WO2016170283A1 - Promoteurs inductibles de trichoderma reesei - Google Patents

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WO2016170283A1
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Claire DERLOT
Senta Blanquet
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IFP Energies Nouvelles
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    • C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2445—Beta-glucosidase (3.2.1.21)
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    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel

Definitions

  • the invention relates to strains of Trichoderma reesei whose inducibility of the promoters of the genes involved in the degradation of cellulose is modified.
  • biomass The natural cellulosic raw materials for such a process are referred to as “biomass” or “lignocellulosic biomass”.
  • biomass Many types of biomass, such as wood, agricultural residues, herbaceous crops and municipal solid waste, have been considered as potential raw materials for biofuel production.
  • the plant wall contains three main types of compounds that are closely related: cellulose and hemicelluloses, polymers of sugars, and lignin, a complex compound consisting of phenylpropane units.
  • Lignin is associated with the fibrillar network (consisting of cellulose and hemicelluloses) by chemical bonds (especially ether or ester bonds) and hydrogen bonds, which makes the fibrillar material difficult to access and hydrolyzable.
  • a physico-chemical pretreatment is generally applied to disintegrate this complex structure and give access to carbohydrates containing fermentable sugars, it is mainly cellulose.
  • This polymer consists of glucose molecules linked together by ⁇ 1-4 bonds very resistant to degradation or depolymerization. Once the cellulose is converted into glucose, it is easily fermented to biofuel, for example ethanol, using yeast.
  • Hemicelluloses are heteropolymers consisting mainly of pentose units (xylose, arabinose) or hexoses (mannose, glucose and galactose) which may be in their acetylated or methylated forms.
  • exo-P-1,4-glucanases or cellobiohydrolases which cut the polysaccharide chains at their ends by releasing cellobiose units (glucose dimer),
  • endo-P-1,4-glucanases which cut the cellulose chains randomly, thus generating new ends that may be attacked by the exoglucanases
  • ⁇ -glucosidases which hydrolyze cellobiose into two glucose units.
  • Hemicellulases which effect the hydrolysis of hemicelluloses, are as varied in their nature as hemicelluloses. Among these are the
  • ⁇ -xylosidases and ⁇ -mannosidases which cleave the xylose or mannose dimers, respectively
  • Trichoderma reesei (or T. reesei) is a saprophytic filamentous fungus of Ascomycetes division. T. reesei is now considered the only microorganism capable of meeting the global cellulase requirements of agrofuel applications due to its high secretion capacity.
  • This cellulolytic cocktail also contains 5 endoglucanases (CEL7B, CEL5A, CEL5B, CEL12A and CEL45A) and ⁇ -glucosidases (mainly BGLI) which are associated with auxiliary proteins that are supposed to help the breakdown of cellulose, such as swollenin, proteins CIP1 and CIP2 or "lytic polysaccharide monooxygenases" (LPMOs or AA9).
  • BGLI ⁇ -glucosidases
  • T. reesei In addition to its cellulolytic system, T. reesei also has a complex hemicellulolytic system consisting of 4 xylanases (XYN1 to 4), xyloglucanase (CEL74A), ⁇ -xylosidase (BXL1), 3-alpha arabinofuranosidases (ABF1-3), 2-arabinofuranosidases / p-xylosidases, acetyl xylan esterase (AXE1) and ⁇ -mannanase (MAN1).
  • XYN1 to 4 xyloglucanase
  • BXL1 ⁇ -xylosidase
  • ABS1 3-alpha arabinofuranosidases
  • AXE1 acetyl xylan esterase
  • MAN1 ⁇ -mannanase
  • lactose it is always necessary to add a certain amount of lactose. It has also been proposed to replace lactose with xylose, which is a xylan hydrolysis product and one of the majority sugars obtained during the pre-treatment stage of the biomass, to reduce the cost of production.
  • xylose which is a xylan hydrolysis product and one of the majority sugars obtained during the pre-treatment stage of the biomass.
  • the cellulase genes and the bgl1 gene in particular, coding for the main extracellular ⁇ -glucosidase are not induced by xylose or other xylan degradation products. Consequently, the use of a less expensive inducing sugar such as xylose does not make it possible to reduce the production cost of cellulases.
  • the inventors have developed modified T. reesei strains, in which regulatory elements of the xynl and xynl xylanase gene promoter sequences have been inserted into the cellulase promoters.
  • This modification made it possible to confer the inducibility of the xylanases to the cellulase genes.
  • the expression of cellulases by these T. reesei strains is induced by the presence of an inducing substrate, said inducing substrate exerting no inducing effect on a wild T. reesei strain, for the production of such cellulase.
  • the invention relates to a strain of Trichoderma reesei whose genome is modified by the insertion of at least one regulatory element of the promoter sequence of a gene selected from xynl and xyn2, in the sequence promoter of a gene coding for a cellulase, it being understood that:
  • the regulatory element of the promoter sequence of the xynl gene comprises the sequence represented in SEQ ID No. 1 or the sequence represented in FIG.
  • the regulatory element of the promoter sequence of the xynl gene comprises the sequence represented in SEQ ID No. 2 or the sequence represented in FIG.
  • said insertion takes place between positions -800 and 0 relative to the translation initiation site of the gene coding for said cellulase.
  • said cellulase is chosen from exo-P-1,4-glucanases or cellobiohydrolases, endo-P-1,4-glucanases and ⁇ -glucosidases. More preferentially, said cellulase is ⁇ -glucosidase.
  • the genome of T. reesei is modified such that the promoter of the ⁇ -glucosidase encoding gene ⁇ g1 comprises a sequence selected from the sequences shown in SEQ ID NO: 5, 6, 8 or 9.
  • the production of cellulases by said strain is inducible by the presence of an inducing substrate selected from xylan; xylose; oligomers of xylose or xylo-oligomers; arabinose; a composition comprising glucose, xylose, galactose, mannose, cellobiose and acetic acid; and their mixtures.
  • an inducing substrate selected from xylan; xylose; oligomers of xylose or xylo-oligomers; arabinose; a composition comprising glucose, xylose, galactose, mannose, cellobiose and acetic acid; and their mixtures.
  • the T. reesei strains according to the invention maintain the inducibility of the production of cellulases by the conventionally used substrates, such as lactose or cellulose.
  • the strain of the invention is characterized in that the production of cellulase by said strain is inducible by lactose, cellulose or a mixture of lactose or cellulose with an inducing substrate selected from: xylan; xylose; oligomers of xylose, arabinose; a composition comprising a mixture of glucose, xylose, galactose, mannose, cellobiose and acetic acid; and their mixtures.
  • the regulatory element of the xynl gene promoter sequence comprises the sequence shown in SEQ ID No. 1 and is inserted between positions -628 and -411 relative to the translation initiation site. of the gene coding for ⁇ -glucosidase.
  • the regulatory element of the xynl gene promoter sequence comprises the sequence shown in SEQ ID NO: 3 and is inserted between positions -633 and 0 relative to the translation initiation site of the gene encoding ⁇ -glucosidase.
  • the regulatory element of the xynl gene promoter sequence comprises the sequence shown in SEQ ID NO: 2 and is inserted between positions -396 and -341 relative to the translation initiation site. of the gene coding for ⁇ -glucosidase.
  • the regulatory element of the promoter sequence of the xynl gene comprises the sequence shown in SEQ ID NO: 4 and is inserted between positions -395 and 0 relative to the translation initiation site of the gene encoding ⁇ -glucosidase.
  • the invention in a second aspect, relates to a mutation cassette comprising a sequence chosen from the sequences represented in SEQ ID Nos. 10 to 14, preferably a sequence chosen from the sequences represented in SEQ ID Nos. 10, 11, 13 and 14. .
  • the invention relates to the uses of a strain of T. reesei according to the invention, especially for the production of cellulolytic enzymes, for the hydrolysis of cellulose to glucose, for the production of biobased products. from glucose, or for the production of biofuels.
  • Xylan or its hydrolysis products xylose or xylobiose
  • C5 sugars such as xylose or arabinose
  • T. reesei xylanases xynl and xynl
  • This induction involves the activation of the transcription factor Xyrl.
  • Xyr1 binds to the repeated 5'-GGCTAA-3 'repeat and 10 bp repeat. We are talking about "xyrl" motif.
  • Induction requires the simultaneous binding of a Xyrl dimer, with each monomer binding to one of the portions of the repetitive-inverted sequence.
  • These elements lie within a region of 217 bp, between -538 and -321bp upstream of the translation initiation site (ATG) of the xynl gene. This region has been designated as containing all the elements controlling the expression of xynl (Rauscher et al., 2006, Zeilinger et al., 1996). This sequence is represented in SEQ ID No. 1.
  • xynl gene a 55-bp element, the "activating xylanase element," which confers regulation of the gene has been demonstrated.
  • This region contains the binding motif for factor Xyrl, as well as transcription factors ACE2 and HAP2 / 3/5 (Wurleitner et al., 2003). This sequence is represented in SEQ ID No. 2.
  • the inventors have succeeded in inserting regulatory elements of the promoter sequences of xylanase xynl and xynl genes into the promoters of the genes encoding cellulases.
  • This genetic modification has made it possible to develop T. reesei strains whose cellulase expression is induced by the presence of an inducing substrate, said inducing substrate exerting no inducing effect on a wild T. reesei strain for the production of such cellulase.
  • the invention relates to a strain of Trichoderma reesei whose genome is modified by the insertion of at least one regulatory element of the promoter sequence of a gene chosen from xynl and xynl, in the promoter sequence of the gene coding for cellulase,
  • the regulatory element of the xynl gene promoter sequence comprises the sequence shown in SEQ ID NO: 1 or the sequence shown in SEQ ID NO: 3;
  • the regulatory element of the promoter sequence of the xynl gene comprises the sequence represented in SEQ ID No. 2 or the sequence represented in SEQ ID No. 4.
  • Trichoderma reesei or T. reesei is a cellulolytic filamentous fungus. Given the ability of T. reesei to secrete large amounts of cellulases and hemicellulases, this strain is of great interest for production of enzymes for the transformation of plant biomass materials into bioproducts useful for industry, such as bioethanol.
  • reference strain of T. reesei is meant a strain of Trichoderma reesei selected from strains QM6a, NG14, RUTC30 and QM9414. These strains are accessible to the public and have been the subject of deposits, respectively under the numbers:
  • ATCC 13631 (strain QM6a);
  • ATCC 56767 (strain NG14);
  • strain according to the invention or “modified strain” is meant indifferently in the present application a strain of Trichoderma reesei, at least one promoter of a gene coding for a cellulase has been modified.
  • promoter or “promoter sequence” is meant a DNA sequence adjacent to the transcription initiation site. The promoter is therefore located upstream of the initiation site and carries sequence elements recognized by the RNA polymerase which determine the direction of transcription. Indeed, the promoter comprises not only sequences defining the transcription initiation site but also consensus sequences of RNA polymerase binding sites and transcription complexes as well as regulatory motifs recognized by activation factors. or repression of transcription.
  • the inventors mutated the promoter of the bgl1 gene in such a way as to modify the inducibility of the strain. These modifications consist in the insertion of a sequence chosen from the sequences represented in SEQ ID No. 1, 2, 3 and 4. Part of the native sequence of the bgll promoter, for its part, is represented in SEQ ID N 15. More specifically, SEQ ID No. 15 represents the 1250 bp preceding the translation initiation site of the bgl1 gene in the wild strain of Trichoderma reesei.
  • the strain of the invention is characterized in that said insertion takes place between positions -1250 and 0 relative to the translation initiation site of the gene coding for said cellulase.
  • the reference to the position with respect to the site of initiation of the translation of a gene is understood by the position on the strain before the insertion of a regulatory element, that is to say before the mutation. This numbering can therefore easily be established with respect to the native sequence of the bgl1 promoter, such as in particular represented in SEQ ID No. 15 for ⁇ -glucosidase.
  • said insertion takes place between positions - 1200 and 0, preferably between positions -1100 and 0, preferentially between positions -1000 and 0, preferably between positions -900 and 0, preferably between positions -800 and 0 more preferably between positions -700 and 0 relative to the translation initiation site of the gene coding for said cellulase.
  • this insertion is between positions -700 and -400 relative to the translation initiation site of the gene coding for said cellulase.
  • this insertion is between positions -628 and -411 relative to the translation initiation site of the gene coding for said cellulase.
  • this insertion is between positions -400 and -300, more preferably between positions -396 and -341 relative to the translation initiation site of the gene coding for said cellulase.
  • the strain of the invention is characterized in that said insertion does not take place at positions -1224; - 1218; -881; -874; -811; -805 relative to the translation initiation site of the cellulase gene.
  • cellulase is meant an enzyme adapted to the hydrolysis of cellulose and allowing the microorganisms that produce them to use cellulose as a source of carbon, by hydrolyzing this polymer into simple sugars (glucose).
  • said cellulase is chosen from exo-P-1,4-glucanases or cellobiohydrolases, endo-P-1,4-glucanases and ⁇ -glucosidases. More preferentially, said cellulase is a ⁇ -glucosidase, preferably that encoded by the bgll gene.
  • said insertion takes place in the promoter of the gene coding for extracellular ⁇ -glucosidase, that is to say in the bgll promoter.
  • the invention relates to a strain of Trichoderma reesei whose genome is modified by the insertion of at least one regulatory element of the promoter sequence of a gene chosen from xynl and xyn2 into the promoter sequence of the gene coding for ⁇ -glucosidase.
  • the HAP2 / 3/5 and xyrl motifs present on the promoter of the bglI gene, are not modified and remain intact.
  • the HAP2 / 3/5 and xyrl motifs correspond to nucleic motifs recognized by transcription factors XYR1 and HAP2 / 3/5.
  • the genome of the strain of the invention may be modified by substitution of a fragment of the bgl1 promoter with a regulatory element of the promoter sequence of an xynl or xynl gene.
  • the T. reesei genome can be modified by:
  • the inducibility of cellulase production by the T. reesei strain according to the invention is modified. More specifically, this production can be induced by the presence of an inducing substrate, preferably an inducing sugar, which exerts little or no effect on a wild T. reesei strain.
  • wild T. reesei strain or "unmodified T. reesei strain” is meant a strain of T. reesei which does not comprise a mutation as described in the present invention, that is to say a strain whose Promoters of the cellulase genes are not modified. Said wild strain can also be a reference strain of T. reesei.
  • induction is meant the synthesis of enzymes in response to the appearance of a specific product. It is known that microorganisms avoid the synthesis of enzymes, for example a metabolic pathway, in the absence of suitable substrates and that the latter are ready to synthesize such enzymes if the substrate reappears.
  • the strain according to the invention has the particularity of producing cellulases in the presence of a substrate which is not the substrate of the cellulase thus produced, in particular xylose.
  • xylose does not induce cellulase production in wild T. reesei strains.
  • the inventors have succeeded in developing a strain whose inducibility is modified with respect to the wild T. reesei strain.
  • inducing substrate is meant a compound inducing an increase in the expression of the targeted metabolic activity, any experimental condition being equal, the metabolic activity is greater when the inducer is at an appropriate concentration than when he is absent or at an inappropriate concentration.
  • said inducing substrate is preferably a sugar in the form of monomer, oligomer or polymer.
  • said inducing substrate is chosen from
  • the T. reesei strains according to the invention maintain the inducibility of the production of cellulases by the conventionally used substrates, such as lactose or cellulose.
  • the strain of the invention is characterized in that the production of cellulase by said strain is inducible by lactose, cellulose and a mixture of lactose with an inducing substrate selected from: xylan; xylose; oligomers of xylose; arabinose; a composition comprising glucose, xylose, galactose, mannose, cellobiose and acetic acid; and their mixtures.
  • the strain of the invention is characterized in that the production of cellulase by said strain is inducible by
  • hydrolyzate hemicellulose is meant a composition comprising a mixture of glucose, xylose, galactose, mannose, cellobiose and acetic acid.
  • said inducing substrate is a mixture of xylan, xylose, xylobiose and / or arabinose.
  • said substrate is the hydrolyzate of hemicellulose.
  • said substrate is xylan.
  • said substrate is xylose.
  • said substrate is xylose oligomers.
  • xylose oligomer or "xylo-oligomer” is meant a solution comprising at least one compound selected from a dimer, a trimer, a tetramer, and a xylose pentamer.
  • said oligomer of xylose is xylobiose.
  • modifying the inducibility of cellulase production refers to the genetic modification of the promoter of a cellulase gene, which results in this promoter becoming inducible by a substrate. inductor.
  • the presence of said inducing substrate in the culture medium leads to the production of said cellulase by the modified strain, it being understood that said inducing substrate exerts little or no effect on a T. reesei strain. wild.
  • the particularity of the invention lies in the fact that the cellulase genes remain inducible by their own inducing substrates, such as lactose, cellobiose or cellulose.
  • the inventors have exemplified several different strains of T. reesei whose promoter of the bgl1 gene has been modified. For the sake of clarity, these constructions are called constructions or strains C1, C2, C4 and C5.
  • the genome of Trichoderma reesei is modified such that the regulatory element of the promoter sequence of the xynl gene comprising the sequence shown in SEQ ID No. 1 is inserted between positions -628 and -411 compared to the translation initiation site of the gene encoding ⁇ -glucosidase.
  • the regulatory element of the promoter sequence of the xynl gene consists of the sequence represented in SEQ ID No. 1.
  • the sequence represented in SEQ ID No. 1 is inserted between positions 622 and 839 of the sequence shown in SEQ ID No. 15.
  • This modified strain of T. reesei is referred to as "Cl construct” or "Cl strain".
  • the strain was substituted for 217 base pairs (bp) of the bgl1 promoter by 217 bp of the regulatory element of the promoter sequence of the xynl gene. Therefore, the promoter of the bgl1 gene of the construct C1 comprises the sequence as represented in SEQ ID No. 5. This sequence represents the 1250 bp preceding the translation initiation site of the bgl1 gene in the C1 construct.
  • the genome of Trichoderma reesei is modified such that the regulatory element of the promoter sequence of the xynl gene comprising the sequence shown in SEQ ID NO: 3 is inserted between positions -633 and 0 by compared to the site of initiation of the translation of the gene coding for ⁇ -glucosidase.
  • the reference to the translation initiation site of the gene coding for ⁇ -glucosidase refers to the position before the insertion of the mutation.
  • the regulatory element of the promoter sequence of the xynl gene consists of the sequence represented in SEQ ID No. 3. The sequence represented in SEQ ID No. 3 is therefore inserted between the positions 617 and 1250 of the sequence represented in SEQ ID No. 15.
  • This modified strain of T. reesei is referred to as "C2 construction” or "C2 strain".
  • the strain was substituted for 633 bp of the bgl1 promoter by 541 bp of the regulatory element of the promoter sequence of the xynl gene.
  • the sequence is juxtaposed with the translation initiation site of bgl1. Therefore, the promoter of the bgl1 gene of construct C2 comprises the sequence as shown in SEQ ID NO: 6. This sequence represents the 1200 bp preceding the translation initiation site of the bgl1 gene in the C2 construct.
  • the genome of Trichoderma reesei is modified such that the regulatory element of the promoter sequence of the xynl gene comprising the sequence shown in SEQ ID No. 2 is inserted between positions -396 and -341 compared to the translation initiation site of the gene encoding ⁇ -glucosidase.
  • the regulatory element of the promoter sequence of the xynl gene consists of the sequence represented in SEQ ID No. 2. The sequence represented in SEQ ID No. 2 is therefore inserted between the positions 854 and 909 of the sequence represented in SEQ ID No. 15.
  • This modified strain of T. reesei is referred to as "C4 construct” or "C4 strain".
  • the strain underwent a 55 bp substitution of the bgl1 promoter by 55 bp of the regulatory element of the promoter sequence of the xyn2 gene. Consequently, the promoter of the bgl1 gene of the C4 construct comprises the sequence as represented in SEQ ID No. 8. This sequence represents the 1250 bp preceding the translation initiation site of the bgl1 gene in the C4 construct.
  • the genome of Trichoderma reesei is modified such that the regulatory element of the promoter sequence of the xyn2 gene comprising the sequence shown in SEQ ID No. 4 is inserted between positions -395 and 0 by compared to the site of initiation of the translation of the gene coding for ⁇ -glucosidase.
  • the reference to the translation initiation site of the gene coding for ⁇ -glucosidase refers to the position before the insertion of the mutation.
  • the regulatory element of the promoter sequence of the xyn2 gene consists of the sequence represented in SEQ ID No. 4. The sequence represented in SEQ ID No. 4 is therefore inserted between the positions 855 and 1250 of the sequence represented in SEQ ID No. 15.
  • This modified strain of T. reesei is referred to as "C5 construct” or "C5 strain".
  • the strain was substituted for 395 bp of the bgl1 promoter by 235 bp of the regulatory element of the xyn2 gene promoter sequence.
  • the sequence is juxtaposed with the translation initiation site. Consequently, the promoter of the bgl1 gene of the C5 construct comprises the sequence as represented in SEQ ID No. 9. This sequence represents the 1151 bp preceding the translation initiation site of the bgl1 gene in the C5 construct.
  • Strains C1, C2, C4 and C5 are inducible by sugars which did not exert little or no inducing effect in wild T. reesei strains. In particular, these strains are inducible by xylose for the production of ⁇ -glucosidase.
  • another subject of the invention relates to a strain of Trichoderma reesei whose genome is modified so that the promoter of the ⁇ -glucosidase comprises a sequence chosen from the sequences represented in SEQ ID No. 5, 6, 8 or 9.
  • the genome of the strain of the invention is modified so that the promoter of the ⁇ -glucosidase more preferably comprises the sequences shown in SEQ ID No. 8 or 9.
  • said genome comprises the sequence shown in SEQ ID No. 5.
  • C3 construct or "C3 strain”.
  • the genome of Trichoderma reesei is modified so that the regulatory element of the promoter sequence of the xynl gene comprising the sequence shown in SEQ ID No. 16 is inserted between positions -1121 and -893 relative to the site for initiation of the translation of the gene coding for ⁇ -glucosidase.
  • the sequence represented in SEQ ID No. 16 is therefore inserted between the positions 129 and 357 of the sequence represented in SEQ ID No. 15.
  • the strain was substituted for 228 bp of the bgl1 promoter by 230 bp of the regulatory element of the xynl gene promoter sequence.
  • the promoter of the bgl1 gene of the C3 construct comprises the sequence as represented in SEQ ID No. 7. This sequence represents the 1250 bp preceding the translation initiation site of the bgl1 gene in the C3 construct.
  • the C3 construct is therefore characterized by an insertion of the regulatory element of the promoter sequence of the selected xynl gene upstream of the -800 and 0 positions relative to the translation initiation site of the gene coding for said cellulase.
  • the strain C3 has a lower inducibility of cellulase production than that observed for the other constructions. In particular, this construct is not inducible by xylose for the production of ⁇ -glucosidase.
  • the invention in a second aspect, relates to mutation cassettes comprising a sequence selected from the sequences shown in SEQ ID SEQ ID Nos. 10 to 14. These cassettes are linear cassettes making it possible to obtain a strain according to the invention from a wild T. reesei strain.
  • cassette or “mutation cassette” is meant a DNA structure allowing the integration of a gene of interest or a fragment of said gene of interest into a target DNA fragment, typically according to the principle of homologous recombination.
  • said cassette is linear and comprises a module comprising a marker gene and / or the gene to be integrated, this module being flanked on either side of DNA fragments homologous to those of the ends of the targeted integration site.
  • the cassette comprising the sequence as represented in SEQ ID No. 10 is used to obtain the C1 strain, that is to say a T. reesei strain whose genome is modified so that the control element of the promoter sequence of the xynl gene comprising the sequence shown in SEQ ID NO: 1 is inserted between positions -628 and -411 relative to the translation initiation site of the bgl1 gene.
  • the cassette comprising the sequence as represented in SEQ ID No. 11 is used to obtain the strain C2, that is to say a T. reesei strain whose genome is modified so that the promoter sequence of the xynl gene comprising the sequence shown in SEQ ID NO: 3 is inserted between positions -633 and 0 relative to the translation initiation site of the bgl1 gene.
  • the cassette comprising the sequence as represented in SEQ ID No. 12 is used to obtain strain C3, that is to say a T. reesei strain whose genome is modified so that the control element of the promoter sequence of the xynl gene comprising the sequence shown in SEQ ID No. 16 is inserted between positions -1121 and -893 relative to the translation initiation site of the bgl1 gene.
  • the cassette comprising the sequence as represented in SEQ ID No. 13 is used to obtain the strain C4, that is to say a T. reesei strain whose genome is modified so that the control element of the sequence Promoter of the xynl gene comprising the sequence shown in SEQ ID NO: 2 is inserted between positions -396 and -341 relative to the translation initiation site of the bgl1 gene.
  • the cassette comprising the sequence as represented in SEQ ID No. 14 is used to obtain the strain C5, that is to say a T.
  • the mutation cassettes are the sequences represented in SEQ ID Nos. 10, 11, 13 and 14. In one embodiment, the mutation cassettes are the sequences represented in SEQ ID No. 13 or 14. In another embodiment embodiment, said genome comprises the sequence shown in SEQ ID No. 10.
  • cassettes are used to insert mutations in the T. reesei genome.
  • Mutational techniques are known to those skilled in the art. It is possible to provide different techniques ensuring the mutation of interest. It will be possible, for example, to use the mutationsystems known to those skilled in the art, as well as the insertions or other modifications of DNA obtained by the homologous recombination techniques.
  • this insertion is implemented by homologous recombination, typically using a vector or a linear cassette.
  • the cassette is co-transformed with a vector that contains the selection marker.
  • the term "vector” is intended to mean any DNA sequence in which it is possible to insert foreign nucleic acid fragments, the vectors making it possible to introduce foreign DNA into a host cell.
  • vectors are plasmids, cosmids, artificial yeast chromosomes (YAC), artificial chromosomes of bacteria (BAC) and artificial chromosomes derived from bacteriophage PI (PAC), vectors derived from viruses.
  • the vector according to the invention allows the introduction of a mutation and / or a deletion.
  • the nucleic acid as described above may be operably linked to a promoter, a terminator or any other sequence necessary for its expression in the host cell.
  • the vector according to the invention carries a selection marker.
  • the selection marker is present on a second vector.
  • selection marker is meant a gene whose expression confers on the cells containing it a characteristic allowing them to be selected. This is for example an antibiotic resistance gene or a gene conferring independence vis-à-vis a particular metabolite.
  • the mutation cassette can then be amplified according to standard techniques well known to those skilled in the art, typically by a method chosen from conventional cloning, PCR fusion, or in vivo cloning in yeast by PCR. In the context of the invention, this cassette is preferentially amplified by PCR.
  • the mutation cassette is then recombinantly introduced into a T. reesei strain that does not express a selectable marker gene.
  • mutant strains having incorporated the mutation cassette are selected according to the expression or absence of the selection marker; clones having been transformed expressing said selection marker.
  • said mutation cassette is a linear cassette.
  • This mutation cassette can be obtained after cloning into a vector as described above and transformation of T. reesei.
  • the integration of a gene of interest into a target DNA fragment is done according to the principle of homologous recombination.
  • a linear cassette comprises a module comprising the portion of DNA to be integrated flanked on either side of DNA fragments homologous to those of the ends of the integration site. target. After transformation of the fungus with the cassette by appropriate methods, homologous recombination between the construction sequences and corresponding regions of the target gene results in the replacement of the target DNA fragment by the integration cassette.
  • a second cassette includes the selective marker gene.
  • said mutation cassette may be a substitution cassette allowing
  • the invention relates to the use of the strain according to the invention for the production of cellulolytic enzymes, preferably in the presence of an inducing substrate selected from xylan; xylose; oligomers of xylose; arabinose; a hydrolyzate of hemicellulose; and their mixtures.
  • an inducing substrate selected from xylan; xylose; oligomers of xylose; arabinose; a hydrolyzate of hemicellulose; and their mixtures.
  • inducers may be mixed with a cellulase-inducing substrate, such as lactose or cellulose, to obtain a higher induction.
  • Another subject of the invention also relates to the use of the strain according to the invention for the hydrolysis of cellulose to glucose.
  • Another subject of the invention relates to the use of the strain according to the invention for the production of biobased products from glucose.
  • Biobased product means any product which is not of fossil origin and which does not contain any organic product of fossil origin.
  • fluossil product means any organic product derived from petroleum or coal or from petroleum or coal products. Preferentially, in the context of the invention, it is an alcohol, such as isopropanol, butanol or ethanol.
  • another subject of the invention relates to the use of the strain according to the invention for the production of biofuels.
  • the term "biofuel” can be defined as any product resulting from the transformation of biomass and can be used for energy purposes.
  • biogas products which can be incorporated (possibly after further processing) into a fuel or be a fuel in their own right, such as alcohols (the ethanol, butanol and / or isopropanol depending on the type of fermentative organism used), solvents (acetone), (butyric) acids, lipids and their derivatives (short or long chain fatty acids, esters of fat), as well as hydrogen.
  • the biofuel according to the invention is an alcohol, for example ethanol, butanol and / or isopropanol. More preferably, the biofuel according to the invention is ethanol.
  • the invention relates to a process for producing ⁇ -glucosidase comprising the step of culturing a strain of Trichoderma reesei whose genome is modified by the insertion of at least one regulatory element of the promoter sequence of a gene chosen from xynl and xynl, in the promoter sequence of the gene encoding ⁇ -glucosidase,
  • the regulatory element of the xynl gene promoter sequence comprises the sequence shown in SEQ ID NO: 1 or the sequence shown in SEQ ID NO: 3;
  • the regulatory element of the promoter sequence of the xynl gene comprises the sequence represented in SEQ ID No. 2 or the sequence represented in SEQ ID No. 4,
  • a substrate selected from lactose and cellulose or a mixture thereof;
  • an inducing substrate selected from xylan; xylose; oligomers of xylose; arabinose; a composition comprising glucose, xylose, galactose, mannose, cellobiose and acetic acid; and their mixtures. All of the above technical specifications apply here.
  • the invention relates to a process for producing a biofuel, preferably ethanol, from cellulosic or lignocellulosic materials, comprising steps of pretreatment of a cellulosic or lignocellulosic substrate, of enzymatic hydrolysis of the pretreated substrate, and alcoholic fermentation of the obtained hydrolyzate, in which is used to produce the cellulolytic and / or hemicellulolytic enzymes, a strain of Trichoderma reesei according to the invention in the presence of an inducing substrate selected from xylan; xylose; oligomers of xylose; arabinose; a hydrolyzate of hemicellulose; and their mixtures.
  • an inducing substrate selected from xylan; xylose; oligomers of xylose; arabinose; a hydrolyzate of hemicellulose; and their mixtures.
  • SEQ ID No. 1 and SEQ ID No. 3 represent a regulatory element of the promoter sequence of the xynl gene.
  • SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 4 represent a regulatory element of the promoter sequence of the xynl gene.
  • SEQ ID No. 5 represents the 1250 bp preceding the translation initiation site of the bgl1 gene in the C1 construct.
  • SEQ ID No. 6 represents the 1200 bp preceding the translation initiation site of the bgl1 gene in the C2 construct.
  • SEQ ID No. 7 represents the 1250 bp preceding the translation initiation site of the bgl1 gene in the C3 construct.
  • SEQ ID No. 8 represents the 1250 bp preceding the translation initiation site of the bgl1 gene in the C4 construct.
  • SEQ ID No. 9 represents the 1151 bp preceding the translation initiation site of the bgl1 gene in the C5 construct.
  • SEQ ID NO: 10 represents the cassette used to obtain the construction Cl.
  • SEQ ID No. 11 represents the cassette used to obtain the construction C2.
  • SEQ ID NO: 12 represents the cassette used to obtain the C3 construction.
  • SEQ ID NO: 13 represents the cassette used to obtain the C4 construction.
  • SEQ ID No. 14 represents the cassette used to obtain the C5 construction.
  • SEQ ID No. 15 represents the 1250 bp preceding the site for initiation of the translation of the bgl1 gene into the wild strain of Trichoderma reesei. It is therefore a fragment of the native promoter of bgl1 in T. reesei.
  • SEQ ID No. 16 represents a regulatory element of the promoter sequence of the xynl gene. This sequence also includes the sequence as represented in SEQ ID No. 1.
  • Figure 1 Schematic of the 4 constructs of the bgll promoter
  • C1 to C3 contain xynl promoter sequences
  • C4 and C5 contain motifs from the xynl promoter.
  • the HAP2 / 3/5 and Xyrl motifs identified within the bgl1 promoter are maintained.
  • Figure 2 Ratio of transcripts bgl1 at 4, 24, and 48 h in the modified strains and the control strain relative to the level of transcripts bgl1 to T0 (normalized to 1).
  • the expression was normalized with respect to the sari gene whose expression is constant. These are the average values obtained in two clones per construct, and two cultures / clone, except for C2.
  • Figure 2A shows the results for QM9414 Aku70 pyr4-
  • FIG. 2C shows the results for the C2 construction
  • FIG. 2D shows the results for the C3 construct
  • FIG. 2F shows the results for the C5 construct.
  • the substrates tested are as follows:
  • Xylose 0.07% which corresponds to a mixture of 0.075% xylose and 1% glycerol
  • the expression was normalized with respect to the sari gene whose expression is constant.
  • FIG. 4 beta-glucosidase activities measured in the supernatants of the cultures of the RutC30 control strain and the two clones comprising the C4 construct, 48 or 72 h after addition of lactose (Lac), xylan (XN) or hemicellulose hydrolyzate substrates.
  • the inventors have developed several exemplary constructions C1, C2, C4 and C5 and a construct C3 used to show the positive effect of the xynl motif, as follows:
  • Construction C3 substitution of a fragment located upstream of the cis elements of the bgl1 promoter by a minimal sequence allowing the regulation of the promoter of the xynl gene.
  • Construction C4 substitution of a fragment of the bgl1 promoter by a minimal sequence allowing the regulation of the promoter of the xynl gene.
  • Construction C5 Substitution of a fragment of the bgl1 promoter by the minimal promoter of the xynl gene.
  • the constructs were made using the Gibson Assembly Cloning Kit (New England Biolabs).
  • the design of the primers for the amplification of the DNA fragments to be associated was carried out via the software http://nebuilder.neb.com/. These primers have been designed to have a tail of 15 to 80bp, which is complementary to the end of the fragment to be joined.
  • the vector plasmid used was the bacterial plasmid pUC19, carrying the ampicillin resistance gene ampR. Before being used as a vector, this plasmid was opened by restriction enzymes Xhol and EcoRI (New England Biolabs) and purified on a column (PCR Purification kit, Qiagen).
  • the plasmid was amplified by transformation in E. coli (provided in the kit) and extracted (Plasmid Plus Midi kit, Qiagen).
  • the replacement cassettes were amplified from the plasmid extracted by PCR.
  • T. reesei was grown in Roux vials containing 200 mL of Potato Dextrose Broth (Difco Laboratories USA) for 3 days at 30 ° C without shaking.
  • the mycelium was collected by filtration on sterile gauze and washed in 200 ml of buffer KPAM ((NH 4) 2 S0 4 0.6M, KH 2 P0 4 25 mM; pH 5.8) via a 30 min incubation at 37 ° C, 150 rpm.
  • KPAM buffer KPAM
  • the fungal wall of the cells was digested by incubation with 100 mL of KPAm buffer containing 30 mg / mL of Glucanex (Novozymes).
  • the cells were then passed on fritted glass, recovered in the filtrate and transferred into 5 Corex 20 mL tubes. They were then precipitated by centrifugation (4000 rpm, 5 min, 4 ° C). Each pellet was washed with 20 mL of CTS10 Buffer (0.4 M sucrose, 100 mM pH 7.5 Tris-HCl, 10 mM CaCl 2 ) and after centrifugation (4000 rpm, 5 min, 4 ° C) the protoplasts been collected in 3 tubes. They were resuspended in 20 mL of CTS10 and precipitated by further centrifugation (4000 rpm, 5 min, 4 ° C).
  • CTS10 Buffer 0.4 M sucrose, 100 mM pH 7.5 Tris-HCl, 10 mM CaCl 2
  • the cells were diluted in 40 mL of selective overlay medium (selective medium agar supplemented with 0.8 M sucrose to maintain the osmotic pressure of the protoplasts) warm (between 50 and 55 ° C) prior to be plated on 5 dishes (8 ml / dish) of selection medium (selective agar medium supplemented with 0.2 M sucrose).
  • selective overlay medium selective medium agar supplemented with 0.8 M sucrose to maintain the osmotic pressure of the protoplasts
  • selection medium selective agar medium supplemented with 0.2 M sucrose
  • RNA extraction, retro transcription and quantitative PCR The frozen mycelium was taken up in 700 ⁇ l of RLT buffer (RNeasy Mini Kit, Qiagen) supplemented with 7 ⁇ l ⁇ of pure ⁇ -mercaptoethanol and ground in tubes containing beads (Lysing matrix C, MP Biomedicals) with the Fastprep (MP Biomedicals) shaker for 40 sec at maximum speed. The tubes were then centrifuged for 5 min (4 ° C, 14,000 rpm) and the supernatant transferred to QIAshredder columns (Qiagen) to separate the liquid phase from the cell debris.
  • RLT buffer RNeasy Mini Kit, Qiagen
  • the Cl, C2 and C3 constructs contain the 217 bp motif identified as responsible for the induction of the xynl gene, this sequence being represented in SEQ ID No. 1.
  • the C4 and C5 constructs in turn, contain the 55 bp essential for the induction of the xynl gene (Zeilinger et al., 1996), this sequence being represented in SEQ ID No. 2.
  • the motifs were placed at the same distance from the transcription start (symbolized by an arrow in Figure 1) as in their original genes.
  • the 153 bp distance between the beginning of the xynl motif and the start of xynl transcription is conserved in C1 and C2, and the 82 bp distance observed in xynl is conserved at the C4 and C5 constructs.
  • the xynl motif was placed upstream of the cis elements of the bgl1 promoter to demonstrate the positional effect of the xynl motif.
  • constructs C2 and C5 in addition to the induction element pattern, the entire sequence downstream of the xynl and xynl genes to the beginning of the coding sequence (thus including the 5 'UTR sequence) was inserted. Since 5'UTR is shorter in the xynl and xynl genes than in the bgll gene, the total length upstream of the translation initiation site (ie ATG) is therefore shorter than in bgll. . After transformation, PCR and locus sequencing were performed to confirm the correct insertion of the motifs. Two clones for each construct were chosen for analysis (with the exception of C2, for which only one clone could be obtained). For these, the modified strains and the starting strain QM9414 Aku70 pyr4- were put in the presence of different carbon sources:
  • the bgl1 gene is significantly induced only in the presence of lactose in the control strain (panel A). This induction is reduced, but always present, in the strains having integrated the Cl, C2 and C3 constructions, that is to say containing the xynl motif in the bgll promoter. Strains possessing the C4 and C5 constructs, on the other hand, retain a significant (60 to 90-fold) induction by lactose.
  • xylan and hemicellulose hydrolyzate also leads to induction in these four strains, of about the same order of magnitude as in the presence of 1% xylose.
  • the C3 construct confers inducibility only in the presence of xylan, but not in the presence of the pentose monomers, emphasizing the importance of the proper positioning of the xynl motif in the promoter and with respect to the initiation of transcription and translation: If the xynl motif is placed between -1121 and -893 bp before the translation initiation site of the bgl1 gene, no induction by the pentose monomers is observed.
  • the sequence between the xynl and xynl motif, respectively, and the initiator codon also has an effect on inducibility: in strains possessing the C2 construct, the bgl1 gene is induced more prominently in the presence of xylan and hemicellulose hydrolyzate. in the strains possessing the C1 construct.
  • this induction is more or less strong.
  • the inventors have shown that it is possible to change the expression profile of ⁇ -glucosidase, but also of cellulases in the presence of inexpensive inductors such as xylose and thus to obtain a cocktail having cellulase activities. -glucosidase and xylanase balanced under these conditions.
  • the inventors have also modified the promoter of the bgl1 gene in a T. reesei RutC30 hyperproductive strain.
  • the ⁇ -glucosidase activities are determined by the hydrolysis of the p-nitrophenol-glucopyranoside substrate (pNPG) to glucose and p-nitrophenol which absorbs light at 410 nm.
  • the reaction mixture contains 90 ⁇ l of pNPG substrate (5 mM in 50 mM citrate buffer at pH 4.8) and 10 ⁇ l of culture supernatant, possibly diluted beforehand.
  • RNA was extracted and the expression of the bgl1 gene determined by RT-qPCR. In parallel, the activity of beta-glucosidase was measured in the supernatants taken at T 48h and 72h. The results are shown in Figures 3 and 4.
  • the level of expression of the bgl1 gene in the modified strains is multiplied by a factor of 60 to 100 in the presence of lactose after 6 hours of exposure, compared to the strain RutC30.
  • This increase in transcript level results in an increase in activity by a factor of 2 and 3 after 48 and 72 h, respectively, in strains with modified promoter.
  • the level of expression of the bgl1 gene in these strains in the presence of xylan increases by a factor of 50 to 60 after 6 h and on hydrolyzate of hemicellulose by a factor of 5 to 6, relative to the control strain. RutC30.
  • the beta-glucosidase activity increases only slightly in the presence of xylan, but doubles on a hemicellulose hydrolyzate for one of the two clones.
  • the results with the hyperproductive strain RutC30 thus confirm that integration of the xyn2 motif into the bgl1 promoter leads to an increase in gene expression.
  • this strain which is not subject to catabolic repression, unlike strain QM414, the increase is observed not only on pentoses, but also on lactose.

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Abstract

L'invention concerne des souches de Trichoderma reesei dont l'inductibilité des promoteurs des gènes de cellulases est modifiée. L'expression de cellulases par ces souches de T. reesei est induite par la présence d'un substrat inducteur, ledit substrat inducteur n'exerçant pas ou peu d'effet inducteur sur une souche de T. reesei non modifiée, tout en gardant l'inductibilité des cellulases par leur substrat inducteur.

Description

Promoteurs inductibles de Trichoderma reesei
Domaine de l'invention
L'invention concerne des souches de Trichoderma reesei dont l'inductibilité des promoteurs des gènes impliqués dans la dégradation de la cellulose est modifiée.
Arrière-plan technologique
La possibilité de produire de l'éthanol à partir de la cellulose a reçu beaucoup d'attention en raison de la disponibilité de grandes quantités de matière première ainsi que de l'intérêt de l'éthanol à titre de carburant. Les matières premières naturelles cellulosiques pour un tel processus sont désignées par le terme "biomasse" ou "biomasse lignocellulosique". De nombreux types de biomasse, par exemple le bois, les résidus agricoles, les cultures herbacées et les déchets solides municipaux, ont été considérés comme des matières premières potentielles pour la production de biocarburant.
Des unités pilote ou de démonstration voire industrielles de production d'éthanol de deuxième génération par voie biologique ont donc vu le jour ces dernières années. Toutefois, une production à très large échelle a été freinée par l'inefficacité de l'extraction des sucres fermentescibles à partir de la biomasse lignocellulo sique .
En effet, la paroi végétale contient trois grands types de composés qui se trouvent intimement liés : la cellulose et les hémicelluloses, polymères de sucres, et la lignine, un composé complexe constitué d'unités de phenylpropane. La lignine est associée au réseau fibrillaire (constitué de cellulose et d'hémicelluloses) par des liaisons de type chimique (notamment des liaisons éthers ou esters) et des liaisons hydrogène, ce qui rend la matière fibrillaire difficilement accessible et hydrolysable.
Un prétraitement physico-chimique est généralement appliqué pour désintégrer cette structure complexe et donner accès aux carbohydrates contenant les sucres fermentescibles, il s'agit principalement de la cellulose. Ce polymère est constitué de molécules de glucose reliées entre elles par des liaisons β1-4 très résistantes à la dégradation ou à la dépolymérisation. Une fois la cellulose convertie en glucose, celui-ci est facilement fermenté en biocarburant, par exemple en éthanol, en utilisant une levure. Les hémicelluloses sont des hétéropolymères principalement constitués d'unités pentoses (xylose, arabinose) ou hexoses (mannose, glucose et galactose) pouvant se trouver sous leurs formes acétylées ou méthylées. Il existe une grande diversité d'hémicelluloses en fonction des constituants du squelette principal (généralement xylane ou mannane) et des composants des ramifications (résidus aromatiques, acides glucuronique, galacturonique, acétique etc...).
La dégradation enzymatique de la cellulose et des hémicelluloses est un processus lent et peu efficace. Certains microorganismes se sont spécialisés dans l'hydrolyse de la lignocellulose et sécrètent différentes enzymes glycolytiques. La dégradation de la cellulose nécessite trois types d'activités principaux :
les exo-P-l,4-glucanases ou cellobiohydrolases (CBH) qui coupent les chaînes polysaccharidiques en leurs extrémités en libérant des unités cellobiose (dimère de glucose),
les endo-P-l,4-glucanases (EG) qui coupent les chaînes de cellulose aléatoirement, générant ainsi de nouvelles extrémités pouvant être attaquées par les exoglucanases, et
les β-glucosidases (BGL) qui hydrolysent le cellobiose en deux unités glucose. Les hémicellulases, qui réalisent l'hydrolyse des hémicelluloses, sont de nature aussi variée que le sont les hémicelluloses. Parmi celles-ci, on trouve les
xylanases, qui coupent aléatoirement les chaînes de xyloses,
les mannanases, qui clivent les chaînes de mannoses,
les β-xylosidases et β-mannosidases, qui clivent les dimères de xylose ou de mannose, respectivement, et
les arabinofuranosidases, qui coupent les liaisons xylose-arabinose.
Parmi les microorganismes sécréteurs de cellulases performantes, on trouve les champignons de genres Trichoderma, Aspergillus, Humicola, Fusarium ainsi que des bactéries telles que Thermomonospora, Bacillus, Cellulomonas et Streptomyces.
Trichoderma reesei (ou T. reesei) est un champignon filamenteux saprophyte de la division des Ascomycètes. T. reesei est aujourd'hui considéré comme le seul microorganisme capable de répondre aux besoins mondiaux en cellulases des applications agro-carburants, en raison de ses capacités de sécrétion élevées.
Aujourd'hui, les meilleures souches peuvent sécréter jusqu'à 100 g/L de protéines, majoritairement représentées par des cellulases et hémicellulases. Les deux cellulases majoritaires de ce cocktail de dégradation (80% des protéines sécrétées) sont les cellobiohydrolases CEL7A et CEL6A (anciennement dénommées CBH1 et CBH2). Ce cocktail cellulolytique contient aussi 5 endoglucanases (CEL7B, CEL5A, CEL5B, CEL12A et CEL45A) et des β-glucosidases (principalement BGLI) qui sont associées à des protéines auxiliaires supposées aider à la dégradation de la cellulose, telles que la swollenine, les protéines CIP1 et CIP2 ou les « lytic polysaccharide monooxygenases » (LPMOs ou AA9).
En complément de son système cellulolytique, T. reesei dispose aussi d'un système hémicellulolytique complexe composé de 4 xylanases (XYN1 à 4), d'une xyloglucanase (CEL74A), d'une β-xylosidase (BXL1), de 3 a- arabinofuranosidases (ABF1 à 3), de 2 a-arabinofuranosidases/p-xylosidases, d'une acétyl xylan esterase (AXE1) et d'une β-mannanase (MAN1). Cependant, le coût de production des cellulases reste élevé et représente un des obstacles économiques pour une mise en œuvre à l'échelle industrielle des procédés de valorisation des biocarburants.
Industriellement, la production optimisée de cellulases par Trichoderma reesei est réalisée en protocole fed-batch (alimentation sans soutirage) en utilisant une solution d'alimentation contenant du lactose comme sucre inducteur de la production de cellulases. Bien qu'utilisé industriellement, le lactose présente l'inconvénient d'être onéreux. Pour pallier ce problème, il a été proposé de réduire le coût de production des cellulases en utilisant les sucres issus des hémicelluloses qui sont libérés lors du prétraitement physico-chimique de la biomasse (p. ex. explosion à la vapeur en conditions acides) pour la propagation de T. reesei et la production d'enzymes. Toutefois, ce mélange ne contient pas ou peu de sucres capables d'induire la production des cellulases par T. reesei. Par conséquent, il est toujours nécessaire d'ajouter une certaine quantité de lactose. II a également été proposé de remplacer le lactose par le xylose, qui est un produit d'hydrolyse des xylanes et l'un des sucres majoritaires obtenu lors de l'étape du prétraitement de la biomasse, pour diminuer le coût de production. Or, les gènes des cellulases et le gène bgll en particulier, codant pour la principale β- glucosidase extracellulaire, ne sont pas induits par le xylose ou autres produits de dégradation du xylane. Par conséquent, l'utilisation d'un sucre inducteur moins onéreux tel que le xylose ne permet pas de diminuer le coût de production des cellulases.
Ainsi, pris dans son ensemble, l'art antérieur fait apparaître un besoin inassouvi et longtemps attendu de développer des souches de T. reesei aux performances de production de cellulases améliorées. C'est le problème que se propose de résoudre la présente invention.
Résumé de l'invention
Les inventeurs ont développé des souches modifiées de T. reesei, dans lesquelles des éléments de régulation des séquences promotrices des gènes des xylanases xynl et xynl ont été insérés dans les promoteurs des cellulases. Cette modification a permis de conférer l'inductibilité des xylanases aux gènes des cellulases. En d'autres termes, l'expression de cellulases par ces souches de T. reesei est induite par la présence d'un substrat inducteur, ledit substrat inducteur n'exerçant aucun effet inducteur sur une souche de T. reesei sauvage, pour la production d'une telle cellulase. Ainsi, dans un premier aspect, l'invention concerne une souche de Trichoderma reesei dont le génome est modifié par l'insertion d'au moins un élément de régulation de la séquence promotrice d'un gène choisi parmi xynl et xyn2, dans la séquence promotrice d'un gène codant pour une cellulase, étant entendu que :
l'élément de régulation de la séquence promotrice du gène xynl comprend la séquence représentée en SEQ ID N°l ou la séquence représentée en
SEQ ID N°3;
l'élément de régulation de la séquence promotrice du gène xynl comprend la séquence représentée en SEQ ID N°2 ou la séquence représentée en
SEQ ID N°4.
Préférentiellement, ladite insertion s'effectue entre les positions -800 et 0 par rapport au site d'initiation de la traduction du gène codant pour ladite cellulase.
Préférentiellement, ladite cellulase est choisie parmi les exo-P-l,4-glucanases ou cellobiohydrolases, les endo-P-l,4-glucanases et les β-glucosidases. Plus préférentiellement, ladite cellulase est la β-glucosidase. Dans un mode de réalisation, le génome de T. reesei est modifié de telle sorte que le promoteur du gène bgll codant pour la β-glucosidase comprend une séquence choisie parmi les séquences représentées en SEQ ID N°5, 6, 8 ou 9.
Préférentiellement, la production de cellulases par ladite souche est inductible par la présence d'un substrat inducteur choisi parmi le xylane; le xylose; les oligomères du xylose ou xylo-oligomères ; l'arabinose; une composition comprenant du glucose, du xylose, du galactose, du mannose, du cellobiose et de l'acide acétique ; et leurs mélanges. Dans le contexte de l'invention, les souches de T. reesei selon l'invention maintiennent l'inductibilité de la production de cellulases par les substrats classiquement utilisés, tels que le lactose ou la cellulose. Aussi, dans un mode de réalisation préféré, la souche de l'invention est caractérisée en ce que la production de cellulase par ladite souche est inductible par le lactose, la cellulose ou un mélange de lactose ou cellulose avec un substrat inducteur choisi parmi : le xylane ; le xylose ; les oligomères du xylose, l'arabinose ; une composition comprenant un mélange de glucose, de xylose, de galactose, de mannose, de cellobiose et d'acide acétique; et leurs mélanges.
Dans un mode de réalisation particulier, l'élément de régulation de la séquence promotrice du gène xynl comprend la séquence représentée en SEQ ID N°l et est inséré entre les positions -628 et -411 par rapport au site d'initiation de la traduction du gène codant pour la β-glucosidase.
Dans un autre mode de réalisation, l'élément de régulation de la séquence promotrice du gène xynl comprend la séquence représentée en SEQ ID N°3 et est inséré entre les positions -633 et 0 par rapport au site d'initiation de la traduction du gène codant pour la β-glucosidase.
Dans un autre mode de réalisation, l'élément de régulation de la séquence promotrice du gène xynl comprend la séquence représentée en SEQ ID N°2 et est inséré entre les positions -396 et -341 par rapport au site d'initiation de la traduction du gène codant pour la β-glucosidase.
Dans un autre mode de réalisation, l'élément de régulation de la séquence promotrice du gène xynl comprend la séquence représentée en SEQ ID N°4 et est inséré entre les positions -395 et 0 par rapport au site d'initiation de la traduction du gène codant pour la β-glucosidase.
Dans un second aspect, l'invention concerne une cassette de mutation comprenant une séquence choisie parmi les séquences représentées en SEQ ID N°10 à 14, préférentiellement une séquence choisie parmi les séquences représentées en SEQ ID N°10, 11, 13 et 14. Dans un troisième aspect, l'invention concerne les utilisations d'une souche de T. reesei selon l'invention, notamment pour la production d'enzymes cellulolytiques, pour l'hydrolyse de la cellulose en glucose, pour la production de produits biosourcés à partir du glucose, ou encore pour la production de biocarburants.
Description détaillée de l'invention
Souches de T. reesei modifiées
Le xylane ou ses produits d'hydrolyse, le xylose ou le xylobiose, sont connus pour induire l'expression des gènes des hémicellulases, dont les xylanases. Il a été démontré que des sucres C5, tel que le xylose ou l'arabinose, induisent les xylanases xynl et xynl de T. reesei (Mach et al., 1996 ; Zeilinger et al., 1996). Cette induction passe par l'activation du facteur de transcription Xyrl. Chez le promoteur du gène xynl, Xyrl se fixe au niveau du motif répété et inversé 5'- GGCTAA-3' espacé de 10 pb. On parle de motif "xyrl ". L'induction nécessite la fixation simultanée d'un dimère de Xyrl, chaque monomère se fixant sur l'une des parties de la séquence répétée-inversée. Ces éléments se trouvent au sein d'une région de 217 pb, comprise entre -538 et -321pb en amont du site d'initiation de la traduction (ATG) du gène xynl. Cette région a été désignée comme contenant l'ensemble des éléments assurant la régulation de l'expression de xynl (Rauscher et al., 2006 ; Zeilinger et al., 1996). Cette séquence est représentée en SEQ ID N°l.
Concernant le gène xynl, un élément de 55 pb, le "xylanase activating élément", qui confère la régulation du gène a été mis en évidence. Cette région contient le motif de fixation pour le facteur Xyrl, ainsi que les facteurs de transcription ACE2 et HAP2/3/5 (Wurleitner et al., 2003). Cette séquence est représentée en SEQ ID N°2.
Il a été démontré qu'une diminution de la quantité de lactose et une augmentation de la quantité de xylose dans le milieu mène à une augmentation de l'activité xylanase, mais également à une baisse concomitante de l'activité cellulase et β- glucosidase (Jourdier et al., 2013).
Aussi, à l'issu de long et fastidieux travaux, les inventeurs ont réussi à s'affranchir de cette limitation, en conférant l'inductibilité des xylanases aux gènes des cellulases par modification de leur promoteur.
Plus spécifiquement, les inventeurs ont réussi à insérer des éléments de régulation des séquences promotrices des gènes de xylanases xynl et xynl dans les promoteurs des gènes codant pour les cellulases. Cette modification génétique a permis de développer des souches de T. reesei dont l'expression de cellulases est induite par la présence d'un substrat inducteur, ledit substrat inducteur n'exerçant aucun effet inducteur sur une souche de T. reesei sauvage pour la production d'une telle cellulase.
Cela permet la production d'un cocktail équilibré avec des plus fortes activités cellulase, β-glucosidase et xylanase, tout en utilisant des substrats inducteurs plus économiques.
Aussi, l'invention concerne une souche de Trichoderma reesei dont le génome est modifié par l'insertion d'au moins un élément de régulation de la séquence promotrice d'un gène choisi parmi xynl et xynl, dans la séquence promotrice du gène codant pour une cellulase,
étant entendu que :
l'élément de régulation de la séquence promotrice du gène xynl comprend la séquence représentée en SEQ ID N°l ou la séquence représentée en SEQ ID N°3;
l'élément de régulation de la séquence promotrice du gène xynl comprend la séquence représentée en SEQ ID N°2 ou la séquence représentée en SEQ ID N°4.
Trichoderma reesei ou T. reesei est un champignon filamenteux cellulolytique. Compte tenu de la capacité de T. reesei à sécréter de grandes quantités de cellulases et des hémicellulases, cette souche est hautement intéressante pour la production d'enzymes pour la transformation des matières de la biomasse végétale en bioproduits utiles à l'industrie, tels que le bioéthanol. Par "souche de référence de T. reesei", on entend une souche de Trichoderma reesei choisie parmi les souches QM6a, NG14, RUTC30 et QM9414. Ces souches sont accessibles au public et ont notamment fait l'objet de dépôts, respectivement sous les numéros:
- ATCC 13631 (souche QM6a);
- ATCC 56767 (souche NG14);
- ATCC 56765 (souche RUT C30); et
- ATCC 26921 (souche QM9414).
Par "souche selon l'invention" ou "souche modifiée", on entend désigner de manière indifférente dans la présente demande une souche de Trichoderma reesei dont au moins un promoteur d'un gène codant pour une cellulase a été modifié. Par "promoteur" ou "séquence promotrice", on entend une séquence d'ADN adjacente au site d'initiation de la transcription. Le promoteur est donc situé en amont du site d'initiation et porte des éléments de séquence reconnus par l'ARN- polymérase qui déterminent le sens de la transcription. En effet, le promoteur comprend non seulement des séquences définissant le site d'initiation de la transcription mais aussi des séquences consensus des sites de fixation de l'ARN polymérase et des complexes de transcription ainsi que des motifs régulateurs reconnus par des facteurs d'activation ou de répression de la transcription.
Les inventeurs ont muté le promoteur du gène bgll de telle sorte à modifier l'inductibilité de la souche. Ces modifications consistent en l'insertion d'une séquence choisie parmi les séquences représentées en SEQ ID N°l, 2, 3 et 4. Une partie de la séquence native du promoteur de bgll, quant à elle, est représentée en SEQ ID N°15. Plus précisément, SEQ ID N°15 représente les 1250 pb précédant le site d'initiation de la traduction du gène bgll dans la souche sauvage de Trichoderma reesei.
Dans un premier mode de réalisation, la souche de l'invention est caractérisée en ce que ce que ladite insertion s'effectue entre les positions -1250 et 0 par rapport au site d'initiation de la traduction du gène codant pour ladite cellulase. La référence à la position par rapport au site d'initiation de la traduction d'un gène, s'entend par la position sur la souche avant l'insertion d'un élément de régulation, c'est à dire avant la mutation. Cette numérotation peut donc aisément être établie par rapport à la séquence native du promoteur de bgll, tel que notamment représentée en SEQ JD N° 15 pour la β-glucosidase.
Préférentiellement, ladite insertion s'effectue entre les positions - 1200 et 0, préférentiellement entre les positions -1100 et 0, préférentiellement entre les positions -1000 et 0, préférentiellement entre les positions -900 et 0, préférentiellement entre les positions -800 et 0, encore plus préférentiellement entre les positions -700 et 0 par rapport au site d'initiation de la traduction du gène codant pour ladite cellulase.
Préférentiellement, cette insertion se fait entre les positions -700 et -400 par rapport au site d'initiation de la traduction du gène codant pour ladite cellulase. Préférentiellement, cette insertion se fait entre les positions -628 et -411 par rapport au site d'initiation de la traduction du gène codant pour ladite cellulase. Alternativement, cette insertion se fait entre les positions -400 et -300, plus préférentiellement entre les positions -396 et -341 par rapport au site d'initiation de la traduction du gène codant pour ladite cellulase.
Dans un second mode de réalisation, la souche de l'invention est caractérisée en ce que ce que ladite insertion ne s'effectue pas aux positions -1224 ; - 1218 ; -881 ; -874 ; -811 ; -805 par rapport au site d'initiation de la traduction du gène de la cellulase.
Sans vouloir être liés par la théorie, les inventeurs émettent l'hypothèse selon laquelle les positions :
• comprises entre -1224 et -1218 par rapport au site d'initiation de la traduction du gène de la cellulase ;
• comprises entre -881 et -874 par rapport au site d'initiation de la traduction du gène de la cellulase ;
• comprises entre -811 et -805 par rapport au site d'initiation de la traduction du gène de la cellulase ; correspondent à des positions spécifiques de reconnaissance par xyrl. Par conséquent, l'insertion d'une mutation à proximité de ces sites peut potentiellement conduire à une absence de modification l'inductibilité de la production de cellulases de la souche.
Par "cellulase", on entend une enzyme adaptée à l'hydrolyse de la cellulose et permettant aux microorganismes qui les produisent d'utiliser la cellulose comme source de carbone, en hydrolysant ce polymère en sucres simples (glucose). Préférentiellement, ladite cellulase est choisie parmi les exo-P-l,4-glucanases ou cellobiohydrolases, les endo-P-l,4-glucanases et les β-glucosidases. Plus préférentiellement, ladite cellulase est une β-glucosidase, de préférence celle encodée par le gène bgll. Ainsi, ladite insertion s'effectue dans le promoteur du gène codant pour la β-glucosidase extracellulaire, c'est-à-dire dans le promoteur de bgll .
Aussi, l'invention concerne une souche de Trichoderma reesei dont le génome est modifié par l'insertion d'au moins un élément de régulation de la séquence promotrice d'un gène choisi parmi xynl et xyn2, dans la séquence promotrice du gène codant pour la β-glucosidase. Préférentiellement, les motifs HAP2/3/5 et xyrl, présents sur le promoteur du gène bgll, ne sont pas modifiés et restent intacts. Les motifs HAP2/3/5 et xyrl correspondent à des motifs nucléiques reconnus par les facteurs de transcription XYR1 et HAP2/3/5.
Dans un mode de réalisation, le génome de la souche de l'invention peut être modifié par substitution d'un fragment du promoteur bgll par un élément de régulation de la séquence promotrice d'un gène xynl ou xynl. En d'autres termes, le génome de T. reesei peut être modifié par :
d'une part, l'excision d'un fragment du promoteur bgll, et
d'autre part, l'insertion d'un élément de régulation de la séquence promotrice d'un gène xynl ou xynl.
L'inductibilité de la production des cellulases par la souche de T. reesei selon l'invention est modifiée. Plus précisément, cette production peut être induite par la présence d'un substrat inducteur, préférentiellement un sucre inducteur, qui n'exerce pas ou peu d'effet sur une souche sauvage de T. reesei.
Par "souche de T. reesei sauvage" ou "souche de T. reesei non modifiée" on entend une souche de T. reesei qui ne comprend pas de mutation telle que décrite dans la présente invention, c'est à dire une souche dont les promoteurs des gènes de cellulase ne sont pas modifiés. Ladite souche sauvage peut également être une souche de référence de T. reesei. Par "induction", on entend la synthèse d'enzymes en réponse à l'apparition d'un produit spécifique. Il est connu que les microorganismes évitent la synthèse d'enzymes, par exemple d'une voie métabolique, en l'absence des substrats adéquats et que ces derniers sont prêts à synthétiser de telles enzymes si le substrat réapparaît. La souche selon l'invention a la particularité de produire des cellulases en présence d'un substrat qui n'est pas le substrat de la cellulase ainsi produite, en particulier le xylose. En effet, le xylose n'induit pas la production de cellulase chez les souches de T. reesei sauvages. En d'autres termes, les inventeurs ont réussi à développer une souche dont l'inductibilité est modifiée par rapport à la souche T. reesei sauvage.
Par "substrat inducteur", on entend un composé induisant une augmentation de l'expression de l'activité métabolique ciblée, toute condition expérimentale étant égale par ailleurs, l'activité métabolique est plus forte lorsque l'inducteur est à une concentration appropriée que lorsqu'il est absent ou à une concentration inadaptée. Dans le contexte de la présente invention, ledit substrat inducteur est préférentiellement un sucre sous forme de monomère, d' oligomère ou de polymère.
Préférentiellement, ledit substrat inducteur est choisi parmi
le xylane
le xylose ;
les oligomères du xylose ;
l'arabinose ;
un hydrolysat d'hémicellulose ; leurs mélanges.
Dans le contexte de l'invention, les souches de T. reesei selon l'invention maintiennent l'inductibilité de la production de cellulases par les substrats classiquement utilisés, tels que le lactose ou la cellulose.
Aussi, dans un mode de réalisation préféré, la souche de l'invention est caractérisée en ce que la production de cellulase par ladite souche est inductible par le lactose, la cellulose et un mélange de lactose avec un substrat inducteur choisi parmi : le xylane ; le xylose ; les oligomères du xylose ; l'arabinose ; une composition comprenant de glucose, de xylose, de galactose, de mannose, de cellobiose et d'acide acétique; et leurs mélanges.
Préférentiellement, la souche de l'invention est caractérisée en ce que la production de cellulase par ladite souche est inductible par
le lactose;
le xylose; et
un mélange de lactose et de xylose. Par "hydrolysat d' hémicellulose", on entend une composition comprenant un mélange de glucose, de xylose, de galactose, de mannose, de cellobiose et d'acide acétique.
Dans un mode de réalisation particulier, ledit substrat inducteur est un mélange de de xylane, de xylose, de xylobiose et/ou d'arabinose.
Préférentiellement, ledit substrat est l'hydrolysat d'hémicellulose.
Plus préférentiellement, ledit substrat est le xylane.
Dans un mode de réalisation, ledit substrat est le xylose. Alternativement, ledit substrat est des oligomères de xylose.
Par "oligomère du xylose" ou "xylo-oligomère", on entend une solution comprenant au moins un composé choisi parmi un dimère, un trimère, un tétramère, et un pentamère du xylose. Préférentiellement, ledit oligomère du xylose est le xylobiose.
Dans le contexte de l'invention, l'expression "modification de l'inductibilité de la production de cellulases" se réfère à la modification génétique du promoteur d'un gène de cellulase, qui a pour conséquence que ce promoteur devient inductible par un substrat inducteur. En d'autres termes, la présence dudit substrat inducteur dans le milieu de culture conduit à la production de ladite cellulase par la souche modifiée, étant entendu que ledit substrat inducteur n'exerce pas ou peu d'effet sur une souche de T. reesei sauvage.
La particularité de l'invention réside dans le fait que les gènes des cellulases restent inductibles par leurs propres substrats inducteurs, tels que le lactose, le cellobiose ou la cellulose.
Les inventeurs ont exemplifié plusieurs souches différentes de T. reesei dont le promoteur du gène bgll a été modifié. Par souci de clarté, ces constructions sont dénommées constructions ou souches Cl, C2, C4 et C5.
Dans un premier mode de réalisation, le génome de Trichoderma reesei est modifié de telle sorte que l'élément de régulation de la séquence promotrice du gène xynl comprenant la séquence représentée en SEQ ID N°l est inséré entre les positions -628 et -411 par rapport au site d'initiation de la traduction du gène codant pour la β-glucosidase. Préférentiellement, l'élément de régulation de la séquence promotrice du gène xynl consiste en la séquence représentée en SEQ ID N°l. La séquence représentée en SEQ ID N° 1 est donc insérée entre les positions 622 et 839 de la séquence représentée en SEQ ID N°15.
Cette souche modifiée de T. reesei est dénommée "construction Cl" ou "souche Cl". Dans ce mode de réalisation, la souche a subi une substitution de 217 paires de bases (pb) du promoteur bgll par 217 pb de l'élément de régulation de la séquence promotrice du gène xynl . Par conséquent, le promoteur du gène bgll de la construction Cl comprend la séquence telle que représentée en SEQ ID N°5. Cette séquence représente les 1250 pb précédant le site d'initiation de la traduction du gène bgll dans la construction Cl. Dans un second mode de réalisation, le génome de Trichoderma reesei est modifié de telle sorte que l'élément de régulation de la séquence promotrice du gène xynl comprenant la séquence représentée en SEQ ID N°3 est insérée entre les positions -633 et 0 par rapport au site d'initiation de la traduction du gène codant pour la β-glucosidase. La référence au site d'initiation de la traduction du gène codant pour la β-glucosidase s'entend de la position avant l'insertion de la mutation. Préférentiellement, l'élément de régulation de la séquence promotrice du gène xynl consiste en la séquence représentée en SEQ ID N°3. La séquence représentée en SEQ ID N°3 est donc insérée entre les positions 617 et 1250 de la séquence représentée en SEQ ID N°15.
Cette souche modifiée de T. reesei est dénommée "construction C2" ou "souche C2". Dans ce mode de réalisation, la souche a subi une substitution de 633 pb du promoteur bgll par 541 pb de l'élément de régulation de la séquence promotrice du gène xynl . Dans ce mode de réalisation, la séquence est juxtaposée au site d'initiation de la traduction de bgll. Par conséquent, le promoteur du gène bgll de la construction C2 comprend la séquence telle que représentée en SEQ ID N°6. Cette séquence représente les 1200 pb précédant le site d'initiation de la traduction du gène bgll dans la construction C2.
Dans un troisième mode de réalisation, le génome de Trichoderma reesei est modifié de telle sorte que l'élément de régulation de la séquence promotrice du gène xynl comprenant la séquence représentée en SEQ ID N°2 est inséré entre les positions -396 et -341 par rapport au site d'initiation de la traduction du gène codant pour la β-glucosidase. Préférentiellement, l'élément de régulation de la séquence promotrice du gène xynl consiste en la séquence représentée en SEQ ID N°2. La séquence représentée en SEQ ID N°2 est donc insérée entre les positions 854 et 909 de la séquence représentée en SEQ ID N°15.
Cette souche modifiée de T. reesei est dénommée "construction C4" ou "souche C4". Dans ce mode de réalisation, la souche a subi une substitution de 55 pb du promoteur bgll par 55 pb de l'élément de régulation de la séquence promotrice du gène xyn2. Par conséquent, le promoteur du gène bgll de la construction C4 comprend la séquence telle que représentée en SEQ ID N°8. Cette séquence représente les 1250 pb précédant le site d'initiation de la traduction du gène bgll dans la construction C4.
Dans un quatrième mode de réalisation, le génome de Trichoderma reesei est modifié de telle sorte que l'élément de régulation de la séquence promotrice du gène xyn2 comprenant la séquence représentée en SEQ ID N°4 est insérée entre les positions -395 et 0 par rapport au site d'initiation de la traduction du gène codant pour la β-glucosidase. La référence au site d'initiation de la traduction du gène codant pour la β-glucosidase s'entend de la position avant l'insertion de la mutation. Préférentiellement, l'élément de régulation de la séquence promotrice du gène xyn2 consiste en la séquence représentée en SEQ ID N°4. La séquence représentée en SEQ ID N°4 est donc insérée entre les positions 855 et 1250 de la séquence représentée en SEQ ID N°15.
Cette souche modifiée de T. reesei est dénommée "construction C5" ou "souche C5". Dans ce mode de réalisation, la souche a subi une substitution de 395 pb du promoteur bgll par 235 pb de l'élément de régulation de la séquence promotrice du gène xyn2. Dans ce mode de réalisation, la séquence est juxtaposée au site d'initiation de la traduction. Par conséquent, le promoteur du gène bgll de la construction C5 comprend la séquence telle que représentée en SEQ ID N°9. Cette séquence représente les 1151 pb précédant le site d'initiation de la traduction du gène bgll dans la construction C5.
Les souches Cl, C2, C4 et C5 sont inductibles par des sucres qui n'exerçaient pas ou peu d'effet inducteur dans les souches sauvages de T. reesei. En particulier, ces souches sont inductibles par le xylose pour la production de β- glucosidase. Aussi, un autre objet de l'invention concerne une souche de Trichoderma reesei dont le génome est modifié de telle sorte que le promoteur de la β- glucosidase comprend une séquence choisie parmi les séquences représentées en SEQ ID N°5, 6, 8 ou 9. Dans un mode de réalisation, le génome de la souche de l'invention est modifié de telle sorte que le promoteur de la β- glucosidase comprend plus préférentiellement les séquences représentées en SEQ ID N°8 ou 9. Dans un autre mode de réalisation, ledit génome comprend la séquence représentée en SEQ ID N°5.
Les inventeurs ont également développé une "construction C3" ou "souche C3". Dans cette construction, le génome de Trichoderma reesei est modifié de telle sorte que l'élément de régulation de la séquence promotrice du gène xynl comprenant la séquence représentée en SEQ ID N°16 est inséré entre les positions -1121 et -893 par rapport au site d'initiation de la traduction du gène codant pour la β-glucosidase. La séquence représentée en SEQ ID N°16 est donc insérée entre les positions 129 et 357 de la séquence représentée en SEQ ID N°15.
Dans ce mode de réalisation, la souche a subi une substitution de 228 pb du promoteur bgll par 230 pb de l'élément de régulation de la séquence promotrice du gène xynl. Aussi, le promoteur du gène bgll de la construction C3 comprend la séquence telle que représentée en SEQ ID N°7. Cette séquence représente les 1250 pb précédant le site d'initiation de la traduction du gène bgll dans la construction C3.
La construction C3 est donc caractérisée par une insertion de l'élément de régulation de la séquence promotrice du gène choisi xynl en amont des positions -800 et 0 par rapport au site d'initiation de la traduction du gène codant pour ladite cellulase. La souche C3 présente une inductibilité de la production de cellulases moindre que celle observée pour les autres constructions. En particulier, cette construction n'est pas inductible par le xylose pour la production de β- glucosidase.
Cassettes de mutation
Dans un second aspect, l'invention concerne les cassettes de mutation comprenant une séquence choisie parmi les séquences représentées en SEQ ID SEQ ID N°10 à 14. Ces cassettes sont des cassettes linéaires permettant d'obtenir une souche selon l'invention à partir d'une souche de T. reesei sauvage.
Par "cassette" ou "cassette de mutation", on entend une structure d'ADN permettant l'intégration d'un gène d'intérêt ou un fragment dudit gène d'intérêt dans un fragment d'ADN cible, typiquement selon le principe de la recombinaison homologue. Préférentiellement, ladite cassette est linéaire et comporte un module comprenant un gène marqueur et/ou le gène à intégrer, ce module étant flanqué de part et d'autre de fragments d'ADN homologues à ceux des extrémités du site d'intégration ciblé.
La cassette comprenant la séquence telle que représentée en SEQ ID N°10 est utilisée pour obtenir la souche Cl, c'est-à-dire une souche de T. reesei dont le génome est modifié de telle sorte que l'élément de régulation de la séquence promotrice du gène xynl comprenant la séquence représentée en SEQ ID N° 1 est inséré entre les positions -628 et -411 par rapport au site d'initiation de la traduction du gène bgll .
La cassette comprenant la séquence telle que représentée en SEQ ID N°l l est utilisée pour obtenir la souche C2, c'est-à-dire une souche de T. reesei dont le génome est modifié de telle sorte que la séquence promotrice du gène xynl comprenant la séquence représentée en SEQ ID N°3 est insérée entre les positions -633 et 0 par rapport au site d'initiation de la traduction du gène bgll. La cassette comprenant la séquence telle que représentée en SEQ ID N°12 est utilisée pour obtenir la souche C3, c'est-à-dire une souche de T. reesei dont le génome est modifié de telle sorte que l'élément de régulation de la séquence promotrice du gène xynl comprenant la séquence représentée en SEQ ID N°16 est insérée entre les positions -1121 et -893 par rapport au site d'initiation de la traduction du gène bgll .
La cassette comprenant la séquence telle que représentée en SEQ ID N°13 est utilisée pour obtenir la souche C4, c'est-à-dire une souche de T. reesei dont le génome est modifié de telle sorte que l'élément de régulation de la séquence promotrice du gène xynl comprenant la séquence représentée en SEQ ID N°2 est inséré entre les positions -396 et -341 par rapport au site d'initiation de la traduction du gène bgll . La cassette comprenant la séquence telle que représentée en SEQ ID N°14 est utilisée pour obtenir la souche C5, c'est-à-dire une souche de T. reesei dont le génome est modifié de telle sorte que la séquence promotrice du gène xynl comprenant la séquence représentée en SEQ ID N°4 est insérée entre les positions -395 et 0 par rapport au site d'initiation de la traduction du gène bgll.
Préférentiellement, les cassettes de mutation sont les séquences représentées en SEQ ID N°10, 11, 13 et 14. Dans un mode de réalisation, les cassettes de mutation sont les séquences représentées en SEQ ID N°13 ou 14. Dans un autre mode de réalisation, ledit génome comprend la séquence représentée en SEQ ID N°10.
Ces cassettes sont utilisées pour insérer des mutations dans le génome de T. reesei. Les techniques de mutations sont connues de l'homme du métier. Il est possible de prévoir différentes techniques assurant la mutation d'intérêt. On pourra par exemple utiliser les systèmes de mutations connus de l'homme du métier, ainsi que les insertions ou autres modifications d'ADN obtenues par les techniques de recombinaison homologue.
Préférentiellement, cette insertion est mise en œuvre par recombinaison homologue, typiquement à l'aide d'un vecteur ou d'une cassette linéaire. La cassette est co-transformée avec un vecteur qui contient le marqueur de sélection.
Selon l'invention, on entend par "vecteur" toute séquence d'ADN dans laquelle il est possible d'insérer des fragments d'acide nucléique étranger, les vecteurs permettant d'introduire de l'ADN étranger dans une cellule hôte. Des exemples de vecteurs sont les plasmides, les cosmides, les chromosomes artificiels de levures (YAC), les chromosomes artificiels de bactéries (BAC) et les chromosomes artificiels dérivés du bactériophage PI (PAC), les vecteurs dérivés de virus. Le vecteur selon l'invention permet l'introduction d'une mutation et/ou d'une délétion. Typiquement, l'acide nucléique tel que décrit précédemment pourra être lié opérationnellement à un promoteur, un terminateur ou toute autre séquence nécessaire à son expression dans la cellule hôte.
Dans un mode de réalisation préféré, le vecteur selon l'invention porte un marqueur de sélection. Alternativement, le marqueur de sélection est présent sur un second vecteur. On entend par "marqueur de sélection" un gène dont l'expression confère aux cellules qui le contiennent une caractéristique permettant de les sélectionner. Il s'agit par exemple d'un gène de résistance aux antibiotiques ou d'un gène conférant une indépendance vis-à-vis d'un métabolite particulier. La cassette de mutation peut être ensuite amplifiée selon les techniques classiques bien connues de l'homme du métier, typiquement par une méthode choisie parmi le clonage classique, la fusion PCR, ou encore le clonage in vivo dans la levure par PCR. Dans le contexte de l'invention, cette cassette est préférentiellement amplifiée par PCR.
La cassette de mutation est ensuite introduite par recombinaison dans une souche de T. reesei qui n'exprime pas un gène du marqueur de sélection.
Après culture, les souches mutantes ayant incorporé la cassette de mutation sont sélectionnées en fonction de l'expression ou non du marqueur de sélection; les clones ayant été transformés exprimant ledit marqueur de sélection.
Dans un mode de réalisation préféré, ladite cassette de mutation est une cassette linéaire. Cette cassette de mutation peut être obtenue après clonage dans un vecteur comme décrit ci-avant et transformation de T. reesei. Typiquement, l'intégration d'un gène d'intérêt dans un fragment d'ADN cible, se fait selon le principe de la recombinaison homologue. Pour cela, une cassette linéaire comporte un module comprenant la partie d'ADN à intégrer flanqué de part et d'autre de fragments d'ADN homologue à ceux des extrémités du site d'intégration ciblé. Après transformation du champignon avec la cassette par des procédés appropriés, une recombinaison homologue entre les séquences de la construction et les régions correspondantes du gène cible a pour résultat le remplacement du fragment d'ADN cible par la cassette d'intégration.
Parallèlement, une seconde cassette comprend le gène du marqueur sélectif.
Aussi, dans ce mode de réalisation, ladite cassette de mutation peut être une cassette de substitution permettant
d'une part, l'excision d'un fragment du promoteur de bgll, et
- d'autre part, l'insertion d'un élément de régulation de la séquence promotrice d'un gène xynl ou xyn2.
Utilisations des souches de l'invention Dans un troisième aspect, l'invention concerne l'utilisation de la souche selon l'invention pour la production d'enzymes cellulolytiques, de préférence en présence d'un substrat inducteur choisi parmi le xylane ; le xylose ; les oligomères du xylose; l'arabinose ; un hydrolysat d'hémicellulose ; et leurs mélanges. Ces inducteurs peuvent être mélangés avec un substrat inducteur des cellulases, tel que le lactose ou la cellulose pour obtenir une plus forte induction.
Un autre objet de l'invention concerne également l'utilisation de la souche selon l'invention pour l'hydrolyse de la cellulose en glucose. Un autre objet de l'invention concerne l'utilisation de la souche selon l'invention pour la production de produits biosourcés à partir du glucose.
Par "produit biosourcé", on entend tout produit qui n'est pas d'origine fossile et qui ne contient pas de produit organique d'origine fossile. Le terme "produit d'origine fossile" signifie tout produit organique issu du pétrole ou du charbon ou des dérivés du pétrole ou charbon. Préférentiellement, dans le contexte de l'invention, il s'agit d'un alcool, tel que l'isopropanol, le butanol ou l'éthanol. Enfin, un autre objet de l'invention concerne l'utilisation de la souche selon l'invention pour la production de biocarburants.
Selon l'invention, le terme "biocarburant" peut être défini comme tout produit issu de la transformation de la biomasse et pouvant être utilisé à des fins énergétiques. D'une part et sans vouloir se limiter, on peut citer à titre d'exemple des biogaz, des produits pouvant être incorporés (éventuellement après transformation ultérieure) à un carburant ou être un carburant à part entière, tels que des alcools (l'éthanol, le butanol et/ou l'isopropanol selon le type d'organisme fermentaire utilisé), des solvants (acétone), des acides (butyrique), des lipides et leurs dérivés (acides gras à courtes ou longues chaînes, esters d'acides gras), ainsi que l'hydrogène. De manière préférée, le biocarburant selon l'invention est un alcool, par exemple l'éthanol, le butanol et/ou l'isopropanol. Plus préférentiellement, le biocarburant selon l'invention est l'éthanol.
Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne un procédé de production de β-glucosidase comprenant l'étape de culture d'une souche de Trichoderma reesei dont le génome est modifié par l'insertion d'au moins un élément de régulation de la séquence promotrice d'un gène choisi parmi xynl et xynl, dans la séquence promotrice du gène codant pour β glucosidase,
étant entendu que :
l'élément de régulation de la séquence promotrice du gène xynl comprend la séquence représentée en SEQ ID N°l ou la séquence représentée en SEQ ID N°3;
l'élément de régulation de la séquence promotrice du gène xynl comprend la séquence représentée en SEQ ID N°2 ou la séquence représentée en SEQ ID N°4,
dans un milieu de culture comprenant
un substrat choisi parmi le lactose et la cellulose ou un de leurs mélanges; et
un substrat inducteur choisi parmi le xylane ; le xylose ; les oligomères du xylose ; l'arabinose ; une composition comprenant de glucose, de xylose, de galactose, de mannose, de cellobiose et d'acide acétique; et leurs mélanges. Toutes les caractéristiques techniques précédemment énoncées s'appliquent ici.
Enfin, l'invention concerne un procédé de production d'un biocarburant, de préférence l'éthanol, à partir de matériaux cellulosiques ou lignocellulosiques, comprenant des étapes de prétraitement d'un substrat cellulosique ou lignocellulosique, d'hydrolyse enzymatique du substrat prétraité puis de fermentation alcoolique de l'hydrolysat obtenu, dans lequel on utilise pour produire les enzymes cellulolytiques et/ou hémicellulolytiques, une souche de Trichoderma reesei selon l'invention en présence d'un substrat inducteur choisi parmi le xylane ; le xylose ; les oligomères du xylose ; arabinose ; un hydrolysat d'hémicellulose ; et leurs mélanges.
Toutes les caractéristiques techniques précédemment énoncées s'appliquent ici.
Description des séquences
SEQ ID N°l et SEQ ID N°3 représentent un élément de régulation de la séquence promotrice du gène xynl .
SEQ ID N°2 et SEQ ID N°4 représentent un élément de régulation de la séquence promotrice du gène xynl.
SEQ ID N°5 représente les 1250 pb précédant le site d'initiation de la traduction du gène bgll dans la construction Cl.
SEQ ID N°6 représente les 1200 pb précédant le site d'initiation de la traduction du gène bgll dans la construction C2.
SEQ ID N°7 représente les 1250 pb précédant le site d'initiation de la traduction du gène bgll dans la construction C3.
SEQ ID N°8 représente les 1250 pb précédant le site d'initiation de la traduction du gène bgll dans la construction C4.
SEQ ID N°9 représente les 1151 pb précédant le site d'initiation de la traduction du gène bgll dans la construction C5.
SEQ ID N°10 représente la cassette employée pour obtenir la construction Cl. SEQ ID N°ll représente la cassette employée pour obtenir la construction C2. SEQ ID N°12 représente la cassette employée pour obtenir la construction C3. SEQ ID N°13 représente la cassette employée pour obtenir la construction C4. SEQ ID N°14 représente la cassette employée pour obtenir la construction C5. SEQ ID N°15 représente les 1250 pb précédant le site d'initiation de la traduction du gène bgll dans la souche sauvage de Trichoderma reesei. Il s'agit donc d'un fragment du promoteur natif de bgll chez T. reesei.
SEQ ID N°16 représente un élément de régulation de la séquence promotrice du gène xynl . Cette séquence comprend également la séquence telle que représentée en SEQ ID N°1.
Par souci de clarté, le tableau suivant récapitule les correspondances entre :
les références aux positions par rapport au site d'initiation de la traduction du gène de la β- glucosidase ; et
les références aux positions par rapport à la séquence représentée en SEQ ID N°15.
Figure imgf000025_0001
Légendes des figures
Figure 1: Schéma des 4 constructions du promoteur de bgll
Cl à C3 contiennent des séquences du promoteur xynl, et
C4 et C5 contiennent des motifs issus du promoteur xynl. Dans ces constructions, les motifs HAP2/3/5 et Xyrl identifiés au sein du promoteur de bgll sont maintenus.
Figure 2 : Ratio de transcrits bgll à 4, 24, et 48 h dans les souches modifiées et la souche témoin par rapport au niveau de transcrits bgll à T0 (normalisé à 1).
L'expression a été normalisée par rapport au gène sari dont l'expression est constante. Il s'agit des valeurs moyennes obtenues chez deux clones par construction, et de deux cultures/clone, sauf pour C2.
La figure 2A représente les résultats pour QM9414 Aku70 pyr4- ;
La figure 2B représente les résultats pour la construction Cl ;
La figure 2C représente les résultats pour la construction C2 ;
La figure 2D représente les résultats pour la construction C3 ;
La figure 2E représente les résultats pour la construction C4 ;
La figure 2F représente les résultats pour la construction C5.
Les substrats testés sont comme suit :
- "Glucose 1%";
- "Lactose 1%";
- "Xylose 1%";
"Xylose 0,07% "qui correspond un mélange de xylose 0,075% et glycerol 1%;
"Ax" qui correspond à un mélange L-Arabinose ImM et D-xylose ImM;
"XN" qui correspond à xylane 1%; et
"C5" qui correspond à un hydrolysat d'hémicelluloses. Les exemples suivant illustrent l'invention mais n'en limitent nullement la portée.
Figure 3 : Ratios de transcrits bgll à 6 et 24 h après ajouts des substrats respectifs lactose (Lac), xylane (XN) ou hydrolysat d'hémicellulose dans deux souches comportant la construction C4 par rapport au niveau de transcrits bgll dans la souche témoin RutC30 sur glucose. L'expression a été normalisée par rapport au gène sari dont l'expression est constante.
Figure 4 : Activités beta-glucosidase mesurées dans les surnageants des cultures de la souche témoin RutC30 et les deux clones comportant la construction C4, 48 ou 72 h après ajout des substrats lactose (Lac), xylane (XN) ou hydrolysat d'hémicellulose.
Exemples Exemple 1
Les inventeurs ont mis au point plusieurs constructions Cl, C2, C4 et C5 exemplifiant et une construction C3 utilisée pour montrer l'effet de positif du motif xynl, comme suit :
- Construction Cl : substitution d'un fragment du promoteur de bgll par une séquence minimal permettant la régulation du promoteur du gène xynl . - Construction C2 : substitution d'un fragment du promoteur de bgll par le promoteur minimal du gène xynl .
- Construction C3 : substitution d'un fragment situé en amont des éléments cis du promoteur de bgll par une séquence minimal permettant la régulation du promoteur du gène xynl .
- Construction C4 : substitution d'un fragment du promoteur de bgll par une séquence minimale permettant la régulation du promoteur du gène xynl.
- Construction C5 : substitution d'un fragment du promoteur de bgll par le promoteur minimal du gène xynl.
Ces constructions sont schématisées dans la figure 1.
Matériel et méthodes
Réalisation des constructions
Les constructions ont été réalisées à l'aide du Gibson Assembly Cloning Kit (New England Biolabs). Le dessin des amorces pour l'amplification des fragments d'ADN à associer s'est effectué via le logiciel http://nebuilder.neb.com/. Ces amorces ont été dessinées de manière à présenter une queue de 15 à 80pb, qui est complémentaire à l'extrémité du fragment à accoler.
Le plasmide vecteur utilisé était le plasmide bactérien pUC19, porteur du gène de résistance à l'ampicilline ampR. Avant d'être utilisé comme vecteur ce plasmide a été ouvert par les enzymes de restriction Xhol et EcoRI (New England Biolabs) et purifié sur colonne (PCR Purification kit, Qiagen).
Une fois les fragments associés, le plasmide a été amplifié par transformation chez E. coli (fournies dans le kit) et extrait (Plasmid Plus Midi kit, Qiagen).
Les cassettes de substitution ont été amplifiées à partir du plasmide extrait par PCR.
Transformation de T. reesei
T. reesei a été cultivé en fioles de Roux contenant 200 mL de Potato Dextrose Broth (Difco Laboratories USA) pendant 3 jours à 30°C sans agitation. Le mycélium était collecté par filtration sur gaze stérile et lavé dans 200 mL de tampon KPAm ((NH4)2S040,6 M ; KH2P0425 mM ; pH 5,8) via une incubation de 30 min à 37°C, 150 rpm. Après une nouvelle étape de filtration su gaze stérile, la paroi fongique des cellules était digérée par incubation avec 100 mL de tampon KPAm contenant 30 mg/mL de Glucanex (Novozymes). Les cellules ont ensuite été passées sur verre frité, récupérées dans le filtrat et transférées dans 5 tubes Corex 20 mL. Elles ont ensuite été précipitées par centrifugation (4000 rpm, 5 min, 4°C). Chaque culot était lavé avec 20 mL de Tampon CTS10 (Saccharose 0,4 M, Tris-HCl pH 7,5 100 mM, CaCl2 10 mM) et après centrifugation (4000 rpm, 5 min, 4°C), les protoplastes ont été rassemblés dans 3 tubes. Ils ont été resuspendus dans 20 mL de CTS10 et précipité par une nouvelle centrifugation (4000 rpm, 5 min, 4°C). Enfin, ils ont été rassemblés dans 1 seul tube et lavés une dernière fois avec 10 mL de CTS10. Après centrifugation (4000 rpm, 5 min, 4°C), les protoplastes ont été récupérés dans 5mL de Tampon CTS50 (Saccharose 0,4M ; Tris HC1 pH 7,5 lOOmM ; CaCl2 50 mM) pour être comptabilisés au microscope optique sur cellule de Malassez. Pour finir, la solution de protoplastes a été centrifugée (4000 rpm, 5 min, 4°C) et les cellules re-suspendues dans du CTS50 dans un volume V calculé pour l'obtention d'une concentration finale de 2.108 cellules/mL.
45 μΐ^ de solution de protoplastes à 2.10 cellules/mL ont été mis au contact de 5 μg de la cassette et de 1 μg du fragment porteur du marqueur de transformation dans un tube Falcon de 50 mL. Le volume total des solutions d'ADN utilisées n'excédait pas 5 μΐ^. Après 10 min d'incubation du mélange à température ambiante, 500 de tampon PEG (60 % poly-éthylène-glycol 4000; 10 mM Tris HC1; 50mM CaCL ; pH 7,5) ont été ajoutés. Après 20 min d'incubation à température ambiante la suspension cellulaire a été allongée avec 450 μΐ^ de CTS50 pour atteindre un volume final de 1 mL. Enfin, les cellules ont été diluées dans 40 mL de milieu de surcouche de sélection (milieu sélectif gélosé additionné de 0,8 M de saccharose pour le maintien de la pression osmotique des protoplastes) chaud (entre 50 et 55°C) avant d'être étalées sur 5 boites (8 mL/boîte) de milieu de sélection (milieu sélectif gélosé additionné de 0,2 M de saccharose). Les boîtes ont ensuite été incubées à 30°C pendant 3-4 jours afin d'observer la germination des spores. Les transformants obtenus ont ensuite été purifiés en quatre étapes de repiquage successives.
Cultures de T. reesei
50 mL de milieu de culture riche (PD, Difco) ont été ensemencés avec des spores de chaque souche et incubés à 30°C sous agitation pendant trois jours. Ensuite, le mycélium a été filtré sur gaze stérile, lavé deux fois avec de l'eau physiologique et remis en suspension dans du milieu minimum (K2HP04 50 mM ; (NH4)2S04 30 mM ; MgS04 1,2 mM ; Acide maléique 100 mM ; Eléments traces (FeS04 5 mg/L ; MnS04 1,4 mg/L ; ZnS04 1,4 mg/L, CoCl2 3,7 mg/L) ; pH 6) additionné de source de carbone (1 % glucose, 1 % lactose, 1 % ou 0,075 % xylose) et d'uridine (10 mM) pour la souche QM9414 Aku70 pyr4~ . Les cultures ont de nouveau été incubées à 30°C pendant 48h. A T0, T4, T24 et T48h, 2 x 2 mL de culture ont été prélevés, centrifugés et le surnageant transféré dans un nouveau tube. Le culot a été séché sur papier Whatman et congélé dans l'azote liquide avant stockage à -80°C jusqu'à l'extraction de l'ARN. Les surnageants ont été placés à -20 C°.
Extraction d'ARN, rétro transcription et PCR quantitative Le mycélium congelé a été repris dans 700 μΐ de tampon RLT (RNeasy Mini Kit, Qiagen) additionné de 7 μL· de β-mercapto-éthanol pur et broyé dans des tubes contenant des billes (Lysing matrix C, MP Biomedicals) avec l'agitateur Fastprep (MP Biomedicals) pendant 40 sec à vitesse maximale. Les tubes ont ensuite été centrifugés pendant 5 min (4°C, 14 000 rpm) et le surnageant transféré dans des colonnes QIAshredder (Qiagen) pour séparer la phase liquide des débris cellulaires. Après centrifugation pendant 2 min (4°C, 10 000 rpm), 0,5 vol d'éthanol ont été ajoutés à l'éluât, qui a ensuite été déposé sur une colonne du kit RNeasy extraction kit (Qiagen). Après centrifugation, une digestion par DNAse (RNase-Free DNase Set, Qiagen) sur colonne puis des lavages ont été réalisés selon les instructions du fournisseur. L'ARN a été élué avec 100 μΐ d'eau DEPC. Les concentrations des ARN extraits ont été déterminées par dosage au Qubit 2.0 (Invitrogen) et 500 ng ont été utilisés pour la réaction de reverse transcription (iScript Kit, Biorad). 5 μΐ de la réaction diluée au 1/5 ont été utilisés comme matrice pour la qPCR. Un contrôle négatif avec la même quantité d'ARN non retro-transcrit a été réalisé pour chaque échantillon pour confirmer l'absence d'ADN. Chaque point a été réalisé en duplicat. Les quantités des transcrits bgll ont été normalisées par rapport au gène sari et par rapport à la quantité de transcrits bgll à T0.
Résultats
Les constructions Cl, C2 et C3 contiennent le motif de 217 pb identifié comme responsable de l'induction du gène xynl, cette séquence étant représentée en SEQ ID N°1.
Les constructions C4 et C5, quant à elles, contiennent les 55 pb essentielles pour l'induction du gène xynl (Zeilinger et al., 1996), cette séquence étant représentée en SEQ ID N°2.
Pour Cl, C2, C4 et C5, les motifs ont été placés à la même distance du début de transcription (symbolisé par une flèche dans la figure 1) que dans leurs gènes d'origine. Ainsi, la distance de 153 pb entre le début du motif xynl et le début de transcription xynl est conservée chez Cl et C2, et la distance de 82 pb observée chez xynl est conservée au niveau des constructions C4 et C5. Dans la construction C3, le motif xynl a été placé en amont des éléments cis du promoteur bgll pour démontrer l'effet de position du motif xynl.
Dans les constructions C2 et C5, en plus du motif comportant les éléments d'induction, toute la séquence en aval des gènes xynl et xynl jusqu'au début de la séquence codante (comprenant donc la séquence 5' UTR) a été insérée. La 5'UTR étant plus courte chez les gènes xynl et xynl par rapport au gène bgll, la longueur totale en amont du site d'initiation de la traduction (c'est à dire l'ATG) est par conséquent plus courte que chez bgll . Après transformation, des contrôles par PCR et par séquençage du locus ont été réalisés pour confirmer la correcte insertion des motifs. Deux clones pour chaque construction ont été choisis pour analyse (à l'exception de la construction C2, pour lequel seul un clone a pu être obtenu). Pour ceux-là, les souches modifiées ainsi que la souche de départ QM9414 Aku70 pyr4- ont été mis en présence de différentes sources de carbone :
le glucose (contrôle non inducteur),
le lactose (contrôle inducteur),
le xylose 1 % et 0,075 % (conditions test),
un mélange arabinose et xylose (1 mM chaque),
- le xylane (1%) ou
un hydrolysat d'hémicelluloses contenant 3,5 g/1 de xylose, 0,6 g/1 de mannose, 0,16 g/1 de galactose et 0,4 g/1 de glucose.
L'expression du gène bgll a ensuite été déterminée par RT- qPCR.
Les résultats sont présentés à la figure 2.
On constate que le gène bgll est significativement induit uniquement en présence de lactose dans la souche témoin (panel A). Cette induction est réduite, mais toujours présente, chez les souches ayant intégré les constructions Cl, C2 et C3, c'est-à-dire contenant le motif xynl dans le promoteur bgll . Les souches possédant les constructions C4 et C5 gardent, en revanche, une induction significative (de 60 à 90 fois) par le lactose.
Contrairement à la souche témoin, on observe aussi une induction du gène bgll dans les souches Cl, C2, C4 et C5 par le xylose 1%, et de façon plus faible avec le xylose 0,075 %. Cette induction devient 5 à 10 fois plus forte dans le cas de la construction C4, comparé aux souches Cl, C2 et C5.
La présence de xylane et d'hydrolysat d'hémicelluloses mène également à une induction dans ces quatre souches, environ du même ordre de grandeur qu'en présence de xylose 1%. En revanche, la construction C3 confère une inductibilité uniquement en présence de xylane, mais pas en présence des monomères de pentoses, soulignant l'importance du bon positionnement du motif xynl dans le promoteur et par rapport à l'initiation de la transcription et de la traduction : Si le motif xynl est placé entre -1121 et -893 pb avant le site d'initiation de la traduction du gène bgll, on n'observe pas d'induction par les monomères de pentoses.
La séquence entre le motif xynl et xynl, respectivement, et le codon initiateur a également un effet sur inductibilité : dans les souches possédant la construction C2, le gène bgll est induit de façon plus importante en présence de xylane et d'hydrolysat d'hémicellulose que dans les souches possédant la construction Cl. La région en aval du motif xynl, comprenant aussi la 5'-UTR du gène xynl a donc un effet positif sur inductibilité par le xylane et ses dérivés.
Dans le cas de la séquence 5'-UTR du gène xynl, on observe exactement l'inverse. En effet, la présence de cette séquence montre plutôt une plus faible induction de bgll en présence de xylose ou de xylane. L'intégration des 55 pb issus du promoteur xynl est donc le meilleur choix pour transférer cette inductibilité. L'ensemble des résultats montre qu'il est possible de changer l'inductibilité du promoteur bgll en insérant les motifs d'induction issus des gènes de xylanases.
En fonction du type de motif et de l'emplacement, cette induction est plus ou moins forte.
Ainsi, les inventeurs ont montré qu'il était possible de changer le profil d'expression de la β-glucosidase, mais aussi des cellulases en présence d'inducteurs peu onéreux comme le xylose et ainsi d'obtenir un cocktail possédant des activités cellulases/ -glucosidase et xylanase équilibrées sous ces conditions.
Exemple 2
Les inventeurs ont également modifié le promoteur du gène bgll dans une souche hyperproductrice T. reesei RutC30.
Matériel et méthodes
Mesure de l'activité β-glucosidase
Les activités β-glucosidase sont déterminées par l'hydrolyse du substrat p- nitrophénol-glucopyranoside (pNPG) en glucose et p-nitrophénol qui absorbe la lumière à 410 nm. Le mélange réactionnel contient 90 μΐ du substrat pNPG (5 mM dans du tampon citrate 50 mM à pH4,8) et 10 μΐ de surnageant des cultures, éventuellement dilué au préalable.
Le mélange est incubé 30 min à 50°C, puis la réaction est stoppée par l'ajout de 100 μΐ de Na2C03 2% après avoir été placée sur glace. Les échantillons sont ensuite incubés à température ambiante pendant 20 minutes, avant de réaliser la lecture à 410 nm. La quantification se fait à l'aide d'une gamme de p-nitrophénol allant de 12,5 à 200 μΜ, et après soustraction des valeurs d'un blanc enzyme contenant 10 μΐ de surnageant de culture avec 90 μΐ de tampon citrate et d'un blanc substrat où le surnageant de culture est remplacé par 10 μΐ de tampon substrat. Les valeurs sont des moyennes de double mesures. Résultats
Le promoteur modifié qui a donné les meilleurs résultats dans la souche modèle QM9414, correspondant à la construction C4, a été introduite dans la souche hyperproductrice T. reesei RutC30.
Pour modifier le promoteur bgll, la souche RutC30 a subi une co-transformation avec 5 μg de la cassette portant la construction C4 et 1 μg du fragment porteur du marqueur de sélection. La transformation et le criblage ont été effectués comme décrit précédemment. Après criblage d'une centaine de clones, plusieurs clones positifs qui avaient intégré la cassette au bon endroit dans le génome ont été identifiés. Deux clones pour lesquels l'intégration de la séquence a été confirmée par séquençage ont été mis en culture en milieu riche, avant d'être transférés dans un milieu minimal contenant soit du glucose 1%, soit du lactose 1%, soit du xylane 1% ou soit de l'hydrolysat d'hémicellulose. Des prélèvements ont été effectués à T = 6h et 24h.
L'ARN a été extrait et l'expression du gène bgll déterminée par RT-qPCR. En parallèle, l'activité de la beta-glucosidase a été mesurée dans les surnageants prélevés à T = 48h et 72h. Les résultats sont présentés dans les figures 3 et 4.
On remarque que le niveau d'expression du gène bgll dans les souches modifiées est multiplié d'un facteur 60 à 100 en présence de lactose après 6h d'exposition, comparé à la souche RutC30. Cette augmentation du niveau de transcrit se traduit par une hausse de l'activité d'un facteur 2 et 3 après 48 et 72 h, respectivement, dans les souches avec promoteur modifié. On constate aussi que le niveau d'expression du gène bgll dans ces souches en présence de xylane augmente d'un facteur 50 à 60 après 6 h et sur hydrolysat d'hémicellulose d'un facteur 5 à 6, par rapport à la souche témoin RutC30.
L'activité beta-glucosidase n'augmente que légèrement en présence de xylane, mais double sur un hydrolysat d'hémicellulose pour l'un des deux clones. Les résultats avec la souche hyperproductrice RutC30 confirment donc que l'intégration du motif xyn2 dans le promoteur bgll mène à une augmentation de l'expression du gène. Dans cette souche qui n'est pas sujette à la répression catabolique, contrairement à la souche QM414, la hausse est observée non seulement sur pentoses, mais également sur lactose.

Claims

REVENDICATIONS
1. Souche de Trichoderma reesei dont le génome est modifié par l'insertion d'au moins un élément de régulation de la séquence promotrice d'un gène choisi parmi xynl et xyn2, dans la séquence promotrice d'un gène codant pour une cellulase, étant entendu que :
l'élément de régulation de la séquence promotrice du gène xynl comprend la séquence représentée en SEQ ID N°l ou la séquence représentée en SEQ ID N°3;
- l'élément de régulation de la séquence promotrice du gène xynl comprend la séquence représentée en SEQ ID N°2 ou la séquence représentée en SEQ ID N°4.
2. Souche selon la revendication 1, caractérisée en ce que ladite insertion s'effectue entre les positions -800 et 0 par rapport au site d'initiation de la traduction du gène codant pour ladite cellulase.
3. Souche selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que ladite cellulase est choisie parmi les exo-P-l,4-glucanases ou cellobiohydrolases, les endo-P-1,4- glucanases et les β-glucosidases.
4. Souche selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que ladite cellulase est la β-glucosidase.
5. Souche selon la revendication 4, caractérisée en ce que le promoteur de la β- glucosidase comprend une séquence choisie parmi les séquences représentées en en SEQ ID N°5, 6, 8 ou 9.
6. Souche selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que la production de cellulase par ladite souche est inductible par un substrat inducteur choisi parmi :
le xylane ;
le xylose ;
les oligomères du xylose ; l'arabinose ;
une composition comprenant de glucose, de xylose, de galactose, de mannose, de cellobiose et d'acide acétique; et
leurs mélanges.
7. Souche selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que la production de cellulase par ladite souche est inductible par un substrat choisi parmi le lactose et la cellulose ou un de leurs mélanges avec un substrat inducteur choisi parmi :
- le xylane ;
le xylose ;
les oligomères du xylose ;
l'arabinose ;
une composition comprenant de glucose, de xylose, de galactose, de mannose, de cellobiose et d'acide acétique; et
leurs mélanges.
8. Souche selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisée en ce que la production de cellulase par ladite souche est inductible par :
- le lactose;
le xylose; et
un mélange de lactose et de xylose.
9. Souche selon l'une quelconque des revendications 4 à 7, caractérisée en ce que l'élément de régulation de la séquence promotrice du gène xynl comprend la séquence représentée en SEQ ID N°l et est inséré entre les positions -628 et -411 par rapport au site d'initiation de la traduction du gène codant pour la β- glucosidase.
10. Souche selon la revendication 4 à 7, caractérisée en ce que l'élément de régulation de la séquence promotrice du gène xynl comprend la séquence représentée en SEQ ID N°3 et est inséré entre les positions -633 et 0 par rapport au site d'initiation de la traduction du gène codant pour la β-glucosidase.
11. Souche selon la revendication 4 à 7, caractérisée en ce que l'élément de régulation de la séquence promotrice du gène xynl comprend la séquence représentée en SEQ ID N°2 et est inséré entre les positions -396 et -341 par rapport au site d'initiation de la traduction du gène codant pour la β-glucosidase.
12. Souche selon l'une quelconque des revendications 4 à 7, caractérisée en ce que l'élément de régulation de la séquence promotrice du gène xynl comprend la séquence représentée en SEQ ID N°4 et est inséré entre les positions -395 et 0 par rapport au site d'initiation de la traduction du gène codant pour la β-glucosidase.
13. Cassette de mutation comprenant une séquence choisie parmi les séquences représentées en SEQ ID N°10, 11, 13 et 14.
14. Utilisation d'une souche selon l'une quelconque des revendications 1 à 12 pour la production d'enzymes cellulolytiques.
15. Utilisation d'une souche selon l'une quelconque des revendications 1 à 12 pour l'hydrolyse de la cellulose en glucose.
16. Utilisation de la souche selon l'une quelconque des revendications 1 à 12 pour la production de produits biosourcés à partir du glucose.
17. Utilisation de la souche selon l'une quelconque des revendications 1 à 12 pour la production de biocarburants.
18. Procédé de production d'un biocarburant à partir de matériaux cellulosiques ou lignocellulosiques, comprenant des étapes de prétraitement d'un substrat cellulosique ou lignocellulosique, d'hydrolyse enzymatique du substrat prétraité puis de fermentation alcoolique de l'hydrolysat obtenu, dans lequel on utilise pour produire les enzymes cellulolytiques et/ou hémicellulolytiques, une souche de Trichoderma reesei selon l'une quelconque des revendications 1 à 12 en présence d'un substrat choisi parmi le lactose et la cellulose ou un de leurs mélanges et d'un substrat inducteur choisi parmi le xylane ; le xylose ; les oligomères du xylose ; l'arabinose ; un hydrolysat d'hémicellulose ; et leurs mélanges.
19. Procédé de production de β-glucosidase comprenant l'étape de culture d'une souche de Trichoderma reesei dont le génome est modifié par l'insertion d'au moins un élément de régulation de la séquence promotrice d'un gène choisi parmi xynl et xynl, dans la séquence promotrice du gène codant pour la β-glucosidase, étant entendu que :
l'élément de régulation de la séquence promotrice du gène xynl comprend la séquence représentée en SEQ ID N°l ou la séquence représentée en SEQ ID N°3;
l'élément de régulation de la séquence promotrice du gène xynl comprend la séquence représentée en SEQ ID N°2 ou la séquence représentée en SEQ ID N°4,
dans un milieu de culture comprenant
un substrat choisi parmi le lactose et la cellulose ou un de leurs mélanges; et
un substrat inducteur choisi parmi le xylane ; le xylose ; les oligomères du xylose ; l'arabinose ; une composition comprenant de glucose, de xylose, de galactose, de mannose, de cellobiose et d'acide acétique; et leurs mélanges.
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