FR3082123A1

FR3082123A1 - Pansement cellularise et son procede de fabrication

Info

Publication number: FR3082123A1
Application number: FR1854944A
Authority: FR
Inventors: Delphine Fayol; Fabien Guillemot; Catherine Van Der Mee; Christelle Laurensou
Original assignee: Urgo Recherche Innovation et Developpement; Poietis SAS
Current assignee: Urgo Recherche Innovation et Developpement; Poietis SAS
Priority date: 2018-06-07
Filing date: 2018-06-07
Publication date: 2019-12-13
Anticipated expiration: 2038-06-07
Also published as: EP3801652A1; FR3082123B1; WO2019234365A1; US20210220510A1

Abstract

La présente invention a trait à un pansement cellularisé et au procédé de fabrication d'un tel pansement, ce procédé comprenant de préférence une étape de bio-impression de cellules.

Description

PANSEMENT CELLULARISE ET SON PROCEDE DE FABRICATION

La présente invention a trait à un pansement cellularisé et au procédé de fabrication d’un tel pansement, ce procédé comprenant de préférence une étape de bio-impression de cellules.

Les pansements cellularisés ou substituts cutanés sont connus et commercialisés depuis longtemps. L’avantage des pansements cellularisés réside dans le fait que l’apport exogène de cellules vivantes participe à la cicatrisation de la plaie. Les cellules apportées par le pansement participent directement ou indirectement (via la sécrétion de facteurs) au processus de cicatrisation.

De tels pansements se présentent généralement sous la forme d’au moins un matériau résorbable (i.e. au moins un matériau naturellement présent dans l’environnement cellulaire). A titre d’exemple, on peut citer les produits GRAFIX®, commercialisés par la société OSIRIS. Ces produits sont composés d’une membrane placentaire contenant une matrice extracellulaire (MEC) riche en collagène, de facteurs de croissances, de fibroblastes, de cellules souches mésenchymateuses et de cellules épithéliales. On peut également citer le produit APLIGRAF®, commercialisé par Organogenesis, composé de kératinocytes, de fibroblastes et de collagène bovin. Le produit DERMAGRAFT®, commercialisé par la société Advanced Biohealing, contient quant à lui des dérivés dermiques et des fibroblastes humains.

De tels pansements cellularisés, bien que présentant une efficacité prouvée sur la cicatrisation, présentent toutefois des risques de transmission de virus tels que, par exemple, les prions (en particulier pour les pansements cellularisés contenant des composés d’origine animale).

Par ailleurs, dans un pansement cellularisé, la densité cellulaire, la zone de localisation des cellules ou la répartition homogène des cellules sont des paramètres mal contrôlés.

Il existe donc un besoin pour de nouveaux pansements cellularisés ne présentant pas les inconvénients de l’art antérieur.

L’impression de cellules, encore appelée bio-impression, directement sur des matériaux bio-résorbables afin de reconstituer un derme ou un épiderme est connue et décrit dans la demande de brevet WO2016/115034 de Wake Forest University ou dans la demande de brevet W020160/073782 d’Organovo. Ces demandes de brevet portent sur l’impression de cellules et de composants extracellulaires (tels que par exemple le collagène, l’acide hyaluronique, ...) pour fabriquer de la peau ex vivo. Les matériaux ou substrats sur lesquels les cellules sont imprimées sont des matériaux utilisés de manière classique dans les cultures cellulaires (hydrogels contenant du collagène, hyaluronane, polyéthylène glycol...).

Les biomatériaux et l’ingénierie tissulaire sont également connus pour remplacer une partie ou une fonction d’un organe ou d’un tissu.

Les biomatériaux sont des matériaux, synthétiques ou vivants, utilisables à des fins médicales pour remplacer une partie ou une fonction d’un organe ou d’un tissu. Lesdits biomatériaux doivent respecter plusieurs obligations :

être bien tolérés par le receveur, c’est à dire ne pas provoquer d’infection, d’inflammation, d’allergie, voire de réaction de rejet s’il s’agit de matériel vivant ; ne pas contenir de substance toxique, comme des perturbateurs endocriniens ou des agents cancérigènes ;

répondre à des contraintes mécaniques pour s’adapter aux pressions exercées par l’environnement (la pression sanguine pour les prothèses vasculaires, des millions d’ouvertures et fermetures pour une valve cardiaque, le poids du corps pour des prothèses de hanche ou de genou, ...) ;

pouvoir être mis en forme, être implantables ou injectables, dégradables (résorbables) ou non suivant le cas, éventuellement poreux s’ils doivent être colonisés une fois implantés, ....

L’ingénierie tissulaire consiste quant à elle à la fabrication d’un tissu par multiplication des cellules autour d'une matrice ou d’un échafaudage (type « scaffold »). La réalisation concrète se heurte cependant à divers problèmes. Par exemple, dans un environnement artificiel les cellules ont tendance à perdre leur aptitude à se différencier. De plus les cellules expriment parfois des protéines atypiques qui, après implantation, peuvent occasionner des inflammations ou des réactions de rejet.

L’utilisation à des fins thérapeutiques de matériaux non résorbables comprenant des cellules est donc décrite dans l’art antérieur (par exemple dans le cas de la fabrication d’un tissu à l’aide d’une matrice « scaffold »). Néanmoins, lorsque cette matrice n’est pas résorbable elle est destinée à être maintenue en place au sein de l’organisme au moins pendant une longue durée, elle n’a pas vocation à être retirée. Il en est de même pour l’utilisation des biomatériaux non résorbables.

Au contraire, la présente invention concerne l’utilisation à des fins thérapeutiques de matériaux non résorbables (de préférence des matériaux synthétiques), mais lesdits matériaux ne sont pas destinés à remplacer une partie ou une fonction d’un organe ou d’un tissu. Us ne sont pas destinés à être maintenus en place au sein de l’organisme, ils ont vocation à être retirés après régénération de l’organe ou du tissu sur lequel ils ont été appliqués. Selon l’invention, les matériaux ont ainsi un rôle de pansement transitoire.

La bio-impression de cellules telle que décrite dans les demandes WO2016/115034 et W020160/073782 s’effectue sur des matériaux bio-résorbables. Des procédés de bioimpression sont également décrits dans les demandes WO2011/107599, WO2016/097619 et WO2016/097620. Ces demandes décrivent notamment que la bio-impression peut être utilisée pour produire des tissus (par exemple des tissus implantables pour la médecine régénératrice).

La bio-impression sur des matériaux non résorbables destinés à être utilisés de façon transitoire n’est donc pas décrite dans l’art antérieur.

Dans le cadre de la présente invention on vient ainsi imprimer des cellules sur des matériaux non résorbables. Lesdits matériaux sont utilisés comme pansements. De tels matériaux ne sont pas naturellement présents dans l’environnement cellulaire et ne sont pas habituellement utilisés en culture cellulaire. De façon surprenante les inventeurs ont constaté que les cellules bio-imprimées sur de tels matériaux étaient non seulement viables, capables de proliférer, mais étaient également capables de migration. L’avantage d’une telle impression ou bio-impression est qu’il est possible de personnaliser ou d’adapter à chaque patient et à chaque plaie le pansement, permettant ainsi un traitement sur mesure afin d’optimiser la cicatrisation des plaies. Ainsi, en fonction de la phase de cicatrisation dans laquelle se trouve la plaie, il est possible d’intégrer des cellules du derme et des cellules de l’épiderme ou seulement un de ces deux types cellulaires. On peut également, au sein d’un même pansement, faire varier la densité cellulaire d’un endroit à l’autre afin d’optimiser le traitement selon la morphologie de la plaie. Par ailleurs, les pansements cellularisés selon la présente invention permettent d’éviter les risques de transmission de virus, notamment parce qu’ils ne contiennent pas de composés d’origine animale. La bio-impression permet également de localiser précisément sur le pansement une zone sur laquelle les cellules seront présentes à une concentration contrôlée. Pour les pansements qui présentent des fibres quadrillées, les cellules peuvent être imprimées spécifiquement sur le quadrillage, ou en dehors du quadrillage. La précision de cette technique est de l’ordre de la dizaine de pm. La densité cellulaire, la zone de localisation des cellules et/ou la répartition homogène des cellules sont ainsi mieux contrôlés dans les pansements selon l’invention par rapport aux pansements cellularisés de l’art antérieur.

Dans un premier aspect l’invention concerne ainsi un pansement cellularisé destiné à être appliqué de façon transitoire sur une plaie, ledit pansement comprenant des cellules sur un matériau non résorbable.

Aux fins de la présente invention, par « pansement cellularisé », on entend que le pansement comprend des cellules.

Selon l’invention, l’expression « destiné à être appliqué de façon transitoire sur une plaie » signifie que les pansements sont destinés à être retirés de la plaie. Les pansements selon l’invention ont en effet un rôle protecteur et sont destinés à être retirés une fois que l’organe ou le tissu de la plaie s’est régénéré. Les pansements selon l’invention ne se résorbent pas, et ils ne sont pas destinés à être maintenus en place pendant une longue durée (plusieurs jours ou plusieurs semaines). Avantageusement le pansement recouvre tout ou partie de la plaie, de préférence toute la plaie.

Aux fins de la présente invention, par « matériau non résorbable », on entend que le matériau ne s’élimine pas progressivement au sein de la plaie, à la différence des matériaux résorbables qui eux se décomposent naturellement. Le retrait/la dégradation d’un matériau non résorbable nécessite donc une action physique/mécanique, au contraire de la dégradation d’un matériau résorbable.

Ledit matériau non résorbable présente avantageusement les propriétés suivantes : (1) il permet l’absorption des exsudais, (2) il peut subir un changement dimensionnel (par la gélification ou la déformation liée à l’absorption), (3) il n’adhère pas aux tissus, (4) il est, de préférence, partiellement hydrophile à l’état hydraté, (5) il présente une glissance à l’état hydraté, et (6) il n’est pas cytotoxique. Selon l’invention, la « glissance à l’état hydraté » signifie que le matériau a un état de surface qui ne permet pas aux cellules d’adhérer sur celuici mais qui les maintient néanmoins en vie.

Avantageusement, ledit matériau non résorbable est choisi parmi :

un pansement interface, un pansement absorbant, ou une mousse hydrophile de polyuréthane.

A titre d’exemple, un pansement interface est tel que décrit dans la demande de brevet EP2793773, c’est-à-dire un pansement interface adhérent comprenant : (i) un gel cohésif non adhérent formé d'une matrice élastomérique hydrophobe constituée d'un élastomère tribloc du type styrène - (éthylène - butylène ) - styrène ou styrène (éthylène - propylène) - styrène éventuellement associé à un copolymère dibloc du type styrène - (éthylène - butylène) ou styrène - (éthylène-propylène), ledit élastomère étant fortement plastifié au moyen d'une huile minérale, et contenant en dispersion une faible quantité de particules hydrophiles d'un hydrocolloïde, et (ii) un tissu flexible à mailles ouvertes, ledit tissu comprenant des fils qui sont enrobés par le gel cohésif non adhérent de façon à laisser les mailles essentiellement non obturées, caractérisé en ce que le tissu est un tricot thermofixé avec fils tramés, lesdits fils étant des fils continus à filaments non élastiques, qui présente dans le sens transversal une extensibilité mesurée selon la norme EN 13726-4 comprise entre 0,01 et 0,5 N/cm. Selon un mode de réalisation préféré, ledit gel cohésif non adhérent est formé d'une matrice élastomérique hydrophobe comprenant, pour 100 parties en poids d'élastomère choisi parmi un élastomère tribloc du type styrène - (éthylène - butylène) - styrène ou styrène (éthylène propylène) - styrène éventuellement associé à un copolymère dibloc du type styrène (éthylène - butylène) ou styrène - (éthylène-propylène), 1 000 à 2 000 parties en poids d'une huile de paraffine, et contenant en dispersion de 2 à 20 % en poids, rapporté au poids total de la matrice élastomérique, de particules hydrophiles d'un hydrocolloïde.

A titre d’exemple, un pansement absorbant est tel que décrit dans la demande de brevet EP2696828, c’est-à-dire un pansement absorbant adhésif comportant un non tissé absorbant (6) et un support de protection imperméable aux fluides et perméable à la vapeur d'eau (4), caractérisé en ce que : (i) le support est constitué par l'assemblage d'un film continu (4a) et d'une armature ajourée enduite, sur au moins une de ses faces, de gel de silicone adhésif (4b), sans obturer les ouvertures de l'armature, ladite armature recouvrant l'intégralité de la surface du film, (ii) en ce que ledit pansement comprend en outre un voile non absorbant (5) et un non tissé complémentaire (7) lesquels sont fixés l'un à l'autre sur leur périphérie en enveloppant ledit non tissé absorbant, de préférence sans point de fixation avec ce dernier, et (iii) en ce que ledit voile non absorbant (5) colle au gel de silicone adhésif (4b) enduit sur ladite armature.

Selon un mode de réalisation de l’invention, les cellules présentes au sein du pansement sont des cellules adhérentes à un substrat (par exemple le polystyrène dans une boite ou une flasque de culture). Elles sont notamment choisies parmi les cellules du derme ou de l’épiderme. Elles sont notamment choisies parmi les cellules de type fibroblaste et/ou les cellules de type épithélial. Avantageusement les cellules sont choisies parmi les fibroblastes et/ou les kératinocytes, notamment les fibroblastes primaires et/ou les kératinocytes primaires. De façon encore plus avantageuse, les cellules sont choisies parmi les fibroblastes dermiques primaires et/ou les kératinocytes épidermiques primaires. Le terme « fibroblastes » fait référence à des cellules en forme de fuseau nu, de forme irrégulière, qui sont responsables de la formation des fibres. Dans les cultures de cellules, de nombreux autres types cellulaires, ne peuvent être, sur le plan morphologique, distingués des fibroblastes. Dans les cultures d'organes et de tissus dans lesquelles les rapports entre cellules sont conservés, il est possible d’identifier les fibroblastes à l'aide de critères histologiques acceptés. Le terme « cellules épithéliales » fait référence à des cellules opposées les unes aux autres qui forment un tissu continu semblable à de la mosaïque avec très peu de substances intercellulaires comme il est possible d’en voir dans des cultures in vitro, de tissus ou d’organes. Le terme « cellules de type fibroblaste » fait référence aux cellules qui sont attachées à un substrat et qui apparaissent allongées et bipolaires. Dans les cultures cellulaires, divers types cellulaires présentent des morphologies similaires. Les cellules qui prennent des formes irrégulières ou des formes de fuseaux sont souvent qualifiées de fibroblastes. Le terme « cellules de type épithélial » fait référence aux cellules qui sont attachées à un substrat et qui apparaissent plates et de forme polygonale. Dans les cultures de cellules, les cellules épithéliales peuvent prendre diverses formes mais ont tendance à se constituer en tissu de cellules polygonales serrées.

Selon un mode de réalisation de l’invention, dans ledit pansement, les cellules sont (ou ont été préalablement) bio-imprimées sur ledit matériau non résorbable. Certains pansements ont la propriété de ne pas adhérer aux plaies, et les cellules n’adhèrent pas aux matériaux généralement utilisés dans les pansements. Il est donc compliqué de faire vivre des cellules à la surface de ce type de pansement puisque les cellules ne pourront pas y adhérer. Un des avantages de la bio-impression est qu’elle permet d’imprimer les cellules à la surface de ce type de pansement, et de les y maintenir jusqu’au transfert du pansement sur la plaie. A titre d’exemple, les demandes WO2016/115034, W020160/073782 WO2011/107599, WO2016/097619 et WO2016/097620 décrivent des procédés de bio-impression qui peuvent être utilisés pour bio-imprimer un pansement selon l’invention.

Selon un mode de réalisation de l’invention, ledit pansement est saturé en liquide jusqu’à 90% de sa capacité d’absorption. De préférence, ledit pansement est saturé en liquide à une teneur comprise entre au moins 50% de sa capacité d’absorption, de préférence au moins 80%, et jusqu’à 90% de sa capacité d’absorption. Selon l’invention, «entre au moins

50% et jusqu’à 90% » s’entend de toutes les valeurs comprises entre 50% et 90%, et notamment 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85% et 90%. Le pansement selon l’invention doit également assurer les fonctions d’absorption ou de gélification des exsudais. Lors de l’ajout des cellules sur le matériau non résorbable ou lors de la bio-impression des cellules, seuls quelques picolitres d’encre cellulaire sont déposés ou imprimés. Les cellules doivent être dans un environnement saturé en humidité voir liquide pour pouvoir survivre et croître. Il faut donc pouvoir maintenir une certaine viabilité cellulaire, tout en permettant au pansement d’assurer ces fonctions. Il est donc important de trouver un équilibre entre l’absorption ou la gélification des exsudats par le pansement, et la survie cellulaire. De préférence, le pansement devra donc être suffisamment hydraté (mais non à saturation) pour que les cellules à sa surface survivent, et ainsi faciliter la cicatrisation. Les inventeurs ont constaté que le pansement selon la présente invention répondait particulièrement à cet équilibre lorsque le pansement est saturé en liquide à 90% de sa capacité d’absorption. La capacité d’absorption du pansement est mesurée selon la norme NF EN 13726-1.

Selon un mode de réalisation de l’invention, ledit pansement comprend une concentration de cellules comprise entre 50 et 30 000 cellules/cm², de préférence entre 200 et 20 000 cellules par cm².

Selon un mode de réalisation de l’invention, ledit pansement comprend en outre un actif, de préférence un actif ayant un rôle favorable dans le traitement des plaies. Avantageusement, ledit actif est choisi parmi un antiseptique, un antibactérien, un antibiotique, un antidouleur, un anti-inflammatoire, un anesthésique ou un composé qui favorise la cicatrisation de la plaie. A titre d’exemple, les antibactériens/antibiotiques peuvent être les dérivés d'argent tels que les sels d'argent ou d'autres métaux (par exemple le sulfate, le chlorure ou le nitrate d'argent et la sulfadiazine argentique), les complexes d'argent ou d'autres métaux (par exemple les zéolithes argent tel que l'alphasan, ou les céramiques), le métrodinazole, la néomycine, le Polymyxine B, les pénicillines (Amoxycilline), l'acide clavulanique, les tétracyclines, la Minocycline, la chlorotétracycline, les aminoglycosides, l'Amikacine, la Gentamicine ou les probiotiques. Les antiseptiques peuvent être la chlorhexidine, le triclosan, le biguanide, l'hexamidine, le thymol, le Lugol, la Povidone iodée, le Chlorure de Benzalkonium et de Benzéthonium. Les antidouleurs peuvent être le Paracétamol, la Codéine, le Dextropropoxyphène, le Tramadol, la Morphine et ses dérivés, les Corticoïdes et dérivés. Les anti-inflammatoires peuvent être les Glucocorticoïdes, les antiinflammatoires non stéroïdiens, l'Aspirine, l'Ibuprofène, le Kétoprofène, le Flurbiprofène, le Diclofénac, l'Acéclofénac, le Kétorolac, le Méloxicam, le Piroxicam, le Ténoxicam, le

Naproxène, l'indométacine, le Naproxcinod, le Nimésulide, le Célécoxib, l'Etoricoxib, le Parécoxib, le Rofécoxib, le Valdécoxib, la Phénylbutazone, l'acide niflumique, l'acide méfénamique. D’autres principes actifs favorisant la cicatrisation peuvent également être utilisés, par exemple le Rétinol, la Vitamine A, la Vitamine E, la N-acétyl-hydroxyproline, les extraits de Centella Asiatica, la papaïne, les huiles essentielles de thym, de niaouli, de romarin et de sauge, l'acide hyaluronique, les oligosaccharides polysulfatés et leurs sels (en particulier les oligosaccharides sulfatés synthétiques ayant 1 à 4 unités oses tels que le sel de potassium du sucrose octasulfaté ou le sel d'argent du sucrose octasulfaté), le sucralfate, l'Allantoïne, l'urée, la metformine, les enzymes (par exemple protéolitiques telles la streptokinase, la tripsine ou la collagénase), des peptides ou des inhibiteurs de protéases. Des anesthésiques tels que la benzocaine, la lidocaine, la dibucaïne, le chlorhydrate de pramoxine, la bupivacaïne, la mepivacaïne, la prilocaïne, ou l'étidocaïne peuvent également être utilisés.

Selon un mode de réalisation, l’invention concerne également un kit comprenant (a) un pansement selon l’invention et (b) un actif tel que mentionné ci-dessus.

Le pansement selon l’invention peut également comprendre tout autre matériau classiquement utilisé par l’homme du métier dans le domaine des pansements, par exemple au moins un sachet de protection ou une boîte de culture ou tout système permettant de faciliter sa manipulation et/ou son transfert.

Dans un deuxième aspect, l’invention concerne également le procédé de fabrication d’un pansement tel que défini ci-dessus. L’exemple 1 illustre un procédé permettant de fabriquer un pansement selon l’invention.

Dans un mode de réalisation, l’invention concerne ainsi procédé de fabrication d’un pansement cellularisé tel que défini ci-dessus, comprenant une étape de mise en contact des cellules avec un matériau non résorbable. Cette étape de mise en contact peut consister en une application directe des cellules avec le matériau non résorbable, une étape d’imprégnation ou une étape d’impression.

Selon un mode de réalisation préféré, l’étape de mise en contact est une étape de bioimpression de cellules sur ledit matériau non résorbable. En particulier, le procédé de fabrication porte sur l'impression de deux types cellulaires (fibroblastes primaires et kératinocytes primaires) sur trois matériaux : un pansement interface, un pansement absorbant, une mousse hydrophile de polyuréthane (HPU). L’étape de bio-impression est réalisée à l’aide d’une bio-encre comprenant les cellules à imprimer.

Selon un mode de réalisation préféré, la bio-impression de cellules est réalisée à partir d’une bio-encre dans laquelle les cellules sont en suspension ou sous forme d’agrégats. Avantageusement, ladite bio-encre consiste en un milieu de culture comprenant une concentration de cellules en suspension d’environ 0,1.10⁶ à 100.10⁶, de préférence 1.10⁶ à 80.10⁶. La bio-encore peut être préparée selon le protocole suivant : après une étape de culture cellulaire (par exemple dans des conditions classiques connues de l’homme du métier), les cellules destinées à être bio-imprimées sont récupérées, puis centrifugées (par exemple à 400g pendant 5 minutes). Le culot cellulaire est ensuite récupéré, puis suspendu dans un milieu de culture à une densité cellulaire de 70.10⁶ cellules/mL. La bio-encre peut également se présenter sous forme d’agrégats (ou micro-agrégats) cellulaires. Dans ce mode de réalisation, la concentration de cellules est supérieure à 100.10⁶ cellules/mL. Ces agrégats peuvent se présenter, par exemple, sous la forme de ceux décrits dans la demande de brevet WO2016/089825.

Avantageusement, lors de l’étape de bio-impression, ledit matériau non résorbable est humide ou sec, de préférence humide. De façon encore plus avantageuse, ledit matériau est humide ou sec lorsque l’étape de bio-impression est réalisée sur le pansement interface. Alternativement, ledit matériau est humide lorsque l’étape de bio-impression est réalisée sur le pansement absorbant ou sur la mousse hydrophile de polyuréthane.

Avant l’étape de bio-impression les pansements peuvent être préparés, notamment découpés dans des conditions stériles le cas échéant.

Eventuellement, avant l’étape de bio-impression, lesdits pansements peuvent être humidifiés à l’aide d’un milieu de culture (par exemple avec 1-2 mL de milieu de culture pour un pansement d’environ 1,5cm x 1,5cm), puis le cas échéant le milieu de culture en excès peut être absorbé. Avantageusement, lorsque le pansement interface est humidifié, il est préférable d’absorber le milieu de culture en excès avant l’étape de bio-impression.

Selon un mode de réalisation préféré, le procédé selon l’invention comprend les étapes suivantes :

optionnellement, une étape de culture cellulaire des cellules destinées à être bio-imprimées, optionnellement, une étape de préparation d’une bio-encre comprenant les cellules destinées à être bio-imprimées, optionnellement, une étape d’humidification de matériau non résorbable, à l’aide d’un milieu de culture, une étape de bio-impression de cellules sur ledit matériau non résorbable.

Selon un mode de réalisation préféré, ledit matériau non résorbable est bio-imprimé au niveau des fibres dudit matériau, à l’intersection des fibres dudit matériau et/ou au centre de chaque quadrille dudit matériau.

Dans un troisième aspect, l’invention concerne également l’utilisation d’un pansement tel que défini ci-dessus.

L’invention concerne ainsi une méthode de traitement d’une plaie chez un patient comprenant :

l’administration topique, sur la plaie destinée à être traitée, du pansement cellularisé tel que défini ci-dessus, optionnellement, le retrait dudit pansement.

Selon un mode de réalisation, ladite méthode peut également comprendre les étapes suivantes :

l’administration topique, sur la plaie destinée à être traitée, d’un premier pansement cellularisé tel que défini ci-dessus, le retrait du premier pansement, l’administration topique, sur la plaie destinée à être traitée, d’un second pansement cellularisé tel que défini ci-dessus, optionnellement, le retrait du second pansement.

L'invention sera mieux illustrée par les exemples et les figures suivantes. Les exemples ci-après visent à éclaircir l'objet de l'invention et à illustrer des modes de réalisation avantageux. Ces exemples ne visent pas à restreindre la portée de l'invention.

FIGURES

La Figure 1 représente le premier motif d’impression sur le pansement interface Urgotul® : les spots d'impression sont positionnés à l'intersection des fibres.

La Figure 2 représente le second motif d’impression sur le pansement interface Urgotul® : des spots d'impression sont ajoutés sur chacun des fibres.

La Figure 3 représente les spots d’impression du motif sur le pansement absorbant : les spots d’impression sont positionnés à l'intersection des fibres, sur les fibres elles-mêmes, et au centre de chaque quadrille.

La Figure 4 représente les résultats des impressions et des ensemencements témoins de fibroblastes primaires sur l'interface, le pansement absorbant et la mousse HPU, lorsque les pansements sont humides. *** signifie que p<0,001.

La Figure 5 représente les résultats des impressions et des ensemencements témoins de fibroblastes primaires sur l'interface, le pansement absorbant et la mousse HPU, lorsque les pansements sont secs. *** signifie que p<0,001.

La Figure 6 représente les résultats normalisés de la Figure 4, où a correspond aux résultats obtenus avec le pansement interface Urgotul®, b le pansement absorbant Urgotul Absorb® et c la mousse HPU. *** signifie que p<0,001.

La Figure 7 représente les résultats normalisés de la Figure 5, où « correspond aux résultats obtenus avec le pansement interface Urgotul®, b le pansement absorbant Urgotul Absorb® et c la mousse HPU. *** signifie que p<0,001.

La Figure 8 représente les résultats des impressions et des ensemencements témoins de kératinocytes primaires sur l'interface Urgotul® humide et la mousse HPU humide. * signifie que p<0,05.

La Figure 9 représente les résultats normalisés de la viabilité des kératinocytes dans laquelle a représente les résultats obtenus avec l’interface Urgotul® et b avec la mousse HPU. * signifie que p<0,05.

La Figure 10 représente les résultats d'immunomarquages du collagène I des fibroblastes imprimés sur l'interface (c, d) et la mousse HPU (e, f) humidifiés et de fibroblastes témoins au fond des puits de culture (a, b).

La Figure 11 représente les résultats d'immunomarquages de la fibronectine synthétisée par les fibroblastes imprimés sur l'interface (c, d) et la mousse HPU (e, f) humidifiés et par les fibroblastes témoins au fond des puits de culture (a, b).

La Figure 12 représente les résultats d'immunomarquages du collagène III synthétisé par les fibroblastes imprimés sur l'interface (c, d) et la mousse HPU (e, f) humidifiés et par les fibroblastes témoins au fond des puits de culture (a, b).

La Figure 13 représente les résultats d'immunomarquages de l'antigène Ki67 présent dans le noyau des fibroblastes prolifératifs imprimés sur l'interface (c, d) et la mousse HPU (e, f) humidifiés et par les fibroblastes prolifératifs témoins (a, b).

La Figure 14 représente le pourcentage de cellules marquées au Ki67.

La Figure 15 représente les résultats des impressions et des ensemencements témoins de kératinocytes primaires sur l'interface et la mousse HPU. * signifie que p<0,05.

La Figure 16 représente représente le nombre de jours qu'il a fallu aux kératinocytes pour migrer depuis les pansements (l'interface et la mousse HPU) sur lesquels ils ont été imprimés ou témoins.

La Figure 17 représente les résultats d'immunomarquages de l'antigène Ki67 présent dans le noyau des kératinocytes prolifératifs imprimés sur l'interface (c, d) et la mousse HPU (e, f) humidifiés et par les kératinocytes prolifératifs témoins (a, b).

La Figure 18 représente le tapis de kératinocytes à 100 % de confluence uniquement en-dessous du pansement, obtenu après 8 jours de migration depuis des échantillons de la mousse HPU.

EXEMPLES

Exemple 1 : Procédé de fabrication d’un pansement selon la présente invention

Les deux types cellulaires utilisés sont des fibroblastes dermiques primaires et des kératinocytes épidermiques primaires extraits à partir de prélèvements opératoires (plasties mammaires et prépuces).

1. Culture cellulaire

Le milieu de culture pour fibroblastes DMEM, est composé de 10% de sérum de veau fœtal, 1% d’antibiotiques : pénicilline, streptomycine, amphotéricine.

Le milieu de culture pour kératinocytes est le milieu CNT-PR commercialisé par la société CellnTec.

Les milieux de culture de ces deux types cellulaires sont changés tous les 2 à 3 jours.

2. Préparation de la bio-encre

Avant utilisation, les fibroblastes et les kératinocytes sont détachés de la flasque culture avec de la trypsine/EDTA 0,25% et du sérum de veau fœtal est ajouté après décollement des cellules pour arrêter la réaction enzymatique. Un comptage au bleu trypan est réalisé pour dénombrer la population et déterminer la viabilité cellulaire. Les cellules sont ensuite centrifugées à 400g pendant 5 minutes. L'encre d'impression est préparée en suspendant le culot cellulaire dans du milieu de culture à la densité de 70xl0⁶ cellules/mL.

3. Marquage en fluorescence des cellules

Les cellules sont éventuellement marquées avec un traceur cellulaire fluorescent, le CellTracker™ orange CMRA Dye (ThermoFischer Scientific, référence C34551) pour visualiser les cellules après impression. Dans ce cas, le culot cellulaire obtenu après trypsination est suspendu dans le traceur cellulaire CMRA et les cellules sont mises 15 minutes dans l'incubateur à 37°C, puis de nouveau centrifugées.

4. Préparation des pansements

Les trois pansements (le pansement interface Urgotul®, le pansement absorbant Urgotul Absorb® et la mousse HPU) sont découpés dans des conditions stériles, à l'aide d'un scalpel (environ 1,5cm x 1,5cm) et positionnés dans les puits de plaques de culture 12 puits. Dans le cas où les pansements sont humidifiés, ImL de milieu de culture est déposé sur l'interface Urgotul®, et 2mL est déposé sur le pansement absorbant Urgotul Absorb® et la mousse HPU qui sont plus épais. Au bout de 20 minutes, le milieu de culture est retiré de chacun des puits de culture contenant les pansements pour pouvoir positionner la plaque de culture pendant l'étape d'impression. Dans le cas de l'interface Urgotul®, il est préférable (et dans certains cas nécessaire) de déposer le pansement avant impression sur une compresse stérile pour que l’excès de milieu de culture entre les fibres quadrillées soit absorbé. En effet, si du milieu est encore présent entre le quadrillage de l'interface, le système d'imagerie détecte difficilement le pansement.

5. Ensemencement cellulaire

La bio-impression de cellules réalisée dans cet exemple utilise la modalité de bioimpression assistée par laser de l’imprimante telle que décrite dans les demandes de brevets WO2011/107599, WO2016/097619 et WO2016/097620. Ce procédé de bio-impression requiert la création préalable d'un fichier d'impression contenant l'ensemble des instructions à exécuter par la machine. Le motif (géométrie et espacement des points) fait partie des informations contenues dans ce fichier. La bio-encre est tout d'abord déposée sur une cartouche constituée d'une lame de verre recouverte d'une très fine couche d'or. Lors de l'impression, le faisceau laser traverse cette cartouche et atteint la zone de la bio-encre. Une cavité se forme et se propage pour finalement générer un jet qui provoque la formation d'une goutte de liquide et son dépôt sur le receveur. En se déplaçant sur la lame donneuse, le faisceau laser génère des gouttes qui se déposent sur le receveur selon un motif cellulaire prédéfini. Ce procédé de bio-impression assistée par laser s'appuie sur le phénomène physique d'interaction laser matière et implique de nombreux paramètres. Certains sont fixés lors de la conception de la machine (comme par exemple la longueur d'onde du laser), d'autres peuvent être ajustés par l'opérateur en fonction des conditions d'impression (comme par exemple l’énergie du laser).

Dans cet exemple, les paramètres ajustables du tableau 1 ci-dessous ont été maintenus à valeur fixe. Le motif a ainsi été l'unique paramètre variable au cours de la bioimpression. Ce motif était créé à partir de l'image du substrat receveur et personnalisé en fonction des caractéristiques géométriques du support. Il était ainsi possible d'imprimer spécifiquement sur le quadrillage de l'interface et du pansement absorbant.

Énergie	Durée d'impulsion	Concentration cellulaire dans la bio-encre	Distance au plan focal	Épaisseur de la couche de bio-encre	Distance donneur /receveur	Volume d'encre déposé sur la lame donneuse
30pJ	200ns(T8)	70 million de cellules/mL	-100 pm	45 pm	500pm	Entre 8 et 8,5pL

Tableau 1 : Les paramètres d'impression fixes lors de l’étape de bio-impression réalisée dans les exemples

Système d'imagerie et un outil logiciel

Un système d'imagerie et un outil logiciel ont été mis au point afin de créer de manière automatisée des motifs d'impression personnalisés en fonction du quadrillage observable sur les matériaux pansement. Cet outil permet de faire correspondre les quadrillages observables sur les pansements (interface Urgotul® et pansement absorbant Urgotul Absorb®) avec les zones d'impression. Il est également possible de varier la densité cellulaire par fibre en modulant l'espacement entre les spots d'impression.

Deux motifs ont été choisis pour l'interface Urgotul®. Sur le premier, les spots d'impression sont positionnés à l'intersection des fibres (Figure 1). Ue second motif est créé en y ajoutant des spots sur chacune des fibres (Figure 2). Pour le pansement absorbant, les spots du motif sont localisés à l'intersection des fibres, sur les fibres elles- mêmes, et au centre de chaque quadrille (Figure 3).

Ue pansement est déposé au fond d'un puits d'une plaque de culture (plaque 12 puits). Puis, le système d'imagerie réalise une acquisition et une reconstruction d'image de manière à restituer la totalité de la surface du matériau (12 photos au total). Uors de la seconde étape, le logiciel binarise l'image obtenue dans la première étape en détectant les zones sombres et les zones claires. Après binarisation, les creux (=centres des quadrillages) apparaissent en noir et les pleins (=fibres), en blanc. Les coordonnées des centres des zones sombres sont ensuite calculées. Ces points se trouvent sur une fibre. En itérant de manière analogue avec les points calculés, il est possible de créer des motifs avec une densité de point par fibre variable. Le motif produit par l'algorithme peut alors être chargé dans le logiciel de l'imprimante afin de l'utiliser comme patron pour l'impression des cellules.

Le logiciel d'imagerie doit remplir deux objectifs pour être validé.

Dans un premier temps, le calcul doit engendrer un bon positionnement des points sur le pansement, afin de reproduire le motif désiré. Cet objectif a été rempli lors du développement du logiciel. L'imagerie du pansement interface permet de générer des images avec un contraste plus important qu'avec le pansement absorbant. Un contraste insuffisant est source d'erreurs dans le calcul du positionnement des points, ce qui est le cas avec le pansement absorbant. Une solution intermédiaire a été trouvée : une fonction de correction de motif a été ajoutée au logiciel. Elle permet de supprimer ou d'ajouter manuellement des points et donc de corriger au cas par cas des erreurs dans le calcul du motif.

Dans un second temps, il faut valider le bon positionnement des gouttes bio-imprimées sur le support pansement. Pour être certains de visualiser correctement le résultat de l'impression, ce sont des fibroblastes primaires et des kératinocytes primaires marqués avec traceur fluorescent dans l'orange qui ont été imprimés à la place de l'hydrogel initialement prévu. Les motifs de kératinocytes imprimés sur l'interface à l'aide du logiciel permet de positionner spécifiquement les spots cellulaires sur les fibres de l'interface. Quel que soit le type cellulaire imprimé, le logiciel laisse le choix quant au motif à utiliser. Par exemple, les spots cellulaires peuvent être positionnés automatiquement à l’intersection de chaque fibre du pansement, ou alors l’utilisateur peut positionner lui-même les spots cellulaires à une distance prédéfinie (300-500-800pm...). Dans cet exemple, le motif imprimé sur la mousse HPU est un carré de 1cm² avec un espacement entre les spots cellulaires (kératinocytes ou fibroblastes) de 200pm.

Exemple 2 : Test de viabilité cellulaire

Avant impression, les pansements sont soit secs, soit humidifiés. Lors de l'ensemencement des témoins, 30 000 cellules sont déposées sur chacun des pansements dans 7,5pL de milieu de culture. Immédiatement après impression ou dépôt à la pipette (pour les témoins) des cellules, les pansements sont immergés dans 2 mL de milieu de culture et sont « flushés » (afin de récupérer le maximum de cellules sur les matériaux, des « flush » successifs sont réalisés à l'aide d'une pipette). Les cellules sont ensuite marquées et comptées sur cellule de Malassez. Le marquage est réalisé sur les cellules directement après l'impression. Les cellules sont laissées en culture (post-impression) minimum 24 heures avant de faire le test de viabilité cellulaire. Les kératinocytes ou les fibroblastes en solution sont alors ensemencés dans un nouveau puits de culture et sont mis dans un incubateur à 37°C et 5 % de CO2. Au bout de 24 heures, le milieu de culture est retiré et les cellules sont marquées avec la solution de calcéine et d'éthidium. Le pourcentage de viabilité cellulaire est calculé après avoir compté le nombre de cellules vivantes et de cellules mortes dans 6 zones par puits de culture.

Dans un premier temps la technique de « live dead » est réalisée sur les fibroblastes primaires imprimés ou témoins sur l'interface Urgotul®, le pansement absorbant Urgotul Absorb® et la mousse HPU sec et humide. La technique de « live dead » permet de distinguer les cellules vivantes des cellules mortes au sein d'une même culture. L’activité estérase intracellulaire ubiquitaire et la présence d’une membrane plasmique intacte sont les caractéristiques des cellules vivantes. Ces cellules transforment le colorant non fluorescent l’acétoxyméthyl calcéine (AM) en calcéine fluorescent (vert). Les cellules mortes sont caractérisées par une perte de l'intégrité de leur membrane plasmique. L’homodimer-1 d’éthidium (EthD-1) pénètre dans ces cellules et se lie aux acides nucléiques ce qui a pour conséquence la présence de fluorescence rouge.

Dans un second temps, la viabilité cellulaire a été étudiée sur les kératinocytes primaires imprimés ou témoins sur l'interface Urgotul® et sur la mousse HPU humides.

Le test statistique utilisé pour analyser les résultats de comptage de la viabilité cellulaire, est un test de Student dont la valeur de a est de 0,05.

A. Résultat de la viabilité des fibroblastes

Les résultats des impressions et des ensemencements témoins de fibroblastes primaires sur l'interface, le pansement absorbant et la mousse HPU sont représentés à la Figure 4 (avec des pansements humides) et Figure 5 (avec des pansements secs). Les résultats normalisés sont présentés dans les Figures 6 et 7 ou a correspond aux résultats obtenus avec le pansement interface Urgotul®, b le pansement absorbant Urgotul Absorb® et c la mousse HPU.

Lorsque les fibroblastes sont imprimés sur l'interface, le pansement absorbant et la mousse HPU humidifiés, la viabilité des fibroblastes est supérieure à 94%, et également très proche de celle des cellules témoins. Les fibroblastes imprimés et témoins sur ces 3 pansements humides restent viables. La faible valeur des écarts-types prouve que ces résultats sont reproductibles.

En revanche, les résultats de viabilités des impressions sur les pansements secs sont très variables mis à part avec l'interface Urgotul®. La viabilité des cellules imprimées ou témoins sur l'interface sec est proche des résultats sur l'interface humide. Les cellules restent donc viables après impression sur l'interface Urgotul® humide ou sèche. Les cellules témoins sur le pansement absorbant Urgotul Absorb® sec et la mousse HPU sèche donnent des résultats de viabilité comparables aux résultats sur ces même pansements mais humides. Les résultats de viabilité des fibroblastes imprimés sur le pansement absorbant Urgotul Absorb® sont d'une grande variabilité. Le résultat est de 57%±46%. Enfin, les cellules imprimées sur la mousse HPU sèche ont une viabilité cellulaire de 36%. Un peu plus de la moitié des cellules meurent après leur impression sur ce pansement sec par rapport à ce même pansement humide. Généralement, les cellules supportent mal les environnements et les supports d'impression secs, ce qui peut expliquer cette différence de viabilité cellulaire.

B. Résultat de la viabilité des kératinocytes

Les résultats des impressions et des ensemencements témoins de kératinocytes primaires sur l'interface Urgotul® humide et la mousse HPU humide sont représentés à la Figure 8. La Figure 9 présente les résultats normalisés de la viabilité des kératinocytes dans laquelle a représente les résultats obtenus avec l’interface Urgotul® et b avec la mousse HPU.

Les cellules imprimées sur l'interface Urgotul® humide ont une viabilité proche de celle des cellules témoins sur l'interface, avec environ 70%±7% de viabilité. Les viabilités entre les cellules témoins et les cellules imprimées étant proches, l'impression sur ce support n'est donc pas la cause des 30% de cellules mortes.

Le pourcentage de viabilité des impressions de kératinocytes primaires sur la mousse HPU humide est de 81%±6%. Les cellules témoins sur ce même pansement ont un pourcentage de viabilité de 90%±7%. La différence entre ces deux valeurs est significative.

La normalisation des résultats montre que la viabilité des kératinocytes imprimés sur l'interface Urgotul® et sur la mousse HPU sont très proches de la viabilité des témoins.

Exemple 3 : Test de migration cellulaire

Avant impression les pansements sont soit secs, soit humidifiés. Les cellules témoins sont ensemencées sur les pansements, avec 30 000 cellules dans 7,5 pL de milieu de culture. Après l'étape d'impression et de dépôt à la pipette (témoins) des cellules, les pansements sont conservés soit 30 minutes soit 3 heures dans un incubateur à 37°C et 5% de CO2. Cette période est appelée la durée de conservation. Chaque pansement est, par la suite, retourné (face imprimée contre le puits de culture) et immergé dans 2 mL de milieu de culture. Un anneau en inox est déposé sur chaque pansement pour ne pas qu'il flotte. Le milieu de culture est changé tous les 2 à 3 jours. Les pansements sont maintenus en culture 4 jours pour les fibroblastes primaires et 8 jours pour les kératinocytes primaires (temps de migration nécessaire pour arriver à 50% de confluence), pour pouvoir par la suite marquer et immunomarquer les cellules qui ont migrées depuis les pansements sur la surface en plastique des puits de culture. Les conditions testées avec des pansements humides sont les même qu'avec les pansements secs.

A. Résultats sur la migration des fibroblastes

Aucune migration des fibroblastes imprimés n'est observée depuis l'interface Urgotul® humide alors que les fibroblastes témoins migrent au bout de seulement un jour.

Il faut 4 et 9 jours aux fibroblastes imprimés pour migrer depuis les pansements absorbants Urgotul Absorb® humide après un temps d’attente de 30 minutes ou de 3 heures post impression. Les cellules témoins sur ce pansement humide mettent un temps comparable pour migrer : 4 jours et 5 jours avec un temps d’attente respectivement de 30 minutes et de 3 heures post-impression.

Il ne faut qu'un jour aux fibroblastes imprimés et témoins pour migrer depuis la mousse HPU humide avec un temps de conservation de 30 minutes. Enfin, lorsque ce temps de conservation s'allonge à 3 heures, les fibroblastes témoins mettent 5 jours pour migrer et aucune migration n'est observée depuis les pansements sur lesquels les fibroblastes ont été imprimés.

Les fibroblastes témoins mettent globalement plus de temps à migrer depuis l'interface Urgotul®, le pansement absorbant Urgotul Absorb® et la mousse HPU humides si le temps de conservation est de 3 heures. Ce résultat semble similaire sur le pansement absorbant Urgotul Absorb® et la mousse HPU lorsque les fibroblastes ont été imprimés. Us mettent presque deux fois plus de temps à migrer depuis le pansement absorbant et ils ne migrent pas depuis la mousse HPU. Le temps de conservation de 30 minutes semble donc plus adapté aux cellules imprimées sur les pansements humides.

Aucune migration n'est observée depuis l'interface Urgotul®, le pansement absorbant Urgotul Absorb® et la mousse HPU secs lorsque le temps de conservation est de 3 heures alors que les fibroblastes imprimés et témoins migrent depuis tous les pansements secs lorsque le temps de conservation est de 30 minutes. Ce temps de conservation peut être augmenté (au-delà de 30 minutes) en utilisant un volume d'ensemencement plus important (7,5pL<V<lmL), tout en restant inférieur au volume d'hydratation à saturation pour que le pansement cellularisé puisse toujours jouer son rôle d'absorption des exsudais de la plaie.

Le temps de migration des fibroblastes bio-imprimés a été étudié depuis l'interface Urgotul®, et la mousse HPU humides, après un temps de conservation de 30 minutes. Des résultats complémentaires ont ainsi été acquis sur 30 échantillons par condition. Pour chaque échantillon, on observe sur une période de 4 jours si les cellules bio-imprimées migrent hors du pansement.

Dans ces conditions, pour la totalité des échantillons de mousse HPU sur lesquels les fibroblastes ont été imprimés, la migration a été observée à partir de 2 jours.

Les résultats de migration des fibroblastes depuis l'interface Urgotul® sont plus variables. La migration est observée au bout de 2 jours après impression pour une bonne partie des échantillons interface (19 échantillons sur 30). Au bout de 4 jours les fibroblastes ont commencé à migrer depuis 4 échantillons, et aucune migration n'est observée depuis 7 échantillons.

B. Résultats sur la migration des kératinocytes

Pour 50% des pansements interface Urgotul® sur lesquels les kératinocytes ont été imprimés et déposés à la pipette, aucune migration n'est observée. Depuis les 50 % d'échantillons restants, la migration de kératinocytes a été observée entre 2 et 4 jours après l'impression ou l’ensemencement manuel des cellules. Le temps de migration depuis l'interface Urgotul® est relativement court mais cette migration n'est observée qu'à partir de la moitié des échantillons d’interface Urgotul®.

Depuis 19 échantillons de mousse HPU sur lesquels les kératinocytes ont été imprimés ou témoins, la migration a été observée entre 2 et 4 jours. La migration des kératinocytes imprimés n'a pas été observée sur un échantillon de mousse HPU ce qui est négligeable. Le temps de migration des kératinocytes imprimés et témoins depuis la mousse HPU est court et concerne la quasi-totalité des échantillons.

Les kératinocytes imprimés sur l'interface Urgotul® et la mousse HPU tout comme les kératinocytes témoins expriment pour la plupart l'antigène Ki67.

Après 8 jours de migration depuis des échantillons de la mousse HPU, de manière surprenante, il a été observé (pour 2 puits sur 4) un tapis de kératinocytes à 100% de confluence uniquement en-dessous du pansement. A la surface de ce tapis, certains kératinocytes commencent à proliférer et à se stratifier. Dans ce cas-là, les kératinocytes ont beaucoup proliféré. Par inhibition de contact une partie de ces cellules n'exprime pas l'antigène Ki67 et sont rentrées en phase de quiescence. D'autres cellules sont restées prolifératives, et ont continué à se diviser à la surface du tapis confluent.

Le pourcentage de prolifération (cellules qui expriment l'antigène Ki67), est calculé pour pouvoir quantifier l'expression de l'antigène Ki67 et comparer les cellules imprimées avec les cellules témoins. Les kératinocytes témoins ont un pourcentage de prolifération de 68%±18 %. Cette grande variabilité peut s'expliquer par une densité d'ensemencement des kératinocytes trop faible (2000 cellules/cm²).

Le pourcentage de prolifération de kératinocytes imprimés sur l'interface est de 92 %.

Le pourcentage de prolifération des kératinocytes imprimés sur la mousse HPU est de 80 %±18 %. Ce résultat est comparable au pourcentage de prolifération des kératinocytes témoins. Les kératinocytes imprimés sur la mousse HPU ne subissent donc aucun changement de leur capacité à proliférer.

Exemple 4 : Marquages et immunomarquages sur cellules

Après impression et dépôts à la pipette des fibroblastes ou des kératinocytes sur l'interface Urgotul® et la mousse HPU humidifiés avec un temps de conservation de 30 minutes, les pansements sont retournés (face d'impression contre le fond du puits de culture) pendant 4 jours pour les fibroblastes et 8 jours pour les kératinocytes. Les cellules sont ensuite fixées, puis, afin de vérifier que le métabolisme cellulaire n'est pas affecté par le contact du pansement après impression, des immunomarquages sont réalisés sur les cellules.

Les marquages réalisés sont :

-L'actine, le collagène I, le collagène III, la fibronectine et le Ki67 sur les fibroblastes,

-Le ki67 sur les kératinocytes.

L'observation des filaments d'actine se fait à l'aide d'un marquage à la phalloïdine. La phalloïdine couplée avec un marqueur fluorescent rouge (texas red) va se lier aux filaments d'actine et empêcher leur dépolymérisation. Les filaments d'actine apparaissent alors fluorescents dans le rouge.

Les cellules sont fixées avec du formaldéhyde 4%. Les membranes cellulaires sont perméabilisées à l'aide d'une solution de Triton, puis un traitement avec de la BSA (bovine serum albumin) permet de réduire les fixations aspécifiques. Les cellules sont ensuite marquées à la phalloïdine puis observées au microscope à fluorescence.

A. Immunomarquages du collagène I, du collagène III et de la fibronectine

Le collagène I et III sont des polypeptides fibrillaires synthétisés et sécrétés par les fibroblastes primaires du derme. Leur rôle est de participer à l'élasticité et à la résistance de la matrice extra cellulaire du derme.

La fibronectine, est une glycoprotéine également synthétisée et sécrétée par les fibroblastes primaires du derme. Elle participe à l'adhésion et à la migration cellulaire dans la matrice extra cellulaire.

Les trois protéines marquées sont localisées dans le cytoplasme cellulaire. Si aucun marquage n'est observé c'est que les cellules n'expriment pas et ne synthétisent pas la protéine ciblée.

Les cellules sont fixées et les membranes cellulaires sont perméabilisées avec du méthanol. Les sites de fixation aspécifique sont saturés avec une solution de BSA, puis les cellules sont marquées dans un premier temps avec l'anticorps primaire, puis dans un second temps avec l'anticorps secondaire (qui se fixe sur l'anticorps primaire pour fluorescer) et le Dapi (qui marque les noyaux cellulaires en bleu). Les cellules sont ensuite observées au microscope à fluorescence.

B. Immunomarquage de l'antigène Ki67

Le Ki67 est l'antigène d'une protéine nucléaire présente dans les cellules prolifératives en phase Gl, S, G2 et M. Les cellules en phase de quiescence GO n'expriment pas cette protéine nucléaire. Ce marquage est localisé dans le noyau des cellules. Si certaines cellules n'expriment pas cet antigène, c'est que les cellules ne sont pas prolifératives. Afin de quantifier les résultats, le pourcentage du nombre de cellules en phase prolifératives est calculé.

C. Résultats

La Figure 10, présente les résultats d'immunomarquages du collagène I des fibroblastes imprimés sur l'interface (c, d) et la mousse HPU (e, f) humidifiés et de fibroblastes témoins au fond des puits de culture (a, b). Les cellules imprimées sur l'interface et la mousse HPU ainsi que les cellules témoins expriment le collagène I. L'intensité du marquage est plus forte dans le cytoplasme de quelques cellules, ce qui pourrait s'expliquer par la synthèse plus importante de collagène I. Cette différence d'intensité est observée dans la population de fibroblastes imprimés sur les deux types de pansements (interface et mousse HPU) et témoins.

La Figure 11, présente les résultats d'immunomarquages de la fibronectine synthétisée par les fibroblastes imprimés sur l'interface (c, d) et la mousse HPU (e, f) humidifiés et par les fibroblastes témoins au fond des puits de culture (a, b). Aucune différence d'immunomarquage ciblant la synthèse de cette protéine n'est observée entre les fibroblastes imprimés, et les fibroblastes témoins. L'impression sur l'interface et la mousse HPU ne perturbe donc pas la synthèse de fibronectine par les fibroblastes.

La Figure 12, présente les résultats d'immunomarquages du collagène III synthétisé par les fibroblastes imprimés sur l'interface (c, d) et la mousse HPU (e, f) humidifiés et par les fibroblastes témoins au fond des puits de culture (a, b). Tout comme avec les résultats précédents d'immunomarquages du collagène I et de la fibronectine présents et synthétisés dans le cytoplasme des fibroblastes, le collagène III est également correctement présent dans les fibroblastes imprimés sur l'interface et la mousse HPU et témoins. Les résultats d'immunomarquage, des fibroblastes imprimés sur les deux pansements interface et mousse HPU ainsi que des fibroblastes témoins, sont similaires. L'impression sur ces deux matériaux ne perturbe donc pas la synthèse, par les fibroblastes, de ces protéines qui ont un rôle essentiel dans la formation de la matrice extra cellulaire dans le derme. L'antigène Ki67 n'est présent que dans le noyau des cellules prolifératives. Son marquage va permettre de comparer le taux de cellules prolifératives entre les fibroblastes imprimés sur l'interface et la mousse HPU et les fibroblastes témoins.

La Figure 13, présente les résultats d'immunomarquages de l'antigène Ki67 présent dans le noyau des fibroblastes prolifératifs imprimés sur l'interface (c, d) et la mousse HPU (e, f) humidifiés et par les fibroblastes prolifératifs témoins (a, b). Quelle que soit la condition testée, on observe des cellules en phase de quiescence (noyau non marqué). Dans certains cas, une inhibition de contact peut expliquer cet état non prolifératif des cellules. D'un point de vue qualitatif, les fibroblastes imprimés tout comme les fibroblastes témoins expriment l'antigène Ki67 et sont donc, pour la plupart, en phase de prolifération.

Le pourcentage de cellules marquées est calculé dans la Figure 14 pour pouvoir quantifier l'expression de l'antigène Ki67 et comparer les cellules imprimées avec les cellules témoins. Les fibroblastes témoins sont pour la plupart prolifératifs avec 83% des cellules comptées qui expriment l'antigène Ki67. Les résultats des cellules imprimées oscillent entre 65% et 90% d'expression de l'antigène Ki67 en fonction des échantillons. Le taux moyen de cellules prolifératives parmi les cellules imprimées ayant migrées depuis l'interface (76%± 15%) ou la mousse HPU (81%±11%) est comparable à celui des cellules témoins (83% ± 5%). En effet, les écarts-type des pourcentages d'expression de l'antigène Ki67 des fibroblastes imprimés sur les deux pansements sont relativement importants, ce qui rapproche les résultats des cellules imprimées des résultats des cellules témoins.

Aucune différence qualitative et quantitative n'est donc à noter entre les cellules imprimées sur l'interface et les fibroblastes imprimés sur la mousse HPU. Ue métabolisme prolifératif des fibroblastes imprimés sur ces deux matériaux pansements humides fonctionne correctement. Ua viabilité normalisée des fibroblastes est très élevée (supérieure à 95%) lorsque les cellules sont imprimées sur les pansements humides. Uorsque les pansements sont secs, la viabilité reste élevée pour l'interface mais chute de manière importante pour le pansement absorbant et la mousse HPU.

Ues résultats des tests de migrations depuis les pansements humides avec un temps de conservation de 30 minutes sont les plus concluants. Ces paramètres semblent être les plus adaptés à la survie et à la migration des fibroblastes depuis les pansements sur lesquels ils ont été imprimés.

Ues marquages et les immunomarquages donnent des résultats similaires entre les cellules imprimées et les cellules témoins. U'impression des fibroblastes sur l'interface et la mousse HPU humides ne modifie pas la synthèse d'actine, de collagène I et III, de fibronectine et d'antigène Ki67 par les fibroblastes. Le métabolisme des fibroblastes primaires imprimés sur l'interface et la mousse HPU humides n'est donc pas modifié et reste comparable au métabolisme des fibroblastes primaires non imprimés et qui poussent à la surface d'un puits de culture.

Toutes les impressions de kératinocytes primaires sont réalisées sur l'interface et la mousse HPU humidifiées avec un temps de conservation de 30 minutes après l'impression dans un incubateur à 37°C avec 5% de CO2.

Les résultats des impressions et des ensemencements témoins de kératinocytes primaires sur l'interface et la mousse HPU sont représentés à la Figure 15. Les cellules imprimées sur l'interface ont une viabilité proche de celle des cellules témoins sur l'interface, avec environ 70%±7% de viabilité. Les viabilités entre les cellules témoins et les cellules imprimées étant proches, l'impression sur ce support n'est donc pas la cause des 30% de cellules mortes. Le pourcentage de viabilité des impressions de kératinocytes primaires sur la mousse HPU est de 81%±6%. Les cellules témoins sur ce même pansement ont un pourcentage de viabilité de 90 %±7%. La différence entre ces deux valeurs est significative. La normalisation des résultats montre que la viabilité des kératinocytes imprimés sur l'interface et sur la mousse HPU sont très proches de la viabilité des témoins.

La Figure 16 représente le nombre de jours qu'il a fallu aux kératinocytes pour migrer depuis les pansements (l'interface et la mousse HPU) sur lesquels ils ont été imprimés ou témoins. Pour 50% des pansements interface sur lesquels les kératinocytes ont été imprimés et déposés à la pipette, aucune migration n'est observée. Depuis les 50% d'échantillons restants, la migration de kératinocytes a été observée entre 2 et 4 jours après l'impression ou l’ensemencement manuel des cellules. Le temps de migration depuis l'interface est relativement court mais cette migration n'est observée qu'à partir de trop peu d'échantillons interface. Depuis 19 échantillons de mousse HPU sur lesquels les kératinocytes ont été imprimés ou témoins, la migration a été observée entre 2 et 4 jours. La migration des kératinocytes imprimés n'a pas été observée depuis seulement un échantillon de mousse HPU ce qui est négligeable. Le temps de migration des kératinocytes imprimés et témoins depuis la mousse HPU est court et concerne la quasi-totalité des échantillons.

La Figure 17, présente les résultats d'immunomarquages de l'antigène Ki67 présent dans le noyau des kératinocytes prolifératifs imprimés sur l'interface (c, d) et la mousse HPU (e, f) humidifiés et par les kératinocytes prolifératifs témoins (a, b). D’après les observations de la Figure 17, les kératinocytes imprimés sur l'interface et la mousse HPU tout comme les kératinocytes témoins expriment pour la plupart l'antigène Ki67. Quelques cellules dont le noyau est bleu n’expriment pas l’antigène KÎ647 et sont observées parmi les kératinocytes imprimés mais aussi parmi les kératinocytes témoins.

Après 8 jours de migration depuis des échantillons de la mousse HPU, de manière surprenante, il a été observé (pour 2 puits sur 4) un tapis de kératinocytes à 100% de confluence uniquement en-dessous du pansement (Figure 18). A la surface de ce tapis, certains kératinocytes commencent à proliférer et à se stratifier. Dans ce cas-là, les kératinocytes ont beaucoup proliféré. Par inhibition de contact une partie de ces cellules n'exprime pas l'antigène Ki67 et sont rentrées en phase de quiescence. D'autres cellules sont restées prolifératives, et ont continué à se diviser à la surface du tapis confluent.

Le pourcentage de prolifération (cellules qui expriment l'antigène Ki67), est calculé dans la Figure 18 pour pouvoir quantifier l'expression de l'antigène Ki67 et comparer les cellules imprimées avec les cellules témoins. Les kératinocytes témoins ont un pourcentage de prolifération de 68%±18 %. Cette grande variabilité peut s'expliquer par une densité d'ensemencement des kératinocytes trop faible (2000 cellules/cm²). Le pourcentage de prolifération de kératinocytes imprimés sur l'interface est de 92%. Le pourcentage de prolifération des kératinocytes imprimés sur la mousse HPU est de 8O%±18%. Ce résultat est comparable au pourcentage de prolifération des kératinocytes témoins. Les kératinocytes imprimés sur la mousse HPU ne subissent donc aucun changement de leur capacité à proliférer. La viabilité des kératinocytes imprimés sur l'interface est proche de la viabilité des kératinocytes témoins. Après l'étude de la migration des kératinocytes (imprimés ou témoins) depuis l'interface, il est observé que les kératinocytes ne migrent depuis l'interface qu'une fois sur deux. Dans les cas où les kératinocytes ont migré depuis l'interface, les cellules ont très bien poussé pendant les 8 à 10 jours de temps de migration et ont commencé à recouvrir la surface du puits de culture. Les résultats des calculs de pourcentage de prolifération suite aux immunomarquages de l'antigène Ki67, indiquent que la prolifération des kératinocytes viables est très bonne. Les kératinocytes sont pour la plupart en phase de prolifération 8 jours après impression sur l'interface. L’ensemencement par impression ou par dépôt à la pipette sur l'interface semble affecter les kératinocytes primaires puisque leur viabilité est inférieure à celle sur la mousse HPU. En revanche, les cellules migrant depuis le pansement présentent un fort taux de prolifération. Deux hypothèses peuvent expliquer ce phénomène :

- La première hypothèse, est que les kératinocytes primaires est un type cellulaire fragile. Le stress induit par un ensemencement ou une impression sur ce matériau peut donc provoquer une mortalité importante, le temps que les cellules s'adaptent à ce matériau.

- Les kératinocytes primaires ont certainement des difficultés à adhérer sur ce type de support. Les kératinocytes différenciés, non prolifératifs qui ont plus de difficultés à adhérer peuvent ne pas survivre à l'impression ou à l'ensemencement manuel sur ce pansement. La seconde hypothèse est donc que l'interface sélectionne les kératinocytes dont le métabolisme est le plus performant avec une capacité de prolifération la plus importante.

Avec un pourcentage de viabilité de 81%, les kératinocytes survivent en grande partie 10 à l'impression sur la mousse HPU. Ce résultat est comparable au pourcentage de viabilité des kératinocytes témoins sur ce même matériau. L'impression tout comme le dépôt à la pipette sur ce support ne perturbe donc pas la survie des kératinocytes primaires. Les kératinocytes migrent au bout de 2 à 4 jours depuis la mousse HPU après l'étape d'impression ou de dépôt à la pipette. Les cellules ne sont donc pas affectées par la culture sur plusieurs jours dans ce 15 pansement. Elles migrent rapidement et colonisent toute la surface du puits de culture recouverte par la mousse HPU. La prolifération des kératinocytes imprimés se déroule correctement et semble augmenter au contact de la mousse HPU.

Claims

REVENDICATIONS

1. Pansement cellularisé sous une forme adaptée à une application transitoire sur une plaie, ledit pansement comprenant des cellules sur un matériau non résorbable.
2. Pansement cellularisé selon la revendication 1, dans lequel ledit matériau non résorbable est choisi parmi :

un pansement interface, un pansement absorbant, ou

- une mousse hydrophile de polyuréthane.
3. Pansement cellularisé selon l’une quelconque des revendications 1-2, dans lequel les cellules sont choisies parmi les cellules de type fibroblaste et/ou les cellules de type épithélial.
4. Pansement cellularisé selon l’une quelconque des revendications 1-3, dans lequel les cellules sont choisies parmi les fibroblastes et/ou les kératinocytes, notamment les fibroblastes primaires et/ou les kératinocytes primaires.
5. Pansement cellularisé selon l’une quelconque des revendications 1-4, dans lequel les cellules sont bio-imprimées sur le matériau non résorbable.
6. Pansement cellularisé selon l’une quelconque des revendications 1-5, ledit pansement étant saturé en liquide jusqu’à 90% de sa capacité d’absorption.
7. Pansement cellularisé selon l’une quelconque des revendications 1-6, ledit pansement comprenant une concentration de cellules comprise entre 50 et 30 000 cellules/cm², de préférence entre 200 et 20 000 cellules/cm².
8. Pansement cellularisé selon l’une quelconque des revendications 1-7, ledit pansement comprenant en outre un actif, de préférence choisi parmi un antiseptique, un antibactérien, un antibiotique, un antidouleur, un anti-inflammatoire, un anesthésique ou un composé qui favorise la cicatrisation de la plaie.
9. Procédé de fabrication d’un pansement cellularisé selon l’une quelconque des revendications 1-8, comprenant une étape de mise en contact des cellules avec un matériau non résorbable, de préférence l’étape de mise en contact étant une étape de bio-impression de cellules sur ledit matériau non résorbable.
10. Procédé de fabrication d’un pansement cellularisé selon la revendication 9 dans lequel la bio-impression de cellules est réalisée à partir d’une bio-encre dans laquelle les cellules sont en suspension ou sous forme d’agrégats.
11. Procédé de fabrication d’un pansement cellularisé selon l’une quelconque des revendications 9-10, dans lequel le matériau non résorbable est humide ou sec.