FR2935001A1 - Emulsion fluorescente - Google Patents
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Abstract
L'invention concerne une émulsion fluorescente, ses utilisations et des réactifs de marquage la comprenant. L'émulsion fluorescente de l'invention est du type huile-dans-eau comprenant au moins une phase continue aqueuse dans laquelle des gouttelettes d'au moins une phase huileuse sont dispersées, lesdites gouttelettes de phase huileuse étant stabilisées par une couche tensioactive, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins une paire de marqueurs formée d'un marqueur fluorescent donneur absorbant à une longueur d'onde ?1 et émettant à une longueur d'onde ?2 différente de ?1, et un marqueur accepteur absorbant à la longueur d'onde ?2 d'émission du marqueur fluorescent donneur, en ce que le marqueur fluorescent donneur et le marqueur accepteur sont maintenus à proximité l'un de l'autre par encapsulation d'au moins l'un d'entre eux dans les gouttelettes de phase huileuse et/ou par liaison d'au moins l'un d'entre eux à l'interface gouttelettes de phase huileuse-phase aqueuse, et en ce qu'elle comprend des molécules d'au moins un tensioactif amphiphile et d'au moins un lipide solubilisant. L'émulsion fluorescente de l'invention trouve application dans le domaine de l'imagerie optique par fluorescence, en particulier l'imagerie optique biomédicale par fluorescence.
Description
EMULSION FLUORESCENTE L'invention concerne une émulsion fluorescente, ses utilisations et des réactifs de marquage la comprenant. Les techniques d'imagerie optique basées sur l'exploitation de la composante diffuse du signal détecté se développent de plus en plus car elles permettent de sonder les objets diffusants et plus spécifiquement les objets diffusants épais. Dans le domaine de l'imagerie biomédicale, ces techniques offrent une alternative aux techniques conventionnelles que sont la radiographie et la tomographie par rayons X, la tomographie par émission de positons, l'imagerie par résonnance magnétique, pour la détection et la localisation, par exemple par tomographie optique diffusive, de tumeurs cancéreuse par exemple. Dans ces techniques, on utilise la gamme de longueurs d'onde du visible, rayonnement non ionisant, plus précisément dans le rouge ou le proche infrarouge où les tissus biologiques présentent un minimum d'absorption, pour détecter la présence d'une zone anormalement absorbante et/ou diffusante. Plus récemment, les techniques optiques d'imagerie moléculaire de fluorescence se développent de plus en plus grâce à l'utilisation de marqueurs fluorescents spécifiques. Ceux-ci viennent se fixer de façon préférentielle sur les cellules cibles d'intérêt, par exemple des cellules cancéreuses, et offrent un meilleur contraste de détection que les marqueurs non spécifiques. Ces techniques ont pour but de localiser spatialement les marqueurs fluorescents mais aussi d'en déterminer la concentration, ce qui, indirectement, permet de localiser la tumeur, d'obtenir des informations sur sa forme et aussi sur son activité biologique.
Les instruments utilisant la propagation de la lumière dans les milieux diffusants peuvent être divisés en 3 catégories, suivant la source de lumière utilisée : continue, fréquentielle ou temporelle. Historiquement, les instruments utilisant une source de lumière continue ont été les premiers à être développés. Ils présentent cependant l'inconvénient, entre autres, de ne pas fournir d'informations sur les propriétés de diffusion du tissu, qui doivent donc être fournies a priori. Les approches temporelles et fréquentielles sont reliées par transformée de Fourier et sont toutes deux plus riches en information. Une seule acquisition avec un couple source-détecteur permet par exemple de mesurer les propriétés optiques d'absorption et de diffusion isotrope, et noter respectivement a et s, d'un milieu homogène.
Dans les techniques d'optique d'imagerie moléculaire de fluorescence, des marqueurs fluorescents ou agents de contraste fluorescents sont injectés au tissu diffusant à étudier, et se localisent de façon spécifique ou non dans la zone à étudier. Le tissu est ensuite éclairé par une source de lumière quasi-monochromatique obtenue en utilisant un filtre passe-bande ou un passe-bas ou encore un rayon laser. La lumière de la source est diffusée dans le tissu et une partie des photons atteint les molécules de marqueurs fluorescents ou fluorophores, qui réémettent l'énergie fournie par la source de lumière qu'ils absorbent, par émission d'une fluorescence à une longueur d'onde décalée vers le rouge. La lumière émise par le fluorophore se propage elle-même dans le tissu diffusant à étudier jusqu'à atteindre les bords et en sortir. C'est cette lumière de sortie qui est collectée par un dispositif imageur tel qu'une caméra, une caméra intensifiée, des fibres optiques ou un autre dispositif imageur, préalablement filtrée pour couper le signal d'excitation et ne recueillir que les photons de fluorescence. Les longueurs d'onde de la lumière émise par la source et par la fluorescence réémise par le fluorophore se font, pour les tissus humains et d'animaux dans le rouge ou le proche infrarouge, zone appelée fenêtre thérapeutique, car se sont à ces longueurs d'onde que les tissus humains et animaux absorbent le moins. En effet, le sang est responsable de l'absorption de la lumière pour les longueurs d'onde plus faibles, et l'eau vers les longueurs d'onde plus élevées. Les molécules fluorescentes, ou fluorophores, sont donc choisies pour absorber et émettre dans ces longueurs d'onde, c'est-à-dire entre 640 et 900 nm.
A l'heure actuelle, la molécule fluorescente n'est pas injectée en tant que telle dans le tissu à étudier mais sous la forme d'une sonde ("optical probe" en anglais). Cette sonde est en général un assemblage moléculaire constitué de la molécule fluorescente qui peut être par exemple un fluorophore organique, un complexe de lanthanide ou bien encore un nanocristal semi-conducteur luminescent ("quantum dot" ou boîte quantique, tel que CdSe, CdTe, InP, Si...). Ces sondes peuvent en outre comporter un ou plusieurs des éléments suivants : a) un ligand biologique, permettant d'imager un processus biologique spécifique. Un tel ligand peut être : i) un ligand biologique de ciblage : c'est alors une entité biologique (anti-corps, peptide, saccharide,...) ou chimique (acide folique par exemple) qui permet une reconnaissance spécifique de certaines cellules (par exemple de cellules tumorales comme décrit par exemple dans l'article de S. Achilefu, Technology in Cancer Research & Treatment, 2004, 3, 393-408) ou de certains organes, ii) un ligand biologique marqueur d'une activité biologique donnée, par exemple d'une activité enzymatique. Par exemple, ces ligands biologiques seront un peptide clivable par une protéase donnée, à l'extrémité duquel sera greffé un 35 inhibiteur de la fluorescence du label. Ce type de ligands permet d'imager spécifiquement l'activité enzymatique de la protéase ainsi que cela est reporté dans l'article de C.H. Tung, Biopolymers, 2004, 76, 391-403. Un autre exemple est constitué par un ligand biologique comportant un pont disulfure séparant le label d'un inhibiteur de sa fluorescence. Ce ligand biologique permet alors d'imager spécifiquement l'internalisation de la sonde dans une cellule comme décrit par exemple dans la demande de brevet français publiée sous le numéro FR 2 888 938 ; b) un agent de furtivité : c'est une entité que l'on rajoute à la sonde afin de lui conférer une furtivité vis-à-vis du système immunitaire, d'augmenter son temps de circulation dans l'organisme, et de ralentir son élimination ; c) un "vecteur d'assemblage" : c'est une entité qui peut permettre d'assembler le(s) label(s) fluorescent(s), et/ou le(s) ligand(s) biologique(s) de ciblage, et/ou le(s) agent(s) de furtivité, et/ou une ou d'autres fonctionnalités (délivrance de médicaments, autre modalité d'imagerie, fonction thérapeutique par exemple).
Les molécules fluorescentes peuvent également être incluses dans des émulsions. Cependant, le tissu humain ou animal sans marqueur fluorescent a une fluorescence propre appelée fluorescence endogène ou auto-fluorescence qui ajoute un signal parasite. La diffusion inélastique de l'excitation ou l'excitation mal filtrée peuvent aussi être des sources de signaux parasites. De plus, la fluorescence réémise par la molécule fluorescente présente des spectres larges. Il est donc difficile d'avoir des signaux de différentes molécules fluorescentes, également appelées dans ce qui suit marqueurs fluorescents donneurs, simultanément, ce qui signifie qu'il n'y a pas ou peu de multiplexage possible. Enfin, à l'heure actuelle, aucune des sondes existantes ne permet de déterminer quand la molécule fluorescente (le marqueur fluorescent) est délivrée dans l'organisme. Un autre domaine d'application de l'imagerie optique par 30 fluorescence est le suivi de la délivrance, de la variation de forme, de dimension ou d'état, d'une substance d'intérêt dans un milieu hôte. Cela peut être par exemple le suivi de la délivrance d'un médicament dans un humain ou un animal ou la délivrance d'un pesticide dans un végétal ou dans une cellule ou un tissu, ou un organe particulier de cet humain, animal ou végétal, ou 35 encore un milieu synthétique représentatif de ces cellules, tissus, organes. Mais le milieu hôte peut encore être un milieu synthétique ou naturel contenant un organisme ou une substance particulière dont on souhaite suivre le trajet.
Mais encore, l'imagerie optique par fluorescence peut être également utilisée pour l'étude de nano-émulsions pour suivre l'évolution de la taille des nanoparticules, ou savoir lorsque ces nanoparticules éclatent ou encore pour déterminer la cinétique de libération d'un marqueur.
L'invention vise donc à fournir une émulsion fluorescente qui peut être utilisée dans toutes ces applications, et permette d'inhiber et même de supprimer le signal parasite dû à l'auto-fluorescence du milieu hôte dans lequel elle est injectée, et/ou permette d'utiliser simultanément plusieurs marqueurs fluorescents et/ou encore permette le suivi de la délivrance, du changement de forme, de dimension etc. d'un médicament ou d'une substance d'intérêt dans un milieu hôte. A cet effet, l'invention propose une émulsion fluorescente du type huile-dans-eau comprenant une phase continue aqueuse dans laquelle des gouttelettes d'une phase huileuse sont dispersées, lesdites gouttelettes étant stabilisées par une couche tensioactive, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins une paire de marqueurs formée d'un marqueur fluorescent dormeur absorbant à une longueur d'onde X1 et émettant à une longueur d'onde X2 différente de et un marqueur accepteur absorbant la longueur d'onde X2 d'émission du marqueur fluorescent donneur, en ce que le marqueur fluorescent donneur et le marqueur accepteur sont maintenus à proximité l'un de l'autre par encapsulation d'au moins l'un d'entre eux dans les gouttelettes de phase huileuse et/ou par liaison d'au moins l'un d'entre eux à l'interface gouttelettes de phase huileuse-phase aqueuse, et en ce qu'elle comprend des molécules d'au moins un tensioactif amphiphile et des molécules d'au moins un lipide solubilisant. Dans un premier mode de réalisation préféré de l'émulsion fluorescente de l'invention, le marqueur accepteur réémet l'énergie lumineuse émise par le marqueur fluorescent donneur sous forme d'énergie lumineuse ayant une longueur d'onde X3 différente des longueurs d'onde Xl et X2. Dans un second mode de réalisation préféré de l'émulsion fluorescente de l'invention, le marqueur accepteur ne réémet pas ou peu l'énergie lumineuse fournie par le marqueur donneur sous forme d'énergie lumineuse. Dans tous les modes de réalisation de l'émulsion fluorescente de l'invention, les longueurs d'onde X1, X2 et X3 sont comprises entre 640 et 900 nm inclus. Egalement de préférence, dans tous les modes de réalisation de 35 l'émulsion fluorescente selon l'invention, les gouttelettes de phase huileuse ont un diamètre moyen compris entre 10 et 200 nm inclus.
Dans une première variante de tous les modes de réalisation de l'émulsion fluorescente de l'invention, le marqueur fluorescent donneur et le marqueur accepteur sont, chacun indépendamment l'un de l'autre, lipophiles ou amphiphiles et sont maintenus à proximité l'un de l'autre par encapsulation dans les gouttelettes de phase huileuse. Dans cette première variante, et dans un premier mode de réalisation préféré, le marqueur fluorescent donneur est le perchlorate de 1,1'-dioctadécyl-3,3,3',3'-tétraméthylindodicarbocyanine (DiD) et le marqueur accepteur est l'iodure de 1,1'-dioctadécyl-3,3,3',3'-tétraméthylindotricarbocyanine (DiR).
Dans un autre mode de réalisation préféré de cette première variante, le marqueur fluorescent dormeur est l'iodure de 1,1'-dioctadécyl-3,3,3',3'-tétraméthylindotricarbocyanine (DiR) et le marqueur accepteur est le vert d'indocyanine (ICG). Dans une seconde variante de tous les modes de réalisation de l'émulsion fluorescente de l'invention, l'un au moins du marqueur fluorescent donneur et du marqueur accepteur est amphiphile et est lié à l'interface gouttelettes de phase huileuse-phase aqueuse en étant lié directement à la membrane des gouttelettes de phase huileuse. Dans une troisième variante de tous les modes de réalisation de l'émulsion fluorescente de l'invention, l'une au moins du marqueur fluorescent donneur et du marqueur accepteur est lié à l'interface gouttelettes de phase huileuse-phase aqueuse par liaison aux molécules de tensioactif. Dans cette variante et dans un premier mode de mise en oeuvre, le marqueur lié aux molécules de tensioactifs est lié à ces molécules de tensioactif par 25 une liaison covalente. Dans un second mode de mise en oeuvre de cette variante, le marqueur lié aux molécules de tensioactifs est lié à ces molécules de tensioactif par un pont disulfure ou un pont peptidique ou une liaison hydrazone. L'invention propose également l'utilisation d'une émulsion 30 fluorescente selon l'invention pour la fabrication d'un réactif de marquage pour le suivi de la délivrance d'un médicament ou d'une substance d'intérêt dans un milieu hôte. L'invention propose encore un réactif de marquage pour le suivi de la délivrance d'un médicament ou d'une substance d'intérêt dans un milieu hôte 35 comprenant une émulsion selon l'invention et un médicament ou une substance d'intérêt encapsulée dans les gouttelettes de phase huileuse.
L'invention propose aussi un réactif de marquage pour le suivi de la délivrance d'un médicament ou d'une substance d'intérêt dans un milieu hôte comprenant une émulsion fluorescente selon l'invention et un médicament ou une substance d'intérêt liée à l'un du marqueur fluorescent donneur et du marqueur accepteur. L'invention propose enfin l'utilisation d'une émulsion selon l'invention pour la fabrication d'un réactif de marquage pour l'imagerie optique par fluorescence. L'invention sera mieux comprise et d'autres avantages 10 caractéristiques de celle-ci apparaîtront plus clairement à la lecture de la description explicative qui suit. Une émulsion est un mélange de deux substances liquides non miscibles constitué d'une phase continue et d'une phase dispersée. Une substance est dispersée dans la seconde substance (phase continue) sous forme de gouttelettes 15 (phase dispersée). Le mélange reste stable grâce à l'action de molécules amphiphiles, appelées émulsifiants ou tensioactifs, qui se placent à l'interface entre les deux phases. Les émulsions sont des édifices supramoléculaires métastables. Ces structures sont à différencier des polymersomes et des micelles. Les polymersomes (famille comprenant les liposomes) sont des 20 vésicules de quelques dizaines à quelques milliers de nm de diamètre. Ces vésicules sont composées d'une ou de plusieurs bicouches de tensioactifs qui permet(tent) de séparer le milieu intravésiculaire du milieu extérieur, les deux milieux étant de même nature (aqueux). Les micelles consistent en des agrégats de tensioactifs 25 autoassemblés, de quelques nanomètres de diamètre. Les tensioactifs s'organisent de manière à orienter leur partie hydrophile vers l'extérieur (le solvant) et leurs chaînes hydrophobes vers le coeur de la micelle. Les émulsions ont déjà été utilisées pour la fabrication d'agents de contraste. Dans toutes ces émulsions, un marqueur est introduit pour permettre la 30 visualisation par la technique voulue. Ainsi, la demande de brevet U 2005/0079131 décrit des émulsions du type huile-dans-eau dans lesquelles les gouttelettes d'huile ont des diamètres moyens compris entre 10 et 200 nm, ce qui correspond à la définition généralement acceptée des termes nano-émulsion, ou mini-émulsion, ou émulsion ultrafine, ou 35 encore émulsion submicronique, dans laquelle un fluorophore est présent au sein de la souche de tensioactifs entourant les gouttelettes d'huile et permettant la stabilisation de l'émulsion. Outre le fait que dans cette demande de brevet, le fluorophore est un agent d'imagerie auxiliaire, l'agent d'imagerie principale étant un élément ayant un numéro atomique (Z) élevé, ce fluorophore n'est pas utilisé en combinaison avec un autre marqueur qui absorbe l'énergie lumineuse émise par le fluorophore. Or, l'invention pour résoudre les problèmes de signal parasite de fluorescence dus à l'auto-fluorescence des tissus humains et animaux, permettre l'emploi de différents marqueurs fluorescents simultanément, ou encore permettre de déterminer quand et si un produit, par exemple un médicament, est délivré dans un milieu hôte, utilise non seulement un fluorophore, appelé dans ce qui suit marqueur fluorescent donneur, mais également un marqueur accepteur, le marqueur donneur transférant son énergie lumineuse au marqueur accepteur, lequel marqueur accepteur restituera cette énergie soit sous la forme d'une fluorescence mais à une longueur d'onde différente de la longueur d'émission de la fluorescence du marqueur fluorescent donneur, soit sous la forme d'une énergie non lumineuse, par exemple sous la forme d'une énergie thermique.
Plus précisément, pour résoudre les problèmes cités ci-dessus, l'invention est basée sur le phénomène de transfert d'énergie de résonnance fluorescente, appelé FRET ou RET. Ce phénomène de transfert d'énergie est un processus non radiatif dans lequel un marqueur fluorescent donneur à l'état excité transmet son énergie de fluorescence à un marqueur accepteur placé à proximité immédiate (quelques nanomètres). Lorsque le marqueur accepteur est lui-même un fluorophore, il réémet l'énergie transférée par le marqueur fluorescent donneur également sous la forme d'une fluorescence. Dans ce cas le phénomène de FRET a notamment pour effet de diminuer la fluorescence du marqueur fluorescent donneur, et d'augmenter celle de l'accepteur et également de modifier la longueur d'ondes de fluorescence permettant la lecture par imagerie optique de fluorescence. Ce phénomène a également pour effet de modifier le temps de vie des fluorescences. Le changement de longueur d'onde de la fluorescence du marqueur fluorescent donneur est importante, en particulier lors de l'imagerie optique par fluorescence des tissus et d'humains. En effet, comme on l'a déjà dit, pour les tissus humains et d'animaux la fluorescence doit se faire dans le rouge ou le proche infrarouge, zone de longueur d'ondes dans laquelle le tissu sans marqueur fluorescent donneur a également une fluorescence propre. Grâce à l'utilisation du marqueur accepteur, la fluorescence est décalée vers le rouge. Et on peut filtrer la fluorescence est décalée dans des zones de longueur d'ondes (toujours dans le rouge ou le proche infrarouge) dans laquelle la fluorescence parasite des tissus est soit fortement diminuée, voire absente. On peut alors filtrer la fluorescence du marqueur accepteur avec des filtres passe-bande et/ou passe-haut et décaler dans une zone où le signal de fluorescence parasite des tissus est bien moins fort. On gagne ainsi en rapport signal souhaité/signal parasite. Mais, le marqueur accepteur peut également être ce que l'on appelle un quencher, c'est-à-dire un marqueur qui absorbe l'énergie lumineuse transmise transférée par le marqueur fluorescent donneur mais qui ne réémet pas cette énergie sous la forme d'énergie lumineuse de fluorescence. En fait, il absorbe l'énergie lumineuse et la restitue sous une autre forme d'énergie, par exemple une énergie thermique. Dans ce cas, la fluorescence du marqueur fluorescent donneur est, si ce n'est complètement stoppée est en tout cas, fortement inhibée, et ce que l'on détectera est la réapparition de la fluorescence du marqueur fluorescent donneur. Le phénomène de transfert d'énergie utilisé dans l'invention se produit lorsque deux conditions sont remplies : 1) le marqueur accepteur absorbe dans le domaine des longueurs d'ondes émises par le marqueur fluorescent donneur, et 2) le marqueur fluorescent donneur et le marqueur accepteur sont à proximité l'un de l'autre, mais sans être liés directement entre eux. L'introduction du marqueur fluorescent donneur et du marqueur accepteur dans une émulsion permet de satisfaire à la deuxième condition, en ce qu'elle permet, dans un premier mode de réalisation, d'encapsuler les marqueur fluorescent donneur et marqueur accepteur dans les gouttelettes d'huile (de phase huileuse), ce qui permet de les maintenir à une distance déterminée l'un de l'autre. Mais, un seul des marqueurs peut être encapsulé, l'autre étant lié soit directement soit indirectement à la membrane de la gouttelette d'huile dans laquelle l'autre marqueur est encapsulé. A nouveau, une distance adéquate est maintenue entre les deux marqueurs. Mais encore, les deux marqueurs peuvent être tous deux liés, directement ou indirectement, à la membrane de la même gouttelette d'huile, ce qui permet, encore une fois, de les maintenir à la distance adéquate l'un de l'autre. Pour que les deux marqueurs soient encapsulés dans la gouttelette d'huile, il faut que ces deux marqueurs soient lipophiles ou aient été rendus lipophiles, par greffage, par exemple, d'une chaîne grasse, ou encore qu'ils soient amphiphiles avec une forte solubilité dans la phase huileuse constituant les gouttelettes. Pour que le marqueur soit lié directement à la membrane, il faut qu'il soit amphiphile, ou ait été rendu amphiphile par greffage d'une chaîne lipophile ou d'une chaîne hydrophile, selon sa lipophilie ou son hydrophilie initiale, et que sa solubilité dans la phase huileuse ne soit pas suffisante pour le maintenir encapsulé dans la gouttelette de phase huileuse. Mais encore, les marqueurs peuvent être liés à la membrane de la gouttelette d'huile par l'intermédiaire des molécules de tensioactifs, qui sont eux de nature amphiphile, présents dans la couche tensioactive de l'émulsion pour la stabiliser. Cela est un avantage en particulier lorsque les marqueurs ou l'un des marqueurs est hydrophile.
La liaison à la molécule de tensioactif peut se faire soit par une liaison covalente soit encore par l'intermédiaire, par exemple, d'un pont disulfure, d'une liaison hydrazone ou d'un pont clivable. Un tel pont clivable peut être un pont disulfure qui a été rompu et qui est clivé par un changement de potentiel redox, il peut être également une liaison hydrazone qui est sensible à une modification du pH, ce qui plus est un avantage lorsque l'on cherche à visualiser des cellules tumorales qui ont souvent un pH plus acide que des cellules saines. On repère ainsi le caractère cancéreux des cellules, soit lorsque le marqueur accepteur est un marqueur non lui-même fluorescent, lorsqu'on le récupère le phénomène de fluorescence du marqueur fluorescent donneur, soit lorsque le marqueur accepteur émet lui-même une fluorescence, par la détection de la fluorescence du marqueur fluorescent donneur et non plus du marqueur accepteur. Le pont clivable peut également être un pont peptidique, par exemple clivable par les protéases comme les métalloprotéases, ou cathépsines qui peuvent être surexprimées dans certains modèles de tumeurs. En résumé, tout couple marqueur fluorescent donneur-marqueur accepteur peut être utilisé dans les émulsions de l'invention et ces marqueurs peuvent être chacun indépendamment l'un de l'autre, positionnés soit à l'intérieur dans gouttelettes d'huile, soit liés à la membrane de la gouttelette d'huile à sa surface externe, soit directement soit indirectement, à condition que le marqueur accepteur absorbe la longueur d'onde X2 d'émission du marqueur fluorescent donneur, qui lui- même absorbe une longueur d'onde X1 différente de 22. Le marqueur accepteur peut lui-même être un fluorophore et dans ce cas il doit émettre à une longueur d'onde 23 différente des longueurs d'onde X1 et X2. Dans la mesure où l'émulsion de l'invention est plus particulièrement destinée à être injectée dans des tissus dans un milieu hôte qui est un humain ou un animal, le marqueur fluorescent donneur doit absorber et émettre dans le domaine des longueurs d'onde du proche infrarouge, c'es-à-dire dans le domaine des longueurs d'onde compris entre 640 nm et 900 nm. Par conséquent, le marqueur accepteur doit lui également absorber dans ce même domaine des longueurs d'onde et, lorsqu'il est lui-même fluorescent, réémettre dans ce même domaine des longueurs d'onde.
De préférence également, les émulsions utilisées dans l'invention sont des nano-émulsions, c'est-à-dire que les gouttelettes d'huile auront une taille comprise entre 10 et 200 nm, et plus préférablement entre 10 et 80 nm inclus, pour permettre l'internalisation des émulsions dans les cellules de tissus humains animaux. Au sens de l'invention, le terme "gouttelette" englobe à la fois les gouttelettes d'huile proprement dites ainsi que les particules solides issues d'émulsion du type huile-dans-eau dans lesquelles l'huile utilisée est une huile cristallisable. Dans ce cas, on parle d'émulsion solide. Les huiles utilisables sont des huiles biocompatibles choisies parmi les huiles naturelles d'origine végétale ou animale, les huiles synthétiques et leurs mélanges. Ces huiles sont utilisées sans modification chimique ou physique 10 préalablement à la formation de l'émulsion. Parmi de telles huiles, on peut notamment citer les huiles d'origine végétale parmi lesquelles figurent notamment les huiles de soja, de palme, d'arachide, d'olives, de lin, de pépins de raisins et de tournesol ; les huiles d'origine animale parmi lesquelles figurent notamment les huiles de poissons ; les huiles synthétiques parmi 15 lesquelles figurent notamment les triglycérides, diglycérides et monoglycérides ; lesdites huiles pouvant être utilisées seules ou en mélanges. Ces huiles peuvent être de première expression, raffinées ou inter-estérifiées. Selon une forme de réalisation particulièrement préférée de 20 l'invention, ces huiles sont choisies parmi les huiles peu solubles dans l'eau, c'est-à-dire présentant une balance hydrophile-lipophile (HLB) généralement inférieure à 8 et encore plus préférentiellement comprise entre 3 et 6 telles que par exemple l'huile de soja. Selon un mode préférentiel, la phase huileuse est constituée au 25 moins à 10 % en poids d'une huile dont la viscosité est supérieure ou égale à 100 cP à 20°C (valeurs de viscosité tabulées par exemple dans le Handbook of Chemistry and Physics, CRC Press, 88`h Edition, 2007). La présence dans la phase huileuse d'une telle huile permet de conférer aux marqueurs formulés dans les émulsions, des durées de vie de fluorescence particulièrement adaptées à l'imagerie in vivo de fluorescence 30 résolue dans le temps. L'émulsion comprend des tensioactifs, et en particulier au moins un tensioactif amphiphile, pour former la couche tensioactive assurant la stabilisation des gouttelettes d'huile au sein de l'émulsion. Ces tensioactifs amphiphiles (comportant une partie solide) sont 35 généralement choisis parmi les composés dont la partie lipophile comprend une chaîne saturée ou insaturée, linéaire ou ramifiée, ayant de 8 à 30 atomes de carbone. Ils peuvent être choisis parmi les phospholipides, les cholestérols, les lysolipides, les sphingomyélines, les tocophérols, les glucolipides, stéarylamines, les cardiolipines d'origine naturelle ou synthétique ; les molécules composées d'un acide gras couplé à un groupement hydrophile par une fonction éther ou ester tels que les esters de sorbitan comme par exemple les monooléate et monolaurate de sorbitan vendus sous les dénominations Span par la société Sigma ; les lipides polymérisés ; les lipides conjugués à de courtes chaînes d'oxyde de polyéthylène (PEG) tels que les tensioactifs nonioniques vendus sous les dénominations commerciales Tween par la société ICI Americas Inc. et Triton par la société Union Carbide Corp. ; les esters de sucre tels que les mono- et di-laurate, mono- et di-palmitate, mono- et distéarate de saccharose ; lesdits tensioactifs pouvant être utilisés seuls ou en mélanges. Selon l'invention, le ou les tensioactifs amphiphiles sont de préférence des tensioactifs d'origine naturelle et assimilables (biocompatibles) comme la lécithine de soja, les phospholipides et le cholestérol. Le tensioactif amphiphile préféré dans l'invention est la lécithine.
L'émulsion de l'invention comprend, en combinaison avec le tensioactif amphiphile, un lipide solubilisant. Le lipide solubilisant permet la dissolution de quantités importantes de tensioactifs, en particulier du ou des tensioactifs amphiphiles. De ce fait, d'une part, il permet la préparation d'émulsions dont la phase dispersée présente un faible diamètre, c'est-à-dire de nanoémulsions, lorsque cela est voulu, et d'autre part et surtout, il permet la solubilisation d'un grand nombre de marqueurs dans l'émulsion de l'invention lorsque les marqueurs sont lipophiles ou amphiphiles et il permet le greffage d'un grand nombre de molécules de marqueurs sur les tensioactifs, en particulier les tensioactifs amphiphiles, car ceux-ci étant mieux solubilisés peuvent être présents en plus grand nombre. De ce fait, les propriétés optiques de l'émulsion sont améliorées. Le lipide solubilisant est un lipide présentant une affinité avec le tensioactif amphiphile suffisante pour permettre la solubilisation du tensioactif amphiphile. Lorsque le tensioactif amphiphile est un phospholipide, un lipide solubilisant approprié est un dérivé du glycérol et en particulier une glycéride obtenue par estérification de glycérol avec des acides gras. Le lipide solubilisant utilisé est avantageusement choisi en fonction du tensioactif amphiphile utilisé. Il présentera généralement une structure chimique proche, afin d'assurer la solubilisation recherchée. Il peut s'agir d'une huile ou d'une cire.
Les lipides solubilisants préférés, en particulier pour les phospholipides sont les glycérides d'acides gras, notamment d'acides gras saturés, et en particulier d'acides gras saturés comportant 8 à 18 atomes de carbone, encore préféré 12 à 18 atomes de carbone. De préférence, il s'agit de glycérides d'acides gras saturés comportant 0% à 20% en poids d'acides gras en C8, 0% à 20% en poids d'acides gras en Cl 0, 10% à 70% en poids d'acides gras en C12, 5% à 30% en poids d'acides gras en C14, 5% à 30% en poids d'acides gras en C16 et 5% à 30% en poids d'acides gras en C18. Particulièrement préférés sont les mélanges des glycérides semisynthétiques solides à température ambiante vendus sous la dénomination commerciale Suppocire NC par la société Gattefossé. Les Suppocire de type N sont obtenues par estérification directe d'acides gras et de glycérol. Il s'agit de glycérides hémi-synthétiques d'acides gras saturés de C8 à C18, donc la composition qualiquantitative est indiquée dans le tableau ci-dessous.
Tableau : Composition en acides gras du Suppocire NC de Gattefossé Longueur de chaînes [% en poids] C8 0,l à 0,9 C10 0,1 à 0,9 C12 25 à 50 C14 l0 à 24,9 C16 10 à 24,9 C 18 10 à 24,9 La quantité de lipide solubilisant peut varier largement en fonction de la nature et de la quantité de tensioactif amphiphile présent dans la phase huileuse. Comme on l'a vu, la nature des marqueurs utilisables dans l'émulsion de l'invention n'est pas critique à partir du moment où ils sont compatibles avec l'imagerie de fluorescence et dans le cas où ils sont utilisés sur des tissus humains ou végétaux, qu'ils absorbent et émettent à une longueur d'onde comprise entre 640 et 900 nm et qu'ils y ait un recoupement spectral entre l'émission du marqueur de fluorescence donneur et l'absorption du marqueur accepteur.
L'un au moins des marqueurs doit être un marqueur fluorescent, c'est-à-dire un fluorophore. De tels marqueurs peuvent être des analogues d'acides gras, sphingolipides, des stéroïdes, des polysaccharides, des phospholipides fonctionnalisés par un groupement absorbant et émettant dans le proche infrarouge et leurs dérivés amphiphiles. On peut citer plus particulièrement les dérivés des cyanines, des rhodamines, des fluorescéines, des coumarines, des squaraines, des azulènes, des xanthènes, des oxazines et des 4,4-difluoro-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacène ("boron dipyrromethene" en anglais), ainsi que dérivés amphiphiles desdits fluorophores. A titre d'exemple, on peut plus particulièrement mentionner les produits vendus sous les dénominations commerciales Bodipy 665/676 (Ex/Em.) par la société Invitrogen; les dérivés amphiphiles de dialkylcarbocyanines telles que le perchlorate de 1,1'-dioctadécyl-3,3,3',3'-tétraméthylindodicarbocyanine (DiD) vendu sous la référence D-307 par la société Invitrogen et l'iodure de 1,1'-dioctadécyl-3,3,3',3'-tétraméthylindotricarbocyanine (DiR) vendu sous la référence D-12731 par la société Invitrogen.
Selon une forme de réalisation préférée de l'invention, les fluorophores sont choisis parmi les dérivés amphiphiles de dialkylcarbocyanines. Le marqueur accepteur, lorsque lui-même fluorescent, peut être choisi parmi les mêmes composés que ceux cités ci-dessus pour le marqueur' fluorescent donneur, à condition qu'il soit compatible avec ce dernier.
Lorsque le marqueur accepteur n'est pas lui-même un marqueur fluorescent, toutes les molécules quencher peuvent convenir. A titre d'exemple, on peut citer, pour un effet d'inhibition ou d'élimination de la fluorescence d'un marqueur fluorescent donneur émettant dans le proche infrarouge : le Dabcyl et dérivés, Black Hole Quencher (BHQ) telles que BHQ 1, BHQ 2 ou BHQ 3 (Biosearch technologies), Nanogold Particules (Nanoprobes), Eclipse Dark Quencher (Epoch Bioscience), Elle Quencher (Orwell), Cy7Q (Amersham), FluoquenchTM tels que FluoquenchTM 670 et FluoquenchTM 680 (Interchim) et les colorants QSY tels que QSY 7, QSY 9 et QSY 21 (Molecular Probes). L'émulsion de l'invention comprend, de préférence, des co-25 tensioactifs, pour améliorer la stabilité de l'émulsion, et en particulier des co- tensioactifs de furtivité. De tels co-tensioactifs de furtivité sont de préférence des molécules amphiphiles dont la partie hydrophile est totalement ou en partie composée d'une chaîne d'oxyde de polyéthylène (PEO ou PEG) et dans laquelle le nombre de motifs 30 PEO varie de préférence entre 2 et 500. Les co-tensioactifs de furtivité peuvent aussi être composés de poly-saccharides de type dextrans par exemple. A titre d'exemple de co-tensioactifs de furtivité utilisables selon la présente invention, on peut en particulier citer les composés conjugués polyéthylèneglycol/phosphatidyléthanolamine (PEG-PE), les éthers d'acide gras et de polyéthylèneglycol tels que les 35 produits vendus sous les dénominations commerciales Brij (par exemple Brij 35, 58, 78 ou 98) par la société ICI Americas Inc., les esters d'acide gras et de polyéthylèneglycol tels que les produits vendus sous les dénominations commerciales Myrj par la société ICI Americas Inc. (par exemple Myrj 45, 52, 53 ou 59) et les copolymères blocs d'oxyde d'éthylène et d'oxyde de propylène tels que les produits vendus sous les dénominations commerciales Pluronic par la société BASF AG (par exemple Pluronic F68, F127, L64 ou L61) ou les produits vendus sous la dénomination commerciale Synperonic par la société Unichema Chemie BV (par exemple Synperonic PE/F68, PE/L61 ou PE/L64). Quant à la couche de tensioactifs situés à la périphérie des gouttelettes d'huile de l'émulsion de l'invention, celle-ci peut comprendre en outre au moins un agent de ciblage d'une activité biologique d'intérêt, ledit agent de ciblage étant constitué d'un co-tensioactif de greffage amphiphile dont la partie hydrophile est liée, de façon covalente, à un ligand biologique. La présence d'un agent de ciblage permet de cibler un processus biologique d'intérêt particulier. Selon une forme de réalisation avantageuse de l'invention, lesdits agents de ciblage sont choisisparmi les composés de formule (I) suivante : AùYI ù(Bi)n] r X2ù(Y2)qù(B2)m] P (I) dans laquelle : - A est la partie lipophile d'un co-tensioactif de greffage amphiphile (CoTA), - X1 et X2, identiques ou différents, constituent la partie hydrophile dudit co-tensioactif CoTA et sont composés d'un bras espaceur flexible choisi parmi les chaînes carbonées linéaires ou ramifiées, saturées ou insaturées, éventuellement substituées, interrompues et/ou terminées par un ou plusieurs hétéroatomes choisis par exemple parmi N, O, P et S, et/ou par un ou plusieurs groupements choisis par exemple parmi les radicaux alkyle en C1-C4, alcoxy en C1-C4, aryle ou par une ou plusieurs fonctions choisies parmi les fonctions éther, ester, amide, carbonyle, carbamate, urée, thiourée et disulfure ; - Y1 et Y2, identiques ou différents, sont choisis parmi les groupements chimiques aptes à relier X1 et B1, respectivement X2 et B2, par des liaisons covalentes ; - B1 et B2, identiques ou différents, sont des ligands biologiques dont l'une des extrémités est engagée dans la liaison covalente formée avec X1, respectivement X2 ; - n est un nombre entier compris entre 1 et 20 inclusivement ; - q est un nombre entier égal à 0 ou 1 ; - m est un nombre entier compris entre 0 et 20 inclusivement, étant entendu que m = 0 lorsque q = 0 ; - p est un nombre entier compris entre 0 et 10 inclusivement ; et - R est un nombre entier compris entre 0 et 10 inclusivement.
La partie lipophile (A) du co-tensioactif de greffage CoTA présent dans l'agent de ciblage de formule (I) lui permet de s'ancrer à la surface des gouttelettes d'huile au sein de la couche tensioactive périphérique. Elle peut notamment être composée d'une chaîne alkyle en C6-C26, linéaire ou ramifiée, saturée ou insaturée.
La partie hydrophile du CoTA constituant les bras espaceurs X1 et X2 des composés de formule (I) ci-dessus peut notamment être choisie parmi les chaînes constituées de motifs polyoxyéthylène ou dextran. Selon une forme de réalisation avantageuse de l'invention, les liaisons covalentes (groupements fonctionnels Y1/Y2) assurant la fixation de X1/X2 aux unités B1B2 sont issues de la réaction entre une fonction chimique initialement portée par la partie hydrophile du CoTA avant sa réaction avec B1/B2 et une fonction chimique complémentaire portée par les ligands biologiques B1/B2 avant leur réaction avec X1 respectivement X2. A titre d'exemple non limitatif et non exhaustif, on peut notamment citer les liaisons covalentes résultant de la réaction : - d'une amine et d'un ester activé, par exemple par un groupement N-succinimidyle conduisant à la formation de liaisons amide ; - d'une oxyamine et d'un aldéhyde conduisant à la formation de liaisons oxyme ; et - d'un maléimide et d'un thiol conduisant à la formation de liaisons 25 thioéther. Parmi les ligands biologiques utilisables à titre d'unités B1/B2 des agents de ciblage de formule (I) ci-dessus, on peut notamment citer : i) les ligands biologiques permettant de cibler spécifiquement certaines cellules tels que des peptides par exemple le peptide RGD (linéaire ou 30 cyclisé), leurs dérivés et leurs analogues (ex : le peptide octéotrate, analogue de la somatostatine, un analogue de la bombésine, de la neurotensine, l'EGF, le VIP...) ; des protéines, des anti-corps, leurs dérivés ou leurs analogues ; des monosaccharides tels que le glucose, des oligosaccharides, des polysaccharides, leurs dérivés et leurs analogues ; des oligonucléotides, ADN, leurs dérivés et leurs analogues ; des 35 molécules organiques telle que le folate, le pamidronate biphosphonaté et des complexes organométalliques dont l'activité de ciblage est due à la reconnaissance moléculaire de ces ligands par des récepteurs sur-exprimés à la surface des cellules de la zone d'intérêt ; ii) les ligands biologiques marqueurs d'une activité biologique donnée, par exemple d'une activité enzymatique. A titre d'exemple de tels ligands, on peut par exemple mentionner les peptides clivables par une protéase donnée, à l'extrémité desquels sera greffé un inhibiteur de la fluorescence du label. Ce type de ligands permet d'imager spécifiquement l'activité enzymatique de la protéase (C.H. Tung, pré-cité). Un autre exemple est constitué par les ligands biologiques comportant un pont disulfure séparant le label d'un inhibiteur de sa fluorescence. Un tel ligand biologique permet alors d'imager spécifiquement l'internalisation de la sonde dans une cellule comme décrit par exemple dans la demande de brevet FR 2 888 938. Le couplage des ligands biologiques sur les co-tensioactifs de greffage CoTA peut être réalisé soit avant l'émulsification soit après l'émulsification. Dans ce dernier cas, il faut que les réactions chimiques employées soient compatibles avec la stabilité colloïdale des émulsions. Elles doivent notamment se dérouler en solution aqueuse et à un pH ni trop acide ni trop basique (pH 5-11). La phase continue de l'émulsion conforme à l'invention est une phase aqueuse, de préférence constituée d'eau et/ou d'un tampon physiologiquement acceptable tel qu'un tampon phosphate comme par exemple du PBS ("Phosphate Buffer Saline") ou d'une solution de chlorure de sodium. L'émulsion conforme à l'invention peut être préparée par toute méthode classique connue de l'homme de l'art pour la préparation des émulsions, par exemple selon un procédé comprenant les étapes suivantes : a) la préparation d'un mélange huileux pour la phase dispersée de l'émulsion consistant à mélanger les différents constituants huileux biocompatibles dans un solvant organique tel que par exemple le chloroforme pour obtenir, après évaporation du solvant, un mélange huileux homogène pour la phase dispersée. Lorsque le marqueur fluorescent donneur et/ou le marqueur accepteur sont lipophiles, et sont à encapsuler dans les gouttelettes d'huile, ils sont ajoutés dans ce mélange huileux et mélangés de façon homogène. Le lipide solubilisant est également ajouté au mélange huileux, soit simultanément, soit séparément des marqueurs. Lorsque le marqueur fluorescent donneur et/ou le marqueur accepteur sont amphiphiles et ont une solubilité dans la phase huileuse suffisante, ils sont intégrés à cette étape a), b) la préparation de la phase continue de l'émulsion par mélange, en phase aqueuse, de préférence à chaud, d'au moins un tensioactif amphiphile, et de préférence d'au moins un co-tensioactif, en particulier de furtivité, et éventuellement d'au moins un agent de ciblage d'une activité biologique d'intérêt, ledit agent de ciblage étant constitué d'un co-tensioactif de greffage amphiphile dont la partie hydrophile est liée, de façon covalente, à un ligand biologique. Lorsque le marqueur fluorescent donneur et/ou le marqueur accepteur sont hydrophiles et sont à lier aux molécules de tensioactifs, en particulier du tensioactif amphiphile, ou sont amphiphiles et ont une solubilité faible dans la phase huileuse et sont à lier aux molécules de tensioactifs, ils sont ajoutés à cette étape b) du procédé de préparation, et c) l'ajout de la phase continue à la phase dispersée et l'émulsification du mélange résultant jusqu'à l'obtention d'une émulsion homogène dans laquelle le diamètre moyen des gouttelettes d'huile est de préférence supérieur à 10 nm. Cette émulsification peut par exemple être réalisée à l'aide d'un sonificateur, pendant une durée comprise entre 4 et 10 minutes. D'une manière générale : - lorsque le ou les marqueurs sont lipophiles, ils sont ajoutés dans le mélange huileux et ils seront encapsulés dans les gouttelettes d'huile, une fois l'émulsion formée, - lorsque le ou les marqueurs sont hydrophiles, ils sont ajoutés dans la phase continue aqueuse et ils seront liés aux molécules de tensioactifs dans 20 l'émulsion finale, et - lorsqu'ils sont amphiphiles, ils sont ajoutés dans la phase huileuse ou dans la phase continue aqueuse selon la phase dans laquelle ils sont le plus solubles. Lorsqu'ajoutés dans la phase huileuse en raison de leur bonne solubilité dans cette phase, s'ils ont un caractère lipophile suffisant, ils seront encapsulés dans les 25 gouttelettes d'huile de l'émulsion, une fois l'émulsion formée ; sinon ils seront liés à la membrane des gouttelettes d'huile par leur partie lipophile et leur partie hydrophile sera dans la couche tensioactive. Selon une forme de réalisation particulière, et lorsque la phase huileuse de l'émulsion est composée d'au moins une huile végétale ou animale et d'au 30 moins une huile cristallisable riche en glycérides d'acide gras en C8-C18, le tensioactif utilisé pour stabiliser l'émulsion peut être incorporé en totalité ou en partie à la phase dispersée lors de l'étape b) ci-dessus. Cette forme de réalisation permet d'éviter la formation de liposomes lors de la préparation de l'émulsion conforme à l'invention et est particulièrement avantageuse lorsque ledit tensioactif est de la lécithine de soja. 35 Avant son utilisation, l'émulsion est ensuite de préférence diluée, par exemple au demi et stérilisée par exemple par filtration. Cette étape de filtration permet par ailleurs d'éliminer les éventuels agrégats qui pourraient s'être formés au cours de la préparation de l'émulsion. Ainsi que cela a été amplement décrit et explicité ci-avant, les émulsions fluorescentes conformes à l'invention peuvent être utilisées en particulier 5 pour la détection d'une activité d'intérêt in vivo ou in vitro. La présente invention a donc pour deuxième objet, un réactif de marquage pour le suivi d'une activité d'intérêt, caractérisé par le fait qu'il comprend au moins une émulsion fluorescente conforme à l'invention et telle que décrite ci-dessus. Selon une forme de réalisation particulière et préférée de l'invention, 10 le réactif est un réactif de diagnostic in vivo. Enfin, l'invention a pour objet, l'utilisation d'au moins une émulsion fluorescente telle que décrite précédemment pour la préparation d'un réactif de marquage pour le suivi d'une activité d'intérêt in vivo par imagerie de fluorescence, et en particulier par imagerie de fluorescence résolue dans le temps (fluorescence pulsée) 15 et/ou pour l'aide au développement et à l'optimisation d'outils thérapeutiques, comme des médicaments. En effet, un tel réactif peut permettre : - la détection de cellules cancéreuses chez l'animal, éventuellement chez l'homme, par imagerie de fluorescence, préférentiellement par imagerie de fluorescence non invasive ; 20 - la détection de plaques d'athéromes chez l'animal, éventuellement chez l'homme, par imagerie de fluorescence, préférentiellement par imagerie de fluorescence non invasive. - la détection de fibres [3-amyloïdes caractéristiques des maladies neuro-dégénératives chez l'animal, éventuellement chez l'homme, par imagerie de 25 fluorescence, préférentiellement par imagerie de fluorescence non invasive. - le suivi in vivo de processus enzymatiques chez l'animal, éventuellement chez l'homme, par imagerie de fluorescence, préférentiellement par imagerie de fluorescence non invasive ; - le suivi in vivo de l'expression de gènes chez l'animal, par imagerie 30 de fluorescence, préférentiellement par imagerie de fluorescence non invasive. - l'évaluation d'une thérapie chez l'animal, par imagerie de fluorescence, préférentiellement par imagerie de fluorescence non invasive ; ou bien encore - le suivi de la biodistribution d'un médicament, ou d'un principe 35 actif, ou d'une substance d'intérêt, de sa délivrance contrôlée, de son efficacité, dans un milieu hôte. Par milieu hôte, on entend un humain, un animal, un végétal ou tout autre milieu synthétique ou naturel dans lequel le suivi de la distribution ou de la délivrance à la cible voulue est à suivre. Mais l'émulsion de l'invention peut également être utilisée dans de nombreuses autres applications telles que par exemple dans l'étude des nano- émulsions pour connaître leurs propriétés, par exemple le moment où elles éclatent ou leur cinétique de libération des marqueurs. Lorsque l'émulsion est utilisée pour l'imagerie optique par fluorescence dans des tissus humains ou animaux, le marqueur fluorescent donneur doit émettre et absorber dans le domaine des longueurs d'onde comprises entre 640 et 900 nm et le marqueur accepteur doit absorber dans ce même domaine. Lorsque le marqueur accepteur est lui-même fluorescent, alors il doit également émettre dans ce domaine de longueurs d'onde. Toujours dans ce cas, de préférence, les gouttelettes d'huile ont un diamètre moyen compris entre 10 et 200 nm inclus. Dans les autres cas, les longueurs d'onde d'émission et d'absorption des marqueurs sont bien entendu à déterminer en fonction du milieu hôte particulier. L'utilisation des émulsions de l'invention présente de nombreux avantages. Tout d'abord, elle permet de réduire le signal parasite dû à l'auto-fluorescence du milieu hôte, qui se produit en l'absence de marqueur fluorescent en décalant la fluorescence du marqueur accepteur dans des domaines de longueurs d'onde où l'auto-fluorescence du milieu hôte est plus faible. On gagne ainsi un rapport signal souhaité/signal parasite. Ensuite, on peut obtenir différentes informations, c'est-à-dire faire du multiplexage, c'est-à-dire marquer différemment certaines zones.
Pour cela, on injectera une première émulsion contenant seulement le marqueur fluorescent donneur, et une émulsion dans lequel le marqueur fluorescent donneur et un marqueur fluorescent accepteur approprié. En éclairant les images avec deux jeux de filtres, on peut retrouver chaque zone où se sont accumulées différentes émulsions. Les zones où il n'y a que la fluorescence du marqueur fluorescent donneur correspondent à une accumulation de l'émulsion correspondante alors que les zones dans lesquelles on ne voit que la fluorescence du marqueur accepteur correspondent aux zones d'accumulation de l'émulsion contenant le marqueur fluorescent donneur et le marqueur accepteur. On peut exciter les marqueurs avec le même laser dans une zone d'absorption commune aux deux marqueurs ou bien encore exciter à deux longueurs d'onde différentes pour n'exciter que le marqueur fluorescent donneur d'une part et le marqueur accepteur d'autre part, ce qui permet de plus d'obtenir une visualisation des zones dans lesquelles on ne voit que la fluorescence du marqueur accepteur. Selon la spécificité de chacun des marqueurs, les renseignements obtenus sont complémentaires. Pour le suivi de la délivrance d'une substance ou d'un médicament, on peut, par exemple, lier l'un des marqueurs à la substance ou au médicament et on encapsule ce marqueur lié au médicament ou à la substance avec l'autre marqueur dans la gouttelette d'huile. Lorsque le médicament (ou la substance) ou le marqueur libre quitte la gouttelette, il y a réapparition de la fluorescence du marqueur fluorescent donneur. Mais encore, pour chacun des composant, médicament ou substance, marqueur fluorescent donneur et marqueur accepteur, les trois localisations à l'intérieur de la gouttelette d'huile, liaison à la membrane de la gouttelette d'huile directement ou indirectement par l'intermédiaire de tensioactifs sont possibles. Pour toutes ces applications, un couple marqueur fluorescent donneur-marqueur accepteur préféré est un couple DiR-ICG. Le marqueur fluorescent donneur est l'iodure de 1,1'-dioctadécyl-3,3,3',3'-tétraméthylindotricarbocyanine (DiR) qui est lipophile et le marqueur accepteur est le vert d'indocyanine (ICG pour "Indocyanin Green") qui est amphiphile. Avec ce couple, une efficacité de FRET élevée supérieure à 80% a été obtenue. Un autre couple adapté particulièrement préféré de l'invention pour introduction dans l'émulsion de l'invention est un couple DiD-DiR. Dans ce couple, le marqueur fluorescent donneur est le perchlorate de 1,1'-dioctadécyl-3,3,3',3'-tétraméthylindodicarbocyanine (DiD) qui est lipophile, et le marqueur accepteur est l'iodure de 1,1'-dioctadécyl-3,3,3',3'-tétraméthylindotricarbocyanine (DiR) qui est également lipophile.
En excitant le fluorophore DiR à 635 nm avec un laser picoseconde et en enregistrant la fluorescence en fonction du temps, le transfert d'énergie du DiD vers le DiR a été mis en évidence. Quant aux concentrations respectives du marqueur fluorescent donneur et du marqueur accepteur, il apparaîtra clairement à l'homme de l'art que celles-ci doivent être au moins égales l'une à l'autre. Cependant, pour améliorer encore la proximité des deux marqueurs, et aussi pour augmenter les signaux de fluorescence du marqueur accepteur, lorsque le marqueur accepteur est lui-même un marqueur fluorescent, on préfère, dans les émulsions de l'invention, utiliser des concentrations en marqueur accepteur 20 à 10 fois supérieures à celles du marqueur fluorescent donneur.
Claims (16)
- REVENDICATIONS1. Emulsion fluorescente du type huile-dans-eau comprenant au moins une phase continue aqueuse dans laquelle des gouttelettes d'au moins une phase huileuse sont dispersées, lesdites gouttelettes de phase huileuse étant stabilisées par une couche tensioactive, caractérisée : - en ce qu'elle comprend au moins une paire de marqueurs formée d'un marqueur fluorescent donneur absorbant à une longueur d'onde X1 et émettant à une longueur d'onde X2 différente de et un marqueur accepteur absorbant à la longueur d'onde X2 d'émission du marqueur fluorescent donneur, - en ce que le marqueur fluorescent donneur et le marqueur accepteur sont maintenus à proximité l'un de l'autre par encapsulation d'au moins l'un d'entre eux dans les gouttelettes de phase huileuse et/ou par liaison d'au moins l'un d'entre eux à l'interface gouttelettes de phase huileuse-phase aqueuse, - et en ce qu'elle comprend des molécules d'au moins un tensioactif 15 amphiphile et d'au moins un lipide solubilisant.
- 2. Emulsion fluorescente selon la revendication 1, caractérisée en ce que le marqueur accepteur réémet l'énergie lumineuse émise par le marqueur fluorescent donneur sous forme d'énergie lumineuse ayant une longueur d'onde X3 différente des longueurs d'onde X1 et 12. 20
- 3. Emulsion fluorescente selon la revendication 1, caractérisée en ce que le marqueur accepteur ne réémet pas ou peu l'énergie lumineuse fournie par le marqueur donneur sous forme d'énergie lumineuse.
- 4. Emulsion fluorescente selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que les longueurs d'onde X1, X2 et X3 sont comprises 25 entre 640 et 900 nm inclus.
- 5. Emulsion fluorescente selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que les gouttelettes de phase huileuse ont un diamètre moyen compris entre 10 et 200 nm inclus.
- 6. Emulsion fluorescente selon l'une quelconque des revendications 30 précédentes, caractérisée en ce que le marqueur fluorescent donneur et le marqueur accepteur sont, chacun indépendamment l'un de l'autre, lipophiles ou amphiphiles, et en ce qu'ils sont maintenus à proximité l'un de l'autre par encapsulation dans les gouttelettes de phase huileuse.
- 7. Emulsion fluorescente selon l'une quelconque des revendications 35 1 à 5, caractérisée en ce que l'un au moins du marqueur donneur et du marqueur accepteur est amphiphile et est lié à l'interface gouttelettes de phase huileuse-phase aqueuse en étant directement lié à la membrane des gouttelettes de phase huileuse.
- 8. Emulsion fluorescente selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que l'un au moins du marqueur fluorescent donneur et du marqueur accepteur est lié à l'interface gouttelettes de phase huileuse-phase aqueuse par liaison aux molécules de tensioactif amphiphile.
- 9. Emulsion fluorescente selon la revendication 8, caractérisée en ce que le marqueur lié aux molécules de tensioactif est lié à ces molécules de tensioactifs par une liaison covalente.
- 10. Emulsion fluorescente selon la revendication 8, caractérisée en ce que le marqueur lié aux molécules de tensioactif amphiphile est lié à ces molécules de tensioactif par un pont disulfure ou un pont peptidique ou une liaison hydrazone.
- 11. Emulsion fluorescente selon la revendication 6, caractérisée en ce que le marqueur fluorescent donneur est le perchlorate de 1,1'-dioctadécyl-3,3,3',3'-tétraméthylindodicarbocyanine (DiD) et le marqueur accepteur est l'iodure de 1,1'-dioctadécyl-3,3,3',3'-tétraméthylindotricarbocyanine (DiR).
- 12. Emulsion fluorescente selon la revendication 6, caractérisée en ce que le marqueur fluorescent donneur est l'iodure de l,1'-dioctadécyl-3,3,3',3'-tétraméthylindotricarbocyanine et le marqueur accepteur est le vert d'indocyanine (ICG).
- 13. Utilisation d'une émulsion selon l'une quelconque des revendications 1 à 11 pour la fabrication d'un réactif de marquage pour le suivi de la délivrance d'un médicament ou d'une substance d'intérêt dans un milieu hôte.
- 14. Réactif de marquage pour le suivi de la délivrance d'un médicament ou d'une substance d'intérêt dans un milieu hôte caractérisé en ce qu'il comprend une émulsion selon l'une quelconque des revendications 1 à 12 et un médicament ou une substance d'intérêt encapsulé dans les gouttelettes de phase huileuse.
- 15. Réactif de marquage pour le suivi de la délivrance d'un médicament ou d'une substance d'intérêt dans un milieu hôte caractérisé en ce qu'il comprend une émulsion selon l'une quelconque des revendications 1 à 12 et un médicament ou une substance d'intérêt lié à l'un du marqueur fluorescent donneur et du marqueur accepteur.
- 16. Utilisation d'une émulsion selon l'une quelconque des revendications 1 à 12 pour la fabrication d'un réactif de marquage pour l'imagerie optique par fluorescence.
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