HU186970B - Process for the adaptation of hepatitis a virus to human connective tissue cells - Google Patents

Description

A találmány tárgya eljárás hepatitisz A-vírus adaptálására emberi kötőszövetsejtekhez és kívánt esetben a kapott hatóanyag további kikészítésére diagnosztikai, illetve terápiái preparátummá.

A hepatitisz-vakcinák előállításával kapcsolatos kutatások során ismeretessé vált olyan eljárás, amely hepatitisz A-vírusok (továbbiakban: HAV) jó kitermeléssel való előállítását teszi lehetővé. A P 30 33 406.6 sz. NSZK-beli szabadalmi bejelentés ismerteti az első olyan eljárást, amellyel gyorsítani sikerül a HAV növekedését annak révén, hogy Rbesus-majom vesesejtjeit [FrhR-4/R] beoltanak HAV-val, a néhány hét múlva megjelenő vírusokat kinyerik és újra beoltják. Ezt a folyamatot mindaddig megismétlik, amíg a vírusok kielégítő növekedési sebességet mutatnak.

Az idézett eljárás szerint kapott HAV azonban nem alkalmas a humán gyógyászatban használható vakcinák készítésére, hiszen állati sejt eredetű.

A találmány kidolgozásával olyan HAV előállítása volt a célunk, amely a humán gyógyászatban (diagnosztika, terápia) felhasználható.

A találmány szerint emberi magzati vescsejteken (továbbiakban: MENZ) át adaptáljuk a hepatitisz Avírusokat (HAV) emberi kötőszövetsejtekhez (MFZ), úgy hogy az ilyen adaptálást a HAV/MENZ/MFZ kapcsolat jellemzi. Ilyen vírust nekem sikerült először előállítanom a következőképpen:

Székletből elkülönítünk HAV-t és azt MENZ-ben tenyésztjük. Magát a tenyésztést ismert módszerrel végezzük, pl. azzal a módszerrel, amelyet a már idézett P 30 33 406 sz. NSZK szabadalmi bejelentésben ismertetnek. Az első, kb. 7—8 hét után szabaddá váló vírusokat arra használjuk, hogy ismét fertőzzük azzal a MENZ-közeget (2. passzázs MENZ-ben). Ezt a folyamatot mintegy tíz passzázsra kiterjedően megismételjük, miközben a növekedési sebesség mindenkor növekszik. Az első MENZ-passzázsban 34 nap után sikerült a sejtzárványban megbízhatóan kimutatni a szabaddá vált vírust, a 10. passzázsban már a 6. napon.

A gyorsan és nagy tömegben növekvő vírusokat lépésenként elkülönítjük.

Ilyen módon kapunk először MENZ-ben adaptált HAV-t: HAV/MENZ.

Ebben a folyamatban kifejezetten meglepőnek tekinthető, hogy

1. egyáltalán nyerhetünk vírusokat viszonylag nagy időtartam után. A szokásos növekedési sebesség lényegesen nagyobb, így már igen rövid időtartam után valószínűtlennek tekinthettük az ilyen folyamat fellépését;

2. á MENZ-hez való adaptálás nagy növekedési sebességgel, többszörös passzálással érhető el.

E viszonyok megismétlődését tapasztaljuk, amikor a fentiek szerint kapott HAV/MENZ közeggel emberi kötőszövetsejteket (MFZ) fertőzünk. Itt is kifejezetten lassú a növekedés az első passzázsban (28 nap), a későbbi siker (10. passzázsban 6 nap) tehát ebben az esetben is meglepő.

A HAV/MENZ többszöri passzálása MFZ-n végül is MFZ-hez adaptált HAV-t, vagyis; HAV/MENZ-MFZ-t eredményez, amelyet akár a sejtből, akár a táptalajból kinyerhetünk és adott esetben közvetlenül, más esetben további kikészítéssel — tisztítás, inaktiválás, a szakterületen szokásos hordozó-, illetve kötőnyagok alkalmazásával — nyert preparátum alakjában felhasználhatunk HAV-antitest tesztekhez is, mindenekelőtt azonban a humán gyógyászati oltóanyagok előállításához.

Ha a sejtből nyerjük ki a vírust, pl. fagyasztás és azt követő felengedés háromszori ismétlésével vagy ultrahangos kezeléssel (ezeket a módszereket a szakirodalom kielégítő mértékben ismerteti), akkor a sejteket a kezelés során véglegesen szétronesoljuk, így további tenyésztésre azok már nem alkalmazhatók. Ennél egyszerűbb is, célszerűbb is a sejtzárványból való kinyerés oly módon, hogy a tápoldatot kivonjuk a sejtből és új tápközeggel pótoljuk, így a sejteket nem roncsoljuk szét, hanem fenntartjuk további tenyésztés céljából. A kivont tápközegben jelen lesz a tenyésztett vírus.

A HAV/MENZ/MFZ-t kizárólag emberi sejteken tenyésztettük, így kizárt az a lehetőség, hogy esetleg állati sejtekből szabaddá vált állati vírusok vagy daganatos sejtekből szabadddá vált Onc-gének ezt a vírust fertőzik. Ezért a találmány szerint adaptált vírusok különösen alkalmasak arra, hogy egyfelől diagnosztikai tesztekben hasonló módon alkalmazzuk azokat, mint az emberi székletből elkülönített vírusokat, másfelől kiindulási anyagként alkalmazzuk vakcinák előállítására, amely vakcina lehet akár elölt mikroorganizmust, akár legyengített virulenciájú élő mikroorganizmust tartalmazó vakcina (továbbiakban: „holt-vakcina”, illetve „élő-vakcina”). Az ilyen vakcina előállítása történhet az ún. Polio-oltóanyagokéhoz hasonló módon.

A találmányt részletesebben példákkal ismertetjük, amelyekben csak a találmány szerinti intézkedéseket részletezzük, „általánosan ismert”-ként utalunk olyan körülményekre és műveletekre, amelyek az adott szakterületen jól ismertek és amelyekre nézve kielégítő útmutatás nyerhető egyebek között a már idézett, P 30 33 406.6 számmal közzétett NSZK szabadalmi bejelentés, illetve az általam a Medical Microbiology and Immunology (Springer-Verlag 1981} 170: 73—81. oldalain publikált cikk, továbbá az ebben a cikkben általam idézett korábbi források tartalmából.

í. példa

Emberi magzati vesesejtek (MENZ) és emberi magzati kötőszövetsejtek (MFZ) előállítása

A MENZ-t emberi magzati veséből, az MFZ-t emberi magzati tüdőből állítjuk elő. A szervek feldolgozását általánosan ismert körülmények között végezzük. A MENZ első monolayer rétegét szub-passzázshoz 5—10szer használhatjuk, MFZ esetében kb. 50—75 a lehetséges szub-passzázsok száma. Akár MENZ, akár MFZ esetében a kezdeti passzázsokban nyert termékek egyrészét önmagában ismert módon befagyaszthatjuk —70 °C hőmérsékleten vagy folyékony nitrogénben és szükség szerint később újra felolvaszthatjuk és alkalmazhatjuk. Az első MENZ-szubpasszázs tartama 28 nap, a tizediké 6 nap. Az MFZ-szubpasszázsok tartama megfelelően 28, illetve 10 nap.

2. példa

HAV tenyésztés MENZ-n és MFZ-n

MENZ vagy MFZ sűrű növésű monolayer rétegeit HAV-tartalmú szuszpenzióval inkubálunk, aminek folytán a vírusok a sejtekre adszorbeálódnak. Ezután alkalmas tápközeget adunk a sejtekre és a sejteket 34—37 °C hőmérsékleten inkubáljuk. Tápközegként pl. alkalmazhatunk Hanks sóval vagy Earle sóval készített ún. „minimál essential médium” tápközeget, de más tápközeg is alkalmazható. Az inkubációs idő általában néhány nap és egy-két hét közötti. Az inkubációs idő eltelte után alkalmas teszt módszerrel kimutatjuk a sejtekből a tápközegbe került HAV menynyiségét, amely a fentiek szerinti tenyésztésnél 10₆—10₈ TCID (tissue culture infectious dosis) közötti. A felszabadított HAV alkalmazható közvetlenül tesztekhez, amelyekben antitestek jelenlétét kívánjuk kimutatni emberi vagy állati szérumokban, megfelelő tisztító és inaktiváló lépések után pedig vakcinaként alkalmazható akár a humán gyógyászatban, akár állatok kezelésénél.

3. példa

Diagnosztikai alkalmazás

A találmány szerint sejtkultúrákban előállított vírusok diagnosztikai tesztekben ugyanúgy alkalmazhatók, mint az emberi székletből elkülönített vírusok. Rádióimmunassay és enzimimmunassay tesztekben a sejtzárványból elkülönített HAV/MENZ/MFZ közvetlenül is alkalmazható antigénként. így pl. a IIAV/MENZ/ /MEZ közvetlenül kapcsolható szilárd fázissal, amelyhez azután a vizsgált személytől nyert antitest (továbbiakban: paciens antitest) köthető. A HAV/MENZ/ /MFZ anti-HAV testen át is kötődhet szilárd fázishoz, ezt követő páciens antitest kötődéssel; antigén oldatként is kapcsolható szilárd fázishoz kötődő páciens antitesttel. Általánosságban mondható, hogy a sejtkultúrából nyert HAV/MENZ/MEZ anti-HAV testek kimutatására szolgáló bármely tesztben alkalmazható antigénként.

4. példa

Terápiái alkalmazás

A HAV/MENZ/MEZ kellően legyengített virulenciájú élő-vakcinaként alkalmazható, mint oltóanyag. Már néhány passzázs után kielégítő mértékű a virulencia gyengülése. Holt-vakeinaként is alkalmazható a találmány szerint adaptált vírus tisztítás és inaktiválás után, ami önmagában ismert módon végezhető.

Ha élő-vakcinaként kívánjuk a vírust az oltóanyagban alkalmazni, olyan passzázsból különítjük el,amely5 ben a vírus virulenciája eléggé legyengült ahhoz, hogy az emberben már ne váltson ki betegségi szimptomát, de az oltott alanyban még eléggé szaporodik ahhoz, hogy antitesteket indukáljon. Ez az állapot az ötödik cs huszadik passzázs között érhető el.

Ha az oltóanyagban holt-vakcinaként kívánjuk alkalmazni, a vírusantigént előbb koncentráljuk, majd tisztító műveletekkel eltávolítjuk a zavaró kísérő proteineket. A tisztítás ismert alkalmas módszere pl. a szacharóz- vagy cézium-kloridoldatos gradiens centrifugálás, továbbá az oszlopkromatográfia vagy az affinitás-kromatográfia. Az inaktiválás vagy ekkor vagy már előbb végezhető, pl. formaldehid vagy propiolakton alkalmazásával. A tisztított HAV-antigén kapcsolható adjuvánssal, pl. alumínium-hidroxid hordozóval, de hordozó nélkül is alkalmazható holt-vakcinaként; a beadás módja általában intramuszkuláris vagy szubkután injekció.

Claims (2)

1. Szabadalmi igénypontok

   1. Eljárás emberi kötőszövetsejthez (továbbiakban: MFZ) adaptált hepatitisz A-vírus (továbbiakban: HAV) előállítására és kívánt esetben az így kapott hatóanyag további kikészítésére, azzal jellemezve, hogy székletből elkülönített HAV-t emberi magzati vesesejteken (továbbiakban: MENZ) tényésztünk és a szabaddá vált vírusokkal [továbbiakban: HAV/ /MENZ] MPZ-t fertőzünk és kívánt esetben az így kapott hatóanyagot [HAV/MENZ/MFZ] a diagnosztikában, illetve terápiában szokásos módon — tisztító és inaktiváló műveletek, hordozó, kötőanyagok szükség szerinti alkalmazásával — preparátummá kikészítjük.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal j θ 11 em e z v e, hogy a HAV növekedési sebességét a MENZn úgy növeljük, hogy az első passzázs során kb. a beoltás utáni 7—8. hétben a tápközegben, illetve a sejteken megjelenő primer HAV-t kinyerjük és újra MENZ-be oltjuk (passzáljuk) és ezt a folyamatot többször megismételjük és az így passzázsonként mintegy 1—2 héttel csökkenő növekedési időtartammal kapott, MENZ-hez adaptált HAV-t hasonló módon,