió képződik. Ez a szuszpenzió az alábbi összetételű: hatóanyag 0,50 mg dextránszulfát (molekulasúly 500,000) 0,50 mg ecetsav (100%) 0,36 mg nátriumacetát-trihidrát 1,90 mg nátriumklorid 8,00 mg desztillált víz ad 1,00 ml

A vizes szuszpenzió intramuszkuláris és szubkután injektálásra alkalmas.

13. példa

Nazális spray mg finomra őrölt hatóanyagot 75 mg benzilalkohol és 1,395 g telített, 8-12 szénatomos zsírsavak félszintetikus gliceridjeinek elegyében (például Miglyol 812) szuszpendálunk. Ezzel a szuszpenzióval 10 ml-es alumínium flakonokat töltünk meg, amelyeket adagoló szeleppel lezárunk és nitrogén nyomás-alatt 6,0 g 40: 60 térfogat arányú diklórdifluormetán-1,2-diklór-1,1,2,2-tetrafluoretán eleggyel (például Freon 12/114) töltünk meg. Az összesen 7,5 g töltősúlyú alumínium flakon 100 egyszeri adagot tartalmaz, az egyes adagok hatóanyagtartalma 0,3 mg. A flakont a szeleppel úgy állítjuk be, hogy az egy alkalommal történő megnyomással az egyszeri adagot permetezze ki.

Hasonlóképpen eljárva állítunk elő olyan nazális spray-ket, amelyek Miglyol helyett azonos súlymennyiségű izopropilmirisztátot vagy izopropilpalmitátot vagy 8-12 szénatomos zsírsavak glicerin- és polioxietilénglikolésztereinek a keverékét (például Labrafac WL 1219) tartalmazzák.

Claims

Szabadalmi igénypontok

1. Eljárás az

L Asn-Phe-Phe-trp-Lys-Thr-Phe-Gaba(Ar)-J , 5 6 7 8 9 10 11 12

I általános képletű ciklusos oktapeptidek előállítására - ahol a képletben trp D-Trp vagy 5-F-D-Trp csoportot jelent és Gaba(Ar) egy olyan y-aminovajsav gyökét jelenti, amely /J-helyzetben 5-7 szénatomos cikloalkilcsoportot, naftil-, halogén-naftil-, fenil-, halogén-fenil-, nitro-fenil- vagy fenoxi-fenil-csoportot hordoz -, azzal jellemezve, hogy egy

Η—[ΙΓ]—C III

III általános képletű lineáris peptidet - ahol

ΙΓ valamilyen, az alábbiakban definiált II általános képletű ciklopeptidnek megfelelő lineáris oktapeptid gyököt jelent, amelyben az amidkötés a peptidgyűrű két tetszőleges szomszédos aminosavcsoportja között van megszakítva és

C szabad hidroxilcsoportot, aktiváló csoporttal átalakított hidroxilcsoportot vagy —NH—NH₂hidrazinocsoportot jelent ciklizálunk és a kapott

I

-Asn-Phe-Phe-trp-Lys(A)-Thr(B)-Phe-Gaba(Ar)- —I II

II általános képletű vegyületben - ahol

Gaba(Ar) és trp a fentiekben megadott jelentésű,

A egy ε-amino védőcsoportot vagy hidrogénatomot és B egy hidroxil védöcsoportot vagy hidrogénatomot jelent, és az A és B szimbólumok közül csak az egyik lehet hidrogénatom - a védőcsoport(ok)at lehasítjuk. (Elsőbbsége: 1980. február 12.)
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja olyan I általános képletű oktapeptidek előállítására, amel ekben trp D-Trp c.oportot jelent és Gaba(Ar) egy olyan γ-aminovajsav gyökét jelenti, amely ^-helyzetben 5-7 szénatomos cikloalkilcsoportot, naftil-, halogén-naftil-, fenil-, halogén-fenil-, vagy nitrofenilcsoportot hordoz, azzal jellemezve, hogy egy

Η—[II']—C III

III általános képletű lineáris peptidet - ahol

II' valamilyen, az alábbiakban definiált II általános képletű ciklopeptidnek megfelelő lineáris oktapeptid gyököt jelent, amelyben az amidkötés a peptidgyűrű két tetszőleges szomszédos aminocsoportja között van megszakítva és C szabad hidroxilcsoportot, aktiváló csoporttal átalakított hidroxilcsoportot vagy —NH—NH₂ hidrazinocsoportot jelent - ciklizálunk és a kapott

-Asn-Phe-Phe-trp-Lys(A)-Thr(B)-Phe-Gaba(Ar)- —I II

II általános képletű vegyületben - ahol

Gaba(Ar) és trp a fentiekben megadott jelentésű,

A egy ε-amino védőcsoportot vagy hidrogénatomot és B egy hidroxil védőcsoportot vagy hidrogénatomot jelent, és az A és B szimbólumok közül csak az egyik lehet hidrogénatom - a védőcsoport(ok)at lehasítjuk. (Elsőbbsége: 1979. július 4.)
3. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja olyan I általános képletű vegyületek diasztereomer elegyeinek vagy az egyes diasztereomereinek előállítására, ahol trp D-Trp csoportot és Gaba(Ar) a 4-amino-3ciklohexil-vajsav, 4-amino-3-fenil-vajsav, 4-amino3-(l-naftil)-vajsav vagy 4-amino-3-(2-naftil)-vajsav gyökét jelenti, azzal jellemezve, hogy egy

Η—[II']—C III

III általános képletű lineáris peptidet - ahol

ΙΓ valamilyen, az alábbiakban definiált II általános képletű ciklopeptidnek megfelelő lineáris oktapeptid gyököt jelent, amelyben az amidkötés a peptidgyűrű két tetszőleges szomszédos aminocsoportja között van megszakítva és C szabad hidroxilcsoportot, aktiváló csoporttal átalakított hidroxilcsoportot vagy —NH—NH₂ hidrazinocsoportot jelent - ciklizálunk és a kapott

-Asn-Phe-Phe-trp-Lys(A)-Thr(B)-Phe-Gaba(Ar) J II

II általános képletű vegyületben - ahol

Gaba(Ar) és trp a fentiekben megadott jelentésű, A egy ε-amino védőcsoportot vagy hidrogénatomot és B egy hidroxil védöcsoportot vagy hidrogénatomot jelent, és az A és B szimbólumok közül csak az egyik lehet hidrogénatom - a védőcsoport(ok)at lehasítjuk. (Elsőbbsége: 1979. július 4.)
4. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja olyan I általános képletű vegyületek diaszte17

-17188 081 romer Jegyeinek vagy az egyes diasztereomereinek előállítására, ahol trp D-Trp csoportot és Gaba(Ar) a 4-amino-3(4-fluor-fenil)-vajsav, 4-amino-3-(4-nitro-fenil)vajsav, 4-amino-3-(4-klór-l-naftil)-vajsav vagy 4-amino-3-(3-fenoxi-fenil)-vajsav gyökét jelenti, azzal jellemezve, hogy egy

Η — [II']—C III

III általános képletű lineáris peptidet - ahol

ΙΓ valamilyen, az alábbiakban definiált II általános képletű ciklopeptídnek megfelelő lineáris oktapeptid gyököt jelent, amelyben az amidkötés a peptidgyürü két tetszőleges szomszédos aminosavcsoportja között van megszakítva és C szabad hidroxilcsoportot, aktiváló csoporttal átalakított hidroxilcsoportot vagy —NH — NH₂ hidrazinocsoportot jelent - ciklizálunk és a kapott • -Asn-Phe-Phe-trp-Lys(A)-Thr(B)-Phe-Gaba(Ar) -I II

11 általános képletű vegyületben - ahol

Gaba(Ar) és trp a fentiekben megadott jelentésű, A egy ε-amino védőcsoportot vagy hidrogénatomot és B egy hidroxil védőcsoportot vagy hidrogénatomot jelent, és az A és B szimbólumok közül csak az egyik lehet hidrogénatom - a védöcsoport(ok)at lehasítjuk. (Elsőbbsége: 1980. február 12.)
5. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja a [D-Trp⁸;/?-ciklohexil-Gaba¹²]-cikloszomatosztatin(5-12)-oktapeptid diaszteromer elegy vagy egyes diasztereomerek alakjában való előállítására, azzal jellemezve, hogy egy H-AsnPhe-Phe-(D-Trp)-Lys(A)-Thr(B)-Phe-(/?-cikIohexil-Gaba)-C általános képletű lineáris oktapeptidet, ahol A, B és C a 2. igénypontban megadott jelentésű, ciklizálunk, majd a jelenlevő védőcsoportokat lehasítjuk. (Elsőbbsége: 1979. július 4.)
6. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja a [D-Trp⁸;/?-(3-fenoxi-fenil)-Gaba¹²]-cikloszomatosztatin(5-l 2)-oktapeptid diasztereomer