HU182067B

HU182067B - Process for producing lh-rh and lh-rh- analogous compounds

Info

Publication number: HU182067B
Application number: HU80319A
Authority: HU
Inventors: Wplfgang Koenig; Volker Teetz; Georg Jaeger; Rolf Geiger
Original assignee: Hoechst Ag
Priority date: 1979-02-14
Filing date: 1980-02-13
Publication date: 1983-12-28
Also published as: AU532335B2; ZA80817B; ES488382A1; IL59362A; DK61180A; JPS6345398B2; DK148085B; EP0014911B1; EP0014911A2; IL59362A0; US4275001A; AR227386A1; DE2905502C2; JPS55111449A; CA1144160A; AU5548180A; ATE2316T1; EP0014911A3; JPS6317839B2; DK148085C

Description

A találmány tárgya aj eljárás a luteinizáló hormont feleszabadító hormon /LII-RH hormon/, illetőleg LH-RH-analógok előállítására, oly módon, hogy két peptidet poláros oldószerben r^agáltatunk, 3-hidroxi-4-oxo-3,4-dihidro-1.2,3-benzotriazin /HOObt/ és valamely karbodiimid hozzáadásával.

Az LH-RH, amint ismeretes, a hipotalamusz /1/ képletű hormonja

L- f^Glu-L-His-L-Trp-L-Ser-L-Tyr-Gly-L-Leu-L-Arg-L-Pro-Gly-NHg /1/, amely a hipofízisben az LH és FSH gonadotrop hormonokat' felszabadítja. {Biológiai Lexikon 2. kötet 635 old»- AkadémiaiKiadó Bp. /1975/7 · LH-RII-analógokként különös jelentőségük van az oly származékoknak, amelyekben a 6-helyzetü Gly valamely IP -aminosavra van kicserélve és amelyekben a 10-helyzetü Gly-NHg rövid szénlánca alkilcsoporttal szabsztitaálva van.

Ismeretes már, hogy az LH-RH és LH-RH-analógok előállítására különösen jól alkalmazható a Slu-His-OH dlpeptidnek a megfelelő peptidekkel, diciklohexil-karbodiimid jelenlétében, a racemizálódást csökkentő N-hidroxi-vegyületek, például N-hidroxl-szukcinimid /HONSu/,.. 1-hidroxi-benzotriazol /H0Bt/,_ J-hidroxi-4-oxo-3,4-dihidro-l,2,3-benzotriazin /HOObt/ vagy N-hidroxi~5-norbornén-endo-2,3-dikarboximid /HONB/ hozzáadásával történő reagáltatása, vö: Biochem. Biophys. Rés. Commun. 45,767-775/1971/.

Nagynyomása folyadék-kromatográfiai vizsgálattal azonban megállapították, hogy ennél az eljárásnál nem kerülhető el a j hisztidin részleges raoemizálódása vö.: az alábbi 1. és 2. tábr lázat. A hisztidin racemizálódásának a hisztidintartalmu peptiidek szintézise során történő csökkentésére az irodalom a tozilp csoport alkalmazását ajánlja az imidazol-gyürü védelmére. /Oheta. Bér. 105, 2872-2882 /1972//. A 2,4-dinitro-fenil-csoport^/Dnp/: ilyen célú alkalmazása azonban a hisztidin túlságosan erős ra—í cemizálódása és további szennyezések képzésére való hajlama mih att kevésbbé látszik alkalmasnak, vö.: Reo. Trav. Ohim. Pay-Bas 256 /1974/. , _t /

Ezért igen meglepő volt, hogy a hisztidin racemizalódás.a 2 % D-hisztidin mennyiségi arány alá csökken, ha a Q1u-Hís-0Hí kiindulási vegyületben a hisztidin-csoportot az N^im 2,4-dinit-. ro-fenil-csoporttál /Dnp/ védjük és a találmány szerinti eljá-t, rás alább ismertetendő reakciókörülményei között dolgozunk. U-. gyanilyen reakciókörülmények között a tozilcsoport lP^m-védőcsexportként való alkalmazása esetén a racemizálódás mértékét nem lehetett 5 % D-hisztidin alá csökkenteni.

A találmány tárgya tehát eljárás az /1/ képletü LH-RH vegyületek

L- CGlu-L-His-L-Trp-L-Ser-L-Tyr-Gly-L-Leu-L-Ar g-L-Pro-Gly-NH₂ /1/ és olyan LH-RH-analógok előáll!tás ára, amelyekben a 6-helyzetü Gly egy természetes 'vágy szintetikus , oldalláncában szabad karboxil- vagy aminocsoportot nem tartalmazó D-aminosavval és a 1Q-helyzetü Gly-NH_? rövid szénláncu alkilcsoporttal szabsztitaálva van, két peptid poláris oldószerben -10^GC és szobahőmérsék4 let közötti hőmérsékleten diciklohexil-karbodiimid, mint kondenzálószer és 3-hidroxi-4-oxo-3,4-dihidro-1.2.37benzotriazin, mint segédanyag jelenlétében végzett kondenzalasávál, oly módon, hogy paptidként egy

-2182.067

D- ' Glu-IIis /Dnp/-0II képletü vegyületet és egy

II-L-Trp-L-Ser-L-Tyr-G^y-L-Leu-L-Arg-L -Pro-^y-lffi₂ képletü vegyületet használunk, ahol a 6-helyzetü Gly és a 10helyzetü Gly-NHp a tárgyi körben megadott módon szubsztituálva lehet, és az oldalláncbeli karboxll-csoportok a peptidkémiában szokásos védőcsoportokkal védve vannak, majd a kapott reakciótermékből a dinitro-fenil-csoportot hidrazinolizissel vagy tio11zissei lehasltjuk.

A találmány szerinti eljárással előállított LH-RH-analó^ gokban a 6-helyzetü Gly csoport helyettesítve lehet bármely olyan természetes vagy szintetikus, oldal-láncban szabad karboxil- vagy aminocsoportot nem tartalmazó D-amlnosavval, amely az LIí-RH-analóg biológiai hatékonyságát nem csökkenti /lásd Schally és munkatársai: Science 17%, 341 /1973/· A 6-helyzetü Gly csoport előnyös helyettesitőTt a D-Ser /Buv, D-leu, D-Ala, D-Phe, D-Trp, D-Glu/ciklohexil/, D-Glu/OBu^/ és D-Lys/Boo/ csoportok képviselik.

A találmány szerinti eljárásban kiindulási anyagként felhasználásra kerülő ^lu-His/Dnp/-0II uj dipeptid-származékot a peptidkémiában szokásos módszerekkel, például a -Ö-lu-His-OH dipeptid 2,4-dinitro-íluor-benzollal, víztartalmú, nátrium-hidrogén-karbonáttal pufferezett oldatban történő reagáltatása utján állíthatjuk elő.

A találmány szer inti eljárásban oldószerként - a reagáló anyagok jó oldódása érdekében - poláros oldószerek, például dimetll-acetamid, dimetil-formamid, dimetil-szulfoxid, .foszforsav-trisz-/dimetil-amid/ vagy N-metil-pirrolidon alkalmazható előnyösen.

A szintézist -10 °C és a szobahőmérséklet közötti hőmérsékleten folytathatjuk le. Előnyösen 0°C körüli hőmérsékleten kezdjük a reakciót es később szobahőmérsékletre hagyjuk a reakcióelegyet felmelegedni.

Kondenzálószerként előnyösen a könnyen hozzáférhető diciklóhexil-karbodllmidet /DCC/ alkalmazzuk, felhasználhatók azonban erre a célra más karbodiimidek, például 1-ciklohexll-

3-/2-morfolino-etil/-karbodiImid-toluolszulfonát vsgy 1-etil-3“/3“dimetilamlno-propll/-karbodiimid-hidroklorld is.

Közbenső termékként először oly peptideket kapunk, amelyek a hisztidin imidazol-gyürüj én dlnitro-fenil-csoporttal vannak védve. Ezt a dinitro-fenil-csoportot azután a tiolizissel /Biochem-Biophys. Rés. Commun. 29» 178 /1967/; Biochemistry j), 5122 /1970/ vagy a hidrazinolizissel /Tetrahedron Letters 44, 4121 /1971/ hasitjuk le.

A Dnjo-tartalmu közbenső terméket általában nem szükséges az előállítási reakclóelegyből elkülöníteni. A peptid-kapcsolás után a reakcióelegyhez például valamely tiolt, mint merkapto-etanolt vagy etll-merkaptánt, illetőleg hidrazint adunk és a Dnp-csoport lehasitásának befejeződése után - ami vékonyrétegkr ómat ográf iával könnyen ellenőrizhető - a reakcióelegyet a szokásos módon feldolgozzuk. Ha védőcsoport-lehasitó reagensként hidrazint alkalmazunk, akkor dimetil-formamid nem alkalmas oliószerként, mert ez a vegyület hidrazlnnal szemben nem stabil.

-3182.067 ^; íjfi-RII-szlntézissel kapcsolatban különböző karboxil-koui.conousékből való kiindulással és különböző kondenzációs móHszöícl uliia Ima zásával végzett összehasonlító kísérleteink erecúményeit az alább következő I. táblázatban foglaltuk össze; e kis érietek során az egyes termékek £D-His2J.rLH-RH-t art almát nagynyomású folyadék-kromatográfiai módszerrel határoztuk meg. Az I. táblázat adatai azt mutatják, hogy kizárólag a DCC-HOObt módszer és N^im-Dnp-védelem alkalmazása esetén lehet a racemizálódás mértékét 2 % D-hisztidin alá visszaszorítani.

Ugyanezt az eredményt kapjuk az LH-RI-I-analógok egyikéinek szintézise során is, amint ezt az alább következő II. táblázat adatai mutatják.

Az I. táblázat tartalma:

Racemizálódási kísérletek az LH-RH-szintézis során

A kísérletekben az alább következő 3-5· példában megadottakhoz hasonló szintézis-körülményeket alkalmaztunk.

A nagynyomású folyadék-krómatográfiát egy 0,4 · 25 cm méretű, LiChrosorb Si 60 kereskedelmi elnevezésű, a Merek cég által gyártott, 60 a átlagos pórus-átmérőjű szilikagél adszor-⁴bonssel töltött oszlopon végeztük; eluálószerként 310 tf. rész kloroform* 190 tf. rész metanol, 14 tf. rész viz,

3,1 tf. rész trietil-amin és 1 tf. rész hangyasav elegyét alkalmaztuk; az eluálási sebesség 1 ml/perc volt.

R^ /LH-RH/ = körülbelül 14,0 - 14,5 perc R_T /fD-His^LH-RH/ = körülbelül 17,5 - 18 perc

I. táblázat

Karboxil-komponens	Módszer	%Fd-Hís5lH-RH
Lg1u-Hís-0H	DCC/HOBt	23
Π	DCC/II0NB	15
H	DCC/IIONS u	15
n	DCC/IIOObt	12
lGlu-His/Tos/-OH	DCC/IIONS u	9
11	DCC/IIOObt	5
^lGlu-His/Dnp/-0H	DCC/HOBt	25
11	DCC/HONB	7
11	DCC/IIONS u	6
11	DCC/IIOObt	1-2

i

A II. táblázat tartalma:

Racemizálódási kísérletek a ^D-Ser/Bu^t?/^7LH-RH-/l-9/-nonapeptid-etilamid szintézise során ______________A kísérletekben a.6. és 7. példában megadottakhoz hasonló szintézis-körülményeket alkalmaztunk.

A nagynyomású folyadék-kr ómat ográf iát egy 0,4 . 25 cm méretű, LiChrosorb Sí 60 kereskedelmi elnevezésű, a Merek cég által gyártott, 60 fi átlagos porus-átmérőjü szilikagél adszorbenssel töltött oszlopon végeztük; eluálószerként 410 tf. rész acetonitril, 29 tf. rész metanol, 29 tf. rész viz, 20 tf. rész kloroform, 3,7 tf. rész trietil-amin és 1 tf. rész hangyasav .elegyét alkalmaztuk. Eluálási sebesség: 2 ml/perc.

-4182.067

Ηφ rD-Ser/Bu^t/⁶71H-DH-/l-9/-nonapeptid-etilamid = 40 perc ^RT 2D-Hi8²,D-ser/Bu^t/^7LH-BH-/l-9/-nonapeptid-etllamid = 48 perc

II. táblázat

Karboxll-komponens % D-His² vegyület

.....tGla-His-OH----------—

II

TI

IT lGlu-His-/Dnp/-0H

Π

TI

Módszer

DCC/HOBt------------	------------20 -
DGC/HONSu	11
DCC/HONB	11
DCC/HOObt	6
DCC/HOBt	12
DGC/HONSu	4
DCC/I-IONB	3
DCC/HOObt	1-1,5

Az alábbi példák az I és II táblázatban szereplő kísérletek gyakorlati kiviteli módjait szemléltetik közelebbről. A példák közül az 1., 5·» 7· és 10. példák a találmány szerinti [aegoldást ismertetik, anélkül, hogy a találmány ezekre korlátozódna; és a 2., 3·, 4., 6., 8. és 9· példák összehasonlítási példaként szolgálnak.

1. példa

FGlu-His/Dnp/-0H . 0,5 H₂0 g 7100 mmól/ '-Glu-His-CII előállítása . H₂0 és 20 g /238 mmól/ nátrium-hidrogén-karbonát 200 ml vízzel készített oldatához keverés közben 1 óra alatt hozzácsepegtettük 22,3 g /120 mmól/ 2,4— dinitro-fluor-benzol 100 ml dioxánnal készített oldatát. Ezután az elegyet 3 óra hosszat keverjük szobahőmérsékleten. A képződött csapadékot leszivatással kiszűrjük és a szürletet 200200 ml etil-acetáttal kétszer extraháljuk. A vizes fázist bepároljuk, a maradékot 200 ml vizben oldjuk és 120 ml n sósavoUda^ot_ad.ank hozzá. A_t kivált vörös szinü olajról a vizes fázist' dekantáljuk és szűrjük. A vizes szürlethez 300 ml n-butanolt adunk, a kétfázisú elegyet alaposan összerázzuk, majd éjjelen át 4 ⁶C hőmérsékleten állni hagyjuk. Másnap a képződött sárga' csapadékot leszivatással szüxjük és kevés n-butanollal mossuk. Ezután a csapadékot a még jelenlevő T-rlu-His-OH teljes eltávo-* litása céljából 300-300 ml vizzel szobahőmérsékleten 1-1 óra hosszat keverjük, minden alkalommal leszivatással szűrjük, azután pedig foszfor-jDentoxid felett vákuumban megszár itjuk. Az igy kapott 20 g -LG1 u-His/Dnp/-0H . 0,5 H₂0 235-241 °0-on bom-j,

1-áa—közbenolvad.—----------- foO gl = -12,2° /o i= 1, foj²¹ = +18,9° /o = 1, ecetsavban/ dimetil-formamidban/

2. példa tGrlu-His/Tos/-OH előállítása /összehasonlító anyag az I. táblázat szerinti kísérletekhez/

-5182.067 ., /10 mmól/ 'Glu-IIis-OII éa 2,3 g nátrium-hidrogén-karbonát 20 ml vízzel készített oldatához szobahőmérsékleten, keverés közben, lassan hozzácsepegtetjük 2,1 /10 %-os felesleg p-toluol-szulfoklorid körülbelül 10 ml dloxannal készített oldatát. A hozzáadás befejezése után az elegyet még 1 óra hosszat tovább keverjük. A reakcióelegyet azután éterrel kétszer kirázzuk, a vizes fázist 2 n sósavoldattal 2 pH-értékig savanyítjuk, majd a képződött csapadékot les Hivatással szűrjük, vízzel mos-’ suk és foszfor-pentoxid felett vákuumban megszór it juk. Ily módon 2,2 g Í&lu-His/Tos/-0H terméket kapunk. -----------------------..................—

3. példa

LH-RH szintézise ÍGlu-His-OH felhasználásával, az I. táblázat szerinti különböző kapcsolási módszerekkel.

640.mg H-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH₉-ditozilát és 150 mg -Glu-His-0Ii.H₉0 3 ml dlmetil-acetárniddal ^készített oldatához 0,065 ml N-etTl-morfolin és 68 mg HOBt /illetőleg 81 mg HOObt, 90 mg H0NB_A 57 mg IíONSu/ elegyet adjuk. Az elegyet 0 °C hőmérsékletre hűtjük, 110 mg diciklohexil-karbodiimidet.adunk hozzá, 1 óra hosszat 0 °c hőmérsékleten, majd éjjelen át szobahőmérsékleten keverjük. Másnap 0,1 ml hidrazin-hidrátot a_dunk az elegyhez, szobahőmérsékleten 2 óra hosszat keverjük, majd leszlvatással szűrjük. A szürletet 30 ml n-butanol es 30 ml vizes nátrium-hidrogén-karbonát-oldat között megoszlatjuk. Az N-butanolos fázist elkülönítjük, nagyvákuumban bepároljuk és a maradékot éterrel eldörzsöljük. A kapott csapadékot leszlvatással leszűrjük és megszűr it juk, majd hig ecetsavban oldjuk és körülbelül 10 ml acetat-alakban levő Dowex 1x2 gyantán kro— matografáljuk. Vizzel eluálunk és az eluátumot fagyasztva szárítjuk. Ily módon 500-600 mg terméket kapunk, amelyet további tisztítás céljából megoszlatásos krómatográfiának vetünk alá egy hidroxi-propilezett, térhálósított dextrán-gélen, a 24 38 350 sz· német szövetségi köztársaságbeli szabadalmi közzétételi irat 1. e/ példájában leirt eljárás szerint. így végűlis 250-300 mg tiszta LH-RH terméket kapunk.

4. példa _______________LH-RH szintézise ?-Glu-His/Tos/-0H felhasználásával, az

I. táblázat szerinti különböző kapcsolási módszerekkel

640 mg H-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NHp-ditozilát és 210 mg ÍGlu-His/Tos/-OH 3 ml dimetil-acetáttal^készitet t oldatához 0,065 ml N-eüil-morfolin és 81 mg HOObt /illetőleg 57 mg HONSu/ elegyét adjuk. Az elegyet 0 °G hőmérsékletre hütjük, 110 mg diciklohexil-karbodiimidet adunk hoqzá, majd az elegyet 0 °G hőmérsékleten 1 óra hosszat és ezt követően szobahőmérsékleten éjjelen át keverjük. A reakcióelegy további feldolgozása a 3. példában leírthoz hasonló módon történik. így 275 mg /11let-őleg 250 mg/ LH-RH terméket kapunk.-----------·-----------------------------------

5. példa

LH-RH szintézise LGlu-His/Dnp/-0H felhasználásával, a találmány szerinti módszerrel g /25 mmól/ fölu-His/Dnp/-0H . 0,5 H_?0 és 32 g /25 mmól/ H-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NHp .2 Tos-OH 150 ml dimetil-acetárniddal készített oldatához 4,07 g HOObt /= 3-hidE

-6182.067 oxi-4-oxo-3j>4-dihidr o-l,2,3-benzotriazin/ hozzáadása és az elegy 0 °C hőmérsékletre· történő lehűtése után 3,25 ml N-etll-moríollnt és 5,5 g diclklohexil-karbodiimldet adunk. Az elegyet 0 °C hőmérsékleten 1 óra hosszat, majd szobahőmérsékleten ejjelen át keverjük, azután a képződött csapadékot leszlvatássál kiszűrjük és kevés dimeti1-aoetamiddal mossuk. A mosófolyasdékot egyesítjük a szürlettel, majd az elegyhez 2,5 ml 100 %-oh hidrazln-hidratot adunk és ezt az elegyet szobahőmérsékleten 4 óra hosszat keverjük. Fekete színű oldatot kapunk, ebből 1250 ml etil-acetát hozzáadásával leválasztjuk a peptidetb. A képződött csapadékot leszlvatással szűrjük, etil-acetáttal mossuk, majd 430 ml metanolban oldjak és 1400 ml etil-acetát hozzáadása utján újból leválasztjuk a peptldet. Ezt a csapadékot leszlvatással leszűrjük, majd 1000 ml n-butanolban oldjuk és az oldatot előbb 1000 ml telített vizes nátrium-hldrogén-karbonát-oldattal, majd 750 ml telített vizes nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal kirazzuk. Az n-butanolos fázist elkülönítjük és nagyvákuumban bepároljak. A bepárlási maradékot etil-acetáttal eldörzsöljük, elkülönítjük és megszáritjuk. Ily módon körülbelül 25 g nyers LH-RH terméket kapunk. A 3· példában leírthoz hasonló módon történő tisztítás után a hozam 12-14 g tisztaamorf LH-RHj. HJ 21 _ _^ο /c = 1, 1 %-os ecetsavban/.

6. példa

LH-RH szintézise -Glu-His/Dnp/-0H felhasználásával, az

I. táblázatban megadott összehasonlítási kapcsolási módszerekkel.

Az 5· példában leírtakkal azonos módon dolgozunk, azzal a’különbséggel, hogy 4,07 g HOObt helyett 3,4 g HOBt-t, 4,5 g HONB-t, illetve 2,9 g IIONSu-t használunk.

7. példa rb-Ser/Bu^t/^7LH-RH-/l-9/-nonapeptid-etilamid szintézise -Glu-HÍs Dnp -OH felhasználásával, a találmány szerinti módszerrel g /25 mmól/ LÖla-IIis/Dnp/-OH . 0,5 H-O és 26,6 g /25 mmól/ H-Trp-Ser-Tyr-D-Ser/Bu^t/-Leu-Arg-Pro-HH-C₂H₅.2HC1 150 ml dimetil-acetamiddal készített oldatához, 4,07 β HOOBt /= 3-hidroxi-4-oxo-3_t4-dihidro-l,2,3-benzotriazin/f hozzáadása és az elegy 0 °C hőmérsékletre való lehűtése után 3,25 ml N-etil-morfolint és 5,5 g diciklohexil-karbodiImidet adunk. Az elegyet 0 °C hőmérsékleten 1 óra hosszat keverjük? majd a keverést éjjelen át szobahőmérsékleten folytatjuk. Masnap a képződött csapadékot leszlvatással leszűrjük és 50 ml dimetil-acetamiddal mossak. A mosófolyadékkal egyesített szürlethez 2,5 ml 100%os hidrazin-hidrátot adunk. JÁz. elegyet szobahőmérs ékleten 4. óra hosszat keverjük, majd 1250 ml etil-acetát hozzáadásával kicsapjuk a peptldet. A csapadékot leszlvatással szűrjük és etil-acetáttal alaposan mossak. Bzatán-430 ml metanolban oldjuk és ebből az oldatból 1400 etil-acetát hozzáadásával újból lecsapjuk a peptidet. Ezt a csapadékot 1000 ml n-butanolban oldjuk es egyszer 1000 ml telített vizes nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal, majd 750 ml telitett vizes nátrium-hidrοβén-kar bonát-oldattal még egyszer kirázzuk. Az n-butanolos fázist bepárol-r

-7182 067 juk. éa a maradékot etil-acetáttal eldörzsöljük éa leszivatássa|. szűrjük, majd a szűrön maradt terméket etil-acetáttal mossuk é$ megszór ltjuk. Ily módon 18,7 g terméket kapunk.

A fenti módon kapott terméket acetáttá történő átalakítás céljából 50 ml viz és 5 ml ecetsav elegyében oldjak, majd 230 ml acetát-alakban levő Dowex 1x2 gyantán kromatografáljuk. Viz* zel elaálank, a kívánt terméket tartalmiazó eluátum-frakciókat egyesítjük és fagyasztva szárítjuk. Ily módon körülbelül 15,0 £ ]D-Ser/BuV°jLH-RH-/l-9/--nonapeptid-etilamidot kapunk, 23 = —40°- /o = 1, metanolban/ ·--------------------------— - -----------------------------------A kapott termék további tisztítása a 3. példában leirt módon történik; a tiszta termék hozama körülbelül 9,5 - 11 g.

8. példa /D-Ser/Bu^/^LH -RH-/l-9/-nonapeptld-etilamid szintézise fGlu-His-/Dnp/-OH felhasználásával, a II. táblázatban megadott összehasonlítási kapcsolási módszerekkel _______________A 7· példában leírtakkal azonos módon dolgozunk, azzal akülönbséggel, hogy 4,07 g HOObt helyett 3,4 g IIOBt-t 4,5 g HCNB-t, illetve 2,9 g IíONSu-t használunk.

9. példa _n ÍD-Ser/Bu^fc/⁶7LH-BH-/l-9/-nonapeptid-etilamid szintézise IGlu-Hfs-CH felhasználásával, a II. táblázat szerinti különböző kapcsolási módszerekkel

532 mg H-Trp-Ser-Tyr-D-Ser/Bu^fc/-Leu-Arg-Pro-NH-C₂H₅ .

—2HG1 és 15Θ mg ÍGlu-Hie-OH . H_?O 3 ml dimeti1-apetamidaal készített oldatához, 0,065 ml N-etíl-morfolin és 68’mg HOBt /illetőleg 81 mg HOOBt, 90 mg HQNB vagy 57 mg HONSu/ hozzáadása iés az elegy 0 °G hőmérsékletre történő lehűtése után 110 mg diciklohexll-karbodiimidet adunk és az elegyet 0 °C hőmérsékleten 1 óra.hosszat, majd szobahőmérsékleten éjjelen át keverjük. A reakcióelegy feldolgozása és a kapott nyers termék tisztítása a 3. példában leírt módon történik. így 104 - 207 mg tiszta terméket kapunk.

’ ~~lOT~példa rGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Lys/Boc/-Leu-Arg-Pro-Gly-NH₂-diacetát

590 mg /0,5 mmól/ H-Trp-Ser-Tyr-D-Lys/Boc/-Leu-Arg-Pro-Gly-NHp.2 HCl-t, 220 mg /0,5 mmól/ bÖlu-His/Dnp/-0H.0,5 H^O-t és 81,5 jng_ /0,5 mmól/ HOObt-t feloldunk 5 ml dimetil-acetamld* bán és 0.065 ml N-etil-morfolint és 110 mg DCC-t adunk hozzá. A reakcióelegyet 1 órán keresztül 0 °C hőmérsékleten, ma^d egy 'éjszakán keresetül szobahőmérsékleten kevertetjük. A_ kivaló csapadékot leszúr jük, és dimeti I-ácetamidd'al~ mossuk. A szűr létet 0,5 ml 2-merkapto-etanóllal és annyi trletil-amlnnal elegyítjük, hogy az oldat kifejezett lúgos reakciót adjon /pH=8-9/« A reakcióelegyet egy éjszakán keresztül állni hagyjuk, majd máápap a peptidet ecetészterrel kicsapjuk és az 5· példában leir-l takkal analóg módon feldolgozzuk és a 3· példában leírtakkal af palóg módon tisztítjuk. Kitermelés 310 mg, forgatóképességs

-41° /c = 1, dimet il-acetamidban/.

-8182.067

Azonos eredménnyel alkalmazható a 2-merkapto-etanol helyett a 2-merkapto-etán vagy a 2-merkapto-ecetsav.

Claims

Szabadalmi igénypont

1. Eljárás az /1/ képletü lutenizáló hormont felszabadító hormon /LH-BH-hormon/ L- fölu-L-His-L-Trp-L-Ser-L-Tyr-Gly-12 3 4 5 6

-L-Lea-L-Arg-L-Pro-Gly-NH~ /1/ és olyan analógjai előállitására - amelyekben a 6-helyzetü Gly egy természetes vagy szintetikus, oldalláncában szabad karboxil- vagy amlno-csoportot nem tartalmazó D-aminosavval és a 10-helyzetü Gly-NHo rövid szénláncu alkilcsoporttal szubsztituálva van - két peptid poláris oldószerben -10 °C és szobahőmérséklet közötti hőmérsékleten diciklohexil-karbodiimid mint kondenzálószer és 3-hidroxi-4-oxo-3,4-dihidro-l,2,3-benzotrlazin mint segéd-anyag jelenlétében végzett kondenzálásával, és a védőcsoportok lehasitásával, azzal jellemezve, hogy peptidként egy

........... 1- ‘Glu-His/Dnp/-0H képletü vegyületet és egy

H-L-Trp-L-Ser-L-Tyr-Gly-L-Leu-L-A r g-L-Pr 0-Gly-NH_o

6 10 ^aképletü vegyületet használunk, ahol a 6-helyzetü Gly és a 10helyzetü Gly-NHn ^a tárgyi körben megadott módon szubsztituálva lehet, és az oldalláncbeli karboxilcsoportok a peptidkémiában szokásos védőcsoportokkal védve vannak, majd a kapott reakciótermékből a dinltro-fenil-csoportot hidrazinolizissel vagy tlollzissel lehasitjuk. .