FR3035406A1 - Promoteurs inductibles de trichoderma reesei - Google Patents
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Abstract
L'invention concerne des souches de Trichoderma reesei dont l'inductibilité des promoteurs des gènes de cellulases est modifiée. L'expression de cellulases par ces souches de T. reesei est induite par la présence d'un substrat inducteur, ledit substrat inducteur n'exerçant pas ou peu d'effet inducteur sur une souche de T. reesei non modifiée, tout en gardant l'inductibilité des cellulases par leur substrat inducteur.
Description
1 Promoteurs inductibles de Trichoderma reesei Domaine de l'invention L'invention concerne des souches de Trichoderma reesei dont l'inductibilité des promoteurs des gènes impliqués dans la dégradation de la cellulose est modifiée. Arrière-plan technologique La possibilité de produire de l'éthanol à partir de la cellulose a reçu beaucoup d'attention en raison de la disponibilité de grandes quantités de matière première ainsi que de l'intérêt de l'éthanol à titre de carburant. Les matières premières naturelles cellulosiques pour un tel processus sont désignées par le terme "biomasse" ou "biomasse lignocellulosique". De nombreux types de biomasse, par exemple le bois, les résidus agricoles, les cultures herbacées et les déchets solides municipaux, ont été considérés comme des matières premières potentielles pour la production de biocarburant. Des unités pilote ou de démonstration voire industrielles de production d'éthanol de deuxième génération par voie biologique ont donc vu le jour ces dernières années. Toutefois, une production à très large échelle a été freinée par l'inefficacité de l'extraction des sucres fermentescibles à partir de la biomasse lignocellulosique. En effet, la paroi végétale contient trois grands types de composés qui se trouvent intimement liés : la cellulose et les hémicelluloses, polymères de sucres, et la lignine, un composé complexe constitué d'unités de phenylpropane. La lignine est associée au réseau fibrillaire (constitué de cellulose et d'hémicelluloses) par des liaisons de type chimique (notamment des liaisons éthers ou esters) et des liaisons hydrogène, ce qui rend la matière fibrillaire difficilement accessible et hydrolysable.
Un prétraitement physico-chimique est généralement appliqué pour désintégrer cette structure complexe et donner accès aux carbohydrates contenant les sucres fermentescibles, il s'agit principalement de la cellulose. Ce polymère est constitué de molécules de glucose reliées entre elles par des liaisons 131-4 très résistantes à 3035406 2 la dégradation ou à la dépolymérisation. Une fois la cellulose convertie en glucose, celui-ci est facilement fermenté en biocarburant, par exemple en éthanol, en utilisant une levure.
5 Les hémicelluloses sont des hétéropolymères principalement constitués d'unités pentoses (xylose, arabinose) ou hexoses (mannose, glucose et galactose) pouvant se trouver sous leurs formes acétylées ou méthylées. 11 existe une grande diversité d'hémicelluloses en fonction des constituants du squelette principal (généralement xylane ou mannane) et des composants des ramifications (résidus aromatiques, 10 acides glucuronique, galacturonique, acétique etc...). La dégradation enzymatique de la cellulose et des hémicelluloses est un processus lent et peu efficace. Certains microorganismes se sont spécialisés dans l'hydrolyse de la lignocellulose et sécrètent différentes enzymes glycolytiques. La dégradation 15 de la cellulose nécessite trois types d'activités principaux : les exo-3-1,4-glucanases ou cellobiohydrolases (CBH) qui coupent les chaines polysaccharidiques en leurs extrémités en libérant des unités cellobiose (dimère de glucose), les endo-3-1,4-glucanases (EG) qui coupent les chaines de cellulose 20 aléatoirement, générant ainsi de nouvelles extrémités pouvant être attaquées par les exoglucanases, et les P-glucosidases (BGL) qui hydrolysent le cellobiose en deux unités glucose.
25 Les hémicellulases, qui réalisent l'hydrolyse des hémicelluloses, sont de nature aussi variée que le sont les hémicelluloses. Parmi celles-ci, on trouve les xylanases, qui coupent aléatoirement les chaines de xyloses, les mannanases, qui clivent les chaînes de mannoses, les P-xylosidases et P-mannosidases, qui clivent les dimères de xylose ou 30 de mannose, respectivement, et les arabinofuranosidases, qui coupent les liaisons xylose-arabinose. Parmi les microorganismes sécréteurs de cellulases performantes, on trouve les champignons de genres Trichoderma, Aspergillus, Humicola, Fusarium ainsi que 3035406 3 des bactéries telles que Thermomonospora, Bacillus, Cellulomonas et Streptomyces. Trichoderma reesei (ou T. reesei) est un champignon filamenteux saprophyte de 5 la division des Ascomycètes. T. reesei est aujourd'hui considéré comme le seul microorganisme capable de répondre aux besoins mondiaux en cellulases des applications agro-carburants, en raison de ses capacités de sécrétion élevées. Aujourd'hui, les meilleures souches peuvent sécréter jusqu'à 100 g/L de protéines, 10 majoritairement représentées par des cellulases et hémicellulases. Les deux cellulases majoritaires de ce cocktail de dégradation (80% des protéines sécrétées) sont les cellobiohydrolases CEL7A et CEL6A (anciennement dénommées CBH1 et CBH2). Ce cocktail cellulolytique contient aussi 5 endoglucanases (CEL7B, CEL5A, CEL5B, CEL12A et CEL45A) et des P-glucosidases (principalement 15 BGLI) qui sont associées à des protéines auxiliaires supposées aider à la dégradation de la cellulose, telles que la swollenine, les protéines CIP1 et CIP2 ou les « lytic polysaccharide monooxygenases » (LPM0s ou AA9). En complément de son système cellulolytique, T. reesei dispose aussi d'un 20 système hémicellulolytique complexe composé de 4 xylanases (XYN1 à 4), d'une xyloglucanase (CEL74A), d'une P-xylosidase (BXL1), de 3 aarabinofuranosidases (ABF1 à 3), de 2 a-arabinofuranosidases/f3-xylosidases, d'une acétyl xylan esterase (AXE1) et d'une 13-mannanase (MANI).
25 Cependant, le coût de production des cellulases reste élevé et représente un des obstacles économiques pour une mise en oeuvre à l'échelle industrielle des procédés de valorisation des biocarburants. Industriellement, la production optimisée de cellulases par Trichoderma reesei est 30 réalisée en protocole fed-batch (alimentation sans soutirage) en utilisant une solution d'alimentation contenant du lactose comme sucre inducteur de la production de cellulases.
3035406 4 Bien qu'utilisé industriellement, le lactose présente l'inconvénient d'être onéreux. Pour pallier ce problème, il a été proposé de réduire le coût de production des cellulases en utilisant les sucres issus des hémicelluloses qui sont libérés lors du prétraitement physico-chimique de la biomasse (p. ex. explosion à la vapeur en 5 conditions acides) pour la propagation de T. reesei et la production d'enzymes. Toutefois, ce mélange ne contient pas ou peu de sucres capables d'induire la production des cellulases par T. reesei. Par conséquent, il est toujours nécessaire d'ajouter une certaine quantité de lactose. 10 il a également été proposé de remplacer le lactose par le xylose, qui est un produit d'hydrolyse des xylanes et l'un des sucres majoritaires obtenu lors de l'étape du prétraitement de la biomasse, pour diminuer le coût de production. Or, les gènes des cellulases et le gène bgll en particulier, codant pour la principale 13- glucosidase extracellulaire, ne sont pas induits par le xylose ou autres produits de 15 dégradation du xylane. Par conséquent, l'utilisation d'un sucre inducteur moins onéreux tel que le xylose ne permet pas de diminuer le coût de production des cellulases. Ainsi, pris dans son ensemble, l'art antérieur fait apparaître un besoin inassouvi et 20 longtemps attendu de développer des souches de T. reesei aux performances de production de cellulases améliorées. C'est le problème que se propose de résoudre la présente invention. Résumé de l'invention 25 Les inventeurs ont développé des souches modifiées de T. reesei, dans lesquelles des éléments de régulation des séquences promotrices des gènes des xylanases xynl et xyn2 ont été insérés dans les promoteurs des cellulases. Cette modification a permis de conférer l'inductibilité des xylanases aux gènes des cellulases.
30 En d'autres termes, l'expression de cellulases par ces souches de T. reesei est induite par la présence d'un substrat inducteur, ledit substrat inducteur n'exerçant aucun effet inducteur sur une souche de T. reesei sauvage, pour la production d'une telle cellulase.
3035406 5 Ainsi, dans un premier aspect, l'invention concerne une souche de Trichoderma reesei dont le génome est modifié par l'insertion d'au moins un élément de régulation de la séquence promotrice d'un gène choisi parmi xynl et xyn2, dans la séquence promotrice d'un gène codant pour une cellulase, 5 étant entendu que : l'élément de régulation de la séquence promotrice du gène xynl comprend la séquence représentée en SEQ ID N°1 ou la séquence représentée en SEQ ID N°3; l'élément de régulation de la séquence promotrice du gène xyn2 comprend 10 la séquence représentée en SEQ ID N°2 ou la séquence représentée en SEQ ID N°4. Préférentiellement, ladite insertion s'effectue entre les positions -800 et 0 par rapport au site d'initiation de la traduction du gène codant pour ladite cellulase.
15 Préférentiellement, ladite cellulase est la P-glucosidase. Dans un mode de réalisation, le génome de T. reesei est modifié de telle sorte que le promoteur du gène bgll codant pour la P-glucosidase comprend une séquence 20 choisie parmi les séquences représentées en SEQ ID N°5, 6, 8 ou 9. Préférentiellement, la production de cellulases par ladite souche est inductible par la présence d'un substrat inducteur choisi parmi le xylane; le xylose; les oligomères du xylose ou xylo-oligomères ; l'arabinose; une composition 25 comprenant du glucose, du xylose, du galactose, du mannose, du cellobiose et de l'acide acétique ; et leurs mélanges. Dans le contexte de l'invention, les souches de T. reesei selon l'invention maintiennent l'inductibilité de la production de cellulases par les substrats 30 classiquement utilisés, tels que le lactose ou la cellulose. Aussi, dans un mode de réalisation préféré, la souche de l'invention est caractérisée en ce que la production de cellulase par ladite souche est inductible par le lactose, la cellulose ou un mélange de lactose ou cellulose avec un substrat 3035406 6 inducteur choisi parmi : le xylane ; le xylose ; les oligomères du xylose, l'arabinose ; une composition comprenant un mélange de glucose, de xylose, de galactose, de mannose, de cellobiose et d'acide acétique; et leurs mélanges.
5 Dans un mode de réalisation particulier, l'élément de régulation de la séquence promotrice du gène xynl comprend la séquence représentée en SEQ ID N°1 et est inséré entre les positions -628 et -411 par rapport au site d'initiation de la traduction du gène codant pour la P-glucosidase.
10 Dans un autre mode de réalisation, l'élément de régulation de la séquence promotrice du gène xynl comprend la séquence représentée en SEQ ID N°3 et est inséré entre les positions -633 et 0 par rapport au site d'initiation de la traduction du gène codant pour la P-glucosidase.
15 Dans un autre mode de réalisation, l'élément de régulation de la séquence promotrice du gène xyn2 comprend la séquence représentée en SEQ ID N°2 et est inséré entre les positions -396 et -341 par rapport au site d'initiation de la traduction du gène codant pour la P-glucosidase.
20 Dans un autre mode de réalisation, l'élément de régulation de la séquence promotrice du gène xyn2 comprend la séquence représentée en SEQ ID N°4 et est inséré entre les positions -395 et 0 par rapport au site d'initiation de la traduction du gène codant pour la P-glucosidase.
25 Dans un second aspect, l'invention concerne une cassette de mutation comprenant une séquence choisie parmi les séquences représentées en SEQ ID N°10 à 14, préférentiellement une séquence choisie parmi les séquences représentées en SEQ ID N°10, 11, 13 et 14.
30 Dans un troisième aspect, l'invention concerne les utilisations d'une souche de T. reesei selon l'invention, notamment pour la production d'enzymes cellulolytiques, pour l'hydrolyse de la cellulose en glucose, pour la production de 3035406 7 produits biosourcés à partir du glucose, ou encore pour la production de biocarburants. Description détaillée de l'invention 5 Souches de T. reesei modifiées Le xylane ou ses produits d'hydrolyse, le xylose ou le xylobiose, sont connus pour induire l'expression des gènes des hémicellulases, dont les xylanases. Il a été démontré que des sucres C5, tel que le xylose ou l'arabinose, induisent les 10 xylanases xynl et xyn2 de T. reesei (Mach et al., 1996 ; Zeilinger et al., 1996). Cette induction passe par l'activation du facteur de transcription Xyrl. Chez le promoteur du gène xynl , Xyrl se fixe au niveau du motif répété et inversé 5'- GGCTAA-3' espacé de 10 pb. On parle de motif "xyrl". L'induction nécessite la 15 fixation simultanée d'un dimère de Xyrl, chaque monomère se fixant sur l'une des parties de la séquence répétée-inversée. Ces éléments se trouvent au sein d'une région de 217 pb, comprise entre -538 et -321pb en amont du site d'initiation de la traduction (ATG) du gène xynl. Cette région a été désignée comme contenant l'ensemble des éléments assurant la régulation de l'expression 20 de xynl (Rauscher et al., 2006; Zeilinger et al., 1996). Cette séquence est représentée en SEQ ID N°1. Concernant le gène xyn2, un élément de 55 pb, le "xylanase activating element", qui confère la régulation du gène a été mis en évidence. Cette région contient le 25 motif de fixation pour le facteur Xyrl, ainsi que les facteurs de transcription ACE2 et HAP2/3/5 (Würleitner et al., 2003). Cette séquence est représentée en SEQ ID N°2. Il a été démontré qu'une diminution de la quantité de lactose et une augmentation 30 de la quantité de xylose dans le milieu mène à une augmentation de l'activité xylanase, mais également à une baisse concomitante de l'activité cellulase et 13- glucosidase (Jourdier et al., 2013).
3035406 8 Aussi, à l'issu de long et fastidieux travaux, les inventeurs ont réussi à s'affranchir de cette limitation, en conférant l'inductibilité des xylanases aux gènes des cellulases par modification de leur promoteur.
5 Plus spécifiquement, les inventeurs ont réussi à insérer des éléments de régulation des séquences promotrices des gènes de xylanases xynl et xyn2 dans les promoteurs des gènes codant pour les cellulases. Cette modification génétique a permis de développer des souches de T. reesei dont l'expression de cellulases est induite par la présence d'un substrat inducteur, ledit substrat inducteur n'exerçant 10 aucun effet inducteur sur une souche de T. reesei sauvage pour la production d'une telle cellulase. Cela permet la production d'un cocktail équilibré avec des plus fortes activités cellulase, P-glucosidase et xylanase, tout en utilisant des substrats inducteurs plus 15 économiques. Aussi, l'invention concerne une souche de Trichoderma reesei dont le génome est modifié par l'insertion d'au moins un élément de régulation de la séquence promotrice d'un gène choisi parmi xynl et xyn2, dans la séquence promotrice du 20 gène codant pour une cellulase, étant entendu que : l'élément de régulation de la séquence promotrice du gène xynl comprend la séquence représentée en SEQ ID N°1 ou la séquence représentée en SEQ ID N°3; 25 l'élément de régulation de la séquence promotrice du gène xyn2 comprend la séquence représentée en SEQ ID N°2 ou la séquence représentée en SEQ ID N°4. Trichoderma reesei ou T. reesei est un champignon filamenteux cellulolytique.
30 Compte tenu de la capacité de T. reesei à sécréter de grandes quantités de cellulases et des hémicellulases, cette souche est hautement intéressante pour la production d'enzymes pour la transformation des matières de la biomasse végétale en bioproduits utiles à l'industrie, tels que le bioéthanol. Par "souche de référence de T. reesei", on entend une souche de Trichoderma reesei choisie parmi les 3035406 9 souches QM6a, NG14, RUTC30 et QM9414. Ces souches sont accessibles au public et ont notamment fait l'objet de dépôts, respectivement sous les numéros: ATCC 13631 (souche QM6a); ATCC 56767 (souche NG14); 5 ATCC 56765 (souche RUT C30); et ATCC 26921 (souche QM9414). Par "souche selon l'invention" ou "souche modifiée", on entend désigner de manière indifférente dans la présente demande une souche de Trichoderma reesei 10 dont au moins un promoteur d'un gène codant pour une cellulase a été modifié. Par "promoteur" ou "séquence promotrice", on entend une séquence d'ADN adjacente au site d'initiation de la transcription. Le promoteur est donc situé en amont du site d'initiation et porte des éléments de séquence reconnus par l'ARN- 15 polymérase qui déterminent le sens de la transcription. En effet, le promoteur comprend non seulement des séquences définissant le site d'initiation de la transcription mais aussi des séquences consensus des sites de fixation de l'ARN polymérase et des complexes de transcription ainsi que des motifs régulateurs reconnus par des facteurs d'activation ou de répression de la transcription.
20 Les inventeurs ont muté le promoteur du gène bgll de telle sorte à modifier l'inductibilité de la souche. Ces modifications consistent en l'insertion d'une séquence choisie parmi les séquences représentées en SEQ ID N°1, 2, 3 et 4. Une partie de la séquence native du promoteur de bgll , quant à elle, est représentée en SEQ ID N°15. Plus précisément, SEQ ID N°15 représente les 1250 pb précédant 25 le site d'initiation de la traduction du gène bgll dans la souche sauvage de Trichoderma reesei. Dans un premier mode de réalisation, la souche de l'invention est caractérisée en ce que ce que ladite insertion s'effectue entre les positions -1250 et 0 par rapport 30 au site d'initiation de la traduction du gène codant pour ladite cellulase. La référence à la position par rapport au site d'initiation de la traduction d'un gène, s'entend par la position sur la souche avant l'insertion d'un élément de régulation, c'est à dire avant la mutation. Cette numérotation peut donc aisément 3035406 10 être établie par rapport à la séquence native du promoteur de bgll, tel que notamment représentée en SEQ ID N°15 pour la P-glucosidase. Préférentiellement, ladite insertion s'effectue entre les positions -1200 et 0, 5 préférentiellement entre les positions -1100 et 0, préférentiellement entre les positions -1000 et 0, préférentiellement entre les positions -900 et 0, préférentiellement entre les positions -800 et 0, encore plus préférentiellement entre les positions -700 et 0 par rapport au site d'initiation de la traduction du gène codant pour ladite cellulase.
10 Préférentiellement, cette insertion se fait entre les positions -700 et -400 par rapport au site d'initiation de la traduction du gène codant pour ladite cellulase. Préférentiellement, cette insertion se fait entre les positions -628 et -411 par rapport au site d'initiation de la traduction du gène codant pour ladite cellulase.
15 Alternativement, cette insertion se fait entre les positions -400 et -300, plus préférentiellement entre les positions -396 et -341 par rapport au site d'initiation de la traduction du gène codant pour ladite cellulase. Dans un second mode de réalisation, la souche de l'invention est caractérisée en 20 ce que ce que ladite insertion ne s'effectue pas aux positions -1224 ; -1218 ; -881 ; -874; -811; -805 par rapport au site d'initiation de la traduction du gène de la cellulase. Sans vouloir être liés par la théorie, les inventeurs émettent l'hypothèse selon 25 laquelle les positions : .( comprises entre -1224 et -1218 par rapport au site d'initiation de la traduction du gène de la cellulase ; .( comprises entre -881 et -874 par rapport au site d'initiation de la traduction du gène de la cellulase ; 30 .( comprises entre -811 et -805 par rapport au site d'initiation de la traduction du gène de la cellulase ; correspondent à des positions spécifiques de reconnaissance par xyrl. Par conséquent, l'insertion d'une mutation à proximité de ces sites peut 3035406 11 potentiellement conduire à une absence de modification l'inductibilité de la production de cellulases de la souche. Par "cellulase", on entend une enzyme adaptée à l'hydrolyse de la cellulose et 5 permettant aux microorganismes qui les produisent d'utiliser la cellulose comme source de carbone, en hydrolysant ce polymère en sucres simples (glucose). Préférentiellement, ladite cellulase est une P-glucosidase, de préférence celle encodée par le gène bgll . Ainsi, ladite insertion s'effectue dans le promoteur du gène codant pour la P-glucosidase extracellulaire, c'est-à-dire dans le promoteur 10 de bgll . Aussi, l'invention concerne une souche de Trichoderma reesei dont le génome est modifié par l'insertion d'au moins un élément de régulation de la séquence promotrice d'un gène choisi parmi xynl et xyn2, dans la séquence promotrice du 15 gène codant pour la P-glucosidase. Préférentiellement, les motifs HAP2/3/5 et xyrl, présents sur le promoteur du gène bgll , ne sont pas modifiés et restent intacts. Les motifs HAP2/3/5 et xyrl correspondent à des motifs nucléiques reconnus par les facteurs de transcription XYR1 et HAP2/3/5.
20 Dans un mode de réalisation, le génome de la souche de l'invention peut être modifié par substitution d'un fragment du promoteur bgll par un élément de régulation de la séquence promotrice d'un gène xynl ou xyn2. En d'autres termes, le génome de T. reesei peut être modifié par : d'une part, l'excision d'un fragment du promoteur bgll , et 25 d'autre part, l'insertion d'un élément de régulation de la séquence promotrice d'un gène xynl ou xyn2. L'inductibilité de la production des cellulases par la souche de T. reesei selon l'invention est modifiée. Plus précisément, cette production peut être induite par 30 la présence d'un substrat inducteur, préférentiellement un sucre inducteur, qui n'exerce pas ou peu d'effet sur une souche sauvage de T. reesei.
3035406 12 Par "souche de T. reesei sauvage" ou "souche de T. reesei non modifiée" on entend une souche de T. reesei qui ne comprend pas de mutation telle que décrite dans la présente invention, c'est à dire une souche dont les promoteurs des gènes de cellulase ne sont pas modifiés. Ladite souche sauvage peut également être une 5 souche de référence de T. reesei. Par "induction", on entend la synthèse d'enzymes en réponse à l'apparition d'un produit spécifique. Il est connu que les microorganismes évitent la synthèse d'enzymes, par exemple d'une voie métabolique, en l'absence des substrats 10 adéquats et que ces derniers sont prêts à synthétiser de telles enzymes si le substrat réapparait. La souche selon l'invention a la particularité de produire des cellulases en présence d'un substrat qui n'est pas le substrat de la cellulase ainsi produite, en particulier le xylose. En effet, le xylose n'induit pas la production de cellulase chez les souches de T. reesei sauvages. En d'autres termes, les 15 inventeurs ont réussi à développer une souche dont l'inductibilité est modifiée par rapport à la souche T. reesei sauvage. Par "substrat inducteur", on entend un composé induisant une augmentation de l'expression de l'activité métabolique ciblée, toute condition expérimentale étant 20 égale par ailleurs, l'activité métabolique est plus forte lorsque l'inducteur est à une concentration appropriée que lorsqu'il est absent ou à une concentration inadaptée. Dans le contexte de la présente invention, ledit substrat inducteur est préférentiellement un sucre sous forme de monomère, d'oligomère ou de polymère.
25 Préférentiellement, ledit substrat inducteur est choisi parmi : le xylane le xylose ; les oligomères du xylose ; 30 l' arabinose ; un hydrolysat d'hémicellulose ; leurs mélanges.
3035406 13 Dans le contexte de l'invention, les souches de T. reesei selon l'invention maintiennent l'inductibilité de la production de cellulases par les substrats classiquement utilisés, tels que le lactose ou la cellulose.
5 Aussi, dans un mode de réalisation préféré, la souche de l'invention est caractérisée en ce que la production de cellulase par ladite souche est inductible par le lactose, la cellulose et un mélange de lactose avec un substrat inducteur choisi parmi : le xylane ; le xylose ; les oligomères du xylose ; l'arabinose ; une composition comprenant de glucose, de xylose, de galactose, de mannose, de 10 cellobiose et d'acide acétique; et leurs mélanges. Préférentiellement, la souche de l'invention est caractérisée en ce que la production de cellulase par ladite souche est inductible par le lactose; 15 le xylose; et un mélange de lactose et de xylose. Par "hydrolysat d'hémicellulose", on entend une composition comprenant un mélange de glucose, de xylose, de galactose, de mannose, de cellobiose et d'acide 20 acétique. Dans un mode de réalisation particulier, ledit substrat inducteur est un mélange de de xylane, de xylose, de xylobiose et/ou d' arabinose. Préférentiellement, ledit substrat est l'hydrolysat d'hémicellulose.
25 Plus préférentiellement, ledit substrat est le xylane. Dans un mode de réalisation, ledit substrat est le xylose. Alternativement, ledit substrat est des oligomères de xylose.
30 Par "oligomère du xylose" ou "xylo-oligomère", on entend une solution comprenant au moins un composé choisi parmi un dimère, un trimère, un tétramère, et un pentamère du xylose. Préférentiellement, ledit oligomère du xylose est le xylobiose.
3035406 14 Dans le contexte de l'invention, l'expression "modification de l'inductibilité de la production de cellulases" se réfère à la modification génétique du promoteur d'un gène de cellulase, qui a pour conséquence que ce promoteur devient inductible par un substrat inducteur. En d'autres termes, la présence dudit substrat 5 inducteur dans le milieu de culture conduit à la production de ladite cellulase par la souche modifiée, étant entendu que ledit substrat inducteur n'exerce pas ou peu d'effet sur une souche de T. reesei sauvage. La particularité de l'invention réside dans le fait que les gènes des cellulases 10 restent inductibles par leurs propres substrats inducteurs, tels que le lactose, le cellobiose ou la cellulose. Les inventeurs ont exemplifié plusieurs souches différentes de T. reesei dont le promoteur du gène bgll a été modifié. Par souci de clarté, ces constructions sont 15 dénommées constructions ou souches Cl, C2, C4 et C5. Dans un premier mode de réalisation, le génome de Trichoderma reesei est modifié de telle sorte que l'élément de régulation de la séquence promotrice du gène xynl comprenant la séquence représentée en SEQ ID N°1 est inséré entre les 20 positions -628 et -411 par rapport au site d'initiation de la traduction du gène codant pour la P-glucosidase. Préférentiellement, l'élément de régulation de la séquence promotrice du gène xynl consiste en la séquence représentée en SEQ ID N°1. La séquence représentée en SEQ ID N° 1 est donc insérée entre les positions 622 et 839 de la séquence représentée en SEQ ID N°15.
25 Cette souche modifiée de T. reesei est dénommée "construction Cl" ou "souche Cl". Dans ce mode de réalisation, la souche a subi une substitution de 217 paires de bases (pb) du promoteur bgll par 217 pb de l'élément de régulation de la séquence promotrice du gène xynl . Par conséquent, le promoteur du gène bgll de 30 la construction Cl comprend la séquence telle que représentée en SEQ ID N°5. Cette séquence représente les 1250 pb précédant le site d'initiation de la traduction du gène bgll dans la construction Cl.
3035406 15 Dans un second mode de réalisation, le génome de Trichoderma reesei est modifié de telle sorte que l'élément de régulation de la séquence promotrice du gène xynl comprenant la séquence représentée en SEQ ID N°3 est insérée entre les positions -633 et 0 par rapport au site d'initiation de la traduction du gène 5 codant pour la P-glucosidase. La référence au site d'initiation de la traduction du gène codant pour la P-glucosidase s'entend de la position avant l'insertion de la mutation. Préférentiellement, l'élément de régulation de la séquence promotrice du gène xynl consiste en la séquence représentée en SEQ ID N°3. La séquence représentée en SEQ ID N°3 est donc insérée entre les positions 617 et 1250 de la 10 séquence représentée en SEQ ID N°15. Cette souche modifiée de T. reesei est dénommée "construction C2" ou "souche C2". Dans ce mode de réalisation, la souche a subi une substitution de 633 pb du promoteur bgll par 541 pb de l'élément de régulation de la séquence promotrice 15 du gène xynl. Dans ce mode de réalisation, la séquence est juxtaposée au site d'initiation de la traduction de bgll . Par conséquent, le promoteur du gène bgll de la construction C2 comprend la séquence telle que représentée en SEQ ID N°6. Cette séquence représente les 1200 pb précédant le site d'initiation de la traduction du gène bgll dans la construction C2.
20 Dans un troisième mode de réalisation, le génome de Trichoderma reesei est modifié de telle sorte que l'élément de régulation de la séquence promotrice du gène xyn2 comprenant la séquence représentée en SEQ ID N°2 est inséré entre les positions -396 et -341 par rapport au site d'initiation de la traduction du gène 25 codant pour la P-glucosidase. Préférentiellement, l'élément de régulation de la séquence promotrice du gène xynl consiste en la séquence représentée en SEQ ID N°2. La séquence représentée en SEQ ID N°2 est donc insérée entre les positions 854 et 909 de la séquence représentée en SEQ ID N°15.
30 Cette souche modifiée de T. reesei est dénommée "construction C4" ou "souche C4". Dans ce mode de réalisation, la souche a subi une substitution de 55 pb du promoteur bgll par 55 pb de l'élément de régulation de la séquence promotrice du gène xyn2. Par conséquent, le promoteur du gène bgll de la construction C4 3035406 16 comprend la séquence telle que représentée en SEQ ID N°8. Cette séquence représente les 1250 pb précédant le site d'initiation de la traduction du gène bgll dans la construction C4.
5 Dans un quatrième mode de réalisation, le génome de Trichoderma reesei est modifié de telle sorte que l'élément de régulation de la séquence promotrice du gène xyn2 comprenant la séquence représentée en SEQ ID N°4 est insérée entre les positions -395 et 0 par rapport au site d'initiation de la traduction du gène codant pour la 3-glucosidase. La référence au site d'initiation de la traduction du 10 gène codant pour la 3-glucosidase s'entend de la position avant l'insertion de la mutation. Préférentiellement, l'élément de régulation de la séquence promotrice du gène xyn2 consiste en la séquence représentée en SEQ ID N°4. La séquence représentée en SEQ ID N°4 est donc insérée entre les positions 855 et 1250 de la séquence représentée en SEQ ID N°15.
15 Cette souche modifiée de T. reesei est dénommée "construction C5" ou "souche C5". Dans ce mode de réalisation, la souche a subi une substitution de 395 pb du promoteur bgll par 235 pb de l'élément de régulation de la séquence promotrice du gène xyn2. Dans ce mode de réalisation, la séquence est juxtaposée au site 20 d'initiation de la traduction. Par conséquent, le promoteur du gène bgll de la construction C5 comprend la séquence telle que représentée en SEQ ID N°9. Cette séquence représente les 1151 pb précédant le site d'initiation de la traduction du gène bgll dans la construction C5.
25 Les souches Cl, C2, C4 et C5 sont inductibles par des sucres qui n'exerçaient pas ou peu d'effet inducteur dans les souches sauvages de T. reesei. En particulier, ces souches sont inductibles par le xylose pour la production de 13- glucosidase. Aussi, un autre objet de l'invention concerne une souche de Trichoderma reesei 30 dont le génome est modifié de telle sorte que le promoteur de la 13- glucosidase comprend une séquence choisie parmi les séquences représentées en SEQ ID N°5, 6, 8 ou 9. Dans un mode de réalisation, le génome de la souche de l'invention est modifié de telle sorte que le promoteur de la 13- glucosidase comprend plus 3035406 17 préférentiellement les séquences représentées en SEQ ID N°8 ou 9. Dans un autre mode de réalisation, ledit génome comprend la séquence représentée en SEQ ID N°5.
5 Les inventeurs ont également développé une "construction C3" ou "souche C3". Dans cette construction, le génome de Trichoderma reesei est modifié de telle sorte que l'élément de régulation de la séquence promotrice du gène xynl comprenant la séquence représentée en SEQ ID N°16 est inséré entre les positions -1121 et -893 par rapport au site d'initiation de la traduction du gène codant pour 10 la P-glucosidase. La séquence représentée en SEQ ID N°16 est donc insérée entre les positions 129 et 357 de la séquence représentée en SEQ ID N°15. Dans ce mode de réalisation, la souche a subi une substitution de 228 pb du promoteur bgll par 230 pb de l'élément de régulation de la séquence promotrice 15 du gène xynl. Aussi, le promoteur du gène bgll de la construction C3 comprend la séquence telle que représentée en SEQ ID N°7. Cette séquence représente les 1250 pb précédant le site d'initiation de la traduction du gène bgll dans la construction C3.
20 La construction C3 est donc caractérisée par une insertion de l'élément de régulation de la séquence promotrice du gène choisi xynl en amont des positions -800 et 0 par rapport au site d'initiation de la traduction du gène codant pour ladite cellulase. La souche C3 présente une inductibilité de la production de cellulases moindre que celle observée pour les autres constructions. En particulier, 25 cette construction n'est pas inductible par le xylose pour la production de 13- glucosidase. Cassettes de mutation 30 Dans un second aspect, l'invention concerne les cassettes de mutation comprenant une séquence choisie parmi les séquences représentées en SEQ ID SEQ ID N°10 à 14. Ces cassettes sont des cassettes linéaires permettant d'obtenir une souche selon l'invention à partir d'une souche de T. reesei sauvage.
3035406 18 Par "cassette" ou "cassette de mutation", on entend une structure d'ADN permettant l'intégration d'un gène d'intérêt ou un fragment dudit gène d'intérêt dans un fragment d'ADN cible, typiquement selon le principe de la recombinaison 5 homologue. Préférentiellement, ladite cassette est linéaire et comporte un module comprenant un gène marqueur et/ou le gène à intégrer, ce module étant flanqué de part et d'autre de fragments d'ADN homologues à ceux des extrémités du site d'intégration ciblé.
10 La cassette comprenant la séquence telle que représentée en SEQ ID N°10 est utilisée pour obtenir la souche Cl, c'est-à-dire une souche de T. reesei dont le génome est modifié de telle sorte que l'élément de régulation de la séquence promotrice du gène xynl comprenant la séquence représentée en SEQ ID N°1 est inséré entre les positions -628 et -411 par rapport au site d'initiation de la 15 traduction du gène bgll. La cassette comprenant la séquence telle que représentée en SEQ ID N°11 est utilisée pour obtenir la souche C2, c'est-à-dire une souche de T. reesei dont le génome est modifié de telle sorte que la séquence promotrice du gène xynl 20 comprenant la séquence représentée en SEQ ID N°3 est insérée entre les positions -633 et 0 par rapport au site d'initiation de la traduction du gène bgll. La cassette comprenant la séquence telle que représentée en SEQ ID N°12 est utilisée pour obtenir la souche C3, c'est-à-dire une souche de T. reesei dont le 25 génome est modifié de telle sorte que l'élément de régulation de la séquence promotrice du gène xynl comprenant la séquence représentée en SEQ ID N°16 est insérée entre les positions -1121 et -893 par rapport au site d'initiation de la traduction du gène bgll.
30 La cassette comprenant la séquence telle que représentée en SEQ ID N°13 est utilisée pour obtenir la souche C4, c'est-à-dire une souche de T. reesei dont le génome est modifié de telle sorte que l'élément de régulation de la séquence promotrice du gène xyn2 comprenant la séquence représentée en SEQ ID N°2 est 3035406 19 inséré entre les positions -396 et -341 par rapport au site d'initiation de la traduction du gène bgll. La cassette comprenant la séquence telle que représentée en SEQ ID N°14 est 5 utilisée pour obtenir la souche C5, c'est-à-dire une souche de T. reesei dont le génome est modifié de telle sorte que la séquence promotrice du gène xyn2 comprenant la séquence représentée en SEQ ID N°4 est insérée entre les positions -395 et 0 par rapport au site d'initiation de la traduction du gène bgll.
10 Préférentiellement, les cassettes de mutation sont les séquences représentées en SEQ ID N°10, 11, 13 et 14. Dans un mode de réalisation, les cassettes de mutation sont les séquences représentées en SEQ ID N°13 ou 14. Dans un autre mode de réalisation, ledit génome comprend la séquence représentée en SEQ ID N°10.
15 Ces cassettes sont utilisées pour insérer des mutations dans le génome de T. reesei. Les techniques de mutations sont connues de l'homme du métier. Il est possible de prévoir différentes techniques assurant la mutation d'intérêt. On pourra par exemple utiliser les systèmes de mutations connus de l'homme du 20 métier, ainsi que les insertions ou autres modifications d'ADN obtenues par les techniques de recombinaison homologue. Préférentiellement, cette insertion est mise en oeuvre par recombinaison homologue, typiquement à l'aide d'un vecteur ou d'une cassette linéaire. La 25 cassette est co-transformée avec un vecteur qui contient le marqueur de sélection. Selon l'invention, on entend par "vecteur" toute séquence d'ADN dans laquelle il est possible d'insérer des fragments d'acide nucléique étranger, les vecteurs permettant d'introduire de l'ADN étranger dans une cellule hôte. Des exemples de 30 vecteurs sont les plasmides, les cosmides, les chromosomes artificiels de levures (YAC), les chromosomes artificiels de bactéries (BAC) et les chromosomes artificiels dérivés du bactériophage P1 (PAC), les vecteurs dérivés de virus. Le vecteur selon l'invention permet l'introduction d'une mutation et/ou d'une délétion.
3035406 20 Typiquement, l'acide nucléique tel que décrit précédemment pourra être lié opérationnellement à un promoteur, un terminateur ou toute autre séquence nécessaire à son expression dans la cellule hôte.
5 Dans un mode de réalisation préféré, le vecteur selon l'invention porte un marqueur de sélection. Alternativement, le marqueur de sélection est présent sur un second vecteur. On entend par "marqueur de sélection" un gène dont l'expression confère aux 10 cellules qui le contiennent une caractéristique permettant de les sélectionner. Il s'agit par exemple d'un gène de résistance aux antibiotiques ou d'un gène conférant une indépendance vis-à-vis d'un métabolite particulier. La cassette de mutation peut être ensuite amplifiée selon les techniques classiques 15 bien connues de l'homme du métier, typiquement par une méthode choisie parmi le clonage classique, la fusion PCR, ou encore le clonage in vivo dans la levure par PCR. Dans le contexte de l'invention, cette cassette est préférentiellement amplifiée par PCR.
20 La cassette de mutation est ensuite introduite par recombinaison dans une souche de T. reesei qui n'exprime pas un gène du marqueur de sélection. Après culture, les souches mutantes ayant incorporé la cassette de mutation sont sélectionnées en fonction de l'expression ou non du marqueur de sélection; les 25 clones ayant été transformés exprimant ledit marqueur de sélection. Dans un mode de réalisation préféré, ladite cassette de mutation est une cassette linéaire. Cette cassette de mutation peut être obtenue après clonage dans un vecteur comme décrit ci-avant et transformation de T. reesei. Typiquement, 30 l'intégration d'un gène d'intérêt dans un fragment d'ADN cible, se fait selon le principe de la recombinaison homologue. Pour cela, une cassette linéaire comporte un module comprenant la partie d'ADN à intégrer flanqué de part et d'autre de fragments d'ADN homologue à ceux des extrémités du site d'intégration ciblé. Après transformation du champignon avec la cassette par des procédés 3035406 21 appropriés, une recombinaison homologue entre les séquences de la construction et les régions correspondantes du gène cible a pour résultat le remplacement du fragment d'ADN cible par la cassette d'intégration. Parallèlement, une seconde cassette comprend le gène du marqueur sélectif.
5 Aussi, dans ce mode de réalisation, ladite cassette de mutation peut être une cassette de substitution permettant d'une part, l'excision d'un fragment du promoteur de bgll, et d'autre part, l'insertion d'un élément de régulation de la séquence 10 promotrice d'un gène xynl ou xyn2. Utilisations des souches de l'invention Dans un troisième aspect, l'invention concerne l'utilisation de la souche 15 selon l'invention pour la production d'enzymes cellulolytiques, de préférence en présence d'un substrat inducteur choisi parmi le xylane ; le xylose ;; les oligomères du xylose; l'arabinose ; un hydrolysat d'hémicellulose ; et leurs mélanges. Ces inducteurs peuvent être mélangés avec un substrat inducteur des cellulases, tel que le lactose ou la cellulose pour obtenir une plus forte induction.
20 Un autre objet de l'invention concerne également l'utilisation de la souche selon l'invention pour l'hydrolyse de la cellulose en glucose. Un autre objet de l'invention concerne l'utilisation de la souche selon l'invention 25 pour la production de produits biosourcés à partir du glucose. Par "produit biosourcé", on entend tout produit qui n'est pas d'origine fossile et qui ne contient pas de produit organique d'origine fossile. Le terme "produit d'origine fossile" signifie tout produit organique issu du pétrole ou du charbon ou 30 des dérivés du pétrole ou charbon. Préférentiellement, dans le contexte de l'invention, il s'agit d'un alcool, tel que l'isopropanol, le butanol ou l'éthanol. Enfin, un autre objet de l'invention concerne l'utilisation de la souche selon l'invention pour la production de biocarburants.
3035406 22 Selon l'invention, le terme "biocarburant" peut être défini comme tout produit issu de la transformation de la biomasse et pouvant être utilisé à des fins énergétiques. D'une part et sans vouloir se limiter, on peut citer à titre d'exemple 5 des biogaz, des produits pouvant être incorporés (éventuellement après transformation ultérieure) à un carburant ou être un carburant à part entière, tels que des alcools (l'éthanol, le butanol et/ou l'isopropanol selon le type d'organisme fermentaire utilisé), des solvants (acétone), des acides (butyrique), des lipides et leurs dérivés (acides gras à courtes ou longues chaînes, esters 10 d'acides gras), ainsi que l'hydrogène. De manière préférée, le biocarburant selon l'invention est un alcool, par exemple l'éthanol, le butanol et/ou l'isopropanol. Plus préférentiellement, le biocarburant selon l'invention est l'éthanol. Enfin, l'invention concerne un procédé de production d'un biocarburant, de 15 préférence l'éthanol, à partir de matériaux cellulosiques ou lignocellulosiques, comprenant des étapes de prétraitement d'un substrat cellulosique ou lignocellulosique, d'hydrolyse enzymatique du substrat prétraité puis de fermentation alcoolique de l'hydrolysat obtenu, dans lequel on utilise pour produire les enzymes cellulolytiques et/ou hémicellulolytiques, une souche de 20 Trichoderma reesei selon l'invention en présence d'un substrat inducteur choisi parmi le xylane ; le xylose ; les oligomères du xylose ; l'arabinose ; un hydrolysat d'hémicellulose ; et leurs mélanges. Description des séquences 25 SEQ ID N°1 et SEQ ID N°3 représentent un élément de régulation de la séquence promotrice du gène xynl. SEQ ID N°2 et SEQ ID N°4 représentent un élément de régulation de la séquence promotrice du gène xyn2.
30 SEQ ID N°5 représente les 1250 pb précédant le site d'initiation de la traduction du gène bgll dans la construction Cl. SEQ ID N°6 représente les 1200 pb précédant le site d'initiation de la traduction du gène bgll dans la construction C2.
3035406 23 SEQ ID N°7 représente les 1250 pb précédant le site d'initiation de la traduction du gène bgll dans la construction C3. SEQ ID N°8 représente les 1250 pb précédant le site d'initiation de la traduction du gène bgll dans la construction C4.
5 SEQ ID N°9 représente les 1151 pb précédant le site d'initiation de la traduction du gène bgll dans la construction C5. SEQ ID N°10 représente la cassette employée pour obtenir la construction Cl. SEQ ID N°11 représente la cassette employée pour obtenir la construction C2. SEQ ID N°12 représente la cassette employée pour obtenir la construction C3.
10 SEQ ID N°13 représente la cassette employée pour obtenir la construction C4. SEQ ID N°14 représente la cassette employée pour obtenir la construction C5. SEQ ID N°15 représente les 1250 pb précédant le site d'initiation de la traduction du gène bgll dans la souche sauvage de Trichoderma reesei. Il s'agit donc d'un fragment du promoteur natif de bgll chez T. reesei.
15 SEQ ID N°16 représente un élément de régulation de la séquence promotrice du gène xynl. Cette séquence comprend également la séquence telle que représentée en SEQ ID N°1. Par souci de clarté, le tableau suivant récapitule les correspondances entre : 20 les références aux positions par rapport au site d'initiation de la traduction du gène de la 13- glucosidase ; et les références aux positions par rapport à la séquence représentée en SEQ ID N°15.
3035406 24 Positions par rapport au site Positions par rapport à la séquence représentée en SEQ ID N°15 d'initiation de la traduction du gène de la f3 glucosidase entre -628 et -411 entre 622 et 839 entre -633 et 0 entre 617 et 1250 entre -396 et -341 entre 854 et 909 entre -395 et 0 entre 855 et 1250 entre -1121 et -893 entre 129 et 357 -1224 26 -1218 32 -881 369 -874 376 -811 439 -805 445 Légendes des figures 5 Figure 1: Schéma des 4 constructions du promoteur de bgll Cl à C3 contiennent des séquences du promoteur xynl, et C4 et C5 contiennent des motifs issus du promoteur xyn2. Dans ces constructions, les motifs HAP2/3/5 et Xyrl identifiés au sein du promoteur de bgll sont maintenus.
10 Figure 2: Ratio de transcrits bgll à 4, 24,et 48 h dans les souches modifiées et la souche témoin par rapport au niveau de transcrits bgll à TO (normalisé à 1). L'expression a été normalisée par rapport au gène sarl dont l'expression est constante. Il s'agit des valeurs moyennes obtenues chez deux clones par 15 construction, et de deux cultures/clone, sauf pour C2. La figure 2A représente les résultats pour QM9414 Aku70 pyr4- ; La figure 2B représente les résultats pour la construction Cl ; La figure 2C représente les résultats pour la construction C2; La figure 2D représente les résultats pour la construction C3 ; 3035406 25 La figure 2E représente les résultats pour la construction C4; La figure 2F représente les résultats pour la construction C5. Les substrats testés sont comme suit : "Glucose 1%"; 5 "Lactose 1%"; "Xylose 1%"; "Xylose 0,07% "qui correspond un mélange de xylose 0,075% et glycerol 1%; "Ax" qui correspond à un mélange L-Arabinose 1mM et D-xylose 1mM; 10 "XN" qui correspond à xylane 1%; et "C5" qui correspond à un hydrolysat d'hémicelluloses. Les exemples suivant illustrent l'invention mais n'en limitent nullement la portée.
15 Exemple Les inventeurs ont mis au point plusieurs constructions Cl, C2, C4 et C5 exemplifiant et une construction C3 utilisée pour montrer l'effet de positif du motif xynl, comme suit : 20 - Construction Cl : substitution d'un fragment du promoteur de bgll par une séquence minimal permettant la régulation du promoteur du gène xynl. - Construction C2: substitution d'un fragment du promoteur de bgll par le 25 promoteur minimal du gène xynl. - Construction C3 : substitution d'un fragment situé en amont des éléments cis du promoteur de bgll par une séquence minimal permettant la régulation du promoteur du gène xynl. 30 - Construction C4: substitution d'un fragment du promoteur de bgll par une séquence minimale permettant la régulation du promoteur du gène xyn2. 3035406 26 - Construction C5: substitution d'un fragment du promoteur de bgll par le promoteur minimal du gène xyn2. Ces constructions sont schématisées dans la figure 1.
5 Matériel et méthodes Réalisation des constructions Les constructions ont été réalisées à l'aide du Gibson Assembly Cloning Kit (New 10 England Biolabs). Le dessin des amorces pour l'amplification des fragments d'ADN à associer s'est effectué via le logiciel http://nebuildenneb.com/. Ces amorces ont été dessinées de manière à présenter une queue de 15 à 80pb, qui est complémentaire à l'extrémité du fragment à accoler.
15 Le plasmide vecteur utilisé était le plasmide bactérien pUC19, porteur du gène de résistance à l'ampicilline ampR. Avant d'être utilisé comme vecteur ce plasmide a été ouvert par les enzymes de restriction Xhol- et EcoRI (New England Biolabs) et purifié sur colonne (PCR Purification kit, Qiagen). Une fois les fragments associés, le plasmide a été amplifié par transformation 20 chez E. cou i (fournies dans le kit) et extrait (Plasmid Plus Midi kit, Qiagen). Les cassettes de substitution ont été amplifiées à partir du plasmide extrait par PCR. Transformation de T. reesei 25 T. reesei a été cultivé en fioles de Roux contenant 200 mL de Potato Dextrose Broth (Difco Laboratories USA) pendant 3 jours à 30°C sans agitation. Le mycélium était collecté par filtration sur gaze stérile et lavé dans 200 mL de tampon KPAm ((NH4)2504 0,6 M ; KH2PO4 25 mM ; pH 5,8) via une incubation de 30 min à 37°C, 150 rpm. Après une nouvelle étape de filtration su gaze stérile, 30 la paroi fongique des cellules était digérée par incubation avec 100 mL de tampon KPAm contenant 30 mg/mL de Glucanex (Novozymes). Les cellules ont ensuite été passées sur verre frité, récupérées dans le filtrat et transférées dans 5 tubes Corex 20 mL. Elles ont ensuite été précipitées par centrifugation (4000 rpm, 5 min, 4°C). Chaque culot était lavé avec 20 mL de Tampon CTS10 (Saccharose 3035406 27 0,4 M, Tris-HC1 pH 7,5 100 mM, CaC12 10 mM) et après centrifugation (4000 rpm, 5 min, 4°C), les protoplastes ont été rassemblés dans 3 tubes. Ils ont été resuspendus dans 20 mL de CTS10 et précipité par une nouvelle centrifugation (4000 rpm, 5 min, 4°C). Enfin, ils ont été rassemblés dans 1 seul tube et lavés une 5 dernière fois avec 10 mL de CTS10. Après centrifugation (4000 rpm, 5 min, 4°C), les protoplastes ont été récupérés dans 5mL de Tampon CTS50 (Saccharose 0,4M ; Tris HC1 pH 7,5 100mM ; CaC12 50 mM) pour être comptabilisés au microscope optique sur cellule de Malassez. Pour finir, la solution de protoplastes a été centrifugée (4000 rpm, 5 min, 4°C) et les cellules re-suspendues dans du 10 CTS50 dans un volume V calculé pour l'obtention d'une concentration finale de 2.108 cellules/mL. 45 !IL de solution de protoplastes à 2.108 cellules/mL ont été mis au contact de 5 tg de la cassette et de 1 tg du fragment porteur du marqueur de transformation dans un tube Falcon de 50 mL. Le volume total des solutions d'ADN utilisées 15 n'excédait pas 5 p.L. Après 10 min d'incubation du mélange à température ambiante, 500 1.1.L de tampon PEG (60 % poly-éthylène-glycol 4000; 10 mM Tris HC1; 50mM CaC12 ; pH 7,5) ont été ajoutés. Après 20 min d'incubation à température ambiante la suspension cellulaire a été allongée avec 450 1.1.L de CTS50 pour atteindre un volume final de 1 mL. Enfin, les cellules ont été diluées 20 dans 40 mL de milieu de surcouche de sélection (milieu sélectif gélosé additionné de 0,8 M de saccharose pour le maintien de la pression osmotique des protoplastes) chaud (entre 50 et 55°C) avant d'être étalées sur 5 boites (8 mL/boîte) de milieu de sélection (milieu sélectif gélosé additionné de 0,2 M de saccharose). Les boîtes ont ensuite été incubées à 30°C pendant 3-4 jours afin 25 d'observer la germination des spores. Les transformants obtenus ont ensuite été purifiés en quatre étapes de repiquage successives. Cultures de T. reesei 50 mL de milieu de culture riche (PD, Difco) ont été ensemencés avec des spores 30 de chaque souche et incubés à 30°C sous agitation pendant trois jours. Ensuite, le mycélium a été filtré sur gaze stérile, lavé deux fois avec de l'eau physiologique et remis en suspension dans du milieu minimum (K2HPO4 50 mM ; (NH4)2504 30 mM; Mg504 1,2 mM; Acide maléique 100 mM; Eléments traces (Fe504 5 mg/L ; Mn504 1,4 mg/L ; Zn504 1,4 mg/L, CoC12 3,7 mg/L) ; pH 6) additionné 3035406 28 de source de carbone (1 % glucose, 1 % lactose, 1 % ou 0,075 % xylose) et d'uridine (10 mM) pour la souche QM9414 Aku70 pyrzr. Les cultures ont de nouveau été incubées à 30°C pendant 48h. A TO, T4, T24 et T48h, 2 x 2 mL de culture ont été prélevés, centrifugés et le surnageant transféré dans un nouveau 5 tube. Le culot a été séché sur papier Whatman et congélé dans l'azote liquide avant stockage à -80°C jusqu'à l'extraction de l'ARN. Les surnageants ont été placés à -20 C°. Extraction d'ARN, rétrotranscription et PCR quantitative 10 Le mycélium congelé a été repris dans 700 pl de tampon RLT (RNeasy Mini Kit, Qiagen) additionné de 7 1..IL de P-mercapto-éthanol pur et broyé dans des tubes contenant des billes (Lysing matrix C, MP Biomedicals) avec l'agitateur Fastprep (MP Biomedicals) pendant 40 sec à vitesse maximale. Les tubes ont ensuite été centrifugés pendant 5 min (4°C, 14 000 rpm) et le surnageant transféré dans des 15 colonnes QIAshredder (Qiagen) pour séparer la phase liquide des débris cellulaires. Après centrifugation pendant 2 min (4°C, 10 000 rpm), 0,5 vol d'éthanol ont été ajoutés à l'éluât, qui a ensuite été déposé sur une colonne du kit RNeasy extraction kit (Qiagen). Après centrifugation, une digestion par DNAse (RNase-Free DNase Set, Qiagen) sur colonne puis des lavages ont été réalisés 20 selon les instructions du fournisseur. L'ARN a été élué avec 100 pl d'eau DEPC. Les concentrations des ARN extraits ont été déterminées par dosage au Qubit 2.0 (Invitrogen) et 500 ng ont été utilisés pour la réaction de reverse transcription (iScript Kit, Biorad). 5 pl de la réaction diluée au 1/5 ont été utilisés comme matrice pour la qPCR. Un contrôle négatif avec la même quantité d'ARN non 25 retro-transcrit a été réalisé pour chaque échantillon pour confirmer l'absence d'ADN. Chaque point a été réalisé en duplicat. Les quantités des transcrits bgll ont été normalisées par rapport au gène sarl et par rapport à la quantité de transcrits bgll à TO.
30 Résultats Les constructions Cl, C2 et C3 contiennent le motif de 217 pb identifié comme responsable de l'induction du gène xynl, cette séquence étant représentée en SEQ ID N°1.
3035406 29 Les constructions C4 et C5, quant à elles, contiennent les 55 pb essentielles pour l'induction du gène xyn2 (Zeilinger et al., 1996), cette séquence étant représentée en SEQ ID N°2.
5 Pour Cl, C2, C4 et C5, les motifs ont été placés à la même distance du début de transcription (symbolisé par une flèche dans la figure 1) que dans leurs gènes d'origine. Ainsi, la distance de 153 pb entre le début du motif xynl et le début de 10 transcription xynl est conservée chez Cl et C2, et la distance de 82 pb observée chez xyn2 est conservée au niveau des constructions C4 et C5. Dans la construction C3, le motif xynl a été placé en amont des éléments cis du promoteur bgll pour démontrer l'effet de position du motif xynl .
15 Dans les constructions C2 et C5, en plus du motif comportant les éléments d'induction, toute la séquence en aval des gènes xynl et xyn2 jusqu'au début de la séquence codante (comprenant donc la séquence 5' UTR) a été insérée. La 5'UTR étant plus courte chez les gènes xynl et xyn2 par rapport au gène bgll , la longueur 20 totale en amont du site d'initiation de la traduction (c'est à dire l'ATG) est par conséquent plus courte que chez bgll. Après transformation, des contrôles par PCR et par séquençage du locus ont été réalisés pour confirmer la correcte insertion des motifs. Deux clones pour chaque 25 construction ont été choisis pour analyse (à l'exception de la construction C2, pour lequel seul un clone a pu être obtenu). Pour ceux-là, les souches modifiées ainsi que la souche de départ QM9414 Aku70 pyr4- ont été mis en présence de différentes sources de carbone : le glucose (contrôle non inducteur), 30 le lactose (contrôle inducteur), le xylose 1 % et 0,075 % (conditions test), un mélange arabinose et xylose (1 mM chaque), le xylane (1%) ou 3035406 30 un hydrolysat d'hémicelluloses contenant 3,5 g/1 de xylose, 0,6 g/1 de mannose, 0,16 g/1 de galactose et 0,4 g/1 de glucose. L'expression du gène bgll a ensuite été déterminée par RT- qPCR.
5 Les résultats sont présentés à la figure 2. On constate que le gène bgll est significativement induit uniquement en présence de lactose dans la souche témoin (panel A). Cette induction est réduite, mais 10 toujours présente, chez les souches ayant intégré les constructions Cl, C2 et C3, c'est-à-dire contenant le motif xynl dans le promoteur bgll . Les souches possédant les constructions C4 et C5 gardent, en revanche, une induction significative (de 60 à 90 fois) par le lactose.
15 Contrairement à la souche témoin, on observe aussi une induction du gène bgll dans les souches Cl, C2, C4 et C5 par le xylose 1%, et de façon plus faible avec le xylose 0,075 %. Cette induction devient 5 à 10 fois plus forte dans le cas de la construction C4, comparé aux souches Cl, C2 et C5.
20 La présence de xylane et d'hydrolysat d'hémicelluloses mène également à une induction dans ces quatre souches, environ du même ordre de grandeur qu'en présence de xylose 1%. En revanche, la construction C3 confère une inductibilité uniquement en présence 25 de xylane, mais pas en présence des monomères de pentoses, soulignant l'importance du bon positionnement du motif xynl dans le promoteur et par rapport à l'initiation de la transcription et de la traduction : Si le motif xynl est placé entre -1121 et -893 pb avant le site d'initiation de la traduction du gène bgll , on n'observe pas d'induction par les monomères de pentoses.
30 La séquence entre le motif xynl et xyn2, respectivement, et le codon initiateur a également un effet sur l'inductibilité : dans les souches possédant la construction C2, le gène bgll est induit de façon plus importante en présence de xylane et d'hydrolysat d'hémicellulose que dans les souches possédant la construction Cl.
3035406 31 La région en aval du motif xynl, comprenant aussi la 5'-UTR du gène xynl a donc un effet positif sur l'inductibilité par le xylane et ses dérivés. Dans le cas de la séquence 5'-UTR du gène xyn2, on observe exactement l'inverse.
5 En effet, la présence de cette séquence montre plutôt une plus faible induction de bgll en présence de xylose ou de xylane. L'intégration des 55 pb issus du promoteur xyn2 est donc le meilleur choix pour transférer cette inductibilité. L'ensemble des résultats montre qu'il est possible de changer l'inductibilité du 10 promoteur bgll en insérant les motifs d'induction issus des gènes de xylanases. En fonction du type de motif et de l'emplacement, cette induction est plus ou moins forte.
15 Ainsi, les inventeurs ont montré qu'il était possible de changer le profil d'expression de la P-glucosidase, mais aussi des cellulases en présence d'inducteurs peu onéreux comme le xylose et ainsi d'obtenir un cocktail possédant des activités cellulases/13-glucosidase et xylanase équilibrées sous ces conditions. 20
Claims (15)
- REVENDICATIONS1. Souche de Trichoderma reesei dont le génome est modifié par l'insertion d'au moins un élément de régulation de la séquence promotrice d'un gène choisi parmi xynl et xyn2, dans la séquence promotrice d'un gène codant pour une cellulase, étant entendu que : l'élément de régulation de la séquence promotrice du gène xynl comprend la séquence représentée en SEQ ID N°1 ou la séquence représentée en SEQ ID N°3; l'élément de régulation de la séquence promotrice du gène xyn2 comprend la séquence représentée en SEQ ID N°2 ou la séquence représentée en SEQ ID N°4.
- 2. Souche selon la revendication 1, caractérisée en ce que ladite insertion s'effectue entre les positions -800 et 0 par rapport au site d'initiation de la traduction du gène codant pour ladite cellulase.
- 3. Souche selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que ladite cellulase est la P-glucosidase.
- 4. Souche selon la revendication 3, caractérisée en ce que le promoteur de la 13- glucosidase comprend une séquence choisie parmi les séquences représentées en en SEQ ID N°5, 6, 8 ou 9.
- 5. Souche selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que la production de cellulase par ladite souche est inductible par un substrat inducteur choisi parmi : le xylane ; le xylose ; les oligomères du xylose ; l'arabinose ; une composition comprenant de glucose, de xylose, de galactose, de mannose, de cellobiose et d'acide acétique; et leurs mélanges. 3035406 33
- 6. Souche selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que la production de cellulase par ladite souche est inductible par un substrat choisi parmi le lactose et la cellulose ou un de leurs mélanges avec un substrat inducteur 5 choisi parmi : le xylane ; le xylose ; les oligomères du xylose ; l' arabinose ; 10 une composition comprenant de glucose, de xylose, de galactose, de mannose, de cellobiose et d'acide acétique; et leurs mélanges.
- 7. Souche selon l'une quelconque des revendications 3 à 6, caractérisée en ce 15 que l'élément de régulation de la séquence promotrice du gène xynl comprend la séquence représentée en SEQ ID N°1 et est inséré entre les positions -628 et -411 par rapport au site d'initiation de la traduction du gène codant pour la 13- glucosidase. 20
- 8. Souche selon la revendication 3 à 6, caractérisée en ce que l'élément de régulation de la séquence promotrice du gène xynl comprend la séquence représentée en SEQ ID N°3 et est inséré entre les positions -633 et 0 par rapport au site d'initiation de la traduction du gène codant pour la P-glucosidase. 25
- 9. Souche selon la revendication 3 à 6, caractérisée en ce que l'élément de régulation de la séquence promotrice du gène xyn2 comprend la séquence représentée en SEQ ID N°2 et est inséré entre les positions -396 et -341 par rapport au site d'initiation de la traduction du gène codant pour la P-glucosidase. 30
- 10. Souche selon l'une quelconque des revendications 3 à 6, caractérisée en ce que l'élément de régulation de la séquence promotrice du gène xyn2 comprend la séquence représentée en SEQ ID N°4 et est inséré entre les positions -395 et 0 par rapport au site d'initiation de la traduction du gène codant pour la P-glucosidase. 3035406 34
- 11. Cassette de mutation comprenant une séquence choisie parmi les séquences représentées en SEQ ID N°10, 11, 13 et 14. 5
- 12. Utilisation d'une souche selon l'une quelconque des revendications 1 à 10 pour la production d'enzymes cellulolytiques.
- 13. Utilisation d'une souche selon l'une quelconque des revendications 1 à 10 pour l'hydrolyse de la cellulose en glucose. 10
- 14. Utilisation de la souche selon l'une quelconque des revendications 1 à 10 pour la production de produits biosourcés à partir du glucose.
- 15. Utilisation de la souche selon l'une quelconque des revendications 1 à 10 pour 15 la production de biocarburants.
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