FR2994847A1 - Utilisation de venins d'araignee pour le blanchiment ou la depigmentation de la peau et compositions comprenant des molecules de venins d'araignee ou des analogues synthetiques de celles ci - Google Patents

Abstract

La présente invention se rapporte à l'utilisation de venins d'araignées, molécules ou analogues synthétique dérivés de ceux-ci pour blanchir la peau. L'invention se rapporte également aux compositions comprenant un venin d'araignée, des molécules ou analogues synthétiques dérivés de ceux-ci pour blanchir/ dépigmenter la peau. L'invention, finalement, se rapporte à une méthode non-thérapeutique pour blanchir la peau humaine comprenant une application topique d'une quantité efficace sur la dite peau humaine de la composition de l'invention.

Description

UTILISATION DE VENINS D'ARAIGNEES POUR BLANCHIR/DEPIGMENTER LA PEAU ET COMPOSITION COMPRENANT DES MOLECULES DE VENINS D'ARAIGNEE OU LEURS ANALOGUES SYNTHETIQUES CHAMP DE L'INVENTION La présente invention se rapporte à l'utilisation de venins d'araignée pour blanchir/dépigmenter la peau ainsi qu'aux compositions comprenant des molécules issues de venins d'araignée ou des analogues synthétiques. CONTEXTE DE L'INVENTION La mélanogénèse est le terme scientifique faisant référence à la pigmentation cutanée.

Ce processus est nécessaire en tant que mécanisme de protection à l'encontre des rayonnements UV, une dérégulation de ce mécanisme pouvant conduire à une accumulation anormale de mélanine appelée hyperpigmentation, incluant les mélasmas ou le lentigo sénile. . L'évolution de la voie de la mélanogénèse prend place dans l'épiderme, en particulier dans des cellules dendritiques interagissant avec les kératinocytes : les mélanocytes. Ces dernières contiennent des organelles spécifiques appelées mélanosomes : site de synthèse de différents pigments (ou mélanines), à l'origine de notre couleur de peau spécifique appelée phototype. Dans la population noire, l'hyperpigmentation se visualise par une pigmentation de la peau inégale et tachetée. Celle-ci peut résulter de l'activation du système immunitaire en réponse à une inflammation, à une infection et/ou à la cicatrisation mais aussi d'une utilisation quotidienne de produits topiques contenant des substances blanchissantes, désormais bannies des produits cosmétiques, comme l'hydroquinone et/ou les corticostéroïdes. Afin de réduire ces dermatoses, comprendre les mécanismes de mélanogenèse est essentiel. Ainsi, il serait plus facile de visualiser où l'inhibiteur potentiel agira afin d'arrêter et/ou réduire la production de mélanine.

La voie de la mélanogenèse est un processus complexe qui permet la production de deux pigments de la peau différents : les eumélanines bruns-noires et les phéomélanines jaunes à rouges. La tyrosinase est l'enzyme clef requise pour la production de mélanine. Sa fonction première est l'hydroxylation de la tyrosine en dihydroxyphenylalanine (DOPA), l'étape limitante de ce processus. La tyrosinase permet l'oxydation de la DOPA en DOPAquinone. Ensuite, deux voies peuvent être choisies. En l'absence de composés thiols (cystéine) (dans la population noire), la DOPAquinone est spontanément oxydée en dopachrome, un produit intermédiaire rouge. Ce dernier peut se cycliser spontanément pour donner du 5,6-dihydroxyindole (DHI), une molécule insoluble noire, ou bien être converti en acide 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylique (DHICA) en présence d'une seconde enzyme : la « Tyrosinase-Related-Protein » (TRP-2). Ce second intermédiaire doit être en présence de l' activité DHICA oxydase pour être converti en mélanines-DHICA. Cette activité est portée par la « Tyrosinase-Related-Protein 1 » (TRP-1). L'utilisation de produits cosmétiques blanchissant est une pratique sociale depuis environ 30 ans dans la population féminine noire. Aujourd'hui, ce concept s'étend aux hommes dans certains pays d'Afrique centrale. Actuellement, 60% des femmes noires africaines admettent utiliser des produits éclaircissant la peau pour obtenir un teint plus claire et plus uniforme. Cette pratique, initiée par les médias, peut non seulement causer des complications dermatologiques significatives mais aussi des complications systémiques à long terme. Prêt de 70% des utilisateurs ont des problèmes de peau tels que l'acné chéloïdienne, des désordres trophiques, de l'hyperpigmentation, etc. Ces complications supplémentaires, toutes dermatologiques dans un premier temps, viennent del' activité toxique des composés présents dans les produits éclaircissants tels que l'hydroquinone ou des dérivés mercuriques. Actuellement, en France et en Afrique, les substances les plus actives utilisées sont l'hydroquinone, souvent à de fortes concentrations supérieure à 4% ou des corticostéroïdes avec de fortes activités, comme le propionate de clobétasol à 0,05%, qui est l'un des corticostéroïdes topiques les plus puissants. Ces produits sont utilisés sous forme de crèmes (hydroquinone ou stéroïdes), de gels (corticostéroïdes) ou de lait (hydroquinone). La quantité de substance active est souvent indiquée mais peut être imprécise. L'utilisation de dérivés mercuriques, répandus auparavant semble être plus limitée aujourd'hui. Ils peuvent être utilisés sous la forme de savons appelés « antiseptique ». Une étude descriptive, prospective a été réalisée sur une période de 6 mois au Sénégal incluant 86 patientes femmes avec un âge moyen de 29-34 ans (allant de 16 à 49 ans). La répartition par produits éclaircissant la peau montre que les corticostéroïdes topiques sont les plus fréquemment utilisés (78%), suivis par l'hydroquinone (56%), les produits basés sur des extraits végétaux (31,7%), les produits caustiques (8,5%) et finalement les produits de composition inconnue (41,4%). Deux composants ou plus étant fréquemment associés (86,5%).

Parmi les 19 types de complications listées, la dyschromie incluant l'hyperpigmentation des articulations, est clairement la plus répandue. Elle reste un stigmate significatif associé à une dépigmentation artificielle avec une sensibilité de 85,4%. Le Striae atrophicae (72%) et l'atrophie cutanée sont également très communs, attestant d'une très fréquente utilisation de corticostéroïdes.

Par ailleurs, depuis plusieurs années, des preuves démontrant qu'il y a des liens entre la production des espèces réactives de l'oxygène (ERO) et la surproduction de mélanine ont été très bien décrites dans la littérature. En effet, la stimulation UV induit une production de mélanine qui provoquera à son tour la libération d'ERO ou d'H202 dans la peau conduisant au vieillissement de la peau. Certains composés de type flavonoïdes sont également connus pour leurs propriétés capables à la fois d'inhiber les productions de mélanine et des ERO (Pour revue : GILLBRO & OLSSON, Int. J. Cosmet. Sci., vol 33(3) :210-21, 2011). Ainsi, l'identification d'inhibiteurs de la tyrosinase ou de TRP-1 peut présenter un intérêt pour le traitement antivieillissement de la peau. Ainsi, il subsiste un besoin dans l'art des substances et compositions cosmétiques capables de réguler la voie de la mélanogénèse sans effets secondaires pour les peaux noires et métissées (phototypes IV -VI).

RESUME DE L'INVENTION Les inventeurs se sont concentrés sur la recherche de nouveaux inhibiteurs de la tyrosinase pour stabiliser l'activité DOPA oxydase de la tyrosinase et l'activité DHICA oxydase de TRP-1. Ils ont étonnamment trouvés que certains venins, particulièrement des venins d'araignées, contiennent cette activité la DOPA-oxydase inhibitrice et une activité DHICA- oxydase inhibitrice. De plus, les inventeurs ont isolé à partir d'un venin d'araignée une molécule ayant à la fois une activité DOPA oxydase inhibitrice et une activité DHICA-oxydase inhibitrice. Actuellement, les activités de ces venins d'araignées n'ont été ni décrites ni suggérées dans l'art antérieur.

Tout au plus, des venins d'abeilles ont été décrits dans la demande de brevet KR 2010- 2264 comme agent cosmétique présentant une activité éclaircissante sur la peau. Un premier objet de l'invention se rapporte à une composition topique comprenant des venins d'araignées, des molécules ou des analogues synthétiques dérivés de ceux-ci. Un autre objet de l'invention se rapporte à l'utilisation de venins d'araignées, de molécules ou d'analogues synthétiques dérivés de ceux-ci comme agent cosmétique pour le blanchiment/dépigmentation de la peau. Un autre objet de l'invention se rapporte à une composition comprenant des venins d'araignées, des molécules ou analogues synthétiques dérivés de ceux-ci comme défini dans l'invention pour traiter et/ou prévenir l'hyperpigmentation telle quelle le mélasma, le chloasma, le lentigo, le vitiligo, l' hyperpigmentation post-inflammatoire due à une abrasion, une brulure, une cicatrice, une dermatose, une allergie de contact, un naevi, une hyperpigmentation avec déterminisme génétique, une hyperpigmentation d'origine métabolique ou médicamenteuse, les mélanomes ou tout autres lésions hyperpigmentantes. Enfin, l'invention se rapporte à une méthode non-thérapeutique pour le blanchir/dépigmenter la peau humaine comprenant une étape d'application topique d'une quantité efficace sur la dite peau humaine de venins d'araignées, de molécules ou analogues synthétiques dérivés de ceux-ci comme défini dans l'invention.

BRIEVE DESCRIPTION DES FIGURES La figure 1 montre l'absorbance et donc l'activité inhibitrice obtenue avec 68 venins extraits de différents animaux (scorpions, araignées, serpents).

La figure 2 montre le criblage de 16 venins d'araignées différents. La figure 3 montre les effets dose-réponse de 5 venins d'araignées actifs. La figure 4 montre le chromatogramme analytique obtenu par HPLC C18 en phase inversée du venin filtré Argiope Lobata. La figure 5 montre l'absorbance et donc l'activité inhibitrice de différentes fractions équivalentes d'Argiope Lobata. La figure 6 montre l'absorbance et donc l'activité inhibitrice de différents pics d'HPLC d'Argiope Lobata. La figure 7 montre la séparation du composé Argiotoxine contenu dans le venin Argiope Lobata avec son chromatogramme HLPC associé.

La figure 8 montre le chromatogramme de l'Argiotoxine purifiée avec le spectre de masse ESI de l'ion moléculaire [M+ H+] de l'Argiotoxine identifiée. La figure 9 montre l'effet dose-réponse du venin d'Argiope Lobata sur l'activité DOPA oxydase. La figure 10 montre l'activité inhibitrice de l'Argiotoxine sur l'activité DOPA oxydase. La figure 11 montre le mécanisme d'inhibition de l'Argiotoxine sur l'activité DOPA oxydase grâce à la représentation Lineweaver-Burk. La figure 12 montre le pourcentage d'inhibition de l'activité DOPA oxydase dépendante de la concentration de 2,4-DHPAA. La figure 13 montre l'absorbance et donc l'activité inhibitrice de l'Argiotoxine sur l'activité DHICA oxydase.

La Figure 14 montre l'activité inhibitrice de l'Argiotoxine sur la mélanogénèse dans un modèle cellulaire. La Figure 15 compare la puissance du composé 2,4-DHPAA et de l'Acide Kojique sur le test cellulaire de mélanogénèse.

La Figure 16 montre l'effet régulateur de l'Argiotoxine comparé à l'Acide Kojique à la fois sur l'expression de la tyrosinase et de TRP1. DESCRIPTION DETAILLE DE L'INVENTION Un premier objet de l'invention se rapporte à une composition topique comprenant des venins d'araignées, des molécules ou des analogues synthétiques dérivés de ceux-ci. Dans le présent document, le terme « composition topique » fait référence à une composition qui est appliquée extérieurement sur n'importe quelle partie du corps sauf les membranes muqueuses telles que les yeux, la bouche, etc. La composition topique peut, ainsi, être appliquée à n'importe quelle partie du corps sauf les membranes muqueuses telles que les yeL,x, la bouche, etc. Cependant, la composition topique de l'invention peut être également incorporée dans des éponges, des écouvillons, des tampons et ou les lingettes, qui sont utilisés pour appliquer la composition topique sur n'importe quelle partie du corps sauf les membranes muqueuses telles que les yeux, la bouche, etc. Dans le présent document, le terme « venin d'araignée » fait référence aux molécules produites par les araignées et injectées à leurs victimes par le biais d'une morsure, piqûre ou tout autre corps tranchant afin de les tuer ou de les paralyser. Ces molécules de venins comprennent mais ne sont pas limitées aux neurotoxines, cytolysines et hémolysines. Dans le présent document, le terme « molécule » fait référence à un composé purifié d'un venin d'araignée (par exemple par HPLC) ou à un composé présent dans un extrait de venin 25 d'araignée. Le terme « extrait » comme utilisé dans le présent document fait référence à une substance extraite d'un produit naturel, indépendamment de sa méthode d'extraction ou de la composition des ingrédients. Par exemple, cela inclue ceux obtenus par extraction d'ingrédients solubles à partir d'un produit naturel en utilisant l'eau ou un solvant organique, ou ceux obtenus par l'extraction d'ingrédients spécifiques uniquement, tels que l'huile, à partir d'un produit naturel.

Dans le présent document, le terme « analogue synthétique » fait référence à tout composé chimique ou biologique dérivé d'une molécule active de venin. Dans le présent document, le terme « analogue » fait référence à un composé chimique qui est de structure similaire à un autre mais qui diffère légèrement dans sa composition. Ainsi, un analogue est un composé qui est similaire ou comparable en fonction et d'apparence au composé de référence. Un autre objet de la présente invention fait référence à l'utilisation de venins d'araignée, molécules ou analogues synthétiques dérivés comme agent cosmétique pour blanchir/dépigmenter. Dans le présent document, le terme « agent de blanchiment de la peau » fait référence à touât composé ou substance qui a l'effet d'altérer le pigment de la peau tant que l'agent possède une activité anti-tyrosinase et/ou une activité anti-mélanogénique. Dans le présent document, les termes « dépigmentant » ou « dépigmentation » font référence à la réduction de la pigmentation de la peau qui existe déjà et/ou à la prévention de toute pigmentation additionnelle supérieure à la pigmentation naturelle. Par exemple, la dépigmentation est obtenue en réduisant la formation ou le niveau de formation de mélanine. De manière privilégiée, les venins d'araignée sont choisis parmi les venins appartenant aux genres Lycosa, Argiope et Araneus et préférentiellement Argiope ou Araneus. D'après « The World Spider Catalog 12.5 », le genre Argiope consiste en les espèces suivantes : Argiope acuminata, Argiope aemula, Argiope aetherea, Argiope aetheroides, Argiope ahngeri, Argiope amoena, Argiope anasuja, Argiope anomalopalpis, Argiope appensa, Argiope argentata, Argiope aurantia, Argiope aurocincta, Argiope australis, Argiope blanda, Argiope boesenbergi, Argiope bougainvilla, Argiope bruennichi, Argiope brunnescantia, Argiope buehleri, Argiope bullocki, Argiope caesarea, Argiope caledonia, Argiope cameloides, Argiope catenulata, Argiope chloreis, Argiope comorica, Argiope coquereli, Argiope dan g, Argiope dietrichae, Argiope doboensis, Argiope ericae, Argiope flavipalpis, Argiope florida, Argiope halmaherensi,s Argiope intricata, Argiope jinghongensis, Argiope katherina, Argiope keyserlingi, Argiope kochi, Argiope legionis, Argiope levii, Argiope lobata, Argiope luzona, Argiope macrochoera, Argiope madang, Argiope magnifica, Argiope maja, Argiope mangal, Argiope manila, Argiope mascordi, Argiope minuta, Argiope modesta, Argiope niasensis, Argiope ocula, Argiope ocyaloides, Argiope pentagona, Argiope perforata, Argiope picta, Argiope ponape, Argiope possoica, Argiope probata, Argiope protensa, Argiope pulchella, Argiope pulchelloides, Argiope radon, Argiope ranomafanensis, Argiope rein wardti, Argiope sapoa, Argiope savignyi, Argiope sector, Argiope takum, Argiope tapinolobata, Argiope taprobanica, Argiope thai, Argiope trifasciata, Argiope truk, Argiope versicolor, Argiope vietnamensis and Argiope furva. D'après « The World Spider Catalog 13.0 », le genre Araneus consiste en les espèces suivantes: Ardneus aballensis, Araneus abeicus, Araneus abigeatus, Araneus acachmenus, Araneus acolla, Araneus acrocephalus, Araneus acronotus, Araneus acropygus, Araneus acuminatus, Araneus acusisetus, Araneus adiantiformis, Araneus adjuntaensis, Araneus aethiopicus, Araneus aethio pissa, Araneus affinis, Araneus agastus, Araneus akakensis, Araneus aksuensis, Araneus albabdominalis, Araneus albiaculeis, Araneus albidus, Araneus albilunatus, Araneus albomaculatus, Araneus alboquadratus, Araneus albotriangulus, Araneus alboven tris, Araneus alhue, Araneus allani, Araneus alsine, Araneus altitudinum, Araneus amabilis, Araneus amblycyphus, Araneus amurius, Araneus amygdalaceus, Araneus ana, Araneus anantnagensis, Araneus anaspastus, Araneus anatipes, Araneus ancurus, Araneus andrewsi, Araneus anguinifer, Araneus angulatus, Araneus anjonensis, Araneus annuliger, Araneus annulipes, Araneus apache, Araneus apiculatus, Araneus apobleptus, Araneus appendiculatus, Araneus apricus, Araneus ara qua, Araneus Gratis, Araneus arenaceus, Araneus arfakianus, Araneus arganicola, Araneus argentarius, Araneus arizonensis, Araneus asiaticus, Araneus aube rtorum, Araneus aurantillemuris, Araneus auriculatus, Araneus axacus, Araneus badiofoliatus, Araneus badongensis, Araneus bagamoyensis, Araneus baicalicus, Araneus balanus, Araneus bandelieri, Araneus bantaengi, Araneus bargusinus, Araneus basalteus, Araneus bastarensis, Araneus baul, Araneus beebei, Araneus beijiangensis ,Araneus biapicatifer, Araneus bicavus, Araneus bicentenarius, Araneus bigibbosus, Araneus bihamulus, Araneus bilunifer, Araneus bimaculicollis, Araneus bimini, Araneus biprominens, Araneus bipunctatus, Araneus bispinosus, Araneus bivittatus, Araneus blaisei, Araneus blochmanni, Araneus blumenau, Araneus boerneri, Araneus boesenbergi, Araneus bogotensis, Araneus boneti, Araneus bonsallae, Araneus borealis, Araneus boreus, Araneus bosmani, Araneus bradleyi, Araneus braueri, Araneus brisbanae, Araneus bryantae, Araneus bufo, Araneus caballo, Araneus calusa, Araneus camilla, Araneus canacus, Araneus canalae, Araneus canestrinii, Araneus caplandensis ,Araneus carabellus, Araneus carchi, Araneus cardioceros, Araneus carimagua, Araneus carnifex, Araneus carroll, Araneus castilho, Araneus catillatus, Araneus catospilotus, Araneus caudifer, Araneus cavaticus, Araneus celebensis, Araneus cercidius, Araneus cereolus, Araneus chiapas, Araneus chiaramontei, Araneus chin gaza, Araneus chunhuaia, Araneus chunlin, Araneus cingulatus, Araneus circe, Araneus circellus, Araneus circulissparsus, Araneus circumbasilaris, Araneus coccinella, Araneus cochise, Araneus cohnae, Araneus colima, Araneus colubrinus, Araneus compsus, Araneus comptus, Araneus concepcion, Araneus concinnus, Araneus concoloratus, Araneus corbita, Araneus corporosus, Araneus corticaloides, Araneus corticarius, Araneus crinitus, Araneus cris pulus, Araneus cristobal, Araneus cuiaba, Araneus cungei, Araneus cyclops, Araneus cyphoxis, Araneus cyrtarachnoides, Araneus daozhenensis, Araneus dayongensis, Araneus decaisnei, Araneus decentellus, Araneus decolor, Araneus decoratus, Araneus demoniacus, Araneus depressatulus, Araneus desierto, Araneus detrimentosus, Araneus diabrosis, Araneus diadematoides, Araneus diadematus, Araneus dianiphus, Araneus diffinis, Araneus dimidiatus, Araneus diversicolor, Araneus doenitzellus, Araneus dofleini, Araneus dospinolon gus, Araneus dreisbachi, Araneus drygalskii, Araneus ealensis, Araneus eburneiventris, Araneus eburnus, Araneus ejusmodi, Araneus elatatus, Araneus elizabethae, Araneus ellipticus, Araneus elongatus, Araneus emmae, Araneus enucleatus, Araneus enyoides, Araneus excavatus, Araneus expletus, Araneus exsertus, Araneus falcatus, Araneus fastidiosus, Araneus favorabilis, Araneus faxoni, Araneus fengshanensis, Araneus ferganicus, Araneus ferrugineus, Araneus fictus, Araneus finneganae, Araneus fishoekensis, Araneus fistulosus, Araneus flagelliformis, Araneus flavistemis, Araneus flavopunctatus, Araneus flavosellatus, Araneus flavosignatus, Araneus flavus, Araneus floriatus, Araneus formosellus, Araneus frio, Araneus fronki, Araneus frosti, Araneus fulvellus, Araneus fuscinotus, Araneus gadus, Araneus galero, Araneus gazerti, Araneus geminatus, Araneus gemma, Araneus gemmoides, Araneus gerais, Araneus gestrellus, Araneus gestroi, Araneus gibber, Araneus ginninderranus, Araneus goniaeoides, Araneus goniaeus, Araneus graemii, Araneus granadensis, Araneus granti, Araneus gratiolus, Araneus groenlandicola, Araneus grossus, Araneus guandishanensis, Araneus guatemus, Araneus guerrerensis, Araneus guessfeldi, Araneus gundlachi, Araneus gurdus, Araneus guttatus, Araneus guttulatus, Araneus habilis, Araneus haematomerus, Araneus hamiltoni, Araneus hampei, Araneus haploscapellus, Araneus haruspex, Araneus herbeus, Araneus hierographicus, Araneus himalayanus, Araneus hirsti, Araneus hirsutulus, Araneus hispaniola, Araneus holzapfelae, Araneus horizonte, Araneus hortensis, Araneus hoshi, Araneus hotteiensis, Araneus huahun, Araneus hui, Araneus huixtla, Araneus humilis, Araneus idoneus, Araneus iguacu, Araneus illaudatus, Araneus indistinctus, Araneus inquietus, Araneus interjectus, Araneus inustus, Araneus iriomotensis, Araneus isabella, Araneus ishisawai, Araneus iviei, Araneus jalimovi, Araneus jalisco, Araneus jamundi, Araneus juniperi, Araneus kalaharensis, Araneus kapiolaniae, Araneus karissimbicus, Araneus kerr, Araneus kirgisikus, Araneus kiwuanus, Araneus klaptoczi, Araneus koepckeorum, Araneus komi, Araneus kraepelini, Araneus lacrymosus, Araneus ladschicola, Araneus lamperti, Araneus lancearius, Araneus lanioAraneus, lateriguttatus Araneus, lathyrinus Araneus latirostris, Araneus leai, Araneus lechugalensis, Araneus legonensis, Araneus lenkoi, Araneus lenzi, Araneus leones, Araneus liae, Araneus liber, Araneus liberalis, Araneus liberiae, Araneus licenti, Araneus lin eatipes, Araneus lineatus, Araneus linshuensis, Araneus lintatus, Araneus linzhiensis, Araneus lithyphantiformis, Araneus lixicolor, Araneus loczyanus, Araneus lodicula, Araneus longicaudus, Araneus luteofaciens, Araneus lutulen tus, Araneus macacus, Araneus madeayi, Araneus madagascaricus, Araneus mamillanus, Araneus mammatus, Araneus mangarevoides, Araneus margaritae, Araneus margitae, Araneus mariposa, Araneus marmoreus, Araneus marmoroides, Araneus masculus, Araneus masoni, Araneus mastersi, Araneus mato grosso, Araneus mauensis, Araneus mayumiae, Araneus mazamitla, Araneus mbogaensis, Araneus memoryi, Araneus mendoza, Araneus menglunensis, Araneus meropes, Araneus mertoni, Araneus metalis, Araneus metellus, Araneus meus, Araneus miami, Araneus microsoma, Araneus microtuberculatus, Araneus 5 mimosicola, Araneus minahassae, Araneus miniatus, Araneus minutalis, Araneus miquanensis, Araneus missouri, Araneus mitificus, Araneus monica, Araneus monoceros, Araneus montereyensis, Araneus moretonae, Araneus mortoni, Araneus morulus, Araneus mossambicanus, Araneus motuoensis, Araneus mulierarius, Araneus musawas, Araneus myurus, Araneus nacional, Araneus nashoba, Araneus necopinus, Araneus neocaledonicus, Araneus 10 nephelodes, Araneus nidus, Araneus nigmanni, Araneus nigricaudus, Araneus nigrodecoratus, Araneus nigroflavornatus, Araneus nigromaculatus, Araneus nigropunctatus, Araneus nigroquadratus, Araneus niveus, Araneus noegeatus, Araneus nojimai, Araneus nordmanni, Araneus nossibeus, Araneus notacephalus, Araneus notandus, Araneus noumeensis, Araneus novaepommerianae, Araneus nox, Araneus nuboso, Araneus nympha, Araneus obscurissimus, 15 Araneus obscurtus, Araneus obtusatus, Araneus ocaxa, Araneus ocellatulus, Araneus octodentalis, Araneus octumaculalus, Araneus ogatai, Araneus omnicolor, Araneus orgaos, Araneus origenus, Araneus oxygaster, Araneus oxyurus, Araneus paenulatus, Araneus pahalgaonensis, Araneus pahli, Araneus paitaensis, Araneus pallasi, Araneus pallescens, Araneus pallidus, Araneus panchganiensis, Araneus panniferens, Araneus papulatus, Araneus partitus, 20 Araneus parvulus, Araneus parvus, Araneus pauxillus, Araneus pavlovi, Araneus pecuensis, Araneus pegnia, Araneus pellax, Araneus penai, Araneus pentagrammicus, Araneus perincertus, Araneus petersi, Araneus pfeifferae, Araneus phaleratus, Araneus phlyctogena, Araneus phyllonotus, Araneus pichoni, Araneus pico, Araneus pictithorax, Araneus pin guis, Araneus pistiger, Araneus plus, Araneus plenus, Araneus pogisa, Araneus poltyoides, Araneus 25 polydentatus, Araneus pontii, Araneus popaco, Araneus postilena, Araneus poumotuus, Araneus praedatus, Araneus praesignis, Araneus prasius, Araneus pratensis, Araneus principis, Araneus pronubus, Araneus pros piciens, Araneus pro videns, Araneus prunus, Araneus pseudoconicus, Araneus pseudosturmii, Araneus pseudoventricosus, Araneus psittacinus, Araneus pudicus, Araneus puebla, Araneus pulcherrimus, Araneus pulchriformis, Araneus punctipedellus, Araneus pupulus, Araneus purus, Araneus qianshan, Araneus quadratus, Araneus quietus, Araneus quira pan, Araneus rabiosulus, Araneus radja, Araneus ragnhildae, Araneus rainbowi, Araneus ramulosus, Araneus rani, Araneus rarus, Araneus raui, Araneus recherchensis, Araneus relicinus, Araneus repetecus, Araneus riveti, Araneus roseomaculatus, Araneus rotundicornis, Araneus rotundulus, Araneus royi, Araneus rubicundulus, Araneus rubripunctatus, Araneus rubrivitticeps, Araneus rufipes, Araneus russicus, Araneus ryukyuanus, Araneus saccalava, Araneus saevus, Araneus sagicola, Araneus salto, Araneus sambava, Araneus santacruziensis, Araneus santarita, Araneus savesi, Araneus schneblei, Araneus schrencki, Araneus scutellatus, Araneus scutifer, Araneus scutigerens, Araneus selva, Araneus seminiger, Araneus senicaudatus, Araneus separatus, Araneus septemtuberculatus, Araneus sericinus, Araneus semai, Araneus shunhuangensis, Araneus sicki, Araneus simillimus, Araneus singularis, Araneus sinistrellus, Araneus sinuosus, Araneus sogdianus, Araneus spathurus, Araneus speculabundus, Araneus sponsus, Araneus squamifer, Araneus stabilis, Araneus stella, Araneus stolidus, Araneus strandiellus, Araneus striatipes, Araneus strigatellus, Araneus strupifer, Araneus sturmi, Araneus suavis, Araneus subflavidus, Araneus subumbrosus, Araneus sulfurinus, Araneus svanetiensis, Araneus sydneyicus, Araneus sylvicola, Araneus taigunensis, Araneus talasi, Araneus talca, Araneus talipedatus, Araneus tambopata, Araneus tamerlani, Araneus taperae, Araneus tai-taricus, Araneus tatianae, Araneus tatsulokeus, Araneus tellezi, Araneus tenancingo, Araneus tenerius, Araneus tengxianensis, Araneus tepic, Araneus tetraspinulus, Araneus texanus, Araneus thaddeus, Araneus thevenoti, Araneus thorelli, Araneus tiganus, Araneus tijuca, Araneus tinikdikitus, Araneus titirus, Araneus toma, Araneus tonkinus, Araneus toruaigiri, Araneus transversivittiger, Araneus transversus, Araneus triangulus, Araneus tricoloratus, Araneus trifolium, Araneus trigonophorus, Araneus triguttatus, Araneus tschuiskii, Araneus tsurusakii, Araneus tubabdominus, Araneus tuscarora, Araneus ubicki, Araneus unanimus, Araneus uniformis, Araneus unistriatus, Araneus urbanus, Araneus urquharti, Araneus ursimorphus, Araneus uruapan, Araneus urubamba, Araneus usualis, Araneus uyemurai, Araneus varie gatus, Araneus venatrix, Araneus ventricosus, Araneus ventriosus, Araneus vermimaculatus, Araneus villa, Araneus vincibilis, Araneus viperifer, Araneus virgunculus, Araneus virgus, Araneus viridisomus, Araneus, viridiventris, Araneus viridulus, Araneus v- notatus, Araneus volgeri, Araneus vulpinus, Araneus vulvarius, Araneus walesianus, Araneus washingtoni, Araneus wokamus, Araneus woodfordi, Araneus workmani, Araneus wulongensis, Araneus xavantina, Araneus xianfengensis, Araneus xizangensis, Araneus yadongensis, Araneus yapingensis, Araneus yasudai, Araneus yatei, Araneus yuanminensis, Araneus yukon, Araneus 5 yunnanensis, Araneus yuzhongensis, Araneus zapallar, Araneus zebrinus, Araneus zelus, Araneus zhangmu, Araneus zhaoi, Araneus zuluanus, Araneus zygielloides, Araneus absconditus, Araneus aethus, Araneus beipiaoensis, Araneus carbonaceous, Araneus cinefactus, Araneus defunctus, Araneus delitus, Araneus emertoni, Araneus exustus, Araneus kinchloeae, Araneus inelegans, Araneus leptopodus, Araneus liaoxiensis, Araneus longimanus, Araneus longipes, Araneus 10 luianus, Araneus meeki, Araneus molassicus, Araneus flan us, Araneus piceus, Araneus reheensis, Araneus ruidipedalis, Araneus troschelii and Araneus vulcanalis. D'après « The World Spider Catalog 14.0 », le genre Lycosa consiste en les espèces suivantes: 15 Lycosa abnormis, Lycosa accurata, Lycosa adusta, Lycosa affinis, Lycosa ambigua, Lycosa anclata, Lycosa apacha, Lycosa approximata, Lycosa arambagensis, Lycosa ariadnae, Lycosa articulata, Lycosa artigas,i Lycosa asiatica, Lycosa aurea, Lycosa auroguttata, Lycosa australicola, Lycosa australis, Lycosa balaramai, Lycosa bamesi, Lycosa bedeli, Lycosa beihaiensis, Lycosa bezzii, Lycosa bhatnagari, Lycosa biolleyi, Lycosa bistriata, Lycosa boninensis, Lycosa bonnet!, Lycosa brunnea, Lycosa caenosa, Lycosa 20 canescens, Lycosa capensis, Lycosa carbone!!!, Lycosa carmichaeli, Lycosa cerrofloresiana, Lycosa chaperi, Lycosa choudhuryi, Lycosa cingara, Lycosa clarissa, Lycosa coelestis, Lycosa connexa, Lycosa contestata, Lycosa corallina, Lycosa coreana, Lycosa cowlei, Lycosa cretacea, Lycosa dacica, Lycosa danjiangensis, Lycosa dilatata, Lycosa dimota,Lycosa discolor, Lycosa elysae, Lycosa emuncta, Lycosa erjianensis, Lycosa erythrognatha, Lycosa eutypa, Lycosa falconensis, Lycosa femandezi, Lycosa ferriculosa, Lycosa 25 formosana, Lycosa frigens, Lycosa fuscana, Lycosa futilis, Lycosa geotubalis, Lycosa gibsoniLycosa gigantea,Lycosa howarthi,Lycosa insularis, Lycosa lambai, Lycosa lange!, Lycosa lativulva, Lycosa lebakensis, Lycosa leireana, Lycosa leuckarti, Lycosa leucogastra, Lycosa leucophaeoides, Lycosa leucophthalma, Lycosa leucotaeniata, Lycosa liliputana,Lycosa longivulva,Lycosa mordax, Lycosa nordenskjoldi, Lycosa philadelphiana, Lycosa prolifica, Lycosa similis, Lycosa singoriensis and Lycosa 30 yunnanensis.

De manière privilégiée, les venins d'araignée sont choisis parmi les venins d'Argiope Lobata, d'Argiope Bruennichi, d'Araneus Tartaricus, d'Araneus Cornutus et de Lycosa Syngoriensis ; de manière préférentielle parmi ceux d'Argiope Lobata, d'Argiope Bruennichi et d'Araneus Tartaricus.

Argiope Lobata est une espèce d'araignée appartenant à la famille des Araneidae. Elle présente une large distribution englobant l'Afrique dans sa totalité et s'étirant jusqu'au sud de l'Europe et en Asie. Argiope Bruennichi est une espèce d'araignée appartenant à la famille des Araneidae. Sa distribution englobe le centre et le nord de l'Europe, l'Afrique du nord et des parties de l'Asie.

Araneus Tartaricus est une espèce d'araignée appartenant à la famille des Araneidae. Elle se trouve dans l'ouest de l'Asie. Araneus cornutus est une espèce d'araignée appartenant à la famille des Araneidae. Elle se trouve de manière prédominante en Europe, en Amérique du Nord et dans l'ouest de l'Asie. Lycosa singoriensis est une espèce d'araignée appartenant à la famille des Lycosidae. Elle se trouve de manière prédominante en Europe centrale. De manière privilégiée, le venin d'araignée de l'invention est le venin d'Argiope Lobata. De manière privilégiée, la molécule du venin d'araignées ou l' analogue synthétique de l'invention est représenté par la formule (1). R1 - R2 - R3 - R4 - R5 - R6 (1) dans laquelle - R1 est un H ou un aromatique tel que (OH)2C6H3- CH2-C(=0)- ou une tyrosine; - R2 est -NH - CHUCH2)- C(=0) -N H2] - C(=0) -' avec n=1 ou 2, de préférence n=1 (à savoir R2 est une asparagine); - R3 est -NH- (CH2),,-N H-, avec n' qui est un nombre entier compris entre 1 et 7, et de préférence entre 1 et 6, et de préférence n'=5; - R4 est absent ou est- (CH2),,-NH-, avec n" qui est un nombre entier compris entre 1 et 7, de préférence n"=3 or 4, et encore de préférence n"=3; - R5 est absent ou est - (CH2),-,-NH-, avec n" qui est un nombre entier compris entre 1 and 7, de préférence n"=3 or 4, et encore de préférence n"=3; - R6 est un résidu arginine; et - R1, R2, R3, R5 ou R6 peuvent être modifiés de sorte que chaque peptide lie R1 - R2, R2 - R3 ou R5 - R6 peut être indépendamment remplacés par une liaison sélectionnée dans le groupe comprenant -CH2-CH2-, -CH = CH-, -C(=0)-CH2-, -CH2-S-, -CH2-NH, -CH2-0-, -CH (OH)-CH2-, ou -CH2-50-.

Dans une autre manière préférentielle, la molécule du venin d'araignée est représentée par la formule (2) OH H N N N N.-it.NH2 NH H H H' H 61H2 (2) Ledit composé de la formule (2) appelé Argiotoxin-636, aussi connu comme argiopine, est une polyamine isolée du venin d'Argiope Lobata (CHEMBL 1098240, CHEBI 724404). De manière préférentielle, l'utilisation d'agent cosmétique pour blanchir/dépigmenter de l'invention sert à prévenir et/ou traiter le les signes de vieillissement cutané photo-induit ou chronologique.

Dans le présent document, le terme « signes de vieillissement photo-induit'> fait référence au vieillissement extrinsèque de la peau, causé par le soleil et plus particulièrement par les rayons ultraviolets, qui induisent une augmentation des radicaux libres et un stress oxydatif dans le derme. N HO NH2 Dans le présent document, le terme « signes chronologiques de vieillissement » fait référence à un vieillissement intrinsèque de la peau, d'origine génétique ou métabolique et conduisant à une atrophie progressive et à une dégénérescence du derme, de l'hypoderme et des structures de soutien de la peau.

Un autre objectif de l'invention se rapporte à une composition comprenant des venins d'araignée, molécule ou analogue synthétique dérivé comme définie dans l'invention pour traiter et/ou prévenir l'hyperpigmentation telles que dans le mélasma, le chloasma, les lentigines, le vitiligo, l'hyperpigmentation inflammatoire due à une abrasion, une brûlure, une cicatrice, une dermatose, une allergie de contact, des naevi, l'hyperpigmentation à déterminisme génétique, l'hyperpigmentation d'origines métabolique ou médicamenteuse, les mélanomes ou tout autres lésions hyperpigmentantes. Dans le présent document, le terme « traiter » signifie soigner un état ou une condition malade déjà présent chez un patient ou un sujet. Traitant peut aussi inclure l'arrêt du développement de l'état ou de la condition de la maladie, et soulager ou en l'améliorer, à savoir causer une régression des conditions ou de l'état de la maladie. Le terme « prévenir », comme utilisé ici, signifie arrêter de manière complète ou presque complète l'état ou la condition de la maladie depuis son apparition chez un patient ou un sujet, en particulier lorsque le patient ou le sujet est prédisposé à ce genre, ou à un risque de contracter l'état ou la condition de la maladie. Prévenir peut également inclure arrêter le développement de l'état ou d'une condition de la maladie. Dans le présent document, le terme « hyperpigmentation » se réfère à une gamme de troubles cutanés causés par une augmentation de la production de mélanine et résultant en une augmentation de la pigmentation cutanée dans des régions localisées. L'hyperpigmentation peut se référer à une hyperpigmentation régionale due à une hyperactivité mélanocytaire, telle que les mélasmas idiopathiques, les hyperpigmentations localisées dues à une hyperactivité et une prolifération bénigne des mélanocytes, telles que dans les taches pigmentantes de sénescence (ou lentigo sénile), et à une hyperpigmentation accidentelle, comme la photosensibilisation ou l'hyperpigmentation cicatricielle, et pour le traitement de certaines leucodermies, telles que le vitiligo. Enfin, l'invention fait référence à une méthode non thérapeutique pour blanchir/dépigmenter la peau humaine comprenant une étape d'application topique d'une quantité efficace sur la dite peau humaine de venins d'araignée, de molécules ou analogues synthétiques dérivés comme défini dans l'invention. Dans le présent document, le terme « quantité efficace » d'une composition contenant un agent actif signifie une quantité suffisante de la dite composition pour fournir l'effet désiré. Dans le présent document, le terme « effet thérapeutique » fait référence à l'inhibition de conditions anormales. Le terme « effet thérapeutique » se réfère également à l'inhibition des facteurs causant ou contribuant à une condition anormale. Un effet thérapeutique soulage dans une certaine mesure un ou plusieurs symptômes de la condition anormale. Les expériences suivantes sont fournies pour illustrer les réalisations de la l'invention et ne doivent pas être considérées comme limitant la portée de l'invention.

EXEMPLES I. MATERIEL & METHODES 1) Expériences in vitro a) Fractionnement des venins par HPLC Les solvants sont achetés auprès de Carlo Erba (Val de Reuil, France) et les venins ont été obtenus grâce à la société Latoxan (Valence, France). Afin d'identifier les molécules actives, les venins ont été séparé par chromatographie en phase liquide à haute pression (HPLC) en 20 fractions. L'HLPC a été faite sur le modèle 1100 d'Hewlett Packard, l'absorbance de l'éluât est enregistrée à une longueur d'onde de 214 nm et une colonne en phase réverse (Eurospher 100 ou 300-5 C18, 120*16 mm) a été utilisée. Les solutions de venins filtrées sont manuellement injectées (Figure 1). Le système de solvants (pour la phase mobile) était : Solvant A= 0,1% TFA dans l'eau et solvant 13. 0,08% de TFA dans 90% eau acétonitrile ; le flux était de 4 ml/min de 0 à 60% du solvant B en 60 min. Ensuite, toutes les fractions HPLC ont été testées pour localiser l'inhibition de l'activité DOPA oxydase. Les fractions lyophilisées actives des venins ont ensuite été purifiées, la méthode utilisée a été la même que celle précédemment décrite. b) Test sur la tyrosinase de champignon La tyrosinase (SIGMA-ALDRICH, T3824) de champignon (Agaricus Bisporus) possède à la fois l'activité DHICAoxydase et l'activité DOPA oxydase (SUGUMARAN et al, Pigment Ce!! Res., vol.12(2), p :118-25, 1999). L'effet des différents venins, des molécules synthétiques ou peptides sur l'activité tyrosinase a été déterminé. j. Quantification de l'activité inhibant la DOPA oxydase par spectrophotométrie L'effet de différents venins d'araignée sur l'activité DOPA oxydase a été mesuré par spectrophotométrie. L'activité DOPA oxydase a été déterminé en utilisant la L-DOPA comme substrat à 0,2 mM. La quantité de DOPAchrome (pigment rouge) formée a été mesurée contre un blanc à 475 nm. Le pourcentage d'inhibition de la DOPA oxydase a été obtenu à partir de: Pourcentage d'inhibition = [(A-B)/(C-D)*100] avec : - A: Absorbance à 475 nm du milieu de réaction + la solution d'inhibiteur avec l'enzyme - B: Absorbance à 475 nm du milieu de réaction + la solution d'inhibiteur sans l'enzyme (blanc) - C: Absorbance à 475 nm du milieu de réaction enzymatique sans la solution d'inhibiteur - D: Absorbance à 475 nm du milieu de réaction sans l'enzyme ni la solution d'inhibiteur La L-DOPA et la tyrosinase de champignon (Agaricus Bisporus, T3824) ont été obtenues chez Sigma-Aldrich (St Quentin Fallavier, France).

L'inhibition de l'activité DOPA oxydase avec la tyrosinase de champignon a été testé in vitro comme précédemment décrit par Elmer-Rico E Mojica et al, (CitPhilippine Journal of Crop Science, vol. 30(1), p :47-51, 2005) avec quelques modifications. Des solutions à 1 mg/mi de la tyrosinase de champignon dans une solution tampon PBS (137 mM NaCI, 2,7 KCI, 10mM Na2HPO4 et ajusté à pH 6,8) et 0,4 mM de L-dihydroxyphénylalanine (L-DOPA) ont été préparé.

Pour le test de l'activité DOPA oxydase : 500 III de la solution L-DOPA 0,4 mM ont été mélangé avec différents volumes d'après les différents inhibiteurs naturels à à 10 mg/ml, et 5 Ill de la solution de tyrosinase de champignon (ajouté en dernier pour initier la réaction enzymatique et cette solution doit être conservée dans la glace). Le volume final est de 1 ml dans une solution de saline de Tampon Phosphate (PBS), pH 6,8. L'absorbance est mesurée à 475 nm chaque minute pendant 15 min à l'aide d'un spectrophotomètre UV-Visible BIOMATE 5®. Le blanc utilisé est l'échantillon sans la solution d'enzyme. Pour préparer les solutions de venin à 10 mg/ml, 10 mg de chaque venin sont pesés et solubilisés dans 1 ml d'une solution tampon PBS. Les solutions sont filtrées sur un filtre 0,45 ptm.

Le test Lineweaver-Burk Les conditions expérimentales de ce test sont citées ci-dessus. La L-DOPA est utilisée à différentes concentrations (de 0,1 à 0,4 mM), l'enzyme est la tyrosinase de champignon à 25 Unités. Chaque point a été fait en duplicat. La formation de DOPAchrome est déterminée par spectrophotométrie à 475 nm.

Quantification de l'inhibition de la DHICA oxydase par le test MBTH Le DHICA est utilisé comme substrat à 0,25 mM. Le MBTH est obtenu de la société Alfa Aesar et le DHICA est préparé selon le protocole de WAKAMATSU & ITO (Anal. Biochem., vol. 170(2), p :335-40, 1988). Ici, la méthode MBTH est utilisée. Cette méthode consiste à visualiser la production d'adduit d'hydrazone-quinone par spectrophotométrie. Le principe est que le MBTH capture l'indole-quinone qui est généré par l'oxydation des composés dihydroxyindoles. Le DHICA est convertit en acide indole-5,6-quinone-2-carboxylique par l'activité DHICA oxydase de la tyrosinase de champignon, le produit indole est capturé par le MBTH et la formation de ce complexe peut être détectée à 492 nm (OLIVARES et al, Biochem. J., vol.354, p131-139, 2001). L'inhibition de l'activité DHICA oxydase en utilisant la tyrosinase de champignon est testée in vitro. Le protocole utilisé est le même que celui décrit par WINDER & HARRIS (Eur. J. Biochem., vol.198(2), p :317-26, 1991) pour la DOPA oxydase avec des modifications mineures. c) Purification des fractions La même méthode HPLC que celle décrite précédemment a été utilisée. L'HPLC-MS utilisé est le LC-2010A HT Liquid Chromatograph (Shimadzu, Marne la vallée, France). Deux longueurs d'onde différentes, à 214 et 280 nm ont été utilisées. d) Caractérisation moléculaire par chromatographie en phase liquide/spectrométrie de masse L'analyse de la masse a été faite à l'aide du système Shimadzu LCMS-2010 EV HPLC. La masse de la molécule d'intérêt a été déterminée grâce à la formule suivante : mMproduct + (z * Madduct) . z z Les produits adduits sont: m/z + H+ (1 g/mol), ou m/z + Na + (23 g/mol), ou m/z + le (39.1 g/mol). e) Analyse des acides aminés En plus de l'analyse par spectrométrie de masse, l'identité de l'Argiotoxine a été évaluée par une analyse d'acide aminé (AAA) après hydrolyse acide [6N HCI, 72h, 110°C]. Tous les lots d'Argiotoxine purifiés ont été quantifiés par la méthode AAA. 2) Expériences in vivo a) Réactifs : Les venins ont été aimablement fournis par la société Latoxan (Valence, France). Les milieux de culture cellulaire, la solution de trypsine-EDTA, la pénicilline/streptamycine ont été acheté chez Gibco (Saint Aubin, France). L'hormone Alpha-Melanocyte Stimulating Hormon (aMSH) et l'Acide Kojique ont été acheté chez SIGMA-ALDRICH (Saint Quentin Falavier, France) et ALFA AESAR (Ward Hill, Mass., USA) respectivement. b) Culture cellulaire : Les B16F10 ont été obtenus à partir de la collection américaine de type cellulaire (ATCC CRL-6475, Manassas, VA, USA). Les cellules sont cultivées dans du milieu Dubelcco's Eagle Medium (DMEM) supplémenté par 10% de sérum de veau foetal décomplémenté (SVF, Lonza ltd., Bâle, Suisse) et de la pénicilline/streptomycine (50 l.tg/ml) dans une atmosphère humide contenant 5% de CO2 à 37°C. c) Test de viabilité cellulaire : L'évaluation de la survie des cellules B16F10 repose sur la réduction de l'anneau tétrazolium du composé MTT soluble dans l'eau (344,5-dimethylthiazol-2-y1]-2,5- diphenyltetrazolium bromide ; Sigma Aldrich) en cristaux de formazan violets insolubles par l'enzyme succinate déshydrogénase mitochondriale. La production de formazan reflète directement le nombre de cellules en vie ou mortes. Les cellules B16F10 sont ensemencées à 25000 par puits dans une plaque P96 et incubées dans du milieu de culture standard. Après 24h de culture, le surnageant est aspiré et remplacé par du milieu neuf contenant des concentrations croissante de DHPA, Argiotoxine, ou Acide Kojique pendant 6h à 37°C.Ensuite, le surnageant est enlevé et remplacé par 50 il d'une solution de MU à 0,5 mg/ml. Les cellules sont exposées au MU pendant 2 h. Enfin, chaque puit est lavés avec du PBS1X et les cristaux contenus dans les puits sont solubilisés par l'ajout de 100 gl de DMSO. Après une agitation rapide de la plaque, l'absorbance est mesurée à 600 nm. d) Mesure du contenu de mélanine dans les cellules de mélanomes B10F10: La détermination de la mélanine extracellulaire est considéré comme un indice de mélanogenèse. Les cellules B16F10 sont cultivées dans des plaques 24 puits (5.104 cellules/puits) dans un milieu sans rouge phénol et sont stimulées par 100 nM d'a-MSH.

Ensuite, 24 heures plus tard, les cellules sont incubées pour 48h avec des concentrations croissantes de DHPA (0 à 250 gM), d'Argiotoxine (de 0 à 42,1gM) ou d'Acide Kojique (0 à 100 p.M) comme contrôle. Pour quantifier la quantité de mélanine secrétée dans le milieu , l'absorbance de 200 gl de surnageant est lue à 405 nm. Les valeurs sont normalisées par la mesure du taux de de protéines totales présent dans chaque puits. e) Détermination du taux de protéine : Les cellules sont lavées avec du PBS1X et dissouts dans 200 gl de NaOH 1N pendant 1 heure à 60°C. Les lysats sont ensuite centrifugés et le taux de protéines déterminé par la méthode Folin-Lowry, en utilisant le kit Protein Assay de BIO-RAD (Marnes-la-coquette, France). L'absorbance est lue à 475 nm. f) Analyse par Western Blot : Les cellules sont ensemencées à 1.106 cellules/boite et cultivée dans des boites de pétri comme précédemment décrits. Après trypsination, les culots cellulaires sont homogénéisés dans une solution contenant du Sodium Dodécyl Sulfate (SDS) et mis à bouillir 5 min à 96°C afin de dénaturer les protéines. Les extraits protéiques sont séparés via un gel SDS-PAGE 10% pendant 1h à 200 V puis transférés sur une membrane de polyvinylidene difluoride (PVDF, GE healthcare Europe, Vélizy-Villacoublay, France). Les membranes sont bloquées toute la nuit avec une solution tampon Tris contenant 0,1% de Tween et 5% de lait écrémé. Les membranes sont incubées 1 heures à 37°C avec des anticorps spécifiques dirigés contre la tyrosinase, TRP-1 ou MITF (C-19 ; G-17; C-11; 1 :100, Santa Cruz, Heidelberg, Germany) et l'actine comme contrôle(C-11, 1 :200, Santa Cruz).. Les membranes sont incubées avec un anticorps secondaire couplés à la peroxydase de raifort (HRP) pendant 2 h à température ambiante (anti-chèvre, 1: 2500 pour la tyrosinase, TRP-1 et MITF (ab 97120, Abcam, Paris, France) et un anti-lapin, 1: 2500 pour l'actine( NA 934V, GE Healthcare)). L'immunomarquage est révélé par un substrat HRP chémiluminescent (Immobilon Western kit, Milipore, Molsheim, France). Des marqueurs de poids moléculaires sont utilisé pour mesurer le poids moléculaire des protéines. g) Analyse statistique : La significativité statistique est démontrée par le test student. Le test est réalisé sur des expériences menées en triplicat, quadruplicat ou qui ont été conduites au moins 3 fois de manière indépendantes. Les valeurs de p <0.05, sont considérées comme étant statistiquement significative et sont marquée par une astérisque. Deux astérisques reflètent que p est inférieur à 0.01.

II. RESULTATS 1) Tests in vitro a) Criblage des venins 68 venins extraits de différentes espèces et familles d'animaux venimeux comme les serpents, les scorpions, les araignées, etc., ont été criblés par spectrométrie UV. L'objectif est de montrer une activité inhibitrice potentielle de ces différents venins sur l'activité DOPA oxydase de la tyrosinase de champignon. Le venin 21, un venin d'araignée, possède une activité inhibitrice sur la DOPA oxydase de la tyrosinase de champignon (Figure 1). Le venin 21 présente l'activité inhibitrice sur l'activité DOPA oxydase la plus intéressante parmi les 68 venins testés. b) Criblage des venins d'araignées A partir de ce premier criblage (Figure 1), il a été trouvé que le venin le plus actif est le venin d'Argiope Lobata (venin 21). Un second criblage a été fait, avec seulement des venins d'araignée (Figure 2). Chaque solution initiale de venin est à 10 mg/ml, et 50 gl de ces solutions ont été testé. La figure 2 montre les résultats obtenus avec 16 venins d'araignées. Pour les venins présentant un effet inhibiteur, une dose-réponse a été réalisée (Figure 3). De nombreux venins de différentes familles d'araignées sont capables d'inhiber l'activité DOPA oxydase. Ici, Argiope Lobata, Araneus Tartaricus, Araneus Cornutus, Lycosa Singoriensis et Argiope Bruennichi sont cités pour leurs propriétés inhibitrices. Les venins d'Argiope Lobata, Araneus Tartaricus, Araneus Cornutus, Lycosa Singoriensis, Argiope Bruennichi montrent une importante activité inhibitrice sur la DOPA oxydaseparce qu'ils ont les plus faibles absorbances, comparé aux autres venins d'araignée (Figure 2). Argiope Lobata (50 gl) a une absorbance d'environ 0,1 et une activité inhibitrice sur la DOPA oxydase autour de 90,9 %. Araneus Tartaricus (50 gl) a une absorbance d'environ 0,2 et une activité inhibitrice sur la DOPA oxydase d'environ 74,5 %. Araneus Cornutus (50 gl) a une absorbance d'environ 0,3 et une activité inhibitrice sur la DOPA oxydase d'environ 41,0 %. Lycosa Singoriensis (50 gl) a une absorbance d'environ 0,250 et une activité inhibitrice sur la DOPA oxydase autour de 56,3%. Argiope Bruennichi (50 g') a une absorbance d'environ 0,175 et une activité inhibitrice sur la DOPA oxydase d'environ 76,5 % (Figure 3). En raison de sa plus forte puissance parmi les venins d'araignées, le venin extrait d'Argiope Lobata a été étudié de manière plus approfondie sur ses effets sur les processus de mélanogenèse. c) Fractionnement, analyse par HPLC et spectrométrie de masse du venin d'Argiope Lobata Fractionnement du venin d'Argiope Lobata A partir d'une solution initiale de venin d'Argiope Lobata a 7 mg/mi (Figure 4), un fractionnement en 20 fractions équivalentes a été réalisé pour localiser l'activité d'inhibition sur la DOPA oxydase. Ces fractions sont toujours testées par spectrophotométrie UV. 40 1.11 de chaque fraction sont lyophilisés, puis repris dans 100 tal de PBS. Seulement 20 I.LL de cette dernière solution sont utilisés pour le test de spectrophotométrie. La figure 5 montre l'activité inhibitrice des différentes fractions équivalentes du venin d'Argiope Lobata. La fraction G8 présente la plus faible absorbance (environ 0,25) et ainsi la plus forte activité inhibitrice sur l'activité DOPA oxydase (35,6%). Ces résultats montrent que l'activité inhibitrice sur la DOPA oxydase est localisée dans la fraction G8 du venin d'Argiope Lobata. La purification de la fraction G8 (résultats non montrés) du venin d'Argiope Lobata est faite parr une HPLC Alliance afin d'isoler les molécules actives et de les caractériser par spectrométrie de masse. La figure 6 montre l'activité inhibitrice des différentes sous-fractions de la fraction G8. La sous-fraction 5 présente la plus faible absorbance (entre 0,3 et 0,4) et donc l'activité inhibitrice la plus importante (entre 40 et 44 %). L'activité inhibitrice sur l'activité DOPA oxydase de la fraction G8 semble être localisée dans la sous-fraction 5. Caractérisation moléculaire par chromatographie liquide/ spectrométrie de masse A l'aide de l'appareil de chromatographie liquide et de spectrométrie de masse LCMS2010 EV et grâce à la formule suivante : m Mproduct + (z appareil de - = z z la masse de la molécule d'intérêt a pu être déterminée. Les produits adduits sont m/z + H+ (1 g/mol), ou m/z + Na + (23 g/mol), ou m/z + le (39.1 g/mol).

Ici, m/z = 637 a été obtenu et a été isolé pour la première fois par Grishin et al, 1989, Toxicon. Cela correspond à MARGIOTOXIN + H+. La présence de produit adduit avec m/z à 319 correspond à la masse de l'argiotoxine chargée 2 fois avec H+ (m/z= 638) et divisé par 2 (638/2= 319). Ce chromatogramme qui est associé au spectre de masse, confirme que l'Argiotoxine-636 est la molécule exacte (Figure 8).

Analyse d'acide aminé Afin de confirmer la structure de l'Argiotoxine, une analyse d'acide aminée a été réalisée sur tous les lots par le laboratoire IBS (Grenoble, France). Tous les lots ont été quantifié par cette méthode.

L'analyse des acides aminés a été réalisée comme illustrée avec le lot 1. L'acide aminé de référence utilisé est la N-Leu. N-Leu chargé : 38904 picomol. / N-Leu lue : 9831 picomol. Masse de la solution d'échantillon d'Argiotoxine : 60,8 mg. Volume initial de l'échantillon : 5 ml A.A. Picomol. Res. % A.A./Mol. Série # Asp/Asn 3941 46.81 0.97 1 Arg 4216 50.08 1.03 1 Autres (Non 262 3.11 0.06 significatif) Calcul: (3941 + 4216) + 2 = 4080 Nb pmol/AA 4080n(38904xm1fo) x (10004xmlf) = 265.55 nmol/g La concentration de la solution d'Argiotoxine est de 171,13 tg/ml ou 269,1 el.

Grâce à la caractérisation de la masse et à l'analyse d'acide aminé, la structure de l'Argiotoxine est confirmée. Cette structure est comparable à celle décrite par GRISHIN et al. (Toxicon., vol.27(5), p :541-549, 1989) L'Argiotoxine est la molécule d'intérêt et sera donc testées pour ses effets sur les activités DOPA et DHICA oxydases de la tyrosinase de 10 champignon. d) Inhibition de l'activité DOPA oxydase du V21 i. Concentration inhibitrice médiane du venin Argiope Lobata 15 A. partir d'une solution de venin à 10 mg/ml, la mesure de la concentration inhibitrice médiane (CI50) est a été réalisée. La figure 9 montre la courbe CI50 du venin Argiope Lobata. Cette courbe montre que 500 l.tg/ml du venin Argiope Lobata inhibe 88% de l'activité DOPA oxydase et 10 p.g/m1 du venin inhibe 5,6% de l'activitéDOPA oxydase. Une concentration de 62,5 .tg/ml du venin inhibe 50% 20 de l'activité DOPA oxydase. Une courbe dose-réponse avec l'Acide Kojique a été réalisée comme inhibiteur de référence. Cela permet de corréler l'activité inhibitrice sur l'activité DOPA oxydase avec celle d'un autre inhibiteur (résultats non présentés). 25 ii. Effet inhibiteur de l'Argiotoxine sur l'activité DOPA oxydase L'activité inhibitrice de l'Argiotoxine sur l'activité DOPA oxydase a également été déterminée sur la tyrosinase de champignon. A partir d'une solution à 190,8 1..tM, la C150 a pu être déterminée. La figure 10 montre la courbe dose-réponse de l'Argiotoxine sur l'activité DOPA oxydase. L'Argiotoxine présente une C150 de 8,561.IM.

Mécanisme d'inhibition de l'Argiotoxine sur l'activité DOPA oxydase La figure 11 montre la représentation Lineweaver-Burk, uneinterprétation graphique permettant la détermination de paramètres enzymatiques tels que la constante de Michaelis (Km) caractérisant l'affinité entre une enzyme et son substrat. La figure 11 montre qu'en présence de concentration croissante d'Argiotoxine, le Km et le Vmax de la tyrosinase de champignon varient, manifestant que l'Argiotoxine présente une inhibition mixte . Ainsi, l'Argiotoxine est un inhibiteur non-compétitif et son site de liaison est différent de celui du substrat. e) Calibration du 2,4 DHPAA Le 2,4 DHPAA est la portion aromatique de l'Argiotoxine-636. Une purification de 2,4-DHPAA synthétisée a été faite par HPLC et une courbe de calibration a été obtenue par spectrométrie UV. Le logiciel utilisé est REGRESSI. Plusieurs concentrations connues de DHPAA à savoir de 0 à 1 mg/m1 ont été obtenues et conservées. Table 1 : Résultats du test de calibration du 2,4 DHPAA [DHPAA] mg/mL Absorbances (DO) 0.05 0.063 0.1 0.153 0.15 0.248 0.2 0.34 0.25 0.421 0.3 0.511 0.35 0.617 0.5 0.852 1 1.672 f) Détermination de la CI50 du 2,4-DHPAA sur l'activité DOPA oxydase La figure 12 présente le pourcentage d'inhibition de l'activité DOPA oxydase dépendante de la concentration en 2,4-DHPAA. Cette figure suggère que la tyrosinase de champignon possède 2 sites actifs différents pour le substrat L-DOPA avec 2 affinités différentes. Ainsi, le 2,4- DHPPA serait un inhibiteur compétitif. Ici, l'activité est plus basse que pour le composé Argiotoxine entier et d'environ 6 mM. Ce résultat reflète que l'activité entière du composé argiotoxine semble ne pas être uniquement restreint à la première partie de la molécule. g) Effet de l'Argiotoxine sur l'activité DHICA oxydase La tyrosinase de champignon possède à la fois les activités DOPA et DHICA oxydase (SUGUMARAN et al, Piment Ce!! Res., vol. 12(2), p :118-25, 1999). L'activité DHICA oxydase est spécifiquement requise pour la biosynthèse des pigments bruns/noirs. La capacité de l'Argiotoxine à inhiber cette activité est grâce à la tyrosinase de champignon. Une inhibition dose-dépendante est visible jusqu'à 100 iiM d'Argiotoxine (Figure 13). Les conditions expérimentales sont les mêmes que précédemment mentionnés. Le DHICA est utilisé comme substrat à 0,25 mM. La figure 13 montre que l'Argiotoxine inhibe l'activité DHICA oxydase de la tyrosinase de champignon de manière dose-dépendante jusqu'à 751.IM. 2) Expériences in vivo: Avant d'approfondir l'évaluation de l'utilisation potentielle de l'Argiotoxine comme agent blanchissant, son effet cytotoxique est évalué à la dose maximale (42,1 1.1M) présentant un effet in vivo. L'Argiotoxine ne présente ni de mort cellulaire ni de cytotoxicité à 42,1 gl'l respectivement évalués par les tests cellulaires de MÎT et de la LDH (données non montrées). a) Test de mélanogenèse Les cellules B16F10 sont des cellules de mélanome murin, une lignée cellulaire capable de produire de la mélanine Et considérée comme un modèle approprié pour mesurer l'inhibition de mélanogenèse. Les cellules sont ensemencées à 5.104 cellules/puits dans une plaque P24 puits et stimulées par 100 nM d' a-MSH, l'hormone stimulant la production de mélanine. 24 h plus tard, les cellules sont traitées avec des concentrations croissantes d'acide kojique utilisé comme contrôle (de 0 à 250 1.1M) et de 0 à 42,1 gM pour l'argiotoxine. 48 heures plus tard, en accord avec SIEGRIST & EBERLE (Anal. Blochem., vol. 159(1), p :191-7, 1986), la quantité de mélanine secrétée dans le milieu est mesurée spectrophotométriquement à 405 nm et normalisée à la quantité de protéines. L'Argiotoxine est aussi capable de bloquer la mélanogenèse dans les B16F10 de manière dose-dépendante et présente une C150 autour de 0,0111M (Figure 14). La tête de la molécule d'Argiotoxine qui a été identifiée comme le DHPA a également été testé sur ce test cellulaire pour évaluer si l'activité ex-vivo de Argiotoxine repose sur l'activité de ce composé connu. Le protocole utilisé était le même que préalablement décrit pour l'argiotoxine. Comme contrôle, l'acide kojique a été utilisé dans la même gamme de concentrations. Les 2 composés montrent un profil de dose-réponse (Figure 15). Le DHPA présente une C150 comparable à celle de l'acide kojique et proche de 5 gM. La présence du groupement DHPA dans l'argiotoxine peut seulement partiellement expliquer la forte puissance de l'argiotoxine. En effet, l'Argiotoxine présente une activité 100 fois supérieure sur ce test cellulaire suggérant que l'activité de l'argiotoxine n'est pas concentrée dans la première partie de la molécule. b) Analyse par Western Biot Afin d'explorer le mécanisme d'action de l'Argiotoxine dans les processus de mélanogenèse, nous avons évalué sa capacité à réguler l'expression des protéines des deux enzymes, la tyrosinase et TRP1 qui est impliquée dans la biosynthèse des pigments bruns/noirs spécifiquement. Des analyses par western blot sont faites sur les cellules B16F10 traitées comme précédemment décrit. La figure 16 montre que, comme attendu, la stimulation par l'aMSH induit l'expression de la tyrosinase et de TYPR1. Le traitement avec l'Acide Kojique diminue légèrement l'expression de la tyrosinase et de TYRP1. Contrairement à l'inhibiteur de référence, l'argiotoxine présente une inhibition significative de l'expression de ces 2 protéines.

L'argiotoxine réduit significativement l'expression des protéines tyrosinase et TRP1 suggérant que le composé puisse directement interagir avec ces enzymes et les dégrader ou bien in-terfèrer avec leur voie de biosynthèse. L'inhibition de l'expression de TRP1 par l'Argiotoxine souligne le fait que ce composé puisse avoir un mécanisme d'action différent comparé à ceux des inhibiteurs clasiques tels que l'Acide Kojique et confirme son intérêt en cosmétique pour développer des produits pour blanchir la peau ciblant les phototypes V et VI. III. ACTI VITE DES ANALOGUES SYNTHETIQUES BLANCHISSANTS 1) Analogues synthétiques Les analogues synthétiques de l'argiotoxine sont listés dans la table I en référence à la formule (1). Table I N° RI. R2 R3 R4 R5 R6 1 Tyr Asparagine n'=7 absent absent Arginine (Asn) (Arg) 2 (0 H)2C6H3- CH2-C(=0)- Asn n'=5 n=6 absent Arg 3 H Asn n'=7 absent absent Arg 4 H Asn n'=6 absent absent Arg H Asn n'=5 absent absent Arg 6 H Asn n'=7 n"=7 absent Arg 8 H Asn n'=7 n"=6 absent Arg 9 H Asn n'=7 n"=5 absent Arg H Asn n'=6 n"=6 absent Arg 12 H Asn n'=6 n"=5 absent Arg 13 H Asn n'=6 n"=4 absent Arg 14 H Asn n'=6 n"=7 absent Arg H Asn n'=5 n"=6 absent Arg 16 H Asn n'=5 n"=5 absent Arg 17 H Asn n'=7 n"=3 n"=3 Arg 18 H Asn n'=6 n"=4 n"=3 Arg 19 H Asn n'=6 n"=3 n"'=4 Arg 20 H Asn n'=6 n"=3 n"=3 Arg 21 H Asn n'=5 n"=4 n"=3 Arg 22 H Asn n'=5 n"=3 rr=4 Arg 23 H Asn n'=5 n"=3 rr=3 Arg 24 H Asn n'=4 n"=5 n"=3 Arg 25 H Asn n'=4 n"=3 n"=5 Arg 26 H Asn n'=4 n"=3 n"'=3 Arg 27 H Asn n'=3 n"=4 n"'=4 Arg 28 H Asn n'=3 n"=5 rr=3 Arg 29 H Asn n'=2 n"=5 n=4 Arg 30 H Asn n'=2 n"=6 n"=3 Arg 2) Inhibition des activités DOPA et DHICA oxydase : Les analogues synthétiques cités ci-dessus sont testés à différentes concentrations sur la tyrosinase de champignon comme décrit précédemment. L'argiotoxine est utilisée comme contrôle positif. 3) Expériences in vivo : Les analogues synthétiques présentant une CI50 inférieure à 10 gM sur les activités DOPA et/ou DHICA sont testés sur la mélanogenèse comme précédemment décrit. Une fois encore, l'Argiotoxine est utilisée comme contrôle positif.

Claims (10)

1. REVENDICATIONS1. Une composition topique comprenant des venins d'araignée, des molécules ou des analogues synthétiques dérivés de ceux-ci.
2. 2. L'utilisation de venins d'araignées, molécules ou analogues synthétiques dérivés de ceux-ci comme agent cosmétique pour le blanchiment/ la dépigmentation de la peau.
3. 3. L'utilisation conformément à la revendication 2, dans laquelle des venins d'araignées sont choisis parmi les venins d'araignées appartenant aux genres Lycosa, Argiope ou Araneus.
4. 4. L'utilisation conformément à l'une des revendications 2 ou 3, dans laquelle les venins d'araignées sont choisis parmi les venins d'Argiope Lobata, d'Argiope Bruennichi, d'Araneus Tartaricus, d'Araneus Cornutus et de Lycosa Syngoriensis.
5. 5. L'utilisation conformément à l'une des revendications de 2 à 4, dans laquelle le venin d'araignée est le venin d'Argiope Lobata.
6. 6. L'utilisation conformément à la revendication 2, dans laquelle la molécule de venin d'araignée ou l'analogue synthétique est représenté par la formule (1) : R1 - R2 -R3 - R4 - R5 - R6 (1) Dans laquelle: - R1 est H ou un aromatique tel que (OH)2C6H3-CH2-C(.0)- ou Tyr; - R'2 est - NH - CHRCH2)n - C(=0)- NH2] - C(=0) -' avec n=1 ou 2, de préférence n=1 ; - R3 est -NH- (CHI, -NH-, avec n' est un nombre entier entre 1 et 7, préférentiellement entre 1 et 6 et de préférence n'=5 ; - R4 est absent ou est - (CH2)n--NH-, avec n" est un nombre entier entre 1 et 7, de préférence n".3 or 4, et encore de préférence n"=3; - R5 est absent ou est -(CH2)e-NH-, avec n" est un nombre entier entre 1 et 7, de préférence n"=3 or 4, et encore de préférence n"=3; - R6 est un résidu arginine; et- R1, R2, R3, R5 ou R6 peuvent être modifiés donc que chaque peptide lie R1 - R2, R2 - R3 ou R5 - R6 puissentt être indépendamment remplacé par une liaison choisie parmi les groupes comprenant -CH2-CH2-, -CH = CH-, -C(=0)-CH2-, -CH2-5- , -CH2-NH, -CH2-0-, -CH (OH)-CH2-, ou -CH2-50-.
7. 7. L'utilisation conformément à la revendication 6, dans laquelle la molécule de venin d'araignée est représentée par la formule (2):
8. 8. L'utilisation conformément à l'une des revendications 2 à 7, dans laquelle le dit agent cosmétique pour le blanchiment/la dépigmentation de la peau est utilisé pour prévenir et/ou traiter des signes de vieillissement cutanée photo-induit ou chronologiques.
9. 9. Une composition comprenant des venins d'araignée, molécules ou analogues synthétiques dérivés de ceux-ci comme défini dans l'une des revendications 1 à 8 pour le traitement et/ou la prévention d'hyperpigmentations comme le mélasmas, le chloasmas, les lentigines, le vitiligo, les hyperpigmentations post-inflammatoires dues à une abrasion, une brulure, une cicatrisation, une dermatose, une allergie de contact, des noevi, des hyperpigmentations à déterminisme génétique, des hyperpigmentations d'origine métaboliques ou médicamenteuses, des mélanomes ou tout autres lésions hyperpigmentantes.
10. 10. Une méthode non thérapeutique pour blanchir/ dépigmenter la peau humaine comprenant une étape d'application topique d'une quantité efficace sur la dite peau humaine de venins d'araignée, molécules ou analogues synthétiques dérivés de ceux-ci comme définit dans l'une des revendications 1 à 7. OH H NH N NH2 H H H H HO NH2 (2).