JP3823178B2 - 認識多様性を有するセンサーチップ - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、多種・多様に存在する生体中の微量物質や、環境中の微量有害物質を高感度に検出することができ、かつ、比較的簡便な方法により製造可能なセンサーチップに関するものである。
【０００２】
【従来技術】
化学分野において、任意の分子を識別する能力のある分子を設計・構築することは、種々の分野で共通の大きなテーマとなっている。生体内には化学物質の認識機構として、特定の化学物質が細胞に存在する特異的レセプターに結合することにより、それを化学言語として認識する仕組みがある。例えば神経伝達物質は、神経細胞をつなぐ細胞間隙内で一方の神経細胞から放出され、それが受け手であるもう一方の神経細胞膜のレセプターと結合することにより神経細胞同士で情報を伝える役目をしている。
また、種々のホルモンは生体内で血液により輸送される臓器間の情報伝達成分を構成していることは良く知られている。これらは分子言語ともいわれ、ホルモンレセプターを介して生命機能を調節する役割をしている。
更に、生体系での抗体に代表される受容体の認識多様性は、その基質結合部位に存在する超可変部位のアミノ酸配列の違いにより発現されている。
免疫グロブリンでは、これにより１０８以上の異なった抗体の存在が可能であり、体内に侵入した多種多様な物質の認識を可能にしている。
【０００３】
一方、合成系における受容体は、近年の超分子化学（T. W. Bell et. al., Angew.Chem. Int. Ed. Engl., 34, 2163 (1995)参照）、ホストーゲスト化学（Y. Kobuke et.al., J. Am. Chem. Soc., 117, 12751 (1995)参照）、モレキュラーインプリンティング法等の進展により、高選択性・高親和性を有する受容体の合成が、数多く報告されている。
例えば、モレキュラーインプリンティング法の応用技術が、特表平６−５１０４７４号公報、特開平５−１９４６１７号公報、特表平８−５０６３２０号公報、及び米国特許第５１１０８３３号明細書等に記載されている。これらは、これによる高分子化合物を、酵素、抗体等に使用する技術である。
前記特表平６−５１０４７４号公報及び特表平８−５０６３２０号公報には、抗体の特性を模倣した特異的結合部位を有する重合可能なモノマー及び架橋モノマーを、プリント（刻印）分子の存在下で重合させ、重合後前記プリント分子を取り除いて、前記プリント分子に相補的な特異的な部位を残すことによって、人工抗体を得る方法及び抗体代替の人工抗体が記載されている。
しかしながら、これら合成受容体は、個々の認識対象物質に対しその都度、受容体の分子設計及び複雑な化学反応などが伴う合成を行わなければならず、環境中の微量有害物質等の未知物質の検出手段としては、簡便・迅速という観点から必ずしも満足できるものではなかった。
【０００４】
これに対して、前記生体系での抗体に代表される受容体の認識多様性を持ったものを、生体膜の形成原理を応用して構築する技術も公知である（繊維学会第１５回シンポジウム予稿集、講演3PA58「末端に種々の官能基を配したポリアミノ酸の脂質膜での構造とその機能」、平成１１年５月８日発行、）。ここには、例えばセリンプロテアーゼに類似する機能を持つものは、その基質結合部位に存在するセリン（Ｓｅｒ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）及びグルタミン酸（Ｇｌｕ）の４種のアミノ酸をそれぞれ末端に導入した疎水性ポリアミノ酸、具体的には前記アミノ酸をＮ末端に結合したポリメチルグルタメートと脂質、具体的にはジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）ベシクル（vesicle）とから、前記４種の疎水性ポリアミノ酸を取り込ませることによって構築でき、構築されたものは高いＮアセチルチロシンエチルエステル（AcTyrEt）の認識能を持つことを説明している。
しかし、このものはベシクル構造であるためセンサーとしては、安定性及びノイズも大きいため、取り扱い上および性能的に満足すべきものではない。
また、酵素や膜タンパク質を各種基材（形状、材質などを含めた）に固定化し、各種センサーとして用いようという研究も数多くなされている（S. J. Updike et. al., Nature 214, 986 (1967), Y. Miwa et. al., Bull. Chem. Soc., Jpn., 67, 2864 (1994)参照）。
しかしながら、これらについても使用上の構造安定性という観点から、実際にはグルコースオキシダーゼや高塩・高熱菌より抽出された膜タンパク質に限られており、満足できる状況にない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、生体系の抗体に代表される、多様性を有する受容体を簡便（測定の対象の変化に対して迅速に対応できるような）な手法により調製でき、構造安定性を有する工学的に利用可能なセンサーチップを提供するものである。
上記観点に基づき、気−液界面に、種々の官能基（認識対象物質に反応性を持つ基）を末端に有するαヘリックス構造を有するポリアミノ酸と脂質とを含む溶液を、液相に認識対象物質を加えた状態で、展開すると、前記液相に加えた認識対象物質と膜中のポリアミノ酸末端との相互作用に基づき誘起されるポリアミノ酸集合体が脂質膜中に形成され（脂質膜の再構成）、前記ポリアミノ酸集合体が前記認識対象物質に対する認識結合部位として機能すること、及び前記ポリアミノ酸集合体が形成された脂質膜を適当な基板上に累積・固定化することでセンサーチップを調製できることを見出し、本発明に至った。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明は、αヘリックス構造を有する重合度１０から１００の疎水性ポリアミノ酸末端に天然アミノ酸あるいはその誘導体を縮合したポリアミノ酸と脂質とから、少なくとも１種の認識対象物資の影響下で、形成した複合単分子膜を、少なくとも１層基板上に累積・固定化したセンサーチップであり、好ましくは、膜の安定性の面から、基板上に累積・固定した複合単分子膜が２層であることを特徴とする前記センサーチップであり、より好ましくは、ポリアミノ酸―脂質複合単分子膜の調製を、少なくとも一種の認識対象物質を含む水溶液上で形成すことにより、該それぞれの認識対象物質により誘起される脂質膜中のポリアミノ酸集合体を該認識対象物質の認識部位として用いることを特徴とする前記センサーチップである。
本発明者は、前記ポリアミノ酸と脂質から、認識対象物質に対応する前記ポリアミノ酸集合体が前記認識対象物質の影響下に自動的に前記脂質二分子膜中に形成され現象を利用して複合単分子膜として形成し、それを適当な基体に累積・固定化することにより、安定なセンサーチップが形成できることを発見することにより、本発明を実現したものである。その原理を図４に示す。Ａ〜Ｈは、ポリアミノ酸末端に結合した官能基を示し、●および▼は認識物質を示す。
【０００７】
【本発明の実施の態様】
本発明を詳細に説明する。
Ａ．本発明のセンサーチップを構成するα−ヘリックス構造を有する疎水性ポリアミノ酸を構成する疎水性のアミノ酸としては、例えば、アラニン、グリシン、ロイシン、イソロイシン、グルタミン酸エステル類、側鎖保護リジン類等を挙げることができる。
疎水性ポリアミノ酸の重合度は１０から１００の範囲が好ましい。これは、重合度が１０未満の場合にはポリアミノ酸が安定なαヘリックス構造を形成しないためであり、重合度が１００を越える場合には、脂質膜に安定に取り込まれないためである。
【０００８】
Ｂ．上記、ポリアミノ酸の末端、具体的にはＮ末端に導入する官能基は、天然アミノ酸及びその誘導体、例えば、保護アミノ酸より選ばれ、そのカルボキシル基とポリアミノ酸末端のアミノ基との通常の縮合反応により導入される。
Ｃ．本発明で用いる脂質膜は、天然脂質あるいは合成脂質より形成されるが、特性的には、センサーチップをＬＢ（ラングミュアー・ブロージェット）法等の手法によって形成するのであるから、該方法により単分子膜（脂質二分子膜：脂質二重層）を形成するものが好ましく、具体例を例示すると、生体膜を形成する、りん脂質として、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、カルジオリビン（ＣＬ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）等や、合成脂質として、ジアルキルアンモニウム、ジアルキルりん酸等において、その脂肪酸組成を種々に変えたものを挙げることができる。また、脂質の脂肪酸には飽和アルキル鎖が好適である。これは、不飽和型の脂質の場合、酸化による膜の劣化の恐れがあるためである。
【０００９】
本発明のセンサーチップは、認識対象物質を含む水溶液上に、ＬＢ法等の通常の手法を用いて形成した上記ポリアミノ酸と脂質との混合単分子膜を、金あるいは銀を蒸着したガラス基板上に累積・固定化したものである。
また、混合膜の固定基体としては、形状としては、平板以外に円板等を採用することができ、基体の材質としては、水晶、マイカ等を採用することができる。
同センサーチップ上での認識対象物質の結合は、表面プラズモン共鳴法を用いた検出が可能である。このほかに、水晶振動子法、原子間力顕微鏡などのプローブ顕微鏡を用いて検出できるが、簡易手段としては、水晶振動子法や表面プラズモン共鳴法が好ましい。
【００１０】
また展開液を調製する溶媒としては、脂質とポリアミノ酸をともに溶解できるものであれば良く、具体的にはクロロホルム、１，２ジクロロエタン等が用いられる。
また、展開溶液の調製には、脂質濃度は０．０１〜１ｍｇ／ｍＬの範囲を採用でき、０．１〜０．５ｍｇ／ｍＬが好ましく、また、脂質と個々の疎水性ポリアミノ酸とのモル比は１０００：１〜１０：１の範囲で使用し、５００：１〜５０：１の範囲が好ましい。
本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
【００１１】
実施例
１．キモトリプシンの基質結合サイトに存在する４種のアミノ酸、セリン、ヒスチジン、アスパラギン酸及びグルタミン酸を、それぞれ末端に有する４種のポリメチルグルタメートを合成し、これらポリアミノ酸とジパルミトイルホスファチジルコリンとの複合単分子膜による、キモトリプシンの基質であるＮアセチルチロシンエチルエステル（AcTyrEt）の認識能を検討した。
ａ．ポリメチルグルタメート(PMG)の重合は以下に従い行った。
Ｎ−カルボキシーγ―メチルＬ−グルタミン酸無物(MG-NCA)５ｇを蒸留脱水したN,N'-ジメチルホルムアミド(DMF)１００ｍＬに溶解させた。
開始剤としてN-シンナモイル-N-アミノエチルアミンをMG-NCAに対しモル比で１／３０加え、室温で２４時間反応させた。反応液を５倍量のエタノール中に注ぎ沈殿物を濾別した。この沈殿物を未反応のN-シンナモイル-N-アミノエチルアミンが光学的に検出できなくなるまで、エタノールにより再沈精製した。得られたPMGの重合度は末端N-シンナモイル-N-アミノエチルアミンとメチルグルタメート残基とのモル比より５０を得た。この比は、PMGのDMF溶液中のN-シンナモイル-N-アミノエチルアミンに基づく３３２ｎｍの吸光度より算出した。
ｂ．ＰＭＧのアミノ末端へのセリンの導入は、以下に従い行った。
PMG ０．５ｇを０℃においてDMF５０ｍＬに溶解させた。ＰＭＧに対し２倍量のFmoc-O-t-ブチル-L-セリン、N-ヒドロキシベンゾトリアゾール、1-エチル-3(3-ジメチルアミノプロピル)カルビジイミド塩酸塩を加え０℃において１時間攪拌の後、室温で４８時間反応させた。
反応液を５倍量のエタノール中に注ぎ沈殿物を濾別し、この沈殿物を未反応のFmoc-O-t-ブチル-L-セリンが光学的に検出できなくなるまで、エタノールにより再沈精製した。得られた末端にFmoc-O-t-ブチル-L-セリンを有するPMG２００ｍｇに体積分率で２０％のピペラジンを含むDMF１０ｍＬを加え、室温で３０分攪拌した。反応後、エタノールにより十分洗浄しアミノ末端のFmoc保護基の脱離を行った。次に、得られた末端にO-t-ブチル-L-セリンを有するPMGに体積分率で５％の水を含むトリフルオロ酢酸１０ｍＬを加え室温で１．５時間反応させ、側鎖保護基のt-ブチル基を脱保護した。エタノールにて十分洗浄した後、目的の末端にセリンを有するPMG ( PMG(Ser) )をえた。
ｃ．末端にヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸を有するPMG ( PMG(His),PMG(Asp), PMG(Glu) )についてもPMG(Ser)と同様に、PMGとNα-Fmoc-Nim-トリチル-L-ヒスチジン、Fmoc-L-アスパラギン酸β-t-ブチルエステル、Fmoc-L-グルタミン酸γ-t-ブチルエステルをそれぞれ縮合させた後、末端Fmoc保護基と側鎖保護基を脱離し合成した。得られたPMG(Ser)、PMG(His)、PMG(Asp)およびPMG(Glu)はいずれも安定なαーヘリックス構造を有していることを円偏光二色性スペクトルから確認した。
【００１２】
ｄ．PMG(Ser), PMG(His), PMG(Asp)及びPMG(Glu)を含むジパルミトイルフォスファチジルコリン(DPPC)単分子膜の調製は以下に従い行った。
PMG(Ser), PMG(His), PMG(Asp)、PMG(Glu)及びDPPCをそれぞれDMFに溶解させた。これら溶液をフラスコ中で混合し、溶媒を蒸発させ、フラスコ内面に薄膜を形成させた。このフラスコにクロロホルムを注ぎ、同薄膜を溶解し、展開溶液を調製した。DPPCの濃度は０．２ｍｇ／ｍＬとし、DPPCと個々のポリアミノ酸とのモル比は４００：１とした。０．１ｍＭのN-アセチルチロシンエチルエステル(AcTyrEt)含む蒸留水で満たしたラングミュアトラフの気−液界面に、先の展開溶液を規定量展開し３０分間２５℃で静置し、PMG(Ser), PMG(His), PMG(Asp)及びPMG(Glu)を含むDPPC単分子膜を形成した。
この工程におけるPMG(Ser), PMG(His), PMG(Asp)及びPMG(Glu)の再配列（再構成）の模式図を図５に示す。認識物質AcTyrEt（■）に対応して再配列（再構成）する。
同膜を圧縮速度５ｍｍ／分で表面圧が４５ｍＮ／ｍに達するまで圧縮した。この状態で、ポリアミノ酸を含むDPPC単分子膜は欠陥のない均質な膜を形成し、さらに膜中のポリアミノ酸が膜面に対し垂直に配向し存在していることを確認している(M. Higuchi，et. al. Langmuir, 13, 1616 (1997)参照)。
【００１３】
さらに、同膜をマイカ基板上に水平付着法により累積し、ＡＦＭ（原子間力顕微鏡）観察を行ったところ、４種のポリアミノ酸は、DPPC単分子膜中で集合体を形成していることが明らかとなった（図１における白色の部分）。
そこで、PMG(Ser), PMG(His), PMG(Asp)及びPMG(Glu)を含むDPPC単分子膜を、膜圧４５ｍＮ／ｍに制御しながら、金を蒸着したガラス基板上に水平付着法により累積・固定化しAcTyrEtに対するセンサーチップを調製した。得られたセンサーチップは表面に吸着したAcTyrEtを除去するために、一昼夜蒸留水に浸し洗浄した。 比較のために、蒸留水上に形成したPMG(Ser), PMG(His), PMG(Asp)及びPMG(Glu)を含むDPPC単分子膜、及びDPPCのみより成る単分子膜もそれぞれ同様に金蒸着ガラス基板上に累積・固定化した。
【００１４】
得られたセンサーチップのAcTyrEt結合能を表面プラズモン共鳴法により評価した。
表面プラズモンの共鳴角は、金表面と溶液との中間層の屈折率に比例し変化することが知られており（C. F. Eagen et. al., Phys. Rev. B, 19, 5068 (1979)参照）、表面プラズモンの共鳴角の変化量から、センサーチップ表面に結合したAcTyrEtの量を見積もることができる。
【００１５】
前記０．１ｍＭのAcTyrEt水溶液上及び蒸留水上で調製したPMG(Ser),PMG(His), PMG(Asp)及びPMG(Glu)を含むDPPC単分子膜を金蒸着ガラス基板上に累積・固定化したセンサーチップへのAcTyrEtの親和定数を示したものである。
図２にAcTyrEt水溶液上及び蒸留水上でそれぞれ調製したセンサーチップに１．５μＭのAcTyrEtを添加したときの共鳴角の変化を示した。この場合の共鳴角の変化量は、AcTyrEtを添加することによる溶液相の屈折率変化に伴う共鳴角の変化を補正するために、DPPC単分子膜を累積・固定化したチップで得られる共鳴角変化を差し引いたものを用いた。
蒸留水上で調製したチップではAcTyrEt添加に伴う共鳴角の変化はほとんど見られない（ｂ）のに対し、AcTyrEt水溶液上で調製したセンサーチップでは大きな共鳴角の変化が認められ（ａ）、AcTyrEtが同センサーチップ表面に結合していることが分かる。
【００１６】
AcTyrEtのセンサーチップによる認識をより詳細に評価するために、加えるAcTyrEtの濃度を変え、結合等温曲線を検討した。結果を図３に示す。
AcTyrEt水溶液上で調製したセンサーチップでは、明らかな飽和型の結合等温曲線を示し（ａ）、このことは、同センサーチップ表面にAcTyrEtの結合サイトが存在することを示している。さらにこれらの結果よりAcTyrEt水溶液上及び蒸留水上で調製したセンサーチップそれぞれのAcTyrEtとの親和定数を算出した。結果を表１に示す。
【００１７】
【表１】
【００１８】
AcTyrEt水溶液上で調製したセンサーチップの親和定数は、蒸留水上で調製したチップの約２０倍の大きな値を取り、AcTyrEtのセンサーチップとして有効に機能していることが分かる。
【００１９】
前記実施例においては、アミノ酸などの官能基を有する疎水性ポリアミノ酸が脂質単分子膜中で集合体した単分子膜を一回（一層）基板上に累積・固定化したセンサーチップであるが、二回（二層）基板上に累積・固定化した場合、より安定したセンサーチップが得られることが確認されている。
また、単分子膜を形成する場合の、認識物質を溶解した溶液、例えば水溶液として、複数の認識物質を加えておけば、複数の物質に対するセンサーチップが得られる。
また、認識物質としては、問題になっている環境ホルモン物質等のセンサーチップを上記方法によって製造できる。
【００２０】
【発明の効果】
以上に述べたように、本発明のセンサーチップは認識対象物質により誘起されるポリアミノ酸集合体をその認識部位として用いているために、ポリアミノ酸―脂質単分子膜調製時に水相に加えた認識対象物質に対し有効なセンサーの調製が簡便に行え、それを基体上に累積・固定することによって多種多様な物質に対応する安定なセンサーチップを提供できるという効果がもたらされる。
【図面の簡単な説明】
【図１】０．１ｍＭのAcTyrEt水溶液上に形成したPMG(Ser), PMG(His), PMG(Asp)及びPMG(Glu)を含むDPPC単分子膜をマイカ基板上に累積した膜の表面構造を示すＡＦＭ像である。
【図２】 ０．１ｍＭのAcTyrEt水溶液上（ａ）及び蒸留水上（ｂ）で調製したPMG(Ser), PMG(His), PMG(Asp)及びPMG(Glu)を含むDPPC単分子膜を金蒸着ガラス基板上に累積・固定化したセンサーチップそれぞれに、１．５μＭのAcTyrEtを加えたときの表面プラズモンの共鳴角変化を示したものである。
【図３】 ０．１ｍＭのAcTyrEt水溶液上（ａ）及び蒸留水上（ｂ）で調製したPMG(Ser), PMG(His), PMG(Asp)及びPMG(Glu)を含むDPPC単分子膜を金蒸着ガラス基板上に累積・固定化したセンサーチップへのAcTyrEtの結合の等温曲線を示したものである。
【図４】 末端に官能基を導入したポリアミノ酸の混合単分子膜中で起こる再配列の模式図
【図５】 PMG(Ser), PMG(His), PMG(Asp)及びPMG(Glu)の再配列（再構成）の模式図（認識物質AcTyrEt（■））
【発明の属する技術分野】
本発明は、多種・多様に存在する生体中の微量物質や、環境中の微量有害物質を高感度に検出することができ、かつ、比較的簡便な方法により製造可能なセンサーチップに関するものである。
【０００２】
【従来技術】
化学分野において、任意の分子を識別する能力のある分子を設計・構築することは、種々の分野で共通の大きなテーマとなっている。生体内には化学物質の認識機構として、特定の化学物質が細胞に存在する特異的レセプターに結合することにより、それを化学言語として認識する仕組みがある。例えば神経伝達物質は、神経細胞をつなぐ細胞間隙内で一方の神経細胞から放出され、それが受け手であるもう一方の神経細胞膜のレセプターと結合することにより神経細胞同士で情報を伝える役目をしている。
また、種々のホルモンは生体内で血液により輸送される臓器間の情報伝達成分を構成していることは良く知られている。これらは分子言語ともいわれ、ホルモンレセプターを介して生命機能を調節する役割をしている。
更に、生体系での抗体に代表される受容体の認識多様性は、その基質結合部位に存在する超可変部位のアミノ酸配列の違いにより発現されている。
免疫グロブリンでは、これにより１０８以上の異なった抗体の存在が可能であり、体内に侵入した多種多様な物質の認識を可能にしている。
【０００３】
一方、合成系における受容体は、近年の超分子化学（T. W. Bell et. al., Angew.Chem. Int. Ed. Engl., 34, 2163 (1995)参照）、ホストーゲスト化学（Y. Kobuke et.al., J. Am. Chem. Soc., 117, 12751 (1995)参照）、モレキュラーインプリンティング法等の進展により、高選択性・高親和性を有する受容体の合成が、数多く報告されている。
例えば、モレキュラーインプリンティング法の応用技術が、特表平６−５１０４７４号公報、特開平５−１９４６１７号公報、特表平８−５０６３２０号公報、及び米国特許第５１１０８３３号明細書等に記載されている。これらは、これによる高分子化合物を、酵素、抗体等に使用する技術である。
前記特表平６−５１０４７４号公報及び特表平８−５０６３２０号公報には、抗体の特性を模倣した特異的結合部位を有する重合可能なモノマー及び架橋モノマーを、プリント（刻印）分子の存在下で重合させ、重合後前記プリント分子を取り除いて、前記プリント分子に相補的な特異的な部位を残すことによって、人工抗体を得る方法及び抗体代替の人工抗体が記載されている。
しかしながら、これら合成受容体は、個々の認識対象物質に対しその都度、受容体の分子設計及び複雑な化学反応などが伴う合成を行わなければならず、環境中の微量有害物質等の未知物質の検出手段としては、簡便・迅速という観点から必ずしも満足できるものではなかった。
【０００４】
これに対して、前記生体系での抗体に代表される受容体の認識多様性を持ったものを、生体膜の形成原理を応用して構築する技術も公知である（繊維学会第１５回シンポジウム予稿集、講演3PA58「末端に種々の官能基を配したポリアミノ酸の脂質膜での構造とその機能」、平成１１年５月８日発行、）。ここには、例えばセリンプロテアーゼに類似する機能を持つものは、その基質結合部位に存在するセリン（Ｓｅｒ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）及びグルタミン酸（Ｇｌｕ）の４種のアミノ酸をそれぞれ末端に導入した疎水性ポリアミノ酸、具体的には前記アミノ酸をＮ末端に結合したポリメチルグルタメートと脂質、具体的にはジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）ベシクル（vesicle）とから、前記４種の疎水性ポリアミノ酸を取り込ませることによって構築でき、構築されたものは高いＮアセチルチロシンエチルエステル（AcTyrEt）の認識能を持つことを説明している。
しかし、このものはベシクル構造であるためセンサーとしては、安定性及びノイズも大きいため、取り扱い上および性能的に満足すべきものではない。
また、酵素や膜タンパク質を各種基材（形状、材質などを含めた）に固定化し、各種センサーとして用いようという研究も数多くなされている（S. J. Updike et. al., Nature 214, 986 (1967), Y. Miwa et. al., Bull. Chem. Soc., Jpn., 67, 2864 (1994)参照）。
しかしながら、これらについても使用上の構造安定性という観点から、実際にはグルコースオキシダーゼや高塩・高熱菌より抽出された膜タンパク質に限られており、満足できる状況にない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、生体系の抗体に代表される、多様性を有する受容体を簡便（測定の対象の変化に対して迅速に対応できるような）な手法により調製でき、構造安定性を有する工学的に利用可能なセンサーチップを提供するものである。
上記観点に基づき、気−液界面に、種々の官能基（認識対象物質に反応性を持つ基）を末端に有するαヘリックス構造を有するポリアミノ酸と脂質とを含む溶液を、液相に認識対象物質を加えた状態で、展開すると、前記液相に加えた認識対象物質と膜中のポリアミノ酸末端との相互作用に基づき誘起されるポリアミノ酸集合体が脂質膜中に形成され（脂質膜の再構成）、前記ポリアミノ酸集合体が前記認識対象物質に対する認識結合部位として機能すること、及び前記ポリアミノ酸集合体が形成された脂質膜を適当な基板上に累積・固定化することでセンサーチップを調製できることを見出し、本発明に至った。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明は、αヘリックス構造を有する重合度１０から１００の疎水性ポリアミノ酸末端に天然アミノ酸あるいはその誘導体を縮合したポリアミノ酸と脂質とから、少なくとも１種の認識対象物資の影響下で、形成した複合単分子膜を、少なくとも１層基板上に累積・固定化したセンサーチップであり、好ましくは、膜の安定性の面から、基板上に累積・固定した複合単分子膜が２層であることを特徴とする前記センサーチップであり、より好ましくは、ポリアミノ酸―脂質複合単分子膜の調製を、少なくとも一種の認識対象物質を含む水溶液上で形成すことにより、該それぞれの認識対象物質により誘起される脂質膜中のポリアミノ酸集合体を該認識対象物質の認識部位として用いることを特徴とする前記センサーチップである。
本発明者は、前記ポリアミノ酸と脂質から、認識対象物質に対応する前記ポリアミノ酸集合体が前記認識対象物質の影響下に自動的に前記脂質二分子膜中に形成され現象を利用して複合単分子膜として形成し、それを適当な基体に累積・固定化することにより、安定なセンサーチップが形成できることを発見することにより、本発明を実現したものである。その原理を図４に示す。Ａ〜Ｈは、ポリアミノ酸末端に結合した官能基を示し、●および▼は認識物質を示す。
【０００７】
【本発明の実施の態様】
本発明を詳細に説明する。
Ａ．本発明のセンサーチップを構成するα−ヘリックス構造を有する疎水性ポリアミノ酸を構成する疎水性のアミノ酸としては、例えば、アラニン、グリシン、ロイシン、イソロイシン、グルタミン酸エステル類、側鎖保護リジン類等を挙げることができる。
疎水性ポリアミノ酸の重合度は１０から１００の範囲が好ましい。これは、重合度が１０未満の場合にはポリアミノ酸が安定なαヘリックス構造を形成しないためであり、重合度が１００を越える場合には、脂質膜に安定に取り込まれないためである。
【０００８】
Ｂ．上記、ポリアミノ酸の末端、具体的にはＮ末端に導入する官能基は、天然アミノ酸及びその誘導体、例えば、保護アミノ酸より選ばれ、そのカルボキシル基とポリアミノ酸末端のアミノ基との通常の縮合反応により導入される。
Ｃ．本発明で用いる脂質膜は、天然脂質あるいは合成脂質より形成されるが、特性的には、センサーチップをＬＢ（ラングミュアー・ブロージェット）法等の手法によって形成するのであるから、該方法により単分子膜（脂質二分子膜：脂質二重層）を形成するものが好ましく、具体例を例示すると、生体膜を形成する、りん脂質として、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、カルジオリビン（ＣＬ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）等や、合成脂質として、ジアルキルアンモニウム、ジアルキルりん酸等において、その脂肪酸組成を種々に変えたものを挙げることができる。また、脂質の脂肪酸には飽和アルキル鎖が好適である。これは、不飽和型の脂質の場合、酸化による膜の劣化の恐れがあるためである。
【０００９】
本発明のセンサーチップは、認識対象物質を含む水溶液上に、ＬＢ法等の通常の手法を用いて形成した上記ポリアミノ酸と脂質との混合単分子膜を、金あるいは銀を蒸着したガラス基板上に累積・固定化したものである。
また、混合膜の固定基体としては、形状としては、平板以外に円板等を採用することができ、基体の材質としては、水晶、マイカ等を採用することができる。
同センサーチップ上での認識対象物質の結合は、表面プラズモン共鳴法を用いた検出が可能である。このほかに、水晶振動子法、原子間力顕微鏡などのプローブ顕微鏡を用いて検出できるが、簡易手段としては、水晶振動子法や表面プラズモン共鳴法が好ましい。
【００１０】
また展開液を調製する溶媒としては、脂質とポリアミノ酸をともに溶解できるものであれば良く、具体的にはクロロホルム、１，２ジクロロエタン等が用いられる。
また、展開溶液の調製には、脂質濃度は０．０１〜１ｍｇ／ｍＬの範囲を採用でき、０．１〜０．５ｍｇ／ｍＬが好ましく、また、脂質と個々の疎水性ポリアミノ酸とのモル比は１０００：１〜１０：１の範囲で使用し、５００：１〜５０：１の範囲が好ましい。
本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
【００１１】
実施例
１．キモトリプシンの基質結合サイトに存在する４種のアミノ酸、セリン、ヒスチジン、アスパラギン酸及びグルタミン酸を、それぞれ末端に有する４種のポリメチルグルタメートを合成し、これらポリアミノ酸とジパルミトイルホスファチジルコリンとの複合単分子膜による、キモトリプシンの基質であるＮアセチルチロシンエチルエステル（AcTyrEt）の認識能を検討した。
ａ．ポリメチルグルタメート(PMG)の重合は以下に従い行った。
Ｎ−カルボキシーγ―メチルＬ−グルタミン酸無物(MG-NCA)５ｇを蒸留脱水したN,N'-ジメチルホルムアミド(DMF)１００ｍＬに溶解させた。
開始剤としてN-シンナモイル-N-アミノエチルアミンをMG-NCAに対しモル比で１／３０加え、室温で２４時間反応させた。反応液を５倍量のエタノール中に注ぎ沈殿物を濾別した。この沈殿物を未反応のN-シンナモイル-N-アミノエチルアミンが光学的に検出できなくなるまで、エタノールにより再沈精製した。得られたPMGの重合度は末端N-シンナモイル-N-アミノエチルアミンとメチルグルタメート残基とのモル比より５０を得た。この比は、PMGのDMF溶液中のN-シンナモイル-N-アミノエチルアミンに基づく３３２ｎｍの吸光度より算出した。
ｂ．ＰＭＧのアミノ末端へのセリンの導入は、以下に従い行った。
PMG ０．５ｇを０℃においてDMF５０ｍＬに溶解させた。ＰＭＧに対し２倍量のFmoc-O-t-ブチル-L-セリン、N-ヒドロキシベンゾトリアゾール、1-エチル-3(3-ジメチルアミノプロピル)カルビジイミド塩酸塩を加え０℃において１時間攪拌の後、室温で４８時間反応させた。
反応液を５倍量のエタノール中に注ぎ沈殿物を濾別し、この沈殿物を未反応のFmoc-O-t-ブチル-L-セリンが光学的に検出できなくなるまで、エタノールにより再沈精製した。得られた末端にFmoc-O-t-ブチル-L-セリンを有するPMG２００ｍｇに体積分率で２０％のピペラジンを含むDMF１０ｍＬを加え、室温で３０分攪拌した。反応後、エタノールにより十分洗浄しアミノ末端のFmoc保護基の脱離を行った。次に、得られた末端にO-t-ブチル-L-セリンを有するPMGに体積分率で５％の水を含むトリフルオロ酢酸１０ｍＬを加え室温で１．５時間反応させ、側鎖保護基のt-ブチル基を脱保護した。エタノールにて十分洗浄した後、目的の末端にセリンを有するPMG ( PMG(Ser) )をえた。
ｃ．末端にヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸を有するPMG ( PMG(His),PMG(Asp), PMG(Glu) )についてもPMG(Ser)と同様に、PMGとNα-Fmoc-Nim-トリチル-L-ヒスチジン、Fmoc-L-アスパラギン酸β-t-ブチルエステル、Fmoc-L-グルタミン酸γ-t-ブチルエステルをそれぞれ縮合させた後、末端Fmoc保護基と側鎖保護基を脱離し合成した。得られたPMG(Ser)、PMG(His)、PMG(Asp)およびPMG(Glu)はいずれも安定なαーヘリックス構造を有していることを円偏光二色性スペクトルから確認した。
【００１２】
ｄ．PMG(Ser), PMG(His), PMG(Asp)及びPMG(Glu)を含むジパルミトイルフォスファチジルコリン(DPPC)単分子膜の調製は以下に従い行った。
PMG(Ser), PMG(His), PMG(Asp)、PMG(Glu)及びDPPCをそれぞれDMFに溶解させた。これら溶液をフラスコ中で混合し、溶媒を蒸発させ、フラスコ内面に薄膜を形成させた。このフラスコにクロロホルムを注ぎ、同薄膜を溶解し、展開溶液を調製した。DPPCの濃度は０．２ｍｇ／ｍＬとし、DPPCと個々のポリアミノ酸とのモル比は４００：１とした。０．１ｍＭのN-アセチルチロシンエチルエステル(AcTyrEt)含む蒸留水で満たしたラングミュアトラフの気−液界面に、先の展開溶液を規定量展開し３０分間２５℃で静置し、PMG(Ser), PMG(His), PMG(Asp)及びPMG(Glu)を含むDPPC単分子膜を形成した。
この工程におけるPMG(Ser), PMG(His), PMG(Asp)及びPMG(Glu)の再配列（再構成）の模式図を図５に示す。認識物質AcTyrEt（■）に対応して再配列（再構成）する。
同膜を圧縮速度５ｍｍ／分で表面圧が４５ｍＮ／ｍに達するまで圧縮した。この状態で、ポリアミノ酸を含むDPPC単分子膜は欠陥のない均質な膜を形成し、さらに膜中のポリアミノ酸が膜面に対し垂直に配向し存在していることを確認している(M. Higuchi，et. al. Langmuir, 13, 1616 (1997)参照)。
【００１３】
さらに、同膜をマイカ基板上に水平付着法により累積し、ＡＦＭ（原子間力顕微鏡）観察を行ったところ、４種のポリアミノ酸は、DPPC単分子膜中で集合体を形成していることが明らかとなった（図１における白色の部分）。
そこで、PMG(Ser), PMG(His), PMG(Asp)及びPMG(Glu)を含むDPPC単分子膜を、膜圧４５ｍＮ／ｍに制御しながら、金を蒸着したガラス基板上に水平付着法により累積・固定化しAcTyrEtに対するセンサーチップを調製した。得られたセンサーチップは表面に吸着したAcTyrEtを除去するために、一昼夜蒸留水に浸し洗浄した。 比較のために、蒸留水上に形成したPMG(Ser), PMG(His), PMG(Asp)及びPMG(Glu)を含むDPPC単分子膜、及びDPPCのみより成る単分子膜もそれぞれ同様に金蒸着ガラス基板上に累積・固定化した。
【００１４】
得られたセンサーチップのAcTyrEt結合能を表面プラズモン共鳴法により評価した。
表面プラズモンの共鳴角は、金表面と溶液との中間層の屈折率に比例し変化することが知られており（C. F. Eagen et. al., Phys. Rev. B, 19, 5068 (1979)参照）、表面プラズモンの共鳴角の変化量から、センサーチップ表面に結合したAcTyrEtの量を見積もることができる。
【００１５】
前記０．１ｍＭのAcTyrEt水溶液上及び蒸留水上で調製したPMG(Ser),PMG(His), PMG(Asp)及びPMG(Glu)を含むDPPC単分子膜を金蒸着ガラス基板上に累積・固定化したセンサーチップへのAcTyrEtの親和定数を示したものである。
図２にAcTyrEt水溶液上及び蒸留水上でそれぞれ調製したセンサーチップに１．５μＭのAcTyrEtを添加したときの共鳴角の変化を示した。この場合の共鳴角の変化量は、AcTyrEtを添加することによる溶液相の屈折率変化に伴う共鳴角の変化を補正するために、DPPC単分子膜を累積・固定化したチップで得られる共鳴角変化を差し引いたものを用いた。
蒸留水上で調製したチップではAcTyrEt添加に伴う共鳴角の変化はほとんど見られない（ｂ）のに対し、AcTyrEt水溶液上で調製したセンサーチップでは大きな共鳴角の変化が認められ（ａ）、AcTyrEtが同センサーチップ表面に結合していることが分かる。
【００１６】
AcTyrEtのセンサーチップによる認識をより詳細に評価するために、加えるAcTyrEtの濃度を変え、結合等温曲線を検討した。結果を図３に示す。
AcTyrEt水溶液上で調製したセンサーチップでは、明らかな飽和型の結合等温曲線を示し（ａ）、このことは、同センサーチップ表面にAcTyrEtの結合サイトが存在することを示している。さらにこれらの結果よりAcTyrEt水溶液上及び蒸留水上で調製したセンサーチップそれぞれのAcTyrEtとの親和定数を算出した。結果を表１に示す。
【００１７】
【表１】
AcTyrEt水溶液上で調製したセンサーチップの親和定数は、蒸留水上で調製したチップの約２０倍の大きな値を取り、AcTyrEtのセンサーチップとして有効に機能していることが分かる。
【００１９】
前記実施例においては、アミノ酸などの官能基を有する疎水性ポリアミノ酸が脂質単分子膜中で集合体した単分子膜を一回（一層）基板上に累積・固定化したセンサーチップであるが、二回（二層）基板上に累積・固定化した場合、より安定したセンサーチップが得られることが確認されている。
また、単分子膜を形成する場合の、認識物質を溶解した溶液、例えば水溶液として、複数の認識物質を加えておけば、複数の物質に対するセンサーチップが得られる。
また、認識物質としては、問題になっている環境ホルモン物質等のセンサーチップを上記方法によって製造できる。
【００２０】
【発明の効果】
以上に述べたように、本発明のセンサーチップは認識対象物質により誘起されるポリアミノ酸集合体をその認識部位として用いているために、ポリアミノ酸―脂質単分子膜調製時に水相に加えた認識対象物質に対し有効なセンサーの調製が簡便に行え、それを基体上に累積・固定することによって多種多様な物質に対応する安定なセンサーチップを提供できるという効果がもたらされる。
【図面の簡単な説明】
【図１】０．１ｍＭのAcTyrEt水溶液上に形成したPMG(Ser), PMG(His), PMG(Asp)及びPMG(Glu)を含むDPPC単分子膜をマイカ基板上に累積した膜の表面構造を示すＡＦＭ像である。
【図２】 ０．１ｍＭのAcTyrEt水溶液上（ａ）及び蒸留水上（ｂ）で調製したPMG(Ser), PMG(His), PMG(Asp)及びPMG(Glu)を含むDPPC単分子膜を金蒸着ガラス基板上に累積・固定化したセンサーチップそれぞれに、１．５μＭのAcTyrEtを加えたときの表面プラズモンの共鳴角変化を示したものである。
【図３】 ０．１ｍＭのAcTyrEt水溶液上（ａ）及び蒸留水上（ｂ）で調製したPMG(Ser), PMG(His), PMG(Asp)及びPMG(Glu)を含むDPPC単分子膜を金蒸着ガラス基板上に累積・固定化したセンサーチップへのAcTyrEtの結合の等温曲線を示したものである。
【図４】 末端に官能基を導入したポリアミノ酸の混合単分子膜中で起こる再配列の模式図
【図５】 PMG(Ser), PMG(His), PMG(Asp)及びPMG(Glu)の再配列（再構成）の模式図（認識物質AcTyrEt（■））
Claims (3)
- αヘリックス構造を有する重合度１０から１００の疎水性ポリアミノ酸末端に天然アミノ酸あるいはその誘導体を縮合したポリアミノ酸と脂質とから、少なくとも１種の認識対象物質の影響下で、形成した複合単分子膜を、少なくとも１層基板上に累積・固定化したセンサーチップ。
- 基板上に累積・固定した複合単分子膜が２層であることを特徴とする請求項１に記載のセンサーチップ。
- ポリアミノ酸―脂質複合単分子膜の調製を、少なくとも一種の認識対象物質を含む水溶液上で形成すことにより、該それぞれの認識対象物質により誘起される脂質膜中のポリアミノ酸集合体を該認識対象物質の認識部位として用いることを特徴とする請求項１または２に記載のセンサーチップ。
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