CN112521440B

CN112521440B - 一种环黄杨碱d的提纯方法

Info

Publication number: CN112521440B
Application number: CN202010447306.7A
Authority: CN
Inventors: 梁秉文; 王亚威; 刘子修; 魏海飞
Original assignee: Nanjing Transdermal Technology Co ltd
Current assignee: Nanjing Transdermal Technology Co ltd
Priority date: 2020-05-25
Filing date: 2020-05-25
Publication date: 2021-08-20
Anticipated expiration: 2040-05-25
Also published as: CN112521440A

Abstract

本发明公开了一种环黄杨碱D的提纯方法，以黄杨木粉为原料，提取环维黄杨星D后的母液蒸干，得环黄杨碱D粗品；随后使用甲醇重结晶，使环维黄杨星D析出，环黄杨碱D在母液中蓄积，然后将母液蒸干，得环黄杨碱D蓄积固体；溶于有机溶剂中，通过硅胶柱层析纯化，然后洗脱得到纯化洗脱液，旋蒸除去溶剂后，得到环黄杨碱D纯化固体；最后采用氯甲烷和乙腈的混合溶剂进行重结晶即得。本发明环黄杨碱D粗品通过蓄积、柱层析纯化和重结晶，将含量为15％样品纯化至纯度98.5％，成盐后易溶于水，便于做成制剂。

Description

一种环黄杨碱D的提纯方法

技术领域

本发明属于中药提取技术领域，具体涉及一种环黄杨碱D的提纯方法。

背景技术

黄杨宁片是我国上世纪80年代自主研制开发的用于心血管系统疾病的药物，自2000年开始，被收载于各版《中国药典》。近年来对黄杨宁的研究较多，药理研究显示，黄杨宁有保护神经元、抗心律失常及心肌缺血等作用；临床上应用于缺血性心脏病、心律失常等疾病，均有良好的疗效^[1]。

中药黄杨宁系从黄杨科植物小叶黄杨及其同属植物中提取的生物碱，其主要成分为环维黄杨星D，化学结构属孕甾烷的衍生物，分子式为C₂₆H₄₆N₂O。环维黄杨星D通过提取纯化方法获得，按照现有技术方法，不能获得100％的物质，其必然含有一定的杂质成分。黄杨宁总生物碱中，除环维黄杨星外，含量最高的为环黄杨碱D。

环黄杨碱D结构如图1所示，其和环维黄杨星D相近，母核相同，具有相似的药理活性，但因为含量低，分离纯化困难。刘洁等人使用高效液相制备色谱对黄杨宁进行分离纯化，得到了少量环黄杨碱D^[2]。

但因为高效液相制备色谱上样量少，无法得到较多的环黄杨碱D，不能应用于大规模生产。从曹捷的专利中可知，环维黄杨星D中的杂质成分，环黄杨碱D含量在一定范围内可降低肝脏毒性^[3]。

而按照高效液相制备色谱的方法纯化，样品量也不能够用于对其毒性和药理活性的研究。

[1]柯仲成,桂双英,虞盛舟,等.黄杨宁的研究进展[J].甘肃中医学院学报,2011,28(1):71-73.

[2]刘洁,杭太俊,张正行,等.黄杨宁原料中生物碱的分离与鉴定[J].中草药,2006,37(11):1614-1618.

[3]一种药物原料及制剂和用途[P].中国发明专利，CN103172691B，2016-05-25.

发明内容

发明目的：本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种能够适合放大生产，工业化的环黄杨碱D的提纯方法。

为了解决上述技术问题，本发明采取的技术方案如下：

一种环黄杨碱D的提纯方法，包括如下步骤：

(1)以黄杨木粉为原料，提取分离出环维黄杨星D后剩余的母液蒸干，得环黄杨碱D粗品；

(2)取步骤(1)环黄杨碱D粗品，使用甲醇重结晶，使环维黄杨星D析出，环黄杨碱D在母液中蓄积，然后将母液蒸干，得环黄杨碱D蓄积固体；

(3)将步骤(2)环黄杨碱D蓄积固体溶于氯甲烷中，通过硅胶柱层析纯化，然后洗脱得到纯化洗脱液，旋蒸除去溶剂后，得到环黄杨碱D纯化固体；

(4)将步骤(3)得到的环黄杨碱D纯化固体，采用氯甲烷和乙腈的混合溶剂进行重结晶即得。

具体地，步骤(1)中，所述的环黄杨碱D粗品中，环黄杨碱D含量不低于15wt％，环维黄杨星D含量不高于85wt％。

以黄杨木粉为原料，提取分离出环维黄杨星D为现有技术，提取分离出环维黄杨星D后剩余的母液为经浓缩、结晶分离出环维黄杨星D后的剩余液体，优选参照专利CN1438236A实施。

具体地，步骤(2)中，使用甲醇重结晶的次数为两次以上；蓄积后的环黄杨碱D蓄积固体中，环黄杨碱D含量不低于50wt％。

具体地，步骤(3)中，所述硅胶柱的目数为100-200目。

优选地，步骤(3)中，层析纯化后的硅胶柱采用梯度洗脱方式，先采用氯甲烷洗脱40～50min，流速为10ml/min；再采用氯甲烷、甲醇和氨水的混合溶剂进行洗脱400～500min，流速为8～10ml/min。

具体地，所述氯甲烷为二氯甲烷或者三氯甲烷；氯甲烷、甲醇和氨水的混合溶剂中三者体积比为(70～20)：1：(0.05～0.2)。

步骤(3)得到的环黄杨碱D纯化固体中，环黄杨碱D的含量不低于75wt％。

优选地，步骤(4)中，所述氯甲烷为二氯甲烷或三氯甲烷，氯甲烷和乙腈的混合体积比为(85～100)：(1～15)。

具体地，步骤(4)中重结晶得到的环黄杨碱D晶体纯度不低于98.0wt％。

有益效果：

本发明环黄杨碱D的提纯方法无需特殊仪器、溶剂，所需溶剂、仪器均为实验室常用耗材，提纯成本低；操作简单，具有较好的重现性，能够实现工业化大生产；采用本发明方法提纯得到的环黄杨碱D纯度大于98wt％。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明做更进一步的具体说明，本发明的上述和/或其他方面的优点将会变得更加清楚。

图1为环黄杨碱D的结构式。

图2为环黄杨碱D粗品的HPLC检测图谱。

图3为环黄杨碱D蓄积固体的HPLC检测图谱。

图4为环黄杨碱D纯化固体的HPLC检测图谱。

图5为环黄杨碱D纯品的HPLC检测图谱。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。

环维黄杨星D来源为黄杨木粉，参考专利CN1438236A实施：

(1)取100kg黄杨木粉，加入10kg的酒精和氨水混合液，将他们搅拌均匀后，调节ph值为7.5。

(2)将搅拌后的黄杨木粉浸泡在80kg的环己烷中，静置过夜，然后过滤除去黄杨木粉，将滤液环己烷进行浓缩回收。

(3)回收后的稀状膏体放置结晶，过滤后用丙酮洗涤可得约60g黄杨宁。

(4)取40ml氯仿、40ml正己烷、40ml甲醇和0.8ml三乙胺配制成100ml流动相。

(5)将上述60g黄杨宁提取物用流动相溶解，装入硅胶柱中进行分离纯化，分段收集并检测环维黄杨星D的含量，合并90％以上的部分。

(6)经浓缩、甲醇重结晶后可得10g左右的环维黄杨星D，母液回收蒸干后得30g环黄杨碱D粗品，HPLC检测如图2和表1所示。

高效液相系统：色谱柱：Inertsustain C18(250mm×4.6mm，5μm)，流动相A：0.01M庚烷磺酸钠与0.01M KH2PO4等量混合溶液(含0.2％三乙胺，用磷酸调pH至3.50)，流动相B：乙腈，流速：1ml/min，波长：210nm，柱温：40℃，流动相A-B(75∶25)，采集时间：30min，等度测样。

表1

峰	时间	峰面积	峰高	峰宽	对称因子	峰面积％
							1	5.420	18.1	1.5	0.1884	1.275	6.054
2	11.050	45.2	2.9	0.2404	0.802	15.119
							3	13.466	20.7	1.2	0.2704	0.781	6.923
4	15.298	62.8	3.1	0.3078	0.793	21.012
							5	15.956	79.1	3.8	0.3171	0.992	26.433
6	17.830	73.2	3	0.3773	0.757	24.459

环黄杨碱D的提纯步骤：

第一步：蓄积

将环黄杨碱D粗品用甲醇重结晶，使环维黄杨星D析出，环黄杨碱D在母液中蓄积，经过两次析晶后，将母液旋蒸干，得到环黄杨碱D含量约为53wt％的环黄杨碱D蓄积固体，HPLC检测如图3和表2所示。

表2

峰	时间	峰面积	峰高	峰宽	对称因子	峰面积％
							1	5.480	12.8	1.6	0.1221	0.859	5.568
2	11.339	121.9	9.2	0.2427	0.884	53.023
							3	15.696	95.2	4.5	0.3217	0.818	41.409

第二步：柱层析纯化

将蓄积后的环黄杨碱D蓄积固体，通过硅胶柱层析纯化：

将5g环黄杨碱D蓄积固体用30ml三氯甲烷溶解呈浅黄色透明液体，用适量三氯甲烷湿法装柱，含170g硅胶(100-200目)的内径40mm层析柱中，高度28cm，上样后，再覆盖0.5cm厚硅胶缓冲；采用梯度洗脱方式，见表3。

洗脱液以100ml/瓶收集，按顺序码放，根据TLC分析收集合并不同Rf值的产物，将合并的收集液旋蒸除去溶剂后，得到含量约为75wt％的环黄杨碱D纯化固体，HPLC检测如图4和表4所示。

其中，TLC色谱系统：薄层板：硅胶G薄层板；展开剂：二氯甲烷∶甲醇∶氨水＝10∶1.5∶0.2；显色剂：稀碘化必钾试剂；点样量；50～100μg。

表3

时间	氯仿	甲醇	氨水
				40min	400ml	0	0
50min	400ml	6	1.0ml
				50min	400ml	8	1.0ml
50min	400ml	10	1.0ml
				50min	400ml	12	1.0ml
100min	400ml	14	1.0ml
				150min	400ml	20	1.0ml

表4

峰	时间	峰面积	峰高	峰宽	对称因子	峰面积％
							1	6.129	11.4	1.1	0.1682	0.786	1.092
2	11.158	802.3	40.5	0.2681	0.711	76.827
							3	13.570	64.4	3.3	0.3044	0.798	6.167
4	15.993	104.2	5.1	0.3448	0.812	9.978
							5	17.818	62.0	2.4	0.3996	0.658	5.937

第三步：重结晶纯化

将纯度75％的环黄杨碱D纯化固体用氯仿和乙腈(90:10)或二氯甲烷乙腈(95:5)的混合溶剂重结晶，得到白色环黄杨碱D纯品。通过HPLC检测，环黄杨碱D纯度为98.59％，检测结果如表5和图5。

表5

峰	时间	峰面积	峰高	峰宽	对称因子	峰面积％
							1	6.127	11.9	1.2	0.1551	0.834	1.412
2	11.155	833.7	47.8	0.2713	0.698	98.588

本发明提供了一种环黄杨碱D的提纯方法的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。

Claims

1.一种环黄杨碱D的提纯方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）以黄杨木粉为原料，提取分离出环维黄杨星D后剩余的母液蒸干，得环黄杨碱D粗品；

（2）取步骤（1）环黄杨碱D粗品，使用甲醇重结晶，使环维黄杨星D析出，环黄杨碱D在母液中蓄积，然后将母液蒸干，得环黄杨碱D蓄积固体；

（3）将步骤（2）环黄杨碱D蓄积固体溶于氯甲烷中，通过硅胶柱层析纯化，然后洗脱得到纯化洗脱液，旋蒸除去溶剂后，得到环黄杨碱D纯化固体；

（4）将步骤（3）得到的环黄杨碱D纯化固体，采用氯甲烷和乙腈的混合溶剂进行重结晶即得；

步骤（3）中，层析纯化后的硅胶柱采用梯度洗脱方式，先采用氯甲烷洗脱40~50min，流速为10ml/min；再采用氯甲烷、甲醇和氨水的混合溶剂进行洗脱400~500min，流速为8~10ml/min；

所述氯甲烷为二氯甲烷或者三氯甲烷；氯甲烷、甲醇和氨水的混合溶剂中三者体积比为（70~20）：1：（0.05~0.2）；

步骤（4）中，所述氯甲烷为二氯甲烷或三氯甲烷，氯甲烷和乙腈的混合体积比为（85~100）：（1~15）。

2.根据权利要求1所述的环黄杨碱D的提纯方法，其特征在于，步骤（1）中，所述的环黄杨碱D粗品中，环黄杨碱D含量不低于15 wt%，环维黄杨星D含量不高于85 wt %。

3.根据权利要求1所述的环黄杨碱D的提纯方法，其特征在于，步骤（2）中，使用甲醇重结晶的次数为两次以上；蓄积后的环黄杨碱D蓄积固体中，环黄杨碱D含量不低于50 wt%。

4.根据权利要求1所述的环黄杨碱D的提纯方法，其特征在于，步骤（3）中，所述硅胶柱的目数为100-200目。

5.根据权利要求1所述的环黄杨碱D的提纯方法，其特征在于，步骤（3）得到的环黄杨碱D纯化固体中，环黄杨碱D的含量不低于75 wt%。

6.根据权利要求1所述的环黄杨碱D的提纯方法，其特征在于，步骤（4）中重结晶得到的环黄杨碱D晶体纯度不低于98.0 wt%。