FR2914928A1 - Procede de preparation d'un support pour l'immobilisation d'une cellule, ledit support et ses utilisations - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne un procédé de préparation d'un support solide susceptible d'immobiliser au moins une cellule et/ou au moins une partie de cellule, ledit procédé comprenant une étape consistant à fixer audit support solide un composé fusogène capable de s'insérer dans les membranes cellulaires. La présente invention concerne également un procédé pour immobiliser au moins une cellule et/ou au moins une partie de cellule utilisant le support solide ainsi préparé, ledit support solide et ses utilisations dans le domaine du diagnostic biomédical ou de la surveillance sanitaire de fluides biologiques ou destinés à l'usage humain ou animal.

Description

PROCEDE DE PREPARATION D'UN SUPPORT POUR L'IMMOBILISATION D'UNE CELLULE,

LEDIT SUPPORT ET SES UTILISATIONS DESCRIPTION DOMAINE TECHNIQUE La présente invention relève de la biochimie, de la médecine, de la biologie, et en particulier de la biochimie analytique et du dosage immunologique. Plus particulièrement, la présente invention concerne la conception d'un instrument d'analyse et de diagnostic (puce d'analyse ou biocapteur) permettant d'examiner des échantillons de différente nature et notamment des échantillons biologiques. Cette puce d'analyse comprend un support, éventuellement fonctionnalisé par une matrice organique, un agent de pénétration tel qu'un composé fusogène capable de s'insérer dans les membranes cellulaires et éventuellement une cellule ou partie de cellule. La présente invention concerne le procédé de fabrication et l'utilisation d'un tel support pour un diagnostic biomédical et/ou pour une surveillance sanitaire. ÉTAT DE LA TECHNIQUE ANTÉRIEURE Lors d'échanges sanguins transfusionnels, un conflit peut survenir entre le produit du donneur et l'organisme receveur. La sécurité transfusionnelle doit assurer la compatibilité immunologique immédiate mais aussi prévenir l'incompatibilité de futures transfusions ; ceci est primordial d'un point de vue santé publique. Des transfusions mal contrôlées peuvent provoquer l'apparition d'anticorps dirigés contre les structures de surface des hématies (antigène) et ainsi entraîner une hémolyse qui peut conduire, lors d'une réaction immunitaire grave, au décès du patient. De même, il est fondamental de prévenir ou de surveiller toute immunisation non désirée. Ceci s'applique tout particulièrement aux immunisations foeto-maternelles. En effet, à la suite d'un premier accouchement une femme ne possédant pas l'antigène Rhésus D (phénotype RH D-) sur ses érythrocytes peut développer des anticorps dirigés contre cet antigène présent à la surface des hématies de son premier enfant (phénotype RH D+). Cette réaction immunologique se produit lors du contact entre le sang de la mère et celui de l'enfant lors de l'accouchement. Dans le cas d'une seconde grossesse (si le second enfant possède lui aussi l'antigène Rhésus D (RH D+)) un conflit immunologique grave pour la mère et le foetus peut se produire entraînant parfois la mort du foetus ou des problèmes chez le nouveau-né (cyanose : troubles d'oxygénation). Ainsi le test consistant à rechercher des anticorps irréguliers acquis secondairement (transfusion, grossesse, greffe) par un individu a une importance considérable. Ainsi, pour assurer le bon déroulement d'une transfusion sanguine, une recherche d'anticorps irréguliers (R.A.I.) systématique est réalisée en complément d'un phénotypage précis. Ces examens sont pratiqués dans tous les laboratoires d'analyses médicales et dans les centres de transfusion sanguine. Aussi, les examens immuno- hématologiques doivent être rapides et les plus fiables possibles. Depuis son introduction en 1945, le test de Coombs reposant sur l'hémaglutination (agrégation des globules rouges due à la multifonctionnalité des anticorps) demeure la technique de référence dans la recherche des anticorps irréguliers. Même si la technique en tube a été la première décrite, elle est progressivement remplacée par des techniques moins subjectives, plus sensibles et plus standardisées. Les techniques en gel ont été introduites en 1990 et sont commercialisées aujourd'hui par les sociétés Diamed et Ortho. Des techniques en phase solide, comme capture-R (Immucor), Ready Screen (Biotest) ou Biloba (Scibiex) sont également présentes sur le marché. Actuellement, la technologie en gel domine le marché de l'immunohématologie. Elle présente cependant un désavantage majeur en raison des difficultés d'automatisation. En effet, la forte augmentation des transfusions sanguines dans les milieux hospitaliers et l'accroissement considérable du nombre d'analyses de sang dans les laboratoires privés incitent les fabricants à automatiser leurs méthodes d'analyses sanguines.

Afin d'améliorer ces systèmes, il serait particulièrement intéressant d'élaborer un nouvel outil immunologique qui présenterait les qualités des tests actuels en apportant un maximum d'améliorations : • visualisation facile, directe et rapide de la liaison antigène-anticorps • une grande fiabilité, • la meilleure sensibilité possible, • une possibilité de miniaturisation et d'automatisation permettant de compiler de multiples tests en une seule analyse, • enfin un coût faible en mesure de concurrencer ses analogues le plus souvent jetables. L'utilisation de méthodes spectrales pourrait répondre à ces différents points en particulier au niveau de la rapidité, la simplicité et la sensibilité. De plus, la visualisation directe de l'interaction autoriserait une évaluation des constantes d'affinité des anticorps vis-à-vis des antigènes et permettrait ainsi une détermination et une quantification plus précise des immunoglobulines.

De nos jours, la plupart de ces impératifs peuvent être surmontés par l'utilisation de technologies visant à immobiliser des biomolécules. Ces dernières permettent alors la détection d'autres analytes cibles. Ces systèmes analytiques, connus sous le nom de biocapteurs, sont très étudiés dans les domaines de l'agroalimentaire, de l'environnement et tout particulièrement celui du biomédical avec les puces à ADN ou sur les puces à protéines, par exemple. Le problème majeur dans le cas de l'immobilisation de cellules sur un biorécepteur est la conservation de leurs propriétés biologiques. L'utilisation du couplage covalent d'une des biomolécules de surface de la cellule est rarement employée car les techniques de greffage affectent la viabilité cellulaire. Le plus souvent les cellules sont seulement adsorbées en surface du support. Parfois, la croissance cellulaire est réalisée directement sur l'électrode de mesure. Enfin, une technique plus complexe consiste à utiliser un anticorps dirigé contre un élément cellulaire reconnu et à lier cet anticorps au support. Cette technique est d'utilisation spécifique du fait de l'anticorps choisi qui détermine le (ou les) type(s) de cellules immobilisées. EXPOSÉ DE L'INVENTION La présente invention permet de résoudre les problèmes techniques cités ci-dessus dans l'exemple des anticorps irréguliers mais déclinables à de nombreux autres cas en proposant un outil qui se définit plus précisément comme un système analytique (biorécepteur) composé d'un élément biologique associé à un support solide et d'une chaîne de mesure (transducteur). Les propriétés de reconnaissance moléculaire de l'élément biologique confèrent une grande sélectivité et une grande affinité à l'interaction biomolécules / analyte cible. Cette dernière engendre un signal qui peut être traduit par différentes méthodes physico-chimiques en une mesure corrélable quantitativement et/ou qualitativement à l'analyte cible, lequel peut être un système biomoléculaire ou cellulaire.

Ainsi, la presente invention propose l'utilisation d'un système d'inclusion supramoléculaire pouvant pénétrer les membranes et ce, pour immobiliser des éléments cellulaires. Ceci représente une technique intermédiaire entre la simple adsorption et le couplage covalent non réalisable jusqu'à présent.

La présente invention permet une visualisation facile, directe et rapide de l'interaction liante ou non liante entre deux biomolécules avec une grande fiabilité, et la meilleure sensibilité possible. La possibilité de miniaturisation et d'automatisation permet de compiler de multiples tests en une seule analyse. De plus, la présente invention est remarquable de par le fait qu'elle est non seulement utile pour rechercher des anticorps irréguliers lors des transfusions sanguines mais qu'elle trouve des utilisations dans tout domaine biologique, médical, agroalimentaire et autre, susceptible de mettre en oeuvre une puce à cellules.

La présente invention concerne tout d'abord un procédé pour préparer un support solide susceptible d'immobiliser au moins une cellule et/ou au moins une partie de cellule, ledit procédé comprenant une étape consistant à fixer audit support solide un composé fusogène capable de s'insérer dans les membranes cellulaires.

Par composé fusogène , on entend dans le cadre de la présente invention tout composé qui peut s'ancrer dans une membrane phospholipidique telle qu'une membrane cellulaire et conduire à l'immobilisation de ladite membrane et donc à celle d'une cellule.

Dans le cadre de la présente invention, le composé fusogène peut être choisi parmi les composés fusogènes non peptidiques et les composés fusogènes peptiques. Par composé fusogène non peptidique , on entend toute molécule ne contenant ni acide aminé, ni analogue d'acide aminé et capable de s'ancrer dans une membrane phospholipidique telle qu'une membrane cellulaire et conduire à l'immobilisation de ladite membrane. Parmi ces composés fusogènes non peptidiques, sont notamment connus le motif glycosyl phosphatidylinositol (GPI) ou les motifs polyisoprène tels que le motif farnésyl (motif isoprène à 15 atomes de carbone) ou le motif géranylgéranyl (motif isoprène à 20 atomes de carbone). En effet, de nombreuses protéines de diverses fonctions, allant de la catalyse enzymatique à l'adhésion, sont attachées à la face externe de la membrane plasmique des cellules eucaryotes par un ancrage à un GPI. La phosphatase alcaline possède, au niveau de son extrémité C-terminale, un tel ancrage de structure bien définie (Ronzon, 2001, Thèse Université Claude Bernard-Lyon). L'isoprénylation est une modification posttraductionnelle qui ajoute un groupement farnésyl ou géranylgéranyl à une protéine présentant un motif particulier en position C-terminale (Maurer-Stroh et Eisenhaber, 2005, Genome Biology, vol. 6, R55). Par composé peptidique , on entend dans le cadre de la présente invention toute molécule constituée d'acides aminés ou d'analogues d'acides aminés telle que des peptides, des glycopeptides, des lipopeptides, des pseudopeptides ou des peptidomimétiques. Ces composés peptidiques fusogènes peuvent être linéaires ou ramifiés, comportant entre 5 et 50 acides aminés, notamment entre 7 et 40 acides aminés et, en particulier, entre 10 et 30 acides aminés.

Dans les séquences peptidiques de la présente invention, les acides aminés sont représentés par leur code à une lettre mais ils peuvent aussi être représentés par leur code à trois lettres selon la nomenclature ci-après .

A Ala alanine C Cys cystéine D Asp acide aspartique E Glu acide glutamique F Phe phenylalanine G Gly glycine H His histidine I Ile isoleucine K Lys lysine L Leu leucine M Met méthionine N Asn asparagine P Pro proline Q Gln glutamine R Arg arginine S Ser sérine T Thr thréonine / Val valine W Trp tryptophane Y Tyr tyrosine Dans une première forme de mise en oeuvre de la présente invention, le composé peptidique fusogène utilisé est un peptide basique issu de protéines virales, de facteurs de transcription, de toxines ou de peptides. Plusieurs peptides basiques dérivés de protéines virales, de facteurs de transcription et de toxines, possèdent la capacité de traverser les membranes sans les altérer (Thoren et al., 2000, FEBS Lett., vol. 482, pages 465-8). Ceci a conduit à l'élaboration du premier vecteur basique de 16 aminoacides appelé Pénétratine (Demande internationale WO 97/12912). Ce peptide dérive de l'homéodomaine d'un facteur de transcription de Antennapedia drosophilia. Ses propriétés particulières permettent son utilisation en tant que vecteur de transport de substances actives hydrophiles à l'intérieur des cellules. Plusieurs autres vecteurs d'internalisation sont également connus tels que ceux décrits dans la demande internationale WO 99/07728. Dans une seconde forme de mise en oeuvre de la présente invention, le composé peptidique fusogène utilisé est un peptide dont la composition en acides aminés est riche en acides aminés hydrophobes i.e. riche en alanine, isoleucine, leucine, méthionine, phénylalanine, tryptophane, tyrosine, valine. Avantageusement, le composé peptidique fusogène comprend au moins 40%, notamment au moins 50% et, en particulier, au moins 60% d'acides aminés hydrophobes par rapport au nombre total d'acides aminés de sa séquence. De tels peptides fusogènes sont avantageusement des peptides dérivés de peptides signaux et, plus particulièrement, du domaine hydrophobe de ces derniers ou des peptides fragments de protéines membranaires notamment de virus tels que le VIH (virus de l'immunodéficience humaine), le HTLV (virus du lymphome humain à cellules T), le MLV (virus de la leucémie murine) et le virus de Herpes.

Le composé peptidique fusogène selon la présente invention est avantageusement choisi dans le groupe constitué par les peptides présentant les séquences suivantes . - AVGIGALFLGFLGAAGSTMGARS (SEQ ID NO. 1 dans la liste de séquences en annexe) correspondant à la séquence comprise entre les acides aminés 519 et 541 à l'extrémité N-terminale de la protéine Gp41 du VIH, - RQIKIWFQNRRMKWKK (SEQ ID NO. 2 dans la liste de séquences en annexe) correspondant à la séquence de la 3ieme hélice de l'homéodomaine du facteur de transcription Antennapedia, peptide également connu sous le nom de Pénétratine, - TAALRLGIKLTQHYFGLLTAFGSNFGTIG (SEQ ID NO. 3 dans la liste de séquences en annexe) correspondant à la séquence du domaine fusogène interne de la protéine F1 du virus du Sendai, peptide SV201 dans l'article de Ghosh et al., 2000, Biochem., vol. 39, pages 11581-92 ; - MMIMLGAICAIIVVVIVIVFFT (SEQ ID NO. 4 dans la liste de séquences en annexe) correspondant à la séquence transmembranaire de la protéine Vamp du système SNARE intervenant dans l'exocytose, -RGGRLSYSRRRFSVSVGR (SEQ ID NO. 5 dans la liste de séquences en annexe) correspondant à un 30 peptide dérivé des protégrines et, plus particulièrement, au peptide SM1738 de la demande internationale WO 99/07728, - C (Acm) GRKKRRQRRRQC avec C(Acm) = Cysacétamidométhyle (SEQ ID NO. 6 dans la liste de séquences en annexe) correspondant au peptide d'internalisation basique TA-T du VIH, leurs dérivés et leurs fragments. La présente invention envisage d'utiliser des dérivés des peptides fusogènes définis ci-dessus.

Par dérivé des peptides fusogènes , on entend des peptides qui présentent 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% et/ou 95% d'identité avec les séquences des peptides fusogènes préférés données ci-dessus. Les dérivés des peptides fusogènes peuvent également présenter, par rapport aux séquences des peptides fusogènes données ci-dessus, au moins un acide aminé supplémentaire en partie C-terminale et/ou en partie N-terminale, une modification post-traductionelle et/ou une modification chimique en particulier une glycosylation, une amidation, une acylation, une acétylation, une méthylation, ainsi que les peptides qui portent un groupement protecteur qui permet d'éviter leur dégradation. Les dérivés des peptides fusogènes peuvent également être ceux dont un ou plusieurs acides aminés sont choisis dans le groupe constitué par des énantiomères, des diastéréoisomères, des acides aminés naturels de conformation D, des bêta acides aminés, des acides aminés alpha substitués, des acides aminés rares notamment l'hydroxyproline, l'hydroxylysine, l'allohydroxylysine, la 6-N-méthyllysine, la N-éthylglycine, la N-méthylglycine, la N-éthylasparagine, l'alloisoleucine, la N-méthylisoleucine, la N-méthylvaline, la pyroglutamine, l'acide aminobutyrique et des acides aminés synthétiques notamment l'ornithine, la norleucine, la norvaline, la cyclohéxyl-alanine et les oméga-acides aminés. Les dérivés des peptides fusogènes couvrent selon l'invention également les rétropeptides et les rétroinversopeptides, de même que les peptides dont la chaîne latérale d'un ou plusieurs acides aminés est substituée par des groupements qui ne modifient pas l'activité fusogène desdits peptides fusogènes. Les fragments des peptides fusogènes préférés présentent avantageusement plus de 5 acides aminés, notamment plus de 10 acides aminés ou encore plus de 15 acides aminés. Il est clair que les dérivés et les fragments des peptides fusogènes susceptibles d'être mis en oeuvre dans le cadre de la présente invention doivent également présenter une activité fusogène. Il sera facile pour l'homme du métier de vérifier la présence de cette activité notamment en utilisant la technique décrite dans la partie expérimentale ci-après. Les peptides fusogènes, leurs dérivés et leurs fragments peuvent être des produits naturels, des produits recombinants obtenus selon des techniques de biologie moléculaire et de génie génétique bien connues de l'homme du métier ou être synthétisés chimiquement selon des techniques telles que la synthèse en phase solide ou liquide également bien connues de l'homme du métier.

Dans le cadre de la présente invention, le support solide sur lequel le composé fusogène est fixé est notamment un support solide inorganique.

Avantageusement, le support solide selon la présente invention est choisi dans le groupe constitué par les verres, le quartz, les silices, les céramiques (par exemple, de type oxyde), les métaux (par exemple, aluminium, chrome, cuivre, zinc, argent, nickel, étain ou or) et les semi-conducteurs (par exemple, silicium, germanium, IT0). Dans une autre variante de l'invention, le support solide ou la surface dudit support solide est en un matériau organique comme un polymère ou une résine incluant le nylon, le polyéthylène glycol, les polycarbonates, les polyfluoropolymères ou les composites. Ledit support solide peut se présenter sous diverses formes de taille variable. A titre d'exemples et de façon non exhaustive, il peut se présenter sous forme de lames, de microplaquettes, de particules, de billes ou de microcanaux de type capillaires. Ces différents types de support peuvent avoir des tailles variant de quelques centaines de micromètres à plusieurs centimètres.

Dans une première forme de mise en oeuvre de la présente invention, le support solide présente une surface portant des groupements fonctionnels (ci-après désignée par surface fonctionnalisée ). De façon avantageuse, ces groupements fonctionnels sont choisis parmi les groupements hydroxyles, des entités radicalaires, les fonctions alcools, amines ou thiols.

Cette fonctionnalisation peut être intrinsèque à la nature du matériau en surface du support solide mis en oeuvre. De façon alternative, cette fonctionnalisation peut être obtenue par nettoyage de ladite surface par l'intermédiaire d'au moins un solvant, détergent, rayonnement ou plasma d'oxygène ou tout autre procédé permettant la formation de groupements fonctionnels tels que précédemment définis. Dans une première variante de la présente invention, le composé fusogène peut être lié de façon directe au support solide fonctionnalisé ou non. Dans une seconde variante de la présente invention, la liaison entre le composé fusogène et le support solide fonctionnalisé ou non est indirecte et réalisée au travers d'agent de jonction. Dans cette forme de mise en oeuvre, un support solide fonctionnalisé est avantageusement choisi. Dans cette seconde variante, au moins un agent de jonction est greffé préalablement à la surface dudit support solide.

Ce (ou ces) agent(s) de jonction assure(nt) ensuite la fixation des composés fusogènes sur le support solide et notamment sur les supports solides dont la surface est inorganique. L'homme du métier connaît différents agents de jonction utilisables. A titre d'exemple et de façon non exhaustive, cette forme de mise oeuvre correspond au cas d'un support recouvert d'une couche mince d'un polymère siloxane de type polyéthylène polyéthylèneglycol ou de la polylysine (D ou L) permettant de fixer le composé fusogène. Par polymère , on entend une répétition d'un certain nombre de motifs monomériques avantageusement compris entre 2 et 30. Dans une variante toute particulière de la présente invention, la fixation indirecte du composé fusogène sur le support solide est réalisée au moyen d'une monocouche autoassemblée organisée d'un ou de plusieurs composés organiques ou organométalliques (Si, Sn, Ge) possédant une chaîne alkyle terminée par un groupe fonctionnel. Ces groupes fonctionnels sont, à titre d'exemple, un hydroxyle, un amino, un carboxyle, un halogène ou un thiol ainsi que leur formes modifiées, notamment des formes activées ou protégées. Ulman a décrit dans Chem. Rev., 1996, vol. 96, pages 1533-54, la formation de monocouches autoassemblées de type alkyltrichlorosilanes fonctionnalisés. Leur utilisation pour la fixation d'acides nucléiques a été décrite dans la demande de brevet FR 2 804 129. Ainsi, dans le cadre de la présente invention, la monocouche autoassemblée organisée comprend un ou plusieurs composés organosiliciés répondant à la formule I suivante : Xi \ X2 l i (CH2)n Am g X3 dans laquelle n est compris entre 3 et 40, m est compris entre 0 et 50, XI, X2, X3 qui peuvent être identiques ou différents entre eux sont sélectionnés dans le groupe constitué par des groupes alkyles saturés en Cl à C6r linéaires ou ramifiés, et des groupements (I) hydrolysables, au moins l'un de XI, X2 et X3 représentant un groupement hydrolysable, - A représente le groupement -0- (CH2CH2O) k-(CH2)2- dans lequel k est compris entre 0 et 100, et i 5 un nombre entier supérieur ou égal à 0 - dans le cas où m = 0 alors B représente un groupement ûOCOR, -OR, -COOR ou un atome d'halogène, R représentant un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle en C1 à C6r linéaire ou ramifié. 10 - dans le cas où m = 1 • si k = 0 et i = 0, alors B représente un groupement R1 • si k = 0 et i ? 1, alors B représente un groupement -ORI, -OCORI, -NRIR2r -COORI, -CONRIR2, -SRI ou 15 un atome d'halogène, • si k ? 1 et i = 0, alors B représente un groupement -CORI, -COORI, -CONRIR2, • si k ? 1 et i ? 1, alors B représente un groupement -ORI, -OCORI, -NRIR2r -COORI, -CONRIR2, -SRI ou 20 un atome d'halogène. RI et R2 peuvent être identiques ou différents représentant un atome d'hydrogène, une chaîne hydrocarbonée éventuellement substituée, saturée ou insaturée et linéaire ou ramifiée comprenant 1 à 24 25 atomes de carbone ou un groupement aromatique. Lorsque B représente un groupement -ORI, -OCORI ou -COORI, indifféremment des valeurs de i et lorsque k ? 1 alors il est bien entendu que B peut représenter tout groupement résultant de la protection 30 d'une fonction hydroxyle ou acide carboxylique tels que les groupements protecteurs décrits dans Protective groups in organic system (T. W. GREENE et al., 2 ed, Wiley lnterscience), par exemple un groupe protecteur cyclique. Au sens de la présente invention, on entend par hydrolysable tout groupe capable de réagir avec un acide en milieu aqueux de façon à donner les composés X1H, X2H ou X3H, XI, X2, X3 étant tels que définis dans la formule I. Selon un mode de mise en oeuvre avantageux, ledit groupement hydrolysable est sélectionné dans le groupe constitué par les atomes d'halogène, le groupement ûN(CH3)2 et les groupements ûOR', R' étant un groupe alkyle saturé en Cl à C6 linéaire ou ramifié. On entend par halogène aussi bien le 15 fluor que le chlore, le brome ou l'iode. Une monocouche autoassemblée organisée formée sur un support solide permet l'obtention d'une surface organique dense, homogène et de paramètres bien définis à la fois chimiquement et structurellement. La 20 formation de cette monocouche, obtenue grâce aux propriétés d'autoassemblage des composés de formule I pour des valeurs de n, m, k, et i bien définies est parfaitement reproductible pour un ou chaque composé organosilicié ou pour des mélanges de plusieurs 25 composés aussi bien en terme de quantité qu'en terme de répartition en surface du support. Cette fonctionnalisation est stable dans le temps et les molécules greffées présentent une bonne orientation vis-à-vis des molécules biologiques. Ces paramètres de 30 distribution des organosiliciés sur le support solide sont déterminés et suivis par différentes méthodes optiques telles que l'imagerie vibrationnelle, la microscopie à force atomique, l'ellipsométrie.... En outre, la formation d'une monocouche autoassemblée organisée, très dense protège les liaisons siloxaniques vis-à-vis des traitements chimiques (acides ou basiques notamment), ce qui permet de réaliser des réactions chimiques variées sur la surface du support. Les composés organosiliciés de formule I utilisés dans la présente invention présentent avantageusement des fonctionnalités très variées et une grande réactivité, eu égard à la nature du groupe A et la diversité des groupements B terminaux utilisables, ces groupements B pouvant bien entendu être modifiés et fonctionnalisés à volonté selon les réactions de chimie organique bien connues de l'homme du métier. Que la liaison du composé fusogène audit support solide soit directe ou indirecte, les liaisons impliquées entre le composé peptidique, le support solide et/ou l'agent de jonction sont choisies parmi les liaisons covalentes, ioniques, électrostatiques ou toute interaction chimique forte sans dégradation des liaisons siloxaniques développées entre les composés organosiliciés et le support solide.

Ainsi, dans le cadre de la présente invention, le procédé pour préparer un support solide susceptible d'immobiliser au moins une cellule ou au moins une partie de cellule comprend avantageusement les étapes suivantes :

a) la préparation d'un support solide tel que précédemment défini, modifié par une monocouche autoassemblée comprenant au moins un composé organosilicié répondant à la formule I telle que précédemment définie, ledit composé organosilicié présentant à son extrémité un halogène, une fonction hydroxyle, acide ou amine, protégée ou non, activée ou non, b) éventuellement, la déprotection de la 10 fonction terminale dudit composé organosilicié utilisé à l'étape (a), c) éventuellement, dans le cas où le support solide modifié porte des fonctions acide carboxylique terminales, l'activation de ces fonctions, 15 d) éventuellement, la déprotection des chaînes latérales et de l'amine terminale du composé peptidique fusogène tel que précédemment défini, e) éventuellement, dans le cas où le support solide modifié porte des fonctions hydroxy ou 20 amine terminales, l'activation de la fonction acide carboxylique terminale du composé peptidique fusogène tel que précédemment défini, f) la mise en contact du support solide modifié obtenu aux étapes (a), (b) ou (c) par 25 immersion, pendant une durée déterminée, avec une ou plusieurs solutions, dans un ou plusieurs solvants polaires, du (ou des) composé(s) peptidique(s) tel(s) que précédemment défini(s) à immobiliser, g) éventuellement, le lavage du support sur 30 lequel sont immobilisés ledit (ou lesdits) composé(s) peptidique(s) suite à l'étape (f).

L'étape (b) de traitement peut par exemple être un traitement basique et éventuellement par ultrasons afin d'éliminer les composés organosiliciés seulement adsorbés en surface.

Les étapes (c) et (e) d'activation des fonctions acide carboxylique peuvent par exemple être effectuées à l'aide d'une solution de N-hydroxysuccinimide ou de carbodiimide, ou encore tout autre réactif d'activation convenable et connu de l'homme du métier. L'étape (f) est réalisée dans des conditions de température de 0 à 70 C et dans une gamme de pression satisfaisante. Au cours de l'étape (f), il est bien entendu que, pour solubiliser les composés peptidiques, toute solution permettant une bonne solubilité de ces derniers et un contrôle de l'évaporation de lasolution sera utilisée. La fixation des composés peptidiques au cours de l'étape (f) pourra être suivie par différentes méthodes optiques ou spectroscopiques (vibrationnelle, UV visible), imagerie Infra-Rouge ou Raman, Microscopie à force atomique, ellipsométrie... Les composés peptidiques fusogènes susceptibles d'être utilisés aux étapes (d), (e) ou (f) peuvent être utilisés seuls ou en mélange. Lors de l'étape (g) de lavage notamment dans un bain d'eau osmosée, le support sur lequel les composés peptidiques sont greffés peut être soumis à des ultrasons et ce, pour éliminer, sans fragiliser la couche greffée, les composés peptidiques seulement adsorbés sur le support.

La présente invention concerne également un procédé pour immobiliser au moins une cellule et/ou au moins une partie de cellule. Ce procédé comprend les étapes suivantes . a') la préparation d'un support selon un procédé tel que défini précédemment, b') la préparation d'une suspension cellulaire contenant au moins une cellule ou au moins une partie de cellule, c') la mise en contact du support solide tel que préparé à l'étape (a') par immersion pendant une durée indéterminée dans la suspension cellulaire préparée à l'étape (b'), d') au moins un lavage du support obtenu à l'étape (c') sur lequel est immobilisée ladite cellule ou ladite partie de cellule. La préparation d'une suspension cellulaire à l'étape (b') est avantageusement réalisée en diluant les cellules ou parties de cellule dans un tampon susceptible de conserver l'intégrité des cellules et des membranes cellulaires. Préalablement à cette étape (b'), les cellules peuvent être soumises à différents traitements tel qu'une centrifugation, un lavage ou une concentration. Ces cellules et parties de cellules comme des membranes cellulaires sont telles que décrites ci-après. L'étape (c') est avantageusement réalisée dans des conditions de température allant de 0 à 50 C et de pression convenable.

Dans le cadre de la présente invention, on entend par cellule , aussi bien une cellule de type procaryote que de type eucaryote. Parmi les cellules eucaryotes, la cellule peut être une levure telle qu'une levure du genre Saccharomyces ou Candida, une cellule de mammifères, une cellule végétale ou une cellule d'insectes. Les cellules de mammifères peuvent notamment être des cellules tumorales, des cellules de lignée somatique normale ou des cellules souches. Il peut s'agir de manière non exclusive de globules rouges, d'ostéoblastes, de cellules neuronales, d'hépatocytes, de cellules musculaires, des lymphocytes ou de cellules progénitrices. Les cellules de type procaryote sont des bactéries qui peuvent être des gram + ou -. Parmi ces bactéries, on peut citer, à titre d'exemples et de façon non-exhaustive, les bactéries appartenant aux embranchements des spirochètes et des chlamydiae, les bactéries appartenant aux familles des entérobactéries (telles que Escherichia coli), des streptococcacées (telles que streptococcus), des microccacées (telles que staphylococcus), des légionelles, des mycobactéries, des bacillacées et autres. Les cellules mises en oeuvre dans le cadre de la présente invention peuvent être obtenues à partir d'une culture cellulaire primaire ou d'une culture d'une lignée cellulaire ou à partir d'un échantillon d'un fluide tel que de l'eau ou un fluide biologique préalablement extrait d'un corps humain ou animal, ledit échantillon pouvant avoir subi différents traitements préalables comme une centrifugation, une concentration, une dilution .... Par partie de cellule , on entend dans le cadre de la présente invention notamment l'intégralité ou une portion de la membrane cellulaire dans laquelle le composé fusogène et notamment le peptide fusogène, ses dérivés ou ses fragments tels que précédemment définis viennent s'ancrer. Par membrane cellulaire , on entend dans le cadre de la présente invention aussi bien la membrane plasmique riche en phospholipides des cellules eucaryotes (également appelée membrane cytoplasmique, plasmalemme ou membrane plasmatique) que la membrane plasmique et la paroi cellulaire glucidique (contenant du peptidoglycane) des bactéries ou des cellules de plantes. Les parties de cellules mises en oeuvre dans le cadre de la présente invention peuvent être obtenues à partir de cellules issues d'une culture cellulaire ou d'un échantillon d'un fluide tels que précédemment définis. L'homme du métier connaît différentes techniques permettant d'obtenir, à partir de cellules ou de cultures cellulaires, des membranes cellulaires, des parties de membranes cellulaires, des fractions riches en membranes cellulaires telles que la technique de partage de phase.

La présente invention concerne également un support solide susceptible d'être préparé par le procédé de préparation selon l'invention et/ou susceptible d'être obtenu après immobilisation d'une cellule et/ou partie de cellule sur ce dernier. La présente invention concerne aussi un kit de diagnostic contenant au moins un support solide selon l'invention. Dans une première forme de mise en oeuvre, la présente invention concerne un support solide tel que précédemment défini sur lequel est fixé un composé fusogène capable de s'insérer dans les membranes cellulaires, ledit composé étant éventuellement ancré dans au moins une cellule et/ou au moins une partie de cellule telles que précédemment décrites. Le support selon cette première forme de mise en oeuvre est remarquable de par le fait qu'il peut être conservé avant toute utilisation. Il peut notamment être congelé, séché ou lyophilisé. L'homme du métier connaît différentes techniques de conservation n'affectant pas la structure protéique du composé fusogène fixé sur ledit support. Dans une seconde forme de mise en oeuvre, la présente invention concerne un support solide tel que précédemment défini sur lequel est fixé un composé fusogène capable de s'insérer dans les membranes cellulaires, ledit composé étant ancré dans au moins une cellule et/ou au moins une partie de cellule telles que précédemment décrites. Dans cette forme de mise en oeuvre, on peut parler d'un support solide activé i.e. activé par les cellules ou parties de cellule ancrées sur ledit support au moyen du composé fusogène. Le support objet de la présente invention décrit permet une immobilisation rapide, simple, reproductible, aspécifique, homogène, d'éléments cellulaires donnés et peut être utilisé pour la détection : de cellules venant s'immobiliser grâce aux composés fusogènes décorant le support solide (première forme de mise en oeuvre ci-dessus), - d'anticorps ou de ligands respectivement spécifiques d'antigènes ou de récepteurs présents sur les cellules ou parties de cellule immobilisées sur le support solide (seconde forme de mise en oeuvre ci-dessus), - de composés à activité thérapeutique potentielle en les testant sur des cellules ou parties de cellule immobilisées sur le support solide, par exemple, des cellules cancéreuses (seconde forme de mise en oeuvre ci-dessus). La présente invention trouve une application particulièrement intéressante dans le domaine du diagnostic biomédical ou de la surveillance sanitaire de fluides biologiques ou destinés à l'usage humain ou animal. La présente invention se rapporte à l'utilisation, pour l'immobilisation d'éléments biomoléculaires ou cellulaires, d'un support solide éventuellement modifié par une monocouche assemblée organisée d'un ou plusieurs composés organométalliques 25 tels que, par exemple, les organosiliciés et aux procédés d'analyse par des méthodes optiques ou spectroscopiques de ces éléments biologiques. Par conséquent, la présente invention concerne l'utilisation d'un support solide tel que 30 précédemment défini dans le cadre d'une veille sanitaire. En effet, les différents composés fusogènes 20 susceptibles d'être utilisés s'insèrent dans la membrane cellulaire de façon aspécifique. Il est donc possible d'utiliser le support présentant le composé fusogène dans le cadre d'une veille sanitaire visant à vérifier la présence ou non de cellules contaminantes du type bactéries dans un fluide. La présente invention permet de concentrer la cible pour la rendre décelable. Cette veille sanitaire peut notamment consister en un contrôle de la qualité microbiologique de l'eau ou en un contrôle microbiologique industriel. La présente invention concerne l'utilisation d'un support solide tel que précédemment défini et/ou d'un procédé d'immobilisation d'au moins une cellule et/ou partie de cellule sur un support solide dans la recherche d'anticorps et/ou de ligands respectivement spécifiques d'antigènes ou de récepteurs présents à la surface des cellules ou parties de cellule fixées audit support. Cette forme de mise en oeuvre est particulièrement intéressante dans le cas de la recherche d'autoanticorps lorsqu'il y a suspicion de maladie auto-immune telle que la maladie de Hashimoto ou dans la cas de la recherche d'anticorps irréguliers acquis secondairement notamment en vue d'une transfusion sanguine. Dans cette forme de mise en oeuvre particulière, deux variantes peuvent être envisagées . - soit sont fixés, au support solide via le composé fusogène, des érythrocytes dont le groupe et/ou le phénotypage sont connus et le support solide ainsi activé est mis en présence d'un fluide préalablement extrait d'un individu tel qu'un mammifère dont on cherche à définir le groupe et/ou le phénotypage, ledit fluide étant avantageusement du sérum sanguin, - soit sont fixés, au support solide via le composé fusogène, des érythrocytes d'un individu tel qu'un mammifère dont on cherche à définir le groupe et/ou le phénotypage sanguin et le support solide ainsi activé est mis en présence d'un fluide contenant au moins un anticorps anti-rhésus ou dirigé contre l'antigène défini.

La détection d'un anticorps sur la cellule ou partie de cellule peut être effectuée par différentes méthodes optiques ou spectroscopiques (vibrationnelle, UV visible), imagerie Infra-Rouge ou Raman, Microscopie à force atomique, ellipsométrie...

En effet, tous ces différents composants possèdent des signatures spectrales caractéristiques permettant leur détection. Il est possible de réaliser un système de détection différentiel permettant d'observer la présence ou non de biomolécules fixées, de façon spécifique, sur les éléments cellulaires ou de cellules elles-mêmes ancrées au support solide via le composé fusogène. La mise en oeuvre de telles techniques de détection est un travail de routine pour l'homme du métier.

A titre d'exemple, un montage simple de transmission Infra-Rouge calibré dans le domaine de fréquence caractéristique des groupes amides permettra d'obtenir rapidement le pourcentage de biomolécules fixées en comparaison à des échantillons non exposés ou non reconnus. II est aussi envisageable par l'intermédiaire de microscopie Infra-Rouge de réaliser une cartographie en imagerie du support ainsi traité. Il est donc possible de réaliser une puce par nanotechnologie et ainsi obtenir une multitude de détections pour cibler un très grand nombre d'échantillons.

D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention apparaîtront encore à la lecture des exemples ci-après donnés à titre illustratif et non limitatif et faisant référence aux figures annexées. BRÈVE DESCRIPTION DES DESSINS La figure 1 est une représentation schématique de la synthèse en phase solide des peptides 1 et 2. Les étapes de déprotection et couplage sont répétées pour chaque acide aminé à incorporer. La durée d'un cycle est de 2 à 3 heures. La figure 2 présente le rapport entre le spectre Infra-Rouge de matériaux en verre greffés par deux agents de jonction (composés ou bras organiques C et D) avant et après traitement à la potasse après soustraction du spectre du verre brut. La figure 3 est une représentation schématique de la fixation indirecte d'un peptide sur un support solide via un bras de jonction.

La figure 4 présente le rapport entre le spectre Infra-Rouge de matériaux en verre greffés par les agents de jonction C et D puis par le peptide 1 après soustraction du spectre du verre brut. La figure 5 présente le rapport entre le spectre Infra-Rouge des différents matériaux (verre + composés C et D (bras) ; verre + bras + peptide 1 ; verre + peptide 1) ayant ou non subi un traitement par les ultrasons après soustraction du spectre du verre brut. La figure 6 présente le rapport entre le spectre Infra-Rouge de matériaux en verre greffés par les agents de jonction C et D puis par le peptide 2 après soustraction du spectre du verre brut. La figure 7 présente les clichés de microscopie photonique de différents supports verre mis en contact avec une suspension cellulaire puis rincés. Les clichés des figures 7A et 7B correspondent respectivement : - à un verre fonctionnalisé par l'agent de couplage que sont les agents de jonction C et D puis par le peptide 1, - à un verre fonctionnalisé par l'agent de couplage que sont les agents de jonction C et D puis par le peptide 2. La figure 8 est une représentation schématique du biorécepteur tel que visualisé sur le cliché de la figure 7B sur lequel sont fixés des anticorps spécifiques des antigènes membranaires des érythrocytes. La figure 9 présente les clichés de microscopie électronique à balayage de différents supports silicium oxydé mis en contact avec une suspension cellulaire puis rincés. Les clichés des figures 9A à 9D correspondent respectivement : à un support silicium oxydé après traitement UV, - à un support silicium fonctionnalisé par les agents de jonction C et D, - à un support silicium fonctionnalisé par les agents de jonction C et D puis par le peptide 1, - à un support silicium fonctionnalisé par les agents de jonction C et D puis par le peptide 2. EXPOSÉ DÉTAILLÉ DE MODES DE RÉALISATION PARTICULIERS 1. Synthèse peptidique.

Deux peptides synthétisés au laboratoire ont été utilisés : - le peptide fusogène 519-541 correspondant à l'extrémité NH2 de la protéine Gp41 du virus du V.I.H. (peptide 2) dont la séquence est la suivante : AVGIGALFLGFLGAAGSTMGARS (SEQ ID NO: 1 dans la liste de séquences en annexe), - le peptide de synthèse, issu de la protéine Gp46 du virus H.T.L.V.-1 (peptide 1) dont la séquence (séquence 242-261) est la suivante : SPNVSVPSSSSTPLLYPSLA (SEQ ID NO: 7 dans la liste de séquences en annexe). Le peptide 1 est particulièrement intéressant. En effet, il existe un anticorps spécifiquement dirigé contre ce peptide 1 (appelé DB4), ce qui permet d'évaluer la conservation de sa fonctionnalité après greffage.

Une synthèse peptidique en phase solide (S . P. P. S .) selon la stratégie Fmoc a été utilisée pour synthétiser ces deux peptides.

Selon la stratégie S.P.P.S., la synthèse s'effectue de façon récurrente à partir du premier aminoacide, ancré sur le support solide par sa fonction carboxylique (étape 1, Figure 1). Le groupement 9-fluorénylméthoxycarbonyle Fmoc (baso-labile) est utilisé pour la protection temporaire de la fonction a-aminée. La libération de cette fonction est l'étape suivante de la synthèse (étape 2). Le deuxième aminoacide, dont la fonction î-carboxylique a été préalablement activée, est couplé avec le groupe aamino libre de l'aminoacide immobilisé sur la résine (étape 3). Les étapes 2 et 3 sont répétées pour chaque résidu à incorporer. Les synthèses ont été réalisées dans les conditions standards du protocole Fmoc à l'aide d'un synthétiseur automatique et en débutant la chaîne de réaction par un aminoacide greffé sur une résine de type Wang. Les réactions de couplage ont été effectuées dans la N-méthylpyrrolidone (NMP), solvant aprotique polaire qui permet une solvatation maximale de l'ensemble peptide-résine. Cette résine présente un taux de présubstitution d'environ 0,5-0,75 mmol.g-1. Elle est constituée de billes de polystyrène réticulé avec 1% de divinylbenzène et fonctionnalisée par l'alcool p-benzyloxybenzylique (bras) qui permet la liaison au premier aminoacide.

II. Préparation du support fonctionnalisé. II.1. Préparation du support en verre au greffage.

Le support solide choisi est un support inorganique en verre ayant subi un traitement permettant l'obtention d'une surface propre et réactive.

En effet, il est nécessaire d'effectuer un nettoyage efficace avant tout greffage, nettoyage qui ne doit toutefois pas altérer la nature de la surface. Pour cela, un détergent alcalin Hellmanex II a été employé afin d'optimiser le nettoyage. L'état de surface du matériau est observé en moyen Infra-Rouge par transmission après une immersion de 15 minutes à 50 C dans une solution aqueuse d'Hellmanex à 2%. Le matériau est ensuite rincé à l'aide d'eau osmosée, puis un traitement à l'aide de jets d'eau osmosée est appliqué systématiquement. L'analyse des plaques après ce nettoyage a permis de constater la disparition des bandes caractéristiques de la pollution organique (groupements CH3 (2955 et 2875 cm-1) et CH2 (2920 et 2850 cm-1)) .

II.2. Préparation des composés organiques. Après conditionnement du support solide en verre au greffage, des bras organiques destinés à fonctionnaliser ledit support ont été synthétisés.

L'utilisation de bras d'une longueur supérieure à 17 carbones a été choisie afin d'obtenir des couches denses entraînant une bonne protection de la liaison siloxanique (Si-O-Si) tout en conservant une bonne réactivité de la fonction terminale. Des molécules trichlorosilylées, de longueur suffisante et possédant une extrémité fonctionnelle, ne sont pas commerciales.

La synthèse de bras possédant de telles propriétés et notamment une fonction alcool pour l'extrémité fonctionnelle permettant la fixation ultérieure d'un peptide a été entreprise. a. Synthèse de l'acétate de docos-21-ènyle. i. Docos-21-èn-1-ol. La réaction fréquemment utilisée pour obtenir une longue chaîne carbonée est le couplage de deux chaînes via deux carbones sp3. Les réactions d'hétérocouplages sont réalisées entre un réactif de Grignard et un halogénure en utilisant un catalyseur à base de cuivre par exemple du LiCuC14 ou de l'iodure de cuivre I.

Le docos-21-èn-1-ol est de formule : C22H440 MM = 324,60 g.mol-1 Première étape : Formation du 11-bromo magnésium-1-undécène A une solution de THF anhydre contenant 2,7g (107 mmoles) de magnésium sous forme de tournures, est ajoutée, goutte à goutte, une solution de 5g (21,4 mmoles) de 11-bromo-l-undécène dans 21 ml de THF. Cette réaction est réalisée sous atmosphère inerte.

L'exothermie de la réaction est régulée à l'aide d'un bain de glace. Puis, 5 ml de dibromoéthane sont ajoutés à ce mélange. La réaction est maintenue active pendant une heure et le surnageant est prélevé à l'aide d'une seringue puis placé dans un ballon sous atmosphère inerte. Deuxième étape : Formation de l'alcoolate de lithium A une solution de THF anhydre sont ajoutés 5,4g (21,4 mmoles) de 10-bromo-undécanol. La solution est placée à -78 C sous atmosphère inerte, puis à l'aide d'une ampoule équi-pression, 0,71 ml (23,45 mmoles) de méthyl-lithium est ajouté puis la réaction est laissée progressivement revenir à température ambiante. Troisième étape : Formation du docos-21-èn-1-ol A la solution contenant le 11-bromo-magnésium-1-undécène refroidie à -78 C, 0,21g (1,1 mmoles) d'iodure de cuivre est additionné. La solution contenant le dérivé lithien y est ajoutée goutte à goutte par l'intermédiaire d'une canule. Le mélange est agité pendant une heure à cette température, puis 15 heures à température ambiante. La réaction est arrêtée par addition de 40 ml d'éthanol absolu ; un précipité noir se forme. Ce dernier est accentué par l'ajout de 3 ml d'HCl 10%. Après filtration sur fritté 1, la solution limpide obtenue est extraite trois fois à l'aide de diéthyl-éther. La phase éthérée restante est alors lavée à l'eau puis avec une solution saturée en NaHCO3. La phase organique est alors récupérée, séchée sur MgSO4 puis concentrée par évaporation des solvants sous pression réduite. Le résidu restant est finalement reprécipité dans l'acétone anhydre. Après filtration sur fritté 4, 4,86g (rdt = 70%) de docos-21-èn-1-ol sont obtenus.

ii. Acétate de docos-21-ènyle.

L'extrémité OH du docos-21-èn-1-ol est ensuite acétylée par l'anhydride acétique dans du dichlorométhane pour conduire à l'acétate de docos-21-ènyle de formule : C24H46O2 MM = 366,63 g.mol-1 A 2g (6 mmoles) de docos-21-èn-1-ol sont ajoutés 20 ml de pyridine anhydre. Après quelques minutes d'agitation, la solution est refroidie par un bain de glace et 0, 7 ml (7,2 mmoles) d'anhydride acétique est ajouté. Après retour à température ambiante, la solution est agitée pendant 12 heures. La pyridine est alors co-évaporée à l'aide de toluène anhydre, puis le résidu est noyé dans 30 ml de dichlorométhane. Cette solution est lavée 3 fois à l'aide d'une solution aqueuse saturée en hydrocarbonate de sodium. Les phases organiques sont rassemblées après séchage sur MgSO4r les solvants sont évaporés sous pression réduite. Une poudre blanche est récupérée. Après purification par chromatographie sur colonne de gel de silice avec comme éluant un mélange dichlorométhane / méthanol (98/2, v/v), 1,34g (rdt = 62%) d'acétate de docos-21-ènyle ci-après désigné composé organique A sont récupérés sous forme d'une huile translucide qui durcit et blanchit à température ambiante.

b. Synthèse du 1-0-acétyl-10-0-[1-docos-21- ényl] triéthylèneglycol. i. Tosylate de docos-21-ène. L'activation de l'extrémité hydroxyle du docos-21-èn-1-ol, par action de chlorure de tosyle en présence de triéthylamine dans le dichlorométhane à température ambiante a permis d'obtenir du tosylate de docos-21-ène de formule : O I I OùS 20 029H5o03S MM = 478,77 g.mol-1 A une solution de 4g (12 mmoles) de docos-21-én-1-al dans 4 ml de triéthylamine anhydre et 30 ml de dichlorométhane anhydre, sont ajoutés, sous azote et à température ambiante, 4,6g (24 mmoles) de chlorure de tosylate lui-même dilué dans 30 ml de dichlorométhane.

Le mélange jaunâtre est agité pendant 12 heures. Après filtration sur fritté 4 et évaporation des solvants sous pression réduite, le résidu est purifié par chromatographie sur colonne de gel de silice avec comme éluant le dichlorométhane à 100%. 3,4g (rdt = 60%) de tosylate de docos-21-ène sont récupérés.

ii . 2- (2- (2- (docos-21-enyloxy) ethoxy) ethoxy)ethanol.

A 1,9g (12,6 mmoles) de triéthylène glycol en solution dans 30 ml de THF anhydre sont additionnés 83mg (2,1 mmoles) d'hydrure de sodium à 60% dans l'huile. Après 15 minutes d'agitation sous azote, 1g (2,1 mmoles) du composé 6 en solution dans 40 ml de THF est ajouté goutte à goutte. Le mélange est alors porté au reflux du THF pendant 12 heures. Après retour à température ambiante, la solution est filtrée sur fritté 4, les solvants sont évaporés et le résidu est purifié par chromatographie sur colonne de gel de silice avec comme éluant un mélange dichlorométhane / méthanol (98/2, v/v). Est récupéré 0,64g (rdt = 67%) de 2-(2-(2-(docos-21-enyloxy)ethoxy)ethoxy)ethanol de formule . C28H5604 MM = 456,75 g.mol-1

iii . 2- (2- (2- (docos-21-enyloxy) ethoxy) ethoxy)ethyl acetate 20 Dans une solution de 20 ml de dichlorométhane est dissous 0,5g (1 mmole) de 2-(2- (2-(docos-21-enyloxy)ethoxy)ethoxy)ethanol, puis 0,26 ml (2,7 mmoles) d'anhydride acétique est ajouté. La solution est agitée sous azote pendant une heure puis 25 au reflux du dichlorométhane pendant 12 heures. Après retour à température ambiante, la solution est extraite 3 fois à l'aide 50 ml de dichlorométhane. La phase organique est ensuite lavée 3 fois à l'aide d'une solution aqueuse saturée en hydrocarbonate de sodium.15 Après séchage sur MgSO4 et évaporation des solvants sous pression réduite de la phase organique, une pâte jaunâtre est récupérée. Après purification par chromatographie sur colonne de gel de silice avec comme éluant un mélange dichlorométhane / méthanol (98/2, v/v), est récupéré 0,45g (rdt = 90%) de 1-0-acétyl-l0-0-[1-docos-21-ényl] Triéthylèneglycol (ou acétate de 2-[2-(2-docos-21-ényloxy-éthoxy)-éthoxy]-éthyle) ci-après désigné composé organique B de formule : o 20 C3oH58O5 MM = 498,79 g.mol-1

c. Hydrosilylation des composés organiques A et B. 15 Les composés organiques A et B possèdent à l'une de leurs extrémités une insaturation. Cette double liaison a été fonctionnalisée à l'aide de chlorosilane pour fixer dans un deuxième temps ces bras au support de verre. 20 Cette hydrosilylation a été effectuée par réaction du trichlorosilane sur A et B dans du toluène en présence du catalyseur de Kârsted. Le composé organique A (200mg (0,5 mmole)) est placé dans un tube de Schenck ayant été 25 préalablement purgé par commutation alternative entre une rampe à vide et une rampe argon. Après addition de 2 ml de toluène fraîchement distillé, la solution est soumise à une agitation, sous argon, jusqu'à complète dissolution du solide. Puis 300111 de trichlorosilane10 fraîchement distillé sont ajoutés ainsi que 2 gouttes du catalyseur de Kârsted. La solution devenue jaune pâle est agitée 2 heures à 40 C. Après évaporation sous pression réduite, un solide brut est obtenu puis est utilisé dans l'état dans l'étape de greffage. Ce solide correspond à l'acétate de 22-(trichlorosilanyl)-docosyle ci-après désigné composé organique C de formule .

C24H47C1302S1 502,08 g.mol-1

A partir du composé organique B et dans les mêmes conditions opératoires, est obtenu le composé 15 organique D correspondant au 1-0-Acétyl-10-0-[22-(trichlorosilanyl)-docosyl] triéthylèneglycol de formule . ÇI O CI-/ L -2~ O ~/~Off/~/~Off\ Cl C30H59C13O5Si 634,24 g.mol1 20 d. Greffage des composés organiques sur le support verre. Après avoir validé le greffage exclusif du composé C puis celui du composé D, a été entrepris le 25 greffage en mélangeant les deux types de composés et en utilisant un mélange équimolaire dans le but d'obtenir une surface présentant une densité moyenne de sites actifs vis-à-vis du peptide. Ainsi, après nettoyage, les matériaux en verre sont introduits dans un réacteur. Cette enceinte permet de sécher le matériau à une température contrôlée en évitant toute contamination organique postérieure au nettoyage ; celle-ci est fréquemment rencontrée lors des séchages en étuve. Ce type de réacteur à double enveloppe sera également utilisé pour réaliser l'étape de silanisation qui doit se dérouler sous atmosphère inerte et à température fixe. Ceci est possible à l'aide d'un système externe de refroidissement avec régulateur thermique.

Les composés chlorosilylés C et D (concentration finale de chaque composé 6.10-3 M) sont solubilisés dans le mélange hexane/chloroforme, 90/10. Cette solution dite de "silanisation" est alors introduite dans le réacteur où se trouvent les matériaux. Le schéma 1 ci-après présente la réaction de greffage sur verre du composé C. G1 0 O O [ 0ùCùCH3 F0_iO__CH3 OH + CI CsH 2 HCC10 CI 20 Plaque de verre Schéma 1 Après une nuit d'immersion, les matériaux 25 sont retirés de l'enceinte et plongés dans un bain d'eau osmosée soumis à des ultrasons sur une durée de cinq minutes. Ce type de traitement permet d'éliminer 90/10 9 les composés organosiliciés seulement adsorbés sur le support sans fragiliser la couche greffée. L'étape suivante est la déprotection de la fonction OH par saponification des composés C et D fixés sur support en utilisant la potasse alcoolique à 0,5 M. Les matériaux sont immergés dans cette solution de KOH pendant 20 minutes. Les supports sont ensuite retirés etles impuretés sont éliminées par 3 traitements successifs de 3 minutes par ultrasons dans un bain d'eau osmosée. Les matériaux sont alors séchés sur papier adsorbant. Le schéma 2 ci-après correspond à la réaction de déprotection de la fonction ester après greffage du composé C. I O O II O-si O-C-OH3 O Zo 01 OùSi \ ~OH 20 KOH O Schéma 2 De plus, en présence d'un greffage hétérogène, KOH pénètre au sein de la couche greffée, et rompt les liaisons liant les bras organosiliciés à la surface. Dans le cas d'un greffage homogène, les molécules de cette base forte ne trouvent pas d'espace entre les molécules greffées pour atteindre la surface. Le greffage du matériau inorganique restera donc intact. L'utilisation de potasse alcoolique permet donc aussi de tester l'homogénéité du greffage. Afin de valider le greffage des composés C et D, ont, tout d'abord, été observées les variations d'hydrophobie / hydrophilie de la surface par l'étude de l'angle de contact d'une goutte d'eau avant, après réaction de silanisation et après saponification. Les résultats de cette analyse de la mouillabilité sont présentés au Tableau 1.

Nombre de Angle moyen obtenu Type tests ( ) Verre brut 35 Moyenne 11,66 Ecart-type 2,61 Verre greffé Moyenne 74,06 avant traitement 30 KOH Ecart-type 2,70 Verre greffé Moyenne 51,12 après traitement 30 2,73 KOH Ecart-type Tableau 1 Une forte augmentation de l'angle de contact après le greffage (verre brut versus verre traité) est obtenue, ce qui confirme la présence d'une couche aliphatique hydrophobe apparue en surface. De plus, après traitement à la potasse alcoolique, la baisse de cet angle validant le passage à une surface rendue plus hydrophile après élimination de la fonction ester. Ce type d'analyse est donc un bon indicateur de la variation de l'état de surface. Cependant afin d'obtenir des informations plus précises sur les éléments greffés, une analyse par Infra-Rouge en transmission a été réalisée afin de caractériser le nombre d'onde correspondant aux groupements CH2 des chaînes aliphatiques des composés C et D greffés. Les spectres obtenus sont présentés sur la Figure 2.

L'analyse confirme la présence en surface de la longue chaîne aliphatique par l'observation des bandes caractéristiques des liaisons CH2 (Vas = 2923cm-1, VS = 2853cm-1) De plus, l'intensité des bandes obtenues ici (ADO = 3.10-3) est comparable à la simulation effectuée d'une monocouche d'arachidate sur verre (ADO = 2,5.10-3). Ceci semble donc bien indiquer la formation en surface du support d'une monocouche des composés C et D. La couche greffée est suffisamment compacte et dense pour empêcher la pénétration de la potasse alcoolique au sein de la couche. Sur la Figure 3, on observe également un décalage du spectre après traitement à la potasse alcoolique vers les basses fréquences. Ainsi, il semble que la présence du groupe ester avant saponification ne permet pas aux chaînes de s'orienter les unes par rapport aux autres. Après traitement à la potasse alcoolique, la disparition de cet ester terminal entraîne une réorganisation des chaînes à l'intérieur de la couche. Le support verre a donc été fonctionnalisé par les deux types de composés C et D de façon à obtenir une surface fonctionnelle à faible densité de sites actifs.

II.3. Fixation du peptide 1. Chaque support fonctionnalisé est placé dans un pilulier à large col, dans lequel se déroule le greffage. Un micro barreau aimanté est ajouté afin d'assurer l'agitation. Ces piluliers sont eux-mêmes placés dans le réacteur qui est ensuite fermé puis purgé par commutation alternative entre une rampe à vide et une rampe argon. Les supports se trouvent donc sous atmosphère inerte. Sont ajoutés 8 ml de solvant de greffage à chaque pilulier situé dans le réacteur et l'agitation est lancée. Puis est ajoutée au matériau la solution dite d'activation comportant, par unité de support, 2 mmol de HOBt et 2 mmol d'iodure de [3-(N- éthylcarbodiimide)-N-propyl]triéthylammonium (DiPC) mis en solution, sous atmosphère inerte, dans 1 ml de solvant de greffage (eau osmosée à 9 g/1 de NaCl). La solution peptidique (par support, 1 mmol de peptide 1 mis en solution sous argon dans 1 ml de solvant de greffage) est ajoutée, goutte à goutte, très lentement, sous agitation, au support préalablement immergé dans la solution d'activation. La réaction suit toujours le protocole réactionnel présenté sur la Figure 3.

L'agitation est maintenue 30 minutes puis arrêtée. Les supports restent immergés pendant 20 heures. Les matériaux sont ensuite retirés des piluliers et les molécules non fixées de façon covalente sont éliminées par ultrasons, par traitements successifs de 2 minutes dans de l'eau osmosée puis sont analysées comme précédemment. Le spectre obtenu est présenté sur la Figure 4. L'observation du spectre met en évidence les bandes caractéristiques de l'amide Iç (vco) et l'amide II (combinaison entre la VCN et la V NH). Ceci laisse envisager la présence du peptide 1 en surface des plaques. Les plaques de verre obtenues lors des différentes expériences ont été analysées par Infra- Rouge en mode Réflexion spéculaire et les spectres obtenus sont présentés Figure 5. Ainsi l'analyse de ces spectres révèle la présence de peptides seulement sur les plaques préalablement greffées par les composés C et D. Ceci confirmerait l'hypothèse d'un greffage covalent et non d'une simple absorption. Ainsi, les supports fonctionnels réalisés permettent la fixation de façon covalente de peptides d'intérêt biologique.

II.4. Fixation du peptide 2. Le peptide 2 synthétisé selon la méthode décrite précédemment a été fixé en utilisant le même protocole que celui pour le peptide 1. Seule l'eau osmosée à 9 g.l-1 de NaCl présente dans les solvants de greffage et d'activation a été remplacée par de l'hexafluoropropan-2-ol qui permet de solubiliser les peptides hydrophobes. Les supports verre ainsi obtenus sont analysés par Infra-Rouge en mode réflexion spéculaire par la méthode P.M.I.R.R.A.S. (Figure 6). Les bandes caractéristiques des amides I et II confirment que le peptide 2 a bien été greffé selon le protocole décrit sur support verre.

III. Vérification des propriétés biologiques des peptides fixés.

Des tests ELISA ont été réalisés afin de vérifier les propriétés biologiques et notamment l'accessibilité de l'épitope et la reconnaissance spécifique d'anticorps pour les peptides fixés.

Ces tests ont notamment été réalisés pour le peptide 1 spécifiquement reconnu par l'anticorps DB4 en utilisant comme contrôle négatif un anticorps appelé BF6, dirigé contre une protéine du système du complément humain et ne reconnaissant pas le peptide 1.

De plus, l'interaction antigène-anticorps dans le cas du peptide 1 et de l'anticorps DB4 a été observée par spectrométrie Infra-Rouge en transmission.

IV. Association d'érythrocytes au support.

A été utilisé du sang obtenu auprès de l'Etablissement Français du Sang et correspondant à un culot d'hématies conservé en tampon C.P.D. (Citrate Phosphate Dextrose). 1 ml de ce sang est prélevé, mis en solution dans 15 ml de tampon PBS 1X puis centrifugé 5 min à 2500 tours/min. Le culot récupéré est ensuite remis en suspension dans ce même tampon. Cette opération, renouvelée trois fois, permet l'élimination d'une grande proportion des protéines plasmatiques et ce, afin de favoriser l'immobilisation cellulaire. Différents supports en verre placés dans les puits d'une plaque 6 puits ont été ensuite immergés dans une solution d'érythrocytes à 1% dans du tampon PBS pendant 1 heure 30 sous faible agitation. Les supports sont ensuite tenus par une pince pour être agités dans 3 bains successifs de tampon PBS.

Les supports en verre ainsi rincés sont conservés dans du PBS, avant d'être placés entre lame et lamelle et être observés sous microscope photonique NIKON optiphot 2 (Biocom visiol@b). Les clichés obtenus (x 650 objectif 50) sont présentés sur la Figure 7. Cette expérience a été réalisée sur : Verre après traitement à l'aide d'une solution Hellmanex Verre fonctionnalisé par les composés organiques C et D , Verre fonctionnalisé par les composés organiques C et D puis par le peptide 1 (Figure 7A), Verre fonctionnalisé par les composés organiques C et D puis par le peptide 2 (Figure 7B).

Aucune hématie n'est présente sur les supports verre après traitement à l'aide d'une solution Hellmanex et verre fonctionnalisé par les composés organiques C et D. De plus, aucune hématie n'est observée sur le cliché qui correspond au support sans peptide 2 fusogène (Figure 7A). Les érythrocytes ne présentent donc pas d'adsorption aspécifique sur le verre, les composés organiques ou le peptide 1. Par contre, le cliché effectué sur un support comportant le peptide 2 fusogène (Figure 7B) présente une forte proportion d'hématies régulièrement réparties sur la plaque. La Figure 8 schématise le biorécepteur tel que visualisé à la Figure 7B.

Ainsi, le peptide 2 fusogène a pu immobiliser les globules rouges sur le support verre.

De plus, les hématies n'ont pas subi de dommages et ont conservé les formes normales de disque biconcave.

Il convient de remarquer que des résultats tout à fait similaires à ceux précédemment présentés ont été obtenus en utilisant un support en silicium oxydé au lieu d'un support en verre. En effet, des expériences identiques à celles précédemment décrites pour le verre ont été réalisées sur des supports de silicium oxydé et les résultats obtenus en microscopie à balayage sont présentés à la Figure 9. Aucune hématie n'est présente sur les plaques sans peptide 2 fusogène i.e. aucune adsorption aspécifique de ces cellules sur le silicium (Figure 9A), les agents de jonction C et D (Figure 9B) ou le peptide 1 (Figure 9C).

Claims (25)

REVENDICATIONS

1) Procédé de préparation d'un support solide susceptible d'immobiliser au moins une cellule et/ou au moins une partie de cellule, ledit procédé comprenant une étape consistant à fixer audit support solide un composé fusogène capable de s'insérer dans les membranes cellulaires.

2) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit composé fusogène est un composé fusogène non peptidique tel que le motif glycosyl phosphatidylinositol ou les motifs isoprènes.

3) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit composé fusogène est un composé fusogène peptidique.

4) Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que ledit composé peptidique fusogène est un peptide basique dérivé de protéines virales, de facteurs de transcription ou de toxines.

5) Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que ledit composé peptidique fusogène est un peptide dont la composition en acides aminés comprend au moins 40% d'acides aminés hydrophobes par rapport au nombre total d'acides aminés de sa séquence.

6) Procédé selon l'une quelconque des revendications 3 à 5, caractérisé en ce que leditcomposé peptidique fusogène est choisi dans le groupe constitué par les peptides présentant les séquences suivantes : -AVGIGALFLGFLGAAGSTMGARS (SEQ ID NO. 1 dans la liste de séquences en annexe), - RQIKIWFQNRRMKWKK (SEQ ID NO. 2 dans la liste de séquences en annexe), - TAALRLGIKLTQHYFGLLTAFGSNFGTIG (SEQ ID NO. 3 dans la liste de séquences en annexe), - MMIMLGAICAIIVVVIVIVFFT (SEQ ID NO. 4 dans la liste de séquences en annexe), - RGGRLSYSRRRFSVSVGR (SEQ ID NO. 5 dans la liste de séquences en annexe), - C(Acm)GRKKRRQRRRQC avec C(Acm) = Cys-acétamidométhyle (SEQ ID NO. 6 dans la liste de séquences en annexe), leurs dérivés et leurs fragments.

7) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que ledit support solide est inorganique.

8) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que ledit support solide est choisi dans le groupe constitué par les verres, le quartz, les silices, les céramiques, les métaux et les semi-conducteurs.

9) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que ledit support solide ou la surface dudit support solide esten un matériau organique comme un polymère ou une résine incluant le nylon, le polyéthylène glycol, les polycarbonates, les polyfluoropolymères ou les composites.

10) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que ledit support solide présente une surface portant des groupes fonctionnels.

11) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que ledit composé fusogène est lié de façon directe audit support solide. 15

12) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que la liaison entre ledit composé fusogène et ledit support solide est indirecte. 20

13) Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que ladite fixation indirecte dudit composé fusogène sur ledit support solide est réalisée au moyen d'une monocouche autoassemblée organisée d'un 25 ou de plusieurs composés organiques ou organométalliques possédant une chaîne alkyle terminée par un groupe fonctionnel.

14) Procédé selon la revendication 13, 30 caractérisé en ce que ladite monocouche autoassemblée 10X / 3 dans laquelle - n est compris entre 3 et 40, - m est compris entre 0 et 50, - X1, X2, X3 qui peuvent être identiques ou différents entre eux sont sélectionnés dans le groupe constitué par des groupes alkyles saturés en C1 à C6i linéaires ou ramifiés, et des groupements hydrolysables, au moins l'un de XI, X2 et X3 représentant un groupement hydrolysable, - A représente le groupement -0-(CH2CH2O) k-(CH2)i- dans lequel k est compris entre 0 et 100, et i 15 un nombre entier supérieur ou égal à 0 - dans le cas où m = 0 alors B représente un groupement ûOCOR, -OR, -COOR ou un atome d'halogène, R représentant un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle en C1 à 06r linéaire ou ramifié. 20 - dans le cas où m = 1 • si k = 0 et i = 0, alors B représente un groupement R1 • si k = 0 et i >- 1, alors B représente un groupement -OR1, -OCOR1, -NR1R2r -COOR1, -CONR1R2, -SR1 ou 25 un atome d'halogène, • si k ? 1 et i = 0, alors B représente un groupement -RI, -COR1, -COOR1, -CONR1R2, 52 organisée comprend un ou plusieurs composés organosiliciés répondant à la formule I suivante : Xi \ X2 Si (CH2)n Am B (I)• si k 1 et i >- 1, alors B représente un groupement -OR1, -OCOR1, -NR1R2r -COOR1, -CONR1R2, -SR1 ou un atome d'halogène. R1 et R2 peuvent être identiques ou différents représentant un atome d'hydrogène, une chaîne hydrocarbonée éventuellement substituée, saturée ou insaturée et linéaire ou ramifiée comprenant 1 à 24 atomes de carbone ou un groupement aromatique.

15) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que ledit procédé comprend les étapes suivantes : a) la préparation d'un support solide tel que défini à l'une quelconque des revendications 7 à 10, modifié par une monocouche autoassemblée comprenant au moins un composé organosilicié répondant à la formule I telle que définie à la revendication 14, ledit composé organosilicié présentant à son extrémité un halogène, une fonction hydroxyle, acide ou amine, protégée ou non, activée ou non, b) éventuellement, la déprotection de la fonction terminale dudit composé organosilicié utilisé à l'étape (a), c) éventuellement, dans le cas où le support solide modifié porte des fonctions acide carboxylique terminales, l'activation de ces fonctions, d) éventuellement, la déprotection des chaînes latérales et de l'amine terminale d'un composé peptidique tel que défini dans l'une quelconque des revendications 3 à 6,e) éventuellement, dans le cas où le support solide modifié porte des fonctions hydroxy ou amine terminales, l'activation de la fonction acide carboxylique terminale d'un composé peptidique tel que défini dans l'une quelconque des revendications 3 à 6, f) la mise en contact du support solide modifié obtenu aux étapes (a), (b) ou (c) par immersion, pendant une durée déterminée, avec une ou plusieurs solutions, dans un ou plusieurs solvants polaires, du (ou des) composé(s) peptidique(s) tel(s) que défini(s) dans l'une quelconque des revendications 3 à 6 et éventuellement après les étapes (d) et/ou (e), g) éventuellement, le lavage dudit support sur lequel sont immobilisés ledit (ou lesdits) composé(s) peptidique(s) suite à l'étape (f).

16) Procédé pour immobiliser au moins une cellule et/ou au moins une partie de cellule, caractérisé en ce que ledit procédé comprend les étapes suivantes : a') la préparation d'un support selon un procédé tel que défini selon l'une quelconque des revendications précédentes, b') la préparation d'une solution 25 cellulaire contenant au moins une cellule ou au moins une partie de cellule, c') la mise en contact du support solide tel que préparé à l'étape (a') par immersion pendant une durée indéterminée dans la solution cellulaire 30 préparée à l'étape (b'), d') au moins un lavage du support obtenu à l'étape (c') sur lequel est immobilisée ladite cellule ou ladite partie de cellule.

17) Procédé selon la revendication 16, caractérisé en ce que ladite cellule est une cellule eucaryote choisie parmi une levure, une cellule de mammifères, une cellule végétale ou une cellule d'insectes.

18) Procédé selon la revendication 17, caractérisé en ce que ladite cellule de mammifères est choisie parmi les globules rouges, les ostéoblastes, les cellules neuronales, les hépatocytes, les lymphocytes, les cellules musculaires et les cellules progénitrices.

19) Procédé selon la revendication 16, caractérisé en ce que ladite cellule est une cellule procaryote telle qu'une bactérie.

20) Procédé selon l'une quelconque des revendications 16 à 19, caractérisé en ce que la partie de cellule est constituée de l'intégralité ou d'une portion d'une membrane cellulaire.

21) Support solide tel que défini dans l'une quelconque des revendications 7 à 10, sur lequel est éventuellement greffée une monocouche autoassemblée organisée telle que définie à l'une quelconque des revendications 13 ou 14, et sur lequel est fixé uncomposé fusogène capable de s'insérer dans les membranes cellulaires tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 6, ledit composé fusogène étant éventuellement ancré dans au moins une cellule et/ou au moins une partie de cellule telles que définies dans l'une quelconque des revendications 17 à 20.

22) Support solide selon la revendication 21, caractérisé en ce que ledit composé fusogène est ancré dans au moins une cellule et/ou au moins une partie de cellule telles que définies dans l'une quelconque des revendications 17 à 20.

23) Kit de diagnostic comprenant au moins un support solide selon l'une quelconque des revendications 21 ou 22.

24) Utilisation d'un support selon la revendication 21 dans le cadre d'une veille sanitaire.

25) Utilisation d'un support selon la revendication 22 et/ou d'un procédé d'immobilisation d'au moins une cellule et/ou d'au moins une partie de cellule tel que défini dans l'une quelconque des revendications 16 à 20 dans la recherche d'anticorps et/ou de ligands respectivement spécifiques d'antigènes ou de récepteurs présents à la surface des cellules ou parties de cellule fixées audit support.30