FR3012725A1

FR3012725A1 - Compositions d'agents de lutte biologique, leur procede de preparation et leurs utilisations

Info

Publication number: FR3012725A1
Application number: FR1360928A
Authority: FR
Inventors: Sophie Leporini; Cedric Ernenwein; Christian Belloy; Patrick Boivin
Original assignee: INST FRANCAIS DES BOISSONS de la BRASSERIE ET de la MALTERIE IFBM; Agro Industrie Recherches et Developpements ARD
Current assignee: INST FRANCAIS DES BOISSONS de la BRASSERIE ET de la MALTERIE IFBM; Agro Industrie Recherches et Developpements ARD
Priority date: 2013-11-07
Filing date: 2013-11-07
Publication date: 2015-05-08
Anticipated expiration: 2033-11-07
Also published as: FR3012725B1

Abstract

La présente invention a pour objet des compositions d'agents de lutte biologique, leur procédé de préparation et leurs utilisations.

Description

COMPOSITIONS D'AGENTS DE LUTTE BIOLOGIQUE, LEUR PROCEDE DE PREPARATION ET LEURS UTILISATIONS La présente invention a pour objet des compositions d'agents de lutte biologique, leur procédé de préparation et leurs utilisations. Le contexte de la protection des cultures contre les maladies, par exemple la fusariose, la septoriose, le mildiou ou la pourriture grise, est en très forte évolution. D'un côté, émerge un objectif de réduction de l'usage des produits phytosanitaires, de l'autre une approche de plus en plus technique de la protection des cultures, le tout avec l'objectif minimum de maintenir les niveaux de production et surtout les marges. Parmi ces maladies des cultures, la fusariose de l'épi est une maladie fongique importante des régions humides et semi-humides qui touche principalement le blé et l'orge. C'est une maladie économiquement importante puisqu'elle entraîne une réduction non négligeable du rendement (d'environ 15 à 30 qx/ha) des céréales et engendre la synthèse de mycotoxines affectant la qualité alimentaire des grains céréaliers et la dépréciation des lots contaminés. La fusariose de l'épi se caractérise par une destruction des cultures, quelques semaines avant la récolte, des suites d'une infection des épis au moment de la floraison. L'un des principaux agents responsable de la fusariose de l'épi sur blé ou maïs en Europe, en 20 Asie et en Amérique est Fusarium graminearum. Les champignons du genre Fusarium sont des moisissures filamenteuses qui appartiennent à la classe des ascomycètes et à l'ordre des pyrénomycètes. Suite à la contamination des céréales, les espèces de Fusarium sont capables de sécréter des mycotoxines. F. graminearum peut produire deux types de mycotoxines: la 25 toxine zéaralénone (F-5) et une mycotoxine plus connue: le trichothécènedéoxynivalenol (DON). Le DON est une mycotoxine qui peut avoir des effets carcinogènes, mutagènes, tératogènes et immunosuppresseurs. De plus, des études sur des animaux de la ferme ont montré qu'une forte exposition au DON à travers l'alimentation peut être associée à de 30 sévères stress gastro-intestinaux (nausée, vomissement et diarrhée). Ainsi, la réglementation européenne impose des seuils de contamination des mycotoxines pour les différents produits céréaliers. Un maximum de DON de 1750µg/kg est toléré pour le blé dur, l'avoine brut et le maïs destinés à l'alimentation humaine. Ce seuil est abaissé à 1250µg/kg pour les autres céréales (Règlement (CE) N° 856/2005 de la Commission du 6 juin 2005).

Actuellement, différentes stratégies sont utilisées dans le but de réduire la sévérité desdites maladies, en particulier la fusariose de l'épi, et par la même occasion la contamination éventuelle des grains par des mycotoxines, notamment les DON. Ces stratégies consistent notamment à travailler les sols, à réaliser une récolte propre (réglage de la batteuse), à cultiver des variétés non sensibles et à éviter la présence de résidus en surface. Une autre approche consiste à traiter les cultures avec des produits phytosanitaires. Dans le cas de la fusariose, les épis de blé peuvent être traités pendant la floraison avec des fongicides dirigés contre Egraminearum. Certains fongicides de la famille des triazoles (tébuconazole et metconazole) limitent significativement le niveau d'infection de F. graminearum sur les épis de blé. Cependant, ces fongicides ne réduisent pas toujours le niveau de production de mycotoxines. Par ailleurs, les fongicides sont des produits chimiques biologiquement actifs et leur application en champs peut présenter des risques toxicologiques et écologiques.

Dans cette optique, la lutte biologique semble être une approche intéressante pour lutter contre les maladies des cultures, notamment la fusariose de l'épi. La lutte biologique est une méthode de lutte contre un ravageur ou une plante adventice au moyen d'organismes naturels antagonistes, notamment des champignons, des bactéries ou des virus.

Beaucoup de champignons pathogènes de plantes ont été la cible de recherche pour découvrir et développer une méthode réduisant biologiquement la maladie qu'ils entrainent. C'est notamment le cas de Fusarium. Les bactéries Bacillus subtilis(souches AS 43.3), Pseudomonas sp (souches AS 64.4) et les levures Cryptoccocus sp. (souches OH 71.4 et OH 181.1) et C. nodaensis (souches OH 182.9) (Sato et al., Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology 1999, 22, 127-132) réduisent de plus de 25% la fusariose de l'épi de blé en serre et en champs. Dans d'autres études en serre et en champs, Mojibur et al. (Biological Control 2009, 48(1), 42-47) ont montré que les souches MKB 158 et MKB 249 de Pseudomonas fluorescens et la souche 202 de Pseudomonas frederiksbergensis réduisaient significativement la sévérité des symptômes de la fusariose causés par F. culmorum sur le blé et l'orge. De même, la bactérie Lysobacter enzymogene souche C3 (Jochum et al., Biological control 2006, 39, 336-344), peut également réduire la sévérité de la fusariose de l'épi, mais sa performance est dépendante du type de culture. Trichoderma est un genre de champignon ascomycète de la famille des Hypocreaceae.

De nombreuses études ont montré l'efficacité de Trichoderma spp en tant qu'agent de lutte biologique contre les espèces de Fusarium, notamment sur la banane (Thangavelu et al. , Agriculture, Ecosystems & Environment 2004, 103, 259-263), les cacahuètes (Rojo et al., Crop Protection 2007, 26, 549-555), les pois chiches (Dubey et al., Biological Control 2007, 40, 118-127) et sur le blé (Schisler et al., Plant Disease 2002, 86, 1350-1356). Geotrichum est un genre de champignons trouvés dans le monde entier dans le sol, l'eau, l'air et des eaux usées, ainsi que dans les plantes, notamment les céréales, et les produits laitiers. La souche Geotrichum candidum a par ailleurs induit une diminution de la présence des mycotoxines et une augmentation des rendements des cultures en champs (FR 2 813 166).

Cependant, ces agents de lutte biologique n'ont pas une action mouillante sur les plantes à traiter, c'est-à-dire qu'ils ne s'étalent pas de façon satisfaisante à la surface desdites plantes. En outre, leur multiplication sur les plantes à traiter n'est pas toujours aisée, alors qu'un des modes d'action de ces agents de lutte biologique est précisément de se multiplier au détriment du pathogène. Les sophorolipides sont des biosurfactants, principalement produits par des microorganismes de type Candida. Les sophorolipides sont cependant connus pour leurs propriétés biologiques notamment biocides, virucides ou spermicides. Ces propriétés sont notamment décrites par Shah et Col. (Antimicrob Agents Chemother. 2005, 49, 1-8). Les sophorolipides sous la forme lactone purifiée, en mélange avec la forme acide, ou estérifiés, sont décrits pour des activités antibactériennes (WO 2004/044216), antifongiques (WO 2006/069175), spermicides et anti-virus (WO 2005/089522) et anti-herpes (WO 2007/130738).

Ainsi, un but de la présente invention est de fournir des compositions d'agents de lutte biologique qui s'étalent aisément à la surface des plantes à traiter et dans lesquels les adjuvants sont non-toxiques pour lesdits agents de lutte biologique, voire même dans lesquels la croissance desdits agents de lutte biologique est favorisée par les adjuvants. L'invention a par conséquent pour objet un produit de combinaison destiné à une utilisation simultanée, contenant: a) une première composition comprenant un ou plusieurs agents de lutte biologique, et b) une deuxième composition comprenant un ou plusieurs sophorolipides, ladite deuxième composition comprenant moins d'environ 27% en masse du ou desdits sophorolipides, en vue de la formation d'un mélange contenant lesdites première et deuxième compositions, ledit mélange étant dépourvu d'eau ou comprenant moins d'environ 6% en masse du ou desdits sophorolipides, le ou lesdits sophorolipides étant, dans ledit mélange, non toxiques pour le ou lesdits agents de lutte biologique. De manière surprenante, les sophorolipides apportent une action mouillante sur la plante, favorisant ainsi l'étalement des agents de lutte biologique sur les plantes à traiter, tout en étant non toxiques pour lesdits agents de lutte biologique, voire même en en favorisant leur croissance.

Par « agent de lutte biologique » (ou BCA, « Biological Control Agent»), on entend des microorganismes vivants destinés à prévenir ou réduire les dégâts causés aux plantes, notamment les cultures, par des ravageurs et/ou des agents phytopathogènes, tels que les insectes, les champignons et les bactéries. Par « sophorolipides », on entend des composés tensioactifs constitués d'une partie saccharidique reliée par une liaison glycosidique à un reste d'alcools gras, d'acides gras ou d'esters d'acides gras. La partie saccharidique, composant la partie polaire ou « tête polaire » du tensioactif, est composée d'un reste de sophorose comportant des hydroxyles libres ou acétylés. Les sophoroses sont des sucres particuliers composés de deux unités glucoses reliées en beta 1,2. Les sophorolipides ayant un reste d'acide gras comme partie lipophile, encore nommé « queue lipophile », possèdent au moins une fonction acide carboxylique sous forme acide ou sous la forme dissociée notamment de sels de métal alcalin. Cette fonction carboxylique peut être estérifiée par un composé comportant au moins une fonction alcool notamment le méthanol. Pour des chaines alkyles longues, c'est à dire comportant au moins dix atomes de carbone et de préférence de 16 à 18 atomes de carbone, une estérification intramoléculaire avec l'un des hydroxyles libres d'un des deux oses de la tête polaire est possible. On parle alors d'une forme lactone. D'une manière générale les sophorolipides disponibles commercialement sont des mélanges des formes ouvertes acide ou ester, avec des formes lactones ou formes fermées, di-acétylés, mono-acétylés ou non acétylés. Les sophorolipides font partie de la famille des bio-tensioactifs, l'indicatif bio faisant référence à leur mode d'obtention par biotechnologie. Ils peuvent en effet être obtenus par un processus de fermentation. Ce processus a notamment été décrit par Gorin et collaborateurs dans « Canadian Journal of Chemistry », 39, 846 en 1961. Les souches bactériologiques natives, sélectionnées ou modifiées capables de métaboliser des sources saccharidiques et des lipides afin de former des glycolipides et notamment des sophorolipides sont par exemple Candida apicola, Candica bombicola, Yarrowia lipolytica, Candida bogoriensis. Les sophorolipides industriellement disponibles peuvent comprendre, en plus desdites formes ouvertes et fermées, des impuretés. Les impuretés peuvent être des alcools gras, des esters d'acides gras, des triglycérides ou huiles, des sucres notamment des glucoses, des sophoroses, des acides organiques sous leurs formes acides ou dissociés notamment des acides gras, de l'acide acétique. Par « non toxiques pour le ou lesdits agents de lutte biologique », on entend que, dans ledit mélange dépourvu d'eau ou comprenant moins d'environ 6% en masse du ou desdits sophorolipides, les agents de luttes biologiques restent sous une forme active ou sont revivifiables. Un test permettant de vérifier la viabilité des agents de luttes biologiques en présence d'adjuvants, notamment de tensioactif, consiste à mettre en contact 1x106 UFC (Unité Formant une colonie)/ml du ou des agents de lutte biologique avec une quantité croissante, à titre d'exemple 0,5%, 2%, 4%, 6%, 8% et 10% d'adjuvants à un ou plusieurs pH donné(s) et à compléter avec de l'eau de forage stérile. Le mélange est alors laissé sous agitation, dans un bécher et à l'aide d'un barreau magnétique, pendant un ou des temps déterminés, par exemple Oh, 1h, 24h et 48h sous hôte lumineuse à lumière constante, à un minimum de 16°C et un maximum de 24°C. Une référence, contenant le BCA dans l'eau uniquement est réalisée dans les mêmes conditions. Cette référence et le mélange BCA/adjuvant sont inoculés sur boîtes de Petri sur PDA (Potato Dextrose Agar) puis incubées pendant 6 jours sous hotte lumineuse à lumière constante, à un minimum de 16°C et un maximum de 24°C. La toxicité de l'adjuvant vis à vis du BCA est évaluée en mesurant la croissance (surface de la boite de Petri en cm2) du BCA développé à 2, 4 et 6 jours vis à vis de la référence, et en mesurant la quantité UFC (unité formant une colonie) par ml dudit BCA. La mesure de la quantité UFC/ml d'un BCA peut par exemple être réalisée en procédant au préalable à des dilutions en cascade de la solution mère de la souche considérée. Si la viabilité initiale est par exemple de 3,3.108 spores/ml, des dilutions en cascade jusqu'à 10-8 sont réalisées. Pour chaque dilution, 1 ml de solution est introduit dans une boîte de Petri sur PDA (Potato Dextrose Agar) (ceci peut être dupliqué pour obtenir des répétions, par exemple 3 boîtes de Petri ainsi innoculées), laquelle est ensuite incubée sous hotte lumineuse jusqu'à apparition des colonies. Les colonies sont alors dénombrées : le dénombrement est par exemple considéré comme significatif lorsqu'il y a entre 15 et 300 colonies par boîte.

Lorsqu'une seule dilution est significative, la moyenne du nombre de colonies comptées sur les boîtes réalisées avec ladite dilution est calculée, ainsi que la concentration de la solution mère. Si le résultat est interprétable avec plusieurs dilutions successives, la formule suivante peut être utilisée pour calculer la concentration de la solution mère: [C] V (n1 + 0.1 n2) x d E colonies comptées E= somme des colonies comptées sur toutes les boites retenues n1 = nombre de boîtes retenues à la lé" dilution (la plus faible dilution) n2 = nombre de boîtes retenues à la 2ème dilution (la plus forte dilution) d= taux de dilution de la lé" dilution (la plus faible dilution) V= volume d'inoculum par boîte en ml En particulier, ladite deuxième composition comprend moins d'environ 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7 ou 6% en masse du ou desdits sophorolipides. En particulier, ledit mélange comprend moins d'environ 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,1%, 0,01% ou 0,005% en masse du ou desdits sophorolipides.

Selon un mode de réalisation avantageux, l'invention concerne un produit de combinaison destiné à une utilisation simultanée, contenant: a) une première composition comprenant un ou plusieurs agents de lutte biologique, et b) une deuxième composition comprenant un ou plusieurs sophorolipides, ladite deuxième composition comprenant moins d'environ 27% en masse du ou desdits sophorolipides, en vue de la formation d'un mélange contenant lesdites première et deuxième compositions, ledit mélange étant dépourvu d'eau, le ou lesdits sophorolipides étant, dans ledit mélange, non toxiques pour le ou lesdits agents de lutte biologique.

Par « dépourvu d'eau », on entend que ledit mélange comprend moins de 7%, de préférence moins de 4%, plus préférentiellement moins d'1% d'eau en masse. Ainsi, lorsque ledit mélange est dépourvu d'eau, lesdites première et deuxième compositions sont également dépourvues d'eau.

De plus, lorsque ledit mélange est dépourvu d'eau, ce dernier comprend en conséquence moins d'environ 27% en masse du ou desdits sophorolipides. Selon un autre mode de réalisation avantageux, l'invention concerne un produit de combinaison destiné à une utilisation simultanée, contenant: a) une première composition comprenant un ou plusieurs agents de lutte biologique, et b) une deuxième composition comprenant un ou plusieurs sophorolipides, ladite deuxième composition comprenant moins d'environ 27% en masse du ou desdits sophorolipides, en vue de la formation d'un mélange contenant lesdites première et deuxième compositions, 10 ledit mélange comprenant moins d'environ 6% en masse du ou desdits sophorolipides, le ou lesdits sophorolipides étant, dans ledit mélange, non toxiques pour le ou lesdits agents de lutte biologique. Selon un mode de réalisation particulièrement avantageux, ledit mélange contenant lesdites première et deuxième compositions et comprenant moins d'environ 6% en masse du 15 ou desdits sophorolipides comprend en outre de l'eau. Cette eau peut : - provenir de ladite première composition, la première composition comprenant alors de l'eau, ou - provenir de ladite deuxième composition, la deuxième composition comprenant alors de 20 l'eau, ou - provenir desdites première et deuxième compositions, les première et deuxième compositions comprenant alors de l'eau, et/ou - être apportée, en plus desdites première et deuxième compositions, afin de former ledit mélange. 25 En particulier, la première composition est dépourvue d'eau, la deuxième composition comprenant moins d'environ 27% en masse du ou desdits sophorolipides comprend en outre de l'eau, et de l'eau est ajoutée auxdites première et deuxième compositions, afin d'obtenir ledit mélange comprenant moins d'environ 6% en masse du ou desdits sophorolipides. Selon un mode de réalisation particulièrement avantageux, l'invention concerne un 30 produit de combinaison constitué par un mélange comprenant le ou lesdits agents de lutte biologique et le ou lesdits sophorolipides. Ainsi, l'invention concerne lesdites première et deuxième compositions, destinées à former un mélange les contenant, et en particulier ledit mélange lui-même.

L'invention concerne donc lesdites première et deuxième compositions, de façon distincte, lesdites première et deuxième compositions étant destinées à être mélangées, ou un mélange comprenant lesdites première et deuxième compositions, c'est-à-dire un mélange comprenant le ou lesdits agents de lutte biologique et le ou lesdits sophorolipides.

Selon un autre mode de réalisation particulièrement avantageux, l'invention concerne un produit de combinaison, ledit produit de combinaison, en particulier ladite deuxième composition, comprenant en outre : - des lécithines, en particulier des lécithines choisies parmi le groupe constitué : - des lécithines de soja ou de colza, plus particulièrement des lécithines de soja ou de colza 10 ayant des HLB comprises de 2 à 9, de préférence de 3 à 6, - des lécithines purifiées, notamment sous la forme de phosphatidylcholines, phosphatidyléthanolamines et phosphatidylinositols, seuls ou en mélanges, et - des lécithines modifiées chimiquement ou par voie enzymatique, notamment les lécithines hydrolysées, hydroxylées, oxydées, acétylées, propionylées et succinylées, 15 ou - des phospholipides issus d'oeufs, d'algues ou de plantes oléo-protéagineuses telles que le soja, le tournesol, le colza, le coton. Par lécithines, on entend un mélange d'origine naturelle comprenant des lipides 20 apolaires, en particulier les triglycérides, et des lipides polaires, en particulier les phospholipides (plus particulièrement les glycéro-phospholipides, encore plus particulièrement les phosphatidylcholines) et/ou les glycolipides. Les phospholipides sont présents dans toutes les membranes biologiques présentant un rôle fonctionnel et structural. Les lécithines sont des substances brunes-orangées de consistance cireuse, insolubles 25 dans l'eau, l'acétone et solubles dans le chloroforme. A titre d'exemple le tableau 1 suivant donne la composition moyenne de la lécithine de soja. Composition de la lécithine de soja Phospholipides : 58-65 % Phosphatidylcholine (PC) 13-18 % Phosphatidyléthanolamine (PE) 10-15 % Phosphatidylinositol (PI) 10-15 % Acide phosphatidique (PA) 5-12 % Acides gras libres 25-35 % Glycolipides 5-7 % Sucres 3-5 % Stérols, tocophérols 1,5-2,5 % Eau 1% Substances minérales 1,2-1,6 % Tableau 1 : Composition moyenne de la lécithine de soja. Le nombre de glycéro-phospholipides est extrêmement élevé, à cause de la diversité possible des chaînes grasses ainsi que la variété des parties polaires liées au groupement phosphate. Les acides gras estérifiant le glycérol en position 1 et 2 ont des longueurs de chaîne variant de quatorze à vingt-deux atomes de carbones (majoritairement en C16, Ci7 et C18). La partie lipophile est constituée de deux chaînes grasses R1 et R2, insaturées ou portant une, deux, voire trois insaturations. La partie hydrophile ou tête polaire est constituée du groupe « glycérophosphoryl S » où S représente les substituants liés au phosphate.

Le comportement des lécithines en solution aqueuse peut être caractérisé par la balance hydrophile lipophile (HLB). La valeur de HLB indique la balance existante entres les groupes solubles dans l'eau et ceux solubles dans les huiles. La HLB des lécithines brutes est généralement basse, conventionnellement égale à 4, ce qui lui confère des propriétés d'émulsionnant eau dans huile. Par modification chimique ou séparation fractionnée bien connues de l'homme du métier, on peut obtenir une gamme de produits sur toute l'échelle des HLB (allant d'environ 1 à environ 19). Selon un autre mode de réalisation particulièrement avantageux, l'invention concerne un produit de combinaison, dans lequel la tension de surface dudit mélange est inférieure à 40 mN/m, en particulier comprise de 15 à 40 mN/m, plus particulièrement de 25 à 35 mN/m.

Selon un autre mode de réalisation particulièrement avantageux, l'invention concerne un produit de combinaison, dans lequel ledit agent de lutte biologique est choisi parmi les champignons et les bactéries. Selon un autre mode de réalisation particulièrement avantageux, l'invention concerne un produit de combinaison, dans lequel ledit agent de lutte biologique est choisi dans le groupe constitué des champignons suivants : - Geotrichum sp., en particulier Geotrichum candidum, plus particulièrement les souches déposées à la CNCM sous les numéros 1.1474 et 1.1475 le 06 septembre 1994, - Trichoderma sp., en particulier Trichoderma harzianum, plus particulièrement Trichoderma harzianum (ATCC 20476), Trichoderma polysporum, plus particulièrement Trichoderma polysporum (ATCC 20475), Trichoderma koningii et Trichoderma asperellum, - Pseudomonas fluorescens, - Bacillus subtilis, en particulier Bacillus subtilis AS 43.3, Bacillus subtilis AS 43.4 et Bacillus subtilis OH 131.14 - Cryptococcus sp., - Bacillus thuringiensis, - Rhodotorula glutinis, et des bactéries lactiques. Selon un autre mode de réalisation particulièrement avantageux, l'invention concerne un produit de combinaison, dans lequel ledit agent de lutte biologique est choisi dans le groupe constitué des champignons suivants : - Geotrichum sp., en particulier Geotrichum candidum, plus particulièrement les souches déposées à la CNCM sous les numéros 1.1474 et 1.1475 le 06 septembre 1994, - Trichoderma koningii et Trichoderma asperellum, - Cryptococcus sp., et des bactéries lactiques. Selon un autre mode de réalisation particulièrement avantageux, l'invention concerne un produit de combinaison, dans lequel ledit agent de lutte biologique est Geotrichum sp., en particulier Geotrichum candidum, plus particulièrement les souches déposées à la CNCM sous les numéros 1.1474 et 1.1475 le 06 septembre 1994. Selon un autre mode de réalisation particulièrement avantageux, l'invention concerne un produit de combinaison, dans lequel ledit agent de lutte biologique est Trichoderma sp., en particulier Trichoderma harzianum, plus particulièrement Trichoderma harzianum (ATCC 20476), Trichoderma polysporum, plus particulièrement Trichoderma polysporum (ATCC 20475)9 Trichoderma koningii ou Trichoderma asperellum. Selon un autre mode de réalisation particulièrement avantageux, l'invention concerne un produit de combinaison, dans lequel ledit sophorolipide est de l'une des structures (1) et (2) suivantes : Co R2' O-ÇH (1) 11 R2 Ri CORS (2) OH dans lesquelles : - RI et RI' représentent indépendamment l'un de l'autre : o une chaine hydrocarbonée saturée linéaire ou ramifiée comprenant de 1 à 21 atomes de carbone, éventuellement substitué par un ou plusieurs groupements hydroxyles, o une chaine hydrocarbonée insaturée, notamment mono insaturée ou polyinsaturée, linéaire ou ramifié, comprenant de 2 à 21 atomes de carbone, éventuellement substitué par un ou plusieurs groupements hydroxyles; - R2 et R2' représentent indépendamment l'un de l'autre : o H, o une chaine hydrocarbonée saturée linéaire ou ramifié comprenant de 1 à 9 atomes de carbone, éventuellement substitué par un ou plusieurs groupements hydroxyles, o une chaine hydrocarbonée insaturée, notamment mono insaturée ou polyinsaturée, linéaire ou ramifié, comprenant de 2 à 9 atomes de carbone, éventuellement substitué par un ou plusieurs groupements hydroxyles; - R3, R4, R3' et R4' représentent indépendamment les uns des autres un atome d'hydrogène ou un groupement acétyle ; - R5 est un groupement choisi parmi : O OCH3, O O(CH2)mCH3 avec m compris de 1 à 11, o OH, o 0-114±, où M+ est un cation métallique ou un cation organique, notamment un ammonium, en particulier le diméthylammonium, le triméthylammonium, l'isopropylammonium, le mono-éthanol-ammonium, le di-éthanol-ammonium ou le tri-éthanol-ammonium, ou un phosphonium, o N(CH2)',OH avec m compris de 1 à 11, O N(CH2),,,SH avec m compris de 1 à 11, o N(CH2),,NRaRb avec m compris de 1 à 11, Ra et Rb représentant indépendamment l'un de l'autre H ou une chaine hydrocarbonée saturée linéaire ou ramifié comprenant de 1 à 9 atomes de carbone, o N(CH2)',N+ReRdRe avec m compris de 1 à 11, Re, Rd et Re représentant indépendamment les uns des autres une chaine hydrocarbonée saturée linéaire ou ramifié comprenant de 1 à 9 atomes de carbone, o N(CH2),'NH(CH2),NH2, m et n étant indépendamment l'un de l'autre compris de 1 à 11, o N(CH2),NH(CH2),NH(CH2)pNH2, m, n et p étant indépendamment les uns des autres compris de 1 à 11, o N(CH2)mZ avec m compris de 1 à 11, Z représentant un cycle choisi parmi les groupes suivants : ^ les cycles aromatiques, en particulier le phényle, le phénol et les phényl diols, ^ les hétérocycles aromatiques, en particulier l'imidazole et l'indole, les hétérocycles saturés, en particulier la pyrrolidine.

Selon un autre mode de réalisation particulièrement avantageux, l'invention concerne un produit de combinaison, dans lequel ledit sophorolipide est de l'une des structures (1) et (2) suivantes : R2 R1 .0C \ (1) R2' CORS (2) OH dans lesquelles : - RI et RI' représentent indépendamment l'un de l'autre : o une chaine hydrocarbonée saturée linéaire ou ramifiée comprenant de 1 à 21 atomes de carbone, éventuellement substitué par un ou plusieurs groupements hydroxyles, o une chaine hydrocarbonée insaturée, notamment mono insaturée ou polyinsaturée, linéaire ou ramifié, comprenant de 2 à 21 atomes de carbone, éventuellement substitué par un ou plusieurs groupements hydroxyles; - R2 et R2' représentent indépendamment l'un de l'autre o H, o une chaine hydrocarbonée saturée linéaire ou ramifié comprenant de 1 à 9 atomes de carbone, éventuellement substitué par un ou plusieurs groupements hydroxyles, o une chaine hydrocarbonée insaturée, notamment mono insaturée ou polyinsaturée, linéaire ou ramifié, comprenant de 2 à 9 atomes de carbone, éventuellement substitué par un ou plusieurs groupements hydroxyles; - R3, R4, R3' et R4' représentent indépendamment les uns des autres un atome d'hydrogène ou un groupement acétyle ; - R5 est un groupement OCH3, O(CH2),,,CH3 avec m compris entre 1 et 11, OH ou O-M+, où M+ est un cation métallique ou un cation organique, notamment un ammonium, en particulier le diméthylammonium, le triméthylammonium, l'isopropylammonium, le mono-éthanol-ammonium, le di-éthanol-ammonium ou le tri-éthanol-ammonium, ou un phosphonium. Selon un autre mode de réalisation particulièrement avantageux, l'invention concerne un produit de combinaison, dans lequel ladite deuxième composition comprend au moins un sophorolipide de structure suivante (1) et au moins un sophorolipide de structure suivante (2) : R2 0-CH R1 0 (1) OH 2' 0-CH R1 COR5 (2) dans lesquelles RI, R1', R2, R2', R3, R4, R3', R4' et R5 sont tels que définis précédemment. Selon un autre mode de réalisation particulièrement avantageux, l'invention concerne un produit de combinaison, dans lequel ladite deuxième composition comprend au moins un sophorolipide de structure (1) et au moins un sophorolipide de structure (2), ledit sophorolipide de structure (1) représentant de 5 à 65%, de préférence de 10 à 50% de la masse totale des sophorolipides. Selon un autre mode de réalisation particulièrement avantageux, l'invention concerne un produit de combinaison, dans lequel ledit agent de lutte biologique est Geotrichum sp., en particulier Geotrichum candidum, et dans lequel ledit sophorolipide est de l'une des structures (1) et (2) suivantes OR3 0 (1) HO R2 R1 O OH R2' 0-CH Ri COR5 (2) OH dans lesquelles : RI et R1' représentent indépendamment l'un de l'autre : o une chaine hydrocarbonée saturée linéaire ou ramifiée comprenant de 1 à 21 atomes de carbone, éventuellement substitué par un ou plusieurs groupements hydroxyles, o une chaine hydrocarbonée insaturée, notamment mono insaturée ou polyinsaturée, linéaire ou ramifié, comprenant de 2 à 21 atomes de carbone, éventuellement substitué par un ou plusieurs groupements hydroxyles; ® R2 et R2' représentent indépendamment l'un de l'autre : o H, o une chaine hydrocarbonée saturée linéaire ou ramifié comprenant de 1 à 9 atomes de carbone, éventuellement substitué par un ou plusieurs groupements hydroxyles, o une chaine hydrocarbonée insaturée, notamment mono insaturée ou polyinsaturée, linéaire ou ramifié, comprenant de 2 à 9 atomes de carbone, éventuellement substitué par un ou plusieurs groupements hydroxyles; ® R3, R4, R3' et R4' représentent indépendamment les uns des autres un atome d'hydrogène ou un groupement acétyle ; e R5 est un groupement OCH3, 0(CH2).CH3 avec m compris entre 1 et 11, OH ou 0-M+, où M+ est un cation métallique ou un cation organique, notamment un ammonium, en particulier le diméthylammonium, le triméthylammonium, l'isopropylammonium, le mono-éthanol-ammonium, le di-éthanol-ammonium ou le tri-éthanol-ammonium, ou un phosphonium. Selon un autre mode de réalisation particulièrement avantageux, l'invention concerne un produit de combinaison, dans lequel ledit agent de lutte biologique est Trichoderma sp., en particulier Trichoderma harzianum, plus particulièrement Trichoderma harzianum (ATCC 20476), Trichoderma polysporum, plus particulièrement Trichoderma polysporum (ATCC 20475), Trichoderma koningii ou Trichoderma asperellum, et dans lequel ledit sophorolipide est de l'une des structures (1) et (2) suivantes : R2 R1 c, `o (1) OH COR5 (2) dans lesquelles : - RI et Ry représentent indépendamment l'un de l'autre : o une chaine hydrocarbonée saturée linéaire ou ramifiée comprenant de 1 à 21 atomes de carbone, éventuellement substitué par un ou plusieurs groupements hydroxyles, o une chaine hydrocarbonée insaturée, notamment mono insaturée ou polyinsaturée, linéaire ou ramifié, comprenant de 2 à 21 atomes de carbone, éventuellement substitué par un ou plusieurs groupements hydroxyles; - R2 et R2' représentent indépendamment l'un de l'autre : o H, o une chaine hydrocarbonée saturée linéaire ou ramifié comprenant de 1 à 9 atomes de carbone, éventuellement substitué par un ou plusieurs groupements hydroxyles, o une chaine hydrocarbonée insaturée, notamment mono insaturée ou polyinsaturée, linéaire ou ramifié, comprenant de 2 à 9 atomes de carbone, éventuellement substitué par un ou plusieurs groupements hydroxyles; - R3, R4, R3' et R4' représentent indépendamment les uns des autres un atome d'hydrogène ou un groupement acétyle ; - R5 est un groupement OCH3, 0(CH2),,,CH3 avec m compris entre 1 et 11, OH ou 0-M+, où M+ est un cation métallique ou un cation organique, notamment un ammonium, en particulier le diméthylammonium, le triméthylammonium, l'isopropylammonium, le mono-éthanol-ammonium, le di-éthanol-ammonium ou le tri-éthanol-ammonium, ou un phosphonium.

Selon un autre mode de réalisation particulièrement avantageux, l'invention concerne un produit de combinaison, dans laquelle ladite première composition est sous forme sèche. Par « forme sèche », on entend que ladite première composition est dépourvue d'eau.

Selon un autre mode de réalisation particulièrement avantageux, l'invention concerne un produit de combinaison, dans laquelle ladite première composition est sous forme sèche et comprend en outre un support, ledit support étant notamment choisi dans le groupe constitué des humus, des argiles, des talcs, des silices naturelles, de la terre de diatomée, des kaolins, des cyclodextrines, des amidons, des lactoses, des cires, des résines synthétiques ou naturelles, des polymères synthétiques ou d'origine naturelle, des oxydes de titanes, des carbonates, des sulfates de sodium, des silicates de sodium et des zéolithes. Par support, on entend des solides amorphes ou cristallisés, chimiquement inertes ou apportant une fonctionnalité, notamment en modifiant le pH de l'eau, la rhéologie de l'eau, en séquestrant les ions monovalents, divalents ou polyvalents présents dans l'eau, sur lesquels le ou les agents de lutte biologiques sont adsorbés. Les formes sèches peuvent être obtenues selon l'une des méthodes connues par l'homme du métier et notamment sans l'intention de s'y limiter par granulation, adsorption sur solides finement divisés, atomisation, déshydratation, séchage sous flux d'air chaud, ou lyophilisation.

Selon un autre mode de réalisation particulièrement avantageux, l'invention concerne un produit de combinaison, dans laquelle ladite première composition est sous forme liquide. Par « forme liquide », on entend que ladite première composition comprend un liquide, en particulier de l'eau. Lorsque ladite première composition est sous forme liquide, elle est notamment sous la forme d'une solution ou d'une suspension. Selon un autre mode de réalisation particulièrement avantageux, l'invention concerne un produit de combinaison, dans laquelle ladite deuxième composition est sous forme liquide. Par « forme liquide », on entend que ladite deuxième composition comprend un liquide, en particulier de l'eau.

Lorsque ladite deuxième composition est sous forme liquide, elle est notamment sous la forme d'une solution ou d'une suspension. Selon un autre mode de réalisation particulièrement avantageux, l'invention concerne un produit de combinaison, dans laquelle ladite deuxième composition est sous forme sèche. Par « forme sèche », on entend que ladite première composition est dépourvue d'eau.

Ainsi, la première et la deuxième composition peuvent être, indépendamment l'une de l'autre, sous forme sèche ou humide, à la condition que ledit mélange contenant lesdites première et deuxième compositions est dépourvu d'eau ou comprend moins d'environ 6% en masse du ou desdits sophorolipides.

Lorsque ledit mélange contenant les première et deuxième compositions est dépourvu d'eau (sous forme sèche), cela signifie que lesdites première et deuxième compositions sont sous forme sèche. Ledit mélange contient moins d'environ 27% en masse de sophorolipides. En outre, ledit mélange peut contenir plus de 6% en masse de sophorolipides.

Lorsque ledit mélange contenant les première et deuxième compositions comprend moins d'environ 6% en masse du ou desdits sophorolipides, cela signifie notamment: - que la première et la deuxième compositions sont sous forme liquide, et que le mélange contenant lesdites première et deuxième compositions comprend, sans ajout de liquide, en particulier d'eau, moins d'environ 6% en masse du ou desdits sophorolipides ; - que la première et la deuxième compositions sont sous forme liquide, et que le mélange contenant lesdites première et deuxième compositions comprend en outre une quantité de liquide additionnelle par rapport à celle contenue dans les première et deuxième compositions, en particulier de l'eau, afin que ledit mélange comprenne moins d'environ 6% en masse du ou desdits sophorolipides ; - que la première composition est sous forme sèche, que la deuxième composition est sous forme liquide, et que le mélange contenant lesdites première et deuxième compositions comprend, sans ajout de liquide, en particulier d'eau, moins d'environ 6% en masse du ou desdits sophorolipides ; - que la première composition est sous forme sèche, que la deuxième composition est sous forme liquide, et que le mélange contenant lesdites première et deuxième compositions comprend en outre une quantité de liquide additionnelle par rapport à celle contenue dans la deuxième composition, en particulier de l'eau, afin que ledit mélange comprenne moins d'environ 6% en masse du ou desdits sophorolipides ; - que la première composition est sous forme liquide, que la deuxième composition est sous forme sèche, et que le mélange contenant lesdites première et deuxième compositions comprend, sans ajout de liquide, en particulier d'eau, moins d'environ 6% en masse du ou desdits sophorolipides ; - que la première composition est sous forme liquide, que la deuxième composition est sous forme sèche, et que le mélange contenant lesdites première et deuxième compositions comprend en outre une quantité de liquide additionnelle par rapport à celle contenue dans la première composition, en particulier de l'eau, afin que ledit mélange comprenne moins d'environ 6% en masse du ou desdits sophorolipides ; ou - que la première et la deuxième compositions sont sous forme sèche, et que le mélange contenant lesdites première et deuxième compositions comprend en outre une certaine quantité de liquide, en particulier de l'eau, afin que ledit mélange comprenne moins d'environ 6% en masse du ou desdits sophorolipides ; - que la première et la deuxième compositions sont sous forme sèche, et que le mélange contenant lesdites première et deuxième compositions, sous forme sèche, comprend moins d'environ 6% en masse du ou desdits sophorolipides. En-particulier : - la première composition est sous forme sèche, la deuxième composition comprend de l'eau, et le mélange contenant lesdites première et deuxième compositions comprend en outre une quantité d'eau additionnelle par rapport à celle contenue dans la deuxième composition, afin 10 que ledit mélange comprenne moins d'environ 6% en masse du ou desdits sophorolipides ; - la première et la deuxième compositions sont sous forme sèche, et le mélange contenant lesdites première et deuxième compositions est donc dépourvu d'eau (sous forme sèche), ledit mélange contenant moins d'environ 27% en masse de sophorolipides, et pouvantt contenir plus de 6% en masse de sophorolipides ; 15 - la première et la deuxième compositions sont sous forme sèche, le mélange contenant lesdites première et deuxième compositions comprend en outre une certaine quantité d'eau, afin que ledit mélange comprenne moins d'environ 6% en masse du ou desdits sophorolipides. Selon un autre mode de réalisation particulièrement avantageux, l'invention concerne 20 un produit de combinaison, dans lequel le rapport de la masse des sophorolipides sur la quantité d'agents de lutte biologique est compris d'environ 10-14 à environ 10-2, notamment d'environ 10-10 à environ 3.10-5 mg de sophorolipides par spore d'agents de lutte biologique. Selon un mode de réalisation particulier, l'invention concerne un produit de combinaison, ledit produit de combinaison, en particulier ladite deuxième composition, 25 comprenant en outre un polymère. Ledit polymère est notamment choisi parmi les polysaccharides naturelles ou obtenus par fermentation, en particulier les gommes de xanthane, les alginates, les amidons natifs ou modifiés, les pectines et amylopectines, les celluloses natives ou modifiés, l'agar-agar, le carraghénane, les hyaluronate de sodium, les arabino-xylanes, les dérivés de chitines. 30 Le dit polymère peut aussi être choisi parmi les résines naturelles ou non, tel que les gommes d'acacia, la gomme arabique, les résines d'arbre , des huiles époxydée, des polyuréthanes, des polyesters, l'alcool polyvinylique, des polyacrylates, des polycarboxylates.

Selon un mode de réalisation particulier, l'invention concerne un produit de combinaison, ledit produit de combinaison, en particulier ladite deuxième composition, comprenant en outre des argiles micronisées. Lesdits polymères, argiles micronisées et résines permettent d'augmenter la rétention de la bouillie sur la feuille, d'éviter le dessèchement. Le glycérol, les dérivés du glycérol et des polyglycérols comme les esters de polyglycérols, les polyols et les dérivés des polyols, en particulier le sorbitol et les dérivés du sorbitol peuvent également être présents dans ledit produit de combinaison, en particulier ladite deuxième composition, afin de lutter contre le dessèchement.

Les filtres UV tels que les oxydes de titane, les oxydes de zinc, les filtres solaires chimiques bloquant les UV-A et/ou les UV-B tels que les benzohenone 3, 4 ou 8, les salicylate d'éthylhexyle ou de triéthanolamine, l'acide para-aminobenzoïque, la cyanophénylcinnamate d'octyle ou octocrylène, peuvent également être présents dans ledit produit de combinaison, en particulier ladite deuxième composition, afin de lutter contre l'action des UV. Selon un mode de réalisation particulier, l'invention concerne un produit de combinaison, ledit produit de combinaison, en particulier ladite deuxième composition, comprenant en outre un solvant ou huile. Ledit solvant peut être choisi parmi les solvants oxygénés et polaires, en particulier les esters d'acides succinique, adipiques, glutariques, lactiques, les glycols, en particulier le butylène glycol, le propylène glycol, et les alcools, en particulier le 1,3 propanediol. Ledit solvant permet alors de stabiliser la formule, en particulier de réduire la viscosité, et/ou de permettre la dispersion de l'éventuelle lécithine dans l'eau. Le solvant ou l'huile peuvent également être choisis parmi les huiles que sont les triglycérides, les esters d'acides gras, les terpènes, et les solvants que sont les solvants paraffiniques, le xylène, le chloro-benzène, l'iso-phorone, et la butirolactone. Ledit solvant ou ladite huile permettent alors de renforcer la pénétration foliaire, voire même pour les huiles essentielles de renforcer l'action de l'agent de lutte biologique, certaines huiles pouvant être fongicides.

Selon un mode de réalisation particulier, l'invention concerne un produit de combinaison, ledit produit de combinaison, en particulier ladite deuxième composition, comprenant en outre des hydrotropes. Lesdits hydrotropes sont par exemple utilisés de 0,5 à 25%, de préférence de 1 à 15% de la masse totale du produit de combinaison ou de la deuxième composition.

Ils sont choisis de manière à ne pas être toxiques pour l'agent de lutte biologique. Les hydrotropes sont ainsi choisis de préférence parmi les hydrotropes dérivés de sucres, tels que les xylosides de C4 à C8 et particulièrement les xylosides d'amyle (C5), les glucosides de C4 à C8, notamment de butyle, d'hexyle, de 2-éthyl-hexyle, d'heptyle, d'octyle.

Les hydrotropes permettent de stabiliser les formulations, notamment d'augmenter la solubilité de l'éventuelle lécithine, de réduire la viscosité et de permettre une meilleure dispersion dans l'eau. Selon un mode de réalisation particulier, l'invention concerne un produit de combinaison, ledit produit de combinaison, en particulier ladite deuxième composition, 10 comprenant en outre un modificateur de pH. Le modificateur de pH est en particulier destiné à modifier le pH pour que ce dernier soit compris d'environ 4 à environ 8. Il est choisi parmi les acidifiant, notamment les acides citrique, lactique, sulfurique, et les agents alcalins, notamment la soude, la potasse, le trisodium citrate, des métasillicates, le 15 carbonate de sodium, le bicarbonate, et les gluconate de sodium. Selon un mode de réalisation particulier, l'invention concerne un produit de combinaison, ledit produit de combinaison, en particulier ladite deuxième composition, comprenant en outre un agent de conservation. Les agents de conservation sont ajoutés pour stabiliser la formule et éviter la 20 prolifération des bactéries, ou levures. Parmi les agents de protection, on peut notamment citer le bronopol, les parabènes, et le phénoxy-éthanol, l'acide benzoïque, l'acide sorbique, ou tout autre agent conforme à la directive Européenne 98/8/CE du 24/04/1998. Selon un autre mode de réalisation particulièrement avantageux, l'invention concerne un produit de combinaison, dans lequel ladite deuxième composition comprend en masse : 25 - de 0,1 à 27%, en particulier de 0,5 à 27% de sophorolipides ; - de 0 à 73% de lécithines ; - de 0 à 10% de polymère ; - de 0 à 10% de résine ; - de 0 à 50% d'hydrotropes ; 30 - de 0 à 73% de solvant ; - de 0 à 73% d'eau ; - de 0 à 73% de support inerte, ledit support inerte étant choisi parmi les humus, les argiles, les silices naturelles, les terres de diatomées, les kaolins, les cylcodextrines, les amidons, les lactoses, les cires, les résines synthétiques ou naturelles, et les talcs ; - de 0 à 10% de modificateurs de pH ; - de 0 à 1% d'agents de conservation. Selon un autre mode de réalisation particulièrement avantageux, l'invention concerne un produit de combinaison, dans lequel ladite deuxième composition comprend en masse : - de 0,1 à 27%, en particulier de 0,5 à 27% de sophorolipides ; - de 0 à 73% de lécithines ; - de 0 à 10% de polymère ; - de 0 à 10% de résine ; - de 0 à 50% d'hydrotropes ; - de 0 à 73% de solvant ; - de 0 à 10% de modificateurs de pH ; - de 0 à 1% d'agents de conservation ; - eau qsp 100%. Selon un autre mode de réalisation particulièrement avantageux, l'invention concerne un produit de combinaison, dans lequel ladite deuxième composition comprend en masse : - de 0,1 à 27%, en particulier de 0,5 à 27% de sophorolipides ; - de 0 à 73% de lécithines ; - de 0 à 10% de polymère ; - de 0 à 10% de résine ; - de 0 à 50% d'hydrotropes ; - de 0 à 73% de solvant ; - de 0 à 10% de modificateurs de pH ; - de 0 à 1% d'agents de conservation ; - support inerte qsp 100%, ledit support inerte étant choisi parmi les humus, les argiles, les silices naturelles, les terres de diatomées, les kaolins, les cylcodextrines, les amidons, les lactoses, les cires, les résines synthétiques ou naturelles, et les talcs. Selon un autre mode de réalisation particulièrement avantageux, l'invention concerne un produit de combinaison, dans lequel ladite deuxième composition comprend en masse : - de 5 à 27% de sophorolipides ; - de 0 à 50% de lécithines, en particulier de lécithine de colza ; - de 0,1 à 10% de polymère ou résine, en particulier des polyglycérols, des dérivés de polyglycérols ou de la gomme de xanthane ; - de 5 à 50% d'hydrotropes, en particulier de xylosides d'amyle ; - de 0 à 10% de solvant, en particulier un solvant choisi dans le groupe constitué des esters d'acides lactiques, et des alcools comprenant de 2 à 8 atomes de carbone ; - de 0 à 0,1% de conservateur, en particulier le bronopol ; - eau qsp 100%.

Selon un autre mode de réalisation particulièrement avantageux, l'invention concerne un produit de combinaison, dans lequel ladite deuxième composition comprend en masse : - de 5 à 27% de sophorolipides ; - de 0,1 à 10% de polymère ou résine, en particulier de gomme de xanthane ; - de 5 à 50% d'hydrotroPes, en particulier de xylosides d'amyle ; - de 0 à 0,1% de conservateur, en particulier le bronopol ; - eau qsp 100%. Selon un autre mode de réalisation particulièrement avantageux, l'invention concerne un produit de combinaison, dans lequel ladite deuxième composition comprend en masse : - de 5 à 27% de sophorolipides ; - de 15 à 50% de lécithines, en particulier de lécithine de colza ; - de 1 à 10% de polymère, en particulier des polyglycérols ou des dérivés de polyglycérols ; - de 5 à 50% d'hydrotropes, en particulier de xylosides d'amyle ; - de 1 à 10% de solvant, en particulier un solvant choisi dans le groupe constitué des esters d'acides lactiques, et des alcools comprenant de 2 à 8 atomes de carbone ; - de 0 à 0,1% de conservateur, en particulier le bronopol ; - eau qsp 100%. Selon un autre mode de réalisation particulièrement avantageux, l'invention concerne un produit de combinaison constitué par un mélange aqueux comprenant le ou lesdits agents de lutte biologique et le ou lesdits sophorolipides, ledit mélange comprenant: - de 2 mg à 250g/L d'agent de lutte biologique sous forme sèche, éventuellement sur support, soit d'environ 2.104 à environ 2,5.1012 spores par litre lorsque lesdits agents de lutte biologique sont des champignons ; - de 0,05 mg à 60 g/L de sophorolipides ; - de 0 à 120g/L de lécithines, en particulier de 0,1mg à 120g/L de lécithines; 30 - de 0 à 22g/L de polymère; - de 0 à 22g/L de résine; - de 0 à 120g/L d'hydrotropes ; - de 0 à 100g/L de solvant ; - eau qsp 1 litre.

Lorsque l'agent de lutte biologique est sur support, la concentration donnée ci-dessus correspond à la masse, par litre, dudit agent de lutte biologique et de son support. Selon un autre mode de réalisation particulièrement avantageux, l'invention concerne un produit de combinaison constitué par un mélange dépourvu d'eau comprenant le ou lesdits agents de lutte biologique et le ou lesdits sophorolipides, ledit mélange comprenant: - de 2 mg à 250g/kg d'agent de lutte biologique sous forme sèche, éventuellement sur support, soit d'environ 2.104 à environ 2,5.1012 spores par kg lorsque lesdits agents de lutte biologique sont des champignons ; - de 0,05 mg à 60 g/kg de sophorolipides ; - de 0 à 120g/kg de lécithines, en particulier de 0,lmg à 120g/L de lécithines; - de 0 à 22g/kg de polymère; - de 0 à 22g/kg de résine; - de 0 à 120g/kg d'hydrotropes ; - support inerte qsp 1 kg, ledit support inerte étant choisi parmi les humus, les argiles, les silices naturelles, les terres de diatomées, les kaolins, les cylcodextrines, les amidons, les lactoses, les cires, les résines synthétiques ou naturelles, et les talcs. Selon un autre mode de réalisation particulièrement avantageux, l'invention concerne un produit de combinaison constitué par un mélange, ledit mélange contenant outre lesdites première et deuxième compositions, un engrais, un amendement, ou des supports de cultures tels que les écorces, les pailles, les menues pailles, ou du mulch. Ledit engrais, en particulier défini par la norme NFU 42-001, peut être minéral ou organique. Ledit amendement, organique, en particulier défini par la norme NFU 44-051, peut être par exemple des fumures azotées organiques.

Ledit support de culture, en particulier défini par la norme NFU 44-551, peut être minéral et/ou organique, par exemple des fumures pailleuses azotées organiques. Selon un autre mode de réalisation particulièrement avantageux, l'invention concerne un produit de combinaison, dans lequel ledit agent de lutte biologique est un champignon, sous forme de spores.

Selon un autre mode de réalisation particulièrement avantageux, l'invention concerne un produit de combinaison, dans lequel ledit agent de lutte biologique est un champignon, sous forme de mycélium.

L'invention concerne également une plante dont tout ou partie de la surface est recouverte par un produit de combinaison tel que décrit précédemment, à raison de 1 à 100 j_tg dudit produit de combinaison par cm2 de surface recouverte. L'invention concerne également un procédé de préparation d'un produit de combinaison tel que décrit précédemment, ledit produit de combinaison étant constitué par un mélange comprenant le ou lesdits agents de lutte biologique et le ou lesdits sophorolipides, ledit mélange étant dépourvu d'eau ou comprenant moins d'environ 6% en masse du ou desdits sophorolipides, ledit procédé comprenant une étape de mélange entre une première composition comprenant un ou plusieurs agents de lutte biologique et une deuxième composition comprenant un ou plusieurs sophorolipides, ladite deuxième composition comprenant moins d'environ 27% en masse du ou desdits sophorolipides, éventuellement de l'eau, et éventuellement un ou plusieurs adjuvants choisis parmi les lécithines, les polymères, les résines, les solvants, des hydrotropes, les modificateurs de pH, les agents de conservation et les engrais, pour obtenir ledit mélange.

Selon un mode de réalisation avantageux, l'invention concerne un procédé de préparation dans lequel lesdites première et deuxième compositions, et de l'eau sont mélangés au cours de ladite étape de mélange pour obtenir ledit mélange. Selon un autre mode de réalisation avantageux, l'invention concerne un procédé de préparation comprenant, après l'étape de mélange, une étape de multiplication dudit agent de lutte biologique compris dans ledit mélange, pour obtenir un mélange dans lequel le ou lesdits agents de lutte biologique se sont multipliés. Selon un autre mode de réalisation avantageux, l'invention concerne un procédé de préparation dudit mélange, dans lequel un engrais ou un amendement organique est ajouté aux première et deuxième compositions lors de ladite étape de mélange.

L'invention concerne également l'utilisation d'un produit de combinaison tel que décrit précédemment, pour le traitement des plantes. Selon un mode de réalisation avantageux, l'invention concerne une utilisation, pour le traitement des plantes, dans laquelle ledit produit de combinaison est constitué par un mélange comprenant le ou lesdits agents de lutte biologique et le ou lesdits sophorolipides, ledit mélange étant dépourvu d'eau ou comprenant moins d'environ 6% en masse du ou desdits sophorolipides. Selon un autre mode de réalisation avantageux, l'invention concerne une utilisation dans laquelle ledit mélange est appliqué par une ou plusieurs pulvérisations sur lesdites plantes.

Selon un autre mode de réalisation avantageux, l'invention concerne une utilisation, dans laquelle la ou lesdites pulvérisations dudit mélange sont précédées et/ ou suivies d'une ou plusieurs applications, en particulier par pulvérisation, d'un fongicide. Selon un mode de réalisation particulièrement avantageux, l'invention concerne une utilisation dans laquelle le fongicide est choisi dans le groupe constitué - des triazoles, en particulier bitertanol, cyproconazole, dichlobutrazole, diniconazole, étaconazole, flusilazol, flutriafol, penconazol,propiconazole, triadimefon, triadimenol et triflumazole ; des imidazoles, en particulier fénapanil, imazalil, prochloraze et triflumizole ; - du chlorothalonil ; les inhibiteurs de la succinate déshydrogénase (SDHI), en particulier fluxapyroxad, isopyrazam et bixafen ; ainsi que de leurs mélanges. Ledit fongicide peut également être tout autre fongicide selon la liste des substances actives phytosanitaires autorisées par l'union Européenne. Selon un mode de réalisation particulièrement avantageux, l'invention concerne une utilisation dudit mélange, ledit mélange comprenant en outre un engrais ou un amendement, en particulier organique, pour le traitement direct des plantes. Selon un mode de réalisation particulièrement avantageux, l'invention concerne une 20 utilisation dudit mélange, ledit mélange comprenant en outre un engrais ou un amendement, en particulier organique, pour le traitement des plantes avant l'apparition des premières pousses. Selon un autre mode de réalisation avantageux, l'invention concerne une utilisation dans laquelle ledit mélange est appliqué par pulvérisation sur lesdites plantes, en quantité 25 suffisante pour apporter : - de 109 à 1013 spores d'agents de lutte biologique, lesdits agents de lutte biologique étant des champignons, et -de 20 mg à 3000 g de sophorolipides, 30 par hectare de culture desdites plantes. Selon un autre mode de réalisation avantageux, l'invention concerne une utilisation dans laquelle lesdites plantes appartiennent au groupe constitué -des céréales, en particulier le blé, le maïs et l'orge, - de la vigne, - des solanacées, en particulier la tomate et la pomme de terre, - des rosacées, en particulier la pomme Selon un mode de réalisation particulièrement avantageux, l'invention concerne une utilisation pour le traitement de plantes atteintes d'une maladie appartenant au groupe constitué : - de la fusariose, ledit agent de lutte biologique étant en particulier Geotrichum sp., Trichoderma sp., ou Bacillus subtilis, - de la septoriose, ledit agent de lutte biologique étant en particulier Geotrichum sp, - du mildiou, ledit agent de lutte biologique étant en particulier Geotrichum sp., Trichoderma sp., ou Bacilles subtilis, - de la pourriture grise, ledit agent de lutte biologique étant en particulier Geotrichum sp., Trichoderma sp., ou Bacillus subtilis. DESCRIPTION DES FIGURES La figure 1 décrit la mise en évidence de l'effet des adjuvants selon l'invention sur la croissance de Geotrichum candidum en milieu liquide, par observations au microscope optique avec l'objectif x 100 pour le cliché A et l'objectif x400 pour les clichés B et C. Sur le cliché A (BCA seul) sont observés des spores de BCA en début de germination. Sur 20 le cliché B (BCA + adjuvant de l'exemple 1) sont observés des hyphes (filaments mycéliens en formation) et spores de BCA en début de germination. Sur le cliché C (BCA + Adjuvant de l'exemple 2) sont observés du mycélium de BCA. La figure 2 décrit les observations au microscope optique d'un témoin (Trichoderma seul, cliché A), d'une composition comprenant BCA et l'adjuvant de l'exemple 1 (cliché B) et 25 d'une composition comprenant BCA et l'adjuvant de l'exemple 2 (cliché C). Les observations sont les suivantes : - Cliché A o Présence de spores mais pas de mycélium visible sur les lames ; o Présence des rares tubes germinatifs ; 30 o Il n'y a pas présence d'amas dans le fond de l'erlen. Cliché B : o Présence de spores quelques mycélium visible mais pas sur toutes les lames ; o Présence de quelques amas (4-5) de mycéliums dans le fond de l'erlen. - Cliché C : o De nombreux amas (+200) dans le fond de l'erlen ; o Les amas sont compacts et sont formés d'un grand nombre de mycéliums. La figure 3 décrit les observations des différentes modalités après croissance sur boite PDA pendant 6 jours (dépôt 3011L, 3 répétitions par modalité). Les observations sont les suivantes : Fusarium seul : Présence de 100% de F. graminearum sur l'ensemble de la boite ; - Trichoderma seul : Présence de 100% de Trichoderma sp. sur l'ensemble de la boite ; - Trichoderma + Fusarium : Sans formule, 10 à 25% de la surface de la boite est recouvert par F. graminearum et présent sur 2 boites sur 3. Le reste des boites est recouvert par Trichoderma sp. ; - Trichoderma + Fusarium + composition de l'exemple 1 : 5% de la surface de la boite est recouvert pat F. gram sur 1 boite sur 3. Le reste est recouvert par Trichoderma sp ; - Trichoderma + Fusarium + composition de l'exemple 2 : pas de développement de F. graminearium sur l'ensemble des boites. 100% de Trichoderma sp. sur l'ensemble de la boite. Les exemples qui suivent illustrent l'invention.

EXEMPLES Exemple 1 : Adjuvant extemporané selon l'invention (deuxième composition) pour augmenter l'efficacité de l'agent de lutte biologique (BCA) Nom commercial / Société Composition % massique Sophoclean (Wheatoleo) Sophorolipides (55% MS) 10% Kelzan Rd (CP Kelko) Gomme de Xanthane 1% APPYCLEAN 6505 Xylosides d'amyle (60% MS) 38.5% (Wheatoleo) Eau QSP 100% Tableau 2 Exemple 2 : Adjuvant extemporané selon l'invention (deuxième composition) pour augmenter l'efficacité des agents de lutte biologique (BCA) Nom commercial / Société Composition % massique Sophoclean® (Wheatoleo) Sophorolipides (55% MS) 20.0% Lécithine de Colza (ADM) Phospholipides 39.1% APPYCLEAN®6505 (Wheatoleo) Xylosides d'amyle (60% MS) 26.6% Solvants QSP 100% Tableau 3 Exemple 3 : Mise en évidence de l'effet des adjuvants selon l'invention sur la croissance de Geotrichum candidum (BCA-1) en milieu liquide.

La croissance du BCA-1 est effectuée dans de l'eau de forage stérile suivant des concentrations appliquées en champ soit 2L/ha de la deuxième composition (adjuvant) et 3.3. 1011 u spores/ha de la première composition (BCA) pulvérisés à 200L/ha de bouillie. Les volumes de solutions préparées sont de 100m1 dans des Erlenmeyers fermés et mis sous agitation à l'aide d'une plaque agitée à 20°C.

BCA-1 = Geotrichum candidum Les observations sont faites au microscope optique avec l'objectif x100 pour le cliché A et l'objectif x400 pour les clichés B et C (figure 1). Le cliché B montre l'effet de la deuxième composition (adjuvant) de l'exemple 1, selon l'invention, sur la croissance du BCA en milieu liquide (à comparer au cliché A du BCA-1 seul dans l'eau). Le cliché C montre l'effet de bénéfique de la deuxième composition (adjuvant) de l'exemple 2, selon l'invention, sur la croissance du BCA-1 en milieu liquide. Exemple 4 : Mise en évidence de l'effet des adjuvants selon l'invention sur la croissance 20 de BCA-2 en milieu liquide. Souche utilisée Le BCA-2 est BINAB® (Trichoderma polysporum (IMI 206039) et Trichoderma harzianum atrovide (IMI 206040)). A partir de la poudre, sont réalisées des boites, comme suit : 25 - 5 à 10 mg de poudre lyophilisée sont ajoutés à de la gélose Potato Dextrose Agar (PDA) ; - Croissance quelques jours sous hotte lumineuse (lumière continue, T°C min = 16°C, T°C max = 24 °C).

Récupération des spores Le protocole de récupération des spores est le suivant : ^ Ajouter 20 ml d'eau de forage stérile (EFS) dans une des boites de Trichoderma sp. - Par aspiration/refoulement avec une pipette stérile de 5m1 d'eau de forage stérile (EFS), décrocher le maximum de spores (une légère agitation manuelle peut être faite en complément) ^ Récupérer les 20m1 dans un flacon de 100 ml stérile ^ Compter le nombre de spores à l'hématimètre de Malassez Nombre de spores récupérées en vue de l'ensemencement : 3.2x107spores/m1 Préparation des Erlenmeyers Des Erlenmeyers sont préparés comme suit : - Mettre 98 ml d'eau de forage dans les erlenmeyers - Stériliser les erlens Mettre lml d'EFS dans les erlens témoins - Le cas échéant, mettre lml de la deuxième composition (adjuvant) selon l'exemple 1 ou 2 - Mettre lml de solution contenant 3.23 x107spores de Trichoderma dans chacun des erlens (première composition (BCA-2)) - Mettre sur plaque agitante à la lumière (photopériode : jour : 6h-22h) jusqu'à J7. Analyses effectuées Mesure du carbone et de l'azote par COT-mètre Appareil utilisé : Analyseur de Carbone Organique Total SHIMADZU modèle TOC-VCPN (Combustion catalytic oxidation/NDIR method, PC-controlled, standard model) adapté à l'analyse du carbone dans les matières en suspension. En parallèle un autre détecteur a été ajouté : le détecteur d'azote TNM-1 qui analyse l'azote en même temps le carbone.

Méthode utilisée : NPOC/TN 5Oppm Gamme : 50 à 1000 ppm de carbone (sans dilution) NPOC (=carbone organique non purgeable) : Ensemble du carbone organique restant en phase aqueuse après purge par un gaz afin d'éliminer le carbone inorganique.

TN (=azote total) : Ensemble de l'azote lié à la matière organique, azote ammoniacal, nitrites et nitrates. Mesure : Mesures effectuées sur le contenu des erlens broyés en fin de manipulation à J7 et sur le filtrat de chaque erlen. La différence entre la valeur dans les échantillons et de leur filtrat nous donne la biomasse réelle. Afin de connaître la part de carbone des formules au départ, des mesures ont également été réalisées sur les formules diluées au 1/100ième.

Résultats a. Observations microscopiques Les observations sont faites au microscope optique avec l'objectif x400 pour les clichés A et B et l'objectif x100 pour le cliché C (figure 2).

Le cliché B montre l'effet de la deuxième composition (adjuvant) de l'exemple 1, selon l'invention, sur la croissance du BCA en milieu liquide (à comparer au cliché A du BCA-1 seul dans l'eau). Le cliché C montre l'effet de bénéfique de la deuxième composition (adjuvant) de l'exemple 2, selon l'invention, sur la croissance du BCA-1 en milieu liquide. b. Mesure du Carbone (= biomasse) et d'azote par COT-mètre Les résultats sont consignés dans le tableau 4 suivant : Trichoderma seul Trichoderma +V1 Trichoderma + V2.3 Biomasse 0 202 785 (=NPOC mg/L) 21 84 88 Ecartype Tableau 4: Biomasse (=NPOC mg/L) de Trichoderma sp. seul au formulé (avec composition de l'exemple 1 ou 2) 7 jours en milieu liquide Exemple 5 : Mise en évidence de l'effet de protection par Trichoderma sp. (Binab ) contre la propagation de Fusarium graminearum (essais sur milieu PDA). Souches utilisées La souche de BCA est BINAB® (Trichoderma polysporum (IMI 206039) et Trichoderma 30 harzianum atrovide (IMI 206040)).

A partir de la poudre, les boites sont réalisées comme décrit dans l'exemple 4. La souche pathogène est Fusarium graminearum 413 fournie par l'IFBM.

Récupération des spores Le protocole de récupération des spores est tel que décrit dans l'exemple 4. Nombre de spores récupérées en vue de l'ensemencement : - 1,2 x108spores/m1 de Trichoderma Binab ; - 2.8 x105spores/m1 de Fusarium graminearum 413. Ensemencement des Erlenmeyers (milieu liquide) Des Erlenmeyers sont préparés comme suit : Mettre 30 ml d'eau de forage dans les erlens Stériliser les erlens Le cas échéant, mettre 0.5 ml de la deuxième composition (adjuvant) selon l'exemple 1 ou 2 Le cas échéant, mettre 2.7 ml de la solution mère de Fusarium Le cas échéant, mettre 0.7 ml de la solution mère de Trichoderma Compléter avec de l'eau de forage stérile tous les erlens qsp 50m1 EFS Ajustement du pH à 5 Mettre sur plaque agitante à la lumière (photopériode : jour : 6h-22h) Ensemencement des boites (milieu solide) Une fois les erlens préparés, 30 µl de chaque erlen sont prélevés et mis au centre d'une boite PDA (Potato Dextrose Agar). Un triplicat est réalisé par modalité. Les boites sont mises à la lumière sous hotte (lumière continue). Résultats Les différentes modalités sont examinées après croissance sur boite PDA pendant 6 jours dépôt 304_, - 3 répétitions par modalité (figure 3).

Exemple 6 : Mise en évidence de l'effet de protection par Geotrichum candidum contre la propagation de Fusarium graminearum (essais sur des plantes en pots). Le type de blé testé est le blé sensas. 30 grains sont semés par pot de 8L et de 25 cm de diamètre (15 grains par sillon). Le terreau est composé de 50%vol de terreau universel et de 50%vol de vermiculite neutre. Les conditions de culture sont une température de 22°C le jour et 17°C la nuit, une humidité de 70%HR, une photopériode de 14h et une intensité lumineuse d'environ 160 i.tmol.m"2.s-1. Les blés sont arrosés 3 fois par semaine suivant les besoins en eau avec environ 400m1 d'eau adoucie par seau. Un apport d'engrais N/P/K : 6/6/6 est réalisé du stade 3-4 feuilles à l'épiaison 1 fois par semaine. L'apport d'engrais total équivaut à 200 unités soit 200 kg d'azote par hectare. Une modalité est constitué de 3 répétitions soit 3 pots. Geotrichum candidum est pulvérisé afin de correspondre à une pulvérisation de 3,3.1011spores/ha. Lorsque Geotrichum candidum est mélangé à des adjuvants, ces derniers sont présents à 0,5% dans la solution. La pulvérisation se fait à l'aide d'un petit pulvérisateur manuel à proximité de l'épi. Cette pulvérisation équivaut à 500L de bouille/ha. L'adjuvant est donc pulvérisé à la concentration de 2,5 litres par hectare. Les graines sont semées au temps to, les épis sont traités par la bouillie contenant Geotrichum candidum avec ou sans adjuvant à To+ 45 jours. L'infection par Fusarium graminearum (GRAM413) débute à To+48 jours. 103 spores par épis sont pulvérisés au moment de la floraison. La salle phytotronique est réglée à 90%HR à partir de l'infection afin de permettre le développement de Fusarium graminearum. Les cinq premiers jours, le blé est brumisé deux fois par jour. La récolte des grains de blé se fait à To + 76 jours. Les épis sont coupés puis mis à séchés à 50°C. Ils sont ensuite décortiqués à la pince afin de ne récupérer que les grains de blé.

Quantification des Moisissures par PCR La PCR en temps réel permet de quantifier un organisme par le nombre de génomes. Elle représente un marqueur du nombre d'unité cellulaire de l'organisme considéré et dans le cas de suivi, peut servir de marqueur de la présence et de la croissance et donc de la propagation des 30 moisissures. L'ADN des moisissures présentes sur grain est extrait en utilisant un kit d'extraction d'ADN et dosé par fluorométrie. La quantification de Fusarium graminearum est réalisée par une réaction PCR avec des couples d'amorces spécifiques qui ont été développés par IFBM et validés selon les critères définies par la norme NF-03-110. La quantification des moisissures est exprimée par nombre de génome de la moisissure pour 1000 génomes de blé. L'analyse PCR permet de quantifier l'abondance de Fusarium graminearum sur les grains de 5 blé, exprimé en nombre de génomes pour 1000 unités génomes haploïde de matrice. Quantification de Déoxynivalénol L'analyse des mycotoxines Trichotécène (DON) dans les céréales est réalisée par extraction avec une mélange acétonitile-eau et quantification par HPLC-MS/MS. L'analyse est réalisé 10 sous système qualité. L'analyse des DON est exprimée en taux de déoxynivalénol en tig par kg de grain. L'ensemble des modalités sont reproduites 3 fois, les résultats expriment la moyenne arithmétique des 3 essais, et l'écart à la moyenne. 15 Résultats (tableau 5) La modalité 1 représente le témoin contaminé par Fusarium graminearum, non traité par une solution de BCA. La modalité 2 représente des plantes contaminées par Fusarium graminearum, traitées par des solutions de BCA dispersé dans l'eau sans ajouts d'adjuvant. 20 La modalité 3 représente des plantes contaminées par Fusarium graminearum, traitées par des solutions de BCA dispersé dans l'eau avec l'ajout de l'adjuvant selon l'exemple 1. Analyse PCR (Génome / 1000 Analyse des Mycotoxines (µg/kg) unités) Moyenne Ecart Moyen Moyenne Ecart Moyen Modalité 2363 1003 4139 2283 1 Modalité 682 512 431 403 2 Modalité 650 98 298 144 3 Tableau 5 Le traitement par Geotrichum candidum permet une réduction de 71,1% de la quantité de génome de F. Graminearum et une réduction de 89.6% du taux de DON. L'ajout de l'adjuvant selon l'invention permet une réduction supplémentaire de 4,7% et de 30,7% respectivement sur le taux de génome et de DON par rapport à l'usage du BCA sans formulant. Exemple 7 : Mise en évidence de l'effet de protection par Geotrichum candidum contre la propagation de Fusarium graminearum (essais sur des plantes en pots). Le blé testé est du blé de printemps (variété Sensas). Une modalité est composée de 3 répétitions soit 3 pots avec 5 pieds de blé par pot. Le substrat de culture est un mélange sol/sable (50/50). Chaque pot contient environ 2,1 kg de substrat. L'apport d'azote est de 180 U/ha fractionné en deux apports (stade 3 feuilles et montaison). Les conditions de culture sont une température de 22°C le jour et 17°C la nuit, une humidité de 70%HR, une photopériode de 14h.

Le traitement anti-fusariose testé a lieu début floraison avec le satellite de pulvérisation qui permet de mieux se rapprocher d'une pulvérisation telle qu'elle est pratiquée en champs (correspondant à 200L d'eau/ha). L'inoculation de la maladie a lieu 3 jours après. Les épis sont recouvert pendant 2 jours à l'aide de petits sachets en plastiques. L'analyse PCR permet de quantifier l'abondance de Fusarium graminearum sur les grains de 20 blé, exprimé en nombre de génomes pour 1000 unités génomes haploïde de matrice. L'ensemble des modalités sont reproduites 3 fois, les résultats expriment la moyenne arithmétique des 3 essais et le groupement selon l'analyse statistique de type ANOVA (tableau 6). 25 La modalité 1 représente des plantes contaminées par Fusarium graminearum, traitées par des solutions de BCA dispersé dans l'eau à la concentration de 3.3 1011 spores revivifiées par hectare sans ajouts d'adjuvant. La modalité 2 représente des plantes contaminées par Fusarium graminearum, traitées par 30 des solutions de BCA dispersé dans l'eau à la concentration de 3.3 1011 spores revivifiées par hectare avec l'ajout de l'adjuvant selon l'exemple 1 à la concentration de 1L/ha. La modalité 3 représente des plantes contaminées par Fusarium graminearum, traitées par des solutions de BCA dispersé dans l'eau à la concentration de 3.3 1011 spores revivifiées par hectare avec l'ajout de l'adjuvant selon l'exemple 2 à la concentration de 1L/ha.

Analyse PCR (Génome / 1000 unités) Moyenne Groupement statistique Modalité 1 4316.67 a Modalité 2 131.3 b Modalité 3 0 b Tableau 6 L'ajout de l'adjuvant de l'exemple 1 selon l'invention permet une réduction supplémentaire de 5 97% du taux de génome par rapport au BCA sans formulant. L'ajout de l'adjuvant de l'exemple 3 selon l'invention permet une protection complète de la plante avec aucun génome du contaminant détecté. Exemple 8 : Mise en évidence de l'effet de protection par Geotrichum candidum contre la 10 propagation de Fusarium graminearum (essais sur des plantes en pots) Le blé testé est du blé de printemps (variété Sensas). Une modalité est composée de 3 répétitions soit 3 pots avec 5 pieds de blé par pot. Le substrat de culture est un mélange sol/sable (50/50). Chaque pot contient environ 2,1 kg de substrat. L'apport d'azote est de 180 U/ha fractionné en deux apports (stade 3 feuilles et montaison). Les conditions de culture sont 15 une température de 22°C le jour et 17°C la nuit, une humidité de 70%HR, une photopériode de 14h. Le traitement anti-fusariose testé a lieu début floraison avec le satellite de pulvérisation qui permet de mieux se rapprocher d'une pulvérisation telle qu'elle est pratiquée en champs (correspondant à 200L d'eau/ha). L'inoculation de la maladie a lieu 3 jours après. 20 L'analyse PCR permet de quantifier l'abondance de Fusarium graminearum sur les grains de blé, exprimé en nombre de génomes pour 1000 unités génomes haploïde de matrice. L'analyse des mycotoxines Trichotécène (DON) est réalisée selon la méthode décrite précédemment et est exprimée en taux de déoxynivalénol en j_tg par kg de grain. L'ensemble des modalités sont reproduites 3 fois, les résultats expriment la moyenne 25 arithmétique des 3 essais et le groupement selon l'analyse statistique de type ANOVA (tableau 7).

La modalité 1 représente des plantes contaminées par Fusarium graminearum, traitées par des solutions de BCA dispersé dans l'eau à la concentration de 3.3 1011 spores revivifiées par hectare sans ajouts d'adjuvant. La modalité 2 représente des plantes contaminées par Fusarium graminearum, traitées par des solutions de BCA dispersé dans l'eau à la concentration de 3.3 1011 spores revivifiées par hectare avec l'ajout de l'adjuvant selon l'exemple 1 à la concentration de 1L/ha. Analyse PCR (Génome / 1000 Analyse des Mycotoxines (µg/kg) unités) Moyenne Groupement statistique Moyenne Groupement statistique Modalité 2485 a 17567 a 1 Modalité 747.8 a 840.5 b 2 Tableau 7 L'ajout de l'adjuvant de l'exemple 1 selon l'invention permet une réduction supplémentaire de 69.9% de la quantité de génome de F. Graminearum et une réduction de 95.2% du taux de DON par rapport au BCA sans formulant. Exemple 9 : Mise en évidence de l'effet de protection par Geotrichum candidum contre la 15 propagation de Fusarium graminearum (essais réalisés en plein champ) Les résultats présentés dans le tableau suivant rend compte d'essais réalisés en France durant l'été 2012. Ce dernier reprend les résultats de 16 essais réalisés dans la Marne, le Somme, le Cher, en Meurthe et Moselle. Le traitement a été réalisé le soir ou la journée si l'humidité > 50% HR. 20 Le BCA testé est le Géotrichum candidum. Il est mis en solution 5 minutes avant le début des pulvérisations. Le suivi de la pluviométrie et de l'hygrométrie a été réalisé jusqu'à la fin de la floraison. La modalité 1 est le témoin non traité. La modalité 2 représente les plantes traitées par Géotrichum candidum à la concentration de 25 3,31011 spores revivifiées par hectare en présente de l'adjuvant de l'exemple 1 à la concentration de 21/Ha.

L'analyse PCR permet de quantifier l'abondance de Fusarium graminearum sur les grains de blé, exprimé en nombre de génomes pour 1000 unités génomes haploïde de matrice (tableau 8).

Analyse PCR (Génome / 1000 unités) Moyenne Ecart à la moyenne Modalité 1 5636 4156 Modalité 2 3062 1769 Tableau 8 Le traitement du blé par Géotricum candidum formulé avec l'adjuavant de l'exemple 1 permet une réduction significative du taux d'infection par F. Graminarum.

Exemple 10 : Mise en évidence de l'effet de protection par Geotrichum candidum contre la propagation de Fusarium graminearum (essais réalisés en plein champ) et de la réduction des intrants conventionnels Les essais se font sur des micro-parcelles expérimentales en champ contenant plusieurs blocs d'environ 25 m2 chacun. Pour chaque pulvérisation, 5 litres de solution sont préparés et pulvérisés à 2001/ha. La modalité 1 représente le témoin non traité. La modalité 2 représente un traitement par un fongicide traditionnel de type TAF (Triazole anti-fusarium), ici le Prosaro (Bayer), constitué par le mélange de prothiconazole à 125 g/1 et de tubuconazole à 125 g/1, à une dose réduite de 0,7 1/ha. La modalité 3 représente un traitement par ledit fongicide traditionnel (TAF) à la pleine dose homologuée, soit 1 1/ha. La modalité 4 représente un traitement par une solution de Géotrichum candidum à la concentration de 3,31011 spores revivifiées par hectare en présente de l'adjuvant de l'exemple 1 à la concentration de 1 1/Ha et du fongicide traditionnel (TAF) à la demi-dose homologuée.

Analyse PCR Modalité 1 (témoin) Modalité 2 (Taf 1/2 dose) Modalité 3 Modalité 4 (Génome / (Taf pleine dose) (Taf 1/2 dose + BCA + adjuvant de l'exemple 1) 1000 unités) Somme des 79 83 18 21 trois blocs Moyenne des 26,3 27,7 6,0 7,0 trois blocs Ecart à la 19,1 4,2 2,7 6,0 moyenne Tableau 9 Les différences entre les modalités 1 et 2 montrent que le fongicide traditionnel utilisé à sa demi-dose homologué n'est pas efficace (tableau 9).

L'analyse statistique par ANOVA (P<0,05) montre qu'il n'y a pas de différence entre la modalité 3 et la modalité 4. L'ajout du BCA et de l'adjuvant de l'exemple 1 permet l'utilisation du fongicide traditionnel à sa demi-dose homologuée (tableau 9). Exemple 11 : Mise en évidence de l'effet de protection par Trichoderma sp. contre la propagation de Septoria tritici (essais sur des plantes en pots). - Semis de blé tendre d'hiver variété BOISSEAU réalisée 7 à 8 mois avant le traitement, au début de l'automne. - Traitement avec les BCA au stade 5 (échelle BBCH : sortie de l'inflorescence ou épiaison) du blé, à JO, - Contamination avec Septoria tritici à J+1, - Indexation de la maladie sur les feuilles F 1 , à J+21 Matériels et conditions de culture : - Variété utilisée : blé tendre d'hiver - variété BOISSEAU Semi : 3 rangées par bac espacées de 15cm, rangées composées de 20 graines soit 60 graines par bacs soit 333 graines /m2. - Terre utilisée : sol crayeux provenance Pomacle (Marne - France) Arrosage avec de l'eau de forage tous les 2 à 3 jours à partir du stade 4 (échelle BBCH) : 5L d'eau par bac soit 27,8mm d'eau/m2/2 à 3 jours. - Apport d'engrais (AlgoFlash lot n° 148133) NPK : 666 (6% d'azote, 6% oxyde de phosphore, 6% oxyde de potassium) et < 0,05% de bore, cuivre, fer, manganèse, molybdène et zinc au mois de mai au stade 4 de l'échelle BBCH (gonflement de l'épi ou de la panicule, montaison) apport toutes les semaines selon les doses préconisées (30 ml d'engrais pour 10L d'eau). Modalités réalisées : couplage BCA (Geotrichum candidum ou Trichoderma sp.) et agent 10 pathogène (Fusarium graminearum). Septoria tritici (3 répétitions) - Septoria tritici formulé avec la composition décrite dans l'exemple 2 (3 répétitions) Trichoderma sp. (Fournisseur Binab) et Septoria tritici (3 répétitions) - Trichoderma sp. (Fournisseur Binab) formulé avec la composition décrite dans 15 l'exemple 2 et Septoria tritici (3 répétitions) Trichoderma sp. est pulvérisé afin de correspondre à une pulvérisation de 3,3.1011 spores/ha. La pulvérisation se fait à l'aide d'un pulvérisateur manuel de 100m1 à proximité (environ 10 cm) du plant. 20 Cette pulvérisation équivaut à 200L de bouillie/ha. La formule est donc pulvérisée à la concentration de 2,5 litres par hectare. La pulvérisation des BCA est effectuée au stade 5 de l'échelle BBCH (sortie de l'inflorescence ou épiaison). L'ensemble des modalités sont reproduites 3 fois, les résultats expriment la moyenne 25 arithmétique des 3 essais. Des feuilles ont été prélevées après le traitement du BCA et après l'inoculation de la maladie. Ces feuilles ont été mises sur milieu PDA afin de vérifier que le BCA était toujours présents. Le BCA est toujours observés après 48h. 30 Conclusion Le tableau 10 ci-après décrit la surface (%) foliaire (F1) du blé tendre d'hiver variété BOISSEAU contaminé par Septoria tritici et préalablement traité avec Trichoderma polysporum et Trichoderma harzianum ou non.

Modalité Surface (%) foliaire (F1) Ecart type Septoria tritici 92,06 4,38 (Maladie seul : Témoin négatif) Trichoderma sp. et Septoria tritici 42,52 3,24 (BCA + maladie) Trichoderma sp.+ composition selon 9,52 2,25 l'exemple 2 et Septoria tritici (BCA formulé + maladie) Tableau 10 Les résultats présentés dans le tableau 10 montrent : qu'avec un traitement préalable de Trichoderma, les feuilles des blés sont significativement moins contaminées de 50% par rapport au témoin contaminé sans traitement préalable ; qu'avec un traitement préalable de Trichoderma formulé avec la composition décrite dans l'exemple 2, les feuilles des blés sont significativement moins contaminées de 80% par rapport au témoin contaminé sans traitement préalable et de 33% par rapport à un traitement préalable non formulé.

Claims

REVENDICATIONS1. Produit de combinaison destiné à une utilisation simultanée, contenant a) une première composition comprenant un ou plusieurs agents de lutte biologique, et b) une deuxième composition comprenant un ou plusieurs sophorolipides, ladite deuxième composition comprenant moins d'environ 27% en masse du ou desdits sophorolipides, en vue de la formation d'un mélange contenant lesdites première et deuxième compositions, ledit mélange étant dépourvu d'eau ou comprenant moins d'environ 6% en masse du ou desdits sophorolipides, le ou lesdits sophorolipides étant, dans ledit mélange, non toxiques pour le ou lesdits agents de lutte biologique.
2. Produit de combinaison selon la revendication 1, constitué par un mélange comprenant le ou lesdits agents de lutte biologique et le ou lesdits sophorolipides.
3. Produit de combinaison selon l'une quelconque des revendications 1 à 2, ledit produit de combinaison, en particulier ladite deuxième composition, comprenant en outre : - des lécithines, en particulier des lécithines choisies parmi le groupe constitué : - des lécithines de soja ou de colza, plus particulièrement des lécithines de soja ou de colza ayant des HLB comprises de 2 à 9, de préférence de 3 à 6, - des lécithines purifiées, notamment sous la forme de phosphatidylcholines, phosphatidyléthanolamines et phosphatidylinositols, seuls ou en mélanges, et - des lécithines modifiées chimiquement ou par voie enzymatique, notamment les lécithines hydrolysées, hydroxylées, oxydées, acétylées, propionylées et succinylées, ou - des phospholipides issus d'ceufs, d'algues ou de plantes oléo-protéagineuses telles que le soja, le tournesol, le colza, le coton.
4. Produit de combinaison selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans lequel ledit agent de lutte biologique est choisi parmi les champignons et les bactéries, en particulier dans le groupe constitué des champignons suivants : - Geotrichum sp., en particulier Geotrichum candidum, plus particulièrement les souches déposées à la CNCM sous les numéros 1.1474 et 1.1475 le 06 septembre 1994,- Trichoderma sp., en particulier Trichoderma harzianum, plus particulièrement Trichoderma harzianum (ATCC 20476), Trichoderma polysporum, plus particulièrement Trichoderma polysporum (ATCC 20475), Trichoderma koningii et Trichoderma asperellum, - Pseudomonas fluorescens, - Bacillus subtilis, en particulier Bacillus subtilis AS 43.3, Bacillus subtilis AS 43.4 et Bacillus subtilis OH 131.14 - Cryptococcus sp., - Bacillus thuringiensis, - Rhodotorula glutinis, et des bactéries lactiques.
5. Produit de combinaison selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans lequel ledit sophorolipide est de l'une des structures (1) et (2) suivantes : OR3 R2 R1 0 (1) R2' O-CH RI CORS (2) dans lesquelles : ® RI et R1' représentent indépendamment l'un de l'autre : 01-1 o une chaine hydrocarbonée saturée linéaire ou ramifiée comprenant de 1 à 21 atomes de carbone, éventuellement substitué par un ou plusieurs groupements hydroxyles, o une chaine hydrocarbonée insaturée, notamment mono insaturée ou polyinsaturée, linéaire ou ramifié, comprenant de 2 à 21 atomes de carbone, éventuellement substitué par un ou plusieurs groupements hydroxyles; ® R2 et R2' représentent indépendamment l'un de l'autre : o H, o une chaine hydrocarbonée saturée linéaire ou ramifié comprenant de 1 à 9 atomes de carbone, éventuellement substitué par un ou plusieurs groupements hydroxyles, o une chaine hydrocarbonée insaturée, notamment mono insaturée ou polyinsaturée, linéaire ou ramifié, comprenant de 2 à 9 atomes de carbone, éventuellement substitué par un ou plusieurs groupements hydroxyles; e R3, Rd, R3 et Rd' représentent indépendamment les uns des autres un atome d'hydrogène ou un groupement acétyle ; e R5 est un groupement choisi parmi : o OCH3, o 0(CH2),,,CH3 avec m compris de 1 à 11, o OH, o 0-M+, où M+ est un cation métallique ou un cation organique, notamment un ammonium, en particulier le diméthylammonium, le triméthylammonium, l'isopropylammonium, le mono-éthanol-ammonium, le di-éthanol-ammonium ou le tri-éthanol-ammonium, ou un phosphonium, o N(CH2),,,OH avec m compris de 1 à 11, o N(CH2),,SH avec m compris de 1 à 11, o N(CH2)mNRaRb avec m compris de 1 à 11, Ra et Rb représentant indépendamment l'un de l'autre H ou une chaine hydrocarbonée saturée linéaire ou ramifié comprenant de 1 à 9 atomes de carbone, o N(CH2)mN+RCRdRe avec m compris de 1 à 11, Rc, Rd et Re représentant indépendamment les uns des autres une chaine hydrocarbonée saturée linéaire ou ramifié comprenant de 1 à 9 atomes de carbone, o N(CH2)mNH(CH2)nNH2, m et n étant indépendamment l'un de l'autre compris de 1 à 11,o N(CH2),'NH(CH2)'NH(CH2)pNH2, m, n et p étant indépendamment les uns des autres compris de 1 à 11, o N(CH2)mZ avec m compris de 1 à 11, Z représentant un cycle choisi parmi les groupes suivants : ^ les cycles aromatiques, en particulier le phényle, le phénol et les phényl diols, ® les hétérocycles aromatiques, en particulier l'imidazole et l'indole, ^ les hétérocycles saturés, en particulier la pyrrolidine.
6. Produit de combinaison selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, dans laquelle ladite première composition est sous forme sèche ou sous forme liquide, en particulier, ladite première composition étant sous forme sèche et comprenant en outre un support, ledit support étant notamment choisi dans le groupe constitué des humus, des argiles, des talcs, des silices naturelles, de la terre de diatomée, des kaolins, des cyclodextrines, des amidons, des lactoses, des cires, des résines synthétiques ou naturelles, des polymères synthétiques ou d'origine naturelle, des oxydes de titanes, des carbonates, des sulfates de sodium, des silicates de sodium et des zéolithes.
7. Produit de combinaison selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, dans lequel le rapport de la masse des sophorolipides sur la quantité d'agents de lutte biologique est compris d'environ 10-14 à environ 10-2, notamment d'environ 10-10 à environ 3.10-5 mg de sophorolipides par spore d'agents de lutte biologique.
8. Produit de combinaison selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, dans lequel ladite deuxième composition comprend en masse : - de 0,1 à 27%, en particulier de 0,5 à 27% de sophorolipides ; - de 0 à 73% de lécithines ; - de 0 à 10% de polymère ; - de 0 à 10% de résine ; - de 0 à 50% d'hydrotropes ; - de 0 à 73% de solvant ; - de 0 à 73% d'eau ; - de 0 à 20% de tensioactifs ; - de 0 à 10% de modificateurs de pH ;- de 0 à 1% d'agents de conservation, en particulier, dans lequel ladite deuxième composition comprend en masse : - de 5 à 27% de sophorolipides ; - de 0 à 50% de lécithines, en particulier de lécithine de colza ; - de 0,1 à 10% de polymère ou résine, en particulier des polyglycérols, des dérivés de polyglycérols ou de la gomme de xanthane ; - de 5 à 50% d'hydrotropes, en particulier de xylosides d'amyle ; - de 0 à 10% de solvant, en particulier un solvant choisi dans le groupe constitué des esters d'acides lactiques, et des alcools comprenant de 2 à 8 atomes de carbone ; - de 0 à 0,1% de conservateur, en particulier le bronopol ; - eau qsp 100%.
9. Produit de combinaison selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, constitué par : - un mélange aqueux comprenant le ou lesdits agents de lutte biologique et le ou lesdits sophorolipides, ledit mélange comprenant: - de 2 mg à 250g/L d'agent de lutte biologique sous forme sèche, éventuellement sur support, soit d'environ 2.104 à environ 2,5.1012 spores par litre lorsque lesdits agents de lutte 20 biologique sont des champignons ; - de 0,05 mg à 60 g/L de sophorolipides ; - de 0 à 120g/L de lécithines, en particulier de 0,1mg à 120g/L de lécithines; - de 0 à 22g/L de polymère; - de 0 à 22g/L de résine; 25 - de 0 à 120g/L d'hydrotropes ; - de 0 à 100g/L de solvant ; - eau qsp 1 litre ; OU 30 4.- un mélange dépourvu d'eau comprenant le ou lesdits agents de lutte biologique et le ou lesdits sophorolipides, ledit mélange comprenant:- de 2 mg à 250g/kg d'agent de lutte biologique sous forme sèche, éventuellement sur support, soit d'environ 2.104 à environ 2,5.1012 spores par kg lorsque lesdits agents de lutte biologique sont des champignons ; - de 0,05 mg à 60 g/kg de sophorolipides ; - de 0 à 120g/kg de lécithines, en particulier de 0,1mg à 120g/L de lécithines; - de 0 à 22g/kg de polymère; - de 0 à 22g/kg de résine; - de 0 à 120g/kg d'hydrotropes ; - support inerte qsp 1 kg, ledit support inerte étant choisi parmi les humus, les argiles, les silices naturelles, les terres de diatomées, les kaolins, les cylcodextrines, les amidons, les lactoses, les cires, les résines synthétiques ou naturelles, et les talcs.
10. Plante dont tout ou partie de la surface est recouverte par un produit de combinaison selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, à raison de 1 à 100 lig dudit produit de combinaison par cm2 de surface recouverte.
11. Procédé de préparation d'un produit de combinaison selon l'une quelconque des revendications 2 à 9, ledit produit de combinaison étant constitué par un mélange comprenant le ou lesdits agents de lutte biologique et le ou lesdits sophorolipides, ledit mélange étant dépourvu d'eau ou comprenant moins d'environ 6% en masse du ou desdits sophorolipides, ledit procédé comprenant une étape de mélange entre une première composition comprenant un ou plusieurs agents de lutte biologique et une deuxième composition comprenant un ou plusieurs sophorolipides, ladite deuxième composition comprenant moins d'environ 27% en masse du ou desdits sophorolipides, éventuellement de l'eau, et éventuellement un ou plusieurs adjuvants choisis parmi les lécithines, les polymères, les résines, les solvants, des hydrotropes, les modificateurs de pH, les agents de conservation et les engrais, pour obtenir ledit mélange.
12. Procédé de préparation selon la revendication 11, dans lequel lesdites première et deuxième compositions, et de l'eau sont mélangés au cours de ladite étape de mélange pour obtenir ledit mélange.
13. Utilisation d'un produit de combinaison selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, pour le traitement des plantes.
14. Utilisation selon la revendication 13, dans laquelle la ou lesdites pulvérisations dudit mélange sont précédées et/ ou suivies d'une ou plusieurs applications, en particulier par pulvérisation, d'un fongicide, ledit fongicide étant en particulier choisi dans le groupe constitué : - des triazoles, en particulier bitertanol, cyproconazole, dichlobutrazole, diniconazole, étaconazole, flusilazol, flutriafol, penconazol,propiconazole, triadimefon, triadimenol et triflumazole ; - des imidazoles, en particulier fénapanil, imazalil, prochloraze et triflumizole ; - du chlorothalonil ; - les inhibiteurs de la succinate déshydrogénase (SDHI), en particulier fluxapyroxad, isopyrazam et bixafen ; ainsi que de leurs mélanges.
15. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 13 à 14, pour le traitement de plantes atteintes d'une maladie appartenant au groupe constitué : - de la fusariose, ledit agent de lutte biologique étant en particulier Geotrichum sp., Trichoderma sp., ou Bacillus - de la septoriose, ledit agent de lutte biologique étant en particulier Geotrichum sp, - du mildiou, ledit agent de lutte biologique étant en particulier Geotrichum sp., Trichoderma sp., ou Bacillus subtilis, - de la pourriture grise, ledit agent de lutte biologique étant en particulier Geotrichum sp., Trichoderma sp., ou Bacillus subtilis.