HRP20040071A2 - Use of il-18 inhibitors in hypersensitivity disorders - Google Patents

Description

Područje izuma

Prisutni izum vezan je uz područje alergija. Točnije, odnosi se na upotrebu IL-18 inhibitora u liječenju i/ili prevenciji poremećaja preosjetljivosti, te posebno poremećaja koji obuhvaćaju reakcije odgođenog tipa preosjetljivosti ljudskoga tijela.

Pozadina izuma

Termin alergija ili preosjetljivost upotrijebljava se kada se prilagodiv imunološki odgovor javlja u neodgovarajućem obliku. Alergijske ili reakcije preosjetljivosti su rezultat obično korisnih imunoloških odgovora koji ne djeluju odgovarajuće na strane antigene (obično makromolekule iz okoline), te ponekad uzrokuju upalne reakcije i oštećenje tkiva. U tim situacijama, obično bezazleni stimulans iz okoline koji se naziva alergen inicira imunološki odgovor koji se kod ponovne izloženosti ponovno aktivira na izazvano patološko oštećenje.

Reakcije preosjetljivosti su štetne imunološke reakcije na vanjske alergene. Postoje mnoge klasifikacije preosjetljivosti. Neke se baziraju na vremenu potrebnom za javljanje simptoma ili kožnih reakcija kod ispitivanja nakon izloženosti antigenu (npr. trenutna i odgođena preosjetljivost), na tipu antigena (npr. reakcije lijekova) ili na prirodi organskog problema. Klasifikacije se općenito pojednostavljuju i ne uzimaju u obzir činjenicu da se može javiti više tipova imunoloških odgovora ili da može biti potrebno više tipova za stvaranje imunološkog oštećenja. Najčešće upotrebljavana klasifikacija je slijedeća:

Tipom I ili trenutnom preosjetljivosti posreduje IgE. Takva preosjetljivost obično se naziva i alergija. Reakcije trenutne preosjetljivosti (tip I) javljaju se zbog vezanja između antigena i IgE na mastocitima ili bazofilima.

Poremećaji vezani uz reakcije preosjetljivosti tipa I također se nazivaju i atopijske bolesti i obuhvaćaju npr. alergijski rinitis, alergijski konjuktivitis, atopijski dermatitis, vanjsku alergijsku astmu, urtikariju, organsku anafilaksu. Rasprostranjenost astme izrazito raste, iako se uzroci ponajčešće ne prepoznaju. Nedavno je zabilježen izraziti porast reakcija tipa I na izloženost proteinima topljivim u vodi koji su prisutni u lateks produktima (npr. gumenim rukavicama, dentalnim zaprekama, kondomima, cjevčicama za respiratornu opremu, kateterima), posebno među medicinskim osobljem i pacijentima koji su izloženi lateksu, te djecom sa spina bifida i urogenitalnim porođajnim defektima. Česte reakcije na lateks su urtikarija, angioedem, konjuktivitis, rinitis, bronhospazam i anafilaksa.

Pacijenti s atopijskim bolestima (uključujući atopijski dermatitis) obično imaju nasljednu sklonost za razvoj preosjetljivosti kojom posreduje IgE antitijelo na udahnute ili progutane tvari (alergene) koje su neškodljive ljudima koji nisu atopijski. Osim u atopijskom dermatitisu, kod preosjetljivosti obično posreduju IgE antitijela.

Tip II ili citotoksična preosjetljivost obuhvaća citolitička djelovanja kojima posreduje antitijelo, komplement i/ili stanični mehanizmi. Cilj reakcija tipa II je stanična površina, a njihov rezultat je stanično oštećenje ili smrt. Antitijelo na stanično vezanom antigenu (tip II) uzrokuje uništenje stanice aktivirajući komplement ili potičući fagocitozu. Primjeri staničnih oštećenja u kojima antitijelo reagira s antigenskim komponentama stanice su Coomb-pozitivna hemolitička anemija, trombocitopenična spontana krvarenja u tkivima uzrokovana antitijelima, leukopenija, pemfigus, pemfigoid, Goodpastureov sindrom i perniciozna anemija. Takve reakcije javljaju se kod pacijenata koji primaju nekompatibilnu transfuziju, kod hemolitičkih bolesti novorođenčadi, te kod neonatalne trombocitopenije, a također imaju ulogu i kod bolesti koje obuhvaćaju više organa, vezanih uz preosjetljivost (npr. sistemski eritemski lupus, SLE).

Mehanizam oštećenja najbolje se objašnjava utjecajem na crvene krvne stanice. Kod hemolitičke anemije, crvene krvne stanice uništavaju se intravaskularnom hemolizom ili makrofagnom fagocitozom, pretežno u slezeni. In vitro istraživanja pokazuju da u prisutnosti komplementa neka antitijela koja vežu komplement (npr. antitijela krvnih grupa anti-A i anti-B) uzrokuju brzu hemolizu. Ostala antijela (npr. anti-LE antitijela) uzrokuju polaganu staničnu lizu, a neka niti ne oštećuju stanice direktno nego uzrokuju njihovo prijanjanje na fagocite i uništavanje pomoću istih. S druge strane, Rh antitijela na crvenim krvnim stanicama ne aktiviraju komplement, te uništavaju stanice pretežno ekstravaskularnom fagocitozom. Primjeri u kojima je antigen sastavni dio tkiva su ranoakutno (hiperakutno) odbacivanje transplantiranog bubrega, zbog prisutnosti antitijela na vaskularnom endoteliju i Goodpastureov sindrom, zbog reakcije antitijela s gromerularnim i alveolarnim temeljnim membranskim endotelijem. Kod eksperimentalnog Goodpastureovog sindroma komplement je važan posrednik oštećenja, no uloga komplementa nije jasno određena kod ranoakutnog odbacivanja transplatata.

Primjeri reakcija u kojima dolazi do haptenskog spajanja sa stanicama ili tkivima obuhvaćaju mnoge reakcije preosjetljivosti na lijekove (npr. hemolitička anemija koja je uzrokovana penicilinom, vidi kasnije).

Reakcije antireceptorske preosjetljivosti mijenjaju staničnu funkciju kao rezultat vezanja antitijela na membranske receptore. Kod mnogih bolesti (npr. mijastenija gravis, Graveova bolest, dijabetes otporan na inzulin) opisana su antitijela na receptorima staničnih membrana. Kod nekih dijabetičnih pacijenata s ekstremnom otpornosti na inzulin javljaju se antitijela na inzulinskim receptorima, sprečavajući na taj način vezanje inzulina na njegove receptore. Kod pacijenata s Graveovom bolesti prepoznato je da antitijelo na receptoru hormona koji stimulira tiroidnu žljezdu (TSH) stimulira utjecaj TSH na njegovim receptorima, što rezultira hipertiroidizmom.

Mehanizmi tipa III obuhvaćaju uglavnom antitijela koja s antigenom formiraju imuno komplekse. Cirkulirajući kompleksi aktiviraju komplement, vežu se na crvene krvne stanice (koje se zatim fagocitoziraju u slezeni), napuštaju cirkulaciju i iniciraju upalu u tkivu (Arthusova reakcija) ili ih fagocitoziraju makrofagi koji predstavljaju antigen, otpuštaju citokine i aktiviraju B i T-stanice. IgE, IgA, IgG i IgM formiraju komplekse s antigenom. Reakcije tipa III proizlaze iz pohranjivanja imunološkog kompleksa u tkivima, posebno u koži, zglobovima ili bubrezima. Imuno kompleks kroničnog nefritisa odgovoran je za najviše slučajeva glomerulonefritisa kod ljudi. Smatra se da su stanja u kojima imuno kompleksi (IC) imaju neku ulogu serumsko oboljenje zbog seruma, lijekova ili virusnog antigena hepatitisa; sistemski eritemski lupus; reumatoidni artritis; poliartertis; krioglobulinemija; preosjetljivi pneumonitis; bronhopulmonarna aspergiloza; akutni glomerulonefritis; kronični membranoprolifacijski glomerulonefritis i povezane bubrežne bolesti. Smatra se da kod bronhopulmonarne aspergiloze, oboljenja seruma koje uzrokuje lijek ili serum i nekih oblika bubrežnih bolesti, reakcija kojom posreduje IgE prethodi reakciji tipa III.

Standardni animalni modeli reakcija tipa III su lokalna Arthusova reakcija i eksperimentalno oboljenje seruma. U Arthusovoj reakciji (uobičajeno lokalna kožna reakcija) životinje se prvo hiperimuniziraju da bi se izazvale velike količine cirkulirajućih IgG antitijela, a zatim im se odmah daju male količine antigena. Antigen taloži uz suvišak IgG i aktivira komplement, tako da brzo javljaju (4-6 sati) jaka upala, edem, bolna lokalna lezija koji se mogu razviti u sterilni apsces koji pak sadrži mnogo polimorfonuklearnih stanica, a zatim u nekrozu tkiva. Mikroskopski se mogu vidjeti nekrozirajući vaskulitis sa zatvorenom arteriolarnom luminom. Reakciji ne prethodi vrijeme zaostajanja budući da je antitijelo već prisutno.

Reakcije tipa I, II i III uzrokuju antitijela. Reakcije tipa IV uzrokuju T-limfociti.

Preosjetljivosti tipa IV, uključujući reakcije kojima posreduju stanice, za razvoj treba 12 ili više sati, a baziraju se na aktiviranim spletovima imunoloških stanica. Upala je osnovna slika tkiva, a rezultat može biti kronična upalna bolest. Preosjetljivost tipa IV također se naziva i odgođen tip preosjetljivosti (tip IV) ili DTH. Reakcijama posreduju interleukin-2, interferon-γ i ostrali citokini koje otpuštaju T-limfociti. Kod DTH, T-limfociti reagiraju s antigenom i otpuštaju interleukin-9, interferon-γ i ostale citokine. T-stanice su jednom sensitizirane primarnim izlaganjem, sekundarno izazivanje slijedi reakcija odgođenog tipa preosjetljivosti, lokalni upalni odgovor kojem su potrebna 2-3 dana za klinički razvoj. Histološki se takve reakcije sastoje od infiltrirajućih T-limfocita, makrofaga i povremenih eozinofila. Eksperimentalno, DTH se može prenjeti T-limfocitima, no ne serumom, tj. antitijela nisu uključena.

DTH može proizlaziti iz imunološkog odgovora kojim posreduju normalne stanice na infekciju virusima, gljivicama i određenim bakterijama, npr. Mycobacterium tuberculosis i Mycobacterium leprae. Ako makrofagi nisu sposobni uništiti progutane organizme, mogu proći diferencijaciju u epiteloidne stanice ili multinuklearne goleme stanice. Nakupljanje tih stanica tvori granulom. Lokalno oštećenje tkiva je neželjena nuspojava, inače zaštitnog imunološkog odgovora. Ako nema DTH odgovora ili je on oslabljen, T-limfociti ne mogu lokalizirati navalu mikroorganizama i kod pacijenta se razvija invazivna, agresivna, proširena bolest, kao što je akutna tuberkuloza.

Kontaktni dermatitis na antigenima je također reakcija tipa IV. Agensi koji ga uzrokuju su obično molekule male molekulske mase (< 1 kD) i same po sebi nisu imunogenske, nego predstavljaju molekule visoke reaktivnosti koje se vežu kovalentno na kožne ili tkivne proteine. Sensitizirajuća strana molekula naziva se hapten i spaja se s proteinom domaćinom koji se naziva nosač. Širok je raspon potencijalnih sensitizirajućih antigena. Prepoznaju se dvije faze patogeneze: indukcijska faza i elicitacijska faza. U indukcijskoj fazi stanice koje predstavljaju antigen u koži, poznate kao Langerhansove stanice, vežu proteinski kompleks hapten-nosač, te ga predstavljaju T-limfocitima zajedno sa antigenom MHC skupine II. Indukcija T-stanica može se javiti nakon više mjeseci izloženosti malim količinama antigena.

Ponovna izloženost antigenu inicira elicitacijsku fazu u kojoj efektorske stanice putuju do kože gdje se susreću s proteinskim kompleksom koji je predstavljen Langerhansovim stanicama u epidermi uz posljedično otpuštanje citokina i upalu kože. Dijagnoza obrambenog agensa postiže se pomoću flastera. Suspektni kontaktni sensitizator stavlja se na leđa pacijenta i prekriva 48 sati. Reakcijsko mjesto se pregleda nakon 2 i 24 sata. Kod pozitivnog odgovora postoji upala i otvrdnuće testiranog mjesta.

Odgođeni tip preosjetljivosti predstavlja također ključni mehanizam za utvrđivanje odbacivanja transplatiranih organa.

Neka klinička stanja u kojima se reakcije tipa IV smatraju važnim su kontaktni dermatitis, preosjetljivi pneumonitis, odbacivanje genetski različitog transplantata, granulomi nastali zbog intracelularnih organizama, neki oblici osjetljivosti na lijekove, tiroiditis i encefalomijelitris nakon cijepljena protiv bjesnoće. Dokaz za zadnja dva bazira se na eksperimentalnim modelima, a kod ljudskih bolesti na pojavi limfocita u upalnoj izlučevini tiroidne žljezde i mozga.

Dermatitis se također naziva i ekcem. Odnosi se na površinsku upalu kože koja je histološki okarakterizana epidermalnim edemom, a klinički mjehurićima (kada je akutan), slabo ogranićenim crvenilom, edemom, iscjetkom, krasticama na koži, ljuskanjem, obično svrabom i pojavom lišajeva potaknutih grebenjem i struganjem.

Često se ekcem odnosi na mjehurasti dermatitis, no ponekad termin predstavlja ograničen ekcem u značenju kroničnog dermatitisa. Neki se odnose na spongiozni dermatitis, budući da je spongioza (intraepidermalni edem) histološko obilježje.

Kontaktni dermatitis je akutna ili kronična upala, često asimetričnog ili nepravilnog oblika, koja nastaje kao posljedica djelovanja tvari koje dolaze u doticaj s kožom i uzrokuju toksične (iritacijske) ili alergijske reakcije.

Dijagnostika reakcija preosjetljivosti ovisi o samom tipu reakcija.

Na reakcije tipa IV može se posumljati kada se upalna reakcija histološki okorakterizira perivaskularnim limfocitima i makrofagima. Kožni testiranja odgođene preosjetljivosti i testiranja u kojima se koriste flasteri najlakše su provedive metode testiranja odgođene preosjetljivosti.

U sprečavanju pogoršanja kontaktnog dermatitisa izvode se ispitivanja u kojima se koriste flasteri nakon što je postignuto uklanjanje kontaktnog dermatitisa. Sumljivi alergen (u prikladnog koncentraciji) primjenjuje se na kožu pod ljepljivim flasterom koji ne apsorbira, te se ostavi tijekom 48 sati. Flaster se ukoni ako se ranije javi pećenje ili svrab. Pozitivan test sastoji se od eritema s otvrdnućem, a ponekad se mogu javiti i mjehurići. Budući da se neke reakcije ne javljaju dok se ne uklone flasteri, mjesto se ponovno pregleda 72 i 96 sati nakon primjene.

Preosjetljivost se također može javiti kao reakcija na lijekove. Prije nego što se posumlja na danu reakciju na lijek, treba se spomenuti da i placebo preparati također mogu uzrokovati različite simptome, čak i objektivne znakove, kao što je kožni osip. Međutim, reakcije na prave lijekove čine glavni medicinski problem.

Kod netolerancije na lijekove, štetna reakcija razvija se prvom upotrebom lijeka. To može biti ista toksična reakcija koja se obično očekuje pri većim dozama ili pak pojačavanje obično blage nuspojave (npr. sedacija antihistaminicima). Idiosinkrazija je stanje u kojem je štetna reakcija na prvu upotrebu lijeka farmakološki neočekivana i jedinstvena.

Karakteristike alergijskih reakcija na lijekove obuhvaćaju reakcije kojima posreduje IgE i koje se javljaju samo nakon izloženosti pacijenta lijeku (ne nužno u liječenju) i to jednom ili dvaput bez incidenta. Jednom kad se razvije preosjetljivost, reakcije se mogu izazvati dozama daleko ispod terapeutskih količina i obično ispod razina koje izazivaju idiosinkratske reakcije. Klinička obilježja se ograničavaju u njihovim manifestacijama. Kožni osip (pogotovo urtikarija), sindrom nalik serumskom oboljenju, neočekivana groznica, anafilaksa i eozinofilni pulomološki infiltrati koji se javljaju tijekom terapije lijekom značajke su preosjetljivosti; kao i anemija, trombocitopenija i agranulocitoza. Rijetko se nakon ponovne izloženosti lijeku (npr. sulfonamidi, jodidi, penicilin) razvije vaskulitis, a opisani su i intersticijski nefritis (npr. metilicin), te oštećenje jetre (npr. halotan).

Najozbiljni primjer preosjetljivosti na lijekove je anafilaksa. Dosad najuobičajenija reakcija na lijekove je patološki oblik osipa, također nepoznate etiologije. Groznica i urtikarijske reakcije predstavljaju također relativno česte posljedice alergije na lijekove. Kada se u terapiji upotrebljavao životinjski serum, serumsko oboljenje predstavljalo je komplikaciju, no životinjski serum se danas rijetko koristi. Može se javiti ozbiljan sindrom sličan serumskom oboljenju nepoznate patogeneze bez visokih razina curkulirajućeg IgG antitijela, no obično zajedno s IgE antitijelima, pogotovo na lijekove tipa penicilina.

Reakcije preosjetljivosti na lijekove baziraju se na svojstvu proteina i velikih polipeptidnih lijekova da stimuliraju stvaranje specifičnih antitijela jednostavnim imunološkim mehanizmima. Moguće je da je najmanja molekula koja je potencijalno antigena glukagon, molekulske mase oko 3500. Najveći broj molekula lijekova su mnogo manje molekule, te ne mogu samostalno djelovati kao antigeni. No, kao hapteni, neke se mogu kovalentno vezati na proteine, a dobiveni konjugati stimuliraju stvaranje antitijela specifičnih za lijek. Lijek, ili jedan ili više njegovih metabolita, kemijski reagira s proteinom. Vezanje serum-protein, zajedničko mnogim lijekovima mnogo je slabije i nedovoljno jako za antigenost.

Specifična imunološka reakcija određena je samo za benzilpenicilin. Taj se lijek ne veže dovoljno čvrsto na tkivne ili serumske proteine da bi nastao antigenski kompleksa, no njegov se glavni degradacijski produkt, benzilpenicilenska kiselina, može spojiti s tkivnim proteinima pri čemu nastaje benzilpeniciloil (BPO), glavna antigenska determinanta penicilina. Pomoću mehanizama koji nisu dobro definirani formira se nekoliko manje važnih antigenskih determinanti u malim količinama. Reakcije preosjetljivosti (I, II, III, IV) najčešće obuhvaćaju BPO determinantu. Kod nekih pacijenata IgE antitijela na manje važnim determinantama mogu biti odgovorna za anafilaksu i urtikariju. IgG antitijela nađena su na glavnim, no ne na manje važnim determinantama. Ona mogu djelovati kao ''blokirajuća antitijela'' na BPO, modificirajući ili čak sprijećavajući reakciju na BPO, dok nedostatak blokirajućih IgG antitijela na manje važnim determinantama može objasniti sposobnost determinanti da uzrokuju anafilaksu.

Svi polusintetski penicilini (npr. amoksicilin, karbenicilin, tikarcilin) potencijalno poprečno reagiraju s penicilinom, tako da pacijenti koji su osjetljivi na penicilin često reagiraju i na njih. Poprečne reakcije sa cefalosporinima javljaju se u manjem stupnju. Liječenje sa cefalosporinima treba započeti uz krajnji oprez ako je pacijent u prošlosti imao ozbiljnu reakciju (npr. anafilaksu) na penicilin.

Reakcije na lijekove kojima posreduju hematološka antitijela (citotoksične, tipa III) mogu se razviti bilo kojim od tri mehanizama: Kod anemije koja je izazvana penicilinom antitijelo reagira sa haptenom koji je čvrsto vezan na membranu crvene krvne stanice, stvarajući aglutinaciju i povećano razaranje crvenih krvnih stanica. Kod trombocitopenije koja je izazvana stibofenom ili kvinidinom lijek formira topljivi kompleks sa njenim specifičnim antitijelom. Kompleks zatim reagira s obližnjim trombocitima (ciljnim stanicama nazvanim ''bezazleni promatrači'') i aktivira komplement koji ostaje sam na trombocitnoj membrani i inducira lizu stanice. Smatra se da kod ostalih hemolitičkih anemija, lijek (npr. metildopa) kemijski mijenja površinu crvenih krvnih stanica, otkrivajući antigen koji uzrokuje i zatim reagira s autoantitijelom, obično Rh specifičnosti.

Toksične idiosinkratske i anafilaktičke reakcije su dovoljno jedinstvene prirode, tako da se škodljiv lijek obično lako identificira. Reakcije tipa serumskog oboljenja javljaju se najčešće zbog prisutstva penicilina, no povremeno su ogovorni i sulfonamidi, hidralizin, sulfoniluree ili tiazidi. Fotosensitizacija je karakteristika klorpromazina, određenih antiseptika u sapunima, sulfonamida, psolarena, demekociklina i griseofulvina. Svi se lijekovi osim onih koji se smatraju apsolutno esecijalnim trebaju uskratiti. Kada se sumlja na groznicu na lijekove, uskračuje se najvjerovatniji lijek (npr. alopurinol, penicilin, izoniazid, sulfonamidi, barbiturati, kvinidin). Smanjenje groznice unutar 48 sati sugerira taj lijek. Ako groznica prati granulocitopeniju, vjerovatnije je da se radi o toksičnost lijeka, a ne o alergiji, te je takvo stanje mnogo ozbiljnije.

Alergijske pulmološke reakcije na lijekove su obično infiltrativne, uz eozinofiliju, te između ostalih, mogu biti uzrokovane zlatnim solima, penicilinom i sulfatimidima. Najčešći slučaj akutne infiltrativne pulmološke reakcije je nitrofurantoin. On vjerovatno uzrokuje alergiju, no ne eozinofiliju.

Reakcije jetre mogu primarno biti kolestatičke (najčešće su umješani fenotiazini i eritromicinski estolat) ili hepatocelularne (alopurinol, hidantoini, soli zlata, izoniazid, sulfonamidi, valpronska kiselina i mnogi drugi). Uobičajena alergijska renalna reakcija je intersticijski nefritis, najčešće zbog meticilina; utječu također i ostali antimikrobialni agensi i cimetidin.

Sindrom sličan sistemskom eritemskom lupusu može uzrokovati nekoliko lijekova, najčešće hidralazin i prokainamid. Sindrom je povezan s pozitivnim testom za antinuklearno antitijelo i relativno je benigan, te pošteđuje bubrege i CNS. Penicilin može uzrokovati SLE i ostale autoimune bolesti među kojima je najznačajnija mijestenija gravis.

1989. godine opisana je serumska aktivnost uzrokovana endotoksinom koja je inducirala interferon-γ (IFN- γ) dobiven iz mišjih stanica slezene (Nakamura i ostali, 1989). Serumska aktivnost nije djelovala kao direktan uzročnik IFN- γ, nego kao kostimulant zajedno s IL-2 ili mitogenima. Pokušaj pročišćavanja aktivnosti od postendotoksičnog mišjeg seruma pokazao je vjerovatno homogeni 50-55 kDa protein. Budući da ostali citokini mogu djelovati kao kostimulanti za stvaranje IFN- γ, pogreška neutralizirajućih antitijela na IL-1, IL-4, IL-5, IL-6 ili TNF u neutralizaciji serumske aktivnosti sugerira da je zaseban faktor. 1995. godine isti znanstvenici pokazali su da je endotoksinom uzrokovani kostimulant za stvaranje IFN-γ prisutan u ekstraktima jetara miševa predodređenih s P. aknama (Okamura i ostali, 1995). U tom je modelu populacija makrofaga jetre (Kupfferove stanice) proširena, a kod tih miševa niska doza bakterijskog lipopolisaharida (LPS) koja kod nepredodređenih miševa nije letalna, postaje letalna. Faktor, nazvan faktorom koji inducira IFN-γ (IGIF) i kasnije osmišljeni interleukin-18 (IL-18), pročišćen je do homogenosti iz 1,200 grama mišjih jetara tretiranih s P. aknama. Degenerirani oligonukleotidi dobiveni iz aminokiselinskih slijedova pročišćenog IL-18 upotrijebljeni su za kloniranje mišje IL-18 cDNA. IL-18 je 18-19 kDa protein koji se sastoji od 157 aminokiselina, koji nema očiglednih sličnosti s bilo kojim peptidom u bazi podataka. Glasničke RNA za IL-18 i interleukin-12 (IL-12) brzo se detektiraju u Kupfferovim stanicama i aktiviraju makrofage. Rekombinantni IL-18 inducira IFN-γ jače nego IL-12, vjerovatno preko odvojenog puta (Micallef i ostali, 1996). Slično serumskoj aktivnosti koja je izazvana endotoksinom, IL-18 ne inducira IFN-γ, nego primarno djeluje kao kostimulant s mitogenima ili IL-2. IL-18 povećava proliferaciju T stanica, vjerovatno preko puta koji ovisi o IL-2, povećava stvaranje Th1 citokina in vitro i pokazuje sinergizam kada je spojen s IL-12 pomoću povećanog stvaranja IFN-γ (Maliszewski i ostali, 1990).

Nakon što je kloniran mišji oblik, 1996. je opisan ljudski DNA slijed za IL-18 (Ushio i ostali, 1996).

Kloniranjem IL-18 iz oboljelog tkiva i proučavanjem IL-18 ekspresije gena, otkrivena uska povezanost tog citokina s autoimunom bolešću. Dijabetički miš koji nije gojazan (NOD) spontano razvija autoimuni inzulitis i dijabetes koji se mogu ubrzati i vremenski uskladiti jednostrukim ubrizgavanjem ciklofosfamida. IL-18 mRNA dokazana je reverznom transkiptazom PCR u NOD mišjoj gušterači tijekom ranih faza inzulitisa. Razine IL-18 mRNA brzo su rasle nakon tretmana ciklofosfamidom i prethodile su usponu u IFN-γ mRNA, a zatim dijabetesu. Zanimljivo, kinetika oponaša kinetiku IL-12-p40 mRNA, što rezultira bliskom korelacijom individualnih mRNA razina. Kloniranjem IL-18 cDNA iz RNA gušterače, a zatim slijedovanjem, otkrivena je identičnost s IL-18 slijedom kloniranim iz Kupfferovih stanica i in vivo predaktiviranih makrofaga. NOD mišji makrofagi također su odgovorili na ciklofosfamid IL-18 ekspresijom gena, za razliku od makrofaga iz Balb/c miševa tretiranih paralelno. Zbog toga se IL-18 ekspresija abnormalno regulira kod autoimunih NOD miševa i usko je povezana s razvojem dijabetesa (Rothe i ostali, 1997).

IL-18 igra važnu ulogu u imunoregulaciji ili upali, povećavajući funkcionalnu aktivnost Fas liganda na Th1 stanicama. (Conti i ostali, 1997). IL-18 se također eksprimira u kori nadbubrežne žlijezde, te zbog toga može biti izlučen neuroimunomodulator, igrajući važnu ulogu u vođenju imunološkog sustava nakon stresnog događaja (Chater i ostali, 1986).

In vivo, IL-18 se formira cijepanjem pro-IL-18, a smatra se da je njegova endogena aktivnost odgovorna za stvaranje IFN-γ u P. aknama i smrtnost kojom posreduje LPS. Zreli IL-18 se stvara iz svog prekurzora pomoću IL-1β enzima za pretvorbu (IL-1β-enzim za pretvorbu, ICE, kaspaza-1).

IL-18 receptor sastoji se od najmanje dvije komponente koje sudjeluju u vezanju liganda. Visoko- i niskoafinitetno vezno mjesto za IL-18 nađeno je u mišjim T stanicama stimuliranim IL-12 (Yoshimoto i ostali, 1998), sugerirajući višestrukolančani receptorski kompleks. Do sada su identificirane dvije receptorske podjedinice, obje pripadaju IL-1 obitelji receptora (Parnet i ostali, 1996). Signalna trandukcija IL-18 obuhvaća aktivaciju NF-κB (DiDonato i ostali, 1997).

Nedavno je iz ljudskog urina izoliran topljivi protein s visokim afinitetom prema IL-18, te su opisane ljudska i mišja cDNA (Novick i ostali, 1999; WO 99/09063). Protein je bio označen kao IL-18 vezni protein (IL-18BP).

IL-18BP nije ekstracelularna domena jednog od poznatih IL-18 receptora, nego izlučeni, prirodno cirkulirajući proteina. On pripada novoj obitelji izlučenih proteina. Obitelj uključuje i nekoliko proteina enkodiranih poxvirusom koji imaju visoku homologiju s IL-18BP (Novick i ostali, 1999). IL-18BP se prirodno eksprimira u slezeni, pripada imunoglobulinskoj superobitelji i ima ograničenu homologiju s IL-1 receptorom tipa II. Njegovi geni su lokalizirani na ljudskom kromosomu 11q13, a u 8,3 kb genomskom slijedu nije otkriveno eksonsko kodiranje za transmembransku domenu (Novic i ostali, 1999).

Eksprimirana su četri ljudska i dva mišja izoforma IL-18BP, nastala iz spajanja mRNA i nađena u raznim cDNA zbirkama, a zatim su pročišćena i određena za vezanje i neutralizaciju IL-18 bioloških aktivnosti (Kim i ostali, 2000). Ljudski IL-18 izoform a (IL-18BPa) pokazao je najveći afinitet prema IL-18 s velikom brzinom spajanja, malom brzinom otpuštanja i disocijacijskom konstantom (K(d)) od 339 pM. IL-18BPc dijeli Ig domenu IL-18PB a, osim za 29 C-terminalnih aminokiselina; K(d) od IL-18BPc je deseterostruko manja (2,94 nM). Međutim, IL-18BPa i IL-18BPc neutraliziraju IL-18 > 95% pri molarnom suvišku oba. IL-18BPb i IL-18BPd izoformima nedostaje kompletna Ig domena, te sposobnost vezanja ili neutraliziranja IL-18. Mišji IL-18BPb i IL-18BPd izoformi posjeduju identični Ig domenu i također neutraliziraju > 95 % mišjeg IL-18 pri molarnom suvišku oba. Mišji IL-18BPd, koji dijeli zajednički C-terminalni motiv s ljudskim IL-18BPa, također neutralizira ljudski IL-18. Molekulskim modeliranjem identificirano je prostrano elektrostatsko i hidrofobno vezno mjesto u Ig domeni IL18BP, koje može biti odgovorno njegovo visokoafinitetno vezanje s ligandom (Kim i ostali, 2000).

1998. je otkriveno da na patogenezu mišje kontaktne preosjetljivosti utječe ekspresija interleukina-18 (IL-18) (Xu i ostali, 1998). Xu i ostali su upotrijebili mišji model kontaktne preosjetljivosti s oksazolonom kao kontaktnim alergenom, te su pokazali indukciju IL-18 ekspresije u kožnim lezijama. Najveća nadregulacija otkrivena je 24 sata nakon izazivanja s alergenom, zatim je IL-18 ekspresija postupno slabila.

Slijedeći izvještaj o sposobnosti IL-18 u poticanju DTH odgovora, neovisno od IL-18 objavili su Kitching i ostali, 2000. No, uloga IL-18 ostaje nejasna, budući da je također opisano da predstavlja potencijalno učinkovitu terapiju za pacijente s atopijskim dermatitisom (Habu i ostali, 2001), što se slaže s nekoliko kliničkih pokusa koji sugeriraju da IFN-γ smiruje simptome atopijskog dermatitisa (Reinhold i ostali, 1990; Hanifin i ostali, 1993).

Kratak pregled izuma

Prisutni izum temelji se na otkriću da liječenje miševa s inhibitorima IL-18 kod modela preosjetljivosti tipa IV rezultira slabljenjem reakcije preosjetljivosti u usporedbi sa kontrolnim životinjama. Izum se zbog toga odnosi na upotrebu IL-18 inhibitora u proizvodnji lijeka za liječenje i/ili sprečavanje poremećaja preosjetljivosti. Upotreba kombinacija IL-18 inhibitora s interferonom i/ili inhibitorom TNF i/ili inhibitorima upale i/ili protualergijskim lijekovima također se razmatra prema izumu. U slijedećem aspektu, izum se odnosi na upotrebu ekspresijskog vektora koji sadrži kodirajući slijed IL-18 inhibitora za liječenje i/ili sprečavanje stanja preosjetljivosti. Izum se odnosi i na upotrebu genetički modificiranih stanica u ekspresiji IL-18 inhibitora za sprečavanje i/ili liječenje poremećaja preosjetljivosti.

Kratak opis slika

Slika 1 prikazuje da liječenje pomoću IL-18BP tijekom izazivanja štiti od kontaktne preosjetljivosti (CHS). Miševi su sensitizirani s DNFB u leđa nulti dan, a izazvani su pet dana kasnije kod ušiju. Oteklina uha dnevno je mjerena te je izražena kao povećanje u oticanju uha izazvanog s DNFB nasuprot kontrolnom uhu koje je tretirano samo prenosnikom. Tretiranjem s 250 μg IL-18BP i. p. po mišu petog do osmog dana značajno je smanjena oteklina uha (A), dok tretiranje nultog do drugog dana nije bilo zaštitno u ovom eksperimentalnom okviru (B) (n = 5 miševa po skupini). Kvadratići: miševi tretirani IL-18BP. Trokutići: kontrola, tj. životinje tretirane fiziološkom otopinom.

Slika 2 prikazuje stupanj otekline uha od petog do tridesetog dana nakon prvog izazivanja haptenom petog dana i drugog izazova devetnaestog dana kod modela odgođenog tipa preosjetljivosti uz sistematsku primjenu 250 μg/miš/dan IL-18BP (prazni kvadratići) ili prenosnika (puni kvadratići) od 11. do 22. dana.

Slika 3 prikazuje da IL-18BP štiti od CHS neutralizirajući IL-18. Uspoređena je sposobnost IL-18 deficijentnih (KO) miševa i miševa divljeg tipa C57BL/6 u javljanju CHS odgovora. IL-18 deficijentni miševi razvijaju CHS na DFNB, iako je manje izražena nego kod miševa divljeg tipa. Nije uočen utjecaj IL-18BP tretmana kod IL-18 deficijentnih miševa, što indicira da je protuupalni učinak IL-18BP kod CHS postignut zbog neutralizacije IL-18 (n = 5 miševa po skupini). Kružići: fiziološka otopina kod IL-18 KO miševa. Rombići: IL-18BP kod IL-18 KO miševa. Kvadratići: IL-18BP kod divljeg tipa (WT) miševa. Trokutići: fiziološka otopina kod WT miševa.

Slika 4 prikazuje da IL-18BP ne smanjuje vaskularno istjecanje tijekom CHS. CHS je izazvana kod C57BL/6 miševa. Za praćenje edema uzrokovanog CHS reakcijom, sredstvo Evans Blue je uštrcano i. v. 2 sata prije izazivanja s DFNB. Miševi su žrtvovani 24 sata kasnije, a uši su podvrgnute ekstraktu boje koji je iscurio iz vaskulasture i nakupio se u okolnom tkivu. Vaskularno istjecanje određeno je kao količina boje po mg posušenog tkiva uha korigirana za koncentraciju sredstva Evans Blue u serumu i izražena kao omjer izazvanog naspram kontrolnog uha. Dok je tretmanom IL-18BP četvrtog i petog dana smanjena oteklina do 56% kontrole tretirane prenosnikom (lijevi prikaz, p < 0,01), između te dvije skupine nije postojala značajna razlika u vaskularnom istjecanju. Obje su skupine pokazale značajno povećani edem u usporedbi s kontrolnom skupinom koja nije sensitizirana (p < 0,05 i p < 0,01). Kao naredna kontrola, miševi su tretirani s 250 μg irelevantnog proteina BSA po životinji i danu. Kod tih miševa razvila se CHS kao i kod kontrolnih životinja tretiranih prenosnikom (n = 10 miševa po skupini).

Slika 5 IL-18BP smanjuje upalnu infiltraciju uha izazvanog s DNFB. Kod C57BL/6 miševa izazvana je CHS na prethodno opisani način. Životinje su tretirane s IL-18BP ili prenosnikom 4.-6. dana. IL-18BP tretman smanjio je sedmi dan oteklinu do 58% kontrole tretirane prenosnikom. Miševi su žrtvovani sedmi dan, izazvane uši su sakupljene, podijeljene prema skupini (n = 8), te su podvrgnute enzimskoj razgradnji da bi se dobile suspenzije pojedinih stanica. Stanice su okarakterizirane FACS analizom na CD45 pozitivnim, živim stanicama. Broj αβT stanica, NK stanica, neutrofila i monocita/makrofaga nađenih u preparatima ušiju izražen je kao postotak ukupno analiziranih stanica (gornje vrijednosti). Na slici niže dano smanjenje tih tipova stanica nakon IL-18BP tretmana u odnosu na kontrolu tretiranu prenosnikom.

Slika 6 prikazuje da se aktivacija T stanica oslabljuje na IL-18BP tretman. Stanice dobivene iz ušiju izazvanih s DNFB su ponovno stimulirane pri 2 x 105 po jažici s veznim anti-CD3 antitijelom. Tijekom perioda uzgoja od 24 sati nije dalje dodavan IL-18BP. Stvaranje IFN-γ izmjereno je tri puta pomoću ELISA. Stanice dobivene iz miševa tretiranih s IL-18BP stvorile su samo 45% IFN-γ nađenog u kulturama stanica iz kontrolnih životinja tretiranih prenosnikom.

Slika 7 prikazuje da IL-18BP tretman smanjuje broj stanice koje stvaraju IFN-γ u upalnom infiltratu uha. Stanični preparati iz ušiju izazvanih s DNFB stimulirani su četri sata s 50 ng/mL PMA* i 500 ng/mL lonomicina. Citokinska sekrecija blokirana je dodatkom 2 μg/mL brefeldinaA zadnja dva sata inkubacije. Stanice su zatim podvrgnute višebojnom imunoflorescentnom bojanju na intracelularne IFN-γ i površinske antigene. IL-18BP tretman smanjio je ukupan broj stanica pozitivnih na IFN-γ bojanje do 78% kontrole tretirane prenosnikom. CD8 T stanice stvarale su IFN-γ, a u manjoj mjeri i CD4 T stanice. IFN-γ nije detektiran u NK stanicama i αβT stanicama (n. d., nedetektiran; * farbol-12 miristat-13-acetat).

Slika 8 IL-18BP tretman ne oslabljuje jačanje Langerhansovih stanica u drenirajućem limfnom čvoru. Miševi su premazani s haptenskim FTIC ili prenosnikom aceton/dibutilftalat (1:1) na lijevoj, odnosno desnoj slabini. Slabinski limfni čvorovi sakupljeni su 24 sata nakon premazivanja. Langerhansove stanice konjugirane haptenom mogu se detektirati pomoću FASC kao FTIC+, CD11c+ stanice u limfnom čvoru koji drenira FTIC premazanu slabinu, no ne i u kontralateralnom limfnom čvoru koji drenira slabinu premazanu samo prenosnikom. Udio haptena koji nosi Langerhansove stanice u drenirajućem limfnom čvoru iznosio je 1,2% ukupnih stanica limfnih čvorova kod životinja tretiranih s IL-18BP 24 sata prije premazivanja. Taj se udio nije značajno razlikovao od broja koji je dobiven kod kontrolno tretiranih životinja (n = 5 drenirajućih limfnih čvorova po skupini).

Opis izuma

Prisutan izum se temelji na otkriću da IL-18 pokazuje koristan utjecaj na oporavljanje od haptenskog izazova kod mišjeg modela preosjetljivosti tipa IV.

Zbog toga se izum odnosi na upotrebu IL-18 inhibitora u proizvodnji lijeka za liječenje i/ili sprečavanje poremećaja preosjetljivosti.

Unutar konteksta prisutnog izuma, izrazi ''poremećaj preosjetljivosti'' i ''alergijski poremećaj'' predstavljaju sinonime. Oba termina odnose se na poremećaje ili reakcije uzrokovane neodgovarajuće prilagodljivim imunološkim odgovorom. Reakcije preosjetljivosti rezultat su obično korisnog imunološkog odgovora koji djeluje neodgovarajuće na strane antigene, kao što su npr. makromolekule iz okoline, koji mogu dovesti do upalne reakcije i oštećenja tkiva. Kod poremećaja preosjetljivosti, obično bezazleni stimulans iz okoline, alergen, inicira imunološki odgovor koji se kod ponovne izloženosti ponovno aktivira na izazvano patološko oštećenje.

Poremećaji preosjetljivosti, kao i njihovi klinički simptomi i implikacije opisani su detaljno u ''Pozadini izuma'', a upotreba prema izumu odnosi se, no nije ograničena poremećaje preosjetljivosti koji su tamo spomenuti.

U preferiranom ostvarenju prisutnog izuma, poremećaj preosjetljivosti se odabire iz skupine koja se sastoji poremećaja s reakcijama preosjetljivosti tipa I, poremećaja s reakcijama preosjetljivosti tipa II, poremećaja s reakcijama preosjetljivosti tipa III ili poremećaja s reakcijama preosjetljivosti tipa IV.

Poremećaji s reakcijama preosjetljivosti tipa I nazivaju se također trenutna preosjetljivost ili obično alergija. Preosjetljivosti posreduje IgE. Reakcije trenutne preosjetljivosti (tip I) javljaju se zbog vezanja između antigena i IgE na mastocitima ili bazofilima. Poremećaji s reakcijama preosjetljivosti tipa I obuhvaćaju atopijske bolesti (nisu ograničene samo na navedene), kao što su alergijski rinitis, alergijski konjuktivitis, atopijski dermatitis, vanjska alergijska astma, urtikarija, organska anafilaksa. Anafilaksa je ozbiljna alergijska reakcija opasna po život koja se javlja zbog (trenutne) preosjetljivosti tipa I.

Tip II ili citotoksična preosjetljivost obuhvaća citolitička djelovanja kojima posreduje antitijelo, komplement i/ili stanični mehanizmi. Antitijelo na stanično vezanom antigenu (tip II) uzrokuje uništenje stanice aktivirajući komplement ili potičući fagocitozu. Poremećaji vezani uz preosjetljivost tipa II unutar područja izuma obuhvaćaju npr. Coomb-pozitivne hemolitičke anemije, trombocitopenična spontana krvarenja u tkivima uzrokovana antitijelima, leukopeniju, pemfigus, pemfigoid, Goodpastureov sindrom i pernicioznu anemiju. Takve reakcije javljaju se kod pacijenata koji primaju nekompatibilnu transfuziju, kod hemolitičkih bolesti novorođenčadi, te kod neonatalne trombocitopenije, a također imaju ulogu i kod bolesti koje obuhvaćaju više organa, vezanih uz preosjetljivost (npr. sistemski eritemski lupus, SLE).

Poremećaji vezani uz preosjetljivost tipa III obuhvaćaju reakcije u kojima antitijela s antigenom formiraju imuno komplekse. Cirkulirajući kompleksi aktiviraju komplement, vežu se na crvene krvne stanice koje se zatim fagocitoziraju u slezeni, napuštaju cirkulaciju i iniciraju upalu u tkivu. Takva se reakcija naziva Arthusova reakcija. Alternativno, komplekse fagocitoziraju makrofagi koji predstavljaju antigen, otpuštaju citokine i aktiviraju B i T-stanice. IgE, IgA, IgG i IgM formiraju komplekse s antigenom. Reakcije tipa III općenito proizlaze iz pohranjivanja imuno kompleksa u tkivima, posebno u koži, zglobovima ili bubrezima. Imuno kompleks kroničnog nefritisa odgovoran je za najviše slučajeva glomerulonefritisa kod ljudi. Prema izumu, poremećaji preosjetljivosti tipa III obuhvaćaju npr. serumska oboljenja zbog seruma, lijekova ili virusnog antigena hepatitisa; sistemski eritemski lupus; reumatoidni artritis; poliartertis; krioglobulinemija; preosjetljivi pneumonitis; bronhopulmonarna aspergiloza; akutni glomerulonefritis; kronični membranoproliferacijski glomerulonefritis i povezane bubrežne bolesti.

Poremećaji vezani uz preosjetljivost tipa IV, uključuju reakcije kojima posreduju stanice, te im za razvoj treba 12 ili više sati. Poremećaji preosjetljivosti tipa IV mogu obuhvaćati upalu čiji rezultat može biti kronična upalna bolest. Preosjetljivost tipa IV također se naziva i odgođeni tip preosjetljivosti (tip IV) ili DTH. T-stanice su jednom sensitizirane primarnim izlaganjem, sekundarno izazivanje slijedi reakcija odgođenog tipa preosjetljivosti. Ta reakcija predstavlja lokalni upalni odgovor kojem ponekad treba 2-3 dana za klinički razvoj.

U preferiranom ostvarenju izuma, poremećaj preosjetljivosti je odgođeni tip preosjetljivosti. Zato se izum preferirano odnosi na sve vrste kliničkih stanja u kojima reakcije tipa IV imaju važnu ulogu, kao što su odgođeni tip kontaktne preosjetljivosti, dermatitis, kontaktni dermatitis, preosjetljivi pneumonitis, odbacivanje genetski različitog transplantata, granulomi nastali zbog intracelularnih organizama, neki oblici osjetljivosti na lijekove, tiroiditis i encefalomijelitris nakon cijepljena protiv bjesnoće.

DTH može proizlaziti iz imunološkog odgovora kojim posreduju normalne stanice na infekciju virusima, gljivicama i određenim bakterijama, npr. Mycobacterium tuberculosis i Mycobacterium leprae. Drugi vanjski agensi koji izazivaju CTH mogu biti biljne, životinjske, insektne ili gmazovske sekrecije, kemijski ili biokemijski antigeni. Oni se mogu dobiti iz prirodnih ili sintetskih izvora. Različite vrste vlakana, materijala i sličnog, npr. lateksa koji se upotrebljava u kirurškim rukavicama, kod određenih osoba mogu izazvati reakciju preosjetljivosti kojom posreduju T stanice. Štetni vanjski agensi mogu biti agensi prisutni u vodi kao što su otopljene soli i minerali koji se javljaju u okolišu, rudarskim, metalurškim i kemijskim postupcima proizvodnje.

U drugom preferiranom ostvarenju izuma, poremećaj preosjetljivosti je kontaktni dermatitis ili kontaktna preosjetljivost. Kontaktni dermatitis na antigenima je također reakcija tipa IV. Agensi koji izazivaju kontaktni dermatitis su obično molekule male molekulske mase (< 1 kD) i same po sebi nisu imunogenske, nego predstavljaju molekule visoke reaktivnosti koje se vežu kovalentno na kožne ili tkivne proteine. Sensitizirajuća strana molekula naziva se hapten i spaja se s proteinom domaćinom koji se naziva nosač. Poznati su mnogi hapteni koji izazivaju kontaktni dermatitis. Da bi se odredilo da li će se kod pojedinca razviti kontaktni dermatitis protiv danog sensitizatora, suspektabilni kontaktni sentitizator stavlja se na leđa pacijenta i prekriva 48 sati. Reakcijsko mjesto se pregleda nakon 2 i 24 sata. Kod pozitivnog odgovora postoji upala i otvrdnuće testiranog mjesta.

Odgođeni tip preosjetljivosti je također ključni mehanizam koji određuje odbacivanje transplatiranih organa, te se zato izum odnosi i na upotrebu IL-18 inhibitora u sprečavanju odbacivanja transplatata.

Termin ''inhibitor IL-18'', unutar konteksta ovog izuma, odnosi se na bilo koju molekulu koja modulira stvaranje IL-18 i/ili njegovo djelovanje tako da se stvaranje IL-18 i/ili njegovo djelovanje oslabljuje, reducira ili djelomično, značajno ili potpuno sprečava ili blokira. Termin ''IL-18 inhibitor'' obuhvaća inhibitore stvaranja IL-18, te inhibitore djelovanja IL-18.

Inhibitor stvaranja može biti bilo koja molekula koja negativno utječe na sintezu, razvoj ili dozrijevanje IL-18. Inhibitori prema izumu mogu biti npr. supresori ekspresije gena interleukina IL-18, antisense mRNA koje smanjuju ili sprečavaju transkripciju IL-18 mRNA ili dovode do degradacije mRNA, proteini koji oslabljuju ispravno nabiranje, te djelomično ili potpuno sprečavaju izlučivanje IL-18, proteaze koje degradiraju sintetizirani IL-18 , inhibitori proteaza koje cijepaju pro-IL-18 na način da stvaraju zreli IL-18, kao što su inhibitori kaspaze-1, i slični.

Inhibitor djelovanja IL-18 može biti IL-18 antagonist, na primjer. Antagonisti se mogu s dovoljnim afinitetom vezati na IL-18 molekulu ili ju odijeliti, te specifično do djelomično ili značajno neutralizirati IL-18 ili vezno mjesto (mjesta) IL-18 odgovorno za vezanje IL-18 s njegovim ligandima (npr. s njegovim receptorima). Antagonist može također inhibirati signalizirajući put IL-18 koji se aktivira unutar stanica na vezanje IL-18/receptor.

Inhibitori djelovanja IL-18 također mogu biti i topljivi IL-18 receptori, molekule koje oponašaju receptore, agensi koji blokiraju IL-18 receptore, IL-18 antitijela, kao što su poliklonalna ili monoklonalna antitijela ili bilo koji drugi agens ili molekula koja sprečava vezanje IL-18 na njegovu metu, oslabljujući ili sprečavajući iniciranje intra- ili ekstracelularnih reakcija kojima posreduje IL-18.

U preferiranom ostvarenju prisutnog izuma, inhibitor IL-18 odabire se od inhibitora kaspaze-1 (ICE), antitijela usmjerenih protiv IL-18, antitijela usmjerenih protiv bilo koje podjedinice IL-18 receptora, inhibitora signalizirajućeg puta IL-18, antagonista IL-18 koji konkuriraju IL-18 i blokiraju IL-18 receptor, te IL-18 veznih proteina, njihovih izoforma, muteina, spojenih proteina, funkcionalnih derivata, aktivnih frakcija ili cirkularno zamijenjenih derivata s istom aktivnošću.

Termin ''IL-18 vezni proteini'' upotrebljava se sinonimno s terminima ''IL-18 vezni protein'' ili ''IL-18 BP''. Termin obuhvaća IL-18 vezne proteine kao što je definirano u WO 99/09063 ili u radu Novicka i ostalih, 1999, uključujući inačice i/ili izoforme IL-18 veznih proteina, kao što je definirano u radu Kima i ostalih, 2000, koji se vežu na IL-18. Prema prisutnom izumu, posebno su korisni ljudski izoformi a i c IL-18BP. Proteini korisni prema izumu mogu biti glikosilirani ili neglikosilirani, mogu se dobiti iz prirodnih izvora, kao što je urin ili se pak mogu dobiti rekobinantno. Rekombinantna ekspresija može se provesti u prokariotskim ekspresijskim sustavima kao što je E. coli ili eukariotskim ekspresijskim sustavima, preferirano ekspresijskim sustavima sisavaca.

Termin ''muteini'' odnosi se na analoge IL-18BP ili analoge virusnog IL-18BP u kojima se jedan ili više aminokiselinskih ostataka prirodnog IL-18BP ili virusnog IL-18BP zamijenjuje drugim aminokiselinskim ostacima, briše ili se pak jedan ili više aminokiselinskih ostataka dodaju prirodnom slijedu IL-18BP ili virusnom IL-18BP, bez znatnog mijenjanja aktivnosti dobivenih produkta u usporedbi s IL-18BP divljeg tipa ili virusnim IL-18BP. Takvi muteini pripravljaju se poznatim sintetskim postupcima i/ili položajno usmjerenim tehnikama mutageneze ili bilo kojom drugom prikladnom tehnikom.

Muteini u skladu s izumom obuhvaćaju proteine kodirane nukleinskom kiselinom, kao što je DNA ili RNA, koja hibridizira DNA ili RNA i kodira IL-18BP ili virusni IL-18BP u skladu s prisutnim izumom i pod strogim uvjetima. Termin ''strogi uvjeti'' odnosi se na uvjete hibridizacije i kasnijeg ispiranja. Vidi Ausubel i ostali, ''Current Protocols in Molecular Biology'', supra, Interscience, N. Y., §§6.3 i 6.4 (1987, 1992) i Sambrook i ostali, supra. Bez ograničenja, primjeri strogih uvjeta obuhvaćaju uvjete ispiranja 12-20 °C ispod izračunate Tm hibrida koji se proučava u npr. 2 x SSC i 0,5% SDS za 5 minuta, 2 x SSC i 0,1% SDS za 15 minuta, 0,1 x SSC i 0,5% SDS pri 37 °C za 30-60 minuta i zatim 0,1 x SSC i 0,5% SDS pri 68 °C za 30-60 minuta. Stručnjacima je jasno da strogost uvjeta također ovisi i o duljini DNA slijedova, oligonukleotidnim probama (kao što je 10-40 baza) ili miješanim oligonukleotidnim probama. Ako se koriste miješane probe, preferirano je upotrijebiti tetrametilamonijev klorid (TMAC) umjesto SSC. Vidi Ausubel, supra.

Istovjetnost odražava vezu između dva ili više polipeptidna slijeda ili dva ili više polinukleotidna slijeda, određenu uspoređivanjem slijedova. Općenito, istovjetnost se odnosi na točno podudaranje nukleotida ili aminokiseline jednog polinukleotidnog, odnosno polipeptidnog slijeda s nukleotidom ili aminokiselinom drugog na dužini uspoređivanog slijeda.

Za slijedove u kojima nema točnog podudaranja, može se određiti % istovjetnosti. Općenito se kod uspoređivanja dva slijeda, oni svrstavaju tako da se između njih postigne maksimalna korelacija. Za postizanje većeg stupnja svrstavanja u jedan ili oba slijeda mogu se umetnuti ''praznine''. Postotak istovjetnosti može se odrediti na cijeloj dužini svakog slijeda koji se uspoređuje (takozvano globalno svrstavanje), što je posebno prikladano za slijedove iste ili vrlo slične dužine ili čak kraće, definirane dužine (takozvano lokalno svrstavanje), a najprikladnije za slijedove nejednakih đužina.

U znanosti su poznate metode za uspoređivanje istovjetnosti ili homologije dva ili više slijedova. Tako se na primjer za određivanje % istovjetnosti između polinukleotida, te % istovjetnosti i % homologije između dva polipeptidna slijeda mogu upotrijebiti programi dostupni u paketu ''Wisconsin Sequence Analysis Package'', verzija 9,1 (Devereux J. i ostali, 1984), na primjer programi BESTFIT i GAP. BESTFIT koristi Smithov i Watermanov (1981) algoritam ''lokalne homologije'' i nalazi najbolju pojedinačnu regiju sličnosti između dva slijeda. U znanosti su također poznati i ostali programi za određivanje istovjetnosti i/ili sličnosti između slijedova, na primjer BLAST skupina programa (Altschul S.F i ostali, 1990, Altschul S.F. i ostali, 1997, pristupačan preko početne stranice NCBI na www.ncbi.nim.nih.gov) i FASTA (Pearson W.R., 1990; Pearson 1988).

Svaki takav mutein preferirano ima slijed aminokiselinska dovoljno duplikativan od slijeda IL-18BP ili virusnog IL-18BP, tako da ima značajno sličnu aktivnost s IL-18BP. Jedna aktivnost IL-18BP predstavlja njegovu sposobnost vezanja IL-18. Dok god mutein posjeduje značajnu aktivnost vezanja prema IL-18, može se upotrijebiti u pročišćavanju IL-18, npr. pomoću afinitetne kromatografije i zbog toga se može smatrati da ima značajno sličnu aktivnost s IL-18BP. Pomoću rutinskih eksperimentalnih postupaka koji obuhvaćaju podvrgavanje takvog muteina npr. jednostavnom ''sendvič'' kompeticijskom ispitivanju, kao što su radioimunoispitivanje ili ELISA ispitivanje, može se odrediti da li neki dani mutein ima stvarno istu aktivnost kao i IL-18BP, te da li se veže na prikladno označeni IL-18.

U preferiranom ostvarenju, svaki takav mutein ima najmanje 40% istovjetnosti ili homologije sa slijedom IL-18BP ili virusno kodiranim IL-18BP homologom, kao što je definirano u WO 99/09063. Više preferirano, ima najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80% ili najviše preferirano, najmanje 90% istovjetnosti ili homologije.

Muteini IL-18BP polipeptida ili muteini virusnih IL-18BP koji se mogu upotrijebiti u skladu s prisutnim izumom ili kodiranje nukleinskih kiselina, obuhvaćaju ograničen set stvarno podudarajućih slijedova poput supstitucijskih peptida ili polinukleotida koje stručnjaci mogu rutinski dobiti na temelju ovdje predstavljenih tehnika ili uputa, bez korištenja nepotrebnih eksperimentalnih postupaka.

Preferirane promjene muteina u skladu s prisutnim izumom poznate su pod nazivom ''konzervativne'' supstitucije. Konzervativne aminokiselinske supstitucije IL-18BP polipeptida, proteina ili virusnih IL-18BP mogu obuhvaćati sinonimne aminokiseline unutar skupine, koje imaju dovoljno slična fizičkokemijska svojstva tako da supstitucija između članova skupine održi biološku funkciju molekule (Grantham, 1974). Jasno je da u ranije definiranim slijedovima mogu biti učinjena umetanja i brisanja aminokiselina bez mijenjanja njihove funkcije, posebno ako umetanja i brisanja obuhvaćaju samo nekoliko aminokiselina (npr. trideset, preferirano deset) i ako se ne uklanjaju ili zamjenjuju aminokiseline presudne za funkcionalnu konformaciju (npr. cisteinski ostaci). Proteini ili muteini dobiveni takvim brisanjima i/ili umetanjima ulaze u područje prisutnog izuma.

Preferirano, sinonimne aminokiselinske skupine su one koje su definirane u tablici 1. Više preferirano, sinonimne aminokiselinske skupine su one koje su definirane u tablici 2. Najviše preferirano, sinonimne aminokiselinske skupine su one koje su definirane u tablici 3.

TABLICA 1

Preferirane skupine sinonimnih aminokiselinskih

[image]

TABLICA 2

Više preferirane skupine sinonimnih aminokiselina

[image]

TABLICA 3

Najviše preferirane skupine sinonimnih aminokiselina

[image]

Primjeri dobivanja aminokiselinskih supstitucija u proteinima koji se mogu upotrijebiti za dobivanje muteina IL-18BP polipeptida ili proteina, ili pak muteina virusnih IL-18BP, za upotrebu u prisutnom izumu obuhvaćaju bile koje poznate metodološke korake, npr. predstavljene u US patentima Marka i ostalih (4,959,314, 4,588,585 i 4,737,462), Kothsa i ostalih (5,116,943), Namena i ostalih (4,965,195), Chonga i ostalih (4,879,111), Leea i ostalih (5,017,691), dok su proteini u kojima je supstituiran lizin predstavljeni u US patentu br. 4,904,584 (Shaw i ostali).

Termin ''spojeni protein'' odnosi se na polipeptid koji sadrži IL-18BP, virusni IL-18BP ili njihov mutein ili fragment, spojen s drugim proteinom, koji npr. u tjelesnim tekućinama ima produženo vrijeme zadržavanja. Zato se IL-18BP ili virusni IL-18BP mogu spojiti s drugim proteinom, polipeptidom ili sličnim, npr. imunoglobulinom ili njegovim fragmentom.

''Funkcionalni derivati'' pokrivaju derivate IL-18 BP, virusnog IL-18BP i njihove muteine i spojene proteine koji se mogu pripraviti iz funkcionalnih skupina koje se javljaju kao ogranci na ostacima ili N- ili C-terminalnim skupinama, a uključeni su u izum dok god ostaju farmaceutski prihvatljivi, tj. ne uništavaju aktivnost proteina koja je značajno slična s aktivnošću IL-18BP ili virusnog IL-18BP i ne prenose toksična svojstva na pripravke u kojima su sadržani.

Takvi derivati mogu, na primjer, obuhvatiti polietilen-glikolske ogranke koji mogu maskirati antigenske položaje i produžiti zadržavanje IL-18BP ili virusnog IL-18BP u tijelesnim tekućinama. Drugi derivati obuhvaćaju alifatske estere karboksilnih skupina, amide karboksilnih skupina reakcijom s amonijakom ili primarnim ili sekundarnim aminima, N-acilne derivate slobodnih amino-skupina aminokiselinskog ostatka formirane s acilnim djelovima (npr. alkanoilne ili karbocikličke aroilne skupine) ili o-acil derivate slobodnih hidroksilnih skupina (npr. one serinskih ili treoninskih ostataka) formirane s acilnim djelovima.

Kao ''aktivne frakcije'' IL-18BP ili virusnog IL-18BP, muteina i spojenih proteina, prisutni izum pokriva svaki fragment ili prekurzor polipeptidnog lanca proteinske molekule same ili zajedno s povezanim molekulama ili vezanim ostacima, npr. šećernim ili fosfatnim ostacima, agregatima proteinske molekule ili šećernim ostacima samim po sebi, koji osiguravaju da navedena frakcija ima značajno sličnu aktivnost s IL-18BP.

Termin ''soli'' odnosi se na soli karboksilnih skupina i na kiselinske adicijske soli amino-skupina IL-18 inhibitorske molekule ili njenog analoga. Soli karboksilnih skupina mogu se formirati pomoću u znanosti poznatih postupaka i obuhvaćaju anorganske soli, na primjer, natrijeve, kalcijeve, amonijeve, cinkove ili soli željeza i slične, a soli s organskim bazama su formirane, na primjer, s aminima, kao što je trietanolamin, arginin ili lizin, piperidinom, prokainom i slične. Kiselinske adicijske soli uključuju, na primjer, soli s anorganskim kiselinama, kao što su, na primjer, kloridna kiselina ili sulfatna kiselina i soli s organskim kiselinama, kao što su, na primjer, octena kiselina ili oksalna kiselina. Naravno, bilo koja takva sol mora održati biološku aktivnost IL-18 inhibitora relevantnu za prisutan izum, kao što je koristan učinak na DTH, na primjer.

U drugom preferiranom ostvarenju prisutnog izuma, inhibitor IL-18 je IL-18 antitijelo. Anti-IL-18 antitijela mogu biti poliklonalna ili monoklonalna, kimerna, humanizirana ili čak potpuno ljudska. Rekombinantna antitijela i njihovi fragmenti okarakterizirani su visokim afinitetom vezanja na IL-18 in vivo i niskom toksičnošću. Antitijela koja se mogu upotrijebiti u izumu okarakterizirana su svojom sposobnošću kod liječenja pacijenata tijekom perioda dovoljnog za postizanje dobre do izvrsne regresije, ublažavanja patogenog stanja ili bilo kojeg simptoma ili skupine simptoma koji se odnose na patogeno stanje, te niskom toksičnošću.

Neutralizirajuća antitijela se lako izazivaju kod životinja kao što su zečevi, koze ili miševi imunizacijom s IL-18. Imunizirani miševi su posebno korisni za osiguravanje izvora B stanica u proizvodnji hibridoma, a uzastopno se uzgajaju da bi se dobile veće količine anti-IL-18 monoklonalnih antitijela.

Kimerna antitijela su imunoglobulinske molekule okarakterizirane s jednim ili više segmenata ili dijelova dobivenih iz različitih životinjskih vrsta. Općenito, varijabilno područje kimernog antitijela dobiva se iz nehumanih antitijela sisavaca, kao što je mišje monoklonalno antitijelo, a konstantno područje imunoglobulina dobiva se iz ljudske imunoglobulinske molekule. Preferirano, oba područja i kombinacija imaju nisku imunogenost koja je rutinski određena (Elliott i ostali, 1994). Humanizirana antitijela su imunoglobulinske molekule stvorene tehnikama genetskog inženjeringa u kojima se mišja konstantna područja zamijenjuju ljudskim kopijama uz održavanje mišjih regija koje vežu antigen. Dobiveno mišje-ljudsko kimerno antitijelo preferirano ima smanjenu imunogenost i poboljšanu farmakokinetiku kod ljudi (Knight i ostali, 1993).

Zbog toga je u drugom preferiranom ostvarenju IL-18 antitijelo humanizirano IL-antitijelo. Preferirani primjeri humaniziranog anti-IL-18 antitijela opisani su u evropskoj patentnoj prijavi EP 0 974 600, na primjer.

U slijedećem preferiranom ostvarenju, IL-18 antitijelo je potpuno ljudsko. Tehnologija za dobivanje ljudskih antitijela detaljno je opisana npr. u WO00/76310, WO99/53049, US 6,162,963 ili AU5336100. Posve ljudska antitijela su rekombinantna antitijela, preferirano stvorena kod transgenskih životinja, npr. ksenomiševa, koje sadrže sve ili neke funkcionalne položaje ljudskog imunoglobulina.

U visoko preferiranom ostvarenju prisutnog izuma, inhibitor IL-18 je IL-18BP ili njegov izoform, mutein, spojeni protein, funkcionalni derivat, aktivna frakcija ili cirkularno zamijenjen derivat. Izoformi, muteini, spojeni proteini ili funkcionalni derivati održavaju biološku aktivnost IL-18BP, posebno vezanje na IL-18 i preferirano imaju aktivnost najmanje uglavnom sličnu s IL-18BP. Idealno, takvi proteini imaju povećanu biološku aktivnost u usporedbi s nemodificiranim IL-18BP. Preferirane aktivne frakcije imaju veću aktivnost od aktivnosti IL-18BP ili druge prednosti, kao što su veća stabilnost, niža toksičnost ili imunogenost, lakše ih je dobiti u velikim količinama ili lakše pročistiti.

Slijedovi IL-18BP i njegove spojene inačice/izoformi mogu se naći u WO99/09063 ili u publikacijama Novicka i ostalih, 1999 i Kima i ostalih, 2000.

Funkcionalni derivati IL-18BP mogu se konjugirati s polimerima da bi se poboljšala svojstva proteina, kao što su stabilnost, poluraspad, bioraspoloživost, tolerancija prema ljudskom tijelu ili imunogenost. Da bi se postigao taj cilj, IL-18BP se na primjer može vezati na polietilen-glikol (PEG). PEGilacija se može provesti pomoću poznatih metoda opisanih u WO 92/13095, na primjer.

Zbog toga u preferiranom ostvarenju funkcionalni derivat sadrži najmanje jedan dio koji je vezan s jednom ili više funkcionalnih skupina koje se javljaju u obliku jednog ili više ogranaka na aminokiselinskim ostacima. Visoko se preferira ostvarenje u kojem dio predstavlja polietilen-glikol (PEG).

U drugom preferiranom ostvarenju izuma, inhibitor IL-18 obuhvaća imunoglobulinsko spajanje, tj. inhibitor IL-18 je spojeni protein koji sadrži sve dijelove ili samo dio IL-18 veznog proteina koji je spojen na cijeli ili dio imunoglobulina. U znanosti su poznate metode dobivanja proteina imunoglobulinskog spajanja (npr. WO 01/03737). Stručnjaku će biti jasno da dobiveni protein spajanja izuma održava biološku aktivnost IL-18BP, posebno vezanje na IL-18. Spajanje može biti direktno ili putem peptida koji predstavlja kariku i koji može uključivati 1-3 aminokiselinskih ostataka ili može biti dulji (npr. 13 aminokiselinskih ostataka). Navedeni peptid može biti tripeptid slijeda E-F-M (Glu-Phe-Met) ili 13-aminokiselinski slijed Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met umetnut između IL-18BP slijeda i imunoglobulinskog slijeda. Dobiveni protein spajanja ima poboljšana svojstva kao što su produženo vrijeme zadržavanja u tjelesnim tekućinama (poluraspad), povećana specifična aktivnost, povećana razina ekspresije ili je olakšano pročišćavanje proteina spajanja.

U preferiranom ostvarenju IL-18BP se spaja na konstantnu regiju Ig molekule. Preferirano, spaja se na regije teških lanaca, kao što su na primjer CH2 i CH3 domene humanog IgG1. Stvaranje specifičnih proteina spajanja koji sadrže IL-18BP i imunoglobulinski dio opisuju se na primjer u primjeru 11 WO 99/09063. I ostali izoformi Ig molekula su također prikladni za stvaranje proteina spajanja prema prisutnom izumu, kao što su izoformi IgG2 ili IgG4, ili pak ostale Ig skupine, na primjer IgM ili IgA. Proteini spajanja mogu biti monomerni ili multimerni, hetero- ili homomultimerni.

Poznati su inhibitorski učinci interferona na virusnu replikaciju i staničnu proliferaciju. Interferon-γ, na primjer, ima važnu ulogu u poticanju imunoloških i upalnih odgovora. Smatra se da interferon β (IFN-β, interferonski tip I) ima protuupalnu ulogu.

Izum se zbog toga također odnosi i na upotrebu kombinacije inhibitora IL-18 i interferona u proizvodnji lijeka za liječenje poremećaja preosjetljivosti.

Interferoni također mogu biti konjugirani na polimere da bi se poboljšala stabilnost proteina. Konjugat interferona β i polietilen-glikola opisan je na primjer u WO99/55377.

U drugom preferiranom ostvarenju izuma, interferon je interferon-β (IFN-β), a više preferirano IFN-β 1a.

Inhibitor stvaranja IL-18 i/ili njegovog djelovanja preferirano se upotrabljava istovremeno s interferonom, nakon njega ili odvojeno od njega.

U još jednom ostvarenju izuma, inhibitor IL-18 se upotrebljava u kombinaciji s TNF antagonistom. TNF antagonisti koriste svoju aktivnost na nekoliko načina. Prvo, antagonisti se s dovoljnim afinitetom mogu vezati na TNF molekulu ili odijeliti TNF molekulu, a mogu i specifično do djelomično ili znatno neutralizirati TNF epitop ili epitope odgovorne za vezanje TNF receptora (kasnije nazvani ''odijeljujući antagonisti''). Odijeljujući antagonist može biti, na primjer, antitijelo usmjereno protiv TNF.

Alternativno, TNF antagonisti mogu inhibirati signalizirajući put TNF koji se aktivira receptorom stanične površine nakon TNF vezanja (kasnije nazvani ''signalizirajući antagonisti''). Obje skupine antagonista korisne su u liječenju poremećaja preosjetljivosti, odvojeno ili zajedno u kombinaciji s IL-18 inhibitorom.

TNF antagonisti mogu se lagano identificirati i procijeniti rutinskim pregledom učinaka kandidata na aktivnost nativnog TNF prema suspektibilnim staničnim linijama in vitro, na primjer humanim B stanicama u kojima TNF uzrokuje proliferaciju i izlučivanje imunoglobulina. Ispitivanje sadrži TNF formulacije pri različitim razrijeđenjima kanditatnih antagonista, npr. od 0,1 da 100 puta molarne količine TNF upotrebljenog u ispitivanju i kontrola bez TNF ili samo uz antagonist (Tucci i ostali, 1992).

Odijeljujući antagonisti su preferirani TNF antagonisti u upotrebi prema prisutnom izumu. Između odijeljujućih antagonista preferirani su polipeptidi koji vežu TNF s visokim afinitetom i koji posjeduju nisku imunogenost. Topljive molekule TNF receptora i neutralizirajuća antitijela na TNF su posebno preferirana. Na primjer, topljivi TNF-RI i TNF-RII su korisni u prisutnom izumu. Krnji oblici tih receptora koji sadrže ekstracelularne domene receptora ili njihove funkcionalne dijelove su više preferirani antagonisti prema pristutnom izumu. Krnji topljivi TNF receptori tipa-I i tipa-II opisuju se na primjer u EP914431.

Krnji oblici TNF receptora su topljivi, te su detektirani u urinu i serumu kao 30 kDa i 40 kDa TNF inhibitorski vezni proteini koji se nazivaju TBPI, odnosno TBPII (Engelmann i ostali, 1990). Prema izumu preferirana je istovremena, naknadna ili odvojena upotreba IL-18 inhibitora s TNF antagonistom i/ili interferonom.

Prema izumu, TBPI i TBPII su preferirani TNF antagonisti za upotrebu u kombinaciji s IL-18 inhibitorom. Derivati, fragmenti, regije i biološki aktivni dijelovi receptorskih molekula, funkcionalno slični receptorskim molekulama također se mogu upotrijebiti u prisutnom izumu. Takav biološki aktivan ekvivalent ili derivat receptorske molekule odnosi se na dio polipeptida ili slijeda koji kodira receptorsku molekulu, dovoljne veličine i sposobnosti vezanja TNF uz takav afinitet da se inhibira ili blokira interakcija s membranski vezanim TNF receptorom.

U drugom preferiranom ostvarenju, za upotrebu prema izumu, humani topljiv TNF-RI (TBPI) je TNF antagonist. Prirodne i rekombinantne topljive TNF receptorske molekule i metode za njihovo dobivanje opisani su u evropskim patentima EP 308 378, EP 398 327 i EP 433 900.

IL-18 inhinitor može se upotrijebiti istovremeno s TNF inhibitorom, nakon njega ili odvojeno od njega.

U drugom preferiranom ostvarenju izuma, lijek sadrži i protuupalni agens, kao što je NSAID (nesteroidni protuupalni lijekovi). U preferiranom ostvarenju, COX-inhibitor, a najviše preferirano COX-2-inhibitor, upotrebljava se zajedno s IL-18 inhibitorom. COX-inhibitori su poznati u znanosti. Specifični COX-2-inhibitori izneseni su u WO 01/00229, na primjer. Aktivne komponente mogu se upotrijebiti istovremeno, jedna iza druge ili odvojeno.

Reakcije preosjetljivosti učestalo se liječe protualergijskim lijekovima, kao što su antihistaminici, kromolin, glukokortikoidi ili simpatomimetici. Zbog toga se prisutni izum odnosi i na kombiniranu terapiju koja obuhvaća inhibitor IL-18 i protualergijski lijek. U skladu s prisutnim izumom preferirana je upotreba antihistaminika i/ili kromolina i/ili glukoortikoida i/ili simpatomimetika za odvojenu, naknadnu ili istovremenu upotrebu s inhibitorom IL-18.

U drugom preferiranom ostvarenju prisutnog izuma, inhibitor IL-18 se upotrebljava u količini od oko 0,0001 do 1000 mg/kg tjelesne težine, oko 0,001 do 100 mg/kg tjelesne težine, oko 0,01 do 10 mg/kg tjelesne težine, oko 0,1 do 5 mg/kg tjelesne težine ili oko 1 do 3 mg/kg tjelesne težine.

IL-18 inhibitor prema izumu se preferirano primjenjuje lokalno. Na primjer, kod kontaktnog dermatitisa IL-inhibitor se može primjeniti izravno na oboljelu površinu kože.

U drugom preferiranom ostvarenju izuma, IL-18 inhibitor se primjenjuje sistematično, a preferirano potkožno ili intramuskularno.

Izum se odnosi i na upotrebu ekspresijskog vektora koja obuhvaća kodirajući slijed inhibitora IL-18 u pripravi lijeka za sprečavanje i liječenje poremećaja preosjetljivosti. U pristupu genske terapije IL-18 inhibitor se isporučuje na položaj gdje je potreban. U liječenju ili sprečavanju poremećaja preosjetljivosti, vektor genske terapije koji sadrži slijed inhibitora IL-18 stvaranja i/ili djelovanja može se injektirati, na primjer, izravno na oboljelo tkivo, čime se sprečavaju problemi vezani uz sistemsku primjenu vektora genske terapije, kao što su slabljenje vektora, dosezanje i ciljanje ciljnih stanica ili tkiva i nuspojave.

Prema izumu, razmatra se upotreba vektora u poticanju i/ili pojačavanju endogenog stvaranja inhibitora IL-18 u stanici u kojoj se obično ne događa ekspresija IL-18 inhibitora ili koja eksprimira nedovoljne količine inhibitora. Vektor može sadržavati regulacijske slijedove funkcionalne u stanicama gdje se želi postići ekspresija inhibitora IL-18. Regulacijski slijedovi mogu biti na primjer promotori ili pojačivači. Regulacijski slijedovi mogu se zatim umetnuti u desni položaj genoma homolognom rekombinacijom čime se povezuje regulacijski slijed s genom čija se ekspresija treba potnuti ili pojačati. Tehnologija se uobičajeno naziva ''endogena genska aktivacija'' (EGA), a opisuje se u npr. WO 91/09955.

Stručnjacima je jasno da je upotrebom iste tehnike također moguće direktno potisnuti IL-18 ekspresiju, bez upotrebe inhibitora IL-18. Da bi se to postiglo, u genski položaj IL-18 može biti uveden negativni regulacijski element, npr. prigušujući element, što dovodi do podregulacije ili sprečavanja IL-18 ekspresije. Stručnjacima će biti razumljivo da podregulacija ili prigušivanje IL-18 ekspresije ima isti učinak kao i upotreba IL-18 inhibitora u sprečavanju i/ili liječenju bolesti.

Izum se odnosi i na upotrebu genetički moduficirane stanice za dobivanje IL-18 inhibitora u proizvodnji lijeka za liječenje i/ili sprečavanje poremećaja preosjetljivosti.

Izum se odnosi i na farmaceutske pripravke, posebno korisne u sprečavanju i/ili liječenju poremećaja preosjetljivosti, koji sadrže terapeutski djelotvornu količinu inhibitora IL-18 i/ili terapeutski djelotvornu količinu interferona i/ili farmaceutski djelotvornu količinu TNF inhibitora i/ili farmaceutski djelotvornu količinu protuupalnog agensa i/ili farmaceutski djelotvornu količinu protualergijskog agensa, pogotovo antihistaminika.

Ulogu inhibitora IL-18 u farmaceutskom pripravku mogu imati inhibotori kaspaze-1, antitijela protiv IL-18, antitijela protiv bilo koje podjedinice IL-18 receptora, inhibitori signalizirajućeg puta IL-18, antagonisti IL-18 koji konkuriraju IL-18 i blokiraju IL-18 receptor i IL-18 vezni proteini, njihovi izoformi, muteini, spojeni proteini, funkcionalni derivati, aktivne frakcije ili cirkularno zamijenjeni derivat s istom aktivnošću.

IL-18BP i njegovi izoformi, muteini, spojeni proteini, funkcionalni derivati, aktivne frakcije ili cirkularno zamijenjeni derivati su preferirani aktivni sastojci farmaceutskih pripravaka.

Interferon sadržan u farmaceutskom pripravku je preferirano IFN-β.

U još jednom preferiranom ostvarenju, farmaceutski pripravak sadrži terapeutski djelotvornu količinu inhibitora TNF-α. Farmaceutski pripravak prema izumu može sadržavati i jedan ili više COX-inhibitora.

Definicija ''farmaceutski prihvatljiv'' označava bilo koji nosač koji ne utječe na učinkovitost biološke aktivnosti aktivnog sastojka i nije toksičan prema domačinu na kojem se primjenjuje. Na primjer, kod parenteralne primjene, aktivni protein (proteini) može se formulirati u jedinici oblika doziranja za ubrizgavanje u prenosnike, kao što su fiziološka otopina, otopina dekstroze, serumski albumin i Ringerova otopina.

Aktivni sastojci farmaceuskog pripravka prema izumu mogu se primjeniti na pojedincu na različite načine. Putevi primjene uključuju intradermalne, transdermalne (npr. u polako otpuštajućim formulacijama), intramuskularne, intraperitonealne, intravenozne, potkožne, oralne, intrakranijalne, epiduralne, lokalne, rektalne i intranazalne puteve. Može se upotrijebiti bilo koji terapeutski djelotvoran put primjene, na primjer apsorpcija preko epitelijalnog ili endotelijalnog tkiva ili genska terapija u kojoj se na pacijentu primjenjuje DNA molekula koja kodira aktivni agens (npr. putem vektora) što uzrokuje ekspresiju i izlučivanje aktivnog agensa in vivo. Nadalje, protein (proteini) prema izumu može se primjeniti zajedno s ostalim komponentama biološki aktivnih agensa, kao što su farmaceutski prihvatljivi površinski aktivni agensi, ekscipijenti, nosači, razrijeđivači i prenosnici.

Za parenteralnu (npr. intravenoznu, potkožnu, intramuskularnu) primjenu aktivni protein (proteini) može se formulirati u obliku otopine, suspenzije, emulzije ili liofiliziranog praška zajedno sa farmaceutski prihvatljivim parenteralnim prenosnikom (npr. vodom, fiziološkom otopinom, otopinom dekstroze) i aditivima koji održavaju izotoničnost (npr. manitolom) ili kemijsku stabilnost (npr. konzervansi i puferi). Formulacija se sterilizira uobičajno upotrebljavanim tehnikama.

Bioraspoloživost aktivnog proteina (aktivnih proteina) prema izumu također se može poboljšati upotrebom konjugacijskih postupaka koji povećavaju poluraspad molekule u ljudskom tijelu, npr. spajanjem molekule s polietilen-glikolom, kao što je opisano u PCT patentnoj prijavi WO 92/13095.

Terapeutski djelotvorne količine aktivnog proteina (aktivnih proteina) biti će funkcije raznih varijabli uključujući tip antagonista, afinitet antagonista prema IL-18, bilo kakvu preostalu citotoksičnu aktivnost koju pokazuju antagonisti, put primjene i kliničko stanje pacijenta (uključujući poželjnost i zadržavanje netoksične razine endogene IL-18 aktivnosti).

''Terapeutski djelotvorna količina'' predstavlja onu količinu IL-18 inhibitora čijom primjenjom dolazi do inhibicije biološke aktivnosti IL-18. Primjenjeno doziranje na pacijentu, u obliku jednostruke ili višestrukih doza, ovisit će o raznim faktorima, uključujući farmakokinetička svojstva IL-18 inhibitora, put primjene, stanje pacijenta i karakteristike (spol, dob, tjelesna težina, zdravlje, visina), opseg simptoma, trenutna liječenja, učestalost liječenja i željeni učinak. Stručnjacima su dobro poznata podešavanja i manipulacije vezane uz utvrđivanje raspona doziranja, kao i in vivo i in viro metode određivanja inhibicije IL-18 kod pojedinca.

Prema izumu, inhibitor IL-18 se upotrebljava u količini od oko 0,001 do 100 mg/kg tjelesne težine, oko 0,01 do 10 mg/kg tjelesne težine, oko 0,1 do 5 mg/kg tjelesne težine, oko 1 do 3 mg/kg tjelesne težine ili oko 2 mg/kg tjelesne težine.

Preferirani put primjene prema izumu je potkožni put primjene. Intramuskularna primjena je također preferirana prema izumu. Da bi se IL-18 inhibitor direktno primjenio na mjestu gdje je potrebno njegovo djelovanje, također je preferirana lokalna primjena.

U drugim preferiranim ostvarenjima, inhibitor IL-18 se primjenjuje dnevno ili svaki drugi dan.

Dnevne doze se obično daju u obliku podijeljenih doza ili u kontinuiranom otpuštajućem obliku djelotvornom za dobivanje željenih rezultata. Druga ili slijedeće primjene mogu se provesti kod doziranja koje je isto, manje ili veće od inicijalne ili prethodne doze primjenjene na pojedincu. Druga ili slijedeće primjene mogu se primjeniti tijekom ili prije početka bolesti.

Prema izumu, IL-18 inhibitor se može primjeniti preventivno ili terapeutski na pojedincu prije, istovremeno ili nakon drugog terapetskog režima ili agensa (npr. višestruki režimi lijekova) u terapeutski djelotvornoj količini, pogotovo uz interferon i/ili TNF inhibitor i/ili drugi protuupalni agens, kao što je COX-inhibitor i/ili protualergijski agens. Aktivni agensi koji se primjenjuju istovremeno s drugim terapeutskim agensima, mogu se primjeniti u istim ili različitim pripravcima.

Izum se odnosi i na metodu za pripravu farmaceutskog pripravka koja obuhvaća miješanje djelotvorne količine IL-18 inhibitora i/ili interferona i/ili TNF antagonista i/ili COX-inhibitora s farmaceutski prihvatljivim nosačem.

Izum se odnosi i na metodu liječenja poremećaja preosjetljivosti koja obuhvaća primjenu farmaceutski djelotvorne količine IL-18 inhibitora na pacijentu kojem je on potreban.

Nakon potpunog opisa izuma, stručnjacima će biti jasno da se isti može provesti uz široki raspon ekvivalentnih parametara, koncentracija i uvjeta bez odvajanja od duha i područja izuma, te bez nepotrebne eksperimentacije.

Dok je izum opisan u svezi sa svojim specifičnim ostvarenjima, jasno je da su moguće njegove daljnje modifikacije. Ovom prijavom se namjeravaju obuhvatiti sve varijante, upotrebe ili prilagodbe izuma koje općenito slijede principe izuma i obuhvaćaju takva odvajanja od prisutnog otkrića koja ulaze u poznatu ili uobičajenu praksu znanstvenog područja na koji se izum odnosi i koja se mogu primjeniti na ranije navedene značajne karakteristike kao što slijedi u području pridodanih zahtjeva.

Sve su citirane reference, uključujući revijske članke ili sažetke, objavljene ili neobjavljene U. S. ili strane patentne prijave, izdane U. S ili strane patente ili bilo koje druge reference potpuno inkorporirane navodom, uključujući sve podatke, tablice, slike i tekst koji se nalazi u citiranim referencama. Cjelovit sadržaj citiranih referenca također je potpuno inkorporiran navodom.

Referenca poznatih metodoloških koraka, konvencionalnih metodoloških koraka, poznatih metoda ili konvencionalnih metoda ni na koji način ne predstavlja dopuštanje da se bilo koji aspekt, opis ili ostvarenje prisutnog izuma iznosi, smatra ili sugerira u relevantnoj znanosti.

Prethodni opis specifičnih ostvarenja potpuno prikazuje opće karakteristike izuma tako da će ga ostali moći, primjenom saznanja unutar znanosti (uključujući sadržaje citiranih referenca), lako modificirati i/ili prilagoditi za razne primjene, bez nepotrebne eksperimentacije i bez odvajanja od općeg koncepta prisutnog ituma. Namjera je da takve modifikacije i adaptacije ulaze u raspon ekvivalenata iznesenih ostvarenja, baziranih na ovdje predstavljenom podučavanju i vođenju. Frazeologija ili terminologija koja je upotrebljena u ovoj prijavi svrha je opisa, no ne i ograničenja, terminologija ili frazeologija prisutnog opisa izuma iznesena je u smislu podučavanja i vođenja stručnjaka na tom području.

PRIMJERI

Primjer 1

IL-18BP tretman smanjuje kontaktnu preosjetljivost

Metode

U svim slijedećim primjerima upotrebljeni su mišji modeli eksperimentalno izazvane kontaktne preosjetljivosti (CHS). Stupanj CHS izmjeren je pomoću oticanja uha kao reakcije na lokalno primjenjeni sensitizator.

Ispitivanje koje se temelji na oticanju uha kod miševa i koje je upotrijebljeno za dobivanje podataka predstavljenih na slikama 1 i 3 (vidi kasnije), detaljno je opisano (Garrigue i ostali, 1994). Ukratko, miševi su sensitizirani lokalno primjenom 25 μL 0,5% 2,4-dinitrifluorbenzenske (DNFB; Sigma Chemical Co.) otopine u smjesi aceton/maslinovo ulje (4:1) na obrijani abdomen (nulti dan). Pet dana kasnije, na desne uši primjenjeno je 20 μL 0,2% DNFB u istom prenosniku, a na lijeve uši primjenjen je samo prenosnik.

Od petog do osmog dana miševi su dnevno primali interperitonealno (i. p) 250 μg/miš/dan rhIL-18 BP (rekombinantni humani IL-18BP) ili fiziološku otopinu u kontrolnoj skupini (slika 1A), ili su pak primili IL-18BP od nultog do drugog dana (slika 1B).

Debljina uha mjerena je pomoću skale instrumenta za mjerenje debljine (Mitutoyo Corp., Kawasaki, Japan), a oteklina uha određena je oduzimanjem vrijednosti prije izazivanja od vrijednosti nakon izazivanja, a zatim oduzimanjem bilo kakve otekline koja se javila kod kontrolnog uha koje je izazvano prenosnikom.

Oteklina uha mjerena je 0., 5., 6., 7., 8., 9., 12., 14. i 16. dan.

Za dobivanje podataka predstavljenih na slikama 4-6 upotrijebljen je drugi model, vidi primjere kasnije. Za meutralizaciju IL-18 tijekom eksperimentalno izazvane kontaktne preosjetljivosti (CHS) na 2,4-dinitrofluorbenzen (DNFB) upotrijebljen je IL-18 vezni protein (IL-18BP). Eksperimentalni postav bio je slijedeći:

0. dan : sensitizacija

25 μL DNFB (0,5% u smjesi aceton/maslinovo ulje (4/1) kao prenosniku) na obrijana leđa

5. dan: izazivanje

5 μL DNFB (0,2%) na leđnu i trbušnu stranu desnog uha

5 μL prenosnika na leđnu i trbušnu stranu lijevog uha

6. dan: očitavanje

Praćenje debljine uha kao mjere upale

Izražavanje rezultata kao povećavanja otekline [μm] kod izazvanog nasuprot kontrolnom uhu

6. ili 7. dan: analiza

Maksimumi otekline javljaju se u ovom modelu između 6. i 7. dana. IL-18 je neutraliziran dnevnim ubrizgavanjem 250 μL IL-18BP (u fiziološkoj otopini) po životinji tijekom sensitizacije 0., 1. i 2. dana ili tijekom izazivanja 4., 5. i 6. dana.

Rezultati

Odgovori kontaktne preosjetljivosti (CHS) su hapten-specifične upale kože kojima posreduju T stanice. Većina haptena dovodi do odgovora oligoklonalnih T stanica koji uključuje uglavnom CD8+ efektorske T stanice, dok CD4+ T stanice imaju podregulacijsku ulogu u CHS odgovoru (Bour i ostali, 1995; Grabbe i ostali, 1998). Za ispitivanje uloge IL-18 u CHS odgovoru, miševi su epikutanozno sensitizirani sa DNFB, a zatim su pet dana kasnije izazvani primjenom haptena na kožu uha. Popratno s haptenskim izazivanjem miševima je ubrizgano i. p. 250 μg/miš/dan rhIL-18BP ili fiziološka otopina. IL-18BP ili fiziološka otopina kao kontrola, primjenjivan je tri dana i to 5.-8. dana nakon prve sensitizacije s DNFB (0. dan). DNFB izazivanje petog dana uzrokovalo je značajno oticanje uha u obje skupine (slika 1A). Stupanj oticanja kod miševa tretiranih fiziološkom otopinom (trokutići) mnogo je izraženiji nego kod miševa tretiranih s IL-18BP (kvadratići), a vraćanje na gotovo normalno stanje uslijedilo je već devetog dana.

Promjena u oteklini uha koja je uočena 0.-2. dana kod tretiranja s IL-18BP nije statistički značajna (slika 1B). Čini se da je vrijeme primjene IL-18BP važan faktor za dobivanje korisnog učinka IL-18BP tretmana.

Zaključak:

U ovom utemeljenom mišjem modelu kontaktne preosjetljivosti/kontaktnog dermatitisa, trodnevni tretman s inhibitorom IL-18 imao je značajno koristan učinak na stupanj oticanja/upale izazvane tretmanom haptena.

Primjer 2

IL-18BP tretman smanjuje kontaknu preosjetljivost nakon drugog izazivanja

Metode

C57BL/6 miševi su sensitizirani epikutanoznom primjenom 25 μL 0,5% DNFB otopine na obrijani abdomen (0. dan). Miševi su prvi put izazvani s 20 μL 0,2% DNFB koji je primjenjen 5. dan na ušima. 19. dana miševi su drugi put izazvani s DNFB. Oteklina uha mjerena je 0. dana (sensitizacija haptenom), 5. dana (prvo izazivanje haptenom), 6., 7., 8., 9., 12., 14., 16., 19. (drugo izazivanje haptenom), 20., 21., 22., 23., 26., 28. i 30. dana. Prosječne vrijednosti s SD za svaku skupinu predstavljene su na slici 2. Miševi su dnevno tretirani i. p. s 250 μg/miš/dan IL-18BP (n = 5; slika 2, puni kvadratići) ili s fiziološkom otopinom (n = 5; slika 2, prazni kvadratići) od 19. do 23. dana.

Rezultat

Kao što je prikazano na slici 2, IL-18BP tretman značajno smanjuje oteklinu uha, pogotovo nakon drugog izazivanja haptenom.

Zbog toga je terapija s IL-18BP posebno prikladna za liječenje poremećaja preosjetljivosti u kojem su pacijenti uzastopno izazivani istim alergenom da bi se prevladale upalne reakcije potaknute izazivanjima.

Primjer 3

IL-18BP štiti od CHS neutralizacijom IL-18

Da bi se provjerilo da li liječenje s IL-18BP štiti od oticanja tako što dolazi do neutralizacije IL-18, uspoređena je sposobnost IL-18 deficijentnih (KO) miševa i miševa divljeg tipa C57BL/6 u javljanju CHS odgovora. IL-18 deficijentni miševi razvijaju CHS na DFNB, iako je manje izražena nego kod miševa divljeg tipa. Nije uočen utjecaj IL-18BP tretmana kod IL-18 deficijentnih miševa, kao što je prikazano na slici 3, što indicira da je protuupalni učinak IL-18BP kod CHS postignut zbog neutralizacije IL-18 (n = 5 miševa po skupini).

Primjer 10

IL-18BP ne smanjuje vaskularno istjecanje

Metode

Kod C57BL/6 miševa izazvana je CHS na prethodno opisani način. Za praćenje edema koji uzrokuje CHS reakcija, Evans Blue je injektiran i. v. 2 sata prije uzazivanja s DNFB. Miševi su žrtvovani 24 sata kasnije, a uši su podvrgnute ekstraktu boje koji je iscurio iz vaskulasture i nakupio se u okolnom tkivu. Vaskularno istjecanje određeno je kao količina boje po mg isušenog tkiva uha korigirana za koncentraciju sredstva Evans Blue u serumu i izražena kao omjer izazvanog naspram kontrolnog uha. Dok je tretmanom IL-18BP četvrtog i petog dana smanjena oteklina do 56% kontrole tretirane prenosnikom (slika 4, lijevi prikaz, p < 0,01), između te dvije skupine nije postojala značajna razlika u vaskularnom istjecanju (slika 4, desni prikaz). Obje su skupine pokazale značajno povećani edem u usporedbi s kontrolnom skupinom koja nije sensitizirana (p < 0,05 i p < 0,01). Kao naredna kontrola, miševi su tretirani s 250 μg irelevantnog proteina BSA po životinji na dan. Kod tih miševa razvila se CHS kao i kod kontrolnih životinja tretiranih prenosnikom (n = 10 miševa po skupini).

In vivo ispitivanja vaskularnog istjecanja

Princip: ubrizgavanje (iv) sredstva Evans Blue i ekstrakcija iz ciljnog tkiva (uha)

Neobrađeni podaci za određivanje:

- Standardna krivulja sredstva Evans Blue (OD620/ng)

- Koncentracija sredstva Evans Blue u krvi (OD620/mL, odnosno μg/mL)

- Masa isušenog tkiva uha (homolateralni i kontralateralni, mg)

- Sadržaj sredstva Evans Blue u ušima (homolateralni i kontralateralni, OD620/μg, odnosno ng/mg)

Postupak kod CHS koja je izazvana s DFNB

- Ubrizgavanje 100 μL sredstva Evans Blue iv retroorbitalno 2 sata prije izazivanja miševa s DNFB petog dana eksperimentalno izazvane CHS

- Ubrizgavanje IL-18BP i. p. jedan sat prije izazivanja

- Mjerenje otekline i žrtvovanje miševa šestog dana (24 h nakon izazivanja uha s DNFB)

o Uzimanje uzoraka krvi, a nakon toga:

o Dodavanje 30 μL seruma u 970 μL formamida (→ 1/33 razrijeđenje)

o Određivanje OD pri 620 nm (→ 1 OD620 ~ 33 OD620/mL)

- Sakupljanje homolateralnog i kontralateralnog uha, a zatim:

o Sušenje 24 sata pri 80 °C

o Određivanje suhe mase

o Usitnjavanje i ekstrahiranje boje s 1 mL formamida, lagano mućkanje 24 sata pri 55 °C

o Filtriranje za uklanjanje većih ostatakaβ, punjenje kiveta, ostavljanje na sobnoj temperaturi da se lipidni sloj nakupi na površini

o Određivanje OD pri 620 nm

Vrijednosti za izračunavanje:

[image]

Rezultati:

Osnovno, oticanju uočenom tijekom CHS reakcije pridonose dva procesa: istjecanje tekućine iz vaskulature u okolno tkivo što uzrokuje edem i izlijevanje upalnih stanica iz krvnih žila na mjesto oštećenja tkiva.

Pokazano je da unatoč općem smanjenju oticanja, tretman s IL-18BP ne smanjuje vaskularno istjecanje kod upotrebe sredstva Evans Blue kao markera (slika 4).

Primjer 5

IL-18BP tretman smanjuje upalnu infiltraciju uha uzazvanog s DNFB

Metode

Kod C57BL/6 miševa izazvana je CHS na prethodno opisani način. Životinje su tretirane s IL-18BP ili prenosnikom 4.-6. dana. IL-18BP tretman smanjio je sedmi dan oteklinu do 58% kontrole tretirane prenosnikom. Miševi su žrtvovani sedmi dan, izazvane uši su sakupljene, podijeljene prema skupini (n = 8), te su podvrgnute enzimskoj razgradnji da bi se dobile suspenzije pojedinih stanica. Stanice su okarakterizirane FACS analizom na CD45 pozitivnim, živim stanicama. Broj αβT stanica, NK stanica, neutrofila i monocita/makrofaga nađenih u preparatima ušiju izražen je kao postotak ukupno analiziranih stanica. Također su izračunati tipovi stanica nakon IL-18BP tretmana u odnosu na kontrolu tretiranu prenosnikom.

Za određivanje stvaranja IFNγ, stanice dobivene iz ušiju izazvanih s DNFB su ponovno stimulirane pri 2 x 105 po jažici s veznim anti-CD3 antitijelom. Tijekom perioda uzgoja od 24 sata nije dalje dodavan IL-18BP. Stvaranje IFN-γ izmjereno je tri puta pomoću ELISA.

Stanični preparati iz ušiju izazvanih s DNFB stimulirani su četri sata s 50 ng/mL PMA* i 500 ng/mL lonomicina. Citokinsko izlučivanje spriječeno je dodatkom 2 μg/mL brefeldina A zadnja dva sata inkubacije. Stanice su zatim podvrgnute višebojnom imunoflorescentnom bojanju na intracelularne IFN-γ i površinske antigene. CD8 T stanice stvarale su IFN-γ, a u manjoj mjeri i CD4 T stanice. IFN-γ nije detektiran u NK stanicama i αβT stanicama (n. d., nedetektiran; *farbol-12 miristat-13-acetat).

Priprava suspenzije pojedinih stanica

Enzimska ragradnja mišjih ušiju za dobivanje suspenzije pojedinih stanica temelji se na postupcima Schulera G. i Steinmana R.M (1985), te Stingla i ostalih (1983).

1. odstranjivanje ušiju, svrstavanje 5 ušiju po preparatu

2. ispiranje 70% etanolom

3. razdvajanje pomoću pincete

4. polaganje kožne strane u 7,5 mL HBSS1 pri 37 °C

5. dodavanje 5 mL 2,5% tripsina2 (10x) za dobivanje konačne koncetracije od 1%

6. inkubiranje 35 minuta pri 37 °C

7. prenošenje kožne strane ušnih polovica na najlonsko sito (stanično cjedilo) smješteno u 10 mL smjese HBSS/80% FCS na ledu i lagano zaplitanje za uklanjanje stanica od ekstracelularnog matriksa

8. uklanjanje sita s velikim ostacima

9. dvostruko ispiranje sa hladnom smjesom HBSS/10% FCS

10. brojanje stanica

FACS analiza

1. ponovno suspendiranje stanica u FACS puferu za bojanje3, svi slijedeći koraci na ledu

2. upotreba 108 stanica po bojanju

3. dodavanje 1 μg sredstva FC-Block, 10 minuta

4. dodavanje anti-CD45 antitijela u kombinaciji s antitijelima usmjerenim protiv bitnih markera, 1 μL svakog, 30 minuta

5. ispiranje 2x

6. postizanje 0,5 x 106 ukupnih rezultata pomoću FACS

7. analiziranje specifičnih markera na CD45+, živim stanicama

Rezultati:

Za ispitivanje upalnog infiltrata na mjestu izazivanja na CD45+, živim stanicama analizirane (FACS) su suspenzije pojedinih stanica pripravljene iz netretiranih i izazvanih ušiju (slika 5). CD45+ stanice prisutne u netretiranom uhu bile su uglavnom γδT stanice i dendritske stanice kože. Upalni je infiltrat 24 sata nakon izazivanja sadržavao CD8 i CD4 T stanice, neutrofile, monocite i NK stanice, uz gotovo dvostruko povećanje ukupnog broja CD45+ stanica u uhu. U skladu sa smanjenjem u oticanju, IL-18BP tretman smanjuje prije svega broj leukocita koji infiltriraju mjesto izazivanja, što je utjecalo na različite tipove stanica u upalnom infiltratu. Smanjenje je iznosilo između 20% i 40%, ovisno o tipu stanica.

Druga karakterizacija količine infiltrata dobivenog iz ušiju miševa tretiranih s IL-18BP pokazala je štetno IFNγ stvaranje na anti-CD3 ponovnu stimulaciju (slika 6). FASC analiza pokazala je da IFNγ uglavnom stvaraju CD8 T stanice, a u manjoj količini i CD4 T stanice. Zanimljivo, NK stanice i γδT stanice nisu pridonosile stvaranju IFNγ (slika 7).

Primjer 6

IL-18BP ne oslabljuje jačanje Langerhansovih stanica

Metoda:

Miševi su premazani s haptenskim FTIC (50 μL 4 mg/mL otopine) ili prenosnikom aceton/dibutilftalat (1:1) na lijevoj, odnosno desnoj slabini. Slabinski limfni čvorovi sakupljeni su 24 sata nakon premazivanja. Langerhansove stanice konjugirane haptenom mogu se detektirati pomoću FASC kao FTIC+, CD11c+ stanica u limfnom čvoru koji drenira

FTIC premazanu slabinu, no ne i u kontralateralnom limfnom čvoru koji drenira slabinu premazanu samo prenosnikom (n = 5 drenirajućih limfnih čvorova po skupini).

Rezultati:

Migracija Langerhansovih stanica (LC) koje prenose antigen na drenirajući limfni čvor ovisna je o protuupanim citokinima IL-1β i TNFα, a regulira je kaspaza-1 (Antonopoulos i ostali, 2001; Kimber i ostali, 1992). Prema tome, IL-18 sudjeluje u migraciji LC (Cumberbatch i ostali, 2001). Zbog toga tretman s IL-18BP može oslabiti jačanje LC i stoga umanjiti imunološki odgovor na DNFB tijekom faze izazivanja. U svrhu ispitivanja navedene hipoteze, lijeva, odnosno desna slabina miševa premazana je haptenskim FTIC ili prenosnikom. Slabinski limfni čvorovi sakupljeni su 24 sata nakon premazivanja i određen je broj FTIC+ stanica po limfnom čvoru. Tretiranje životinja s IL-18BP 24 sata prije premazivanja nije promijenilo broj haptena koji prenose LC prisutnih u drenirajućem limfnom čvoru 24 sata nakon premazivanja (slika 8). Zbog toga u ovom modelu IL-18 nema važniju ulogu u migraciji LC.

Primjer 7

IL-18BP umanjuje stupanj odgođenog tipa preosjetljivosti kod drugog mišjeg modela DTH

Metode

Odgođeni tip preosjetljivosti

Miševi su sensitizirani intravenoznim ubrizgavanjem 108 BALB/c stanica slezene, te su izazvani petog dana s 13 x 108 BALB/c stanica slezene (50 μL PBS) u desne šape. U kontrolne lijeve šape ubrizgano je 50 μL PBS. Oticanje desne šape izračuna se oduzimanjem vrijednosti prije izazivanja i bilo kakvog oticanja koje je izmjereno u lijevim šapama od vrijednost nakon izazivanja.

Za eksperimenate prijenosa, iz staničnih suspenzija dobivenih iz limfnih čvorova životinja sensitiziranih s BALB/c stanicama slezene ili iz limfnih čvorova netretiranih kontrolnih životinja odvojene su B220+ i CD8+ stanice inkubacijom s štakorskim anti-mišjim B220-FITC i CD8-FITC, a zatim separacijom u MACS kolonama s paramagnetskim mikrozrncima (Milteni Biotech, Auburn, California, USA). Eluirani preparati obogaćeni CD4* T stanicama ubrizgani su u repnu venu miševa (2 x 107 stanica/miš). Nakon 16 sati miševi su izazvani ubrizgavanjem 13 x 106 BALB/c stanica slezene (bez crvenih krvnih stanica) u desnu šapu, a oteklina je praćena tijekom slijedećih dana.

Rezultat

Odgođeni tip preosjetljivosti (DHT) izazvan je CD4+ T stanicama uz očite podregulacijske učinke CD8+ T stanica (Grabbe i ostali, 1998). U DTH modelu istražuje se ponašanje CD4+ T stanica kod miševa tretiranih s IL-18BP. C57BL/6 životinje sensitiziraju se intravenoznim ubrizgavanjem 108 alogenskih BALB/c stanica slezene. Pet dana kasnije u desnu šapu ubrizgalo se 13 x 106 BALB/c stanica slezene, zajedno sa 10 mg/kg rekombinantnog humanog IL-18BP i. p. ili prenosnika. Lokalna upala mjeri se određivanjem otekline šape tijekom 24 sata.

Reference

1. Altschul S.F i ostali, J. Mol. Bio., 215, 403-410, 1990, Altschul S.F. i ostali, Nucleic Acids Res., 25:389-3402, 1997.

2. Antonopoulos C., M. Cumberbatch, R.J. Dearman, R.J. Daniel, I. Kimber i R.W. Groves, 2001, ''Functional caspase-1 is reqired for Langerhans cell migration and optimal contact sensitization in mice'', J. Immunol. 166:3672-3677.

3. Bour H. i ostali, 1995, ''Major histocompatibility complex class I-restricted CD8 + T cells and class II-restricted CD4 + T cells, respectively, mediate and regulate contact sensitivity to dinitrofluorobenzene'', Eur. J. Immunol. 25:3006-3010.

4. Chater K.F i ostali, u ''Sixth International Symposium on Actinomycetales Biolology'', Akademiai Kaido, Budimpešta, Mađarska (1986), str. 45-54.

5. Conti B., J.W. Jahng, C. Tinti, J.H. Son i T.H. Joh, 1997, ''Induction of interferon-gamma inducing factor in adrenal cortex'', J. Biol. Chem. 272:2035-2037.

6. Cumberbatch M., R.J. Dearman, C. Antonopoulos, R.W. Groves i I. Kimber, 2001, ''Interleukin (IL)-18 induces Langerhans cell migration by tumor necrosis factor-alpha- i IL-1beta-dependent mechanism'', Immunology 102:323-330.

7. Devereux J. i ostali, Nucleic Acids Res., 12, 387-395, 1984.

8. DiDonato J.A, Hayakawa M, Rothwarf D.M, Zandi E. i Karin M. (1997), Nature 388, 16514-16517.

9. Elliott M.J, Maini R.N., Feldmann M., Long-Fox A., Charles P., Bijl H. i Woody J.N., 1994, Lancet 344, 1125-1127.

10. Engelmann H, D. Novick i D. Wallach, 1990, ''Two tumor necrosis factor-binding proteins purified from human urine. Evidance for immunological cross-reactivity with cell surface tumor necrosis factor receptors'', J. Biol. Chem. 265-1531-1536.

11. Garrigue J.L., Nicolas J.F., Fraginals R., Benezra C., Bour H., Schmitt D., Contact Dermatitis, 1994, travanj; 30(4):231-7.

12. Grabbe S., i Schwarz T., 1998, ''Immunoregulatory mechanisms involved in elicitation of allergic contact hypersensitivity'', Immunol. Today 19: 37-44.

13. Habu i ostali, J. Immunol., 2001, 166:5439-5347.

14. Hanifin i ostali, (1993), J. Am. Acad. Dermatol. 29:189.

15. Kim S.H., Eisenstein M., Reznikov L., Fantuzzi G., Novick D., Rubinstein M., Dinarello C.A., ''Structural requirements of six naturally occuring isoforms of the IL-binding protein to inhibit IL-18, Proct. Natl., Acad. Sci., U S A 2000; 97:1190-1195.

16. Kimber I. i M. Cumberbatch, 1992, ''Stimulation Langerhans cell migration by tumor necrosis factor alpha (TNF-alpha)'', J. Invest. Dermatol. 99:48S-50S.

17. Maliszewski C.R., T.A. Sato, T. Vanden Bos, S. Waugh, S.K. Dower, J. Slack, M.P. Beckmann i K.H. Grabstein, 1990, ''Cytokine receptors and B cell functions. I. Recombinant soluble receptors specificaly inhibit IL-1- and IL-4-induced B cells activities in vitro'', J. Immunol. 144:3028-3033.

18. Micallef M.J., T. Ohtsuki, K. Kohno, F. Tanabe, S. Ushio, M. Namba, T. Tanimoto, K. Torigoe, M. Fujii, M. Ikeda, S. Fukuda i M. Kurimoto, 1996, ''Interferon-gamma-inducing factor enhances T helper 1 cytokine production by stimulated human T cells: synergism with interleukin-12 for interferon-gamma production'', Eur. J. Immunol. 26:1647-51 issn: 0014-2980.

19. Nakamura K., Okamura H., Wada M., Nagata K., Tamura T., Infect. Immun., 1989, veljača; 57(2):590-5.

20. Novick D., Kim S.H., Fantuzzi G., Reznikov L., Dinarello C. i Rubinstein M., (1999), Immunity 10, 127-136.

21. Okamura H., Nagata K., Komatsu T., Tanimoto T., Nukata Y., Tanabe F., Akita K., Torigoe K., Okura T., Fukuda S. i ostali, Infect. Immun., 1995, listopad; 63 (10):3966-72.

22. Parnet P., Garka K.E., Bonnert T.P., Dower S.K. i Sims J.E, (1996), J. Biol. Chem. 271, 3967-3970.

23. Reinhold i ostali, (1990), Lancet 335:1282.

24. Rothe H., Jenkins N.A., Copeland N.G., Kolb H., J. Clin. Invest., 1997, veljača 1; 99(3):469-74.

25. Schuler G. i Steinman R.M., (1985), ''Murine epidemal Langerhans calls mature into potent immunostimulatory dendritic cells in vitro'', J. Exp. Med. 161, 526-546.

26. Stingl L.A., Sauder D.N., Iijima M., Wolff K., Pehamberger H. i Stingl G., (1983), ''Mechanism of UV-B-induced impairment of antigen-presenting capacity of murine epidermal cells'', J. Immunol 130, 1586-1591.

27. Tucci A., James H., Chicheportiche R., Bonnefoy J.Y., Dayer J.M. i Zubler R.H., 1992, J. Immunol. 148, 2778-2784.

28. Ushio S., Namba M., Okura T., Hatorri K., Nukada Y., Akita K., Tanabe F., Konishi K., Micallef M., Fujii M., Torigoe K., Tanimoto T., Fukuda S., Ikeda M., Okamura H., Kurimoto M., J. Immunol., 1996, lipanj 1; 156(11):4274-9.

29. Yoshimoto T., Takeda K., Tanaka T., Ohkusu K., Kashiwamura S., Okamura H., Akira S. i Nakanishi K., (1998), J. Immunol 161, 3400-3407.

30. Xu i ostali, (1998), J. of Interferon and Cytokine Research 18:653-659.

Claims (27)

1. Upotreba IL-18BP inhibitora, naznačena time, da se koristi u proizvodnji lijeka za liječenje i/ili sprečavanje poremećaja preosjetljivosti.

2. Upotreba prema zahtjevu 1, naznačena time, da se poremećaj preosjetljivosti odabire iz skupine koja se sastoji od poremećaja s reakcijama preosjetljivosti tipa I, poremećaja s reakcijama preosjetljivosti tipa II, poremećaja s reakcijama preosjetljivosti tipa III ili poremećaja s reakcijama preosjetljivosti tipa IV.

3. Upotreba prema zahtjevu 2, naznačena time, da je poremećaj preosjetljivosti odgođen tip preosjetljivosti.

4. Upotreba prema zahtjevu 2 ili 3, naznačena time, da je poremećaj preosjetljivosti kontaktna preosjetljivost.

5. Upotreba prema bilo kojem od zahtjeva 1-4, naznačena time, da se inhibitor IL-18 odabire iz inhibitora kaspaze-1 (ICE), antitijela protiv IL-18, antitijela protiv bilo kojih podjedinica IL-18 receptora, inhibitora signalizirajućeg puta IL-18, antagonista IL-18 koji konkuriraju IL-18 i blokiraju IL-18 receptor, te IL-18 veznih proteina, njihovih izoforma, muteina, spojenih proteina, funkcionalnih derivata, aktivnih frakcija, cirkularno zamijenjenih derivata ili soli.

6. Upotreba prema zahtjevu 5, naznačena time, da je inhibitor IL-18 IL-18 antitijelo.

7. Upotreba prema zahtjevu 6, naznačena time, da IL-18 antijelo humanizirano IL-18 antitijelo.

8. Upotreba prema zahtjevu 7, naznačena time, da je IL-18 antitijelo humano IL-18 antitijelo.

9. Upotreba prema zahtjevu 5, naznačena time, da je inhibitor IL-18 IL-18 vezni protein ili njegov izoform, mutein, spojeni protein, finkcionalni derivat, aktivna frakcija, cirkularno zamijenjeni derivat ili sol.

10. Upotreba prema zahtjevu 9, naznačena time, da je inhibitor IL-18 spojeni protein koji obuhvaća imunoglobulinsko spajanje pri čemu se spojeni proten veže na IL-18.

11. Upotreba prema bilo kojem od zahtjeva 5-10, naznačena time, da fukcionalni ekvivalent obuhvaća najmanje jedan dio koji je vezan na jednu ili više funkcionalnih skupina koje se pak javljaju kao jedan ili više ogranaka na aminokiselinskim ostacima.

12. Upotreba prema zahtjevu 11, naznačena time, da je dio polietilen-glikolski (PEG) dio.

13. Upotreba prema bilo kojem od prethodnih zahtjeva, naznačena time, da lijek sadrži i interferon za istovremenu, naknadnu ili odvojenu upotrebu.

14. Upotreba prema zahtjevu 14, naznačena time, da je interferon interferon-β.

15. Upotreba prema bilo kojem od prethodnih zahtjeva, naznačena time, da lijek sadrži i inhibotor tumorskog nekroznog faktora (TNF) za istovremenu, naknadnu ili odvojenu upotrebu.

16. Upotreba prema zahtjevu 15, naznačena time, da je inhibitor TNF TBP I i/ili TBP II.

17. Upotreba prema bilo kojem od prethodnih zahtjeva, naznačena time, da lijek sadrži i protuupalni agens za istovremenu, naknadnu ili odvojenu upotrebu.

18. Upotreba prema zahtjevu 17, naznačena time, da je protuupalni agens COX-inhibitor.

19. Upotreba prema bilo kojem od prethodnih zahtjeva, naznačena time, da lijek sadrži i protualergijski agens za istovremenu, naknadnu ili odvojenu upotrebu.

20. Upotreba prema bilo kojem od prethodnih zahtjeva, naznačena time, da se koristi inhibitor IL-18 u količini od oko 0,001 do 1000 mg/kg tjelesne težine, oko 0,01 do 100 mg/kg tjelesne težine, oko 0,1 do 10 mg/kg tjelesne težine ili oko 5 mg/kg tjelesne težine.

21. Upotreba prema bilo kojem od prethodnih zahtjeva, naznačena time, da se IL-18 inhibitor primjenjuje potkožno.

22. Upotreba prema bilo kojem od prethodnih zahtjeva, naznačena time, da se IL-18 inhibitor primjenjuje intramuskularno.

23. Upotreba prema bilo kojem od prethodnih zahtjeva, naznačena time, da se IL-18 inhibitor primjenjuje lokalno.

24. Upotreba ekspresijskog vektora koji sadrži kodirajući slijed inhibitora IL-18, naznačena time, da se koristi u proizvodnji lijeka za liječenje i/ili sprečavanje poremećaja preosjetljivosti.

25. Upotreba vektora za izazivanje i/ili pojačavanja endogenog stvaranja inhibitora IL-18 u stanicama, naznačena time, da se koristi u proizvodnji lijeka za liječenje i/ili sprečavanje poremećaja preosjetljivosti.

26. Upotreba stanice koja je genetski modificirana za dobivanje inhibitora IL-18, naznačena time, da se koristi u proizvodnji lijeka za liječenje i/ili sprečavanje poremećaja preosjetljivosti.

27. Metoda za liječenje i/ili sprečavanje alergijskih poremećaja, naznačena time, da obuhvaća primjenu djelotvorne inhibicijske količine IL-18 inhibitora na pacijentu kojemu je to potrebno.