HU185302B - Process for the separation of the heart glycosides of digitalis lanata and for the isolation of one or several components in pure form - Google Patents

Abstract

A találmány tárgya eljárás a Digitális lanata primer vagy szekunder szívgükozidjainak a szétválasztására és egy vagy több komponens tiszta alakban történő kinyerésére a nyers glikozidkeverék oszlopon végzett kromatografálása útján. A találmány értelmében úgy járnak el, hogy a Digitális lanata primer vagy szekunder glikozidjainak dúsított keverékét a) 1-4 szénatomos alifás alkoholban vagy annak vízzel vagy valamely halogénezett alifás szénhidrogénnel készített 99 : 1-70 : 30, illetve 95 : 5-70 : 30 arányú elegyében oldva magnézium-szilikát oszlopra viszik vagy b) 1-4 szénatomos alifás alkohol és víz 99 : 1-70 : 30 arányú elegyében oldva poliamid oszlopra viszik, az oszlopról ugyanazzal az oldószerrel vagy oldószereleggyel eluálják, az egyes komponenseket tartalmazó frakciókat összegyűjtik, bepárolják és kristályosítják. -1-

Description

A találmány tárgya eljárás a Digitális lanata szívglikozidjainak a szétválasztására és egy vágytöbb komponens tiszta alakban történő kinyerésére. Közelebbről a találmány tárgya eljárás a Digitális lanata primer vagy szekunder szívglikozidjainak, főleg az A, B és C lanatozid, illetve a digoxin oszlopkromatográfiás elválasztására és tiszta, kristályos alakban történő előállítására.

A Digitális lanata növényből úgynevezett primer és szekunder szívglikozidok állíthatók elő. A friss növényből enzimgátlók, például ammóniumszulfát vagy nátriumklorid jelenlétében végzett extrakcióval vagy a kíméletesen szárított növényből ugyancsak extrakcióval állítják elő a primer glikozidok keverékét. Ebből a nyers glikozidkeverékből újabb extrakcióval eltávolítják a lipoidokat, rezinoidokat, klorofillt és egyéb szennyezéseket, majd az így kapott, dúsított glikozidkeveréket tovább tisztítják.

A Digitális lanata növény olyan enzimrendszert tartalmaz, amely a primer (úgynevezett genuin) szívglikozidok molekulájában a cukorlánc részleges lehasitására képes, így keletkeznek a szekunder glikozidok. Ezeknek az ipari előállítására több módszer ismeretes. így előállíthatok az izolált primer glikozidok részleges hidrolízisével vagy a növényben jelen levő enzimek segítségével. Az így kapott szekunder glikozidkeveréket extrakcióval kinyerik, majd újabb extrakcióval eltávolítják a ballasztanyagokat, és a keletkező, dúsított glikozidkeveréket tovább tisztítják.

A dúsított glikozidkeverékekből különféle módokon állítják elő a tiszta primer és szekunder szívglikozidokat, így például frakciónál! kristályosítással vagy ellenáramú oldószeres extrakcióval. Az első eljárás hátránya, hogy a nagyszámú szívglikozid és a még mindig tekintélyes mennyiségben jelen levő egyéb kísérőanyagok mellől rossz hatásfokkal, nem a kívánt tisztaságban és viszonylag nagy mennyiségű oldószer felhasználásával állítják elő a kívánt, különösen hatékony szívglikozidokat. A másik eljárásmód hátránya, hogy a részlegesen tisztított, nagyszámú komponenst tartalmazó glikozidkeverék komponenseinek hatékony szétválasztására nem alkalmas, csak néhány gükozidot tartalmazó keverék komponenseinek a szétválasztását lehet vele elérni. Ehhez több oldószer bizonyos arányú elegyeit használják, ezeknek nagy része nem regenerálható, ez növeli az eljárás költségeit.

A Digitalis-glikozidok különböző vizsgálataira és tiszta alakban való előállítására egyre szélesebb körben alkalmazzák az oszloprendszerü és síkelrendezésü kromatográfiás módszereket.. A síkelrendezésü módszereket (klasszikus papírkromatográfia, rétegkromatográfia stb.) elsősorban analitikai célra, míg az oszloprendszerü módszereket első sorban preparatív célra használják.

A kétféle folyadékkromatográfiás technika kő zötti elvi kapcsolat nyilvánvaló. Ennek ellenére a kedvező rétegkromatográfiás elválasztási eredményeket nem lehet mindig egyértelműen oszlopkromatográfiás viszonyok közé átvinni. A két technika közötti nagyrészt tisztázatlan kapcsolatokkal is magyarázható, hogy a Digitalis-glikozidok ősz· 2

302 lopkromatográfiás és analitikai elválasztására a gyakorlatban eltérő oldószerrendszereket és szorbenseket használnak. így a rétegkromatográfiás elválasztást általában szilikagél-gipsz (5: 1) szor⁵ bensrétegen 5: l :4:0,1 arányú kloroform-metanol-metilén-klorid-viz oldószereleggyel (Farm. Obzor, 35, 450. [1966]), nem aktivált szilikagél G rétegen 9: 1 arányú kloroform-metanol eleggyel (Farm. Weekbl., 104, 877. [1969]), propilénglikollal ^{! 0} impregnált cellulózrétegen propilénglikollal telített, 90: 10 arányú benzol-etilacetát eleggyel (J. Chromatogr., 35, 122. [1968]), míg formamiddal impregnált HPTLC szilikagél 60 F₂₅₄ rétegen 7 : 10,5 arányú xilol-metiletilketon vagy 5 :11: 0,5 arányú ¹⁵ kloroform-tetrahidrofurán-formamid eleggyel (J. Chromatogr., 138, 238. [1977]) végzik.

A Digitalis-glikozidok ipari méretű, oszlopkromatográfiás szétválasztására az jellemző, hogy viszonylag tiszta glikozidkeveréket visznek fel az osz²⁰ lopra, és az eluálást több oldószer, illetve oldószerelegy egymás után való adagolásával (többlépcsős elucióval) végzik. így az 57 742 számú román szabadalmi leírás szerint a glikozid keveréket formamiddal impregnált alumíniumoxid oszlopra viszik, ²⁵ és formamiddal telített, 99 : 1 arányú kloroformmetanol eleggyel, majd 98,5 : 1,5 arányú kloroform-metanol eleggyel, végül 98 : 2 arányú kloroform-metanol eleggyel eluálják. Az 57 006 számú román szabadalmi leírás szerint az eluálást külön³⁰ böző arányú, formamiddal telített metilénkloridmetanol elegyekkel végzik. Szorbensként az alumíniumoxid helyett szilikagél oszlopot is használnak. A többlépcsős elució rendkívül megnehezíti az oldószervisszanyerést, a tisztítás nagyon költséges és ³⁵ az oldószerelegy ismételt felhasználása gyakorlatilag lehetetlen, ezenkívül nagy az oldószerfelhasználás. Az oszlop impregnálásához használt formamid részleges hidrolízise pedig a szívglikozidok hidrolíziséhez vezethet. Végül további hátrány az is, hogy ⁴θ az eluensből általában nem végezhető el a kristályosítás, különösen nehéz ez a formamidot tartalmazó rendszerek esetén.

A találmány feladata, hogy a Digitális lanata primer és szekunder glikozidjainak a szétválasztá45 sához olyan oldószereket vagy oldószerelegyeket nyújtson, amelyek az említett glikozidokat jól oldják, ugyanakkor jól regenerálhatok és ismételten felhasználhatók, valamint olyan szorbenseket is biztosítson, amelyeknek jó az elválasztóképessége ⁵θ és amelyek regenerálás nélkül többször használhatók.

A találmány alapja az a felismerés, hogy a Digitális lanata primer és szekunder glikozidjai egy rövidszénláncú alifás alkohollal vagy annak vízzel ⁵⁵ vagy valamely halogénezett szénhidrogénnel alkotott elegyével magnézíum-szilikát oszlopon vagy egy rövidszénláncú alifás alkohol és víz elegyével poliamid oszlopon hatékonyan elválaszthatók, a szorbens oszlopok régenerálás nélkül többször fel⁶θ használhatók és a glikozidok az eluens oldatából bepárlással közvetlenül kristályosíthatok.

A találmány értelmében úgy járunk el, hogy a Digitális lanata primer vagy szekunder glikozidjainak dúsított keverékét

a) 1-4 szénatomos alifás alkoholban vagy annak

185 302 vízzel vagy valamely halogénezett alifás szénhidrogénnel készített 99 : 1-70 : 30, illetve 95 : 5-70 : 30 arányú elgyében oldva magnézium-szilikát oszlopra visszük vagy

b) 1-4 szénatomos alifás alkohol és víz 99 : 1-70 : 30 arányú elegyében oldva poliamid oszlopra visszük, az oszlopról ugyanazzal az oldószerrel vagy oldószereleggyel eluáljuk, az egyes komponenseket tartalmazó frakciókat összegyűjtjük, bepároljuk és kristályosítjuk.

1-4 szénatomos alifás alkoholként például méta-. nőit, etanolt vagy propánok, előnyösen metanolt és halogénezett alifás szénhidrogénként például kloroformot, métilénkloridot vagy széntetrakloridot, előnyösen kloroformot használunk. Ha az oldást és eluálást kizárólag alifás alkohollal végezzük, az előnyösen etanol.

Az eljárás során a szorbens oszlopok a megadott oldószerek, illetve oldószerelegyek alkalmazása esetén a kiindulási anyagként alkalmazott glikozidkeverékekben jelen levő szennyezések nagy részét a felső harmadban megkötik, a szívglikozidokat pedig frakcionáltan átengedik. Minthogy a megadott oldószerek, illetve oldószerelegyek a szétválasztandó glikozidokat jól oldják, nagyobb mennyiségű glikozidkeverék vihető fel az oszlopra viszonylag kis oldószertérfogatban, így jó az oszlop felbontóképessége.

Az összegyűjtött frakciókból a glikozidokat kinyerhetjük úgy, hogy a frakciókat térfogatuk ’/ó-’/e-ára betöményítjük, ekkor a gtikozidok nagy része, különösen a digoxin és a gitoxin kristályosán kiválik, és a kis mennyiségben jelen levő egyéb kísérő glikozidok oldatban maradnak. így tiszta termék állítható elő átkristályosítás nélkül. Ez különösen akkor valósítható meg, ha az eluálást alifás alkohol és víz elegyével végezzük. Eljárhatunk úgy is, hogy az összegyűjtött frakciókat bepároljuk és a glikozidokat ismert módon kristályosítjuk.

A’találmány szerinti eljárás előnyei tehát az alábbiak. Nincs szükség többlépcsős elucióra, kicsi az oldószerfelhasználás, az oldószer regenerálható, az oszlop egymást követően regenerálás nélkül többször felhasználható és az eluensből a glikozidok közvetlenül kristályosíthatok.

A találmány szerinti eljárást közelebbről az alábbi kiviteli példákkal szemléltetjük.

1. példa

4,0 g, 60% digoxint, 12% gitoxint és 28% más glikozidot, valamint egyéb kísérőanyagokat tartalmazó Digitális lanata nyers glikozidkeveréket, amelyet a 149 778 számú magyar szabadalmi leírás alapján állítottunk elő, feloldunk 200 ml 90%-os vizes metanolban. Az oldatot 1500 ml 90%-os vizes metanolban szuszpendált 450 g magnéziumtriszilikát oszlopra visszük. (Az oszlop méretei: hosszúsága 400 min, átmérője 75 mm.) A frakcionálási 90%os vizes metanollal végezzük. A frakciók összetételét szilikagélen rétegkromatográfiásan vizsgáljuk. (Futtató elegy: 90 : 14 : 0,5 arányú diklórmetánmetanol-ecetsav, előhívó: 20%-os vizes o-foszforsav oldat, 125 ’C, 10 perc.)

1500 ml 90%-os vizes metanol eluciója után digoxint tartalmazó frakciók jelentkeznek. 400 ml-ben a digoxin zöme lejön az oszlopról (A frakció), további 125 ml-ben kevés gitoxinnal együtt kapjuk a maradék digoxint (B frakció), majd 380 ml-ben kapjuk a gitoxin fő tömegét (C frakció). Újabb 400 ml 90%-os vizes metanollal már csak kis mennyiségű anyag eluálódott (D frakció), és további 50Ö ml 90%-os vizes metanollal való eluálás után az oszlop újra felhasználható frakcionálásra.

Az egyes összegyűjtött frakciókat 50 ’C-on gyorsbepárlón (körülbelül térfogatuk ’/e-ára) bepároljuk, amíg a kristálykiválás meg nem indul. A lehűlt oldatból a kivált kristályokat leszűrjük, és kis mennyiségű hideg, 1 : 1 arányú metanol-víz elegygyel mossuk. így az egyes frakciókból az alábbi anyagokat kapjuk.

A frakció: 2,0 g digoxin,

B frakció: 0,4 g digoxin,

C frakció: 0,6 g gitoxin,

D frakció: 0,2 g anyag, amely kísérő glikozidokból és bomlástermékekből áll.

A bepárlás során kapott metanol fajsúly beállítás után teljes egészében felhasználható további frakcionálásra.

2. példa

Az 1. példa szerinti módon járunk el, azonban a nyers glikozidkeveréket 100 ml 90%-os vizes metanolban oldjuk, és az oldatot 1.000 ml 90%-os vizes metanolban szuszpendált 250 g Polyamid 11 oszlopra visszük fel. Az eluálást szintén 90%-os vizes metanollal végezzük.

Ily módon 0,97 g 95% tisztaságú digoxint kapunk (kitermelés: 85%), amely 240-255 °C-on bomlás közben olvad, valamint 0,3 g kromatográfiásan tiszta gitoxint, amelynek olvadáspontja 284-285 ’C.

3. példa

7,0 g, 60% digoxint, 10% gitoxint és 30% más glikozidot, valamint egyéb kísérőanyagokat tartalmazó Digitális lanata nyers glikozidkeveréket, amelyet a 149 778 számú magyar szabadalmi leírás alapján állítottunk elő, feloldunk 200 ml 9 : 1 arányú metanol-kloroform elegyben, és az oldatot 150 J ml 9 : 1 arányú metanol-kloroform elegyben szuszpendált 450 g magnéziumtriszilikát oszlopra visszük. (Az oszlop méretei: hosszúsága 110 mm, átmérője 110 mm.) Az eluálást 9 : 1 arányú metanol-kloroform eleggyel végezzük, a frakciókat az 1. példában leírt módon vizsgáljuk. Az összegyűjtött, bepárolt frakciók kristályosítását a 151 897 számú magyar szabadalmi leírásban ismertetett módon végezzük. Ily módon az A frakcióból 3 g, 97% tisztaságú digoxint (olvadáspont: 245-260 ’C), a B f akcióból 1,2 g 80% tisztaságú digoxint ,és a C frakcióból 1,1 g kromatográfiásan tiszta gitoxint kapunk. Digoxin kitermelés: 71%.

4. példa g, 30% A lanatozidot, 10% B lanatozidot, 40% C lanatozidot és 20% egyéb anyagot tartalmazó

185 302

Digitális lanata nyers»glikozidkeveréket, amelyet a 156 753 számú magyar szabadalmi leírás 1. példája alapján állítottunk elő, feloldunk 100 mi 90%-os vizes metanolban. Az oldatot 1500 ml 90%-os vizes metanolban szuszpendált 450 g magnéziumtriszilikát oszlopra visszük. Az eluálást 90%-os vizes metanollal végezük, a frakciókat az 1. példában leírt módon vizsgáljuk. Az összegyűjtött, bepárolt frakciókat a 156 638 számú magyar szabadalmi leírásban ismertetett módon kristályosítjuk. Ily módon 1 1,3 g 95%-os tisztaságú C lanatozidot (kitetmelés: 83%), 0,25 g 96%-os tisztaságú B lanatozidot (kitermelés: 62%) és 1,0 g 96%-os tisztaságú A lanatozidot (kitermelés: 83%) kapunk. A termékek olvadáspontja megegyezett az irodalmi értékekkel. ¹

5. példa

0,5 g, 60% dígoxint, 12% gitoxint és 28% más glikozidot, valamint egyéb kísérőanyagokat tartalmazó Digitális lanata nyers glikozidkeveréket, amelyet a 149 778 számú magyar szabadalmi leírás alapján állítottunk elő, feloldunk 150 ml 96%-os etanolban. Az oldatot 1500 ml 96%-os etanollal szuszpendált 450 g magnéziumtriszilikát oszlopra visszük. (Az oszlop méretei: hosszúsága 400 mm, átmérője 75 mm.) A frakcionálási 96%-os etanollal végezzük.

A frakciók összetételének vizsgálatát, a frakciók összegyűjtését, bepárlását és a glíkozidok kristályosítását az 1. példában leírt módon végezzük. így 0,23 g dígoxint és 0,08 g gitoxint kapunk, amelyek kromatográfiás tisztaságúak.

A visszanyert etanol további frakcionáláshoz használható.

Claims (4)

1. Eljárás a Digitális lanata primer vagy szekunder szívglikozidjainak a szétválasztására és egy vagy több komponens tiszta alakban történő kinyerésére a nyers glikozidkeverék oszlopon végzett kromatografálása útján, azzal jellemezve, hogy a Digitális lanata primer vagy szekunder glikozidjainak dúsított keverékét

a) 1-4 szénatomos alifás alkoholban vagy annak vízzel vagy valamely halogénezett alifás szénhidro⁵ génnel készített 99 : 1-70 ; 30, illetve 95 : 5-70 : 30 arányú elegyében oldva magnézium-szilikát oszlopra visszük vagy

b) 1-4 szénatomos alifás alkohol és víz 99 : 1-70 : 30 arányú elegyében oldva poliamid osz³ lopra visszük, az oszlopról ugyanazzal az oldószerrel vagy oldószereleggye! eiuáljuk, az egyes komponenseket tartalmazó frakciókat összegyűjtjük, bepároljuk és kristályosítjuk.

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatositási ⁵ módja, azzal jellemezve, hogy az alifás alkohol és víz vagy halogénezett alifás szénhidrogén elegyében alifás alkoholként metanolt vagy etanolt előnyösen metanolt alkalmazzunk.

3. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatositási

0 módja, azzal jellemezve, hogy halogénezett alifás szénhidrogénként kloroformot alkalmazunk.

4. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatositási módja, azzal jellemezve, hogy az oldást és eluálást tiszta alifás alkoholként etanolban végezzük.