HU180260B - Process for producing composition for treating infections with herpes zoster and other herpes-infections - Google Patents

Description

dr. Mayr Anton, orvos, München, dr. Stickl Helmut, orvos, Krailling, dr. Westhues Melchior, orvos, München Német Szövetségi Köztársaság

Eljárás Herpes zoster és más herpes-fertőzések kezelésére szolgáló készítmény előállítására

A találmány tárgya eljárás Herpes zoster és más herpesfertőzések kezelésére szolgáló készítmény előállítására.

Az utóbbi években megszaporodtak az úgynevezett faktorbetegségek, melyek alatt melegvérüek úgynevezett opportunista kórokozó csirák által előidézett baktériumos, vírus- és gombaeredetű fertőzőbetegségeit értjük. Ezek a kórokozók vagy latens formában vannak jelen a szervezetben, vagy szimbiózisban együttélnek a testtel anélkül, hogy azt károsítanák. Ha azonban bizonyos tényezők /például nagyenergiájú sugárzások, antimetabolltok, az immunapparátus rendszerbetegségei, hormonok és mások/ miatt az általános ellenállás osökken, úgy ezek a fertőzőbetegségek megtámadják a szervezetet és nehezen gyógyítható kórképekhez vezetnek.

A fentiekre példa a herpes zoster /övsömör/, melyet a Herpesvírus varicellae okoz.

A herpes zoster bárányhimlő /varioella/ megbetegedés után hosszú idő múlva, az áloázottan fennmaradt vírus aktiválódása utján lép fel és természeténél fogva ideggyökök heveny gyulladása, melyhez csatlakozóan az érzőidegek mentén a bőrön hólya?ok jelennek meg. A zoster csak embernél lép fel: sem térmészeea, sem kísérletes állati megbetegedés formájában nem fordul elő.

A zoster szabványos gyógymódját eddig nem sikerült kialakítani. A kezelésre irányuló számos kísérlet, mint például lokális kezelés /porok vagy kenőosök/, szteroidok, fájdalomcsillapító és reumaellenes szerek, valamint az interféronlzálás ed

-1180260 élig nem adott kielégítő eredményt.

A passzív lnterferonizálás, azaz Izolált, külső interferon alkalmazása csak rövid ideig tartó eredményhez vezetett és a zostert nem tudta döntően befolyásolni. Kedvezőbb eredményeket értek el az úgynevezett interferon-indukcióval, azaz olyan anyagok beadásával, amelyek a testazonos sejteket interferontermelésre késztetik /indukálják/. De ezek is csak korlátozott hatásosságot mutattak, mivel - virus által kiváltott interferontermelés esetén - az interferon visszahat a kiváltó virus fertőző folyamatának további alakulására is. Szintetikus interferon-induktorok károsaknak mutaíikoztak, mivel a sejtek genetikus anyagát érintik. Kielégítő, hatékonyságot és ártalmatlanságot biztosító aktív interferonizá^ást is eddig még nem találtak.

A 2 437 166 számú Német Szövetségi Köztársaságban nyilvános ságr ahozat ali irat szerint herpes zoster és más virus-betegségek kezelésére 420-800 sejttenyészetátoltás /passzázs/ utján legyengített avipoxvirus alkalmazható. Az attenuált avipoxvlrus a fenti továbboltásl tartományban azonos és stabil tulajdonságokkal rendelkezik.

A 429 továbboltással attenuált és utána háromszor plaquemódszerrel /egyrétegű sejtkultúrába/ leoltott vírust /432. paszszázs/ Mayr-Stlckl-Avipox-Interferon-Inducer'’ megjelöléssel a Nordheim-Westfalla tartományi oltóintézetben, a virustenyéaztésl és -vizsgálati osztályon Düsseldorfban tettük le.

A 2 437 166 számú Német Szövetségi Köztársaságbell nyilvános ságrahozatall iratban leírt fenti tyuk-varlcellavlrua hátránya a még meglévő szaporodóképességében rejlik.

Megállapítottuk, hogy a varicella- és para-varicella-virusok /Poxvirldiae család/, különösen az avipox-virus és az orf-virus, úgy eredeti /virulens/, mint attenuált /avlrulens/ formában gamma-sugárzás hatására nemcsak szaporodóképességüket vesztik el, hanem egyúttal fokozódik herpes-fertőzésekkel szembeni hatásosságuk is; ez azért meglelő, mert az inaktiváláai kezelés általában a hatásosság csökkenéséhez vezet.

Az ilyen inaktiváláshoz gamma-besugárzás alkalmas, amely szelektíven károsítja a virus nukleinsavalt, anélkül, hogy más virusstrukturák, különösen a vírus felszíni strukturál* a vírusfehérje és a burokanyagok megváltoznának vagy károsodnának.

Meglepő módon azt is megállapítottuk, hogy a találmány szerint kezelt virus-készitmények nemcsak parenterális, hanem orális kezelés esetén is kifejtik gyógyszer-hatásukat.

A találmány szerinti készítmények előállítása céljából sejttenyészeteket az alkalmazni kivánt vírussal fertőzünk meg; a virusszaporodás tetőpontján a vírust a sejttenyészetből ismert módszerek segítségével kinyerjük és tisztítjuk. A tisztított virusszuszpenzióban meghatározzuk az 1 ml-re eső lnfektiv egy

azonban már akkor kielégítően hatásos, ha alsó határként mintA fentiek szerint kapott virusszuszpenzló gammabesugárzásához ismert módon az inaktiváló sugárkezelést addig folytatjuk, amíg a kiindulóanyag valamennyi vírusa elveszti szaporodó-2180260 képességét. Az inaktiválási kinetika szempontjából különösen a következő tényezők mértékadóik: a virusanyag fajtája, koncentrációja, közege és térfogata, az edény anyaga és az energiaforrás. Az lnaktlvált virusanyaghoz előnyösen alkalmas stabilizátorokat adunk, például 2 %-os lefölözött tejet vagy peptont. Végül az inaktlvált anyagokat gyorshütéssel szárítjuk. A szárított termék kiindulóanyagként szolgál a találmány szerinti készítmény mindenkori alkalmazási formálnak előállításához.

Az alábbiakban példaképpen leírjuk egy találmány szerinti készítmény előállítását.

Kiindulóanyagként a fent emlitett helyen letétbe helyezett ”Mayr-Stickl-Avipox-Interferon-Inducer” jelzésű, emberre és állatra ártalmatlan és tyukembíló-fibroblaszt-tenyészetekben /FHB/ szaporodni képes tyukhimlő-vlrust használjak. A vírus a ΞΡ-1 tyukhimlőtörzsből ered, melynek virulenolaját az FHE-ben való számos passzázs során lecsökkentettük és a 429. továbboltás után plaque-képzéssel tisztítottuk. A 3» plaque-passzázs /432. továbboltás/ után kapott virusszuszpenziot friss fiatal tojások /leukémiamentes/ FHE-jében felszaporitjuk és liofilezzük. Ez a2 anyag /elsődleges tenyészet/ a találmány szerinti készítmény klindulóanyaga. A találmány szerinti készítmény előállítása céljából stacionárius EHE-ben /közeg: borjuamnion-folyadék « RAF/ elszaporitjuk. A vlrusszuszpenziokat feltárjuk /ultrahang/, tisztítjuk /frakclonált centrlfugálás/ és 2,5 % laktalbumin hozzáadása után liofilezzük. A végső preparátum titere 107 - 5.1O°»5 írustartalmat FHE-ben ismert eljárásokkal mutatjuk ki.

A kiindulási virusszuszpenzlóból a fentiek szerint izolált vírust a szaporodóképesség megszüntetése céljából gamma-súg ár zással kezeljük /kobaltágyú; dózisteljesitmény körülbelül 20 krad/ perc, 500 ml-es ipariüveg-tartály/ és 10θ rád elnyelt dózissal lnaktiváljuk. Az inaktiválás kimutatása céljából a kezelt anyagból elegendő szúr ópróba-tér fogat okát adunk embrionális tyukfibroblaszt-sejtek tenyészeteihez. Ha legkésőbb 9 nap múlva nem jelentkeznek virusokozta sejtkárosító /citopatogén/ hatások /CPE/ a sejttenyészetben, ez a teljes inaktiválást bizonyítja.

Az igy kapott preparátumok különböző formákban alkalmazhatók:

1. Steril kétszer desztillált vízben reszuszpendálva /Imi = 1O⁷»⁷⁵ KID₅₀/ml/;

2. tablettázva vagy kapszulázva /1 tabletta illetve kap- szula = io⁷»⁰ kid₅₀, a tablettázott forma esetében a liofilezés előtti folyékony fázisból indulunk ki/ és

3. spray alakjában /1 ml kétszer desztillált viz 10% gli cerlnnél = 10'KIDr-n/ml/·

A találmány szerinti készítmény szokványos segédanyagokat tartalmazhat. A találmány szerinti készítmények segítségével hatásosan küzdhetők le melegvérüek herpesfertőzései, különösen a herpes zoster.

A találmány szerinti készítmények beadása után a nem-specifikus rezisztenoia keretében fokozódik a fagocitózis és a humorális rezisztencia-faktorok, különösen a komplement és az

-3180260

IgM-antltestek stimulációja következik be. Ezen felül atimulálodik az interferon-képződés, vagy a már megindult interferontermelődés fokozódik, illetve a már létrejött interferon felszabadul. Párhuzamosan megy végbe a makrói ág ok beszürődése a lépbe, májba és nyirokcsomókba és a monocltak felszaporodása a keringésben. Általában a makrofág-tevékenység /fagooltózis, antigén-közvetítés/ a kiindulási érték 400 %-áig emelkedhet.

A találmány szerinti készítmény hatásossága SVS-modellben /újszülött egerek standardizált megfertőzése a stomatitis veslcularls vírusával/ mutatható ki, amely technikai okokból és jó reprodukálhatósága miatt a találmány szerinti készítmény vizsgálatára alkalmas.

276 egeret megfertőzünk a vesioularis stomitltis vírussal; a következő néhány napon belül 224 fertőzött állat /81%/ pusztul el*

Egy 201 állatból állü osoportot előkezelünk szaporodóképes ovlpox-virusból álló kezeletlen készítménnyel; ekkor 85 állat pusztul el, vagyis a mortalitás a kontrollal szemben csak

42,3 %.

125 állatból álló csoportot a találmány szerinti készítménnyel előkezelve osak 18 állat pusztul el, vagyis a mortalitás 14,4 %, tehát 1/5-e a fertőzött kezeletlen állatok mortalitásának.

Ami a halál beálltának a gyorsaságát illeti, a fertőzött és kezeletlen kontrollállatok átlagosan 5,3 ^naP múlva, az összehasonlítási készítménnyel előkezelt állatok 19,5 nap múlva és á találmány szerinti készítménnyel előkezelt állatok 33,3 nap múlva pusztultak el.

A következő táblázat azt is bemutatja, hogy dózisonként azonos virusantigén-mennylség mellett a hatasindex 48-ról 82-re emelkedik.

-4180260

H <r4 «1 N o o .

SPd 2 WOJ P r4 r4 43 aj

Pi

LA « cn to

K\

LA

Táblázat

A találmány szerinti készítmény hatásosságának vizsgálata

Ή •H a

N CQ

A H φ *» <d ρ p K

S!

P Φ x> 3 Φ s f £ cn

A q

4>·<0 *443 O -H Sri

Φ4· ι—I M Η Q 'Λ Pi OJ O Λ ⁰¹ Μ O ö

Pl co

ΙΛ

- ·> 9!

&*

C\lCM co .ifi tfl feJí S φ %^W5Í_& kD-rl H43 φ Ű \Orl tűCÜH'® r4 φ·< H ® Ö ja aj44 «4» ο- | m φ -rí tAM O-HJ4 « 4- n tír) a> tn OJ CO HMD CMR 5»4>4*JJ

O

JO h a

V.

Megjegyzést Szignifikancia-számitás a Chi-kvadrát módszerrel; p^_0,01

-5180260

Az összehasonlításképpen használt készítmény és a találmány szerinti készítmény között további különbség mutatható ki a fagocltózis-vizsgálat segítségével. Ha egereknek intraperltoneálisan a szaporodásra képes összehasonlítási készítményt adjuk be, úgy fokozódik a fagooitózls, ami szénrészecskékkel végzett feltisztulási próbával matatható ki. 48 óra múlva az 1:16 hígításban alkalmazott készítmény még fagocitózls-fokozódást tud előidézni. A találmány szerinti készítménnyel azonos időpontban azonos hatás még 1:64 hígítás esetében is elérhető.

A találmány szerinti készítmény alkalmazására a következő példákat említjük meg:

1/ 11 éves leány 3 nap óta fennálló axc-zosterrel.A fentiek szerint előállított készítmény 0,5 ml térfogatait porlasztó segítségével orron át és belélegzés utján adagoljuk.

Az alkalmazást az 1. napon 3x, a 2. napon 2x, a 3· napon 1X végezzük el. Már 48 óra múlva csökken a fajdalom és elkezdődik az arc-zoster pörkösödése. A pörk 12 nap után esik le /normálisan ez nem következik be 32 nap előtti/.

2/ 51 éves férfi nyombélfekéllyel és rossz általános állapottal. A zoster a 7-10· borda magasságában a mellbimbótól a hátig terjed ki. Számos hólyagocska látható, uj hólyagok az első megfigyeléstől számított 4. napig jelennek meg. Rohamokban erős fájdalom lép fel, különösen éjjel.

A leírtak szerint előállított orális tablettákból összesen 48-at alkalmazunk. Minden alkalommal 6 tablettát adunk be, 4-6 órás időközökben /éjjel legalább 8 órás szünetet tartunk/· A kezelés 3 napig tart. A fájdalom a kezelés elkezdésének napján enyhül, a 3· kezelési napon megszűnik. Pörkképződés a kezelés 6. napjául, a pörk leesese a 18. napon következik be. A zoster eredményes kezelésével együtt javul a nyombélfekély. A melléküregek kis érő hurutos tünetei is visszafejlődnek, az orrlégzés szabaddá válik.

3/ 23 éves leány idült reoidiváló hólyaghuruttal Γόοΐίbaktériumok, soor /candidlasis/ a vizelet-tenyészetben/. A körlönböző szokványos terápiás kísérletek nem eredményeztek tartós hatást. A fentiek szerint előállított tablettákból 3 nap alatt 36-ot adunk be. A panaszok /gyakori vizelés és a kísérő égető érzés/ egy hét malva javulnak és ettől kezdve hosszabb időn át a beteg panaszmentes.

Claims (2)

1. Szabadalmi igénypontok

   1. Eljárás Herpes zoster és más herpes-fertőzések elleni készítmény előállitására, azzal jellemezve, hogy sejttenyészeteket Poxvirldiae-családba tartozó varicella- és páravar!cellavírussal fertőzünk meg, a vírus szaporodás csúcspontján a vírust izoláljuk éstisztítjuk, a tisztított vírus szuszpenziójának ti tér ét 5,1O^Ö-5,1O⁸ IDcz/ial-*® állítjuk be, gamma-bea ugar z ássál a vírus nukleinsavalt szelektíven károsítjuk anélkül, hogy más vírus struktúrák, különösen a vírus felszíni strukturál, a virusfehérje és a burokanyagok megváltoznának vagy károsodnának, végül a vlrusszuszpenziót adott esetben stabilizátorokkal és/ vagy segédanyagokkal együtt intraperitoneálisan vagy lokálisan alkalmazható készítménnyé dolgozzuk fel·

   -6180260
2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatositási módja, azzal jellemezve, hogy a gamma-sugárzásnak a ”Mayr-Stiokl-Avlpox-Interíeron-Induoei” jelzéssel letett, 420-800 sejttenyészet-továbboltással legyengített, a fenti továbboltáal tartományban végig azonos és stabil avipoxvirust tesszük ki.