FR3120946A1 - Test de dépistage virologique, antigénique, reposant sur la mise en œuvre de deux complexes biochimiques quantiques ; procédé de dépistage virologique mettant en œuvre de tels complexes et utilisation d’un tel test de dépistage virologique. - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne un test virologique antigénique, mettant en œuvre deux complexes biochimiques quantiques permettant de révéler la présence d’un agent pathogène, tel que le virus du SARS-CoV-2 ou de l’un de ses variants, dans un échantillon muco-salivaire liquide de sujet humain ou, par extension, dans tout type de corps liquide non physiologique. L’invention concerne en outre le procédé mis en œuvre dans ce test et son utilisation.

Description

Test et procédé de dépistage virologique, antigénique, reposant sur la mise en œuvre de deux complexes biochimiques quantiques ; utilisation d’un tel test.

La présente invention appartient au domaine des tests de dépistage virologique. Plus particulièrement, la présente invention concerne un test antigénique, mettant en œuvre deux complexes biochimiques quantiques, aptes à révéler la présence d’un agent pathogène, tel que le virus du SARS-CoV-2 ou de l’un de ses variants, dans un échantillon muco-salivaire liquide de sujet humain ou, par extension, dans tout type de corps liquide non physiologique.
Elle vise par extension le procédé consistant à mettre en œuvre les complexes quantiques décrits, ainsi que leur utilisation dans le cadre d’une opération de dépistage virologique.

Les coronavirus constituent un groupe de virus à ARN capables d’infecter une grande diversité d'hôtes, en ce compris les humains. Ils sont à l’origine de différents types de maladies affectant principalement le système respiratoire ou le système gastro-intestinal. Certains de ces virus, particulièrement pathogènes, ont provoqué de véritables épidémies, comme celle dite du coronavirus du syndrome respiratoire aigu sévère (SARS-CoV) en 2003, ou du coronavirus du syndrome respiratoire du Moyen-Orient (MERS-CoV) en 2012.
Le coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SARS-CoV-2) représente une nouvelle souche de SARS-CoV provoquant la maladie dite à coronavirus 2019 (COVID-19). Le 30 janvier 2020, l'Organisation Mondiale de la Santé (OMS) a déclaré que l'épidémie liée à ce nouveau coronavirus constituait une urgence de santé publique de portée internationale (USPPI), le plus haut niveau d'alarme de l'OMS, avant d’estimer, le 11 mars 2020, que la COVID-19 pouvait être qualifiée de pandémie.
Le SARS-CoV-2 appartient au genre Betacoronavirus, de même que le SARS-CoV et le MERS-CoV. En comparant leurs génomes, on constate également que le SARS-CoV-2 partage 79 % de son identité génétique avec le SARS-CoV et 50% avec le MERS-CoV. Son analyse phylogénétique révèle par ailleurs qu’il est étroitement lié aux coronavirus de type SARS affectant les chauves-souris, avec lesquels il présente 88% de similitudes.

Le SARS-CoV-2 est un virus à ARN simple brin enveloppé. Son génome d’environ 30 kilobases code pour 16 protéines, dont 4 protéines de structure. Il s’agit du plus long ARN viral actuellement connu. Les 4 protéines en cause consistent en : une protéine de membrane (M), une protéine d'enveloppe (E), une protéine de nucléocapside (N) et une protéine de surface (protéine Spike ou S) formant une sorte de couronne, d’où le nom de coronavirus. Le diamètre des virions varie environ de 60 à 140 nm.
Le SARS-CoV-2 se transmet entre humains, soit par voie aérienne, via des gouttelettes entre 1 µm et 1 mm ou des aérosols (de quelques nanomètres à 100 µm) produites par des personnes infectées, lorsqu'elles éternuent, toussent ou parlent, soit par contact direct avec une personne ou une surface infectées.

L'infection par le SARS-CoV-2 se poursuit ensuite par l’entrée dans l’organisme et la pénétration cellulaire. Ce mécanisme implique la glycoprotéine S et se déroule en plusieurs étapes impliquant l'attachement à la surface cellulaire via le récepteur ACE2, l’intervention de protéases et la fusion membranaire.
La protéine S est divisée en deux sous-unités : S1, responsable de la liaison au récepteur, et S2, responsable de la fusion avec la membrane cellulaire.

Le mécanisme d'internalisation cellulaire du SARS-CoV-2 repose sur les étapes clés suivantes:
- La liaison au récepteur : la sous-unité S1 de la protéine Spike du SARS-CoV-2 possède un domaine RBD (Receptor Binding Domain) lui permettant de se lier au récepteur cellulaire de l'enzyme de conversion de l'angiotensine humaine 2 (hACE2). Contrairement au SARS-CoV, le domaine RBD du SARS-CoV-2 est principalement en conformation basse, plutôt qu’en conformation haute, ce qui signifie qu'il est moins accessible. Par conséquent, bien que le RBD du SARS-CoV-2 ait une affinité de liaison élevée avec hACE2, globalement sa protéine Spike présente une affinité de liaison plus faible avec hACE2 que celle du SARS-CoV. Toutefois, bien que disposant d’un RBD moins accessible, le SARS-CoV-2 reste très contagieux, grâce au second mécanisme qu’il met en œuvre : l'activation protéolytique.
- L’activation protéolytique : le clivage protéolytique de la protéine S permettant son activation, se produit à deux niveaux : le site S1 / S2 (limite entre les unités S1 et S2) et le site S2. Le clivage du site S1 / S2, sous l’effet de la furine, peut conduire à des changements conformationnels de la protéine S, favorisant l'exposition du RBD et la liaison à hACE2. Le préclivage du site S1 / S2 pourrait également favoriser l’action ultérieure d’une protéase transmembranaire (TMPRSS2), en exposant le site S2. Le clivage du domaine S2 sous l’effet de la TMPRSS2 se trouve ainsi à l’origine de l’endocytose. Par conséquent, la furine et le TMPRSS2 ont des effets cumulatifs, nécessaires au mécanisme d'internalisation cellulaire du SARS-CoV-2, de sorte que l'inhibition de l'une ou des deux protéases empêcherait leur action.

Il résulte de ce qui précède que les mécanismes concertés de liaison au récepteur et d'activation protéolytique de la protéine Spike, sont essentiels à la fusion membranaire des cellules virales et des cellules hôtes, ainsi qu’à la libération du génome du virus dans la cellule hôte. Après transcription et réplication du génome viral dans les cellules infectées, de nouvelles particules virales se formeront et infecteront à leur tour d'autres cellules.

L'infection par le SARS-CoV-2 provoque la COVID-19. Les formes cliniques de cette pathologie sont variables d’un individu à un autre, allant de formes asymptomatiques, légères ou modérées, affectant les voies respiratoires supérieures, à des formes graves (pneumopathie, insuffisance respiratoire, syndrome de détresse respiratoire aiguë).
La pandémie de COVID-19 est à l’origine d’une crise sanitaire mondiale sans précédent, tant par sa durée que par son rayonnement géographique. Elle exerce une pression importante sur le système de santé publique et les hôpitaux, se traduisant notamment par une pénurie de dispositifs et matériels médicaux, parmi ceux utilisés dans les services de médecine intensive-réanimation. Elle a également touché la filière des dispositifs de diagnostic in vitro, dans le cadre des campagnes massives de dépistage mises en œuvre à l’échelle mondiale. Ces pénuries sont à la fois la conséquence d’une augmentation brutale de la demande touchant simultanément de nombreux pays, mais également la résultante d’une chaine de valeur des produits de santé, segmentée et mondialisée.
Soucieux d’affirmer sa souveraineté, l’état français a démontré qu’il souhaitait réduire la dépendance de la France et de l’Europe vis-à-vis des pays tiers en incitant les acteurs concernés à fabriquer des produits de santé liés à la crise de la COVID-19. Cette crise représente également un lourd fardeau social et économique. Il est ainsi rapidement devenu indispensable de lutter contre toute forme de propagation de la maladie, en recourant notamment à des systèmes de dépistage du COVID-19 qui soient rapides et efficaces.
La récente apparition de nouveaux variants de la COVID-19 à travers le monde, appelle à renforcer les campagnes de dépistage au sein de la population et à adapter les solutions diagnostiques.

Bien que différentes stratégies puissent être autorisées dans des cas spécifiques ou selon les pays, il existe globalement aujourd’hui trois types de tests permettant de savoir si une personne est infectée ou non par la COVID 19 : les tests dits qRT-PCR, les tests RT-LAMP et les tests antigéniques. La plupart d’entre eux sont exercés sur des prélèvements nasopharyngés mais, dans certains cas ou pays, des prélèvements oropharyngés ou salivaires peuvent être autorisés.

Ces tests présentent chacun leurs avantages et leurs inconvénients , résumés dans le tableau reproduit ci-dessous :

L’examen des solutions connues au jour de la présente demande de brevet témoigne de l’intérêt de créer un nouveau test de dépistage rapide, justifiant d’un niveau de performance irréprochable, que ce soit notamment en termes de sensibilité ou de spécificité.
Tel est l’objet de la présente invention qui porte sur un test antigénique remédiant à l’ensemble des inconvénients décrits précédemment.

L’efficacité de ce test repose sur la mise en œuvre d’une technologie permettant de détecter la présence d’un virus, préférentiellement celui du virus SARS-CoV-2 ou de l’un de ses variants, dans un échantillon muco-salivaire d’origine humaine mais aussi, par extension, dans tout autre type de liquide non physiologique.

Le caractère disruptif de cette innovation s’appuie sur la synthèse de deux complexes biochimiques quantiques, mettant en œuvre des mécanismes biomimétiques.
Comme telle, la présente invention est issue de la conjugaison de calculs réalisés en matière de mécanique quantique et de l’observation attentive des interactions biologiques induites par une infection au CoV-2 du SARS.
Elle permet, en quelques minutes seulement, de révéler l’infection d’un individu au virus SARS CoV-2 ou à l’un de ses variants, à partir d’un simple échantillon de sa salive ou de son mucus nasal sous forme liquide.

Selon l’invention, la solution décrite présente de nombreux avantages sur les tests de dépistage au COVID 19, recensés dans le cadre de notre étude :

1. Elle repose sur une technologie qui, à la façon d’un piège quantique (electron trap), utilise le mécanisme d'entrée cellulaire propre au virus SARS CoV-2 pour générer un signal. Cette spécificité marque une différence essentielle avec l’ensemble des tests antigéniques actuels, dont le fonctionnement repose sur l’identification de la protéine de nucléocapside présente au sein du virus, ce qui ne constitue pas une véritable mesure de son infectiosité.
2. Son fonctionnement répond à une réaction spécifique et biomimétique du virus SARS CoV-2. Ainsi, elle adresse la protéine de pointe (Spike ou S) du virus, en mimant le processus biologique de pénétration du virus dans la cellule.
3. En cas de dépistage positif à la Covid 19 ou à l’un de ses variants, le test fait rapidement apparaitre un signal coloré, visible à l’œil nu, ne nécessitant ni appareil de mesure, ni analyse en laboratoire.
4. Son fonctionnement est basé sur l’examen d’un prélèvement salivaire ou muco-nasal liquide. Le test décrit ne présente donc aucun des inconvénients (douleurs et désagréments) induits par l’usage de l’écouvillon communément employé dans le cadre des tests antigéniques commercialisés sur le marché FRANÇAIS.
5. Le test décrit témoigne d’une sensibilité supérieure à celle des tests antigéniques actuels, équivalant celle des tests RT-PCR.
6. Il permet un dépistage rapide des différents variants du SARS CoV-2.
7. Il assure un dépistage sûr et efficace du SARS CoV-2 et de ses variants, sur une plage de temps plus large que celle caractérisant les autres tests du marché.

Le test de dépistage , objet de la présente invention, se compose d’un dispositif à écoulement latéral(1) comportant, en l’une de ses extrémités, un tampon d’échantillonnage (2) sur lequel est déposé le prélèvement à analyser (3), dont la migration (4) vers l’autre extrémité du test est assurée par un simple basculement dudit dispositif. Un tampon recouvert de deux complexes quantiques (5), qui seront décrits ultérieurement, est partiellement introduit sous le tampon d’échantillonnage (2), prenant appui, en son extrémité opposée, sur une membrane de nitrocellulose (9) comportant deux lignes de test successives (respectivement 6 et 7), ainsi qu’une ligne de contrôle de test (8). En cas de dépistage positif, le protocole mis en œuvre prévoit que les virus marqués par les complexes 1 et 2 se fixent aux récepteurs placés sur ces lignes, ladite fixation se traduisant, sous l’effet de l’accumulation, par une coloration rouge, pour la première ligne de test (6), bleue pour la seconde (7)). La ligne de contrôle (8) permet de valider le protocole de test et doit toujours apparaître à l’issue du dépistage, pour attester de son caractère fonctionnel et du bon déroulement de la procédure prévue. Sa révélation sous la forme d’une ligne rouge témoigne de la parfaite migration du prélèvement testé sur toute la longueur du dispositif de dépistage.
Enfin, le dispositif se termine par un tampon d’absorption (9) permettant d’éponger l’excédent du prélèvement à analyser.

Comme suggéré précédemment, l’efficacité du test de dépistage antigénique couvert par la présente invention repose sur un principe de détection chimique du virus SARS-CoV-2 mettant en œuvre deux complexes quantiques :

1. Un complexe biomimétique quantique coloré (complexe 1), permettant de réagir de manière rapide avec la protéine la plus externe (Spike) du SARS-CoV-2 ou de l’un de ses variants.
2. Un complexe quantique neutralisant coloré (complexe 2), permettant une double détection du SARS-CoV-2 ou de l’un de ses variants.

Le test de dépistage antigénique, objet de la présente invention, met ensuite en œuvre un dispositif de révélation visuelle de son bon fonctionnement, par la coloration de la ligne de contrôle, et de l’éventuelle contamination au virus SARS-CoV-2 ou à l’un de ses variants du prélèvement testé, par la coloration des lignes de test.

Aux fins de la présente demande de brevet, nous procèderons successivement à la description du complexe 1 (A) et du complexe 2 (B), avant d’examiner la réaction biochimique du test en cas de confrontation avec un prélèvement contaminé (C).

A - Description du complexe 1 :

Selon un premier aspect, le test couvert par la présente invention met en œuvre un complexe hybride organo-minéral (complexe 1), comprenant des quanta dots fonctionnalisés de manière covalente, au moyen d’un lien chimique (linker) intégrant au moins un peptide.
Pour plus de clarté et aux fins de la présente description de l’invention, le terme « QD1/Pep1 » sera utilisé pour désigner le premier quantum dot (QD1) fonctionnalisé de manière covalente à un premier peptide Pep1.
La nature du peptide Pep1, introduit dans le complexe 1, a été choisie à l’issue d’une observation minutieuse des interactions biologiques mises en jeu lors d’une infection par le SARS CoV-2 ou l’un de ses variants.
Il est aujourd’hui largement admis que les protéines de surface S (Spike) jouent un rôle décisif dans l'attachement, la fusion et l'entrée du virus dans la cellule, notamment via les « receptor-binding domain » (RBD). Ces RBD de la protéine S du SARS-CoV2 jouent eux-mêmes un rôle important dans la liaison aux récepteurs spécifiques et l'induction d'anticorps neutralisants contre l’infection par le virus. Ces récepteurs spécifiques ont été identifiés comme les récepteurs de l'enzyme de conversion de l'angiotensine 2 (ACE2), qui sont des acteurs clés du contrôle de la pression artérielle. La complexation de ces protéines ACE2 par le virus du SARS-CoV2, en vue d’infecter les cellules, est ainsi largement admise.
Plus précisément, la structure moléculaire du récepteur ACE2 et/ou l’enchainement d’acides aminés mis en jeu pour la fixation avec le domaine RBD ont été étudiés. Par enchainement d’acides aminés, on entend un polymère d’acides aminés ou peptides.
Une structure tridimensionnelle a même été mise en évidence, soulignant le rôle déterminant assuré par certains acides aminés, susceptibles de favoriser l’ancrage du virus.
A l’issue de nombreux calculs, nous sommes parvenus à synthétiser un peptide sur mesure, nous assurant d’une efficacité optimale.
Les peptides synthétisés peuvent faire l’objet de modifications (glycosylation, acylation et/ou acétylation etc.), permettant de moduler leurs activités et/ou propriétés. En l’état actuel de nos connaissances dans le domaine des sciences biologiques, c’est la première fois au monde que ce type de complexe est synthétisé. Ce peptide a ensuite été greffé de manière covalente sur un Quantum Dots sur-mesure, pour créer un complexe biochimique quantique.
En complexant ce peptide, synthétisé de façon optimale et greffé chimiquement sur un quantum dot, nous sommes parvenus à créer une activité enzymatique synthétique de type cellulaire, plus efficace et moins sensible à un environnement biochimique difficile, que ne l’est le récepteur ACE2 natif.
Ce complexe biomimétique de nouvelle génération, présente un double avantage biochimique dans le domaine biologique :

• Sa spécificité : A ce jour, l'interaction du récepteur ACE2 avec la protéine de pointe n'a été observée que pour le SARS CoV-2, mais n'a pas été démontrée pour les autres coronavirus, tels que le CoV-1 du SARS ou le CoV MERS.
• Sa sensibilité : Des études in vitro montrent que la constante de dissociation à l'équilibre (KD) de l'ACE2 et de la RBD du SARS-CoV-2 est très faible et estimée à 4,7 nM. De plus, les mutations génétiques observées dans le domaine RBD du pic renforcent encore l'interaction avec le récepteur ACE2 (KD plus faible en fonction du type de mutation), rendant le virus d’autant plus virulent.

Ce dernier point est essentiel à notre démonstration, puisqu’il sous-tend que notre complexe biomimétique jouira d’une efficacité constante (voir optimisée) sur les souches mutantes actuelles.
Les zones d’ancrage sur le récepteur ACE2 sont comprises entre E23 et L45, et L351 et R357 ; ces deux domaines formant une boucle.
Avantageusement, des substitutions d’acides aminés dans cette structure pourront être envisagées, pour augmenter l’efficacité de liaison avec le domaine RBD de la protéine Spike.
A titre d’exemple, les peptides suivants pourront être envisagés dans notre protocole de synthèse : Avantageusement, les peptides 1 et 13 seront utilisés, selon l’invention.
De manière générale, par quantum dot (QD), on désigne un composé présentant une différence d’énergie entre la bande de valence et la bande de conduction (Eg), suffisamment petite pour qu’un électron passe d’un niveau à l’autre.
Les QD1 sont avantageusement des éléments nanométriques, organisés ou non, et généralement présentés sous une forme sphérique, dont le rayon est inférieur au rayon de Bohr. Cependant, des sphéroïdes oblates ou prolates peuvent également être formés, de même que des bâtonnets ou d’autres formes.
Les quanta dots QD1 sont des particules cristallines (forme non amorphe), avantageusement des semi-conducteurs, constitués d’atomes des groupes I, II, III, IV, V, VI, VII et VIII tels que C, Si, Ge, Sn, S, Se, Te, B, N, P, As, Al, Sb, Ga, In, Cd, Zn, O, Cu, Cl, Pb, Tl, Bi, Ti, U, Ba, Sr, Li, Nb, La, I, Mo, Mn, Ca, Fe, Co, Ni, Eu, Cr, Br, Au, Ag, Pt, Hg.
De manière plus avantageuse, les quanta dots QD1 seront constitués d’atomes du groupe IV (C, Si, Ge) ou de leurs alliages, d’un alliage binaire, ternaire, quaternaire ou quinaire des groupes III et V (B, Al, Ga, In, N, P, Ge, Sn), d’un alliage binaire ou ternaire des groupes II et VI (Zn, Cd, Hg, O, S, Se, Te), d’un alliage du groupe I-VII (Cu, Ag, Au, Mn), des alliages binaires ou ternaires des groupes IV et VI (C, Si, Ge, Sn , Pb et O, S, Se, Te), des alliages des groupes V et VI (Bi et Te), des alliages des groupes II et V (Cd, Zn et P, As, Sb) et des oxydes des groupes VIII (Fe, Co, Ni, Ru, Rh, Pd).
De manière encore plus avantageuse, le quantum dot QD1 comprend, selon l’invention, deux ou trois de ces éléments, ainsi que leurs oxydes. A titre d’exemple, nous choisissons un quantum dot de Co3O4 ou carbon quantum dots, selon le peptide choisi.
De manière générale, le quantum dot QD1 présente une taille moyenne de l’ordre de la première cristallite (r_i) ou quelques dizaines de nanomètres.
Plus spécifiquement, pour un transfert optimal d’électrons vers le peptide, la tailles du QD1 est fixé, selon nos calculs quantiques, dans un espace confiné, estimé à : Ainsi, QD1 présente une taille avantageusement comprise entre le premier cristallite et 1000 nm, plus avantageusement entre 2 et 10nm, et, préférentiellement, de l’ordre de 4nm, la taille étant mesurée par SAXS (small angle Xray scattering) ou par diffusion de la lumière dynamique (DLS).
Par taille, on désigne la dimension la plus importante des quanta dots, par exemple le diamètre dans le cas de quanta dots de forme sphérique. Il s’agit de la taille moyenne de quanta dots fonctionnalisés. Néanmoins, la taille des quanta dots non fonctionnalisés QD1 se positionne généralement elle aussi dans les plages de valeurs indiquées ci-dessus. Le cas échéant, l’homme du métier saura adapter la taille des quanta dots non fonctionnalisés QD1.
Les quanta dots QD1 peuvent être synthétisés selon les techniques conventionnelles, par exemple par l’approche dite « bottom up » de croissance de précurseurs. Cette voie de synthèse, couramment utilisée dans le domaine des nanomatériaux, met en œuvre une étape de nucléation et une étape de croissance à partir d’atomes isolés. Elle permet de contrôler la taille des quanta dots.
Les quanta dots QD1 et/ou QD1/Pep1 sont avantageusement de forme sphérique.
Avantageusement, ils sont colorés ou photoluminescents, de façon à faciliter leur détection à l’œil nu ou sous illumination UV.
La notion de fonctionnalisation des quanta dots fait partie des connaissances générales de l’homme du métier. Elle consiste dans la formation de liaisons covalentes et non dans la formation d’une simple coquille.
Bien entendu, qu’elle soit covalente ou pas, la liaison en cause ne se limite pas à un seul composé et permet d’associer une multitude de molécules, d’au moins un type de composé, sur chaque quantum dot.
Ainsi, et conformément aux connaissances dont dispose l’homme du métier en la matière, la formation du complexe QD1/Pep1 n’est rendu possible que par la présence à la surface de QD1, de fonctions spécifiques, programmées lors de sa synthèse, et permettant d’y greffer de façon covalente Pep1.
Selon l’invention, le greffage covalent est réalisé au moyen d’un linker.
Le complexe QD1/Pep1 est caractérisé en ce que le linker comprend une fonction de type éther, ester, phosphate, amide ou amadine. Avantageusement, il est prescrit de recourir à une amidine linéaire comprenant 3 à 10 carbones, préférentiellement à une amidine linéaire comportant 4 à 6 carbones et contenant un groupe sulfhydryle terminal.
Selon l’invention, le greffage covalent du peptide sur le quantum dot choisi QD1 va permettre d’immobiliser et de stabiliser électroniquement le peptide en :

• Maintenant sa structure tridimensionnelle dans sa conformation idéale, le rendant ainsi moins sensible au changement de température, de pH, etc. Cela permettra d’augmenter ou d’améliorer son efficacité et son interaction optimale avec l’antigène.
• Ensuite, c'est en convertissant les photons que le quantum dot transfère les électrons pour oxyder et/ou réduire son environnement, afin de créer des espèces réactives créant un phénomène énergétique "de type enzymatique", qui permettra la réaction électronique forte du peptide avec la protéine de pointe du virus (Spike). Les quanta dots fonctionnalisés sont avantageusement colorés, ce qui permettra de faciliter la lecture visuelle du test.

B - Description du c omplexe 2
Pour plus de clarté et aux fins de la présente description de l’invention, le terme « Col1/Ac1 » sera utilisé pour désigner le premier colloïde (Col1) fonctionnalisé de manière covalente à un premier anticorps (Ac1).
Selon l’invention, ce second complexe est un complexe neutralisant. Il a été développé, cette fois-ci, en observant la réponse immunitaire associée à un développement de la maladie COVID-19. Après infection, le virus SARS CoV-2 se multiplie dans le rhinopharynx où son ARN peut être détecté de manière précoce. Le système immunitaire va ensuite organiser une réponse ciblée, en produisant des anticorps spécifiques aux protéines du virus, par l’intermédiaire des lymphocytes B et T activés.
Les immunoglobulines M (IgM) anti SARS CoV-2 sont exprimées à partir du 5ème jour faisant suite à l’infection, mais ne commencent à être détectables dans le sang qu’au 7ème jour chez une partie de la population infectée. Ce n’est qu’au cours de la deuxième semaine suivant l’infection qu’ils deviennent détectables chez tous les individus ayant été infectés.
Les immunoglobulines G (IgG) anti SARS CoV-2 peuvent être exprimées légèrement en décalé par rapport aux IgM, bien que fréquemment elles soient exprimées en quasi concomitance. Elles sont également détectables dans le sang.
De manière générale, les immunoglobulines A (IgA) sont spécifiques de la réponse immunitaire des muqueuses. Elles sont détectables dans les sécrétions telles que la sueur, les larmes, la salive ou la mucosité nasale. Elles sont également détectables dans le plasma sanguin.
Actuellement, il y a peu d’informations disponibles concernant l’expression des IgA anti SARS CoV-2 chez les patients contaminés par le virus. Une publication mentionne cependant leur expression pendant la phase aigüe de l’infection, en quasi concomitance avec les IgM.
Naturellement, les patients qui sont infectés par le SARS Cov-2 peuvent être rapidement identifiés par la surveillance simultanée des IgM et des IgG. Le niveau d'anticorps IgM commence à augmenter au bout d'une semaine après l'infection initiale, tandis que l'IgG apparaît plus tard que l'IgM (généralement dans les 14 jours suivant l'infection) et peut durer 6 mois, voire plusieurs années, ce qui signifie que l'IgG sert d'indicateur d'une infection antérieure.
L’anticorps Ac1 peut notamment être choisi dans le groupe comprenant : les immunoglobulines M (IgM), G (IgG), A (IgA), D (IgD), et E (IgE).
Avantageusement, l’anticorps choisi, selon l’invention, consistera en une immunoglobuline de type G.
Les coronavirus sont des virus sphériques enveloppés, d’un diamètre de 80 à 120 nm. La capside virale, formée par la nucléoprotéine (N), ainsi que le génome, sont contenus dans l’enveloppe et sont de symétrie hélicoïdale. A la surface des particules sont enchâssées trois protéines structurales : la protéine de membrane M, la protéine d’enveloppe E et la protéine de pointe (Spike) S. La protéine S, située en périphérie du virus, donne cet aspect de couronne en microscopie électronique et son nom à cette famille virale.
Les tests antigéniques existant sur le marché visent, majoritairement, la protéine de la nucléocapside (N). L’Organisation Mondiale de la Santé, ainsi que la Haute Autorité de Santé et le Conseil Scientifique du Ministère de la santé, recommandent de cibler cette protéine de la nucléocapside, car elle est davantage préservée et moins soumise à mutation que la protéine de pointe (Spike). En revanche, la libération de cette protéine est conditionnée par une dégradation préalable du virus.
D’après nos recherches, cette dégradation préalable n’est pas opportune. Elle peut entrainer une diminution de la sensibilité du test et ne constitue pas le reflet fidèle de la réalité puisque, par définition, ces résidus de virus peuvent aussi bien révéler l’existence d’une infection en cours, qu’être les témoins d’une infection passée.
De ce point de vue, le fait de cibler les protéines externes du virus entier, semble de nature à optimiser l’efficacité du test, en ce qu’il permet d’identifier la présence au sein de l’organisme d’un virus actif.
Avantageusement, l’anticorps choisi pour le complexe 2 consistera une immunoglobuline de type G, spécifique de la protéine Spike, permettant une analyse globale du virus et une détermination de son infectiosité à un instant donné.
Les colloïdes Col1, de nature minérale et préférentiellement métallique, peuvent être synthétisés selon les techniques conventionnelles, par exemple par l’approche dite « bottom up » de croissance de précurseurs.
Les colloïdes Col1 sont avantageusement des éléments nanométriques, organisés ou non, généralement présentés sous une forme sphérique, dont le rayon est inférieur au rayon de Bohr. Cependant, des sphéroïdes oblates ou prolates peuvent également être formés, de même que des bâtonnets ou d’autres formes.
Ainsi, un nombre illimité d’exemples de matériaux métalliques des groupes I à VIII peuvent constituer les colloïdes Col1 tels que Ti, V, Zr, Cr, Mn, Fe, Co, Ni, Ru, Rh, Pd, Pt, Cu, Ag, Au. Plus particulièrement les métaux nobles tels que Au, Ag, Pt, Pd, ou leurs alliages. A titre d’exemple, selon l’invention, nous choisissons un colloïde d’or (Au).
Dans le cas particulier des colloïdes de métaux nobles, tels que l’or, l’argent ou le platine, la résonance plasmonique de surface (LSPR) produit des coefficients d'absorption et des propriétés de diffusion exceptionnellement élevés dans la gamme de longueurs d'onde UV/visible. Dans le cadre de méthodes de détection optique, cette caractéristique leur confère une plus grande sensibilité que les colorants organiques classiques. Ces colloïdes présentent donc un profil particulièrement adaptés aux applications de biodétection colorimétrique.
En outre, leurs propriétés LSPR peuvent être facilement modulées en fonction de leur taille, de leur forme et de leur composition.
Ces bandes LSPR changent fortement avec la distance inter-particulaire. Ainsi, l'agrégation des NP entraîne un changement de couleur prononcé, directement lié au couplage d’absorption inter-particulaire.
La plupart des biocapteurs colorimétriques basés sur les colloïdes d'or et/ou d'argent ont été développés en tenant compte de ces changements de couleur générés par le couplage d’absorption inter-particulaire lors de l'agrégation, tandis que d'autres méthodes ont utilisé les propriétés LSPR des colloïdes de métaux nobles comme un rapporteur coloré.
De manière générale, le colloïde Col1 présente une taille moyenne de l’ordre de quelques nanomètres ou quelques dizaines de nanomètres.
Ainsi, le colloïde Col1 présente une taille avantageusement comprise entre la taille de la première cristallite et 1000 nm, plus avantageusement entre 5 et 200nm, préférentiellement de l’ordre de 15nm, la taille étant mesurée par SAXS ou par diffusion de la lumière dynamique (DLS).
La formation du complexe Col1/Ac1 est réalisée selon les connaissances de l’homme du métier, certaines fonctions spécifiques apparues à la surface de Col1, durant la synthèse, permettant de fonctionnaliser l’anticorps Ac1 de façon électrostatique ou covalente.
De manière avantageuse, Ac1 sera greffé de manière covalente pour favoriser une orientation vers la surface de la partie variable de l’anticorps. La chimisorption peut s’effectuer au moyen de dérivés du thiol ou en recourant à des liants bifonctionnels.
La bioconjugaison sur des anticorps implique des conditions de réactions plutôt douces. Un grand nombre de linker bifonctionnels sont commercialement accessibles. Les groupes carboxyliques habituels peuvent être mis en réaction avec des amines primaires, au moyen d'une réaction de condensation permettant de produire des amides. Dans ce cas, un carbodiimide soluble dans l'eau (par exemple, l'EDC) est généralement utilisé. Après avoir formé un composé intermédiaire avec la partie carboxylique, le groupe activé est réactif vis-à-vis des amines primaires. Dans le cas des amines primaires présentes à la surface des particules, des composés activateurs de fonction esters (N-hydroxy-succinimide ; NHS) peuvent être utilisés pour former des amides.
Par ailleurs, l'introduction de groupes sulfhydryles dans les biomolécules, aux fins de fonctionnalisation des particules métalliques, constitue une méthode rapide et efficace. Ils peuvent être introduits dans les molécules par réaction avec des amines primaires, en utilisant des réactifs d'addition de sulfhydryles, tels que le 2-iminothiolane (réactif de Traut), le SATA, le SATP ou le SAT(PEG)4. Plus particulièrement, le réactif de Traut (ou 2-Iminothiolane) est une molécule qui réagit avec les amines primaires pour former un composé thiolé (Traut et al., 1973). Les amines naturellement accessibles à la surface des anticorps, provenant des résidus lysines et arginines ainsi que du N-terminal, seront utilisées pour cette thiolation.
La réaction entre le réactif de Traut et les amines étant favorisée à pH basique, le tampon des anticorps est échangé contre un tampon à pH 8 contenant 50 mM de NaH2PO4 (PBS), en présence d’EDTA. La concentration en EDTA est comprise entre 1 et 10mM, avantageusement entre 2,5 et 5mM, préférentiellement de 5mM.
Une fois l’anticorps greffé de manière covalente sur la particule métallique, la surface est saturée avec une protéine non spécifique de l’antigène, telle que de la caséine, de la gélatine ou plus avantageusement avec de la BSA, à une concentration comprise entre 1 et 10%, avantageusement entre 3 et 6%, préférentiellement de 5%.
Après purification par centrifugation adaptée pendant 30 minutes, entre 1G et 30KG, le complexe Col1/Ac est remis en solution dans PBS/sucrose 5%/tween20 0.5%.
A l’inverse de ce qu’on a pu démontrer pour le récepteur ACE2, les mutations génétiques imputables aux virus variants ont un effet négatif sur la reconnaissance par les anticorps spécifiques de la protéine Spike. En effet, la plus grande majorité des mutations a lieu sur la protéine Spike et plus particulièrement sur le domaine RBD.
La présence de ce second complexe neutralisant nous permettra de dire si le patient est infecté par la source d’origine du SARS CoV-2 ou par une des souches variantes.
C - Réactions biochimiques du test au contact du prélèvement

A l’issue d’un dépistage conforme, soit après migration du prélèvement de salive ou de mucus nasal initialement placé sur le tampon d’échantillonnage jusqu’au tampon d’absorption qui lui est diamétralement opposé, trois scénarios sont possibles :

• : Seule la ligne de contrôle située à l’extrémité du dispositif apparait (1). Le fait que les deux lignes de test restent invisibles confirme que la concentration de l’antigène 2019-Cov au sein du prélèvement testé est égale à zéro ou sous la limite de détection du test. Le test est donc négatif, ce qui permet légitimement d’affirmer que le propriétaire du prélèvement n’est pas infecté.
• : La coloration des deux lignes de test se révèle (1 et 2) en rouge et en bleu, de même que la ligne de contrôle, en rouge, témoigne du caractère fonctionnel du dépistage. Ce constat signifie que les virus marqués par les complexes quantiques 1 et 2 se sont fixés sur les récepteurs (Anticorps et récepteur ACE2) respectivement intégrés aux lignes 1 et 2. Le test est positif, le propriétaire du prélèvement est infecté par la souche originale du SARS-CoV-2.
• : Seule la deuxième ligne de test (1) apparait, ainsi que la ligne de contrôle (2) témoignant du caractère fonctionnel du dépistage. Ce constat signifie que les virus marqués par le seul complexe quantique biomimétique (complexe 1) se sont fixés sur les récepteurs intégrés à la ligne de test 2.
  Le test est positif, le propriétaire du prélèvement est infecté par une souche variante du SARS-CoV-2.

Selon l’invention, le test de dépistage virologique décrit est ainsi capable de révéler avec précision la présence ou non du virus SARS CoV-2 ou de l’un de ses variants dans la salive ou le mucus nasal d’un patient ou, plus largement, dans tout corps liquide d’origine non physiologique. Le test peut être effectué de manière autonome par le patient lui-même ou par un professionnel de santé, en laboratoire d’analyse médicale, en cabinet médical ou en officine.
Il peut également être réalisé en routine chez une personne asymptomatique souhaitant s’assurer de sa non-contamination, ou encore chez des patients présentant des symptômes évocateurs de la maladie.

Selon un autre aspect, l’invention porte sur le procédé consistant à mettre en œuvre les deux complexes quantiques précédemment décrits dans le cadre d’une action de dépistage virologique du SARS-CoV-2 ou de l’un de ses variants.

Enfin, selon un ultime aspect, l’invention porte sur l’utilisation du test antigénique précédemment décrit, dans le cadre d’une action de dépistage virologique du SARS-CoV-2 ou de l’un de ses variants.

Claims (12)

1. Test de dépistage viral antigénique mettant en œuvre des complexes biomimétiques quantiques capables de révéler la présence d’un agent pathogène, tel que le virus du SARS-CoV-2 ou l’un de ses variants, dans un échantillon muco-salivaire liquide de sujet humain ou, par extension, dans tout type de corps liquide non physiologique, caractérisé en ce que :

   • Le premier de ces complexes consiste dans l’association de quanta dots et d’un peptide synthétique, conçu pour se lier de manière spécifique à la protéine Spike du virus SARS CoV-2 ou de l’un quelconque de ses variants, comme le ferait une cellule humaine ;
   • Le second de ces complexes consiste dans l’association d’un colloïde minéral, préférentiellement métallique, et d’un anticorps spécifique de la protéine Spike du virus SARS CoV-2 ou de l’un quelconque de ses variants.
2. Test de dépistage viral antigénique, selon la revendication 1, caractérisé en ce que les quanta dots et le peptide formant le premier complexe quantique sont liés de manière covalente.
3. Test de dépistage viral antigénique, selon l’une des revendications 1 à 2, caractérisé en ce que le colloïde métallique et l’anticorps formant le second complexe quantique sont liés de manière covalente.
4. Test de dépistage viral antigénique, selon l’une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que les quanta dots utilisés dans le premier complexe sont des quanta dots d’oxyde de cobalt Co3O4 ou des carbon dots.
5. Test de dépistage viral antigénique, selon l’une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le peptide utilisé dans le premier complexe est synthétisé sur mesure et de structure E QAKTF LDKFN HEAED LFYQS SL G LG KGDFR.
6. Test de dépistage viral antigénique, selon l’une des revendications 1 à 5,caractérisé en ce que les quanta dots utilisés sont constitués d’un autre élément choisi dans les groupes I, II, III, IV, V, VI, VII et VIII tels que C, Si, Ge, Sn, S, Se, Te, B, N, P, As, Al, Sb, Ga, In, Cd, Zn, O, Cu, Cl, Pb, Tl, Bi, Ti, U, Ba, Sr, Li, Nb, La, I, Mo, Mn, Ca, Fe, Co, Ni, Eu, Cr, Br, Au, Ag, Pt, Hg.
7. Test de dépistage viral antigénique, selon l’une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que les colloïdes utilisés dans le second complexe sont des colloïdes d’or.
8. Test de dépistage viral antigénique, selon l’une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que l’anticorps utilisé dans le second complexe est une immunoglobuline de type G, spécifique de la protéine Spike du SARS CoV-2.
9. Test de dépistage viral antigénique, selon l’une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que les colloïdes utilisés dans le second complexe sont d’autres colloïdes de métaux nobles, tels que Ag, Pt, Pd ou leurs alliages.
10. Test de dépistage viral antigénique, selon l’une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu’il met en œuvre :

    • Un premier complexe quantique issu de la liaison covalente de quanta dots de Co3O4 et d’un peptide synthétisé sur mesure de structure E QAKTF LDKFN HEAED LFYQS SL G LG KGDFR ;
    • Un second complexe quantique issu de la liaison covalente de colloïdes d’or et d’une immunoglobuline de type G, spécifique de la protéine Spike du SARS CoV-2.
11. Procédé de dépistage mettant en œuvre le test de dépistage viral antigénique selon l’une des revendications 1 à 10, ledit test mettant en œuvre :

    • Un premier complexe quantique, issu de la liaison covalente de quanta dots de Co3O4 et d’un peptide synthétisé sur mesure de structure E QAKTF LDKFN HEAED LFYQS SL G LG KGDFR ;
    • Un second complexe quantique, issu de la liaison covalente de colloïdes d’or et d’une immunoglobuline de type G, spécifique de la protéine Spike du SARS CoV-2.
12. Utilisation d’un test de dépistage mettant en œuvre le test de dépistage viral antigénique selon l’une des revendications 1 à 10, ledit test mettant en œuvre :

    • Un premier complexe quantique, issu de la liaison covalente de quanta dots de Co3O4 et d’un peptide synthétisé sur mesure de structure E QAKTF LDKFN HEAED LFYQS SL G LG KGDFR ;
    • Un second complexe quantique, issu De la liaison covalente de colloïdes d’or et d’une immunoglobuline de type G, spécifique de la protéine Spike du SARS CoV-2.